Paula Fernández, Valeria Vermeulen, Nicolas Veliz.

Teórico 2: Espectroscopia UV-Visible

Método utilizado principalmente para la identificación y la determinación cuali-cuanti de medicamentos en

todas sus etapas.

Dado un compuesto se denomina cromóforo a la porción de estructura o al sustituyente de dicha estructura

que tiene la propiedad de absorber al UV.

En espectroscopia UV- Vis se irradia con luz de energía suficiente como para provocar transiciones
electrónicas, es decir promover un electrón desde un orbital de baja energía a uno de alta energía.

Esto significa que si un molécula absorbe el verde, el color que va a reflejar es el complementario, es decir, el
rojo o Si una sustancia absorbe entre 500 y 520 se ve rojo. Para que las substancias puedan absorber tienen
que tener dobles enlaces pi conjugados. Cuando se absorbe toda la luz se ve negro, y cuando se refleja, se
ve blanco.

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Cuando sobre una molécula incide la radiación ultravioleta, se produce un salto desde los electrones de
enlaces de unión, a enlaces de anti unión. Pasa de estado normal a estado excitado. Esas transiciones no
ocurren en todos los tipos de enlaces, las que ocurren principalmente son de enlaces pi a pi estrella(pi*)
excitado (lo más común) y de n a pi estrella (pi*) y de n a sigma estrella. Los otros saltos llevan mucha más
energía (más de 170 kcal/mol) y por lo tanto no son posibles.

Ver en la guía, están las energías de las transiciones, pero no lo toma.

En este método se hace incidir luz ultravioleta en una cuba. Parte de la radiación se va a absorber, y parte se
va a transmitir. Se va a medir lo que se transmite, pero nos interesa lo que se absorbe.

A diferencia de infrarrojo, que son bandas agudas, en UV son anchas, porque incluyen la estructura fina de
transiciones vibracionales y rotacionales de menor energía. El espectro se registra como Absorbancia (A) vs
Long de onda. No es un pico de absorbancia agudo, porque los picos en el medio hacen que sea un pico
ancho.

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Ley de lambert y beer:

Incide un haz de luz sobre la cuba. Considerando el haz con que se incide, el espectro uv-vis registra las
longitudes de onda a las que se absorbió y se cuantifica la absorbancia. Mientras que la transmitancia refiere
a la cantidad de radiación incidente que se transmite a través de la solución.

T = I / Io.

Absorbancia = -log transmitancia = Log Io/I

Cuando incide un haz en una celda, existen pérdidas por refracción entre celda y el aire, celda y solución, etc.
Por eso es imprescindible usar equipos de doble haz, lo que lleva a que se cometa menos error.

Ley de lambert-beer

b: paso óptico y c: concentración

La zona de longitudes de onda que se registra en un espectro UV-Vis es de entre 200 y 800 nm. En esta zona
no absorben dobles ni triples enlaces aislados.

Solo van a absorber enlaces pi conjugados y heteroátomos, con pares de electrones no compartidos (O, N).

Siempre hay que hacer la determinación de todas las muestras en las mismas condiciones, para evitar errores
y comparar las muestras con estándares, no utilizar información teórica.

A medida que aumenta la conjugación de sistemas aromáticos, la absorbancia se va desplazando hacia el

visible, hacia longitudes de onda mayores.

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Por ejemplo las decalinas, a medida que se suma un benceno va aumentando la longitud de onda donde se
produce el pico, y el último compuesto va teniendo color anaranjado, ya que se acerca más al visible.

Equipamiento:

La lámpara de tungsteno se usa para absorción en el visible, la de deuterio para ver UV. Las cubetas de vidrio
o plástico se usan para ver visible, pero cómo absorben al UV, se debe utilizar cubetas de cuarzo.

Posee un monocromador con un sistema de espejos que hace que el haz pase por las dos cubetas en
paralelo, lo que mejora el rendimiento del método.

-Para qué sirve la espectrofotometría?

1. Análisis cuantitativo
2. espectrofotometría diferencial
3. estudios de preformulación (determinación de pKa, coeficiente de partición, solubilidad).
Curvas de calibración:

Al realizar una curva de absorción hay que tener en cuenta cuál es el máximo de absorción, ya que las
substancias se deben medir en el máximo, donde se comete menor error. Asique se va a realizar una curva
de calibración mediante distintas diluciones del patrón. Luego se mide una muestra y se interpola la muestra.

Se mide en el máximo, ya que allí es donde más probable es que la absorbancia sea proporcional con la
concentración. Si no se mide en el máximo, puede que no cumpla la ley de lambert y beer. Por eso tenemos
que hacer bien la curva de calibración.

Hay maneras igual de lograr trabajar a otras longitudes, por ejemplo:

● Para valorar muestras: la anilina en etanol tiene un máximo a 230 nm. Pero si acidificamos el pico
ppal, aparece a 203 nm. Esto es un Shift hipsocrómico.
● En el medio alcalino, el fenol presenta un corrimiento al rojo o shift batocrómico (o longitudes
mayores de onda).

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Aplicaciones de la ley de Beer a Mezclas

Dentro de la técnica, no es fácil. Por ejemplo si a cierta longitud de onda absorben dos substancias, asique no
las puedo cuantificar. La absorbancia va a corresponder a la suma de ambas sustancias, pero si a otra
longitud de onda solamente absorbe una de las 2, calculo la cc a ESA longitud de onda. Sabiendo esa cc y
las absortividades, midió la absorbancia a la primer longitud de onda y resto.

Espectroscopía derivativa:

Un espectro UV-Vis puede representarse por una función matemática. Cualquier función matemática puede
ser derivada respecto a una de sus variables. Luego, una de estas funciones (que representa un espectro UV-
Vis) puede ser derivada una, dos o más veces con respecto a la longitud de onda o frecuencia. El instrumento
hace el cálculo electrónicamente trabajando en intervalos no muy grandes de longitud de onda para analizar
mejor la información que porciona el espectro no derivado. Esto permite obtener el crecimiento de la señal, lo
que brinda mayor información, pero aumenta considerablemente el ruido de fondo. Esta técnica funciona
como una especie de filtro. Resuelve las bandas traslapadas (hombros) y facilita la interpretación de las
características del espectro. Resuelve las anchas bandas obtenidas en los espectros UV-Vis.

Se hacen derivadas de las pendientes de la curva Absorbancia=f(long de onda).

Primera derivada: el máximo es 0, así que cada punto de inflexión es máximo y mínimo. Si a eso lo
derivamos, el máximo pasa por 0, el mínimo pasa por 0, y tenemos otros dos máximos que eran los puntos de
inflexión, y un mínimo por el espectro normal. Cada derivada genera un pico más.

En el espectro normal, en la 2da derivada el máximo pasó a ser un mínimo.

-Utilidad:

● Criterio de pureza en primera instancia.

● Permite medir muestras turbias
● Mezclas compuestas: Los componentes de una mezcla pueden no ser determinados exactamente por
bandas de absorción definidos, sino que se presentan pequeños picos en el espectro UV-Vis. Con los
métodos convencionales dichos picos son evaluados con error. Con la primera o segunda derivada
bajo determinadas condiciones se pueden distinguir los componentes individuales con un pequeño
error. Por ejemplo si tuviera dos picos que se generaron a partir de derivar un máximo, estos picos
tienen un valor de absorbancia. Se hace la derivada primera de una de las dos substancias.
Derivamos, y ese máximo será 0. Miramos la absorbancia en esa longitud de onda de la otra
substancia. Eso se hace en lugar de hacer la 2da derivada. La 2da substancia puede dar un número
negativo o no, pero permitirá distinguirlas.
Limitaciones:

1. Selectividad moderada
2. No es fácilmente aplicable en el análisis de mezclas
3. Poco aplicable a formulaciones con contenido de excipientes que absorban al UV.

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Preguntas de examen:

1. Dado un compuesto en solvente cloroformo, se lee a 235 nm. Mejorar el procedimiento.

Cambiar el solvente ya que el Cloroformo absorbe hasta 245 - 250 nm. Si debe usarse obligatoriamente,
extraer el compuesto, evaporar el cloroformo y tomar el residuo con otro solvente. Realizar diluciones seriadas
al décimo a partir de una solución inicial 1% y hacer un barrido desde el visible hasta que se produzca
absorción total. Intentar obtener una curva bien diferenciada con ABS en el rango 0.200 -0.800 ya que la
mayor precisión se obtiene cuando la ABS es 0.434.

2. Problema en el que te decían que tenías que hacer el seguimiento de síntesis analizando por UV una droga
que se sintetizaba a partir de un precursor que eran muy similares entre ellos. Te daban la técnica que usaban
para analizar, es decir, las masa que pesaban del producto, las diluciones y el E1% teórico, y tenias que decir
que pensabas de la técnica y que mejoras le harías.

Apuntaba a que como eran muy similares los dos compuestos, el precursor y el producto de interés, tenias
que proponer otra técnica de análisis que sí logre diferenciarlos y cuantificarlos por separado. Se podrían
diferenciar las dos muestras (cambiar el pH para q absorba una y otra no, o privatizando alguna con otro
compuesto que absorbe al UV, cambiando la longitud de onda para q absorba B y no A, o haciendo derivadas
con el equipo.