Técnicas Instrumentales Básicas 4

TEMA 3.
ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
1. INTRODUCCIÓN
La luminiscencia molecular constituye un método óptico que incluyen la fluorescencia,

fosforescencia y quimioluminiscencia. En los dos primeros casos, la molécula de analito
absorbe una REM hasta alcanzar un estado excitado. En el último caso, la molécula alcanza el
estado excitado a través de una reacción química.
Características
- Estos métodos tienen una gran sensibilidad, ya que podemos llegar a las partes por
billón. Esa sensibilidad viene determinada por el gran intervalo de linealidad de la
representación de la señal frente a la concentración.
- Selectividad. Todas las moléculas absorben el ultravioleta, muchas absorben el visible
pero pocas presentan fenómenos de luminiscencia.
- En esta técnica trabajamos en tres dimensiones. Una dimensión es la intensidad de
señal, excitación y emisión.
- Los espectros son altos y mal estructurados como consecuencia de los múltiples saltos
electrónicos. Estas técnicas implican el tránsito de electrones.
2. PROCESOS FLUORESCENTES Y FOSFORESCENTES
Dos son los procesos mediante los que se produce la fluorescencia.
a) En primer lugar, la REM (luz incidente) va a pasar a la muestra y esta se excita.
b) En segundo lugar, la molécula se relaja, es decir, disminuye de su estado de excitación a

estados de menor energía. Esta relajación se produce de formas distintas: por emisión de
calor; por emisión de energía en forma de fotones; o transformándose en otras especies
mediante reacciones fotoquímicas.
Según el principio de exclusión de Pauli, solo pueden existir dos electrones por orbital, los
cuales no pueden tener todos sus números cuánticos iguales.
Si los dos electrones están apareados, se encuentran en un estado electrónico singulete, es

decir, con los tres primeros números cuánticos iguales, pero de spines contrarios. Esto produce
que la molécula o el enlace no tengan propiedades magnéticas, es decir, se trate de una
molécula diamagnética. Si tengo dos electrones desapareados, tengo un estado electrónico
triplete, moléculas o enlaces que sí poseen propiedades magnéticas.
La multiplicidad es la manera de calcular el estado electrónico de un determinado compuesto.

Se calcula como: 2s +1, siendo s el número de spin de esos electrones.
Para los diamagnéticos, s=0, por tanto 2s +1 =1
Para los paramagnéticos, s=-1/2 + ½ = 1, por tanto 2s +1 =3

Un estado electrónico triplete posee menor energía (cuando menos energético más estable)
que un estado electrónico singulete, pero el salto de un singulete a un triplete produce un
cambio en la multiplicidad. Este salto electrónico se denomina prohibido. Es un tránsito muy
poco probable.
El proceso de relajación de una molécula excitada es muy rápido (10-8s), pero si el estado
excitado de la molécula es triplete, el proceso de relajación puede ser más lento y variar de 10 -
4
hasta segundos. El paso de un estado singulete excitado al fundamental produce
fluorescencia. El paso de un triplete excitado al fundamental produce fosforescencia. En
ambos se libera REM dentro del UV/VISIBLE.
La fosforescencia tiene longitudes de onda mayores que la fluorescencia
¿Cómo se produce fosforescencia?
Llamamos conversión interna es un cambio de un estado excitado a otro excitado y sin

cambiar la multiplicidad. (mirar cuaderno)
Si hay cambios en la multiplicidad (cambio de singlete a triplete), se denomina cruce de

sistemas. El cruce de sistemas permite que exista la fosforescencia.
Cuando la relajación se produce sin emisión de radiación por efecto del disolvente o de otras
moléculas distintas a la de analito decimos que se ha producido conversión externa.
A medida que aumenta la fluorescencia, disminuye la fosforescencia y viceversa
¿De qué depende que la molécula presente fosforescencia o fluorescencia?
Llamamos rendimiento cuántico a la relación entre el número de moléculas que emiten

fluorescencia entre el número de moléculas que han sido excitadas. Su valor es entre 0 y 1
Entre las variables que afectan a estos fenómenos se encuentran las siguientes:
- El tipo de transiciones que tienen que tener lugar son del tipo pi y pi antienlazante.
- Extensión del anillo aromático. A medida que aumenta el número de anillos
aromáticos, aumenta la fluorescencia. Esto se debe a un aumento de la conjugación,
desplazando el espectro hacia la zona del UV-visible.
- El efecto del sustituyente. A medida que aumenta el número atómico, en el caso de
los halógenos, tenemos un mayor número de niveles energéticos, esto favorece la
fosforescencia. La fosforescencia se ve favorecida también por moléculas
paramagnéticas como el O2
- Rigidez estructurada. A medida que la molécula es más rígida, la fluorescencia y
fosforescencia se ven aumentadas.
- Temperatura y disolvente. La fluorescencia y fosforescencia son inversamente
proporcionales a la temperatura. Disolvente como el tetracloruro de carbono,
diclorometano, favorece la situación de estos fenómenos frente a otros disolventes
que no tienen átomos pesados.
- pH.
- Efecto de la concentración. La observación de F (fluorescencia) o P(fosforescencia) es
directamente proporcional al haz incidente absorbido en la muestra. Como la ley de
Lambert – beer es: (mirar cuaderno)
Esa fórmula solo es válida si las concentraciones son pequeñas.
ESPECTRO
En el tema anterior medía lo que se absorbia. En este voy a ver la emisión de F o P recogida a
90º con respecto al haz incidente.
3. INSTRUMENTOS
a) Fuentes. En principio deberían ser las mismas que las del UV/Visible, lo que ocurre es que
las lámparas no son lo suficientemente intensas. Por tanto, uso lámparas de xenón o mercurio,
que son más intensas.
b) Selector de longitud de onda. Si es un filtro (fluorímetros), tendré un equipo barato. Si es un

monocromador (espectrofluorímetros), tendré un equipo caro. Los espectrofluorímetros
deben disponer de dos monocromadores. El primero de ellos situados antes de la muestra
para seleccionar la longitud de onda a la cual van a excitar a la muestra, y el segundo está
colocado 90º con respecto al primero para seleccionar la longitud de onda de emisión de la
muestra.
c) Muestra. Las cubetas pueden ser de cuarzo, plástico, etc. La única diferencia es que tiene
que tener cuatro caras o al menos tres caras translúcidas a la radiación. Además esta cubeta se
coloca en un vaso Dewar, parecido a un termo, que posee nitrógeno líquido, que aumenta la
temperatura y evitan los procesos de relajación de la muestra, favoreciendo los procesos de
fluorescencia de la muestra
d) Detector. Son fotomultiplicadores que multiplican la señal saliente para aumentarla. Se

encuentra situado 90º con respecto al haz de la REM
e) Traductores. Igual que en los otros.
4. ESPECTRO
Podemos registrar distintos espectros en la fluorescencia:
Espectro de emisión. Consiste en el registro de la señal de fluorescencia frente a la longitud de

onda de emisión. Para recoger un espectro de emisión debo fijar la longitud de onda de
excitación
Espectro de excitación. Lo que hago es variar todas las longitudes de onda de excitación y
recojo la emisión a una única longitud de onda fija.
Un espectro de emisión suele parecerse a un espectro de absorción pero no es igual. Lo

normal es que la longitud de onda de emisión sea superior a la de excitación.
Un espectro tridimensional registra la intensidad de fluorescencia frente a la longitud de onda
de emisión y excitación. Excito uno y veo todo
Trabajar en 3D me da la posibilidad de trabajar con espectro sincrónico. Es aquel en el cual se

va variando la longitud de onda de emisión y excitación. Excito uno y lo veo, excito otro y lo
veo a diferencia del espectro tridimensional que excita uno y lo ve todo.
La variación de los monocromadores de entrada y salida debe ajustarse para que ese barrido
sincrónico pase por los máximos de emisión y excitación.
En el espectro sincrónico obtenemos bandas más estrechas con lo que se evitan solapamientos
entre distintas bandas de absorción.

Técnicas Instrumentales Básicas 4

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Técnicas Instrumentales Básicas 4

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Técnicas Instrumentales Básicas 4

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

TEMA 3.

La luminiscencia molecular constituye un método óptico que incluyen la fluorescencia,

2. PROCESOS FLUORESCENTES Y FOSFORESCENTES

Dos son los procesos mediante los que se produce la fluorescencia.

a) En primer lugar, la REM (luz incidente) va a pasar a la muestra y esta se excita.

b) En segundo lugar, la molécula se relaja, es decir, disminuye de su estado de excitación a

Si los dos electrones están apareados, se encuentran en un estado electrónico singulete, es

La multiplicidad es la manera de calcular el estado electrónico de un determinado compuesto.

Para los diamagnéticos, s=0, por tanto 2s +1 =1

Para los paramagnéticos, s=-1/2 + ½ = 1, por tanto 2s +1 =3

La fosforescencia tiene longitudes de onda mayores que la fluorescencia

¿Cómo se produce fosforescencia?

Llamamos conversión interna es un cambio de un estado excitado a otro excitado y sin

Si hay cambios en la multiplicidad (cambio de singlete a triplete), se denomina cruce de

A medida que aumenta la fluorescencia, disminuye la fosforescencia y viceversa

¿De qué depende que la molécula presente fosforescencia o fluorescencia?

Llamamos rendimiento cuántico a la relación entre el número de moléculas que emiten

Esa fórmula solo es válida si las concentraciones son pequeñas.

b) Selector de longitud de onda. Si es un filtro (fluorímetros), tendré un equipo barato. Si es un

d) Detector. Son fotomultiplicadores que multiplican la señal saliente para aumentarla. Se

e) Traductores. Igual que en los otros.

Podemos registrar distintos espectros en la fluorescencia:

Espectro de emisión. Consiste en el registro de la señal de fluorescencia frente a la longitud de

Un espectro de emisión suele parecerse a un espectro de absorción pero no es igual. Lo

Trabajar en 3D me da la posibilidad de trabajar con espectro sincrónico. Es aquel en el cual se

También podría gustarte