LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL – UNIVERSIDAD DEL VALLE

DETERMINACIÓN DE ACETAMINOFÉN EN UN MEDICAMENTO POR

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Montoya Villota Karen Daniela (1733885), Tenorio García Nathalia (1643037)

montoya.karen@correounivalle.edu.co, tenorio.nathalia@correounivalle.edu.co
Programa: Tecnología Química (2131)
Fecha de práctica: 13 de Marzo de 2020
Fecha de entrega: 20 de Marzo de 2020
Docente: Harold Díaz

Palabras clave: interacción, inyección, gases disueltos.

Resumen: Se determinó en contenido de acetaminofén en una tableta por cromatografía liquida de alta resolución. Para
ello se utilizó un cromatógrafo de líquidos (HPLC) y una curva de calibración por patrón externo. El contenido de
acetaminofén encontrado fue de (458,522 ± 0,021 mg de acetaminofén/tableta) con un porcentaje de error de 0,295%. Se
concluye que la exactitud de las mediciones cuantitativas por cromatografía líquida es en gran medida gracias a la
sensibilidad y reproducibilidad de la técnica, lo anterior, producto del uso de volúmenes de muestra mayores, del uso de
una válvula de inyección y a la desgasificación y filtración de las soluciones utilizadas.

Datos, cálculos y resultados. La corrección de las concentraciones y la determinación de

su incertidumbre se realizó aplicando la ecuación 1 y el
Preparación curva de calibración. siguiente cálculo:

Para la preparación de la curva de calibración inicialmente 0,5 ± 0,006𝑚𝐿 201 ± 0,005 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 1000 𝑚𝐿
se preparó una solución de 200 mg/L de acetaminofén ∗ ∗
50 ± 0,12 𝑚𝐿 1000 𝑚𝐿 1𝐿
analítico (Ace) en un matraz de 100 mL. Para ello fue
necesario pesar 20 mg y disolverlos con (5,0 ± 0,022) mL 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒
de metanol grado HPLC. El cálculo se muestra a = 2,01 ± 0,01
𝐿
continuación:
Tabla 1. Volúmenes de alícuota y concentración de
200 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 100 𝑚𝑔 acetaminofén.
100 𝑚𝐿 ∗ ∗ = 20,0 𝑚𝑔 Conc. Conc.
1000 𝑚𝐿 99,9 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 Volumen de
Acetaminofén acetaminofén
alícuota (mL)
Puesto que experimentalmente se tomaron 20,1 mg de (ppm) corregida (ppm)
acetaminofén analítico, se hace necesario ajustar la 2 0,5 ± 0,006 2,01 ± 0,01
concentración y calcular su incertidumbre de la siguiente 4,8 1,0 ± 0,009 4,02 ± 0,009
manera: 7,6 2,0 ± 0,015 8,04 ± 0,008
10,4 2,5 ± 0,016 10,05 ± 0,007
20,1 ± 0,1 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 1000 𝑚𝐿 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 13,2 3,0 ± 0,01 12,06 ± 0,004
∗ = 201 ± 0,005 16,0 4,0 ± 0,023 16,08 ±0,006
100 ± 0,10 𝑚𝐿 1𝐿 𝐿

𝜎𝑦 𝜎 2 𝜎 2 𝜎 2 Preparación de la muestra y el blanco.

𝑦
= √( 𝑎𝑎) + ( 𝑏𝑏 ) + ( 𝑏𝑐 ) (1)
Para la preparación de la muestra de acetaminofén se pesó
A partir de la solución anterior se preparó una curva de una tableta y se pulverizó. Teóricamente cada tableta
calibración de 2,0 a 16,0 mg/L de acetaminofén en contiene 500 mg de acetaminofén, por tanto, para obtener
matraces de 50 mL. El cálculo realizado y los volúmenes 22,5 mg de acetaminofén fue necesario realizar el siguiente
tomados se muestran a continuación: cálculo:

2 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 1000 𝑚𝐿 559,2 𝑚𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎

50 𝑚𝐿 ∗ ∗ = 0,49 𝑚𝐿 22,5 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 ∗ = 25,2 𝑚𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎
1000 𝑚𝐿 201 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 500 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒
Los pesos obtenidos se muestran a continuación: 3000,000
y = 172,33x + 114,2
Tabla 2. Pesos de las muestras. 2500,000 R² = 0,9987
Muestra Peso (±0,1 mg) 2000,000
Tableta 559,2

Area
1 25,5 1500,000
2 25,3 1000,000
Promedio muestras 25,4
500,000
Posteriormente, esta porción de tableta se transfirió a un 0,000
matraz de (100 ± 0,1) mL, se adicionó (5,0 ± 0,022) mL de 0 5 10 15 20
metanol grado HPLC y enrasó con agua desionizada. Concentración Acetaminofén (ppm)
Finalmente, se tomó (1,0 ± 0,009) mL de la solución Gráfica 1. Curva de calibración (Área vs Concentración
anterior en un matraz de (25 ± 0,04) mL y se completó el acetaminofén (ppm).
volumen con agua desionizada.
Los resultados obtenidos para las muestras se muestran a
Para la preparación del blanco se adicionó (0,5 ± 0,006) continuación:
mL de metanol grado HPLC en un matraz de (10 ± 0,025)
mL y se enrasó con agua desionizada. De la anterior Tabla 4. Área del acetaminofén de cada muestra.
solución se transfirió (1,0 ± 0,009) mL a un matraz de (25 Muestra Área (mAU *s)
± 0,04) mL y se completó el volumen con agua 1 1726,1
desionizada. 2 1624,0
Promedio 1675,05
Medición en el cromatógrafo.
Para calcular el contenido de acetaminofén en la tableta se
Antes de realizar las mediciones en el instrumento la fase realizó el método de los mínimos cuadrados y se hizo uso
móvil, los estándares y las muestras se filtraron a través de
de las siguientes ecuaciones:
una membrana de 0,45 μm.
∑𝑖=1{(𝑥𝑖 −𝑥̅ )∗(𝑦𝑖 −𝑦̅ )}
Mediante el uso de un cromatógrafo de líquidos (HPLC) 𝑏= 2 (2)
∑𝑖=1(𝑥𝑖 −𝑥̅ )
marca HEWLETT PACKARD modelo HP 1100 serie
1100, se realizó la separación y medición del área del
acetaminofén en cada solución estándar y muestras. Los Donde b es la pendiente de la curva, xi cada una de las
resultados se muestran a continuación: concentraciones de los estándares, 𝑥̅ el promedio de las
concentraciones, yi cada una de las áreas obtenidas y 𝑦̅ el
Tabla 3. Área del acetaminofén de cada solución estándar. promedio de las áreas.
Conc. Acetaminofén (ppm) Área (mAU *s)
2,01 ± 0,01 496,570 𝑎 = 𝑦̅ − 𝑏𝑥̅ (3)
4,02 ± 0,009 764,070
8,04 ± 0,008 1476,800 Donde a es el intersecto de la curva.
10,05 ± 0,007 1855,400
∑𝑖=1{(𝑥𝑖 −𝑥̅ )∗(𝑦𝑖 −𝑦̅ )}
12,06 ± 0,004 2226,900 𝑟= 2
(4)
16,08 ±0,006 2871,200 √[∑𝑖=1(𝑥𝑖 −𝑥̅ ) ]∗[∑𝑖=1(𝑦𝑖 −𝑦̅)2 ]

Con los datos de la tabla anterior se construyó la siguiente Donde r es el coeficiente de correlación.
curva de calibración:
∑𝑖=1(𝑦𝑖 −𝑦̂)2
𝑆𝑦 = √ 𝑛−2
(5)
𝑥

Donde 𝑆𝑦 es una estimación de los errores aleatorios del

𝑥
eje y, 𝑦̂ son los valores de y ajustados y n-2 son los grados
de libertad.
 𝑆𝑦
𝑥
𝑆𝑏 = (6) 𝑦 = 172,326𝑥 + 114,198 (13)
2
√∑𝑖=1(𝑥𝑖 −𝑥̅ )

Despejando la anterior ecuación, teniendo en cuenta el

Donde Sb es la desviación estándar de la pendiente. promedio de las áreas y aplicando la ecuación 10 para
calcular la desviación, tenemos:
∑𝑖=1 𝑥𝑖 2
𝑆𝑎 = 𝑆𝑦 ∗ √ 2 (7)
𝑥 𝑛∗∑𝑖=1(𝑥𝑖 −𝑥̅ ) 1675,05 − 114,198 𝒎𝒈 𝑨𝒄𝒆
𝑥= = 𝟗, 𝟎𝟓𝟖 ± 𝟎, 𝟏𝟕𝟎
172,326 𝑳
Donde Sa es la desviación estándar del intersecto.
Para calcular el contenido de acetaminofén en cada tableta
𝐼𝐶𝑏 = 𝑏 ± 𝑡(𝑛−2) 𝑆𝑏 (8) y su incertidumbre se hizo uso de la ecuación 1 y se realizó
el siguiente cálculo:
Donde ICb es el intervalo de confianza de la pendiente y t(n-
2) tiene un valor de 2,78 al 95 % de confianza y 4 grados de 9,058 ± 0,170 𝑚𝑔 𝐴𝑐𝑒 100 ± 0,1 𝑚𝐿
libertad. ∗
1000 𝑚𝐿 25,4 ± 0,1 𝑚𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
25 ± 0,04 𝑚𝐿 559,2 ± 0,1 𝑚𝑔
𝐼𝐶𝑎 = 𝑎 ± 𝑡(𝑛−2) 𝑆𝑎 (9) ∗ ∗
1 ± 0,009 𝑚𝐿 1 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎
Donde ICa es el intervalo de confianza del intersecto. 𝒎𝒈 𝑨𝒄𝒆
= 𝟒𝟓𝟖, 𝟓𝟐𝟐 ± 𝟎, 𝟎𝟐𝟏
𝑆𝑦
𝒕𝒂𝒃𝒍𝒆𝒕𝒂
𝑥 1 1 (𝑦𝑜 −𝑦̅)2
𝑆𝑥𝑜 = √𝑚 + 𝑛 + 2 (10)
𝑏 𝑏2 ∑𝑖=1(𝑥𝑖 −𝑥̅ ) Para calcular el porcentaje de error se tuvo en cuenta que
cada tableta tiene 500 mg de acetaminofén y se hizo uso de
Donde Sxo es la desviación estándar de la muestra, m el la siguiente ecuación:
número de lecturas, n el número de puntos de la curva y yo
el promedio de las áreas de las muestras. |𝑥𝑒𝑥𝑝 −𝑥𝑟𝑒𝑎𝑙 |
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100 (14)
𝑥𝑟𝑒𝑎𝑙
𝐿𝑂𝐷 = 𝑎 + 3𝑆𝑦 (11)
𝑥 |458,522 − 500|
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100 = 𝟎, 𝟐𝟗𝟓 %
Donde LOD es el límite de detección. 500

Discusión de resultados.
𝐿𝑂𝑄 = 𝑎 + 10𝑆𝑦 (12)
𝑥
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus
Donde LOQ es el límite de cuantificación. siglas en inglés), es un tipo de cromatografía que combina
una fase móvil líquida y una fase estacionaria finamente
Los resultados se muestran a continuación: dividida1. A su vez, con el fin de obtener velocidades de
flujo satisfactorias, el líquido debe ser presurizado a varios
Tabla 5. Valores obtenidos del método de los mínimos cientos o más de libras por pulgada cuadrada1. En este tipo
cuadrados. de cromatografía, la separación se efectúa inyectando la
b 172,3259204 muestra en una columna empacada, generalmente usando
a 114,1979 una jeringa y una válvula de inyección. Seguidamente, la
r 0,999359423 muestra es arrastrada a la columna por la fase móvil y se
𝑺𝒚 35,80678194 produce una separación producto de las interacciones
𝒙
Sb 3,085530626 específicas de la muestra con la fase estacionaria y con la
Sa 30,5933279 fase móvil2, 3. Finalmente, los detectores normales de
ICb 172,326 ± 8,578 HPLC detectan la elución de un compuesto desde el
ICa 114,19 ± 85,049 extremo de la columna en función de algunas
LOD 0,62355706 ppm características físicas, tales como, la absorción de luz
LOQ 2,0778523 ppm ultravioleta, la capacidad de fluorescencia o la diferencia
en el índice de refracción entre el analito y la fase móvil2.
A partir de la ecuación de la recta obtenida (ecuación 13)
se determina la concentración de acetaminofén:
De acuerdo a lo anterior, como se observó se obtuvo un saturación9. En particular, el problema del aire disuelto es
contenido de acetaminofén en la tableta de (458,522 ± más grave cuando se mezclan disolventes (en general,
0,021 mg de acetaminofén/tableta) con un mínimo acetonitrilo o metanol con agua), porque la solubilidad de
porcentaje de error (0,295%). La exactitud del resultado aire en mezclas es menor que en la misma proporción de
debida en gran medida a la sensibilidad, reproducibilidad disolventes puros9. De este modo, un método alternativo
y a la capacidad de separación de especies no volátiles o para desgasificar consiste en burbujear con helio, este
termolábiles de la HPLC4. A diferencia de la cromatografía
método es muy utilizado y elimina el 80% del aire en
gaseosa, la inyección de la muestra supone un problema
solución; donde, el aire se sustituye con otro gas, helio,
menor en la cromatografía líquida puesto que se utilizan
volúmenes mayores (1 a 100 μL) y una válvula de pero su solubilidad es tal que la gasificación no representa
inyección5. La válvula de inyección (figura 1), permite un problema9.
bucles intercambiables de carga de muestra, cada uno de Por otra parte, cabe señalar que como fase móvil se utilizó
un volumen fijo, que van desde 2 a 1000 mL. Aquí, se una elución isocrática, la cual consiste en una elución que
utiliza una jeringa, en la posición de «carga», para lavar y utiliza un solo solvente o una mezcla de solventes de
llenar el bucle con nueva muestra a la presión atmosférica6. composición constante, en nuestro caso una mezcla de
Una vez llenado, el líquido que procede de la bomba a alta metanol-agua 50:50 (v/v)7, de manera general el uso de
presión pasa por el segmento de válvula situado en la parte mezclas de solventes permite obtener separaciones más
inferior izquierda. Cuando la válvula gira 60° en sentido eficientes que cuando se implementan solventes puros10.
contrario a las agujas del reloj, el contenido del bucle de Así mismo, como fase estacionaria se utilizó una columna
muestra es inyectado a alta presión en la columna6. Lo de acero inoxidable de 12 cm de largo y 4,6 mm de
anterior no ayuda solamente a la mejora de la diámetro interno, rellena con partículas porosas de
reproducibilidad de la inyección, sino que hace posible el octadesilsiloxano (C-18) (figura 2) de un diámetro de 5
uso de una curva de calibración normal5, 6. μm11, 12.

Figura 2. Estructura de la columna C-18.

La separación en esta columna se produce usualmente por

la interacción hidrofóbica, sin embargo, existen tres
Figura 1. Válvula de inyección usada en HPLC. mecanismos primarios de interacción que dictan el
comportamiento cromatográfico global13. Esto incluye: las
A su vez, otro factor que aportó en la obtención de interacciones hidrofóbicas (figura 3), que son interacciones
resultados óptimos es la eliminación de los gases disueltos de van Del Waals débiles y transitorias entre el ligando de
y el polvo de los líquidos. Los gases disueltos ocasionan fase estacionaria no polar (por ejemplo C18) y la
flujos inestables y ensanchamiento de bandas; además, las naturaleza hidrófoba de la molécula de muestra (por
burbujas y el polvo interfieren con el funcionamiento de la ejemplo, el esqueleto de carbono) 13. Las interacciones
mayoría de los detectores7. La eliminación de los gases y el polares (figura 4), que son interacciones que se producen
polvo puede efectuarse filtrando a través de un filtro entre silanoles residuales, grupos polares incrustados,
millipore (membrana de mezclas biológicamente inertes de grupos polares superficiales o grupos terminales polares en
acetato de celulosa y nitrato de celulosa) de 0,45 μm8. la fase estacionaria que interactúan con los grupos polares
Igualmente, es preciso mencionar que se hace necesario del analito a través de enlaces de hidrógeno y dipolo-
filtrar los solventes y eliminar el polvo y las partículas dipolo13. Finalmente, las interacciones iónicas (figura 5),
sólidas que estén en suspensión para evitar que dañen la que se producen entre grupos silanol residuales en la
bomba o los sistemas de inyección u obturen la columna7. superficie (Si-OH) que pueden desprotonarse y adquirir
una carga negativa, e interaccionar iónicamente con
Es importante señalar, que en el proceso de moléculas básicas de analito cargadas positivamente13. A
desgasificación, sólo se requiere eliminar el aire suficiente parte de estas tres interacciones, la selectividad estérica y
para que su concentración sea menor que los niveles de la forma de la molécula en ocasiones también pueden
contribuir a la interacción13.
 condición permite tener un menor valor de A en la
ecuación de Van Deemter (menor difusión por
arremolinamiento) y la segunda da como resultado un
valor pequeño de C (transporte de masa más rápido entre
las fases, necesario para tener gran rapidez de flujo)14. Así
mismo, la difusión molecular en los líquidos es lenta, y se
puede despreciar; por lo tanto, la transferencia de masa es
el determinante primario de H en HPLC14. Por último, el
uso de partículas pequeñas también reduce al mínimo la
longitud de la trayectoria de difusión, puesto que el tamaño
de los poros se reduce; lo anterior produce una
Figura 3. Ejemplo de interacción hidrofóbica.
disminución del ensanchamiento de la banda14.
Cabe agregar que, el pequeño diámetro de la columna (4.6
mm) permite una mayor sensibilidad; puesto que la rapidez
de flujo es proporcional al cuadrado del diámetro de la
columna, lo que ocasiona un menor flujo para columnas
angosta y por ende una menor dilución de la muestra, el
resultado es una mayor detección debido a que los
máximos son más angostos y altos15. A su vez, el detector
utilizado fue el detector ultravioleta, donde la celda
espectrofotométrica de flujo posee una configuración de
“celda Z”, en la que la trayectoria de la luz sigue el eje de
un tramo horizontal del flujo de efluente, para aumentar la
trayectoria de la absorbancia y la sensibilidad16.
Figura 4. Ejemplo de interacción polar.
Por último, una gran variedad de compuestos orgánicos se
pueden disolver en fases mixtas de agua-disolvente
orgánico para separarlos, de tal modo que la cromatografía
de fase inversa es, con mucho, la forma más difundida de
HPLC10. A su vez, en contraste con la cromatografía de
gas-líquido, donde la fase móvil gaseosa se encuentra fija y
las condiciones de separación se cambian variando la fase
estacionaria, en la cromatografía de partición líquido-
líquido se puede variar la fase móvil, esto es, la “fuerza del
disolvente”10. Para terminar, la cromatografía de líquidos
tiene un potencial de aplicaciones más amplio debido a que
85% de los compuestos conocidos no son lo
suficientemente volátiles o estables como para ser
Figura 5. Ejemplo de interacción por intercambio iónico.
separados por cromatografía de gases17.

Como se mencionó, la fase estacionaria que se utilizó,

Preguntas.
consistía en partículas porosas de octadesilsiloxano (C-18) a) ¿Cuál es la composición de la columna C-18 usada en
con un diámetro de 5 μm. De este modo, existen dos la práctica?
factores claves para realizar un análisis satisfactorio: el
primero es que el material de empaque debe estar R/: Resuelta en la discusión.
finamente dividido y tener una alta regularidad esférica
para permitir una óptima homogeneidad y densidad de b) ¿Por qué la cuantificación en HPLC con curva de
empaque; en segundo lugar, la fase estacionaria debe estar calibración de patrón externo es precisa mientras que en
en forma de una película delgada y uniforme, sin lugares cromatografía gaseosa es recomendable usar curva de
para el estancamiento14. Dicho lo anterior, la primera calibración con patrón interno?
 [6] Harris, D. C. (2013). Análisis Químico Cuantitativo
R/: Resuelta en la discusión. (3rd ed.). Barcelona, España: Editorial Reverté S.A. p 622,
623.
Conclusiones. [7] Skoog, D. A., Holler, J., & Crouch, S. R. (2008). Op.
Cit. p 818, 819.
 La exactitud de las mediciones cuantitativas en [8] Merk. (n.d.). Membrana MF-Millipore. Retrieved
cromatografía líquida se da gracias al uso de March 15, 2020, from
volúmenes de muestra superiores, al uso de una https://www.merckmillipore.com/CO/es/product/MF-
válvula de inyección y a la desgasificación y filtración Millipore-Membrane-Filter-0.45m-pore-size,MM_NF-
de las soluciones utilizadas. HAWP04700
 Los gases disueltos y las partículas de polvo ocasionan [9] Christian, G. D, & Álvarez, R. (2011). Química
flujos inestables, ensanchamiento de bandas e analítica (6th ed.). México: McGraw-Hill. p 609-610.
interfieren con el funcionamiento de la mayoría de los [10] Ibíd., p 614.
detectores. Además, pueden causar daños en la [11] Skoog, D. A., Holler, J., & Crouch, S. R. (2008). Op.
bomba, en los sistemas de inyección y taponar la Cit. p 821, 822.
columna. [12] Harris, D. C. (2013). Op. Cit. p 810 – 813.
 En una columna C-18, pueden darse interacciones de [13] ¿Qué es la HPLC y cómo funciona? - NotiJenck.
tres tipos: hidrofóbicas, polar y de intercambio iónico. (n.d.). Retrieved March 16, 2020, from
 Para un análisis por HPLC es importante implementar https://www.notijenck.com.ar/notas/que-es-la-hplc-y-
una columna en óptimas condiciones, donde el como-funciona
pequeño tamaño y regularidad esférica de las [14] Christian, G. D, & Álvarez, R. Op. Cit. p 605-607.
[15]. Ibíd., p 616.
partículas de empaque, junto con una película delgada
[16]. Ibíd., p 612-613.
y uniforme de la fase estacionaria, permiten una mayor [17]. Ibíd., p 604.
eficiencia y por ende a una mayor sensibilidad.
 Un diámetro pequeño de la columna permite una
mayor sensibilidad, ya que disminuye la dilución de la
muestra, obteniéndose pichos angostos y altos.
 A diferencia de CG en HPLC es posible modificar la
fase móvil, es decir, la “fuerza del disolvente”, para
modificar las condiciones de separación. Igualmente,
por HPLC si es posible analizar especies no volátiles o
termolábiles, lo que le confiere un mayor potencial de
aplicaciones con respecto a CG.

Referencias.
[1] Skoog, D. A., West, D. M., Holler, J., & Crouch, S. R.
(2015). Fundamentos de Química Analítica. Fundamentos
de química analítica (9th ed.). México D.F: Cengage
Learning, Inc. p 913.
[2] Chapter 32 High Performance Liquid Chromatography
- ppt download. (n.d.). Retrieved March 15, 2020, from
https://slideplayer.com/slide/6339952/
[3] Cromatografía de líquidos HPLC. (n.d.). Retrieved
March 15, 2020, from
http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-
qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc
[4] Skoog, D. A., Holler, J., & Crouch, S. R. (2008).
Principios de Análisis Instumental (6th ed.). México, D.F:
Cengage Learning, Inc. p 816.
[5] Skoog, D. A., West, D. M., Holler, J., & Crouch, S. R.
(2015). Op. Cit. p 917.