Técnicas de Imagen y Proteómicas Aplicadas Al Seguimiento de La Interacción Virus-Planta Huésped

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Universidad de Granada Estación Experimental

del Zaidín

Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas


al seguimiento de la interacción virus-planta
huésped

Mónica Pineda Dorado

Tesis Doctoral
Granada 2007
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Mónica Pineda Dorado
D.L.: Gr. 550 - 2007
ISBN: 978-84-338-4267-1
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al
seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Imaging and proteomic techniques for monitoring


the interactions virus-host plant

Memoria presentada para optar al grado de Doctora por la Licenciada en


Biología Mónica Pineda Dorado

Fdo.: Mónica Pineda Dorado

Con el Vº Bº de la directora del trabajo:

Fdo.: Matilde Barón Ayala


Dra. en Ciencias Biológicas
Investigador Científico del CSIC
Estación Experimental del Zaidín, Granada

Granada, 2007
El trabajo que se presenta en esta memoria de Tesis Doctoral ha sido
realizado en el Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de
Plantas de la Estación Experimental del Zaidín de Granada (Consejo Superior de
Investigaciones Científicas), con la ayuda de una beca predoctoral del Ministerio
de Educación y Ciencia y un contrato asociado a proyecto (BIO2004-04968-CO2-
02). El trabajo ha sido financiado por los proyectos del Programa Nacional de
Biotecnología BIO2001-1937-C02-02 y BIO2004-04968-CO2-02.

Los resultados de este trabajo han sido presentados en los siguientes


Congresos:

- XII Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología (SEF). Lloret de Mar,


Gerona (España). 2004.
- International Satellite Meeting: Photosynthesis and post-genomic era, “From
Biophysics to Molecular Biology, a path in the research of Photosystem II”. Trois-
Rivières, Québec (Canadá). 2004.
- 13th International Congress of Photosynthesis. Montreal (Canadá). 2004
- XXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular
(SEBBM). Lérida (España). 2004.
- Photosynthesis and stress; Biophysical and Biochemical Methods in
Photosynthesis. Research Central-European Conference. Brno (República Checa).
2005.
- Sustainability, Environmental Stress and the Bases of Plant Resistance. Sofía
(Bulgaria) 2006.

Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido expuestos por la
Licenciada M. Pineda en el seminario “Fluorescencia roja de la clorofila: Una
herramienta para la detección del estrés vegetal”, celebrado en la Estación
Experimental La Mayora (Algarrobo-Costa, Málaga) en marzo de 2006.
Algunos de los resultados de esta Tesis Doctoral han dado lugar a las
siguientes publicaciones:

- Sajnani, C., Pérez-Bueno, M.L., Pineda, M., García-Luque, I., Nedbal, L.,
Benedikty, Z., Roncel, M., Ortega, J.M., Ducruet, J.M., Römer, S. y Barón, M.
(2005) The chloroplast as target of biotic stress: damage and defence during viral
pathogenesis. En: Photosynthesis: Fundamental aspects to global perspectiva. Van
Der Est, A. y Bruce, D. eds. ACG Publishing, Lawrence, KS. pp 610-611.

- Chaerle, L., Pineda, M., Romero-Aranda, R., Van Der Straeten, D. y Barón, M.
(2006) Robotized thermal and chlorophyll fluorescence imaging of Pepper Mild
Mottle Virus infection in Nicotiana benthamiana. Plant Cell. Physiol. 47: 1323-
1336.
Durante todos estos años de realización de Tesis Doctoral, mucha gente ha
contribuido a que mi trabajo aquí en Granada o en los lugares donde he realizado
estancias, haya sido una de las mejores experiencias que me tenía reservada la vida.
Me gustaría dar las gracias a todos ellos, espero acordarme de todos y si alguno se
me queda en el tintero, ruego sea capaz de perdonarme, pues el olvido es fruto del
despiste y no de la falta de cariño. A todos: GRACIAS. Todas las cosas buenas que
se pueden encontrar en esta Tesis es consecuencia de vuestra ayuda, todos los
fallos son sólo míos.
Si estos agradecimientos tuvieran que seguir un orden cronológico, en primer
lugar me gustaría agradecerle a Cayo Ramos, buen profesor y mejor persona, el
que fuera el primero que “científicamente” confió en mí. Siempre trabajaré con la
esperanza de no defraudar esa confianza.
De la misma manera, me he esforzado por no defraudar la confianza de
aquella que a su vez confió en Cayo y me “adoptó” en su laboratorio, ofreciéndome
todo tipo de facilidades para que mi trabajo y mi vida en Granada fueran lo más
fáciles y agradables posible. Por eso, quiero agradecer a mi directora de Tesis,
Matilde Barón, todo el empeño que ha puesto para que este trabajo saliera adelante
contra viento y marea, por seguir pensando que podía sacar algo bueno de mi aun
cuando los resultados iniciales no fueron todo lo satisfactorios que yo hubiera
deseado, por darme la oportunidad de viajar y por seguir queriéndome en su
laboratorio.
Gracias a Carmen Lluch Plá, mi tutora de tercer ciclo porque su ayuda ha
sido enorme, haciendo fácil algo tan difícil como es superar con éxito toda la
burocracia que rodea a la Tesis.
Gracias a Isabel García Luque y Maite Serra, por recibirme con los brazos
abiertos en su laboratorio del CIB, por su gran apoyo logístico, por dar siempre
buenos consejos y por el material biológico cedido a nuestro laboratorio.
Gracias a Carlota y a Marisa, excelentes maestras en la poyata del
laboratorio. Su enorme calidad como científicas sólo se ve superada por su calidad
humana. Su amistad es uno de los tesoros que me llevo conmigo. Muchas gracias
por la paciencia, los consejos, las horas dedicadas a enseñarme, los ánimos, las
risas, por ser paño de lágrimas y por ¡la terapia de grupo!
Gracias a Abdel, por estar siempre dispuesto a regar mis plantas durante
vacaciones y fines de semana, por ayudarme con el medio de cultivo hidropónico y
por enseñarme tantas cosas de la cultura marroquí y de la religión musulmana.
Aunque no consiga convencerme de muchas de esas cosas, lo que sí ha conseguido
es que las respete aún más.
Gracias a Iratxe, porque aunque haya llegado hace poco tiempo, ha traído
frescura al laboratorio. Gracias por su compañía, por su ayuda y por estar siempre
dispuesta a darla.
Gracias a Juan José Lázaro, por su habitual buen humor y carácter, por
interesarse siempre por nuestro trabajo y apoyarlo, incluso compartiendo material
científico y dejándonos usar su laboratorio, donde utilizamos aparatos cuyo ruido
continuo no es precisamente agradable.
Gracias a Paquita, por aguantar con tan buen humor ese ruido y por su
inestimable ayuda con mis plantas, la bibliografía, las fotocopias, etc.
Gracias a Laura, porque siempre estaba dispuesta a compartir sus
conocimientos con los demás, y me ayudó mucho cuando quisimos que en nuestro
laboratorio se hiciera, además de Bioquímica, Biología Molecular.
Gracias a Sergio, compañero de penas y alegrías, siempre pendiente de mi
trabajo y animándome, lo que me he reído con él, y lo que he sufrido cuando me
martirizaba con el reggaeton.
Gracias a Iván, porque aunque también ha llegado hace poco, se ha acoplado
perfectamente a nosotros y se ha convertido en un miembro indispensable de
nuestra “familia”.
Gracias a Laci, uno de los mejores húngaros que hay, y eso que los hay muy
buenos. Gracias por tratarme tan bien en Budapest, donde me siento como en mi
casa y donde siempre quiero volver, por su ayuda con mi trabajo allí y aquí, por su
buen humor aunque las cosas se tuerzan en el laboratorio, y por su amistad.
Gracias miles a los compañeros de pasillo con los que tantísimas risas he
compartido, son los mejores: José Ángel, Juande, Antonio, Álvaro, Sol, Amada
(que no era del pasillo, pero como si lo fuera), Eloy..., cómo echo de menos a los
que están fuera. Gracias a Mari Carmen, José Carlos y Ana Vílchez por ser como
son. Gracias a María, Raúl y Antonio por ayudarme a recuperar archivos
importantes (vitales, debería decir). Gracias a todos los demás compañeros
“precarios” de la Estación Experimental del Zaidín, sois muchos para enumeraros,
me gustaría que todos os sintierais incluidos en este agradecimiento. Gracias a
Andrés Belver por prestarnos material de laboratorio y ayudarnos a encontrar el
material de centrífuga misteriosamente desaparecido. Gracias a Alberto Bago por
dejarme usar su microscopio con cámara de fotos que ayudó a que mi primera
publicación científica viera la luz, y a la ya doctora Adriana Marulanda por
enseñarme a usarlo, y por ser sufrida y cariñosa compañera en el largo camino del
doctorado. Gracias a Mariam y a Ana Chueca, y a Julio López Gorgé. Gracias a
Antonio Jesús Castro por darme un buen consejo sobre proteómica. Mis geles de
proteínas en el rango básico no existirían de no ser por él. Gracias a Tino Krell por
su ayuda en la parte de esta tesis dedicada a proteómica. Gracias a todos los
empleados de mantenimiento y del departamento de informática, y sobre todo, a
Antonio Melgar, por estar pendiente de las cámaras de cultivo, día y noche, fines
de semana, festivos, vacaciones…, gracias por todas esas veces que le he hecho
venir y él lo ha hecho sin rechistar.
Gracias a todos mis compañeros de fatigas del CIB, que hacían que a una le
entraran ganas de levantarse por las mañanas y enfrentarse al día a día cuando el
estado de ánimo no es el mejor. Gracias al “dostol” Alfonso, Margot, Miriam,
Gema, Antonio, Mercedes, Carolina y Pablo. Gracias por tantos y tan buenos
momentos.
Gracias a Pili, la mejor compañera de piso del mundo. Gracias por estar
siempre dispuesta a hablar y a escuchar, por ser como es. Siempre nos quedará el
Athenas… (aunque cada vez nos cobren un precio diferente).
Gracias a mi otra compañera de piso en Madrid, Esther, porque aunque no
pueda decir que es la mejor compañera de piso (entre otras cosas porque apenas
aparecía por allí), sí que puedo afirmar que cuando se le conoce se le quiere
incondicionalmente.
Gracias a Merce Romero, por ser mi guía en el mundo del intercambio de
gases. Su entusiasmo es contagioso, da gusto trabajar con ella. Gracias también a
Enrique Moriones, Jesús Navas y Rafael Fernández, así como a todos los que nos
juntábamos en el cuarto de becarios y alrededor de la mesa del desayuno en La
Mayora, en especial a Elena, mi compañera de tapas.
Gracias también a los becarios de Cayo: “Isas”, Luis y Clara Todos forman
un grupo excelente, con el que da gusto colaborar.
I would like to say thanks to Zuzana Benedikty for making easier my first
stay abroad in such a place like Nové Hrady (probably, Zuzana cannot understand
why I say “such a place”). Also, I should say thanks to Julie Soukupová and
Ladislav Nedbal, because they are very good hosts, always taking care about us
when we go to the Czech Republic, and helping us with FluorCam in Granada. In
this point, I have to thank also Martin Trtilek, our favourite fluorometer designer.
I would like to say thanks to Dominique Van Der Straeten and Laury Chaerle
for receiving me in their lab and for being so helpful with me.
I would like to say thanks to Eva Sarvari, Magdolna Droppa, Karoli Bokak
and Zoltan Zsigeti for making me feel like home in Budapest, for showing me very
interesting demonstrations, Balaton Lake, the excellent Hungarian food, and, over
everything, for being so very good people.
Gracias a toda mi familia y amigos, por todo ese apoyo que me dan y que
nunca me puede faltar. A la familia de Pepe, por preguntar siempre “eso que tú
haces, ¿para qué sirve?”. Especiales gracias a Antonio, Raquel, Karmele,
Guillermo y Miguel, porque siempre confiaron en mi. Especiales gracias también a
Paco, por interesarse siempre en lo que yo hacía, desde que estudiaba en la
universidad.
Hay cuatro personas para los que la palabra GRACIAS (así, con mayúsculas)
se me queda pequeña. Es imposible expresar con palabras mi enorme gratitud, pero
lo intentaré. A mis padres, Manuel y Carmen, GRACIAS por estar siempre ahí, por
empeñarse en que yo tuviera una educación universitaria, por querer siempre lo
mejor para mi. Me han dado todo lo mejor que unos padres puedan dar a sus hijos.
Lucho a diario por estar a la altura de sus expectativas y por no defraudarlos jamás,
pues se merecen todo lo mejor, y sin embargo, se conforman conmigo. A mi
hermana, Mari Carmen, GRACIAS por cuidar siempre de su hermana pequeña, por
no olvidar jamás un cumpleaños y por ser la mejor hermana que se puede desear y
de la que me gustaría poder disfrutar más. A mi pareja, Pepe, GRACIAS por dar
alegría a mi vida como sólo él sabe hacerlo, por todo lo que significa para mi,
pasado, presente, y sobre todo, futuro. Os quiero mucho a los cuatro, GRACIAS
por devolverme tanto amor.
A mis padres
A mi hermana
A Pe

“Si he conseguido ver más lejos


es porque me he aupado en hombros de gigantes”
Sir Isaac Newton
Índice

ÍNDICE

ABREVIATURAS.................................................................................................. 19
RESUMEN ............................................................................................................. 23
SUMMARY............................................................................................................ 25
A. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 27
A.1. El estrés en las plantas. La interacción planta-virus como
modelo de estrés biótico en el cloroplasto ................................................. 27
A.2. Técnicas biofísicas de imagen aplicadas al estudio de la
detección precoz del estrés vegetal ............................................................ 34
A.2.1. Termografía ........................................................................ 35
A.2.1.1. La transpiración: el origen del calor
desprendido por las plantas .............................................. 35
A.2.1.2. Termografía, una técnica de imagen................... 37
A.2.1.3. Aplicaciones de la termografía a la
biología vegetal ................................................................ 39
A.2.1.3.1. Selección de mutantes......................... 39
A.2.1.3.2. Cultivo de vegetales en el espacio ...... 39
A.2.1.3.3. Transporte hídrico en plantas.............. 40
A.2.1.3.4. Tolerancia a la congelación ................ 41
A.2.1.3.5. Calidad de los frutos ........................... 41
A.2.1.3.6. Alteraciones ocasionadas por
patógenos ............................................................. 41
A.2.1.3.7. Muerte celular ..................................... 43
A.2.1.3.8. Teledetección ...................................... 44
A.2.2. Fluorescencia verde-azul .................................................... 46
A.2.2.1. Origen de la fluorescencia verde-azul ................ 48
A.2.2.2. Cocientes de fluorescencia ................................. 50
A.2.2.3. Fluorescencia inducida por luz UV de imagen ... 51

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Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2.2.4. Aplicaciones de la fluorescencia inducida


por luz UV ........................................................................ 54
A.2.2.4.1. Exposición a la luz UV ....................... 54
A.2.2.4.2. Crecimiento y desarrollo..................... 55
A.2.2.4.3. Deficiencias y/o excesos
de minerales......................................................... 55
A.2.2.4.4. Calidad de los frutos ........................... 56
A.2.2.4.5. Estrés hídrico ...................................... 57
A.2.2.4.6. Temperatura........................................ 58
A.2.2.4.7. Hojas variegadas................................. 58
A.2.2.4.8. Respuestas a patógenos....................... 59
A.2.2.4.9. Teledetección...................................... 60
A.2.3. Fluorescencia roja de la clorofila ....................................... 61
A.2.3.1. Origen de la fluorescencia roja
de la clorofila.................................................................... 61
A.2.3.2. Cinética de inducción de la fluorescencia I:
el efecto Kautsky .............................................................. 63
A.2.3.3. Cinética de inducción de la fluorescencia II:
análisis de los coeficientes de quenching ......................... 65
A.2.3.4. Los componentes del quenching
no fotoquímico (NPQ)...................................................... 67
A.2.3.4.1. Quenching ligado a la
transición de estado o qT ..................................... 68
A.2.3.4.2. Quenching ligado a la
Fotoinhibición o qI .............................................. 68
A.2.3.4.3. Quenching dependiente del
gradiente de pH transtilacoidal o qE.................... 69
A.2.3.5. Medida de la emisión de fluorescencia roja de
la clorofila. Fluorímetros de imagen................................. 72

16
Índice

A.2.3.6. Aplicaciones de la fluorescencia de la


clorofila de imagen ........................................................... 74
A.2.3.6.1. Seguimiento de la infección
fúngica ................................................................. 74
A.2.3.6.2. Seguimiento de la infección
bacteriana............................................................. 78
A.2.3.6.3. Seguimiento de la infección viral ....... 79
A.2.3.6.4. Seguimiento de los daños
ocasionados por herbívoros ................................. 82
A.2.3.6.5. Seguimiento de los daños
post-cosecha......................................................... 82
A.2.3.6.6. Teledetección ...................................... 84
A.3. Proteómica de plantas......................................................................... 84
A.3.1. Espectrometía de masas...................................................... 86
A.3.1.1. Preparación de la muestra................................... 86
A.3.1.2. Separación proteica............................................. 87
A.3.1.3. Digestión e ionización de la muestra .................. 89
A.3.1.4. Separación e identificación de los iones............. 91
A.3.2. Proteómica de plantas empleando geles
bidimensionales: estudio de proteínas con punto
isoeléctrico en el rango básico (pH>7).......................................... 94
A.3.3. Proteómica de las interacciones planta-patógeno ............... 96
B. OBJETIVOS....................................................................................................... 99
OBJECTIVES .................................................................................................. 100
C. RESULTADOS ................................................................................................ 101
C.1. Robotized thermal and chlorophyll-fluorescence imaging of
pepper mild mottle virus infection in Nicotiana benthamiana................. 101
C.2. Multi-colour fluorescence imaging: an useful tool to
visualise systemic viral infection in plants............................................... 131

17
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

C.3. Conventional and combinatorial chlorophyll fluorescence


imaging of tobamovirus-infected plants................................................... 167
C.4. Changes induced by the pepper mild mottle
tobamovirus on the chloroplast proteome of
Nicotiana benthamiana ............................................................................ 191
D. DISCUSIÓN .................................................................................................... 225
E. CONCLUSIONES............................................................................................ 251
CONCLUDING REMARKS........................................................................... 253
F. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 255
G. ANEXOS ......................................................................................................... 303

18
Abreviaturas

ABREVIATURAS

1D: monodimensional
2D: bidimensional
2D-DIGE: electroforesis bidimensional empleando fluoróforos (2-D difference gel
electrophoresis)
ΦPSII: rendimiento cuántico del fotosistema II
AB: abaxial
ABA: ácido abscísico
AD: adaxial
AS: asintomática
BGF: fluorescencia verde-azul (blue-green fluorescence)
BN-PAGE: geles de poliacrilamida nativos azules (blue native gels)
CCD: charge-coupled device
CF1: porción catalítica de la ATP sintasa
Chl: clorofila
Chl a: clorofila a
Chl b: clorofila b
Chl-F: fluorescencia emitida por la clorofila
Chl-FI: fluorescencia emitida por la clorofila de imagen
CMV: virus del mosaico del pepino (cucumber mosaic virus)
CP: proteína de cubierta del virus (coat protein)
Cyt. f: citocromo f
dpi: días post-inoculación
F440: fluorescencia azul
F520: fluorescencia verde
F690: fluorescencia roja
F740: fluorescencia en el rojo lejano

19
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

FL-FIS: sistema de fluorescencia de imagen inducida por una lámpara de flases


(flash lamp - fluorescence imaging system)
F0: fluorescencia mínima
F’0: fluorescencia mínima alcanzada después de la inducción de la fluorescencia y
el apagado de la luz actínica.
Fig.: figura
FP: fluorescencia máxima alcanzada con luz actínica
FM: fluorescencia máxima en un estado adaptado a la oscuridad
F’M: fluorescencia máxima en un estado adaptado a la luz
FNR: ferredoxin-NADP+ reductasa
FTICR: Espectrómetro de masas (Fourier-transform ion cyclotron resonance)
FV: fluorescencia variable
FV/FM: máximo rendimiento cuántico del PSII
gox: glicolato oxidasa
GS: glutamina sintetasa
HPLC: cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid
chromatography)
HR: reacción hipersensible (hypersensitive reaction)
Hsp70: proteínas chaperonas pertenecientes a la familia heat shock de 70 kDa
IEF: isoelectoenfoque(isoelectric focusing)
IPG: gradiente inmobilizado de pH (immobilized pH gradient)
IT: trampa iónica (ion trap)
LC: cromatografía líquida (liquid chromatography)
LHC: complejo de antena (light harvesting complex)
Lhc: proteína de union a clorofila
LIF: fluorescencia inducida por láser (laser induced fluorescence)
MCFI: fluorescencia de imagen inducida por luz UV (multicolour fluorescence
imaging)
MS: espectrometría de masas (mass spectrometry)

20
Abreviaturas

MS/MS: espectrometría de masas en tándem


m/z: cociente masa/carga
NPQ: quenching no fotoquímico (non-photochemical quenching)
OEC: complejo de fotolisis/oxidación del agua (oxygen evolving complex)
PAM: pulse amplitude modulation
PGK: fosfoglicerato-quinasa
pI: punto isoeléctrico
pmf: fuerza protón motriz (proton motive force)
PMF: huella peptídica (peptide mass fingerprinting)
PMMoV: virus del moteado suave del pimiento (pepper mild mottle virus)
PMMoV-I y –S: cepas italiana y española del virus del moteado suave del pimiento
PR: (proteínas) relacionadas con la patogénesis (pathogenesis- related)
PRK: fosforibulo-quinasa
Psa-: proteínas pertenecientes al fotosistema I
Psb-: proteínas pertenecientes al fotosistema II
PSI: fotosistema I
PSII: fotosistema II
PTM: modificación post-traduccional (post-translational modification)
Q: cuadrupolo
qN: quenching no fotoquímico
qP: quenching fotoquímico
RbcL: subunidad mayor de la RuBisCO
RbcS: subunidad menor de la RuBisCO
RC: centro de reacción
Rca: RuBisCO activasa
ROS: especies reactivas de oxígeno (reactive oxygen species)
RuBisCO: ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa
S: sintomática
SA: ácido salicílico (salicylic acid)

21
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

SAR: respuesta sistémica adquirida (systemic acquired response)


SBPase: sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa
SDS: dodecilsulfato sódico (sodium dodecylsulfate)
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (sodium
dodecylsulfate - poliacrylamide gel electrophoresis)
SFBA: sedoheptulosa/fructosa-bisfosfato aldolasa
T: temperatura
t: tiempo
TL: termoluminiscencia
TOF: espectrómetro de masas mediante “tiempo de vuelo” (time-of-flight)
TOF/TOF: espectrómetro de masas mediante “tiempo de vuelo” en tándem
TMV: virus del mosaico del tabaco
UV: ultravioleta
WT: silvestre (wild type)

22
Resumen – Summary

RESUMEN

Trabajos previos de nuestros grupo han demostrado que la infección por el


virus del moteado suave del pimiento (PMMoV) en Nicotiana benthamiana induce
un descenso en los niveles de proteínas de la cadena transportadora de electrones y
del ciclo de Calvin, así como cambios en la expresión de diversos genes de
proteínas del cloroplasto, tanto de codificación nuclear como cloroplastídica. Las
medidas de termoluminiscencia mostraron alteraciones en el lado donador del PSII
y en el potencial asimilatorio, la inducción de un transporte cíclico de electrones en
torno al PSI para atender una mayor demanda de ATP en las plantas infectadas y la
presencia de estrés oxidativo. Las técnicas de captación de imágenes de
fluorescencia roja emitida por la clorofila demostraron ser de utilidad para realizar
un seguimiento de la infección por este tobamovirus y de los mecanismos de
defensa que el cloroplasto desarrolla durante la patogénesis.
Continuando con estos trabajos, en la presente Tesis Doctoral hemos
utilizado tres técnicas biofísicas de captación de imágenes para estudiar el estrés
causado por PMMoV en Nicotiana benthamiana. (i) La termografía de imagen
permitió el seguimiento de los cambios en el patrón de transpiración de las hojas
mediante la visualización de los cambio de temperatura en su superficie. Hemos
demostrado que las plantas infectadas sufrían un incremento progresivo de
temperatura en las hojas asintomáticas, que afectaba primero a las venas
principales y se extendía posteriormente al resto del limbo foliar; este fenómeno
precedía a la entrada del virus en este tipo de hojas. En las hojas sintomáticas, el
incremento de temperatura era homogéneo y no progresivo, siendo posterior a la
aparición de síntomas. En ambos casos, este aumento de temperatura se

23
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

correlacionó con un descenso de la transpiración de la hoja ocasionado por el cierre


estomático inducido por la infección viral. Las medidas de fluorescencia roja de la
clorofila de imagen, simultáneas a las térmicas, mostraron que las alteraciones en el
patrón de emisión de fluorescencia se correlacionan con la distribución del virus en
las hojas asintomáticas. (ii) Las técnicas de imagen de captación de fluorescencia
inducida por luz UV han registrado un aumento de la fluorescencia verde y azul,
muy acentuado en la cara abaxial de las hojas de plantas infectadas. Asimismo, el
análisis por HPLC de extractos de hoja nos ha permitido establecer que la sustancia
responsable de este aumento de fluorescencia verde y azul en las plantas infectadas
es el ácido clorogénico. Los cocientes de fluorescencia F440/F690 y F440/F740
han demostrado además ser adecuados para el seguimiento de la infección viral
tanto en la cara adaxial como abaxial de las hojas. (iii) Las técnicas de imagen de
detección de la fluorescencia roja de la clorofila nos han demostrado que, incluso
en ausencia de síntomas, el NPQ es un buen indicador de la infección viral.
Utilizando métodos estadísticos avanzados, hemos conseguido encontrar
parámetros obtenidos a partir de la cinética de inducción de la fluorescencia que, a
diferencia de los parámetros convencionales, no reflejan ningún proceso
fisiológico, pero sus imágenes permiten un seguimiento de la infección con
PMMoV y la detectan antes de la entrada del virus en las hojas asintomáticas.
La última parte del presente trabajo, continúa con la aproximación
proteómica al cloroplasto de Nicotiana benthamiana y el análisis de los cambios
que el virus induce en el mismo. Los geles bidimensionales, realizados en este caso
en el rango de pH 6-11, nos han permitido ampliar el número de proteínas
identificadas en el proteoma del cloroplasto de la planta huésped, y comprobar
cómo la infección por PMMoV lleva a un incremento o descenso en los niveles de
expresión de algunas de ellas.

24
Resumen – Summary

SUMMARY

In previous works our research group has shown that the infection of
Nicotiana benthamiana plants with the pepper mild mottle virus (PMMoV) induces
a decrease of the levels of some chloroplastidic proteins and their encoding
mRNAs. Thermoluminescence measurements showed the presence of oxidative
stress in infected plants, disturbances both on the PSII donor side and assimilatory
potential in the host plant, as well as the induction of a PSI cyclic electron transport
to attend the increasing ATP demand due to the viral infection. The chlorophyll
fluorescence imaging appeared also as an useful tool to follow plant virus
infection, as well as to analyse the protective mechanisms developed by the
chloroplast against biotic stress.
In the present Ph.D. work, we have used three imaging techniques to study
the impact of PMMoV in Nicotiana benthamiana. (i) Thermographic imaging
allowed the visualization of changes in the transpiration pattern of the leaves by
measuring their temperature. We could demonstrate that asymptomatic leaves from
infected plants suffered a progressive temperature increase, starting in the tissues
surrounded the main veins and expanding later to the rest of the leaf blade. This
effect preceded the virus entrance on the leaf. Temperature increment on
symptomatic leaves was homogeneous and occurred after symptom appearance. In
both cases, the temperature increase correlated with a transpiration decrease, due to
the viral induced-stomatal closure. Simultaneous measurements of red chlorophyll
fluorescence imaging showed alterations on the fluorescence pattern of the
asymptomatic leaves correlated with the viral entrance and spreading on these
leaves. (ii) Imaging UV-induced fluorescence showed an increment in the blue-

25
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

green fluorescence, especially in the abaxial surface of the leaves from infected
plants. HPLC analysis of leaf extract has shown that chlorogenic acid is the main
emitter of this kind of fluorescence. We have also shown that the fluorescence
ratios F440/F690 and F440/F740 were suitable for following the infection with
PMMoV in both adaxial and abaxial surfaces of the leaves. (iii) Red chlorophyll
fluorescence imaging showed that NPQ is a good indicator of the viral infection in
the absent of symptoms. We could detect the infection in the asymptomatic leaves
previously to viral immunolocalization by means of advanced statistical
approaches using data obtained from the fluorescence kinetics.
The last part of this work continues the analysis of the chloroplast proteome
of Nicotiana benthamiana as well as of the changes induced by the infection with
PMMoV. Using bidimensional electrophoresis in the pH range 6-11, we have
increased the number of proteins identified in this proteome and showed some of
them that were up-(PsbQ) or down-regulated (PSI proteins, RuBisCO large
subunit, ribosomal protein) by the viral infection.

26
A. Introducción

A. INTRODUCCIÓN

A.1. EL ESTRÉS EN LAS PLANTAS. LA INTERACCIÓN PLANTA-VIRUS


COMO MODELO DE ESTRÉS BIÓTICO EN EL CLOROPLASTO

El término estrés fue definido por primera vez en los años 30 por Hans Selye
(1936). Desde entonces, el concepto se ha ido modificando y mejorando hasta
elaborarse definiciones más específicas de estrés para las plantas. El estrés vegetal
se definiría como la alteración del estado fisiológico provocada por factores, de
naturaleza abiótica y biótica, que tienden a alterar el equilibrio (Gaspar et al. 2002),
o bien como cualquier condición desfavorable para el metabolismo, crecimiento y
desarrollo de los vegetales que, en la mayor parte de los casos, pueden recuperarse
cuando desaparecen los agentes estresantes (Lichtenthaler 1998). Sin embargo,
cuando se exceden los límites de tolerancia de la planta y se sobrepasa la capacidad
adaptativa de la misma, el resultado puede ser el daño permanente o incluso la
muerte (Larcher 1987). La respuesta de la planta al estrés consta de cuatro fases:
respuesta o reacción de alarma, resistencia, fase final o de agotamiento cuando se
sobrecarga la respuesta adaptativa de la planta y finalmente, la fase de regeneración
parcial o total de las funciones fisiológicas cuando el factor causante del estrés
desaparece (Lichtenthaler 1998). El concepto de estrés se ha extendido aún más
diferenciando entre eu-estrés y dis-estrés. El primero es un estrés suave que activa
el metabolismo celular y estimula la actividad fisiológica de la planta, siendo un
elemento positivo y una fuerza impulsora del crecimiento vegetal. En cambio, el
segundo es cualquier condición desfavorable, bien de alta intensidad o de larga
duración, que afecta negativamente a la planta, sobrecargando los mecanismos que

27
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

permiten hacer frente al estrés, causando daño y, eventualmente, la muerte. La


diferenciación entre eu y dis- estrés pone especial énfasis en que el estrés es
dependiente de la dosis y del tiempo (Lichtenthaler 1998). Finalmente, el estrés
actuaría como un factor de selección, una fuerza impulsora de la mejora de la
resistencia vegetal y de la evolución adaptativa de las plantas (Gaspar et al. 2002).
Los cloroplastos desempeñan un importante papel en la respuesta de defensa
de la planta frente a factores de estrés biótico y abiótico, que, por otra parte, pueden
desencadenar en los vegetales mecanismos de ajuste o reparación similares
(Goodman et al. 1986, Barón et al. 1995, Balachandran et al. 1997, Rahoutei et al.
2000). El fotosistema II (PSII), complejo de las membranas tilacoidales
responsable del desprendimiento de oxígeno fotosintético, es una pieza clave en la
respuesta del cloroplasto a perturbaciones ambientales que afectan su
funcionalidad, y presenta por ello numerosos mecanismos de adaptación a
condiciones adversas (Baker 1991, Barber 1995, 1998, Barón et al. 1995a y b,
Lichtenthaler 1996). Siendo la fotosíntesis el principal proceso metabólico de los
vegetales, no es de extrañar que la disminución de la fotosíntesis de las plantas
estresadas en general, o infectadas en particular, sea un fenómeno muy bien
documentado (Goodmann et al. 1986). Este fenómeno tiene lugar en plantas
infectadas por insectos (Lin et al. 1999, Zangerl et al. 2002, Aldea et al. 2006, Tang
et al. 2006), por hongos (Scholes et al. 1994, Scholes y Rolfe 1996, Chou et al.
2000, Meyer et al. 2001, Repka 2002, Berger et al. 2004, Scharte et al. 2005,
Swarbrick et al. 2006), por bacterias (Berger et al. 2007, Bonfig et al. 2006) y por
virus (Balachandran y Osmond 1994, Balachandran et al. 1994, 1997, Osmond et
al. 1998, Lohaus et al. 2000, Rahoutei et al. 2000, Funayama-Noguchi 2001).
Los mecanismos concretos por los que los virus inhiben la fotosíntesis en la
planta huésped son, en su mayoría, desconocidos. La interacción de virus de
distintos grupos con el cloroplasto y especialmente con el PSII ha sido estudiada
por diversos grupos (Naidu et al. 1984a y b, Goodman et al. 1986, Hodgson et al.
1989, Reinero y Beachy, 1986, 1989, Gunasinghe y Berger 1991, Banerjee et al.

28
A. Introducción

1995). La inhibición observada se atribuyó bien a la interacción de algún


componente viral, como la proteína de cubierta o CP, con el PSII (Reinero y
Beachy 1989, Banerjee et al. 1995) o, alternativamente, a un descenso en los
niveles de sus proteínas constituyentes (Lehto et al. 2003), principalmente las
relacionadas con el complejo de fotolisis/oxidación del agua (OEC) (Naidu et al.
1986, Takahashi et al. 1991, Takahashi y Ehara 1992, Rahoutei 2000, Rahoutei et
al. 2000, Pérez-Bueno 2003, Pérez-Bueno et al. 2004). Para algunos autores, la
interferencia de ciertos componentes virales con procesos como la síntesis o el
transporte al cloroplasto de proteínas del PSII y/o del ciclo de Benson-Calvin
codificadas en el núcleo, podría ser el mecanismo responsable de las alteraciones
en el cloroplasto durante la infección viral (Lindbeck et al. 1991, Dawson 1992).
Nuestro grupo, en colaboración con el de la Dra. Isabel García Luque
(Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid), ha estudiado durante los últimos
años el efecto de la infección viral en fotosíntesis y de los correspondientes
mecanismos de defensa en interacciones planta-virus compatibles (Barón et al.
1995a, Rahoutei et al. 1998, 1999, 2000, Pérez-Bueno 2003, Pérez-Bueno et al.
2004, Sajnani 2005, Pérez-Bueno et al. 2006). Utilizando el sistema modelo
Nicotiana benthamiana-tobamovirus (PMMoV: virus del moteado suave del
pimiento, PaMMV, virus del moteado suave de la páprika) hemos constatado que
el PSII es uno de los puntos principales de la acción viral y que el OEC es el
principal afectado, registrándose una disminución de la actividad oxigénica y una
inhibición preferente del transporte electrónico en el PSII (Barón et al. 1995a,
Rahoutei et al. 1999, 2000, Rahoutei 2000, Sajnani 2005). El análisis de los
cambios inducidos en el patrón proteico cloroplastídico reveló que las proteínas
constituyentes del OEC, PsbO, PsbP y PsbQ, codificadas por genes nucleares, son
las principales afectadas, pero de forma diferencial, detectándose una drástica
bajada en los niveles de acumulación de las dos últimas y de sus correspondientes
transcritos durante el desarrollo de los síntomas, sin observarse cambios en la
primera (Rahoutei et al. 1998, Rahoutei et al. 2000, Pérez-Bueno 2003). La

29
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

caracterización de las proteínas OEC durante la infección puso de manifiesto la


existencia de familias proteicas y multigénicas para las proteínas PsbO y PsbP en
Nicotiana benthamiana; además las isoformas de las proteínas PsbP aparecen
influenciadas de forma diferencial por la infección viral, indicando la existencia de
mecanismos reguladores de su expresión durante la patogénesis (Rahoutei et al.
1998, Pérez-Bueno 2003, Pérez-Bueno et al. 2004, Sajnani 2005). Este hecho
podría constituir una respuesta defensiva de la planta frente al estrés biótico.
Asimismo, se demostró que la regulación de las proteínas del OEC tiene lugar a
nivel transcripcional, comprobando además que la inhibición de los genes
cloroplastídicos es posterior a la de los genes nucleares (Pérez-Bueno 2003). Para
algunos autores (Takahashi et al. 1991, Takahashi y Ehara 1992.) la inhibición
parcial de la actividad oxigénica por un descenso diferencial en los polipéptidos
OEC podría estar asociada a los procesos moleculares primarios de expresión de
síntomas en algunas combinaciones huésped-parásito, y aportan además evidencias
junto con otros autores de que la síntesis de los miembros individuales de una
familia multigénica puede ser estimulada o reprimida por distintos estímulos
medioambientales (DeRocher y Bohnert 1993, Argüello-Astorga y Herrera-Estrella
1998).
Las medidas de termoluminiscencia (TL) realizadas sobre hojas de Nicotiana
benthamiana infectadas con PMMoV nos confirmaron también daños en el lado
donador del PSII, así como alteraciones en el potencial asimilatorio de las hojas y
la inducción de un transporte cíclico en torno al fotosistema I (PSI) para atender a
una mayor demanda de ATP durante la patogénesis (Rahoutei et al. 1999, Sajnani
2005). La mayor demanda energética del tejido infectado se corresponde con la
activación de los mecanismos de defensa y con la síntesis de proteínas inducidas
por el estrés (Ayres et al. 1996, Balachandran et al. 1997), así como con el empleo
de la maquinaria celular del huésped por parte del virus para replicarse (Lucas et al.
1993). Otros grupos de investigación apoyan nuestras conclusiones sobre el daño
en el lado donador del PSII debido a la infección viral (Bertamini et al. 2004),

30
A. Introducción

demostrando que incluso los niveles de la proteína PsbO pueden descender debido
a la infección por TMV (virus del mosaico del tabaco), cuya helicasa muestra gran
afinidad por esta proteína del OEC (Abbink et al. 2002). Nuestro grupo también ha
demostrado que el estrés abiótico es capaz de producir cambios en la acumulación
de las proteínas de este complejo (Barón et al. 1995a).
Además de la bajada en la eficiencia fotosintética, en la mayoría de
interacciones planta-patógeno compatibles, también tiene lugar un incremento en
respiración, cambios en la partición del fotosintato y alteraciones en la
acumulación de almidón (Lucas et al. 1993, Shalitin y Wolf 2000, Hull 2002,
Maule et al. 2002).
El estudio de la acción de los virus vegetales más allá de la fase luminosa de
la fotosíntesis ha demostrado que en las plantas infectadas se producen graves
alteraciones en el metabolismo de carbohidratos (acumulación de almidón y
azúcares solubles en hoja), y en su transporte a través del floema, que podrían
afectar la expresión génica y rutas metabólicas del huésped, y llevar a una síntesis
deficiente de complejos, enzimas y pigmentos fotosintéticos en la planta infectada
(Scholes et al. 1994, Wright et al. 1995b, Havelda y Maule 2000, Herbers et al.
2000). Los azúcares, directa o indirectamente, provocan la retroinhibición de la
fotosíntesis (Krapp y Stitt 1995), la regulación de la expresión génica (Herbers et
al. 2000) e incluso la represión transcripcional de genes fotosintéticos (Sheen et al
1990). La iluminación de tejidos con alto contenido en hidratos de carbono puede
llevar a una sobre-reducción de la cadena de transporte electrónico y a la
desorganización del aparato fotosintético a través de efectos selectivos sobre la
expresión génica de proteínas de membrana y estromáticas (Maxwell et al. 1995).
Algunos autores proponen que las señales redox procedentes del cloroplasto y el
contenido de azúcares son reguladores activos de la expresión de genes nucleares
codificadores de proteínas cloroplastídicas (Oswald et al. 2001), mientras que para
otros es todavía una incógnita si el control de la expresión génica en las plantas
infectadas se realiza por señales redox o por los niveles de carbohidratos (Osmond

31
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

et al. 1998, Lohaus et al. 2000). Herbers et al. (2000) muestran, en fases tempranas
de la infección con potyvirus, una regulación transcripcional de genes cab (que
codifican proteínas de unión a clorofila a y b) como la proteína del complejo mayor
de antena del PSII (LHCII), y el gen rbcS (subunidad menor de la ribulosa 1,5-
bifosfato carboxilasa/oxigenasa) de la RuBisCO. Para estos autores, los azúcares
también podrían actuar como amplificadores de las respuestas de defensa durante
la interacción planta-patógeno.
Además, se ha visto que la infección viral puede afectar procesos como los
de apertura estomática (Chaerle et al. 1999, Chaerle et al. 2004) o difusión en el
mesófilo, que controlan la asimilación de CO2 (Sampol et al. 2003). También, la
infección viral puede afectar al metabolismo secundario vegetal, propiciando la
acumulación de compuestos de naturaleza fenólica (Nicholson y Hammerschmidt
1992, Dixon y Paiva, 1995, Kofalvi y Nassuth 1995, Dixon et al. 2002) que
absorben luz ultravioleta y/o fluorescen en el verde o el azul (Buschmann y
Lichtenthaler 1998, Cerovic 1999, Buschmann et al. 2000, Balogun y Teraoka
2004). Estudios de nuestro grupo con hojas de Nicotiana benthamiana infectadas
con PMMoV e iluminadas con luz ultravioleta confirman estos datos (Sajnani
2005).
Actualmente, al aparato fotosintético se le asigna una función dual, fijando
por un lado la energía solar y por otro, actuando como sensor ambiental mediante
la generación de señales redox que pueden actuar en conexión con las de otros
orgánulos celulares, regulando la expresión de los genes fotosintéticos
cloroplastídicos y nucleares en respuesta a los distintos factores de estrés
(Pfannschmidt 2003). El cloroplasto está implicado en el equilibrio entre procesos
fotoprotectores y procesos fotoinhibitorios. Los primeros tratan de disipar la
energía de excitación excesiva que no puede utilizarse en fotosíntesis, mientras que
los segundos tienen lugar cuando se excede la capacidad de fotoprotección y
antioxidante de la planta y se inicia la fotooxidación de los complejos
fotosintéticos, fundamentalmente el PSII, por una superproducción de especies

32
A. Introducción

reactivas de oxígeno (ROS) (van Kooten et al. 1990, Balachandran y Osmond


1994, Balachandran et al. 1997, Rahoutei et al. 2000, Chow et al. 2002). Este
hecho es de suma importancia puesto que el proceso de infección por patógenos
está modulado específicamente por las condiciones de iluminación durante el
crecimiento vegetal (Karpinski et al. 2003). El cloroplasto ha de adaptarse a las
altas y bajas intensidades lumínicas para optimizar el uso de la luz absorbida en
fotosíntesis, mantener un estado energético y un balance NADPH/ATP óptimos y
minimizar la formación de ROS que se derivan de estos procesos. Si bien estos
ROS pueden ser potencialmente dañinos, son señales necesarias para inducir las
respuestas de defensa del vegetal, como la respuesta sistémica adquirida (SAR)
(Karpinsky et al. 1999) o la regulación a la baja de la actividad del PSII
(Mullineaux y Karpinsky 2002, Fryer et al. 2003); estas señalizaciones, por otra
parte, pueden ser comunes a estreses de tipo biótico y abiótico (Dat et al. 2000).
Una de las principales características de la infección por patógenos es que no
hay una alteración uniforme del metabolismo foliar, de la actividad fotosintética ni
del desarrollo de síntomas. El diseño de sistemas de captación de imagen de
fluorescencia (azul, verde, roja o en el rojo lejano), radiación infrarroja o térmica,
autoluminiscencia (emisión espontánea de fotones), bioluminiscencia
(luminiscencia emitida por reacciones enzimáticas), o reflectancia (espectro visual)
ha permitido estudiar la heterogeneidad de la respuesta vegetal al estrés
(Lichtenthaler y Miehé 1997, Buschmann y Lichtenthaler 1998, Cerovic et al.
1999, Buschmann et al. 2000, Chaerle y Van Der Straeten 2000, 2001, Havaux et
al. 2006, Chaerle et al. 2007a). Estos sistemas tienen la ventaja de ser métodos de
diagnóstico no invasivos y pre-sintomáticos. Nuestro grupo, (Pérez-Bueno 2003,
Sajnani 2005, Pérez-Bueno et al. 2006, Chaerle et al. 2006) ha realizado notables
aportaciones en este campo utilizando técnicas de fluorescencia roja de imagen
para el seguimiento de la infección por PMMoV en N. benthamiana. En el presente
trabajo se amplían estos estudios incorporando nuevas técnicas de imagen para el
seguimiento de esa interacción huésped-patógeno.

33
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2. TÉCNICAS BIOFÍSICAS DE IMAGEN APLICADAS AL ESTUDIO DE


LA DETECCIÓN PRECOZ DEL ESTRÉS VEGETAL

Cuando una planta muestra síntomas visibles de estrés, puede estar ya


dañada irreversiblemente. Tradicionalmente, los cambios inducidos por factores de
estrés en las plantas han sido detectados mediante un muestreo destructivo, seguido
de una serie de tediosas determinaciones bioquímicas y moleculares, lo que puede
retrasar varios días un diagnóstico (Lichtenthaler 2003), y ocasionar pérdidas de
cosechas enteras. Por este motivo, se buscaron técnicas alternativas que permitieran
una detección precoz del estrés vegetal y los grandes avances tecnológicos de las
últimas décadas han acudido en ayuda de bioquímicos, fisiólogos y patólogos
vegetales. Actualmente, diversas técnicas biofísicas que permiten la detección
inmediata de las situaciones de estrés antes de que los síntomas visuales aparezcan
y los efectos adversos se establezcan, están emergiendo como herramientas
prometedoras para la gestión de los cultivos. Especial atención merecen las
técnicas de imagen, debido a la información espacial que proporcionan, puesto que
las situaciones de estrés generalmente no afectan por igual a toda la superficie de la
planta. Según Lichtenthaler (2003), en las etapas iniciales del estrés ya aparecen
gradientes metabólicos y fotosintéticos en las hojas de las plantas afectadas.
Técnicas de imagen como la fluorescencia y la termografía han demostrado su
poder para detectar cambios inducidos por el estrés en el patrón de emisión de luz
de las hojas (Chaerle y Van Der Straeten 2001, Nedbal y Whitmarsh 2004, Chaerle
et al. 2007a). Pueden ser aplicadas para detectar el estrés en un estadio temprano,
tanto a escala microscópica como en teledetección, y ser de utilidad para la
búsqueda en los cultivos de poblaciones de mutantes que muestren mayor
tolerancia al estrés (Chaerle y Van Der Straeten 2000, 2001, Chaerle et al. 2007a).
En los siguientes apartados se detallarán los avances experimentados en la
aplicación de las técnicas de fluorescencia y termografía. Describiremos el origen
de estas emisiones lumínicas, la metodología empleada para registrarlas y su

34
A. Introducción

utilidad como detectores precoces del estrés vegetal, haciendo especial hincapié en
las técnicas de imagen empleadas en la elaboración de la presente Tesis Doctoral.

A.2.1. Termografía
A menudo pensamos en el concepto de temperatura como la medición del
calor desprendido por el cuerpo de los animales; de hecho, solemos clasificarlos
como de “sangre fría” o “sangre caliente”. Sin embargo, nos es más difícil
relacionar la temperatura con el mundo vegetal, aún cuando es posible medir la
temperatura de la superficie de las hojas mediante la detección de la radiación
infrarroja que todos los objetos, a temperatura ambiente, emiten con una longitud
de onda de 8-14 µm (Chaerle y Van Der Straeten 2000, 2001). La termografía es la
técnica que posibilita la medida de la radiación infrarroja y se ha aplicado
extensamente en medicina (para un breve resumen de muchas de sus aplicaciones
que escapan a los objetivos de esta tesis, ver Chaerle 2000) y es ampliamente
utilizada por los ejércitos para detectar, mediante el calor que emiten, objetos en
situaciones de escasa o nula visibilidad (www.militaryinfrared.com).
El calor desprendido por el metabolismo vegetal tiene un papel muy
secundario en la temperatura de los vegetales, con una notable excepción: las flores
de las plantas “termogénicas”, la mayoría pertenecientes a la familia Araceae, que
pueden controlar su temperatura mediante el control de la respiración (Chaerle
2000, Chaerle y Van Der Straeten 2000, 2001). Los cambios en la temperatura de
las hojas en plantas no termogénicas resultan, principalmente, de alteraciones en la
transpiración y dependen, por tanto, de la conductancia estomática (Fuchs y Tanner
1966, Jones et al. 1998).

A.2.1.1. La transpiración: el origen del calor desprendido por las plantas


La transpiración en las plantas es un proceso que está finamente regulado
para evitar las pérdidas excesivas de agua, al tiempo que se maximiza el
intercambio de gases necesario para la fotosíntesis. La regulación se lleva a cabo en

35
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

las células oclusivas de los estomas. Cuando están abiertos, en la evaporación de


agua, al igual que la sudoración en animales, se consume gran cantidad de calor y
la consecuencia es la refrigeración de los tejidos y un descenso en la temperatura
de la superficie foliar. Por el contrario, cuando los estomas se cierran, ya sea
durante la noche o ante situaciones de estrés como la falta de agua, la temperatura
de la hoja aumenta debido a la falta de transpiración (Fig. 1).

H 2O ESTOMAS
CERRADOS
-
-
 T hoja
-

CO2

O2
CO2
-

O2 -

H2O -

ESTOMAS
ABIERTOS  T hoja

Fig. 1: Relación entre apertura estomática, transpiración y temperatura de las hojas. T: temperatura.

La correlación entre temperatura de la superficie foliar y transpiración, así


como entre temperatura y conductancia estomática ha sido demostrada por diversos
autores. Chaerle et al. (1999) mostraron, mediante medidas simultáneas de
porometría y termografía, cambios paralelos en la temperatura y transpiración de la
hoja, durante la reacción hipersensible (HR) en plantas de tabaco infectadas con
TMV. Mediante el empleo de un IRGA (infrared gas analyser), Chaerle et al.
(2001) establecieron que los cambios en la temperatura de las hojas tras sufrir
muerte celular están precedidos por el cierre estomático del tejido colapsado. El
uso de peelings de la epidermis y de impresiones epidérmicas ha sido igualmente

36
A. Introducción

de utilidad para relacionar el comportamiento de los estomas y los consecuentes


cambios en la temperatura de las hojas (Boccara et al. 2001). Porómetros o IRGAs
e impresiones epidérmicas también han sido usados simultáneamente a tal fin
(Lindenthal et al. 2005, Oerke et al. 2006). Jones (1999) demostró que la
termografía de imagen tiene suficiente resolución espacial como para proporcionar
información sobre la variabilidad de la conductancia estomática a lo largo de la
superficie de una hoja de Phaseolus vulgaris. Más recientemente, Jones (2004a y
b) subraya que los recientes avances de la termografía la capacitan para el estudio
de los cambios en la conductancia estomática, y señala que “la termografía ha
demostrado ser más que un método para obtener imágenes bonitas; posee
particulares ventajas para el análisis cuantitativo de la información fisiológica
espacial y dinámica”.

A.2.1.2. Termografía, una técnica de imagen


Como veremos a lo largo de toda la presente Tesis Doctoral, las técnicas de
imagen proporcionan una mayor información que las medidas puntuales. Su gran
poder resolutivo permite mostrar el valor que un determinado parámetro presenta
en todos los puntos de la superficie de una hoja, e incluso en plantas completas. De
esta forma, podemos visualizar gradientes o cambios locales que, con mediciones
puntuales, pasarían desapercibidos. En el caso de la termografía, el desarrollo de
esta técnica ha permitido visualizar imágenes de la temperatura de los objetos.
En termografía de imagen, la radiación infrarroja emitida por todo objeto con
temperatura superior al cero absoluto, es captada por un detector sensible a
longitudes de onda en el rango de los 4-14 µm. Para objetos que poseen una
temperatura parecida a la del ambiente, se emplean detectores sensibles a λ=8-14
µm; las cámaras infrarrojas que operan con λ=4-8 µm se utilizan para el
seguimiento de procesos a altas temperaturas. Un software apropiado transforma
esta radiación en imágenes termales donde la temperatura del objeto es mostrada
aplicando una escala de falsos colores. Los sistemas de termografía usados

37
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

actualmente tienen una resolución entre 0,08-0,03ºC. El sistema de termografía


empleado en la realización de la presente tesis doctoral, poseía una resolución de
0,08ºC y tenía la ventaja adicional de estar acoplado a una cámara CCD (charge-
coupled device) que captaba imágenes de fluorescencia roja de la clorofila (Chl-F)
(véase apartados A.2.3.5. y C.1.) y una cámara de vídeo que captaba imágenes en
color de la reflectancia de las hojas. Estas tres cámaras (infrarroja, CCD y vídeo)
estaban armadas en el brazo de un robot que se movía automáticamente tras
programar en el ordenador las coordenadas correspondientes a las posiciones de las
hojas (Fig. 2). Debido a que el cierre estomático también afecta a la fotosíntesis, las
imágenes de Chl-F son complementarias a las de termografía (Chaerle 2000,
Chaerle y Van Der Straeten 2000, 2001, Chaerle et al. 2007a). Este extremo fue
confirmado por Daley et al. (1989) y Omasa y Takayama (2003), demostrando que
una vez superado un determinado umbral de luz, el cierre estomático inducido por
la aplicación exógena de ácido abscísico (ABA) y calculado a partir de imágenes
térmicas, ocasiona un incremento del quenching no fotoquímico y un descenso del
fotoquímico (calculados a partir de la Chl-F de imagen).

Fig. 2: A la izquierda, brazo del robot para la obtención de imágenes termales, de reflectancia y de
Chl-FI, perteneciente al grupo de la Dra. Dominique van der Straeten, de la Universidad de Gante. A
la derecha, detalle de las cámaras armadas en el brazo del robot: de fluorescencia, de termografía y de
reflectancia (de izquierda a derecha, respectivamente).

38
A. Introducción

A.2.1.3. Aplicaciones de la termografía a la biología vegetal


A.2.1.3.1. Selección de mutantes. La temperatura de las hojas puede usarse
como indicador en la detección de mutantes con el control de los estomas alterado.
Mutantes de cebada con estomas insensibles a ABA muestran una temperatura
significativamente más baja tras un tratamiento con esta hormona que el tipo
salvaje, y son posibles de detectar entre una amplia población de plantas gracias a
la termografía (Raskin y Ladyman 1988). Más recientemente, la termografía ha
posibilitado el aislamiento de dos mutantes de Arabidopsis (ost1-1 y ost1-2, Fig. 3)
que aparecían con temperaturas más bajas que el tipo silvestre bajo estrés hídrico
(Merlot et al 2002, y revisado en Wang et al. 2004). El gen ost1 está implicado en
la ruta de señalización del ABA (Mustilli et al. 2002). Boccara et al. (2001)
propusieron la termografía como una técnica útil para la selección de mutantes
afectados en la respiración, al relacionar la respuesta de un mutante mitocondrial
tras la infección con un elicitor bacteriano, con el descenso de su temperatura
foliar. La termografía también podría usarse para la búsqueda de mutantes en la
ruta de señalización de dichos elicitores.
Temperatura de la hoja (ºC)

control Fig. 3: Los mutantes de


Arabidopsis ost1-1 y ost1-2
fueron aislados usando
ost1-1
termografía de imagen
(tomado de Mustilli et al.
ost1-2 2002).

A.2.1.3.2. Cultivo de vegetales en el espacio. La conquista del espacio no


será posible sin las plantas. Los largos viajes espaciales requieren una continua
producción de alimentos, conversión de CO2 en O2 y la purificación del agua,
necesidades que las plantas pueden cubrir. Sin embargo, el crecimiento de las
mismas fuera de nuestro planeta está comprometido, debido a la escasa convección

39
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

del aire bajo condiciones de microgravedad, que limita el intercambio de calor y


gases entre las hojas y el aire, reduciéndose así el crecimiento vegetal. Mediante el
estudio termográfico de plantas en vuelos parabólicos se ha demostrado que la
temperatura de las hojas aumenta en condiciones de microgravedad (Fig. 4). El
objetivo de estas investigaciones es fabricar cámaras cerradas con sistemas de
circulación del aire (space plant box) que permitan el cultivo de plantas durante
largos periodos de tiempo bajo condiciones de microgravedad en el espacio (Kitaya
et al. 2001, 2003).

T (ºC)

1.0
Gravedad (g)

2.0

0.01

4 8 12 16 20
Tiempo (s) de caída libre

Fig. 4: Relación entre temperatura de las hojas y gravedad (tomado de Kitaya et al. 2003).

A.2.1.3.3. Transporte hídrico en plantas. La termografía de imagen ha sido


usada para detectar anomalías en el ascenso de la savia en leñosas, ya que esta
técnica permite la visualización de las variaciones térmicas a lo largo de los vasos
de los árboles en tiempo real (Alfondillo et al. 1993). La discontinuidad de los
tejidos vasculares produce una diferencia en la conductividad termal que provoca
una distribución no homogénea de las temperaturas superficiales. La termografía
también se ha aplicado en la detección de las cavitaciones provocadas por hongos
fitopatógenos en sicomoros (Acer pseudoplatanus) (Catena 1992).

40
A. Introducción

A.2.1.3.4. Tolerancia a la congelación. La congelación es un factor de estrés


importante en determinados climas, que inflinge daños económicos en cultivos y
limita la distribución de los mismos, así como la de especies silvestres. La
supervivencia de estas plantas depende de su habilidad para tolerar algún grado de
congelación. Por tanto, entender el fenómeno de la congelación y cómo perjudica a
las plantas es de gran importancia. Las mejoras en los métodos de imagen, entre los
que destaca la termografía, que incluso puede suministrar imágenes en tiempo real,
están proporcionando una descripción precisa de la naturaleza del daño que
ocasiona, dónde se inicia y cómo avanza el hielo, así como su tasa de crecimiento
(Wisniewski et al. 1997, Pearce y Fuller 2001, Pearce 2001). La termografía ha
proporcionado información sobre el efecto de diversas sustancias en la nucleación
del hielo (Gusta et al. 2004) y parece ser una buena herramienta para ensayar
estrategias de protección contra la congelación.

A.2.1.3.5. Calidad de los frutos. La monitorización no destructiva post-


cosecha de las frutas y los vegetales es importante para su control de calidad. La
termografía infrarroja es apta para la evaluación del daño superficial que afecta
negativamente a la vida del fruto (Tollner et al. 1993). El secado de los frutos es un
proceso que puede alterar su calidad y vida media, si se aplica más calor y durante
más tiempo de los necesarios. La termografía de imagen se ha probado para
controlar la temperatura de la superficie de las naranjas valencianas durante el
proceso de secado, permitiendo así determinar el momento en el que el proceso ha
acabado sin alterar la calidad del fruto (Fito et al. 2004).

A.2.1.3.6. Alteraciones ocasionadas por patógenos. El estudio mediante


termografía de imagen de la HR en plantas de tabaco resistentes (Nicotiana
tabacum cv. Xanthi NN) e infectadas con TMV, reveló un incremento
presintomático de la temperatura de la superficie de las hojas, que coincidía con la
posterior lesión necrótica característica (Fig. 5A). Dicho incremento de

41
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

temperatura se asoció a un cierre estomático localizado, ocasionado por la síntesis


de ácido salicílico (SA) ligado a la HR. La desaparición de este efecto en la
oscuridad se corresponde con un cierre estomático generalizado, que enmascara las
diferencias locales de transpiración (Chaerle et al. 1999). Previamente se había
demostrado que el SA provoca un incremento en la ruta respiratoria alternativa en
plantas termogénicas, elevando la temperatura de las mismas (Raskin et al. 1987);
y que la aplicación exógena de SA en tejidos no termogénicos eleva la temperatura
de los mismos, debido al incremento de la respiración total y de la alternativa (Van
Der Straeten et al. 1995). La infección por el hongo Phyllosticta en varias especies
de coníferas, también ocasiona un aumento de temperatura en las zonas
circundantes al punto de infección (Aldea et al. 2006), y el cierre estomático se
asocia a un descenso en la eficiencia fotosintética del PSII y a un incremento del
quenching no fotoquímico (NPQ). Estos mismos autores describen también un
aumento de temperatura en las lesiones producidas por insectos herbívoros, debido
a la desecación que sufren los tejidos tras ser devorados.

A B
C
4h
26 h
3 días

13 h 39 h

5 días

73 h 8 días
Térmica Vídeo Reflectancia Térmica Térmica Vídeo

Fig. 5: A) Las lesiones necróticas producidas por TMV en hojas de tabaco Xanthi XX y B) las
espontáneas en tabaco transgénico bO, se detectan presintomáticamente gracias a la termografía de
imagen (tomado de Chaerle 2000). C) El descenso de temperatura ocasionado por P. cubensis en
pepino también se detecta presintomáticamente gracias a esta técnica (tomado de Lindenthal et al.
2005).

42
A. Introducción

El efecto opuesto al de TMV en tabaco resistente, se registró en plantas de


Nicotiana sylvestris inoculadas con un elicitor bacteriano (harpin) (Boccara et al.
2001). El descenso de temperatura se correlacionó con un mayor número de
estomas abiertos. La discrepancia entre los efectos de TMV y el elicitor bacteriano
puede deberse que la resistencia vegetal a virus y a bacterias sigan rutas diferentes
(Murphy et al. 1999). Chaerle et al. (2004) encontraron que la infección por
Cercospora beticola en plantas de remolacha también produce un descenso de
temperatura, que en esta ocasión fue atribuido a que el hongo utiliza los estomas
como puerta de entrada al mesófilo, o bien a la producción de toxinas fúngicas que
afectan a la polaridad/permeabilidad de las membranas de las células epidérmicas.
Los mismos principios pueden aplicarse al descenso presintomático de temperatura
(Fig. 5C) registrado mediante termografía en plantas de pepino tras la infección por
el hongo Pseudoperonospora cubensis (Lindenthal et al. 2005, Oerke et al. 2006).
También se ha registrado un descenso de temperatura en las lesiones provocadas
por himenópteros, dípteros y ácaros en las hojas de varias coníferas (Aldea et al.
2006), así como en el tejido circundante a las mordeduras de larvas de lepidópteros
en hojas de Arabidopsis thaliana (Tang et al. 2006). Esta alteración en el transporte
hídrico podría incrementar el transporte de nutrientes hacia el patógeno en
desarrollo (Aldea et al. 2006).
La termografía también se empleó en el estudio de los tumores que
Agrobacterium tumefaciens causa en plantas de Ricinus communis, estableciéndose
que el tumor es un sumidero patológico en la planta huésped (Schurr et al. 1996).

A.2.1.3.7. Muerte celular. Existen mutantes de arroz, maíz y Arabidopsis


capaces de mimetizar las lesiones necróticas producidas por patógenos sin la
necesidad de que éstos intervengan (lsd, lesions simulating disease). Además,
algunas plantas transgénicas forman lesiones necróticas espontáneas parecidas a la
HR y acumulan ácido salicílico. Chaerle et al. (2001) realizaron el seguimiento
mediante termografía de imagen de la muerte celular en el mutante lsd2 de

43
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Arabidopsis y en tabaco bO transgénico, que sobreexpresa una bacterio-opsina. Las


lesiones localizadas, desencadenadas por un cambio en la temperatura de
crecimiento, eran similares a la HR producidas por TMV en tabaco, y la respuesta
térmica presintomática era la misma (Fig. 5B), comprobándose asimismo que el
cierre estomático precedía al colapso de los tejidos. En el caso del tabaco bO,
algunas hojas mostraban una respuesta térmica uniforme.

A.2.1.3.8. Teledetección. La teledetección es un método de adquisición e


interpretación de las medidas realizadas sobre un objeto sin mediar contacto físico
entre éste y el equipo de medida. El objeto puede ser analizado en multitud de
ocasiones sin que sufra daños. Las propiedades específicas de la vegetación, sana o
bajo condiciones de estrés, condicionan la cantidad y la calidad de la radiación
reflejada o emitida por hojas y cultivos (Nilsson 1995a y b). El término
teledetección está restringido a los instrumentos que miden la radiación
electromagnética emitida o reflejada por un objeto en varias partes del espectro:
ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. Las metodologías empleadas en
teledetección incluyen cámaras dotadas de filtros, radiómetros, sistemas de video,
sónar, radar, etc., y pueden estar instaladas en gran diversidad de plataformas,
alturas y distancias (satélites, helicópteros, globos, brazos hidráulicos, etc. (Nilsson
1995a y b). Entre las técnicas susceptibles de ser empleadas en teledetección se
encuentran la termografía y la fluorescencia de imagen, por lo que realizaremos un
pequeño repaso de las aplicaciones realizadas hasta la fecha, con fecha posterior a
las excelentes revisiones de Nilsson (1995a y b).
La mayoría de los cultivos son altamente sensibles a los pequeños cambios
en la disponibilidad de agua, teniendo éstos gran impacto en la productividad y en
la calidad de las cosechas (Jones et al. 2002). El sector de la agricultura emplea
más de las dos terceras partes del agua disponible (Chaerle et al. 2005). Por otra
parte, en los últimos tiempos, el cambio climático está ocasionando la escasez de
agua en determinadas zonas del planeta. En nuestro país, los años 2005 y 2006 han

44
A. Introducción

sido especialmente secos, y las demandas de agua, crecientes. Por tanto, el uso
racional y responsable de los recursos hídricos y la adopción de un régimen de
riego eficiente es de vital importancia. La termografía de imagen ha demostrado su
eficacia en este terreno, ya que la temperatura de los cultivos es un poderoso
indicador del estado hídrico de las plantas y una herramienta potente para
proporcionar información sobre el uso del agua en agricultura, permitiendo
desarrollar regímenes de riego apropiados (Cohen et al. 2005, Leigh et al. 2006).
Jones (2004b) revisa los diversos métodos disponibles para establecer regímenes de
riego, y subraya la importancia de la termografía entre todos ellos. El reciente
desarrollo de cámaras térmicas portátiles ha extendido enormemente las
oportunidades de análisis de las propiedades térmicas de cultivos y ha expandido la
información disponible relativa a las condiciones de crecimiento de las plantas.
Esta técnica permite el análisis semiautomático de grandes áreas de cultivo con una
mayor reproducibilidad de la que podría conseguirse con la porometría. (Jones et
al. 2002). Recientemente, Leigh et al. (2006) han desarrollado un método para
medir fidedignamente la temperatura de los cultivos bajo luz solar directa.

Control irrigado 6 h sin riego

SAR
SAR

Fig. 6: Teledetección: estimación de la temperatura de los cultivos de algodón empleando una cámara
térmica situada a 5 m de distancia del cultivo. SAR: superficie artificial de referencia (tomado de
Cohen et al. 2005).

45
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

El empleo de la termografía en teledetección requiere el uso de superficies de


referencia con temperaturas conocidas, (Fig. 6), como pueden ser hojas cubiertas
con vaselina para evitar la transpiración (superficie seca) y hojas pulverizadas con
agua (superficie húmeda), que se usaron en las medidas térmicas de cultivos de vid
(Jones 2002, Leinonen y Jones 2004). Cohen et al. (2005) emplearon superficies de
referencia artificiales en sus medidas realizadas en cultivos de algodón. Estas
mediciones permitieron diseñar índices que evalúan el estrés hídrico de los
cultivos.
Cualquier estrés de origen biótico o abiótico que interfiera con la toma de
agua por las raíces o en el transporte del agua impulsado por la transpiración, o en
ambos, es susceptible de una detección previsual mediante termografía (Chaerle
2000). Un ejemplo lo encontramos en la detección de la infestación de cultivos de
remolacha con el nematodo Heterodera schachtii (Schmitz et al. 2004), que
parasita la raíz de las plantas de remolacha y reduce la evaporación de agua por las
hojas; de tal forma, que las bajas y las altas densidades de poblaciones de
nematodos pueden ser distinguidas en función de la temperatura de las hojas de las
plantas afectadas. Así la termografía de imagen puede ser una herramienta útil para
la monitorización de cultivos desde el aire, que suplemente a otras técnicas de
teledetección desde satélites. Hay que tener en cuenta que la termografía (o
cualquier otra técnica empleada en teledetección), por sí sola, no identifica el factor
de estrés causante del cambio de temperatura (Nilsson 1995a y b), por lo que una
combinación con otras técnicas puede proporcionar firmas específicas de actuación
de un determinado factor de estrés (Chaerle et al. 2004), siendo más fácil atajar el
problema antes de que los síntomas sean visibles.

A.2.2. Fluorescencia verde-azul


Cuando una planta es expuesta a la luz ultravioleta (UV) de larga longitud de
onda (UV-A, 320-380 nm), emite fluorescencia, con máximos de emisión en el
azul (440 nm), verde (520 nm), rojo (690 nm) y rojo lejano (740 nm) (Fig. 7),

46
A. Introducción

conocidos como F440, F520, F690 y F740, respectivamente (Buschmann y


Lichtenthaler 1998). El máximo en el verde a veces no está bien definido y se
presenta como un hombro, por lo que suele asociarse con la fluorescencia azul. En
este caso, hablamos de fluorescencia verde-azul (BGF, del inglés blue-green
fluorescence). Por su origen común, F690 y F740 se conocen como fluorescencia
de la clorofila (Chl-F), puesto que la clorofila a (Chl a) es el único fluoróforo
presente en las hojas que emite en esta parte del espectro, ya que la Chl b transfiere
toda su energía de excitación a la Chl a in vivo (Cerovic et al. 1999). En este
capítulo, abordaremos la descripción de la BGF, mientras que la Chl-F merece un
capítulo aparte. Como se detallará a continuación, la emisión de F440, F520, F690
y F740 va a cambiar en función del origen de la hoja, especie vegetal, cantidad de
pigmentos foliares, edad, si consideramos el haz o el envés, o de las condiciones
ambientales a las que ha sido expuesta la planta.
Fluorescencia

Emisión (longitud de onda en nm)

Fig: 7: Espectro de emisión de fluorescencia inducido por luz UV en una hoja verde de maíz. Los
máximos de emisión están indicados (tomado de Lichtenthaler y Miehé 1997).

47
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2.2.1. Origen de la fluorescencia verde-azul


A diferencia de la Chl-F, el origen de la BGF es heterogéneo, puesto que son
varias las substancias que pueden fluorescer en el verde y en el azul. Generalmente,
estos fluoróforos son productos del metabolismo secundario biosintéticamente
relacionados con la ruta del shikimato, y se conocen como fenoles, polifenoles o
fenilpropanoides (Cerovic et al. 1999). Sin embargo, no todos los fenoles
participan por igual en la emisión de BGF: los fenoles solubles no emiten
fluorescencia (Lichtenthaler y Schweiger 1998), mientras que los que están
covalentemente unidos a las paredes celulares de las células epidérmicas y las
venas de las hojas son emisores (Bongi et al. 1994, Stober et al. 1994, Buschmann
y Lichtenthaler 1998, Buschmann et al. 2000). Se ha descrito el ácido ferúlico
como el principal responsable de la BGF (Morales et al. 1996, Lichtenthaler y
Schweiger 1998, Meyer et al. 2003), aunque el ácido cumárico y el ácido
clorogénico también podrían participar en menor medida (Lichtenthaler y
Schweiger 1998, Cerovic et al. 1999). Por último, se sabe que algunas
nicotinamidas, (NAD, NADH) flavinas (FMN, FAD, riboflavina) y co-enzimas
(piridoxal-5’-fosfato) también fluorescen en el verde y en el azul, si bien su
aportación está enmascarada por la mayor concentración del resto de fluoróforos y
necesita de fluorímetros altamente sensibles tipo PAM (pulse-amplitude
modulation) para detectarla (Cerovic et al. 1999).
En un corte transversal de la hoja de una planta dicotiledónea como
Nicotiana benthamiana, la fluorescencia no está homogéneamente distribuida,
debido a que dichas hojas presentan dos caras bien definidas. Por un lado, la cara
adaxial (AD) o haz, expuesta a la luz, con una epidermis gruesa y un parénquima
en empalizada, compuesto por células altamente empaquetadas. Por el otro, la cara
abaxial (AB) o envés, con una epidermis más fina y un parénquima lagunar, donde
las células dejan entre sí grandes espacios intercelulares. En estas hojas, la mayor
parte de la BGF procede, como ya se ha dicho, de la cutícula, de las paredes
celulares de la epidermis y el tejido vascular, mientras que la Chl-F procede del

48
A. Introducción

mesófilo y de los cloroplastos de las células oclusivas de los estomas, ya que la


epidermis carece de cloroplastos. (Fig. 8). La asimetría de las hojas bifaciales
explica por qué, en general, la emisión de fluorescencia inducida por el UV es
mayor en la cara AB que en la AD, donde el alto grado de empaquetamiento del
parénquima en empalizada favorece la reabsorción de la fluorescencia emitida por
parte de las Chls (Buschmann y Lichtenthaler 1998, Cerovic et al. 1999).

B Epidermis

A paredes celulares
Parénquima en
empalizada

cloro-
fila a
paredes
celulares
Parénquima lagunar
Epidermis

Mesófilo
Fig. 8: Asimetría de una hoja bifacial de dicotiledónea como Nerium oleander (adelfa). A)
micrografía de epifluorescencia (200x) de la emisión en el visible de una sección transversal de una
hoja de adelfa. Adaxial, ad; abaxial, ab. Se ha indicado la posición de la epidermis AD y AB, que
fluoresce en el azul; así como la situación del parénquima en empalizada y el lagunar, que lo hace en
el rojo (tomado de Mantha et al. 2001). B) Espectros de emisión de la epidermis AD y de las células
del mesófilo bajo la misma. La intensidad de la BGF de las células del mesófilo es menor que la de la
epidermis libre de pigmentos fotosintéticos, ya que BGF es reabsorbida por las Chls (tomado de
Buschmann et al. 2000).

Dados los distintos orígenes de BGF y Chl-F y que cada una de ellas puede
variar independientemente en respuesta a factores ambientales o fisiológicos,
además de influirse mutuamente, a veces es necesario emplear cocientes de
fluorescencia en lugar de valores de fluorescencia absolutos. A continuación,

49
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

detallaremos los cocientes más empleados para describir las respuestas de las
plantas al estrés.

A.2.2.2. Cocientes de fluorescencia


El cociente F690/F740 (y su inversa, F740/F690, equivalente a F735/F700)
fue el primer cociente empleado por el grupo del Prof. Lichtenthaler (Lichtenthaler
et al 1986, Gitelson et al. 1999). Dado que la Chl in vivo absorbe en la región
cercana a los 690 nm (Gitelson et al. 1998), cuanto mayor es la concentración de
Chl en las hojas, mayor es la reabsorción de la fluorescencia emitida. Sin embargo,
esto no ocurre con la fluorescencia en el rojo lejano, que es independiente de la
concentración de Chl. Por tanto, existe una relación inversa entre el contenido total
de Chl y el cociente F690/F740 (Babani y Lichtenthaler 1996, Gitelson et al. 1998,
1999, Buschmann et al. 2000). Dicha relación se ha probado en varias especies
vegetales y durante el reverdecimiento de plantas etioladas (Stober y Lichtenthaler
1992). Gitelson et al. (1998) demostraron que los valores de este cociente están
muy poco influenciados (menos del 7%) por la morfología y estructura de las
hojas.
Los cocientes F440/F690 y F440/F740 han demostrado ser los más sensibles
y rápidos a la hora de diagnosticar el estrés (Schweiger et al. 1996), reflejando,
además, la existencia de dos mecanismos fotoprotectores en las plantas. 1) La
cantidad de substancias que absorben en el verde y el azul (fluorescentes o no)
presentes en la epidermis condiciona la emisión de Chl-F, pues filtran la luz
incidente, de tal manera que la cantidad de luz que llega al mesófilo es menor,
disminuyendo consecuentemente la Chl-F y aumentando el valor de los cocientes.
2) También se ha postulado que las sustancias fluorescentes en el verde y el azul
podrían proporcionar fotones a las moléculas de Chl del mesófilo vía emisión de
fluorescencia. En este caso, la luz resultante, altamente energética pero no dañina
para la planta, podría utilizarse en los procesos fotosintéticos (Schweiger et al.
1996, Mantha et al. 2001) o bien re-emitirse mediante Chl-F, por lo que se

50
A. Introducción

registraría un aumento de la misma y un descenso de los cocientes (Schweiger et


al. 1996). Ambos mecanismos fotoprotectores funcionan a la vez. Sin embargo y
dependiendo de las condiciones de crecimiento, de la especie vegetal en cuestión y
del tipo de estrés aplicado, uno u otro mecanismo actúa en mayor o menor medida.
Schweiger et al. (1996) también demostraron que la luz UV no es necesaria para
que los mecanismos fotoprotectores tengan lugar, sino que otros estreses (como el
hídrico o el ocasionado por el calor) pueden desencadenarlos. Asimismo, también
es sabido que los patógenos potencian la síntesis de fenilpropanoides, conocidos
como fitoalexinas (Nicholson y Hammerschmidt 1992, Dixon y Paiva, 1995,
Kofalvi y Nassuth 1995, Dixon et al. 2002).
Por último, el cociente F440/F520 también se emplea como indicador de
estrés, ya que la banda verde puede presentar un aumento con respecto a la azul a
largo plazo bajo varios estreses ambientales, aparentemente por la acumulación de
fluoróforos verdes (Buschmann y Lichtenthaler 1998).

A.2.2.3. Fluorescencia inducida por luz UV de imagen


Como ya hemos visto, la fluorescencia inducida por luz UV nos proporciona
información acerca de los procesos fotoquímicos de la hoja (Chl-F), de su
contenido en Chl (F690/F740) y de la presencia y acumulación de productos del
metabolismo secundario (BGF). En el mercado existen gran variedad de
espectrofluorímetros que miden los espectros de emisión de fluorescencia al excitar
las hojas mediante lámparas de xenon o láseres (en este caso, hablamos de
fluorescencia inducida por láser o LIF, del inglés laser-induced fluorescence). Sin
embargo, estos espectrofluorímetros nos ofrecen información de pequeñas áreas
foliares seleccionadas aleatoriamente, por lo que perdemos información espacial
cuando existen gradientes de fluorescencia a lo largo de las hojas, o bien los
cambios están localizados en una parte de la misma (Fig. 9A). De hecho, los
estreses que actúan a corto plazo o los ataques causados por patógenos, rara vez
afectan a la hoja completa (Lichtenthaler y Miehé 1997). Por este motivo se diseña-

51
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A Medidas puntuales Imagen

 Resolución espacial
 Distribución de la señal a lo largo del área
 Buena resolución espectral foliar
 Instrumentos de bajo coste  Localización de señales
- No representativo  Patrón de señales
- Sólo un píxel por medida  Buena confianza estadística

Fig. 9: A) Ventajas de la fluorescencia de imagen con respecto a medidas puntuales de la hoja,


según se muestra en hojas de arce. La heterogeneidad espacial de la fluorescencia y sus cocientes se
muestra en las imágenes y no mediante medidas puntuales, aunque se realicen varias en una misma
hoja (tomado de Lichtenthaler et al. 2005). B) Esquema del sistema de fluorescencia de imagen de
Karlsruhe (tomado de Buschmann et al. 2000).

52
A. Introducción

ron fluorímetros de imagen que proporcionaran información espacial de las


distintas bandas de fluorescencia inducidas por el UV, de mucha más calidad que
las medidas puntuales empleadas hasta ese momento (Lang et al. 1996,
Lichtenthaler et al. 1996, Lichtenthaler y Miehé 1997). Varios laboratorios han
desarrollado sus propios aparatos de fluorescencia de imagen inducida por el UV
(MCFI, por multicolour fluorescence imaging), ya que no existen prototipos
comerciales. Describiremos el diseñado por el grupo de Lichtenthaler en Karlsruhe,
ya que en nuestros experimentos llevados a cabo en la Universidad Eötvös Lórand
de Budapest, empleamos un aparato muy similar.
En el sistema de fluorescencia de imagen FL-FIS (del inglés flash lamp -
fluorescence imaging system), la luz UV de excitación proviene de una lámpara de
xenon que emite flashes de luz a 355 nm, acoplada a un filtro que deja pasar sólo
luz UV (Fig. 9B). Las imágenes son adquiridas mediante una cámara CCD (del
inglés charge-coupled device) sincronizada con la lámpara de flashes. Las
imágenes de F440, F520, F690 y F740 son adquiridas secuencialmente para el
mismo campo de visión, cada una con el filtro apropiado. Dichos filtros están
montados en una ruleta frente a la cámara CCD y se cambian automáticamente. La
adquisición de las imágenes de emisión de fluorescencia requirió, en nuestro caso,
800 flashes de luz UV. Las imágenes se procesan con ayuda del software Camille
1.05, que corrige las imágenes frente a la excitación no uniforme de la muestra y
calcula, además, los cocientes de fluorescencia. La imagen que resulta se presenta
en escala de grises, pero es posible la aplicación de una escala de falsos colores
(Buschmann y Lichtenthaler 1998, Buschmann et al. 2000, Lichtenthaler y Babani
2000).
Sin embargo, el primer aparato diseñado para visualizar la fluorescencia
inducida por UV de imagen fue el microscopio de fluorescencia de transmisión o
de epi-fluorescencia (Cerovic et al. 1999; ver Fig. 8), que ha proporcionado
abundante información acerca de la localización exacta de los fluoróforos vegetales

53
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

(Stober y Lichtenthaler 1993b, Agati et al. 2002, Mantha et al. 2001, Hideg et al.
2002).
A escala macroscópica, la efectividad de la MCFI ha sido probada en
numerosas ocasiones (Heisel et al. 1996, Lang et al. 1996, Lichtenthaler et al.
1996, Lichtenthaler y Miehé 1997, Langsdorf et al. 2000, Krizek et al. 2001,
Lichtenthaler et al. 2005, Lenk y Buschmann 2006).
Otra ventaja que ofrece la MCFI es la posibilidad de su aplicación para la
detección de estreses en campo, incluso mediante teledetección.

A.2.2.4. Aplicaciones de la fluorescencia inducida por luz UV


La MCFI se puede emplear en la identificación y clasificación de plantas,
puesto que los compuestos implicados en la absorción en el UV y en la BGF son
marcadores quimiotaxonómicos. En este caso, el cociente F440/F690 es idóneo
puesto que la BGF de las monocotiledóneas en general, y especialmente las
herbáceas, es mayor que en las dicotiledóneas (Chappelle et al. 1985). Sin
embargo, la BGF por sí sola no garantiza la clasificación y es necesario recurrir a la
anatomía de las hojas y al análisis de la combinación de los diferentes pigmentos
presentes en ellas. Además, la MCFI puede proporcionar mucha información sobre
el crecimiento y el desarrollo de los vegetales, constituyendo una herramienta muy
útil para monitorizar el crecimiento de los cultivos y valorar el impacto ambiental.
A continuación, enumeraremos diferentes situaciones en las que la fluorescencia
inducida por luz UV (acoplada o no a la captación de imágenes) se ha empleado
con éxito.

A.2.2.4.1. Exposición a la luz UV. Las plantas pueden protegerse de los


efectos nocivos de la luz UV mediante la acumulación en la epidermis foliar de
sustancias que absorben en el UV (fluorescentes o no) y evitan que las radiaciones
nocivas penetren en el mesófilo (Stober y Lichtenthaler 1993a, Stober et al. 1994,
Lenk et al. 2006). Por ello, las plantas crecidas en el campo emiten mayor BGF y/o

54
A. Introducción

menor Chl-F que las plantas crecidas en invernadero. Stober y Lichtenthaler


(1993a) establecieron que el cociente F440/F690 incrementa gradualmente a
medida que aumenta la intensidad lumínica utilizada durante el crecimiento
vegetal. Con respecto a plantas crecidas en interior, el cociente F690/F740 puede
ser mayor o menor en plantas crecidas al aire libre (Buschmann y Lichtenthaler
1998, Babani et al. 2005), mientras que el cociente F440/F520 disminuye
drásticamente, posiblemente debido a la mayor acumulación de fluoróforos verdes
en comparación con los azules (Buschmann y Lichtenthaler 1998). Así los
cocientes F440/F690 y F440/F740 pueden ser de gran utilidad a la hora de valorar
el grado de protección de una planta frente a la luz UV.

A.2.2.4.2. Crecimiento y desarrollo. El contenido de Chls y de compuestos


que absorben en el UV depende de la edad de la hoja y de la luz a la que ha estado
expuesta. Las hojas etioladas emiten mayoritariamente BGF, aunque también
presentan una mínima señal de Chl-F que hace pensar en la presencia de trazas de
Chl en sus células (Stober y Lichtenthaler 1993b). Durante el proceso de síntesis de
Chl en las hojas etioladas, los cocientes BGF/Chl-F se correlacionan de forma
inversa con el contenido total de Chls de las hojas que reverdecen (Stober y
Lichtenthaler 1992, Babani y Lichtenthaler 1996, Babani et al. 1996). Se han
detectado también incrementos de la BGF en hojas senescentes de maíz (Meyer et
al. 2003), mientras que en hojas de alcachofa se ha registrado una caída de la BGF
como consecuencia de la pérdida de ácido clorogénico (principal emisor de
fluorescencia azul y verde en la alcachofa) durante la senescencia (Morales et al.
2005).

A.2.2.4.3. Deficiencias y/o excesos de minerales. Heisel et al. (1996)


estudiaron varias deficiencias nutricionales en plantas de maíz, estableciendo que
los cocientes BGF/Chl-F son de gran utilidad en este tipo de ensayos. Muchos han
sido los estudios realizados en plantas con deficiencias en nitrógeno (Langsdorf et

55
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

al. 2000, Apostol et al. 2003, Corp et al. 2003, Mercure et al. 2004, Lichtenthaler et
al. 2005). Este tipo de estrés generalmente ocasiona incrementos en F440/F690 y
F440/F740 (Fig. 10), mucho antes de que el déficit de nitrógeno cause una pérdida
del contenido de Chls (por tanto, los índices señalados son detectores del estrés
más tempranos que el cociente F690/F740). Se sabe que la carencia de este
nutriente provoca la acumulación de fenoles en la epidermis de las hojas, que
absorben la radiación y dejan pasar menos cantidad de luz al mesófilo. Gracias a la
fluorescencia inducida por UV se ha podido realizar un mapa de la disponibilidad
de nitrógeno en un campo de maíz (Apostol 2006). La fluorescencia inducida por
luz UV también ha sido de gran utilidad a la hora de detectar deficiencias de hierro
(Morales et al. 1994), toxicidad por exceso de cinc (Schuerger et al. 2003) o déficit
de potasio (Chappelle et al. 1984).

A.2.2.4.4. Calidad de los frutos. La fluorescencia inducida por luz UV ha


demostrado ser de utilidad en la detección mediante técnicas no destructivas de
golpes en manzanas aparentemente intactas, ya que se registran cambios tanto en
BGF como en Chl-F. Asimismo, la oxidación de rodajas de plátanos pudo ser
detectada antes de que el característico color marrón fuese visible mediante
cambios en la BGF (Wulf et al. 2003, Zude 2006).

-N +N -N +N

Figura 10: Imágenes de los cocientes F440/690 y F690/F740 en hojas de remolacha crecidas con
(+N) o sin (-N) aporte de nitrógeno (tomado de Lichtenthtaler et al. 2005).

56
A. Introducción

Fig. 11: Cambios en los


cocientes de fluorescencia
azul/rojo y rojo/rojo lejano
durante la rehidratación
(respuesta rápida en 30 s) y el
F440/F690

F690/F735
lento proceso de desecación
(240 min) en las hojas verdes
del musgo Tortula rurales. El
cero en el eje X representa el
estado seco antes de la
rehidratación del musgo
(tomado de Takács et al.
Tiempo (min) 2000).

A.2.2.4.5. Estrés hídrico. Cuando se somete a estrés hídrico a plántulas de


calabaza, se produce un fuerte incremento de la BGF, por lo que los cocientes
BGF/Chl-F aumentan (Schweiger et al. 1996). Una sequía prolongada en plantas de
tabaco ocasiona un incremento de BGF y Chl-F, si bien la primera aumenta
proporcionalmente más que la segunda, por lo que los cocientes F440/F690 y
F440/F740 aumentan progresivamente a medida que se reduce el contenido hídrico
de la planta (Lang et a. 1996). No se detectó una tendencia clara en el cociente
F690/F740, mientras que F440/F520 ni siquiera mostró correlación con el
contenido de agua de la planta. La planta Haberlea rhodopensis también muestra
un aumento de los cocientes BGF/Chl-F mientras sufre desecación, debido a un
aumento de la BGF y un descenso de la Chl-F, recuperando los valores normales
durante la etapa de rehidratación (Georgieva et al. 2006). Takács et al. (2000) en
experimentos con plantas criptógamas tolerantes a la desecación concluyen que los
aumentos rápidos, 1 ó 2 h dependiendo de la especie, en los cocientes de
fluorescencia durante el estrés hídrico, sólo podían deberse a los cambios
producidos en las propiedades ópticas de las hojas por la pérdida de volumen de
sus células y no por la acumulación de sustancias fenólicas (Fig. 11).

57
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2.2.4.6. Temperatura. Las altas temperaturas provocan aumentos en la


emisión de BGF y Chl-F, más acusado en la primera, aumentando así el cociente
BGF/Chl-F (Schweiger et al. 1996). Un brusco descenso de temperatura también
ocasiona un incremento reversible de la BGF, pero no de la Chl (Bongi et al. 1994,
Morales et al. 1996, 1998, Cerovic et al. 1999). Existen claras evidencias de que
estos cambios provienen tanto de los fluoróforos de la epidermis como del
microambiente en el que éstos se encuentran (Morales et al. 1998, Saito et al.
1998).

A.2.2.4.7. Hojas variegadas. Las partes claras de las hojas variegadas emiten
gran cantidad de BGF en comparación con las partes verdes; si trazáramos un
transepto a lo largo de una hoja variegada, veríamos que F440 y F690 muestran un
contraste negativo (Lichtenthaler et al. 2005) (Fig. 12). Además, las zonas claras
poseen trazas de Chl no funcional (Lichtenthaler et al. 1996), por lo que los
cocientes F440/F690 y F440/F740 son mucho mayores que en las partes verdes de
las mismas (Buschmann y Lichtenthaler 1998).

Figura 12: Imagen en blanco y


negro de una hoja variegada de
Campelia zonania L. con un
análisis del perfil de emisión de
F440 (línea discontinua) y F690
Fluorescencia

(línea continua) a lo largo de la


superficie de la hoja, realizado a
partir de las respectivas
imágenes de fluorescencia. Se
aprecia el contraste negativo
entre F440 y F690 (tomado de
Lichtenthaler et al. 2005).
Borde izquierdo Hoja Borde derecho

58
A. Introducción

A.2.2.4.8. Respuestas a patógenos. Se ha comprobado que las plantas


infectadas por hongos sufren un incremento en el contenido de ácidos fenólicos
(Niemann et al. 1991) y de BGF, que en un principio se atribuyó a la propia
autofluorescencia del hongo (Lüdeker et al. 1996). Sin embargo, hoy día existen
pruebas de que los patógenos inducen un aumento de sustancias de naturaleza
fenólica (Nicholson y Hammerschmidt 1992, Kofalvi y Nassuth 1995) conocidas
como fitoalexinas, involucradas en la defensa contra patógenos (Dixon y Paiva,
1995, Dixon et al. 2002). En el caso de los hongos, las fitoalexinas tendrían por
misión inhibir el crecimiento fúngico o evitar la colonización del hospedador
estrechando las paredes celulares en los puntos de entrada (Cerovic et al. 1999), y
dada su naturaleza fenólica, podrían fluorescer bajo la luz UV. De hecho,
recientemente se ha detectado un aumento de compuestos fenólicos que fluorescen
al iluminarse con luz UV en plantas de cebada resistentes al hongo Blumeria
graminis (Swarbrick et al. 2006). Dichas plantas expresan el gen de resistencia
Mla12, que está íntimamente asociado a la muerte de las células epidérmicas tras el
intento de infección del hongo. Por su parte, Buschmann y Licthtenthaler (1998)
detectaron mediante MCFI las lesiones ocasionadas por moscas blancas en hojas de
tabaco, así como los daños ocasionados por ácaros. Éstos succionan los
cloroplastos de la cara AB de las hojas, y producen un descenso de Chl-F que se
visualiza en los cocientes F440/F690 y F440/F740. En cuanto a infecciones virales,
Szigeti et al. (2002) informaron del aumento de los cocientes F440/F690,
F440/F740 y F690/F740 en hojas de col china infectadas con el virus del mosaico
amarillo del nabo. Más recientemente, Chaerle et al. (2007b) mostraron un
aumento de la BGF durante la HR provocada por el virus del mosaico del tabaco
(TMV) en estas plantas, y lo correlacionaron con un aumento de escopoletina. Se
ha detectado un aumento en la BGF de plantas de Nicotiana benthamiana
infectadas con PMMoV en estadios tempranos de la infección, más acusado en la
cara AB que en la AD, probablemente asociado a un incremento de ácido

59
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

clorogénico (Sajnani 2005). También se ha demostrado mediante técnicas


diferentes a la fluorescencia, que las plántulas de tomate infectadas con el Virus X
de la Patata (PVX) y/o el Virus del Mosaico del Tabaco (TMV) acumulan fenoles
esterificados en las paredes celulares, alterando incluso el tipo de componente
fenólico en las plantas infectadas con respecto a los controles (Balogun y Teraoka
2004).

A.2.2.4.9. Teledetección. Todos los trabajos descritos anteriormente y algunos


otros (Luedeker et al. 1997, Apostol et al. 2003, Moya et al. 2003, Apostol et al.
2006, y una completa revisión de Nilsson 1995a) avalan la utilidad de la
fluorescencia inducida por luz UV a la hora de monitorizar el estado de las
cosechas o masas forestales, incluso desde satélites. El control de las plagas y la
fertilización de los cultivos son las principales dianas de las técnicas de
teledetección. Dado que la BGF está directa y casi linealmente correlacionada con
la temperatura de la hoja, podría considerarse la posibilidad de emplear esta técnica
como un termómetro para teledetección en cultivos (Morales et al. 1998). Richards
et al. (2003) demostraron que la fluorescencia inducida por UV es una herramienta
útil para la teledetección bajo gran diversidad de condiciones lumínicas,
incluyendo la oscuridad completa y ambientes con rápidos cambios de luz,
similares a los que ocurren en días parcialmente nublados. Sin embargo, esta
técnica presenta aún ciertas limitaciones, todavía por resolver (Buschmann y
Lichtenthaler 2000): gran cantidad de estreses provocan el aumento del cociente
F440/F690, por lo que esta técnica por sí sola carecería de especificidad, siendo
necesaria la combinación con otras técnicas biofísicas (Cerovic et al 1999, Apostol
et al 2003). Además, ya que las relaciones hídricas cambian los cocientes de
fluorescencia en plantas criptógamas tolerantes a la desecación, las comunidades
dominadas por tales plantas no son dianas apropiadas para la teledetección del
estrés vegetal vía fluorescencia de imagen usando los cocientes de fluorescencia
desarrollados para plantas superiores (Takács et al. 2000).

60
A. Introducción

A.2.3. Fluorescencia roja de la clorofila


Como apuntábamos en el capítulo dedicado a la BGF (A.2.2), las moléculas
de Chl a, cuando son excitadas con luz de longitud de onda larga, emiten una señal
de fluorescencia en el rojo (F690) y en el rojo lejano (F740). En el presente
apartado, analizaremos con detalle la fluorescencia en la región roja del espectro de
la Chl (Chl-F), ya que durante los últimos 70 años ha sido de gran utilidad para la
comprensión del fenómeno de la fotosíntesis, y durante las últimas tres décadas, se
ha convertido en una de las herramientas más usadas para el seguimiento de las
reacciones fotosintéticas in vivo (Nedbal y Whitmarsh 2004), hasta el punto de que
ningún estudio sobre estrés y fotosíntesis parece estar completo sin datos de
fluorescencia (Maxwell y Johnson 2000). Ofrece además, las ventajas de ser una
técnica no destructiva, precisa y de gran rapidez en las medidas (Lichtenthaler
1996).

A.2.3.1. Origen de la fluorescencia roja de la clorofila


Las hojas fotosintéticamente activas recogen la energía de la luz solar gracias
a los pigmentos presentes en los complejos mayores de antena del PSII y el PSI
(LHC II y LHC I, respectivamente; LHC: light harvesting complex). Esta energía
se transfiere, posteriormente, a los centros de reacción (RC) P680 y P700, donde la
energía se utiliza para la separación de cargas (Fig. 13). En este proceso participan
las Chls a y b, así como los denominados carotenoides primarios (Lichtenthaler y
Rinderle 1988). Se sabe que, a temperatura ambiente, la emisión de Chl-F procede
fundamentalmente de la Chl a del PSII (Kyle et al. 1983, Cerovic et al. 1999); de
esta forma, el PSII controla y distribuye equilibradamente la energía captada por
los dos fotosistemas (Lichtenthaler y Rinderle 1988).
La energía lumínica que llega al PSII es convertida en energía química
mediante los procesos fotoquímicos (Fig. 14). Una pequeña parte de la energía, la
que no puede ser empleada en fotosíntesis, se disipa en forma de calor (procesos no
fotoquímicos) o bien en forma de fluorescencia, con objeto de que el exceso de

61
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

h·ν h·ν h·ν

Calor PSII LHC PSI Calor


Fluorescencia (Fluorescencia)

∆pH transtilacoidal ATP

H + H + Ciclo de
Benson-Calvin
2 H2O cadena
e-
P680 transportadora de P700 NADPH
O2 electrones

Fig. 13: Transformación de la luz absorbida por las antenas de ambos fotosistemas en tres
distintos tipos de energía: fotosintética (procesos fotoquímicos), fluorescencia y calor (procesos no
fotoquímicos).

CONDICIONES CONDICIONES DE
FISIOLÓGICAS ESTRÉS

Chl* a Chl* a

fotosíntesis calor


ν calor hν
ν fluorescencia

fluorescencia fotosíntesis
Chl a Chl a
Fig. 14: La clorofila excitada por la luz (Chl*) vuelve a su estad basal mediante tres procesos en
equilibrio. Bajo condiciones fisiológicas, los procesos fotoquímicos son los predominantes. Bajo
situaciones de estrés, los procesos no fotoquímicos y la fluorescencia aumentan en detrimento de la
fotosíntesis.

62
A. Introducción

energía no dañe a ambos fotosistemas. En condiciones fisiológicas normales, la


fotosíntesis predomina sobre los procesos disipativos; sin embargo, cuando la
planta se enfrenta a situaciones adversas, la maquinaria fotosintética no puede
trabajar a pleno rendimiento y la energía sobrante debe disiparse. Como
consecuencia, los procesos no fotoquímicos y la fluorescencia, aumentan. Por
tanto, la medida de la emisión de fluorescencia remite a la de la eficiencia
fotosintética, con la que muestra una relación inversa, y puede proporcionar
evidencias directas del mecanismo y dinámica de los primeros eventos de la
fotosíntesis (Sauer y Debreczeny 1996).

A.2.3.2. Cinética de inducción de la fluorescencia I: el efecto Kautsky


Kautsky y Hirsch (1931) registraron por primera vez, utilizando un filtro
especial y con sus propios ojos, la emisión de fluorescencia de una planta adaptada
a la oscuridad y expuesta después a la luz azul. Pudieron comprobar que la emisión
de fluorescencia no era estable, alcanzando al principio un máximo de un tono rojo
brillante, pero que posteriormente decrecía. Esta observación supuso la primera
descripción de la cinética de la Chl-F, y desde entonces lleva el nombre del
primero de sus autores.
En efecto, una planta adaptada a la oscuridad tiene todos sus RC “abiertos”,
con QA completamente oxidada (Fig. 15A), y a la espera de la separación de cargas
inducida por la luz. En esta situación, en las plantas se registra una fluorescencia
mínima, también llamada F0 o quenching de antena (Fig. 15B). Cuando una luz
intensa incide sobre las antenas, los centros de reacción se “cierran” y QA se reduce
totalmente, de forma que la energía que sigue llegando a los fotosistemas se
encuentra en exceso, por lo que se disipa en forma de fluorescencia, alcanzándose
un máximo. Si la luz empleada a tal efecto es actínica, este máximo se conoce
como FP, mientras que si la luz es saturante, recibe el nombre de FM (fluorescencia
máxima). La diferencia entre FM y F0 se denomina fluorescencia variable o FV. A
partir de estos valores de fluorescencia, se puede calcular un parámetro básico

63
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

conocido como máximo rendimiento cuántico del PSII o FV/FM, que nos indica la
eficiencia fotosintética máxima de nuestro sistema. Normalmente, una planta sana
de cualquier especie tiene un índice FV/FM cercano a 0,8 (Björkman y Demming
1987), pero cuando se enfrenta a situaciones de estrés, este valor suele disminuir.
Continuando con la cinética de inducción de fluorescencia de Kautsky, tras el
inicial aumento de fluorescencia, se registra un descenso de la misma, debido a que
QA va cediendo electrones a la cadena transportadora y los centros de reacción se
van “abriendo”. Este descenso en la emisión de fluorescencia hasta un estado
estacionario de equilibrio (FS) se conoce como quenching, y tiene dos orígenes: el
fotoquímico (qP, ocasionado por el desencadenamiento de la fotosíntesis) y el no
fotoquímico (qN).

A B
FM
quenching
Fluorescencia

F0 FS

Tiempo
Luz saturante

Fig. 15: A) Esquema de la cadena de transporte de electrones en el PSII, donde QA es uno de los
aceptores de electrones (tomado de www.uqtr.ca/labcarpentier/eng/research.htm). B) Cinética de
inducción de la fluorescencia: el efecto Kautsky.

64
A. Introducción

FM

qN
Fluorescencia

F’M
FV

qP

F
F0 Luz actínica
F’0

Tiempo
Pulsos saturantes

Fig. 16: Cinética de la inducción de la fluorescencia y análisis de los coeficientes de quenching


mediante la aplicación de pulsos de luz saturantes (para una descripción del protocolo detallado, ver
Pérez-Bueno et al. 2006).

A.2.3.3. Cinética de inducción de la fluorescencia II: análisis de los coeficientes de


quenching
Determinar qué fracción del fenómeno de quenching puede ser atribuida a
los procesos fotoquímicos y cuál a los no fotoquímicos es un proceso complejo.
Para ello se recurre al protocolo de análisis de los coeficientes de quenching,
mediante la aplicación de pulsos de luz saturantes durante el período de
iluminación con luz actínica en la cinética de la inducción de la fluorescencia (Fig.
16). Cada nuevo máximo de fluorescencia obtenido se denomina F’M, cuyo valor
no alcanza nunca al de FM, lo que indica que los mecanismos de quenching no
fotoquímico están actuando. De esta forma, la diferencia entre FM y F’M se debe al
qN, mientras que la diferencia entre F’M y el valor de fluorescencia anterior al
pulso de luz saturante se corresponde con qP.
El cálculo de qP requiere el conocimiento de la F’0 (fluorescencia mínima
tras la inducción de la fluorescencia y el apagado de la luz actínica). Sin embargo,
existe una aproximación a qP, denominada rendimiento cuántico del PSII (ΦPSII),

65
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

que cuantifica la proporción de energía absorbida por el PSII que es utilizada en el


transporte electrónico fotosintético y que suele ser proporcional a la tasa de fijación
de CO2 (Genty et al. 1989). Se expresa como:

FM' − Ft ∆F
Φ PSII = = '
FM' FM

Por otra parte, en la literatura sobre fluorescencia roja de la clorofila, es más


común hablar de NPQ, de cálculo sencillo y correlacionado con la emisión de
calor, que de qN. Según Bilger y Björkman (1990):

FM − FM' ∆F
NPQ = '
= 'M
FM FM

Nuevas ecuaciones matemáticas desarrolladas por diversas autores, proponen


otros coeficientes de quenching (quenching total, quenching no fotoquímico
completo, etc.) distintos a los aquí descritos; revisiones como la de Rohácek y
Bartak (1999) y Maxwell y Johnson (2000) recogen una gran variedad de ellos. La
mayoría describen las señales de fluorescencia anteriormente citadas pero de forma
diferente (Buschmann 1999). Algunos autores como Lichtenthaler, prefieren usar
el parámetro Rfd o índice de vitalidad de las plantas (Lichtenthaler y Miehé 1997).
Todos estos coeficientes de fluorescencia reflejan cambios en algún proceso
fisiológico del vegetal, por lo que son los preferidos de fisiólogos y patólogos. Sin
embargo, están surgiendo otros puntos de vista en estudios más biofísicos, a la
búsqueda de parámetros matemáticos que sean buenos indicadores de estrés - a ser
posible presintomáticos- aunque no se correspondan directamente con un proceso
del metabolismo vegetal. Soukupová et al. (2003), en estudios con toxinas
fúngicas, desarrollaron un algoritmo experimental simple que consiguió identificar
un parámetro de Chl-F (F0/FM) que, de forma presintomática, maximizaba el

66
A. Introducción

contraste entre tejidos tratados y no tratados, o bien entre tejidos sanos e


infectados. F0/FM no tiene significado fisiológico, pero intuitivamente es muy
similar a FV/FM, y ya fue usado con éxito en la predicción de la calidad post-
cosecha de limones (Nedbal et al. 2000b). Más recientemente, este parámetro
también ha demostrado su validez señalando el punto de inoculación de varias
roseotoxinas en manzanas (Žabka et al. 2006). El grupo del Dr. Ladislav Nedbal
(Nové Hrady, República Checa), continúa tratando de introducir nuevas formas de
análisis de los datos arrojados por la Chl-F mediante análisis de
“discriminabilidad”, que resulta de la resta de los valores de fluorescencia de
plantas control y plantas estresadas dividido por la resta de sus respectivas
desviaciones típicas, o la “selección de características” (feature selection). Esta
última consiste en la aplicación de métodos estadísticos avanzados para encontrar
una combinación de imágenes que ofrezca el mayor contraste entre plantas sanas y
plantas estresadas. La “selección de características” se ha empleado con éxito en
plantas de Arabidopsis thaliana infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae
(Berger et al. 2007, Matouš et al. 2007), detectándose la infección de forma
presintomática mediante un parámetro elegido por este sistema, 18 h antes que con
el parámetro FV/FM (no presintomático).

A.2.3.4. Los componentes del quenching no fotoquímico (NPQ)


NPQ ha demostrado en estudios anteriores de nuestro grupo (Rahoutei et al.
2000, Pérez-Bueno 2003, Sajnani 2005, Pérez-Bueno et al. 2006) y de otros autores
(Scholes y Rolfe 1996, Osmond et al. 1998,Chou et al. 2000, Lohaus et al. 2000,
Swarbrick et al. 2006) ser un parámetro de gran utilidad para el seguimiento de las
infecciones por patógenos y del efecto de otros factores de estrés, hecho que se
confirma en el presente estudio. Pero el origen de NPQ sigue siendo todavía objeto
de controversia.
El aparato fotosintético es altamente dinámico y capaz de responder
rápidamente a los estímulos ambientales. En condiciones en las que la energía de la

67
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

luz absorbida supera a la capacidad de trasformación en energía química de la


cadena de transporte electrónico, el NPQ constituiría un mecanismo de protección
frente a daños fotoinhibitorios de suma importancia para la adaptación a corto
plazo frente a cambios en las condiciones ambientales. Tres son los mecanismos
que constituyen el NPQ (Maxwell y Johnsson 2000, Horton et al. 2005) y pueden
medirse con un fluorímetro tipo PAM: qT (ligado a la transición de estado), qI
(componente de fotoinhibición) y qE (quenching dependiente del gradiente de pH
transtilacoidal), de tal forma que:

NPQ = qT + qI + qE

A.2.3.4.1. Quenching ligado a la transición de estado o qT. La rápida


reorganización de las antenas es un mecanismo por el cual se ajusta la absorción de
energía de los dos fotosistemas en respuesta a cambios en el espectro y/o
intensidad de la luz incidente. Cuando la actividad del PSII supera a la del PSI,
proteínas de la antena del PSII son fosforiladas de forma reversible, provocando la
disociación de trímeros de LHCII que se desplazan y unen al PSI, disminuyendo
así el tamaño de las antenas del PSII en favor del PSI y procurando una
distribución más equilibrada de la absorción de energía por ambos fotosistemas
(Walters y Horton, 1991, van Wijk et al. 1993, Szabó et al. 2005). Por el contrario,
cuando las condiciones de iluminación favorecen preferentemente al PSI, el
proceso inverso tiene lugar mediante la desfosforilación del LHCII. Se piensa que
qT está relacionado con el estado de activación de la ferredoxina-NADP+ reductasa
(Schansker et al. 2006). La contribución de qT al total del quenching es muy
pequeña y sólo se detecta a bajas intensidades de luz (Maxwell y Johnson 2000).

A.2.3.4.2. Quenching ligado a la fotoinhibición o qI. Cuando la luz incidente


es excesiva o, debido a la presencia adicional de algún factor de estrés en
condiciones de iluminación moderada, se activa la producción de ROS que pueden

68
A. Introducción

causar daños oxidativos a pigmentos, proteínas y lípidos, componentes de la


maquinaria fotosintética. La consiguiente disminución de la eficiencia fotosintética
es conocida como fotoinhibición y tiene lugar en el plazo de horas (Maxwell y
Johnson 2000). Parece ser que los carotenoides previenen la oxidación disipando la
energía en exceso (Szabó et al. 2005). Otros autores proponen que qI podría estar
vinculado a la presencia de PSII no funcionales (centros disipativos), normalmente
dañados en su lado donador (van Wijk et al. 1993).

A.2.3.4.3. Quenching dependiente del gradiente del pH transtilacoidal o qE.


Este componente se define como la porción rápidamente reversible del quenching
que no está asociada a la separación de cargas (Horton et al. 1996, Demmig-Adams
y Adams 2000, Maxwell and Johnson 2000). Es el mecanismo de quenching no
fotoquímico que sigue la cinética de inducción más rápida y el que mayor cantidad
de energía disipa (80%, Holt et al. 2004), hasta el punto de que es considerado un
factor ecofisiológico de suma importancia en la adaptación de las plantas al exceso
de luz incidente (Niyogi et al. 2005). qE se caracteriza por requerir el
establecimiento del gradiente de pH generado en la membrana tilacoidal durante la
fotosíntesis y la participación de la proteína PsbS del PSII, y está asociado con un
cambio en la absorción a los 535 nm (∆A535) (Holt et al. 2004, Szabó et al. 2005).
El mecanismo de activación de qE, para el que se han propuesto numerosos
modelos, es objeto de amplia discusión (Niyogi et al. 2005, Codgell 2006).
Según Holt et al. (2004) y Niyogi et al. (2005), el primer paso necesario para
que qE tenga lugar es la protonación de dos residuos de glutamato de la proteína
PsbS, debido al establecimiento del gradiente de pH transtilacoidal generado
durante la fotosíntesis. Dicho gradiente activaría también a la enzima violaxantina-
de-epoxidasa, que sintetizaría zeaxantina a partir de violaxantina, vía ciclo de las
xantofilas. La proteína PsbS protonada, que actuaría en forma de dímero, tendría la
capacidad de unirse a zeaxantina. Crouchman et al (2006) han propuesto
recientemente que en tales condiciones, PsbS es responsable de la activación de

69
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

cambios conformacionales que llevan al establecimiento del NPQ. La protonación


de PsbS activaría el sitio de unión a zeaxantina y, como resultado, se obtendría el
cambio en el espectro de absorción de ésta (∆A535) (Holt et al. 2004, Niyogi et al.
2005, Szabó et al. 2005). Ante la falta de estructura cristalográfica de PsbS, Haripal
et al. (2006) han propuesto un modelo teórico de esta proteína que confirmaría la
validez de este modelo.
Horton et al. (2005) complican un poco más el modelo para explicar cómo se
generan qE y también qI, mediante mecanismos de acción muy similares (Horton y
Ruban 2005, Fig. 17A y B). Describen la forma en que la de-epoxidación y la
protonación controlan la conformación de las antenas del PSII, dando lugar a
nuevas interacciones entre pigmentos dentro de las subunidades proteicas (Horton
y Ruban 2005).
Un paso que podría ser previo a estos mecanismos de quenching en las
antenas ha sido encontrado en mutantes de cebada (Finazzi et al. 2004). Estas
plantas poseían un mecanismo de NPQ independiente de zeaxantina que resultó
estar ligado al RC. Estos autores postulan que el quenching de RC podría ser el
primero en activarse, y que sería un estado de transición rápidamente reemplazado
por un quenching fotoquímico, o bien por un quenching de antena.
qE también podría estar regulado por diversos factores que contribuyen a la
acidificación del lumen, como la activación de la reacción de la peroxidasa de
Mehler o el flujo cíclico electrónico alrededor del PSI (Kanazawa y Kramer 2002,
Avenson et al. 2004).
La rápida activación de qE sugiere que este componente del NPQ aparece
como respuesta a condiciones ambientales fluctuantes (Kanazawa y Kramer, 2002),
que podrían modular el transporte electrónico fotosintético lineal, lo que se conoce
como “sensibilidad de qE” (Avenson et al. 2004). El transporte electrónico
fotosintético, acoplado a la translocación de protones desde el estroma al lumen,
origina el establecimiento de una fuerza protón motriz transtilacoidal (pmf, del
inglés proton motive force) que gobierna la síntesis de ATP. De esta forma, dismi-

70
A. Introducción

A De-epoxidación
B
Directo

I II H PsbS H
Protonación

∆ pH
Zea
H H H H
PsbS H PsbS H
III IV
PsbS
Indirecto
Violaxantina Zeaxantina

Fig. 17: A) Modelo del cambio conformacional del LHCII (rectángulos verdes) para el NPQ. La
proximidad entre los rectángulos (LHCII) representa la extensión del cambio conformacional que
causa la disipación de la energía y que controla la eficiencia del quenching. El grosor de las flechas
indica la cantidad de energía disipada en cada estado. Los estados de quenching van del I-IV. I
representa el estado adaptado a oscuridad, mientras que IV es el estado de qE predominante, que se
alcanza después de varios minutos de exposición a la luz. El estado III es el estado de transición de qE
que se alcanzaría inmediatamente después de encender la luz y antes de que la de-epoxidación tenga
lugar. El estado II es un estado de “memoria”, que se encontraría a los pocos minutos de apagar la luz
tras haber expuesto la planta previamente a la luz, y se correspondería con qI. B) Posibles
mecanismos de actuación de PsbS. El quenching sería directo, si PsbS protonada y unida a
zeaxantina actuara disipando el exceso de energía en forma de calor; en cambio, el quenching
indirecto tendría lugar si la proteína PsbS protonada indujera el quenching de antena catalizando los
cambios conformaciones entre los estados I y III, y entre II y IV (reproducido a partir de Horton et al.
2005).

nuyendo la conductividad de la ATP sintasa de membrana a los protones, podría


incrementarse la pmf y regularse la “sensibilidad de qE” (Kanazawa y Kramer,
2002). Más recientemente se ha argumentado que la pmf aporta contribuciones
significativas al componente de potencial eléctrico de membrana (∆ψ) del
tilacoide. Se postula que cambiando las aportaciones relativas de la pmf a ∆ψ y a
∆pH se alterarían necesariamente la “sensibilidad de qE” al total de la pmf. Por
tanto, este modelo establece que ∆pH/pmf podría cambiar con el estado fisiológico
de las plantas. Es más, la fracción de pmf guardada como ∆ψ o como ∆pH es

71
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

importante en el balance del papel dual de pmf: permitir la síntesis de ATP


mientras se mantiene el pH del lumen dentro de un rango donde la captura de luz
pueda ser regulada mediante qE (Avenson et al. 2004).

A.2.3.5. Medida de la emisión de fluorescencia roja de la clorofila.


Fluorímetros de imagen
En los últimos tiempos, la interpretación de la emisión de Chl-F ha
evolucionado hasta el punto de que existen diversos fluorímetros comerciales que
se usan rutinariamente para el ensayo de la actividad de la fotosíntesis en plantas,
algas y cianobacterias (Nedbal et al. 2000b). Existen fluorímetros que realizan
medidas puntuales de las hojas, de mayor o menor complejidad, como el PEA
(plant efficient analyser, de Hansatech Instruments, Norfolk, Inglaterra) o el PAM
(Waltz, Effeltrich, Alemania), este último de gran eficacia en el cálculo de los
diferentes coeficientes de quenching. Sin embargo, y como ha quedado
convenientemente explicado a lo largo de la presente Tesis Doctoral, las medidas
puntuales son en la mayor parte de los casos, insuficientes.
Por tanto, el desarrollo de instrumentos capaces de registrar imágenes de la
emisión de Chl-F por parte de células, tejidos, hojas e incluso plantas completas, ha
supuesto un gran avance en la comprensión de los procesos fotosintéticos. La
fluorescencia de imagen (Chl-FI) revela un amplio rango de características internas
de las hojas, incluyendo variaciones espaciales debidas a diferencias en la
fisiología, desarrollo, estado nutricional, distribución de pigmentos, morfología y
propiedades ópticas. La heterogeneidad en la señal de fluorescencia a lo largo de
una hoja puede estar causada por factores internos, tales como las variaciones en la
fisiología de las hojas durante el desarrollo, o por factores externos como los
estreses bióticos y abióticos (Nedbal y Whitmarsh, 2004), y podría reflejar
alteraciones en las relaciones fuente-sumidero inducidas por el patógeno
(Swarbrick et al. 2006).

72
A. Introducción

Unidad de detección

Unidades de excitación

Unidad de
control

Fig. 18: Modelo abierto del FluorCam (PSI, www.psi.cz) con sus distintos componentes.

Actualmente existen dos casas comerciales que suministran sistemas de


medición de Chl-FI: Walz (www.walz.com) y PSI (Photon System Instruments,
www.psi.cz). PSI produce gran variedad de fluorímetros de imagen, incluso para
técnicas de microscopía. De todos ellos, describiremos brevemente el “FluorCam
abierto”, ya que es el sistema de imagen empleado en el laboratorio de la Dra.
Barón y con el que se ha realizado una gran parte de la presente Tesis Doctoral.
El FluorCam está basado en el modelo descrito por Nedbal et al. (2000a),
con algunas modificaciones. Consiste en una unidad de excitación (luz actínica y
luz saturante), una unidad de detección (cámara CCD) y una unidad de control
(Fig. 18). La luz actínica (con una modulación de 10 µs de duración) es
suministrada por dos paneles de diodos que emiten luz naranja (620 nm) y que
iluminan de forma homogénea la muestra consiguiendo hasta 350 µmol
-1 -2
(fotones)·s ·m , mientras que la luz saturante proviene de una lámpara halógena de
tungsteno de 250 W provista de un obturador y que es capaz de generar pulsos de
hasta 2000 µmol (fotones)·s-1·m-2. Las imágenes se graban de forma sincronizada
con los flashes de medida gracias a un obturador electrónico presente en la cámara

73
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

y que permite minimizar las interferencias de señales no moduladas. Por lo tanto, el


FluorCam permite en su conjunto captar en paralelo las señales de fluorescencia y
las correspondientes al “ruido de fondo” en imágenes separadas. Éstas son restadas
posteriormente para generar una imagen de la fluorescencia real emitida por la
muestra como resultado de la iluminación aplicada. Igualmente esta técnica
permite un cálculo muy exacto de F0, señal de fluorescencia que otros fluorímetros
no son capaces de captar. Posteriormente, gracias a un ordenador, podemos obtener
dichas imágenes y componer otras correspondientes a los coeficientes de
quenching que deseemos. Asimismo, los valores numéricos de dichos coeficientes
pueden obtenerse y utilizarse en programas de cálculo como Excel o SigmaPlot.

A.2.3.6. Aplicaciones de la fluorescencia de la clorofila de imagen


Las bondades de la fluorescencia de la clorofila han hecho que esta técnica
haya sido ampliamente usada en los últimos años y se haya considerado como el
“estetoscopio de los fisiólogos vegetales” (Valcke 2003). Revisar todas sus
aplicaciones escapa a los objetivos de esta tesis, por lo que nos centraremos
fundamentalmente en el seguimiento del estrés biótico mediante Chl-FI. Desde el
estudio pionero de Björn y Forsberg (1979) para revelar la respuesta del aparato
fotosintético al ataque por patógenos, se han realizado multitud de estudios de
estrés biótico aplicando Chl-FI.

A.2.3.6.1. Seguimiento de la infección fúngica. La bibliografía disponible


sobre Chl-FI relativa a la infección fúngica es muy amplia. Ya desde 1995, Esfeld
y sus colaboradores la utilizaron para estudiar las relaciones fuente-sumidero en
plantas de garbanzo infectadas con el hongo Ascochyta rabiei. Pudieron comprobar
que la infección fúngica conduce a una rápida inducción de Chl-F como resultado
de un aporte metabólico procedente de otros tejidos fuente actuando, por tanto, el
tejido infectado como sumidero.

74
A. Introducción

En el caso de plantas de judía infectadas con el hongo Uromyces


appendiculatus, la Chl-FI demostró que en los puntos de infección la emisión de
fluorescencia era heterogénea en el tiempo y el espacio, precediendo a los síntomas
visuales en 3 ó 4 días (Peterson y Aylor 1995). Estos autores concluyeron que la
capacidad fotosintética de las áreas infectadas estaba alterada, pero no pudieron
establecer la magnitud del daño. Similares resultados fueron obtenidos en la misma
planta, pero en esta ocasión, infectada con el hongo Colletotrichum
lindemuthianum, registrándose una inhibición de la fotosíntesis en áreas foliares
aparentemente sanas. En esta ocasión, el descenso en la tasa fotosintética fue
correlacionado con un cierre estomático (Meyer et al. 2001). Scharte et al. (2005)
también registraron un descenso en la tasa de transporte electrónico fotosintético
acoplado a cierre estomático en plantas de tabaco infectadas con el hongo
Phytophthora nicotianae.
El patrón heterogéneo en la emisión de fluorescencia (tanto espacial como
temporal) también tiene lugar en hojas de avena infectadas con el hongo Puccinia
coronata (Scholes y Rolfe 1996). La tasa fotosintética de las zonas infectadas
disminuyó al comienzo de la infección, extendiéndose progresivamente al resto de
la hoja. El patrón de qN fue más complejo, disipando más o menos energía en
forma de calor dependiendo de la zona de la hoja, invadida o no por el hongo, y del
estadio de la infección.
Resultados similares se obtuvieron en Arabidopsis infectada con Albugo
candida y en hojas de cebada infectadas con Blumeria graminis, si bien la bajada
en la tasa de fotosíntesis estaba restringida al área infectada hasta muy avanzado el
ciclo infectivo. Las imágenes de ΦPSII y de NPQ durante la inducción de la emisión
de fluorescencia revelaron una compleja heterogeneidad metabólica dentro de la
hoja infectada (Chou et al. 2000, Swarbrick et al. 2006) (Fig. 19A).
La infección de hojas de roble por Erysiphe cichoracearum y la de Botritis
cinerea en tomate provoca igualmente alteraciones en el metabolismo de la planta,
dando lugar a varios anillos con diferentes tasas fotosintéticas fácilmente

75
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

distinguibles gracias a las técnicas de Chl-FI. Las zonas que muestran una baja tasa
fotosintética coinciden con aquellas que mostraban un mayor NPQ (Repka 2002,
Berger et al. 2004).
Estos resultados contrastan con los de Aldea et al. (2006), quienes detectaron
un descenso de actividad fotosintética incluso en áreas alejadas del punto de
inoculación de Phyllosticta en varias coníferas como consecuencia del daño físico
infligido por el hongo en los RC del PSII (Fig. 19B).

dpi 0 8 11 14
A +

ΦPSII

_
NPQ
+
B ΦPSII

Fig. 19: Heterogeneidad espacio- temporal en la fotosíntesis de plantas infectadas por hongos. A)
Evolución de la infección por Albugo candida (punto de inoculación indicado por una flecha) en
hojas de Arabidopsis thaliana (tomado de Chou et al. 2000). B) Infección por Phyllostactica en hojas
de Cercis canadensis (tomado de Aldea et al. 2006).

Soukupová et al. (2003) detectaron de forma presintomática el efecto


causado por destruxinas, toxinas procedentes del hongo Alternaria brassicae, en
hojas de Brassica napus y Sinapis alba. Estos autores desarrollaron un algoritmo
simple para encontrar las señales de fluorescencia que mejor mostraran las
diferencias entre plantas tratadas con destruxinas y las control.

76
A. Introducción

La emisión de fluorescencia de hojas de remolacha aumenta antes de la


aparición de síntomas en el punto de inoculación del hongo Cercospora beticola, a
la par que se registra un descenso de la temperatura en el mismo punto (Chaerle et
al. 2004). La infección por TMV en tabaco también registra un aumento de
fluorescencia, acompañado de un incremento de la temperatura, por lo que estos
autores concluyen que las interacciones planta-patógeno pueden distinguirse
mediante métodos de imagen antes de que el daño sea visible, y que la
combinación de diferentes métodos tiene el potencial para generar firmas
específicas de este tipo de interacciones, a modo de huellas dactilares, para la
identificación temprana del patógeno.

Control P. syringae

FV/FM

ΦPSII

qN

Fig. 20: La infección con Pseudomonas syringae en Arabidopsis thaliana produce un descenso de los
parámetros de quenching indicados en la imagen (tomado de Bonfig et al. 2006).

77
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2.3.6.2. Seguimiento de la infección bacteriana. Paradójicamente, la


infección bacteriana ha suscitado poca curiosidad para aquellos que trabajan en
Chl-FI, si bien, en los últimos tiempos este campo ha experimentado un creciente
interés por parte de los investigadores. La infección producida por Pseudomonas
syringae en Arabidopsis thaliana provocó un descenso presintomático de FV/FM,
ΦPSII y qN en el sitio de infección, si bien había cierta graduación desde el borde
hacia el centro de la zona de inoculación (de mayor a menor, Fig. 20) (Bonfig et al.
2006). Los cambios en qN son un poco más complejos, y si la zona central está
muy dañada, se registra un aumento del mismo. La respuesta de Arabidopsis a P.
syringae es más o menos rápida en función a si la cepa bacteriana es virulenta
(ocasionando infección sistémica) o avirulenta (induciendo HR). Estos autores
concluyeron de su trabajo que P. syringae afecta directamente los RC del PSII.
Usando el mismo modelo experimental, Berger et al. (2007) detectaron un
descenso de FV/FM y del índice de vitalidad y un aumento de NPQ. Sin embargo, la
variabilidad que registró este último planteó a estos autores la posibilidad de
utilizar la “selección de características” para encontrar parámetros que detectaran
mejor la diferencia entre plantas control e infectadas, consiguiendo un total de 8
imágenes combinatorias que revelaron la infección presintomáticamente, y
encontrando que la bacteria avirulenta inducía cambios más drásticos.
El grupo del Dr. Ramos y el Ldo. Rodríguez-Moreno han estudiado, en
colaboración con nuestro grupo, los efectos de la infección con varios patovares de
P. syringae en judía. Se ha comprobado que la infección bacteriana induce cambios
tanto espaciales como temporales en la eficiencia fotosintética y en el NPQ. Los
distintos valores de éste dentro de la hoja infectada pudieron correlacionarse con la
concentración bacteriana dentro de la hoja infectada.
Otra posibilidad que ofrecen las técnicas de Chl-FI es su uso con propósitos
de biorremediación. En este sentido, la Chl-FI ha demostrado ser un método rápido
y fiable para la detección de la biodegradación de herbicidas mediante una bacteria
que degrada linurón (Variovorax paradoxus WDL1). Las plantas crecidas con

78
A. Introducción

linurón suministrado en su solución nutritiva, sufrieron más daños que aquellas que
crecieron con linurón más la mencionada bacteria, lo que fue rápidamente
descubierto mediante Chl-FI, mientras que la termografía de imagen detectó el
efecto de forma mucho más tardía (Chaerle et al. 2003).

Fig. 21: Emisión de fluorescencia de una hoja de tabaco infectada con TMV a diferentes días post-
inoculación (indicados en cada panel). El patrón de emisión es heterogéneo en el espacio y en el
tiempo (tomado de Balachandran et al. 2004).

A.2.3.6.3. Seguimiento de la infección viral. El modelo experimental tabaco-


TMV ha sido objeto de estudio de la Chl-FI en varias ocasiones. Osmond et al.
(1990) y Balachandran et al. (1994) estudiaron la reacción sistémica de la planta a
este virus, demostrando que la infección provoca una emisión de fluorescencia
variable en el tiempo y en el espacio, detectable de forma presintomática (Fig. 21).
La HR inducida por TMV en tabaco fue estudiada por Chaerle et al. (2004),
quienes registraron un aumento de fluorescencia en el punto de inoculación del
virus. Sajnani (2005) estudió la emisión de fluorescencia y los coeficientes de

79
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

quenching en la infección sistémica de tabaco silvestre (WT) y tabaco transgénico


por TMV. Las plantas transgénicas sobreexpresaban la enzima β-
carotínhidroxilasa, por lo que son capaces de incrementar la tasa y velocidad de
síntesis de zeaxantina en condiciones de alta intensidad lumínica (Götz et al. 2002).
Los mejores parámetros para el seguimiento de la infección viral fueron NPQ y
ΦPSII, que demostraron una relación inversamente proporcional, si bien la magnitud
de los cambios era mucho menor en el caso de este último. Los experimentos se
llevaron a cabo a media y alta intensidad lumínica. Aún en las drásticas
condiciones de estrés que supone la infección bajo alta intensidad lumínica, la línea
transgénica de tabaco no mostraba diferencias en su comportamiento fotosintético
con respecto a la WT y en definitiva, tampoco ventajas.
De forma similar a la infección por hongos que provoca heterogeneidad
espacial en la fotosíntesis de las plantas infectadas, la infección por el virus del
mosaico del pepino (CMV) en plantas de calabaza también provoca la
diferenciación de varias regiones circulares con diferentes tasas de fotosíntesis y
distintos niveles de emisión de fluorescencia (Técsi et al. 1994).
Mediante Chl-FI se pudo comprobar que el NPQ refleja el estado de
desarrollo de los síntomas provocados por el geminivirus restringido a floema,
Abutilon mosaic virus, en plantas de Abutilon striatum Dicks. (Osmond et al. 1998,
Lohaus et al. 2000).
La infección de Eupatorium makinoi por geminivirus da lugar a plantas
variegadas muy usadas en decoración en los jardines japoneses. El descenso de Chl
de las hojas provoca bajas tasas fotosintéticas (Funayama-Noguchi 2001).
En colaboración con el del Dr. Roland Valcke, nuestro grupo, empleando el
sistema experimental Nicotiana benthamiana-cepa italiana de PMMoV (PMMoV-
I), demostró que el NPQ fue el parámetro de quenching que mejor distinguió las
plantas infectadas de las sanas en hojas que nunca muestran síntomas
(asintomáticas) (Pérez-Bueno 2003, Pérez-Bueno et al. 2006). A los 14-17 dpi se
registró un aumento de NPQ en los tejidos adyacentes a las venas principales,

80
A. Introducción

rodeados de una delgada línea de bajo NPQ (Fig. 22). Este patrón espacio-temporal
es muy característico de este tobamovirus en N. benthamiana, pudiéndose
correlacionar la zona de alto NPQ con el patrón de distribución del virus en las
hojas asintomáticas.

Control

PMMoV-I

dpi 7 14 17 21 24 28

Fig. 22: La infección de N. benthamiana por PMMoV-I da lugar a un patrón de NPQ espacio-
temporal heterogéneo en hojas asintomáticas (tomado de Pérez-Bueno 2003).

Reflectancia ΦPSII Temperatura

avispa

hongo

Fig. 23: El daño ocasionado por insectos y por hongos causa un descenso de la actividad fotosintética
más allá del área afectada y provoca efectos antagonistas en la temperatura (ºC) de las hojas (tomado
de Aldea et al. 2006).

81
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2.3.6.4. Seguimiento de los daños ocasionados por herbívoros. Los


insectos herbívoros producen graves pérdidas en prados y masas forestales; sin
embargo, el impacto que generan en plantas individuales no puede calcularse sólo
por la cantidad de tejido devorado por los herbívoros, debido a que su impacto en
fotosíntesis es mayor que la suma de los agujeros provocados (Zangerl et al. 2002).
Muchos de los fenómenos que median los efectos del daño en fotosíntesis han
pasado desapercibido a los investigadores porque las medidas puntuales realizadas
mediante métodos convencionales de intercambio de gases en pequeñas áreas de
las hojas han sido técnicamente imposibles (Zangerl et al. 2002). El desarrollo de
las técnicas de Chl-FI ha solventado estas limitaciones, proporcionando imágenes
de grandes áreas de las hojas y un completo análisis de quenching. Así, se ha
demostrado que los efectos adversos de los herbívoros en la fotosíntesis se
extienden mucho más allá del área afectada (hasta 6 veces más que el tamaño de
ésta) (Zangerl et al. 2002, Aldea et al. 2006), y varían incluso en función del
estadio larvario del insecto (Tang et al. 2006). Las zonas donde se registra un
descenso de FV/FM o ΦPSII, normalmente registran un aumento de NPQ, aunque la
Chl-FI es capaz de detectar cierta heterogeneidad y distinguir zonas con bajo NPQ
(Tang et al. 2006). La combinación entre Chl-FI y la termografía de imagen resulta
un arma poderosa a la hora de valorar el daño provocado por los herbívoros e
incluso ayudaría a distinguir entre diferentes estreses bióticos por el efecto
antagonista que estos provocan en ambas radiaciones electromagnéticas (Fig. 23,
Aldea et al. 2006, Tang et al. 2006).

A.2.3.6.5. Seguimiento de los daños post-cosecha. Los vegetales una vez


cosechados también son susceptibles del ataque por patógenos. Dado que los frutos
poseen Chl, su emisión de fluorescencia es susceptible de ser medida mediante
Chl-FI y es posible utilizar esta técnica como una herramienta de control de
calidad. Mientras maduran, los frutos van perdiendo Chl y su emisión de Chl-F es

82
A. Introducción

menor, por lo que esta técnica también puede emplearse para determinar el grado
de madurez y vida media de los mismos (Ciscato 2000, Nedbal et al. 2000b).
La Chl-FI pudo poner de manifiesto presintomáticamente la infección de
limones por Penicillium digitatum (Fig. 24) (Nedbal et al. 2000b). Más
recientemente, el daño ocasionado por toxinas de Trichothecium roseum o por
podredumbre negra en manzanas también pudo detectarse mediante Chl-FI (Ariana
et al. 2006, Žabka et al. 2006).
Butz et al. (2005) han realizado una revisión sobre los métodos desarrollados
para el control no destructivo de la calidad de los frutos, concluyendo que la
combinación de diferentes técnicas, entre las que se encuentras las de imagen, es la
mejor opción para conseguir este propósito.

F0

FV

FM

F0/FM

Tiempo 0 h 48 h 66 h 84 h

Fig. 24: Detección presintomática de la infección por Penicillium digitatum en limones (tomado de
Nedbal et al. 2000b).

83
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.2.3.6.6. Teledetección. Nilsson (1995a) revisó las aplicaciones de


diferentes técnicas de imagen con fines de teledetección, entre las que se
encontraba la Chl-FI. Desde entonces, las mejoras en la modulación de la luz en los
sistemas de medición y la más elevada sensibilidad de los detectores de imágenes
permiten mejores medidas de cultivos en el campo y a plena luz solar (Nedbal y
Whitmarsh 2004). En tanto que la fluorescencia inducida por luz UV también
provoca la emisión de Chl-F, todo lo descrito en el apartado A.2.2.4.9. puede
aplicarse a la Chl-FI como medio de teledetección.

A.3. PROTEÓMICA DE PLANTAS

El término proteoma fue acuñado por vez primera en el congreso de


Electroforesis Bidimensional de Siena (1994) y hace referencia al conjunto de
proteínas expresadas por un genoma (William y Hochstrasser 1997). En el caso de
las plantas, el proteoma se correspondería con la expresión de proteínas de una
planta, órgano, tejido, tipo celular u orgánulo en un estado de desarrollo
determinado (Hochholdinger et al. 2006) y la proteómica se definiría, por tanto,
como el análisis sistemático de la población proteica de dichos compartimentos
(van Wijk 2001). El proteoma de cada célula viviente, a diferencia del genoma, es
dinámico, alterable en respuesta al estado metabólico de la célula y a la recepción
de moléculas señal intra y extracelulares; además muchas de las proteínas que se
expresan son susceptibles de modificaciones post-traduccionales (PTM, post-
translational modifications) (Newton et al. 2004). Por todo ello, surgió la
necesidad de redefinir el término proteómica, en la que se ha denominado era de la
postgenómica, sugiriéndose que la proteómica representa el esfuerzo para
establecer las identidades, cantidades, estructuras y funciones bioquímicas y
celulares de todas las proteínas pertenecientes a un organismo, órgano u orgánulo;
también estudiaría esta disciplina cómo estas propiedades varían en el espacio, el
tiempo y bajo distintas condiciones fisiológicas (Kenyon et al. 2002).

84
Fig. 25: Esquema del sistema experimental y de las técnicas más empleadas en proteómica.
Prefraccionamiento
Prefraccionamiento ESI MALDI
dela
de lamuestra
muestra Separación
Separación Separaciónde
Separación de
(recomendado)
(recomendado) proteica
proteica Digestióntríptica
Digestión tríptica Ionización
Ionización iones
iones

Electroforesis: Cromatografía:
MS:
•1D •Monodimensional
•Trampa iónica MS/MS:
•SDS-PAGE •Bidimensional
•Cuadrupolo (Q) •TOF/TOF
•BN-PAGE •Multidimensional
•TOF •QTOF
•2D
•FTICR
•IEF/SDS-PAGE
•2D-DIGE Detección:
Detección:
•BN/SDS-PAGE dela
•Medidade
•Medida lamasa
masa
Identificación de la muestra dela
•Medidade
•Medida laabundancia
abundancia
•Huella peptídica (PMF) •ICAT
•ICAT
•Secuenciación de novo •ITRAQ
•ITRAQ

Modificaciones post-traduccionales Confrontacióncon


Confrontación conbases
basesde
dedatos
datos
(Post-traductómica)
Screening:

A. Introducción
Interacciones proteína-proteína (SELDI-TOF MS) •Mutantes
(Interactómica) •Estreses
•Estados de desarrollo
85
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

La proteómica se está convirtiendo en una herramienta poderosa en la


caracterización funcional de plantas modelo y cultivables, debido
fundamentalmente a dos motivos: la cada vez más amplia información de
secuencias de nucleótidos (Whitelegge 2004), y la alta sensibilidad y rapidez en la
identificación de proteínas por espectrometría de masas (MS) conseguidos en los
últimos años (Fig. 25, Jonsson 2001, Cánovas et al. 2004, Newton et al. 2004). La
velocidad, exactitud y sensibilidad de la MS supera a otras técnicas anteriores
como la secuenciación mediante el método de Edman (1970). Debido a que los
avances tecnológicos en proteómica son cada vez más accesibles, los esfuerzos por
catalogar y cuantificar proteomas completos son paralelos a otras aproximaciones
genómicas, transcriptómicas o metabolómicas. La aplicación de los datos obtenidos
mediante proteómica para catalogar genes, mostrar información sobre PTMs de los
genes identificados y su localización subcelular es particularmente interesante
(Baginsky y Gruissem 2006), reconociéndose que la proteómica es el nexo de
unión entre genómica, genética y fisiología (Zivy y de Vienne 2000).

A.3.1. Espectrometría de masas


El método de identificación de proteínas mediante MS se resume en la Fig.
25.

A.3.1.1. Preparación de la muestra


Una buena preparación de la muestra, consiguiendo extraer el máximo
número de proteínas de una célula, tejido, órgano u organismo dados, es el paso
más importante para lograr este objetivo (Agrawal et al. 2005a). Se recomienda el
prefraccionamiento, ya que puede reducir mucho la complejidad del extracto
proteico, mientras que se enriquece de proteínas poco abundantes. Otro beneficio
añadido es la información funcional que se obtiene determinando el compartimento
subcelular donde las proteínas están individualmente localizadas (Bertone y Snyder
2005). Las proteínas se aíslan del resto de los componentes vegetales mediante

86
A. Introducción

diversos métodos, entre los que destaca el empleo de fenol o de acetona-


tricloroacético (Hurkman y Tanaka 1986, Shaw et al. 2003). La meta final es la
solubilización de las proteínas en un tampón que se adecue al sistema de
separación que se vaya a emplear.

A.3.1.2. Separación proteica


Las proteínas pueden separarse mediante técnicas electroforéticas o
cromatográficas. La electroforesis monodimensional (1D) en geles de
poliacrilamida es el método más sencillo de separación electroforética de proteínas
en función de la masa molecular de las proteínas desnaturalizadas (SDS-PAGE,
sodium dodecil sulphate poliacrylamide gel electrophoresis, Laemli 1970) o del
tamaño y la forma de complejos proteicos en condiciones nativas (BN-PAGE, blue
native poliacrylamide gel electrophoresis, Schägger y Jagow 1991, Eubel et al.
2005). Sin embargo, debido al gran número de proteínas que se encuentran en las
muestras biológicas, es necesario un sistema de separación que aumente el nivel de
resolución añadiendo un criterio de separación previo. Así nació la electroforesis
bidimensional (2D) con técnicas como BN/SDS-PAGE (Fig. 26) y el IEF/SDS-
PAGE (O’Farrell et al. 1977). El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica de
separación de proteínas en función a su punto isoeléctrico (pI) empleando soportes
en los que se ha establecido un gradiente de pH.
Los geles 1D o 2D, una vez teñidos (azul Coomassie, tinción de plata o
tinción fluorescente con SYPRO® Ruby) y escaneados pueden ser analizados y
comparados con programas de imagen comerciales, especialmente diseñados a tal
fin. Dichos programas han sido objeto de continuas mejoras durante los últimos
años, pero todavía hay un largo camino hasta conseguir la completa automatización
del análisis de la imagen sin requerir la intervención del usuario (Görg et al. 2004).
La comparación de muestras con el método convencional de IEF/SDS-PAGE
requiere el estudio de varios geles a la vez en los que la migración de cada proteína
y su intensidad pueden diferir de un gel a otro, aumentando la variabilidad experi-

87
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

ATP sintasa Monómeros PSII


PSI Dímeros PSII Cyt b6f Trímeros LHCII
Supercomplejos PSII Rubisco Ensamblaje LHCII

Fig. 26: Separación proteica mediante 2D electroforesis: BN/SDS-PAGE. Complejos proteicos


cloroplastídicos y su composición en subunidades en Arabidopsis thaliana (tomado de Aro et al.
2005).

mental. Este problema ha sido subsanado por la técnica 2D-DIGE (2D difference
gel electrophoresis, Ünlü et al. 1997, Tonge et al. 2001, Alban et al. 2003), que
permite el análisis de varias muestras en un solo gel gracias al empleo de
fluoróforos (Görg et al. 2004); así se reducen las variaciones metodológicas en las
posiciones y abundancia de las proteínas. Este método permite economizar tiempo
y esfuerzo, ya que conlleva el uso de un menor número de geles. Las aplicaciones
de la 2D-DIGE incluyen el estudio de la expresión diferencial bajo varias

88
A. Introducción

condiciones de crecimiento o estrés, comparación de extractos y el análisis de la


variabilidad biológica (Görg et al. 2004). Diversos estudios usando 2D-DIGE en
proteómica comparativa han demostrado la gran sensibilidad y reproducibilidad del
sistema (Alban et al. 2003, Amme et al. 2006, Lilley y Dupree 2006).
La cromatografía 1D, 2D o multidimensional permite una mayor
automatización del proceso cuando se quieren catalogar las proteínas de extractos
celulares complejos a gran escala (Bertone y Snyder 2005).

A.3.1.3. Digestión e ionización de la muestra


La digestión tríptica de las proteínas separadas por los métodos anteriores
proporciona una huella peptídica (PMF, peptide mass fingerprinting) característica
de cada proteína, lo que permite en la mayoría de los casos su identificación sin
ambigüedades (Cottrell 1994). Los péptidos generados son identificados mediante
MS, lo que requiere una ionización previa de la muestra. En la década de los 80, la
introducción de dos métodos de ionización “suaves” cimentó las bases de la
identificación rápida y altamente sensible de las proteínas mediante MS (Gevaert et
al. 2001). Dichos métodos, cuya fundamental aportación a la ciencia ha sido
reconocida en 2002 con el Premio Nóbel de Química, son la desorción/ionización
mediante láser asistida por matriz (MALDI, matriz-assisted laser
desorption/ionization) (Karas et al. 1988, Tanaka et al. 1988) y la ionización
mediante electroespray (ESI, electrospray ionization) (Fenn et al. 1989).

Fig. 27: Esquema de la ionización de péptidos mediante MALDI. El láser provoca la desorción e
ionización de la muestra (tomado de www.cnic.es/proteomica).

89
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

En la ionización MALDI los analitos co-cristalizados en una matriz


apropiada son convertidos en iones mediante la acción de un láser pulsado (Fig.
27). La matriz actúa como intermediaria en el proceso de transferencia de energía
entre el láser y los péptidos, absorbiendo energía del primero y transfiriéndola a los
segundos, los cuales se desorben e ionizan a la par que adquieren carga
(generalmente positiva) procedente también de la matriz. El proceso de ionización
por MALDI genera principalmente iones con una sola carga (Karas et al. 1988,
Tanaka et al. 1988, Jonson 2001, www.cnic.es/proteomica).

Cátodo

Ánodo

Fig. 28: Representación esquemática del proceso de ESI (tomado de Jonson 2001).

El ESI y sus variantes de bajo flujo (ESI nano-flujo o nanoespray) es un


método de ionización a presión atmosférica que produce, a partir de un medio
líquido y bajo la influencia de un campo eléctrico, pequeñas gotas con una o varias
cargas. El flujo líquido pasa a través de una aguja a alto voltaje, creándose una
acumulación de cargas en el extremo de la aguja. Bajo el campo eléctrico, la
repulsión entre cargas del mismo signo es tan grande que provoca la ruptura de la
superficie del líquido, rompiéndose en pequeñas gotas altamente cargadas que se
mueven hacia el electrodo (Fig. 28). Los iones en la fase gaseosa se forman
mediante una serie de evaporaciones cíclicas del disolvente mientras son aceleradas

90
A. Introducción

hacia la entrada del espectrómetro de masas (cátodo). El método del nanoespray


consigue flujos menores de muestra, lo que reduce la cantidad de muestra
consumida y aumenta la sensibilidad del método (Fenn et al. 1989, Wilm y Mann
1996, Jonson 2001, Newton et al. 2004).

A.3.1.4. Separación e identificación de los iones


Los iones en fase gaseosa son separados de acuerdo a su cociente masa/carga
(m/z). Hay cuatro tipos de espectrómetros de masas compatibles con las técnicas
proteómicas: el cuadrupolo (Q), la trampa iónica (IT, ion trap), el “tiempo de
vuelo” (TOF, time-of flight) y el Fourier-transform ion cyclotron resonance
(FTICR). Las cualidades de cada uno de ellos están recogidas en la tabla 1, y su
rango de sensibilidad se encuentra en el rango de los pmol o fmol. Los más usados
son el Q y el TOF (Jonsson 2001, Aebersold y Mann, 2003, Newton et al. 2004).
En el TOF lineal los iones son acelerados de tal forma que los iones con bajo
cociente m/z viajan a mayor velocidad a lo largo de la zona de deriva y llegan antes
al detector que registra los “tiempos de vuelo”. A partir de éstos pueden calcularse
las relaciones m/z de los iones. El analizador TOF tiene una naturaleza pulsada
(discontinua) y ha sido ampliamente usado junto con una fuente pulsada de iones
como es el MALDI (Jonsson 2001, Chernushevich et al. 2001,
www.cnic.es/proteomica).

Tabla 1: Principales analizadores de masas usados en espectrometría y sus características


principales (modificado a partir de Newton et al. 2004).

Analizador Fiabilidad Coste Complejidad Velocidad


Q Alta Bajo Baja Rápida
IT Alta Medio Baja-Media Rápida
TOF Moderada Medio-Alto Baja-Media Muy rápida
FTICR Moderada Alto Alta Moderada

91
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

El Q está compuesto por cuatro cilindros conductores y funciona aplicando la


combinación de una corriente directa y una radiofrecuencia, actuando como un
filtro de iones, de tal manera que se pueden seleccionar iones según su masa. El Q
es un analizador en continuo, lo que le hace altamente compatible con fuentes de
infusión continua como el electroespray o técnicas cromatográficas en líquido (LC)
(Jonsson 2001, Chernushevich et al. 2001).
La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) añade otra dimensión a la
identificación proteica, puesto que aumenta la eficacia del método mediante su
duplicación. La posibilidad de emplear MS o MS/MS permite multitud de
combinaciones, aunque se prefieren las de MALDI-TOF/TOF y LC-ESI-Q/TOF
(Newton et al. 2004). La mayor ventaja que presenta este último método con
respecto al MALDI-TOF/TOF es que se pueden analizar muestras muy complejas
de proteínas (Link et al. 1999, Aebersold y Mann 2003, Beranova-Giorgiani 2003,
Newton et al. 2004, Zolla et al. 2004).
La identificación de las proteínas mediante PMF es posible gracias a la
existencia de bases de datos generadas a partir de secuencias tanto proteicas como
génicas, estas últimas proporcionadas por los múltiples proyectos genómicos que
se han desarrollado en los últimos años y que continuamente se actualizan con
información de los muchos genes ya clonados. Para ello, se han elaborado
programas informáticos como MASCOT, SEQUEST o Pro-Found que, mediante
sofisticados algoritmos, adjudican una puntuación a cada proteína según el grado
de solapamiento con proteínas existentes. Cuando la proteína de interés no está
presente en las bases de datos, a veces es posible identificarla mediante homología
con otras proteínas (Cottrell 1994) o bien, mediante secuenciación de novo. Esto
último es posible gracias a las técnicas de MS/MS y consiste en la generación de
una secuencia parcial que puede ser usada en combinación con la masa del ión
parental intacto, para proporcionar información adicional a la búsqueda por
homología (Hunt et al. 1986, van Wijk 2001, Liska y Shevchenko 2003, Görg et al.
2004, Granvogl et al. 2006). Existen múltiples bases de datos generales con las que

92
A. Introducción

confrontar los espectros generados por MS y MS/MS: NCBI (National Center for
Biotechnology Infomation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EBI (European
Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/Databases/proeomic.html), Swiss-
Prot y TrEMBL (http://www.expasy.org/sprot). Bases de datos específicas para
plantas son: TAIR (The Arabidopsis Information Resource,
http://www.arabidopsis.org, Huala et al. 2001), TIGR (genome rice annotation,
http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/index.shtml, Goff et al. 2002, Yu et al. 2002),
una base de datos específica para plantas arbóreas, con Populus trichocarpa como
planta modelo (http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/Poptr1.home.html), PPdb (Plastid
Proteome database, http://ppdb.tc.cornell.edu/, Sahnoun et al. 2000), Plastid
Protein DB (PL_prot, http://www.pb.ipw.bio.ethz.ch/), PROTICdb
(http://moulon.inra.fr/~bioinfo/PROTICdb, Ferry-Dumazet et al. 2005), AMPDB
(Arabidopsis Mitochondrial Protein Database, http://www.ampdb.bcs.uwa.edu.au/,
Heazlewood y Millar 2005), http://www.gramene.org/ y http://www.plantgdb.org/.
La modificación en la expresión proteica provocada por el estrés en las
plantas puede ser cuantificada gracias a métodos como el ICAT o el ITRAQ, que
añaden distintas modificaciones químicas a los péptidos provenientes de muestras
diferentes que pueden ser detectadas mediante MS/MS (Gygi et al. 1999, 2000,
Dunklye et al. 2004, Newton et al 2004, Whitelegge 2004, Jones et al. 2006a,
Lilley y Dupree 2006)
Dado que la secuencia de muchas de las proteínas maduras de los
organismos eucariotas no coincide con la secuencia aparente deducida a partir del
DNA, la proteómica abre paso a la llamada post-traductómica, ya que permite la
deducción de sitios de splicing, PTMs y proteolisis de péptidos señal (Aebersold y
Mann 2003, Hirano et al. 2004, Seo y Lee 2004, Kwon et al. 2006, Whitelegge et a.
2006). La proteómica también abre las puertas a la llamada interactómica (Hirano
et al. 2004), que estudia las interacciones proteína-proteína o proteína-ligando. Una
de las técnicas que permite dicho estudio es el empleo de chips de proteínas
(SELDI-TOF MS, Issaq et al. 2002).

93
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

A.3.2. Proteómica de plantas empleando geles bidimensionales: estudio de


proteínas con punto isoeléctrico en el rango básico (pH>7)
En el presente trabajo de Tesis Doctoral nos hemos centrado en la resolución
del patrón proteico cloroplastídico de Nicotiana benthamiana en el rango básico,
prestando especial atención a proteínas con alto pI, como complemento a estudios
previos del grupo sobre proteínas cloroplastídicas en el rango de pH 4-7 (Pérez
Bueno et al. 2004; Sajnani, 2005). En ambos casos, se ha abordado también el
efecto de la infección con PMMoV en el proteoma de la planta huésped.
Clásicamente, el IEF (O’Farrell et al. 1977) presentaba toda una serie de
problemas que hacían difícil la reproducibilidad del método. El más conflictivo era
el establecimiento de un gradiente de pH en los geles de disco empleados, para el
cuál era necesario el uso de anfolitos. Esta dificultad, añadida a la imposibilidad de
generar gradientes de pH elevados y a otras relativas al manejo, se ha salvado con
el empleo de geles de poliacrilamida en los que el gradiente de pH está
inmovilizado (en inglés, immobilized pH gradients o IPGs). Este método permite
una gran resolución y reproducibilidad en los resultados, así como la separación de
proteínas de alto punto isoeléctrico (Corbett et al. 1994; Blomberg et al. 1995;
Görg et al. 2000, 2004).
Son raras las ocasiones en las que los geles de disco se siguen empleando
(Komatsu et al. 2006). Estos autores han conseguido establecer un gradiente de pH
entre 4,5 y 8,5 y mediante 2D-DIGE han logrado encontrar proteínas reguladas por
giberelinas en arroz. Además de los IPGs, existen otros métodos que mejoran el
IEF de proteínas con elevados pI. El empleo de tampones específicos para
solubilizar la muestra para IEF/SDS-PAGE es uno de ellos (Chinnasamy y
Rampitsch 2006). También contribuye a la mejora del IEF el método llamado cup-
loading, o carga de las proteínas en el IPG una vez éste se ha rehidratado, en lugar
de hacer una rehidratación con muestra, que es el método convencional por ser el
más sencillo; la carga anódica ha demostrado que mejora el enfoque de proteínas
con elevado pI o muy hidrofóbicas (Görg et al. 2000, 2004). Curiosamente, gran

94
A. Introducción

parte de estas últimas han demostrado ser proteínas de naturaleza básica


(Seigneurin-Berny et al. 1999, Rossignol 2001, Ephritikhine et al. 2004). Por
último, el IEF de proteínas básicas puede ser mejorado substancialmente utilizando
voltajes muy bajos al principio del proceso, que se van incrementando muy
lentamente en sucesivos pasos, lo que alarga el tiempo de IEF pero arroja
excelentes resultados (Görg et al. 2000, 2004).
En los últimos años, la proteómica ha generado gran número de revisiones
bibliográficas, pero tan sólo un 5% corresponden a proteómica vegetal (Schröeder
y Kieselbach 2003). Agrawal et al. (2005b) hacen una revisión de la proteómica de
los órganos de plantas dicotiledóneas, Ephritikhine et al. (2004) y Whitelegge
(2003) de las membranas vegetales, Cánovas et al. (2004) sobre la interacción
planta-patógeno y planta-organismo simbionte, y también se han publicado
recientemente revisiones completas sobre proteómica de los orgánulos vegetales en
general (Cánovas et al. 2004, Newton et al. 2004, Rossignol et al. 2006) y de los
plástidos en particular (van Wijk 2004). En nuestro grupo, Sajnani (2005) elaboró,
en su Tesis Doctoral, una completa revisión de la proteómica del cloroplasto. Sin
embargo, y debido a la complejidad que conlleva el estudio y caracterización de
proteínas de elevado pI, son muy pocos los artículos sobre proteómica de plantas
que lo abordan.
Porubleva et al. (2001) consiguieron resolver, a partir de extractos crudos de
hojas completas de maíz, 200 manchas en un rango de pH 6-11 en geles 2D.
Rolland et al. (2003) en una revisión sobre proteómica de la cubierta
cloroplastídica (envelope) establecieron que una gran parte de estas proteínas
tienen un alto pI. El análisis del lumen tilacoidal de plantas de Arabidopsis en el
rango de pH 7-11, demuestra que se resuelven un menor número de proteínas que
en el rango ácido (4-7), 12 frente a 69. De las proteínas básicas, destacan PsbQ del
OEC y una PsbQ-like (Peltier et al. 2002; Schubert et al. 2002). El estudio de
proteínas periféricas y del lumen de guisante en el rango de pH 7-11, llevó a la
identificación de 6 proteínas con pI>7; tan sólo una de ellas se correspondió con

95
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

PsbQ (Peltier et al. 2000).El análisis de las preparaciones de cloroplastos íntegros


de Arabidopsis en el rango de pH 7-10 permitió la resolución de 11 proteínas; de
las cuales, 3 fueron identificadas mediante MALDI-TOF/MS como la proteína
PsbQ del OEC, cuya expresión disminuye tras la exposición de la planta a altas
intensidades de luz (Phee et al. 2004).

A.3.3. Proteómica de las interacciones planta-patógeno


Aunque existe abundante literatura sobre los genes que están implicados en
la patogénesis, pocos esfuerzos se han dedicado a identificar las modificaciones en
el proteoma vegetal asociadas a la interacción planta-patógeno (Cánovas et al.
2004). Sin embargo, en los últimos años, han aparecido algunos trabajos que
abordan este objetivo.
La detección de patógenos en las plantas, vectores o reservorios naturales es
esencial para asegurar su salud y una agricultura sostenible. La proteómica, junto
con los avances en la secuenciación de los genomas de muchos patógenos
vegetales, abriría múltiples posibilidades en el desarrollo de técnicas rápidas,
sensibles y específicas con este fin (López et al. 2003). La MS, con su capacidad de
discriminar proteínas y péptidos exclusivos de patógenos sin la necesidad de
reactivos específicos para ellos, podría rivalizar con las aproximaciones genómicas
(Padliya y Cooper 2006). Cooper et al. (2003) fueron capaces de identificar en dos
plantas del género Nicotiana proteínas del Virus X de la patata, mediante
cromatografía acoplada a MS/MS. Casado-Vela et al. (2006) consiguieron incluso
diferenciar entre especies y cepas de tobamovirus en frutos de tomate, mediante 2D
y MALDI-TOF MS. Muy recientemente, Padliya y Cooper (2006) realizaron una
completa revisión sobre MS aplicada a la detección de patógenos vegetales y
sostienen que esta técnica identifica mejor un virus vegetal que cualquier otra.
Otro enfoque es la detección de proteínas cuya expresión es inducida o se ve
afectada, al alta o a la baja, por la acción de factores de estrés biótico. El análisis
proteómico de cultivos celulares de Arabidopsis reveló aquellas proteínas que

96
A. Introducción

respondían al tratamiento con elicitores fúngicos, entre las que se encuentran


proteínas de defensa frente a estrés oxidativo, mitocondriales y de la pared celular,
así como chaperonas moleculares, una kinasa y otras participantes en diversas rutas
metabólicas (Ndimba et al. 2003, Chivasa et al. 2006). La infección por
Pseudomonas syrangae pv. tomato en estas mismas plantas induce la expresión de
dos grupos de enzimas antioxidantes: glutation S-transferasas y peroxiredoxinas
(Jones et al. 2004), así como cambios en la expresión de enzimas del metabolismo
del carbono y proteínas del PSII (Jones et al. 2006b). Los miembros de estas
familias proteicas pueden ser modificados post-transduccionalmente según la
virulencia de la cepa de P. syrange pv. tomato y el resultado de la infección (Jones
et al. 2004), según demuestran los múltiples spots presentes en los geles (Jones et
al. 2004, 2006b). El mismo sistema huésped-patógeno fue usado para probar por
primera vez la técnica de ITRAQ en plantas. El sistema tuvo éxito detectando 5
proteínas que podrían fosforilarse como parte de la respuesta defensiva basal
(reconocimiento del patógeno) de la planta a la infección (Jones et al. 2006a).
La infección fúngica ha sido la más estudiada, usando gran variedad de
sistemas huésped-patógeno. Las proteínas vegetales cuya expresión se ve afectada
y/o inducida pertenecen a: rutas fotosintéticas, siendo el cloroplasto el principal
orgánulo afectado (Zhou et al. 2006); metabolismo del carbono y producción de
energía; transducción de señales (Curto et al. 2006); síntesis de aminoácidos;
metabolismo del nitrógeno (Zhou et al. 2006); proteínas de la pared celular
(Colditz et al. 2004, Kim et al. 2004); rutas antioxidantes (Campo et al. 2004, Kim
et al. 2004, Zhou et al. 2006); síntesis, degradación, plegamiento y estabilización
proteicas (Campo et al. 2004, Colditz et al. 2004, Curto et al. 2006); y proteínas
relacionadas con la patogénesis (PR) (Konishi et al. 2001, Rep et al. 2002, Campo
et al. 2004, Colditz et al. 2004, Kim et al. 2004, Curto et al. 2006, Smith et al.
2006, Zhou et al. 2006).
El efecto de la planta parásita Orobanche crenata en Pisum sativum ha sido
estudiado mediante aproximaciones proteómicas por Castillejo et al. (2004),

97
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

encontrándose que en plantas de guisante susceptibles disminuyen los niveles de


algunas proteínas del metabolismo de los carbohidratos y del nitrógeno, así como
enzimas del transporte electrónico mitocondrial, mientras que en plantas resistentes
aumentaron las proteínas relacionadas con la ruta de asimilación del nitrógeno y las
proteínas PR.
En cuanto a los cambios detectados en plantas infectadas con virus, se han
encontrado mediante BN/SDS-PAGE varias proteínas PR, de las cuales 10 tienen
naturaleza básica (Roggero y Pennazio 2005). En nuestro grupo, se han encontrado
varias isoformas de la proteína PsbP del OEC, cuyo nivel de expresión varía con la
infección por PMMoV (Pérez-Bueno et al. 2004, Sajnani 2005), indicando una
regulación diferencial del mismo para hacer frente al estrés ocasionado por el virus.
Además, una aproximación al proteoma cloroplastídico de N. benthamiana
mediante IEF/SDS-PAGE en el rango de pH 4-7 nos ha permitido resolver unos
150 polipéptidos, de los cuales se han identificado 55 que pertenecen a 29 proteínas
distintas. La infección indujo un descenso en al menos 26 de ellas, pertenecientes a
13 proteínas diferentes, la mayoría pertenecientes al ciclo de Benson-Calvin y a la
cadena de transporte electrónico fotosintético (Sajnani 2005).

98
B. Objetivos / Objectives

B. OBJETIVOS

1. Seguimiento de la infección viral en el sistema huésped-patógeno Nicotiana


benthamiana-PMMoV mediante técnicas de imagen para comprobar su utilidad en
el diagnóstico y detección temprana del estrés biótico.

1.1. Investigación del efecto de la infección viral sobre la transpiración


foliar mediante termografía de imagen.
1.2. Estudio de los cambios en los patrones espaciales de emisión de
fluorescencia de plantas infectadas, usando técnicas de imagen de
detección de fluorescencia multiespectral inducida por UV. Análisis de
compuestos emisores.
1.3. Análisis del impacto de PMMoV sobre el aparato fotosintético de
la planta huésped mediante la captación de imágenes de fluorescencia
roja.

2. Estudio del proteoma del cloroplasto de Nicotiana benthamiana en el rango de


pH 6-11, así como de los cambios inducidos en éste por la infección con PMMoV.

99
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

OBJECTIVES

1. Study of the viral infection in the host-pathogen system Nicotiana benthamiana-


PMMoV by means of imaging techniques, to test their applications in the diagnosis
and early detection of biotic stress.

1.1. Analysis of the viral-induced changes on leaf transpiration by


means of imaging thermography.
1.2. Study of changes on the fluorescence leaf spatial pattern in
infected plants by UV-induced multicolour fluorescence imaging.
Analysis of emitting compounds.

1.3. Study of changes caused by PMMoV infection on the


photosynthetic apparatus of infected plants by means of red
fluorescence imaging.

2. Proteomic approach to the Nicotiana benthamiana chloroplast proteome in the


pH range 6-11. Analysis of the changes induced by the PMMoV infection.

100
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

C.1. Robotized thermal and chlorophyll-fluorescence imaging of


pepper mild mottle virus infection in Nicotiana benthamiana

Laury Chaerle1,4, Mónica Pineda2,4, Remedios Romero-Aranda3, Dominique Van


Der Straeten1,*, Matilde Barón2,*

1. Unit Plant Hormone Signalling and Bioimaging, Ghent University, K. L. Ledeganckstraat 35, B-
9000 Gent (Belgium).
2. Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology of Plants, Estación Experimental del
Zaidín. C/ Profesor Albareda, nº 1. C.P. 18008. Granada (Spain).
3. Department of Plant Breeding, Estación Experimental La Mayora. 29750 Algarrobo-Costa, Málaga
(Spain).

4. These authors have equally contributed to this work and are placed in alphabetical order
*For correspondence,
mbaron@eez.csic.es; fax: +34958129600; dominique.vanderstraeten@ugent.be; fax : +3292645333

Abstract: After infecting a susceptible host, pathogens spread throughout the


plant. Depending on pathogen type and strain, the severity of symptoms greatly
varies. In the case of pepper mild mottle virus (PMMoV) infection in Nicotiana
benthamiana, newly developing leaves display visual symptoms (symptomatic
leaves). In this study two PMMoV strains were used, the Spanish strain (PMMoV-
S) being more virulent than the Italian one (PMMoV-I). Plants infected with
PMMoV-I could recover from the virus-induced symptoms. Leaves that were fully
developed at the start of PMMoV infection remained symptomless. In these
asymptomatic leaves, an increase in temperature, initiating from the tissue adjacent
to the main veins, was observed 7 days before the chlorophyll fluorescence pattern
changed. Virus immunolocalization on tissue prints matched well with the
concomitant pattern of chlorophyll fluorescence increase. The temperature
increase, associated with the veins, was shown to be related to stomatal closure.
Upon PMMoV-I infection, appearance of thermal and chlorophyll fluorescence

101
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

symptoms as well as virus accumulation were delayed by 3 days compared to


PMMoV-S induced symptoms. Temperature increase of whole symptomatic leaves
was also correlated to a decrease in stomatal aperture. In contrast to the persistent
increase in symptomatic leaf temperature observed during PMMoV-S infection, the
temperature of symptomatic leaves of PMMoV-I infected plants decreased
gradually during recovery.
We propose that the earliest temperature increase is caused by a systemic
plant response to the virus infection, involving the control of water loss. In
conclusion, thermography has a potential as an early reporter of an ongoing
compatible infection process.

Keywords: Biotic stress - Infrared gas analysis - Nicotiana benthamiana – Pepper mild mottle virus –
Stomatal conductance – Thermography.

Abbreviations: AS, asymptomatic; Chl-F, Chlorophyll fluorescence; Chl-FI, Chlorophyll


fluorescence imaging; dpi, days post infection; FL, chlorophyll fluorescence image captured after low
intensity excitation; FH, chlorophyll fluorescence image captured after high intensity excitation; gs,
stomatal conductance; HR, hypersentive response; IRGA, infrared gas analyser; PMMoV-S and –I,
Spanish and Italian strains of the pepper mild mottle virus; S, symptomatic; TMV, tobacco mosaic
virus.

Introduction
Thermal and chlorophyll-fluorescence imaging (Chl-FI) have proved to be
valuable non-destructive tools to study the spatial and temporal heterogeneity of
leaf transpiration and photosynthesis under biotic stress. Thermography visualises
leaf surface temperature and thus reveals the pattern of transpiration over a leaf.
This technique is well-suited to monitor pest and pathogen infections, which often
lead to changes in plant water status (Chaerle and Van Der Straeten 2000, 2001).
Presymptomatic increases in temperature were visualised at tobacco mosaic virus
(TMV) infection sites in resistant tobacco during the hypersensitive reaction (HR)
(Chaerle et al. 1999). A bacterial-toxin induced HR was also successfully revealed

102
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

by thermography (Boccara et al. 2001). Still at the lab scale, downy mildew
infection in cucumber was visualised at an early stage by thermal imaging
(Lindenthal et al. 2005, Oerke et al. 2006). By remote airborne thermal imaging,
Schmitz et al. (2004) could distinguish low and high nematode infestation in sugar
beet fields, due to the effect of infestation on plant water relations.
Each representative of the wide range of plant-pathogen interactions likely
affects different plant physiological processes to a varying extent. Using several
imaging techniques in parallel increases the chance of highlighting these
pleiotropic effects. Using thermography, Chaerle et al. (2004) observed opposite
effects on leaf temperature in a necrotrophic fungal infection versus a viral-induced
HR. Chl-FI carried out in parallel on the same plants revealed an increase in
chlorophyll fluorescence (Chl-F) in both infection types, albeit with different
kinetics. Chl-FI was also used to reveal disease signatures, which could allow
diagnosis in the absence of symptoms in the visible spectrum (Chaerle and Van
Der Straeten 2001, Nedbal and Whitmarsh 2004). Chl-FI of fungi-infected oat and
Arabidopsis plants (Rolfe and Scholes 1995, Scholes and Rolfe 1996, Chou et al.
2000), as well of fungi and bacterial-infected tomato (Berger et al. 2004),
correlated changes in Chl-F emission with alterations of carbohydrate metabolism
and photosynthetic gene expression. In addition, changes in source-sink
relationships during fungal infection were highlighted by Chl-FI (Esfeld et al.
1995, Weiss et al. 1998). The same technique visualised the inhibition of
photosynthetic electron transport during infection of tobacco with Phytophthora
nicotianae (Scharte et al. 2005). Studies on the early responses in Chl-F emission
to viral infection demonstrated photoinhibitory damage in the infected plants
(Balachandran and Osmond 1994, Balachandran et al. 1994, Balachandran et al.
1997, Osmond et al. 1998, Lohaus et al. 2000).
In the plant-pathogen system Nicotiana benthamiana infected with either the
Italian or the Spanish strain of pepper mild mottle virus (PMMoV-I, PMMoV-S),
the oxygen evolving complex (OEC) of the photosynthetic electron transport chain

103
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

was identified as the main target of this tobamovirus (Barón et al. 1995, Rahoutei
et al. 1998, 1999, 2000, Pérez-Bueno et al. 2004). In the present work we have
simultaneously monitored changes in photosynthesis and transpiration in N.
benthamiana leaves infected with PMMoV-S or PMMoV-I by Chl-FI and
thermography, respectively. To support thermal image data, stomatal conductance
(gs) measurements were carried out with an infrared gas analyser (IRGA); in
addition, stomatal imprints were used to investigate both stomatal density and
aperture. Immunolocalization of viral spreading was followed by tissue printing to
reveal a possible correlation with the fluorescence and thermographic patterns of
infected plant leaves.

Material and methods


Plant growth and virus infection
The imaging experiments were carried out in triplicates, using 3
subsequently grown batches of plants. N. benthamiana Gray plants were cultivated
in a growth chamber at 100 µmol m-2 s-1 PAR (photosynthetically-active
radiation), generated by cool white fluorescent lamps, with a 16/8h light/dark
photoperiod, a temperature of 23ºC and a relative humidity of 60-70%. Plants with
6-7 fully-expanded leaves were inoculated in the three lower leaves (inoculated
leaves), using 25 µl of inoculum per leaf (50 µg of PMMoV per ml of 20 mM
sodium phosphate/biphosphate buffer pH 7.0). Mock-inoculated plants were treated
with buffer only. The Italian and Spanish strains of PMMoV (genus Tobamovirus)
were isolated in Sicily (Italy) and Almería (Spain), respectively (Wetter et al. 1984,
Alonso et al. 1989).
Visual symptoms became visible at 5 (PMMoV-S infection) -7 (PMMoV-I)
days post-inoculation (dpi). New leaves developed after inoculation (S leaves)
showed severe wrinkling and curling; in contrast, no symptoms were observed in
those leaves that were fully expanded at infection time (AS leaves). Inoculated
leaves did not show any symptoms. Summarizing, we can distinguish in the

104
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

infected plants three kinds of leaves: inoculated, asymptomatic and symptomatic


leaves; inoculated leaves were not used in this study. After 14 dpi, stunting of the
plant was clearly evident. Plants infected with the Italian strain of the virus were
able to recover: after 21 dpi, PMMoV-I infected plants developed new non-curly
leaves and plant height increased again. No new leaves appeared in PMMoV-S
infected plants after 14 dpi.
IRGA measurements could not be carried out in parallel with thermal and
fluorescence experiments. In the case of IRGA measurements, the symptomatology
of the corresponding infections was delayed by 2 days: PMMoV-S infected plants
showed symptoms at 7 dpi, while PMMoV-I infected ones displayed symptoms at
8-9 dpi.
Starting with the lowest inoculated leaf and numbering leaves in ascending
order, we have analysed leaf number 5 as the AS leaf and the second youngest leaf
as the S one.

Imaging
Imaging was carried out in a custom-made walk-in chamber with built-in
gantry robot monitoring a 2×1m area. Twenty-four plants representing the three
different treatments were imaged within one experiment. Each treatment group was
split in 2 for respectively AS and S leaf imaging. Illumination and temperature was
set equal to the conditions in which the plants were grown before imaging: A
FLIR/Agema (FLIR Systems, West Malling, Kent, UK) THV900LW camera (pixel
resolution 272×136) was used to capture the thermal images of the PMMoV
infection process. Thermographic measurements on AS and S leaves were
reproducible for the three independent experiments. The fluorescence and colour
images had a size of 300×300 pixels. The Chl-FI system consists of a miniature
black and white CCD camera with <0.1 Lux sensitivity, fitted with a cut-off high
pass red filter (B+W 092) to detect light above 650 nm. The camera is surrounded
by a ring of six small halogen lamps, shielded by a blue cut-off low-pass filter

105
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

(Schott BG-39) to provide excitation light below 650 nm, with an excitation
maximum at 500 nm (Chaerle et al. 2004). Fluorescence images were grabbed after
respectively 1 second of 250 µmol m-2 s-1 PAR (FL) and immediately after an
additional second of 1000 µmol m-2 s-1 PAR (FH). Colour reflectance images were
captured under chamber illumination.
The ImageJ software package (rsb.info.nih.gov/ij, Thévenaz et al. 1998) was
used to register (i.e. adjust for the difference in field of view and magnification
between the three imaging sensors) and process the captured images. The 8-bit
fluorescence images were normalized for optimal visualization, using the same
scaling factor based on the maximum pixel intensity over all selected images across
all time points. This allows a relative comparison of fluorescence intensity for the
AS leaves of control, PMMoV-I, and PMMoV-S infected plants per panel, as well
as between the different time points.
Leaf temperature data were obtained with AGEMA Research software. Leaf
temperature was measured by drawing a region of interest (roi) corresponding to
the leaf outline. Temperature profiles across the leaves were obtained by drawing a
line perpendicular to the main vein, covering 60 (80) pixels for small (large)
leaves. The main vein was located in the middle of the line (approx. 30 or 40 pixels
to the leaf edge).

Stomatal conductance measurements


Stomatal conductance (gs) to water vapour was determined on a 100 mm2
leaf area at the leaf apex by IRGA in an open system at ambient partial pressures of
carbon dioxide and water vapour, using a portable photosynthesis system (LI-6400,
Li-Cor Inc., Lincon NE, USA). Within the measurement cuvette, average leaf
temperature was 29 ±1ºC. During gas exchange measurements, radiation was
supplied by Qbeam solid state LED lighting system attached to the leaf cuvette
(6400-02B LED, Li-Cor Inc., Lincon NE, USA). Six different leaves were

106
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

considered for data calculation. AS leaves were measured at 4, 7, 10, 14, 17, 19,
22, 26 and 28 dpi, whereas S leaves were measured at 7, 10, 19, 24 and 28 dpi.

Stomatal imprints
Leaf impressions were obtained from both surfaces of the leaves at 16 dpi
according to Romero-Aranda et al. (2001), on the same leaves used for IRGA
measurements. Imprints were examined by a light microscope (Leica DMRB,
Leica Microsystems, Switzerland) at 200 x magnification, and stomata were
counted on forty fields selected at both sides of the mid-rib. To determine stomatal
aperture of adaxial leaf surface, impressions were analysed by a light microscope
(Nikon Eclipse E200, Nikon Inc. Instruments, Groups USA), and photographed by
a Nikon Coolpix 4500. Thirty stomata (fifteen at every side of the mid-rib) were
measured.

Chlorophyll content measurements


Chl content was measured (10 repeats per leaf) using the CL-01 Chlorophyll
Content Meter, which determines relative Chl content using dual wavelength
optical absorbance (620 and 940nm) measurements from leaf samples (Hansatech
Instruments, Norfolk, England; http://www.hansatech-instruments.com/cl01.htm).

Statistics
Statistical analysis was carried out with SigmaPlot 8.0 software. Student t-
test was used to compare control with infected plants, and PMMoV-I infected with
PMMoV-S infected plants. Significance level was set to 0.005. Graphs show mean
values and their corresponding standard errors. Significant differences between
treatments (according to Student t-tests) are indicated on bar-graphs with different
small letters.

107
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Tissue prints
Localization of PMMoV coat protein (CP) in both AS and S leaves was
performed by tissue print analysis using specific antiserum against viral CP
(Alonso et al. 1989). Non-specific binding was reduced by preabsorbing the
immune antiserum with acetone powder obtained from stems and leaves of young
healthy N. benthamiana plants, as described by Ruiz del Pino et al. (2003). Whole
leaves from healthy and infected plants were imprinted on polyvinylidene fluoride
(PVDF) sheets and assayed as described by Maliga et al. (1995). Membranes were
first incubated with the PMMoV-CP specific antiserum at the appropriate dilutions
and subsequently with goat anti-rabbit alkaline phosphatase-IgG (Sigma Aldrich).
Bound antibodies were detected using nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-
indolyl phosphate (NBT/BCIP, Roche).

Results
Visual symptoms
During the imaging experiments, plants infected with PMMoV-S at the 6th or
7th leaf stage developed new curly young leaves (symptomatic [S] leaves) at 5 dpi,
while in plants infected with PMMoV-I these symptoms appeared between 5 and 7
dpi. Growth was obviously inhibited in plants infected with either one of the virus
strains, stunting was evident at 14 dpi. Plants infected with PMMoV-S were totally
senescent at 22 dpi, whereas PMMoV-I infected plants started to recover from the
symptoms (as evaluated by emergence of new unaffected leaves) at 21 dpi.
Recovery occurred irrespective of the time of appearance of the first symptoms.
Asymptomatic (AS) leaves were totally developed at the infection time and did not
show any symptoms along the infection process. In the batch of plants on which
gas exchange was measured, infection was delayed by 2 days: plants infected with
PMMoV-S and PMMoV–I showed symptoms at 7 and 8-9 dpi, respectively.

108
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

Fig. 1: Colour reflectance (R), thermal (T) and Chl-F (FH, under high excitation light; FL, under low
excitation light) imaging of AS leaves of N. benthamiana, at 4 dpi (A), 7 dpi (B), 10 dpi (C), 14 dpi
(D), 17 dpi (E), 22 dpi (F), 26 dpi (G) and 28 dpi (H). Image width is 60 mm for all panels.

109
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Temperature patterns of asymptomatic leaves


Control plants did not show any discernable surface temperature pattern,
apart from a slightly higher leaf vein temperature (Fig. 1, panels A-E, 4-17 dpi).
Old AS leaves displayed an overall higher leaf temperature (Fig. 1, panels F-H, 22-
28 dpi), including both veinal and interveinal regions.
At 4 dpi, PMMoV-S infected plants were not discernable from controls (Fig.
1A). Starting at 7 dpi, AS leaves of PMMoV-S infected plants showed a higher
temperature immediately adjacent to the major veins, when compared to control
plants (Fig. 1B). This zone of higher temperature expanded, and affected tissues
surrounding main veins in the subsequent days (Fig. 1, panels C, D: 10-14 dpi). In
the middle stage of the infection, (17 dpi) the whole leaf surface displayed a higher
temperature than the control leaves (Fig. 1, panel E). This temperature increase
occurred before the visible decline in Chl content (Fig. 1, panel F, 22 dpi).
AS leaves of PMMoV-I infected plants displayed the same patterns as plants
infected with PMMoV-S, but their response was delayed. This is consistent with
the lower virulence of the PMMoV-I strain. The temperature increase initiated at
the veins in PMMoV-I infected plants at 9-10 dpi (Fig. 1, panel C). For all 3
repeats, the entire leaf surface had a higher temperature as compared to controls
from 22 dpi onwards (Fig. 1, panel F).

Temperature profiles across asymptomatic leaves


Temperature profiles across the AS leaf surface were plotted to visualise the
evolution of the temperature difference between veins and surrounding tissue.
Control plants displayed a higher temperature in veins in comparison with
surrounding tissue but this difference did not increase with plant age (Fig. 2, left
panel). AS leaves of PMMoV-I-infected plants started to show a slight increase in
temperature centred on the main vein at 10 dpi, and this pattern was more evident
at 17 dpi (Fig. 2, middle panel). At 22 dpi the whole leaf surface had a high
temperature. This response appeared earlier in AS leaves of PMMoV-S infected

110
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

plants. The latter presented a higher temperature associated with the vicinity of the
veins from 7 dpi on (Fig. 2, right panel). Subsequently, the region of higher
temperature expanded to the surrounding tissues, finally affecting the whole leaf.

Fig. 2: Infection-induced local increases in leaf temperature in AS leaf tissues adjacent to major
veins. Temperature profiles are shown along a 60 to 80 pixel line drawn in the middle of an AS leaf,
and centred on the midrib (vein type I; for N. benthamiana vein classification, see Roberts et al.
1997). The thermal images shown were captured at 12 dpi. Every vertical dotted line represents the
position of veins type I and II. Temperature difference between horizontal solid lines is 0.1ºC. The T-
values indicate the lowest pixel value for every temperature trace. From bottom to top: 4, 7, 10, 12,
14, 17 and 22 dpi.

111
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

At 17 dpi, temperature differences among the line profile nearly levelled out. The
overall temperature of the leaf was nearly a degree higher in PMMoV-S infected
plants as compared to the corresponding control plants. At this time point, the AS
leaf of the PMMoV-I infected plant still showed a marked contrast between the
main vein and the adjacent tissue. At 22 dpi AS leaves from both PMMoV-S and
PMMoV-I infected plants, exhibited a higher average temperature than those of
control plants.

Whole leaf temperature measurements in symptomatic leaves


In spite of the spatial and temporal differences in the thermographic pattern,
no significant differences in average whole leaf temperature were measured at any
time points, between the AS leaves of control, PMMoV-I, and PMMoV-S infected
plants (Fig. 3A). In contrast, S leaves from plants infected with either one of the
PMMoV strains showed a significant higher temperature than the control leaves at
14, 17 and 19 dpi (Fig. 3B). Subsequently, the temperature of S leaves from
PMMoV–S infected plants stayed high, while S leaf temperature of PMMoV–I
infected plants decreased at 21 dpi to reach control values. This corresponds with
the initiation of the symptom recovery phase. At 7 dpi (Fig. 4A) the S leaf of the
depicted PMMoV–S infected plant appeared marginally warmer. However,
statistical analysis did not support a significant difference in leaf temperature
between the control and PMMoV-S infected plants (Fig. 3B). At 14 dpi, both
Italian and Spanish strains induced a higher temperature in the S leaf (Fig. 4B). The
S leaf temperature of the PMMoV-I infected plant decreased from 21 dpi on (Fig.
4C), coinciding with the onset of the recovery phase and the appearance of new
young leaves, as can be seen in the reflectance image. This is in accordance with
the significantly lower average whole leaf temperature at this time point in
PMMoV-I versus PMMoV-S (Fig. 3B). In contrast with PMMoV-I infected plants,
temperature of S leaves of PMMoV-S infected plants remained high and no new
leaves appeared. Finally, S leaf temperature of PMMoV-I infected plants appeared

112
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

Asymptomatic Symptomatic
24
A aaa aaa aaa abb abc abb aab aa aa B
23
T (ºC)

22

21

20
4 7 10 14 17 19 22 26 28 4 7 10 14 17 19 21 24 28
t (days post-inoculation)

Asymptomatic Symptomatic
0.9 aaa aaa abb ab ab
C D
gs (mol H2O·m-2·s-1)

0.8
0.7 aaa aaa aaa aaa aaa aabb aab aa aa
Control
0.6 PMMoV-I
0.5 PMMoV-S
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
5 7 10 14 17 19 21 26 28 7 10 19 24 28
t (days post-inoculation)

Fig. 3: Virus-induced temperature changes in N. benthamiana leaves (A and B). Data are mean values
from four different plants, error bars represent standard error. Virus-induced stomatal conductance
changes in N. benthamiana leaves (C and D). Data are mean values from at least six different plants,
error bars represent standard error. Letters show the significant differences, according to statistical
analysis (p<0.005). No significant differences were found in panel A.

equal to the control value, which is in agreement with the complete recovery of
these plants (Fig. 3B, 4D).

Stomatal conductance measurements


No significant differences in this parameter were found between AS control leaves
and PMMoV-I infected ones (Fig. 3C), whereas AS leaves of PMMoV-S infected
plants showed a significant decrease of stomatal conductance from 19 to 21 dpi,

113
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fig. 4: Colour reflectance (R), thermal (T) and Chl-F (FH, under high excitation light; FL, under low
excitation light) imaging of S leaves of N. benthamiana, at 7 dpi (A), 14 dpi (B), 21 dpi (C) and 28
dpi (D). At each time-point newly-emerged leaves are shown. PMMoV-S infected plants did not
produce new leaves after 14 dpi and died at 22 dpi. Image width represents 60 mm for all panels.

compared with the controls. In contrast, S leaves from both infected plants
displayed a decrease in stomatal conductance compared with the control, which
was significant at 19 dpi (Fig. 3D). Indicative of the recovery phase, gs values of S
leaves from PMMoV-I infected plants increased at both 24 and 28 dpi, compared

114
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

with gs values at 19 dpi, but remained significantly different from control gs values.
However, for these S leaves, the ratio of gs values from control plants over gs
values from PMMoV-I infected plants decreased markedly from 9.68 (19 dpi) over
2.27 (24 dpi) to 1.77 (28 dpi).

Stomatal density and stomatal aperture


Stomatal imprints made at 16 dpi of both abaxial and adaxial side from AS
and S leaves, allowed us to determine both stomatal density and aperture. No
significant differences in stomatal density was found between infected and control
plants (Fig. 5), indicating that PMMoV does not modify the normal development of
stomata in Nicotiana benthamiana plants. On the other hand, stomatal aperture at
the adaxial leaf surface and close to the midrib, was significantly reduced in both
AS and S leaves of infected plants (Fig. 5), suggesting that stomatal closure is
involved in the thermal increase. PMMoV-S, the most virulent strain, induced the
strongest effect.

Asymptomatic Symptomatic
Adaxial Abaxial Adaxial Abaxial
50 120
Stomatal density

100
(stomata/mm2)

40
80
30
60
20 Fig. 5: Stomatal density and
40
aperture measurements after
10 20 imprinting. Both stomatal density
0
4 0
4 and aperture of AS (left) and S
a b c (right) leaves of Nicotiana
Stomatal aperture

a b b
3 3 benthamiana are shown at 16 dpi.
Data are mean values, error bars
(µ m)

2 2 represent standard error. Letters


indicate the significant differences,
1 1 according to statistical analysis
(p<0.005).
0 0
Adaxial Adaxial
Leaf side
Control
PMMoV-I
PMMoV-S

115
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fluorescence imaging of asymptomatic and symptomatic leaves


Changes in fluorescence emission from AS leaves due to the viral infection
became evident (Fig. 1D: 14 dpi PMMoV–S; Fig. 1E: 17dpi PMMoV- I) after
appearance of thermal symptoms (7 dpi PMMoV- S, 10 dpi PMMoV- I). Control
plants did not show changes in fluorescence emission over time.
During the first days of infection, AS leaves of PMMoV-S infected plants
appeared similar in FH fluorescence (Chl-F image captured under high excitation
light) to controls; however, at 14 dpi Chl-F of interveinal tissue increased
compared to control plants, the veins having lower fluorescence values. At 17 dpi,
the fluorescence pattern was similar to the previous time point, albeit with slightly
lower fluorescence values. At 22 dpi (Fig. 1F) fluorescence was high in the areas
surrounding the main veins and lower in the rest of the interveinal regions,
displaying a heterogeneous pattern.
AS leaves of PMMoV-I infected plants displayed a FH intensity gradient and
a heterogeneous leaf blade response, albeit less prominent than in the PMMoV-S
infected plants, and starting later (from 17 dpi on). At 22 dpi (Fig. 1F),
fluorescence intensity increased in tissues surrounding veins and remained high,
showing a characteristic pattern until the end of the infection (Fig. 1H). In the
experiment where PMMoV-I infected plants showed earlier symptoms (5 dpi), AS
leaves displayed localised fluorescence decreases in the interveinal regions, similar
to the appearance of low-Chl-F areas in PMMoV-S infected leaves at the end of the
infection.
The fluorescence images captured at low excitation light (FL) did not reveal
any specific pattern different from the images captured at high light levels (FH),
although the characteristic fluorescence signals appeared even later (17 dpi for
PMMoV-S infected plants and 22 dpi for PMMoV-I infected ones). No clear trend
emerged from the Chl-F measurements (FH or FL) on the S leaves (Fig. 4).

116
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

Chlorophyll content
To investigate a possible correlation between changes in leaf temperature or
in Chl-F with those in Chl content, this parameter was also measured. In AS leaves
from PMMoV-I and PMMoV-S infected plants Chl content was not significantly
different from control, and moreover remained higher at later time points as
compared to control (Fig. 6A).
In S leaves, Chl content was the highest in infected plants at 7 dpi (Fig. 6B).
Chl content decreased significantly at 14 and 21 dpi for PMMoV-S infected plants,
and for PMMoV-I only at 21 dpi. PMMoV-S infection thus showed a more severe
response as expected. At 28 dpi, Chl content for the PMMoV-I infected plants
reached control values, corresponding to total recovery.

Asymptomatic Symptomatic
16 aabb aabb abc aa
14
A Control
B
Chl content (a.u.)

12 PMMoV-I
PMMoV-S
10
8 a a a a a a a a a aabb aabb a a a a a
6
4
2
0
3 7 10 14 17 21 28 7 14 21 28
t (days post-inoculation)

Fig. 6: Chl content of AS (A) and S (B) N. benthamiana leaves. Data are mean values from six
different plants, error bars represent standard error. Letters show the significant differences between
infected and control plants, according to statistical analysis (p<0.005).

Viral immunolocalization
To establish a possible correlation between both thermal and fluorescence
patterns in infected plant leaves, and PMMoV localisation, tissue prints were
carried out using an antibody against the viral coat protein. In AS leaves of plants

117
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

infected with PMMoV-S, virus was detected at 14 dpi, mainly in the leaf base
along the major veins (Fig. 7A). At 21 dpi the virus was present in most of the
main veins. In plants infected with PMMoV-I, the virus localisation pattern was
similar, but delayed in time; the first detection occurred at 17 dpi, and the virus had
spread through the whole main vein system at 24-28 dpi. Non-specific binding
could be seen at 10 dpi in both AS leaf and in its corresponding control (Fig. 7A).
Both viral infections were detectable on S leaves at every dpi assayed, and even in
the recovery phase of plants infected with PMMoV-I (Fig. 7B).

Fig. 7: Tissue prints carried out using a specific antibody against the viral CP at different post-
infection times (dpi) from AS (A) and S leaves (B).

118
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

Table 1: Timing of symptoms induced by PMMoV (time in dpi).

Asymptomatic leaves Symptomatic leaves


Control PMMoV-I PMMoV-S Control PMMoV-I PMMoV-S
Visible - - - - 5-7 5
Thermography - 10 7 - 14 14
gs - - 19 - 19 19
Stomatal
- 16 16 - 16 16
aperture
Chl-F - 17 14 - No trend No trend
Not Not
Tissue Printing detected
17 14 detected
5-7 5

The same asymptomatic leaf was measured from 4 to 28 dpi. Newly emerging symptomatic leaves
were measured when 2 days old, from 4 until 28 dpi.

Discussion
Early detection by thermography of a viral infection was previously reported
(Chaerle et al. 1999, 2004). This response was however specific for the local
hypersensitive response (HR) induced at the TMV infection site in resistant
tobacco plants, since parallel imaging of a TMV-infected leaf of a susceptible
tobacco plant did not reveal changes in temperature (within 7 dpi, the timeframe of
the thermal effect of the HR; Chaerle et al. 1999). To our knowledge, the present
work on PMMoV infection in N. benthamiana is the first to demonstrate
thermographic visualisation of a systemic viral infection in asymptomatic leaves.
Importantly, thermography revealed symptoms prior to detection of the virus by
tissue print or Northern blot (Pérez-Bueno 2003) (Table 1).
Asymptomatic leaves from plants infected with either one of the PMMoV
viral strains displayed an expanding temperature increase initiating adjacent to the
major veins, and starting at respectively 7 (PMMoV-S ) and 10 dpi (PMMoV-I)
(Table 1). This difference correlates with the lower virulence of PMMoV-I.
Control leaves only display a higher leaf vein temperature, due to the lack of
stomata in the epidermis covering leaf veins; transpiration is thus low, resulting in
less cooling (Chaerle et al. 2003). The tissue next to the major veins has a similar

119
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

stomatal density to the tissue further towards the leaf border (data not shown),
hence transpiration and leaf temperature are equal under control conditions.
A linear correlation between Chl content and temperature of AS leaves could
not be established (Fig. 6). Thus, factors other than premature leaf aging (of which
a decrease in Chl content is indicative) were responsible for the observed early
temperature increase in virus-infected plants. In control AS leaves, a late, gradual
increase in leaf temperature (Fig. 1; on average starting at 21-23 dpi) paralleled a
decrease in Chl content (Fig. 6). This correlates with a reduction in stomatal
conductance (see Fig. 3C), which is related to leaf age and thus to aging of the
stomatal apparatus (Wardle and Short 1983, Willmer et al. 1988).
The observed temperature increase is most likely due to stomatal closure and
the consequent reduction of transpiration. Temperature is known to vary with leaf
transpiration and therefore is a function of stomatal conductance (Fuchs and
Tanner 1966, Jones et al 1998). A number of reports show that transpiration, as
determined by either gas exchange or porometry measurements, is reduced in
several plant-viral interactions (Keller et al. 1989, Linsey and Gudauskas 1975,
Sridhar et al. 1994, Clover et al. 2001, Ryšlavá et al. 2003, Zhou et al. 2004,
Rowland et al. 2005). However, these methods lack the spatial information
provided by thermography, which has enough spatial resolution to monitor the
variability of stomatal conductance across the leaf surface (Jones, 1999; Jones et al.
2002).
Both average stomatal aperture and number of stomata per unit leaf surface
influence transpiration (Jones 1998). Studies on different host-virus systems show
either a reduction of leaf stomatal conductance (Levy and Marco 1991, Sampol et
al. 2003, Bertamini et al. 2004, Zhou et al. 2004, Guo et al. 2005a, b) or no effect
(Alleyne et al. 1989). To our knowledge no information is available showing an
effect of viral infection on stomatal density. Upon PMMoV-infection of Nicotiana
benthamiana plants, stomatal density of abaxial and adaxial leaf surfaces did not
change.

120
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

PMMoV-I and PMMoV-S infections induced a characteristic spatially and


temporally heterogeneous temperature pattern in AS leaves. However, the average
whole temperature of these leaves was not significantly different from control
leaves at any time point. IRGA analysis could not show a decrease in stomatal
conductance at the AS leaf tip of PMMoV-I infected plants. In AS leaves of
PMMoV-S infected plants, significant differences were only monitored for 19 and
21 dpi (17dpi shows the same trend but is not significant). However, thermal
imaging reveals vein-associated temperature increases due to PMMoV-S infection
from 7dpi on (Table 1). In addition, for both viral strains a significant decrease in
stomatal aperture and consequently in stomatal conductance was observed on
imprints made at 16 dpi, in regions close to the midrib (Fig. 5). The apparent lack
of sensitivity of IRGA can be attributed to two factors. IRGA cannot reveal spatial
patterns of transpiration, which will go undetected if only a minor part of the
measured area is affected. In addition, the measured 100 mm2 area of the leaf apex
remains colder than the rest of the leaf (see Fig. 1E, 17 dpi). This locally lower
temperature explains the delay in detection of a decrease in stomatal conductance,
expanding from the major veins towards the leaf border. These observations
indicate that only thermal imaging discriminates healthy from infected AS leaves at
early time points (Table 1), and allows following viral invasion in a simple, fast
way.
In contrast with the AS leaves, S leaves did not reveal a characteristic
thermographic pattern. However, they already displayed significant differences in
whole leaf temperature at 14 dpi (Fig. 3B, Fig. 4). Stomatal aperture was also
clearly reduced at 16 dpi. Stomatal conductance was greatly diminished from 19
dpi onwards. This directly proves that stomatal closure caused by PMMoV
infection leads to an increase in leaf temperature. During the recovery phase, newly
emerging (S) leaves from PMMoV-I infected plants showed a temperature similar
to the control leaves. Gs values of S leaves of PMMoV-I infected plants did not
reach control levels, but in support of a recovery response, the ratio of control gs

121
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

values over values of PMMoV-I-infected plants clearly decreased from 19 dpi to


28 dpi.
Stomatal conductance is mainly influenced by abiotic factors including high
radiation, high and low temperatures, salinity, deficit of irrigation, but is also
affected by foliar pathogens (Chaerle et al. 2004, Lindenthal et al. 2005, Scharte et
al. 2005, Oerke et al. 2006). Several compounds known to reduce stomatal aperture
accumulate during host pathogen interactions, such as salicylic acid (SA; Malamy
et al. 1990, Van Der Straeten et al. 1995, Chaerle et al. 1999), nitric oxide (Del Rio
et al. 2004, Mur et al. 2005), the plant hormones ABA and auxin (Whenham and
Fraser 1981, Whenham et al. 1986, Grabov and Blatt 1998). In addition, phenolic
compounds accumulating during plant diseases, due to the activation of the phenyl-
propanoid pathway (Nicholson and Hammerschmidt 1992, Kofalvi and Nassuth
1995), were also reported to alter stomatal function (Bhatia et al. 1986, Plumbe and
Willmer 1986, Chaerle et al. 2001). Recently, Sajnani (2005) detected an increase
of phenolic compounds by blue-green fluorescence (BGF) in Nicotiana
benthamiana plants infected with PMMoV, which could possibly underlie the
observed stomatal closure and associated temperature increase.
The appearance of a heterogeneous fluorescence pattern in AS leaves (visible
in FH images) is delayed with respect to the thermographic pattern (Table 1). At 14
and 17 dpi the FH images of the AS leaves from plants infected with PMMoV-S
and PMMoV-I, respectively, showed a high contrast between main veins and
interveinal tissues. At 22 dpi the FH pattern induced by both viral strains was quite
similar, displaying very high fluorescence in areas surrounding the main veins.
Only in the final infection steps the areas surrounding the main veins where the
virus is spreading were lightly saturated (Fig. 1G, H). At these time points, the
PMMoV infection induced a degradation of the thylakoid membrane by lipid
peroxidation (Rahoutei et al. 1999), and dramatic changes in PSII function
(Rahoutei et al. 2000, Pérez-Bueno et al. 2004). Any of these phenomena could
account for the observed fluorescence increase.

122
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

However, the fluorescence increase can not be attributed to a local Chl


decrease and the consequently diminished fluorescence reabsorption (Gitelson et
al. 1998, Buschmann et al. 2000), because these viruses do not induce a vein
clearing symptom (see colour reflectance images, Fig. 1). This observation was
supported by measurements of Chl content in AS leaves, showing either no
differences between control and infected plants or a higher Chl content in the latter
(14-17 dpi for PMMoV-S infected plants) (Fig. 6A). The most plausible
explanation for the fluorescence increase is an inhibition of PSII electron transport.
This hypothesis is supported by previous work showing PMMoV mediated
inhibition of PSII function through an influence on the transcription rates of genes
encoding oxygen-evolving-complex proteins (Rahoutei et al. 1999, 2000, Pérez-
Bueno et al. 2004). Fluorescence point measurements with the PAM fluorometer
(Rahoutei et al. 2000) indicated that the number of open reaction centres decreased
during pathogenesis. A higher number of closed reaction centres could be
responsible for the higher fluorescence emission. More generally, lower values of
PSII electron transport efficiency were also documented during infection with other
tobamoviruses (van Kooten et al. 1990, Balachandran and Osmond 1994,
Balachandran et al. 1994); in addition, viruses belonging to other families, such as
the grapevine leafroll virus, can induce similar effects (Bertamini et al. 2004).
The vein-associated patterns revealed by both thermography and
fluorescence in AS leaves present similarities with those induced by the well
known PSII inhibiting methylurea herbicides. However, after methylurea herbicide
treatment of common bean and Xanthium strumarium, Chl-F and leaf temperature
of the tissue adjacent to the veins increased concomitantly (Chaerle et al. 2003,
Messinger et al. 2006). Chl-F kinetics could also be delayed (as compared to the
temperature response) due to the different site of action of methylurea herbicides
(inhibiting the acceptor site of PSII) and PMMoV (inhibiting the donor site)
(Rahoutei et al 2000). Likely, the systemic effect causing the earlier thermal
response after PMMoV infection is not directly affecting Chl-F. Either a

123
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

systemically transported signal (possibly phenolics; Sajnani 2005) or a direct effect


on water availability could explain the early thermal effect. ABA and nitric oxide -
signals known to influence transpiration - were shown to accumulate in compatible
and incompatible interactions (Whenham and Fraser 1981; Mur et al. 2005),
possibly supporting the above-mentioned hypothesis.
The localisation of the viruses in tissue prints taken at different time-points
matched well with the concomitant pattern of Chl-F increase in AS leaves.
Importantly, the first thermal symptoms around the main veins preceded the tissue
print pattern by 7 days. In contrast to the observations for AS leaves, no clear trend
emerged from the Chl-F measurements (FH or FL) on the S leaves (Fig. 6B). Tissue
prints of these leaves showed a quick viral accumulation in the whole leaf during
the early infection steps. This could explain the absence of a dynamic fluorescence
pattern in S leaves.
The results presented in this paper indicate that thermography can visualise
effects of compatible virus infections well before the appearance of symptoms in
the visible spectrum and before the causal agent was present. This widens the range
of host- pathogen systems that was successfully visualised by non-contact imaging
methods, certainly broadening the applicability thereof.

Acknowledgements
M.P. was recipient of a MEC fellowship, which included financial support
for a short-term research stay at Ghent University. L.C. is a post-doctoral fellow of
the Research Foundation - Flanders.
This research was supported by grants from the Spanish Ministry of Science
and Education (MEC, grants BIO2001-1937-C02-02 and BIO2004-04968-C02-02,
to M.B.) and by a grant (G.0015.01) from the Research Foundation - Flanders to
D.V.D.S. The authors are very grateful to Drs. Isabel García Luque and Maite
Serra (Centro Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid) for providing all
PMMoV solutions and antibodies against the viral coat protein.

124
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

References
Alleyne, V., Larsen, F.E. and Stewardt, S.H. (1989). Water relations of container-grown virus-tested
and common apple (Malus domestica Borkh.) rootstocks. Scientia Horticulturae 38: 117-129.
Alonso, E., García-Luque, I., Avila-Rincón, M.J., Wicke, B., Serra, M.T. and Díaz-Ruiz, J.R. (1989)
A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. J. Phytopathol. 125:
67-76.
Balachandran, S. and Osmond B.C. (1994) Susceptibility of tobacco leaves to photoinhibition
following infection with two strains of tobacco mosaic virus under different light and nitrogen
nutrition regimes. Plant Physiol. 104: 1051-1057.
Balachandran, S., Osmond, B.C. and Daley, F.P. (1994) Diagnosis of the earliest strain-specific
interactions between tobacco mosaic virus and chloroplasts of tobacco leaves in vivo by means
of chlorophyll fluorescence imaging. Plant Physiol. 104: 1059-1065.
Balachandran, S., Hurry, V.M., Kelley, S.E., Osmond, C.B., Robinson, S.A., Rohozinski, J., Seaton,
G.G.R. and Sims, D.A. (1997) Concepts of plant biotic stress. Some insights into the stress
physiology of virus-infected plants, from the perspective of photosynthesis. Physiol. Plant.
100: 203-213.
Barón, M., Rahoutei, J., Lázaro, J.J. and García-Luque, I. (1995) PSII response to biotic and abiotic
stress. In Photosynthesis: From Light to Biosphere. Edited by Mathis, P. Vol. IV: 897-900.
Kluwer Academic Publishers. Dordrecht.
Berger, S., Papadopoulos, M., Schreiber, U., Kaiser, W. and Roitsch, T. (2004) Complex regulation
of gene expression, photosynthesis and sugar levels by pathogen infection in tomato. Physiol.
Plant. 122: 419-428.
Bertamini, M., Muthuchelian, K. and Nedunchezhian, N. (2004) Effect of grapevine leafroll on the
photosynthesis of field grown grapevine plants (Vitis vinifera L. cv. Lagrein). Journal of
Phytopathology 152: 145-152.
Bhatia, D.S., Jindal, V. and Malik, C.P. (1986) Effect of salicylic acid and tannic acid on stomatal
aperture and some enzyme changes in isolated epidermal peelings of Euphorbia hirta L.
Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 181: 261-264.
Boccara, M., Boue, C., Garmier, M., De Paepe, R. and Boccara, A.C. (2001) Infra-red thermography
revealed a role for mitochondria in pre-symptomatic cooling during harpin-induced
hypersensitive response. Plant Journal 28: 663-670.
Buschmann, C., Langsdorf, G. and Lichtenthaler, H.K. (2000) Imaging of the blue, green, and red
fluorescence emission of plants: An overview. Photosynthetica 38: 483-491.
Chaerle, L., Van Caeneghem, W., Messens, E., Lambers, H., Van Montagu, M. and Van Der Straeten,
D. (1999) Presymptomatic visualization of plant-virus interactions by thermography. Nature
Biotechnology 17: 813-816.

125
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Chaerle, L. and Van Der Straeten, D. (2000) Imaging techniques and the early detection of plant
stress. Trends Plant Sci. 5: 495-501.
Chaerle, L. and Van Der Straeten, D. (2001) Seeing is believing: imaging techniques to monitor plant
health. Biochim. Biophys. Acta. 1519: 153-166.
Chaerle, L., Hulsen, K., Strasser, R.J., Valcke, R., Höfte, M. and Van Der Straeten, D. (2003)
Robotized time-lapse imaging to assess in-planta uptake of phenylurea herbicides and their
microbial degradation. Physiol. Plant. 118: 613-619.
Chaerle, L., Hagenbeek, D., De Bruyne, E., Valke, R. and Van Der Straeten, D. (2004) Thermal and
chlorophyll-fluorescence imaging distinguish plant pathogen interaction at an early stage.
Plant Cell Physiol. 45: 887-896.
Chaerle, L., Saibo, N. and Van Der Straeten, D. (2005) Tuning the pores: towards engineering plants
for improved water use efficiency. Trends Biotechnol. 23: 308-315.
Chou, H.M., Bundock, N., Rolfe, A.S. and Scholes, J.D. (2000) Infection of Arabidopsis thaliana
leaves with Albugo candida (white blister rust) causes a reprogramming of host metabolism.
Mol. Plant Pathol. 2: 99-113.
Clover, G.R.G., Jaggard, K.W., Smith, H.G. and Azam-Ali, S.N. (2001) The use of radiation
interception and transpiration to predict the yield of healthy, droughted and virus-infected
sugar beet. Journal of Agricultural Science 136: 169-178.
Del Río, L.A., Corpas, F.J. and Barroso, J.B. (2004) Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in
plants. Phytochemistry 65: 783-792.
Esfeld, P., Siebke, K. and Weis, E. (1995) Local defence-related shift in the carbon metabolism in
chickpea leaves induced by a fungal pathogen. In Photosynthesis: from light to biosphere.
5:663-666. P Mathis, ed., Kluwer Academic Publisher. Dordrecht.
Fuchs, M. and Tanner, C.B. (1966) Infrared thermometry of vegetation. Agronomy Journal 58: 597-
601.
Gitelson, A.A., Buschmann, C. and Lichtenthaler, H.K. (1998) Leaf chlorophyll fluorescence
corrected for re-absorption by means of absorption and reflectance measurements. J. Plant
Physiol. 152: 283-296.
Grabov, A. and Blatt, M.R. (1998) Co-ordination of signalling elements in guard cell ion channel
control. J. Exp. Bot. 49:399-406.
Guo, Y.-P., Guo, D.-P., Peng, Y. and Chen, J.-S. (2005a) Photosynthetic responses of radish
(Paphanus sativus var. longipinnatus) plants to infection by turnip mosaic virus.
Photosynthetica 43: 457-462.
Guo, Y.-P., Guo, Y.-P., Zhao, J.-P., Liu, H., Peng, Y., Wang, Q.-M., Chen, J.-S. and Rao, G.-Z.
(2005b) Photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence in leaves of stem mustard (Brassica
juncea var. tsatsai) after turnip mosaic virus infection. Plant Sci. 168: 57-63.

126
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

Jones, H.G. (1998). Stomatal control of photosynthesis and transpiration. J. Exp. Bot. 49: 387-398.
Jones, H.G. (1999) Use of thermography for quantitative studies of spatial and temporal variation of
stomatal conductance over leaf surfaces. Plant, Cell and Environment 22: 1043-1055.
Jones, H.G., Stoll, M., Santos, T, de Sousa, C. Chaves, M. and Grant, M. (2002) Use of infrared
thermography for monitoring stomatal closure in the field: application to grapevine. J. Exp.
Bot. 53, 2249- 2260.
Keller, P., Lüttge, U., Xue-Chen W. and Büttner, F. (1989) Influence of rhizomania disease on gas
exchange and water relations of a susceptible and a tolerant sugar beet variety. Physiol. and
Mol. Plant Pathol. 34: 379-392.
Kofalvi, S.A. and Nassuth, A. (1995) Influence of wheat streak mosaic virus infection on
phenylpropanoid metabolism and the accumulation of phenolics and lignin in wheat. Physiol.
and Mol. Plant Pathol. 47: 365-377.
Levy, D. and Marco, S. (1991). Indices of water deficit in susceptible and resistant cucumber in
response to infection by cucumber mosaic virus. Ann. Appl. Biol. 119: 381-386.
Lindenthal, M., Steiner, U., Dehne, H.-W. and Oerke, E.-C. (2005) Effect of downy mildew
development on transpiration of cucumber leaves visualized by digital infrared thermography.
Phytopathology 95: 233-240.
Linsey, D.W. and Gudauskas, R. T. (1975). Effects of maize dwarf mosaic virus on water relations of
corn. Phytopathology 65: 434-440.
Lohaus, G., Heldt, H.W. and Osmond, C.B. (2000) Infection with phloem limited Abutilon mosaic
virus causes localized carbohydrate accumulation in leaves of Abutilon striatum: relationships
to symptom development and effects on chlorophyll fluorescence quenching during
photosynthetic induction. Plant Biol. 2: 161-167.
Malamy, J., Carr, J.P., Klessig, D.F. and Raskin, I. (1990) Salicylic acid: a likely endogenous signal
in the resistance response of tobacco to viral infection. Science. 250: 1002-1004.
Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A.R., Gruissem, W. and Varner, J.E. (1995) Methods in Plant
Molecular Biology: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor,
NY.
Messinger, S.M., Buckley, T.N. and Mott, K.A. (2006) Evidence for involvement of photosynthetic
processes in the stomatal response to CO2. Plant Physiol. 140: 771-778.
Mur, L.A.J., Edi Santosa, I., Laarhoven, L.J.J., Holton, N.J., Harren F.J.M. and Smith, A.R. (2005)
Laser photoacoustic detection allows in planta detection of nitric oxide in tobacco following
challenge with avirulent and virulent Pseudomonas syringae pathovars. Plant Physiol. 138:
1247-1258.

127
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Nedbal, L. and Whitmarsh, J. (2004) Chlorophyll fluorescence imaging of leaves and fruits. In
Chlorophyll a Fluorescence: A Signature of Photosynthesis. Papageorgiou, C.G., Govindjee,
eds. 14: 389-407. Springer. Dordrecht.
Nicholson, R.L. and Hammerschmidt, R. (1992) Phenolic compounds and their role in disease
resistance. Annual Review of Phytopathology 30: 369-389.
Oerke, E.-C., Steiner, U., Dehne, H.-W. and Lindenthal, M. (2006). Thermal imaging of cucumber
leaves affected by downy mildew and environmental conditions. J. Exp. Bot. 57: 2121-2132.
Osmond, C.B., Daley, P.F., Badger, M.R. and Lüttge, U. (1998) Chlorophyll fluorescence quenching
during photosynthetic induction in leaves of Abutilon striatum Dicks infected with Abutilon
mosaic virus observed with a field-portable system. Bot. Acta. 111: 390-397.
Pérez-Bueno, M.L. (2003) Photosystem II and viral infection: Analysis of fluorescence imaging and
regulation of the synthesis of the oxygen-evolving-complex proteins during pathogenesis.
PhD Thesis. University of Granada, Granada, Spain.
Pérez-Bueno, M.L., Rahoutei, J., Sajnani, C., García-Luque, I. and Barón, M. (2004) Proteomic
analysis of the oxygen-evolving complex of photosystem II under biotic stress. Studies on
Nicotiana benthamiana infected with tobamoviruses. Proteomics 4: 418-425.
Plumbe, A.M. and Willmer, C.M. (1986) Phytoalexins, water-stress and stomata. III. The effects of
some phenolics, fatty acids and some other compounds on stomatal responses. New phytol.
103: 17-22.
Rahoutei, J., García-Luque, I., Cremona, V. and Barón, M. (1998) Effect of tobamovirus infection on
PSII complex of infected plants. In Photosynthesis: from light to biosphere. 4: 2761-2764. G
Garab, ed., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Rahoutei, J., Barón, M., García-Luque, I., Droppa, M., Neményi, A. and Horvath, G. (1999) Effect of
tobamovirus infection on the thermoluminiscence characteristics of chloroplast from infected
plants. Z. Naturforsch. 54c: 634-639.
Rahoutei, J., García-Luque, I. and Barón, M. (2000) Inhibition of photosynthesis by viral infection:
Effect on PSII structure and function. Physiol. Plant. 110: 286-292.
Roberts, A.G., Santa Cruz, S., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Turgeon, R. and Oparka, K.J. (1997)
Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana comparison of a fluorescent solute
with fluorescent virus. Plant Cell. 9: 1381-1396.
Rolfe, A.S. and Scholes, J.D. (1995) Quantitative imaging of chlorophyll fluorescence. New Phytol.
131: 69-79.
Romero-Aranda, R., Soria, T. and Cuartero, J. (2001). Tomato plant-water uptake and plant-water
relationships under saline growth conditions. Plant Science 160: 265-272.

128
Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336. C. Resultados

Rowland, D., Dorner, J., Sorensen, R., Beasley, J.P. Jr. and Todd, J. (2005) Tomato spotted wilt virus
in peanut tissue types and physiological effects related to disease incidence and severity. Plant
Pathology 54: 431-440.
Ruiz del Pino, M., Moreno, A., García de Lacoba, M., Castillo-Lluva, S., Gilardi, P., Serra, M.T. and
García-Luque, I. (2003) Biological and molecular characterization of P101 isolate, a
tobamoviral pepper strain from Bulgaria. Arch. Virol. 148: 2115-2135.
Ryšlavá, H., Müller, K., Semorádová, Š., Synková, H. and Čeřovská, N. (2003) Photosynthesis and
activity of phosphoenolpyruvate carboxylase in Nicotiana tabacum L. leaves infected by
Potato virus A and Potato virus Y. Photosynthetica 41: 357-363.
Sajnani, C. (2005) Viral infections as stress factor in photosynthesis. PhD Thesis, University of
Granada, Granada, Spain.
Sampol, B., Bota, J., Riera, D., Medrano, H. and Flexas, J. (2003). Analysis of the virus-induced
inhibition of photosynthesis in malmsey grapevines. New Phytologist 160: 403-412.
Scharte, J., Schon, H. and Weiss, E. (2005) Photosynthesis and carbohydrate metabolism in tobacco
leaves during an incompatible interaction with Phytophthora nicotianae. Plant Cell Environ.
28: 1421-1435.
Schmitz, A., Kiewnick, S., Schlang, J. and Sikora, R.A. (2004) Use of high resolution digital
thermography to detect Heterodera schachti infestation in sugar beets. Commun. Agric. Appl.
Biol. Sci. 69: 359-363.
Scholes, J.D. and Rolfe, S.A. (1996) Photosynthesis in localised regions of oat leaves infected with
crown rust (Puccinia coronata): quantitative imaging of chlorophyll fluorescence. Planta 199:
573-582.
Sridhar, R., Mohanty, S.K. and Ramarkrishanayya, G. (1994). Physiology of rice tungro virus disease:
water relations of diseased plants. Acta Phytopatologica et Entomologica Hungarica 29: 137-
145.
Thévenaz, P., Ruttimann, U.E. and Unser, M. (1998) A pyramid approach to subpixel registration
based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7: 27-41.
Van Der Straeten, D., Chaerle, L., Sharkov, G., Lambers, H. and Van Montagu, M. (1995) Salicylic
acid enhances the activity of the alternative pathway of respiration in tobacco leaves and
induces thermogenicity. Planta 196: 412-419.
van Kooten, O., Meurs, C. and van Loon, L.C. (1990) Photosynthetic electron transport in tobacco
leaves infected with tobacco mosaic virus. Physiol. Plant. 80: 446-452.
Wardle, K. and Short, K.C. (1983) Stomatal response of in vitro cultured plantlets. I. Responses in
epidermal strips of Chrysanthemum to environmental factors and growth regulators. Biochem
Physiol Pflanzen 178, 619–624.

129
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Weis, E., Meng, Q., Siebke, K., Lippert, K. and Esfeld, P. (1998) Topography of leaf carbon
metabolism as analyzed by chlorophyll a-fluorescence. In Photosynthesis: mechanisms and
effects Vol5. Edited by G. Garab pp. 4259-4264. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht.
Wetter, C., Conti, M., Alschuh, D., Tabillion, R. and van Regemortel, M.H.V. (1984) Pepper mild
mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Phytopathology. 74: 405-410.
Whenham, R.J. and Fraser, R.S.S. (1981) Effect of systemic and local-lesion-forming strains of
tobacco mosaic virus on abscisic acid concentration in tobacco leaves: consequences for the
control of leaf growth. Physiol. Plant Pathol. 18: 267-278.
Whenham, R.J., Fraser, R.S.S., Brown, L.P. and Payne, J.A. (1986) Tobacco-mosaic-virus-induced
increase in abscisic-acid concentration in tobacco leaves: Intracellular location in light and
dark-green areas, and relationship to symptom development. Planta 168: 592-598.
Willmer, C.M., Wilson, A.B. and Jones, H.G. (1988) Changing responses of stomata to abscisic acid
and carbon dioxide as leaves and plants age. J. Exp. Bot. 39: 401-410.
Zhou, Y.H., Peng, Y.H., Lei, J.L., Zou, L.Y., Zheng, J.H. and Yu, J.Q. (2004) Effects of potato virus
YNTN infection on gas exchange and photosystem 2 function in leaves of Solanum tuberosum
L. Photosynthetica 42: 417-423.

130
C. Resultados

C.2. Multicolour fluorescence imaging: an useful tool to visualise


systemic viral infection in plants

Mónica Pineda1, László Gáspár2, Fermín Morales3, Zoltán Szigeti2, Matilde


Barón1,*.

1. Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology of Plants. Estación Experimental del
Zaidín, Spanish Council for Scientific Research (CSIC). C/ Profesor Albareda, nº 1. C.P. 18008.
Granada (Spain).
2. Department of Plant Physiology and Molecular Plant Biology, Eötvös Loránd University, Pázmány
Péter sétány 1/c, 1117 Budapest, Hungary.
3. Department of Plant Nutrition, Aula Dei Experimental Station, Spanish Council for Scientific
Research (CSIC), Apdo. 202, E-50080 Zaragoza, Spain.

* Corresponding author: mbaron@eez.csic.es; Telephone number: 0034 958 18 16 00 Extension 213;


Fax number: 0034 958 12 96 00

Abstract: Multicolour fluorescence induced by UV light is a sensitive and specific


tool to provide information about the primary and secondary metabolism of the
plants by obtaining signals of the chlorophyll fluorescence and blue-green
fluorescence (BGF), respectively. We have followed the systemic infection on
leaves of Nicotiana benthamiana plants with the Pepper Mild Mottle Virus
(PMMoV) by means of a multicolour fluorescence imaging set up. This technique
could detect differences during the infection process between two strains of
PMMoV and establish a correlation between the virulence and the changes induced
on the plant. BGF increase mainly in the abaxial leaf side during pathogenesis and
the corresponding images showed a clear vein-associated pattern in both old and
young leaves of the infected plants. Chlorogenic acid was demonstrated to be the
main contributor to the BGF emission in N. benthamiana plants, being also
correlated with the levels of this hydroxycinnamic acid in the young symptomatic
leaves with the fluorescence signal and the virulence of the viral strain infecting the

131
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

plant. BGF imaging could detect viral-induced metabolic changes in asymptomatic


leaves before the viral inmunodetection by tissue printing. The situation in
symptomatic leaves is more complex, due to the quick invasion by the pathogen.
Red and far red fluorescence images confirmed our previous results about
alterations in the photosynthetic apparatus of old leaves from infected plants
detected with other imaging techniques. Fluorescence ratios F440/F690 and
F440/F740, which increase in both symptomatic and asymptomatic leaves during
the viral infection, were excellent indicators of biotic stress.

Keywords: blue-green fluorescence - chlorophyll fluorescence - UV-induced


fluorescence imaging - Nicotiana benthamiana - pepper mild mottle virus -
tobamovirus.

Abbreviations: AB, abaxial; AD, adaxial; AS, asymptomatic; BGF, blue-green


fluorescence; Chl, chlorophyll; Chl-F, chlorophyll fluorescence; Chl-FI;
chlorophyll fluorescence imaging; CP, viral coat protein; dpi, days post-
inoculation; F440, blue fluorescence (fluorescence intensity at 440 nm); F520,
green fluorescence (fluorescence intensity at 520 nm); F690, red chlorophyll
fluorescence (fluorescence intensity at 690 nm); F740, far-red chlorophyll
fluorescence (fluorescence intensity at 740 nm); HCA, hydroxycinnamic acid;
HPLC, high performance liquid chromatography; HR, hypersensitive response;
MCF, multicolour fluorescence; NPQ, non-photochemical quenching; PMMoV-S
and –I, Spanish and Italian strains of the pepper mild mottle virus; PVDF:
polyvinylidene fluoride; S, symptomatic; UV, ultraviolet.

Introduction
In the last decade, ultraviolet (UV)-excited fluorescence signals have
emerged as a sensitive and specific tool to evaluate the physiological state of plants

132
C. Resultados

before the impact of different environmental stress factors is evident (Lichtenthaler


and Miehé 1997; Buschmann and Lichtenthaler 1998; Cerovic et al. 1999).
Excitation of leaves with long-wavelength UV radiation results in a total of
four characteristic fluorescence bands with maximal or shoulders near to 440 nm
(blue; F440), 520 nm (green; F520), 690 nm (red; F690) and 740 nm (far-red;
F740) fluorescence (Lichtenthaler and Miehé 1997; Buschmann and Lichtenthaler
1998; Buschmann et al. 2000). F690 and F740 taken together are also called
chlorophyll fluorescence (Chl-F) since this fluorescence signals are emitted by
chlorophyll a (Chl). F440 and F520 are often treated as blue-green fluorescence
(BGF), since F520 is rarely present as a distinct peak (Cerovic et al. 1999).
During the monitoring of multicolour-fluorescence (MCF) signals by point
measurements of randomly selected leaf areas, the information about fluorescence
gradients over the whole leaf surface is missed. In contrast, the UV-excited
fluorescence imaging systems offer high spatial resolution from the leaf pattern to
the remote sensing applications (Nilsson 1995; Lang et al. 1996; Lichtenthaler and
Miehé 1997; Buschmann and Lichtenthaler 1998; Apostol et al. 2003).
BGF is primarily emitted from the epidermis and from both mesophyll cell
walls and the leaf veins by several phenolic compounds covalently bound to the
cell wall carbohydrates. In contrast, Chl-F emanates principally from mesophyll
cells. For some author (Harrys and Hartley 1976; Morales et al. 1996; Lichtenthaler
and Schweiger 1998) ferulic acid appears as the main BGF emitter in leaves,
showing that soluble plant phenolic compounds being present in the vacuole of
plant cells contribute very little to the overall BGF emission. More recently,
Morales et al. (2005) indicate that chlorogenic acid is one of the main BGF
fluorophores in artichoke leaves. This hydroxycinnamic acid (HCA) is
predominant in tobacco plants, increasing its levels with the leaf age (Ounis et al.
2001; Cerovic et al. 2002).
The use of the fluorescence ratios F440/F520, F440/F690, F440/F740 and
F690/F740 is widespread since BGF and Chl-F have distinct origins and can

133
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

change independently in response to stress factors. F440/F690 and F440/F740 are


very early stress indicators and F440/F520 could change after long stress exposure
(Buschmann and Lichtenthaler 1998; Lichtenthaler and Schweiger 1998;
Buschmann et al. 2000). The F690/F740 ratio presents an inverse relationship with
the leaf Chl content (Lang et al. 1996; Gitelson et al. 1998, 1999; Cerovic et al.
1999; Buschmann et al. 2000).
Several limiting agricultural factors have been monitored by MCF, using in
most of the cases imaging systems: mineral deficiencies (Morales et al. 1994;
Heisel et al. 1996; Buschmann and Lichtenthaler 1998; Langsdorf et al. 2000;
Cartelat et al. 2005; Lichtenthaler et al. 2005), water stress (Lang et al. 1996;
Schweiger et al. 1996; Buschmann and Lichtenthaler 1998; Hideg et al. 2002), and
high temperature stress (Morales et al. 1998). Imaging is especially valuable for the
visualization of the plant-pathogen interactions where, according to the
symptomatology, no uniform alteration of the foliar metabolism is expected
(Chaerle and Van Der Straeten 2001; Nedbal and Whitmarsh 2004). Chl-F imaging
(Chl-FI) has revealed the spatial-temporal changes on the photosynthetic efficiency
pattern during pathogenesis in plants infected with fungi (Rolfe and Scholes 1995;
Scholes and Rolfe 1996; Chou et al. 2000; Scharte et al. 2005), bacteria (Berger et
al. 2004, 2007) and virus (Balachandran and Osmond 1994; Balachandran et al.
1994, 1997; Osmond et al. 1998; Lohaus et al. 2000; Chaerle et al. 2006; Pérez-
Bueno et al. 2006). However there is a lack of MCF studies which include the
analysis for the BGF signals in pathogen-infected plants. Fungal infection was
reported to increase F440 either by the fungus autofluorescence (Lüdeker et al.
1996) or by the production of plant phytoalexins (Niemann et al. 1991). Szigeti et
al. (2002) showed changes in the fluorescence ratios in Chinese cabbage infected
with turnip yellow mosaic virus. By means of MCF imaging, Buschmann and
Lichtenthaler (1998) reported an early visualization of small punctures made by
tobacco flies on leaves and mite attack on bean; more recently, Chaerle et al.

134
C. Resultados

(2007) monitored the hypersensitive response (HR) to tobacco mosaic virus (TMV)
infection by a BGF increase linked to scopoletin accumulation.
In the present work we follow, a systemic viral infection by an MCF imaging
setup in Nicotiana benthamiana plants infected with either the Spanish or the
Italian strain of Pepper Mild Mottle Virus (PMMoV-S, PMMoV-I; the origin of
these strains was previously reported in Alonso et al. 1989 and Wetter et al. 1984,
respectively). In previous studies we have showed that the oxygen-evolving
complex (OEC) of photosystem II (PSII) is the main target of this tobamovirus in
the chloroplast (Barón et al. 1995; Rahoutei et al. 1998, 1999, 2000; Pérez-Bueno
et al. 2004). Kinetic Chl-FI studies showed a correlation between NPQ (non-
photochemical quenching) and the PMMoV spreading in leaves without showing
any symptoms (Pérez-Bueno et al. 2006). Imaging thermography could detect the
infection earlier than the former technique in the form of an increase in leaf
temperature caused by stomatal closure (Chaerle et al. 2006). In order to give a
more complete picture of the host plant response to PMMoV infection, information
is lacking about secondary metabolites implicated in signalling processes and
response to pathogens in N. benthamiana. Hence, we have monitored changes in
both BGF and Chl-F in N. benthamiana leaves infected with either PMMoV-S or
PMMoV-I by a compact flash-lamp MCF setup. Fluorescence values (F440, F520,
F690 and F740) and fluorescence ratios (F440/F520, F440/F690, F440/F740 and
F690/F740), as well as their corresponding images, of whole leaves from control
and infected plants were monitored along the infection. In an attempt to identify the
compounds involved in the BGF emission, imaging was complemented by high
performance liquid chromatography (HPLC) analysis of leaf extracts. To correlate
changes in fluorescence parameters with the virus entrance in the symptomatic
young leaves, inmunolocalization of viral coat protein (CP) by tissue printing was
carried out.

135
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Material and methods


Plant growth and PMMoV infection
Nicotiana benthamiana cv. Gray plants were cultivated in a growth chamber
at 120 µmol m-2 s-1 PAR (photosynthetically-active radiation), generated by white
fluorescent lamps (HPI-T 250 W, Phillips, Eindhoven, Netherlands), with a 15/9h
(26/20ºC) light/dark photoperiod and a relative humidity of 60%. The three lowest
leaves of plants with 6-7 fully-expanded leaves were carburundum-dusted and
mechanically inoculated with the Spanish or the Italian strains of PMMoV
(PMMoV-S and PMMoV-I) using 50 µl of inoculum per leaf (50 µg of virus per
ml of 20 mM sodium phosphate/biphosphate buffer pH 7.0). Mock-inoculated
plants were treated with buffer only.
At 5 (PMMoV-S infected plants) and 7 (PMMoV-I infected plants) days
post-inoculation (dpi), visual symptoms became visible: new leaves developed
after the inoculation showed severe curling and wrinkling (symptomatic leaves, S).
In contrast, no symptoms were observed in the three inoculated leaves and neither
in those upper fully expanded leaves that were inoculated. These non-inoculated
leaves will be referred as asymptomatic leaves (AS, Rahoutei et al. 2000). Stunting
of the plants was clearly evident at 14 dpi. PMMoV-I infected plants were able to
recover from 21 dpi onwards: plant height increased again and plants developed
new non-curly leaves. In contrast, no new leaves appeared in PMMoV-S infected
plants after 14 dpi and plants died at 21 dpi, except for the batch of the plants
whose fluorophore content was determined which died at 23 dpi.
Starting with the lowest leaf and numbering leaves in ascending order, we
have analysed the 5th leaf as the AS one. The second youngest leaf at every dpi was
tested as the S one.

Fluorescence Imaging
Fluorescence imaging measurements were carried out in control and virus
infected plants at different post-infection times: 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 (for plant

136
C. Resultados

infected with both viral strains), 21, 24 and 28 dpi (for controls and plants infected
with PMMoV-I).
Fluorescence excitation and detection was essentially the same as described
earlier (Lenk and Buschmann 2006).
Fluorescence emission images of the abaxial (AB) and adaxial (AD) surfaces
of leaves were carried out with a compact flash-lamp fluorescence imaging system
(FL-FIS, Buschmann and Lichtenthaler 1998; Lichtenthaler and Babani 2000).
Excitation light was provided by a pulsed xenon lamp with a UV-transmitting filter
(transmission maximum at 355 nm). Fluorescence images were acquired with a
CCD-camera gated synchronously with the flash lamp. Leaves were placed at 390
mm from the camera, obtaining images with 60 mm width. The multispectral
fluorescence imaging for the blue (F440), green (F520), red (F690) and far-red
(F740) fluorescence was acquired sequentially for the identical field of view, each
with the appropriate filter that were built into a filter wheel in front of the CCD-
camera. The acquisition of the fluorescence emission images required the
accumulation of 800 images.
Images were processed by specific software (Camille 1.05 software,
Photonetics, Kehl, Germany). The raw image was corrected for non-uniform
excitation with the pixels of an image showing uniform fluorescence (blue
fluorescence image of a white paper). Black and white images of both measured
fluorescence intensity and fluorescence ratios (F440/F520, F440/F690, F440/F740
and F690/F740, acquired by a division of fluorescence intensities pixel by pixel)
were set at the appropriate intensity and either false colour or black and white scale
were applied by ImageJ software package (rsb.info.nih.gov/ij).
Numerical data were obtained by Camille 1.05 software, in a region of
interest corresponding to the leaf outline. Fluorescence profiles across the leaves
(carried out by ImageJ, http://rsb.info.nih.gov/ij) were obtained by drawing a line
perpendicular to the main vein, covering 266 pixels of AS leaves. The main vein
was located in the middle of the line (133 pixels to the leaf edge).

137
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fluorophore determination
Phenolic compounds were extracted in warm (at 70 ºC) from 20 mm2 leaf
disks with methanol for 30 min. The extract solution was brought to a volume of 5
or 10 ml (depending on type of sample) with methanol, and then frozen at –80 ºC
until analysis.
Leaf extracts were analyzed by an HPLC method described previously (Morales et
al. 2005). This method revealed the presence of one (majority) phenolic acid,
identified as chlorogenic acid by comparison of its retention time and UV
absorption spectrum with that of chlorogenic acid (pure standard) in methanol.
Prior to analysis, the sample extracts were thawed and filtered through a 0.45 µm
polyvinylidene fluoride (PVDF) filter. High-performance liquid chromatography
was performed with a HPLC system (Waters Alliance 2795 HPLC system, Waters
Corp., Mildford MA, USA) equipped with on-line degasser, autosampler module (4
ºC) and column oven (40 ºC). A diode array detector (Waters 2996 UV-visible)
was used for analyte detection. The column used was an analytical HPLC column
(Waters Symmetry C18, 250 mm x 4.6 mm i.d., dp = 5 µm) with a 20-mm guard
column of the same material. The mobile phase consisted of a gradient system of
solution A, MilliQ water-acetic acid (97.5:2.5; v/v) and solution B, HPLC gradient
grade methanol-acetic acid (97.5:2.5; v/v) at a flow rate of 1.0 ml min-1. The
gradient program was as follows: linear gradient from solution A-B (70:30) to
solution A-B (51:49) in 15 min, isocratic at solution A-B (51:49) for 10 min,
followed linear gradient to solution A-B (70:30) in 5 min, finally isocratic at
solution A-B (70:30) for 5 min. Injection volume was 15 µl. Automated
instrumentation was realized with an HPLC data system (HyStar, Bruker Daltonik
GmbH, Bremen, Germany). The data were analyzed by a data processing software
package (HyStar PostProcessing, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany).
Quantification was based on peak area measurements at 325 nm. Standard
solutions were prepared with chlorogenic acid, and were examined by HPLC in
order to determine its retention time (4.1 min). A multipoint calibration was

138
C. Resultados

performed in the range of 1.25-40 µM. Linear relationship was as follows: Y =


9.28 X + 1.14 (R2 = 0.9999).α-Naphtol (≥99% GC; Riedel-de Haën, Seelze,
Germany) was used as internal standard (retention time, tR, 23.0 min).

Statistics
Statistical analysis was carried out with specific software (SigmaPlot 8.0
software, Systat Software Inc., San Jose, California, USA). Student t-test was used
to compare control with infected plants, and PMMoV-I infected with PMMoV-S
infected plants. Graphs show mean values (obtained from at least 4 samples per
leaf type) and their corresponding standard errors. Tables 1 and 2 indicate
significant differences between treatments, according to Student’s t-tests and the
three significance levels tested: p<0.05 (*), p<0.01 (**) and p<0.001 (***).

Tissue prints
Localization of PMMoV CP in S leaves was performed by tissue print
analysis using specific antiserum against viral CP (Alonso et al. 1989). As
described by Ruíz del Pino et al. (2003), non-specific binding was reduced by
preabsorbing the immune antiserum with acetone powder obtained from stems and
leaves of young healthy N. benthamiana plants. Whole S leaves from infected and
their respective equivalent leaves in control plants were imprinted on PVDF sheets
and assayed as described by Maliga et al. (1995). Membranes were first incubated
with the PMMoV-CP specific antiserum at the appropriate dilutions and
subsequently with goat anti-rabbit alkaline phosphatase-IgG (Sigma-Aldrich, St.
Louis, USA). Bound antibodies were detected using nitro-blue tetrazolium/5-
bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP, Roche, Basel, Switzerland).

Results
Here we present the images corresponding to fluorescence emission at the
different wavelengths analysed and to ratios between them. In addition, values of

139
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

these parameters averaged in the whole leaf surface are showed. In order to avoid
the tedious enumeration of dpi in which significant differences according to the
statistic (see Material and Methods) are found between PMMoV infected plants
and controls, this information is displayed in tables 1 and 2.

Asymptomatic leaf Symptomatic leaf


Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial
1.8 3.5

1.6 Control 3.0

1.4 PMMoV-I 2.5

F440 (x10 )
F440 (x10 )

3
3

PMMoV-S
1.2 2.0

1.0 1.5

0.8 1.0

0.6 0.5
1.8
0.4 2.5
0.0
1.6
2.0
1.4
F520 (x103)

F520 (x103)
1.2 1.5

1.0 1.0
0.8
0.5
0.6

0.4 80
0.0
80
60
F690 (x10 )

F690 (x10 )
3

3
60

40
40

20 20

0
80 0

60

60
F740 (x10 )

F740 (x103)
3

40

40

20

20

0
3 5 7 10 12 14 17 21 24 28 3 5 7 10 12 14 17 21 24 28 3 5 7 10 12 14 17 21 24 28 3 5 7 10 12 14 17 21 24 28

t (days post-inoculation) t (days post-inoculation)

Fig. 1. Time-course of blue (F440), green (F520), red (F690) and far red (F740) fluorescence
emission of asymptomatic (left) and symptomatic (right) leaves of Nicotiana benthamiana control and
PMMoV-infected plants. Averages of the whole leaf at every dpi assayed are displayed, error bars
indicate standard error. AB and AD surfaces of the leaves are shown. Fluorescence intensity is given
in arbitrary units.

140
C. Resultados

Fluorescence emission of asymptomatic leaves


The most evident changes in fluorescence emission of AS leaves occurred in
the AB surface of the leaves.
BGF. Values of total (averaged in the whole leaf) blue fluorescence (F440)
emitted by old AS leaves from control and infected plants increased with leaf age
only in the AB surface (Fig. 1). The highest F440 values correspond to PMMoV-S
infected plants, according to the highest virulence of this strain.
Comparing with control values, F440 of the AB surface of AS leaves of
PMMoV-infected plants increased from 10 and 12 dpi onwards (PMMoV-S and –I,
respectively; Fig. 1, Table 1). In the last PMMoV-I-infection steps, corresponding
to the recovery phase of the symptoms occurred in these plants, F440 values
decreased until values similar to the controls (Fig. 1, Table 1).

Table 1. Summary of the statistical analysis of the intensity of the fluorescence emitted in the blue,
green, red and far-red region by intact leaves of control and PMMoV infected N. benthamiana plants.
Table displays days post-inoculation where significant differences were found at p<0.05 (*), p<0.01
(**) and p<0.001 (***). Asymptomatic leaves: old leaves which remain symptomless during all the
infection process; F440, blue fluorescence; F520, green fluorescence; F690, red fluorescence; F740,
far red fluorescence; PMMoV-I and –S, Italian and Spanish strains of the Pepper Mild Mottle Virus;
n.s. no significant differences were found at any dpi assayed; symptomatic leaves, young leaves
displaying curling from the first week of the infection time.

PMMoV Asymptomatic leaf Symptomatic leaf


Strain AB surface AD surface AB surface AD surface
10-17***, 21-24*,
-I 12-24** n.s. 10**, 14**, 17-21*, 24**
F440 28**
** *** **
-S 10-14 ,17 5 7*, 10-14***, 17** 7**, 10*, 12-14***, 17*
12-14*, 17**, 21*,
-I n.s. 10-17***, 21-28** 14*, 21-24**
F520 24***
-S 10***, 12-14**, 17*** *
5-7 ; 14-17 * * ***
5 , 7-14 , 17 **
7**, 10*, 12-14***, 17*
5*, 7**, 10***, 12** 14- 7*, 10-12**, 14- 7**, 10*, 12-14**, 17-
-I 10*, 17-21*
F690 17* 17* 21*, 28**
-S n.s. n.s. 5**, 7-10*, 17* 7**, 12-14**, 17*
7*, 10-12**, 14- 7**, 10*, 12-17**, 21*,
-I 7*, 10-14**, 17* 10**, 14*, 17**, 21*
F740 17* 28*
-S 17* n.s. 7*, 10**, 14-17** 7**, 12***, 14**, 17***

141
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Total green fluorescence emission (F520) from AS leaves of healthy and


infected plants displayed a very similar trend to F440 (Fig. 1); however, increase of
this parameter with leaf ageing is more noticeable than with F440, affecting also
the AD side. The most virulent strain, PMMoV-S, caused the highest F520
increment (Table 1), which could also be detected in PMMoV-I infected plants,
albeit with some delay. As in the case of F440, F520 values decreased until values
similar to the controls during the symptom recovery phase (Fig. 1, Table 1).
To analyse the viral-induced spatiotemporal changes of emitted fluorescence
at the different wavelengths, we have compared the images obtained before (5 dpi)
and after (17 dpi) the fluorescence changes (Fig. 2). The F440 patterns from
control leaves did not exhibit great changes along the experimental time (Fig. 2a).
The areas showing the highest fluorescence emission corresponded with the
vascular tissues of the AB leaf surface. At 5 dpi, leaves from infected plants were
very similar to the controls. However, a F440 increase could be detected at 17 dpi
in both veinal and interveinal tissues of AS leaves of infected plants, being more
apparent in the AB surface and in the case of PMMoV-S infected plants. The F520
pattern was very similar to those of F440, except for the increase of F520 emission
at 17 dpi in control plants.
Chl-F. Values of total red fluorescence emitted by Chl of AS leaves were
stronger in the AB leaf side in all cases (Fig. 1). F690 diminished with leaf aging in
old AS leaves from both control and infected plants. No significant differences
could be established between PMMoV-S-infected and control plants on either of
the leaf sides (Table 1); while PMMoV-I infected ones showed a significant
fluorescence decrease in the AB surface at 5-17 dpi, as well as in the AD surface at
7-17 dpi. Coinciding with the recovery phase (21-28 dpi) F690 of AS leaves of
PMMoV-I infected plants were similar to the respective controls on both leaf
surfaces.
During the first infection days, F690 pattern (Fig. 2a) of AS leaves from
infected plants appeared similar to control ones; however, at 17 dpi, F690

142
C. Resultados

Fig. 2. Images of blue (F440), green (F520), red (F690) and far red (F740) fluorescence emission of
AS (a) and S (b) leaves of Nicotiana benthamiana control and PMMoV-infected plants. AB and AD
surfaces of the leaves are shown. Images obtained before (5 dpi) and after (17 dpi) fluorescence
changes occurred are displayed. The applied colour scale is shown for every panel. Different
asymptomatic (old) and symptomatic (young) leaves sizes are due to leaf age.

143
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

decreased in the whole leaf compared to that of control plants. A fluorescence


gradient pattern appeared, where the highest values in AS leaves were found in leaf
areas surrounding the main veins (for N. benthamiana vein classification, see
Roberts et al. 1997).
The behaviour of F740 pattern (Fig. 2a) and whole leaf F740 (Fig. 1) was
similar in healthy and infected plants to that exhibited by F690, with some
differences listed in Table 1.

Asymptomatic leaves fluorescence profiles at 17 dpi


Fluorescence profiles of AS leaf surface at 17 dpi were plotted to visualise
the distribution of the different fluorescence signals registered across these leaves
(Fig. 3). The AB leaf surface was chosen because of the more prominent
fluorescence signal.
BGF emission of control leaves showed the lowest values. Three small peaks
could be distinguished, corresponding to veins type I and II. BGF levels of AS
leaves from PMMoV-infected plants were higher along the whole profile, being
more evident in the vein area, and in the case of PMMoV-S infected plants. Thus,
profiles confirmed the enhancement of BGF in the vascular regions.
On the other hand, control AS leaves exhibited the highest Chl-F values. The
main veins displayed the lowest values in AS leaves from both control and
PMMoV-infected plants (Fig. 3).

Fluorescence emission of symptomatic leaves


In S leaves, similarly to AS leaves, the main changes in fluorescence pattern
and total fluorescence values occurred in the AB surface of the leaves.
BGF. Emission of blue fluorescence from young control leaves did not
manifest great differences along the experimental time on either leaf surface (Fig.
1, Table 1). PMMoV-S produced the highest F440 and F520 increment in both leaf
surfaces compared to the controls. Once again this phenomenon was delayed in the

144
C. Resultados

case of PMMoV-I infection and during the recovery phase, F440 values of these
leaves decreased reaching control values.
Both surfaces of control young leaves displayed a very homogeneous F440
and F520 pattern during the period analysed (Fig. 2b). S leaf of PMMoV-infected
plants did no differ from controls at 5 dpi (increased values registered in the AD
surface were not significant); however, a BGF increment in the whole leaf (both
surfaces) was evident at 17 dpi, the vein areas showing the highest values, more
apparent in the AB surface of the S leaves and in PMMoV-S infected plants, as in
the case of AS leaf patterns of infected plants.

Fig. 3. Infection-induced changes in leaf fluorescence emission in the AB surface of AS leaves


at 17 dpi. Fluorescence profiles are shown along a 266 pixel line drawn in the middle of an AS leaf,
and centred on the midrib (vein type I; for N. benthamiana vein classification, see Roberts et al.
1997). Vertical dotted lines represent the positions of veins type I and II. Fluorescence emission was
normalised to maximum values. Fluorescence difference between solid lines is 0.2 relative units.

145
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Chl-F. Control plants emitted the strongest F690 (Fig. 1), as in AS leaves.
The AB side of S leaves from PMMoV-S infected plants exhibited the first
significant changes (5-10 and 17 dpi; Table 1). The AD surface only showed
significant differences as early as 7 dpi and from 12 to 17 dpi. PMMoV-I infected
plants showed decreased F690 values in the AD surface at 7-21 dpi, and 28 dpi.
The AB surface displayed lower F690 emission than control plants at 10 and 17-21
dpi. Only this leaf surface showed the effects of recovery phase.
F740 emission followed a very similar kinetics to F690 (check Table 1 for
significant time points).
In contrast to the defined red Chl fluorescence pattern from AS leaves of
infected plants, no clear pattern emerged from F690 images of S leaves (Fig. 2b).
The only remarkable fact is the lower fluorescence intensity of S leaves from
infected plants at 5 and 17 dpi in both surfaces of the leaves, which is significant at
5 dpi in the case of AB side of S leaves of PMMoV-S infected plants, and at 17 dpi
in all cases. Also imaging of F740 was comparable to that of F690 (Fig. 2b).

Fluorescence ratios of asymptomatic leaves


The fluorescence ratios that were early indicators of stress caused by
PMMoV infection in Nicotiana benthamiana plants were F440/F690 and
F440/F740, in both AB and AD surfaces of the AS leaves.
F440/F520. The values of this fluorescence ratio were decreasing with leaf
aging in all treatments, being more evident in the case of AS control leaves and in
the AB side of the leaves (Fig. 4). Table 2 shows the earliest difference between
the AS leaves from PMMoV-S and –I infected plants and their corresponding
controls at 12 and 14 dpi, respectively, in the AB side.
Figure 5a displays the fluorescence ratios of AS leaves before (5 dpi) and
after (17 dpi) the biggest changes in fluorescence ratios occur. In the case of
control leaves, decreasing of F440/F520 due to leaf aging was patent on the
images. Comparing the images from control and infected plants at 17 dpi, an

146
C. Resultados

increase of this ratio was evident in the AB side of plants infected with both viral
strains, exhibiting the vein areas the highest values.
F440/F690. As Figure 4 shows, AS leaves of infected plants displayed
higher values of F440/F690 than control leaves early in the time-course, being
more evident in the AD side of the leaves. The earliest change was registered in the
AD side of the AS leaves of PMMoV-I infected plants (Table 2). These results
were confirmed by imaging (Fig. 5a). Even being an increase of F440/F690 clear at
17 dpi in the AB surface of the AS leaves of infected plants, the AD ones
evidenced the highest values of the ratio at this post-infection time. It was possible
to observe a decreasing gradient in this parameter from the vein (showing the
highest values of the ratio) to the mesophyll. Control AS leaves did not show clear
changes along the experimental time.
F440/F740. The kinetics of this parameter was very similar to that of
F440/F690 (Fig. 4). F440/F740 detected significant differences later than
F440/F690 in both virus infections (Table 2). However, recovery phase of
PMMoV-I infected plants could be detected at 28 dpi in both surfaces of the AS
leaf, if we consider that any significant difference between the values of the ratio
between control and infected plants are evident at this post-infection time (Table
2).
Images of F440/F740 displayed a very similar situation to F440/F690, albeit
with higher values than the former (Fig. 5a).
F690/F740. In general, F690/F740 values, inversely correlated with the Chl
content in leaf, were higher in the AB surface than in the AD one. In both leaf
surfaces and for the 3 samples analysed, F690/F740 slightly diminished until 10-12
dpi, from this point the ratio raised, being more evident this phenomenon on the
AD side.
AS leaves of PMMoV-S infected plants displayed the highest ratio and
consequently the lowest Chl content at 17 dpi, only significant in the AB leaf
surface (Table 2, Fig. 5). However, the AB surface of AS leaves from PMMoV-I

147
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

infected plants did not differ significantly along the experiment, when compared
with the controls. In this kind of leaves, the AD leaf surface displayed a higher Chl
content than controls at various time-points (12, 14, 28 dpi, Table 2).

Asymptomatic leaf Symptomatic leaf


Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial
1.6
1.4
2.0
1.2

F440 / F520
F440 / F520

1.0 1.5
0.8
1.0
0.6 Control
0.4 PMMoV-I 0.5
0.2 PMMoV-S
0.08
0.0 0.16
0.0
0.07 0.14
0.06 0.12
F440 / F690

F440 / F690
0.05 0.10
0.04 0.08
0.03 0.06
0.02 0.04
0.01 0.02
0.06
0.00 0.18
0.00
0.16
0.05
0.14
F440 / F740

F440 / F740
0.04 0.12
0.10
0.03
0.08
0.02 0.06
0.04
0.01
0.02
0.00
1.8 0.00
1.8

1.6 1.6
F690 / F740

1.4 1.4 F690 / F740


1.2 1.2

1.0 1.0

0.8 0.8

0.6 0.6
3 5 7 10 12 14 17 21 24 28 3 5 7 10 12 14 17 21 24 28 3 5 7 10 12 14 17 21 24 28 3 5 7 10 12 14 17 21 24 28

t (days post-inoculation) t (days post-inoculation)

Fig. 4. Time-course of F440/F520, F440/F690, F440/F740 and F690/F740 fluorescence ratios of


asymptomatic (left) and symptomatic (right) leaves of Nicotiana benthamiana control and PMMoV-
infected plants. Averages of the whole leaf at every dpi assayed are displayed, error bars indicate
standard error. AB and AD surfaces of the leaves are shown. Fluorescence intensity is given in
arbitrary units.

148
C. Resultados

Table 2. Summary of the statistical analysis of the different fluorescence ratios of control and
PMMoV infected N. benthamiana plants. Table displays days post-inoculation where significant
differences were found at p<0.05 (*), p<0.01 (**) and p<0.001 (***). Asymptomatic leaves: old
leaves which remain symptomless during all the infection process; F440, blue fluorescence; F520,
green fluorescence; F690, red fluorescence; F740, far red fluorescence; PMMoV-I and –S, Italian and
Spanish strains of the Pepper Mild Mottle Virus; n.s. no significant differences were found at any dpi
assayed; symptomatic leaves, young leaves displaying curling from the first week of the infection
time.
PMMoV Asymptomatic leaf Symptomatic leaf
Strain AB surface AD surface AB surface AD surface
-I 14-28** 17**, 28* n.s. n.s.
F440/F520
-S 12-14*, 17** 17** n.s. 17*
7*, 10**, 12-14***, 5*, 7**, 10***, 7*, 10-14***, 17-
-I 10-17***, 21-24*
17-21**, 24* 12-17**, 21*, 28* 21**, 28**
F440/F690
7-10*, 12***, 14**,
-S 12-14*, 17** n.s. 7*, 10**, 12-17*
17*
*** ** ** ***
10-12 , 14-21 , 7 , 10 , 12- 7*, 10-14***, 17-
-I 10-17***, 21-24*
24* 14**, 17-21* 21**, 28*
F440/F740
7-10*, 12-14***,
-S 14*, 17** 14* 7*, 10**, 12-17*
17**
* *
-I n.s. 12-14 , 28 10-12* 12*, 14**, 28*
F690/F740
-S 17* n.s. 10-12*, 14-17** 7*, 17*

Fluorescence ratios of symptomatic leaves


In the case of S leaves, every fluorescence ratio assayed was a good indicator
of the stress induced by PMMoV infection in Nicotiana benthamiana plants, except
for F440/F520. However, any of the ratios could establish significant differences
between S leaves of infected and control plants before the symptoms appeared.
F440/F520. This fluorescence ratio was very regular along the experiment
and between treatments (Fig. 4, Table 2). The only significant difference was found
in the last assay point for PMMoV-S infected plants: at 17 dpi in the AD surface of
the S leaves, as shown in Figure 5b. No clear trend emerged from the F440/F520
images.
F440/F690 and F440/F740. Young control leaves displayed a slight increase
of these parameters along the experiment, being more prominent in the AD surface
of these leaves. In contrast to F440/F520, alterations in both F440/F690 and
F440/F750 ratios due to the viral infection could be found as early as 7 dpi (Fig. 4,

149
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fig. 5. Images of F440/F520, F440/F690, F440/F740 and F690/F740 fluorescence ratios of AS (a)
and S (b) leaves of Nicotiana benthamiana control and PMMoV-infected plants. AB and AD surfaces
of the leaves are shown. Images obtained before (5 dpi) and after (17 dpi) fluorescence changes
occurred are displayed. The applied colour scale is shown for every panel. Different asymptomatic
(old) and symptomatic (young) leaves sizes are due to leaf age.

150
C. Resultados

Table 2). Recovery phase of the symptoms on PMMoV-I infected plants was
registered as a decrease in this ratios, more evident in the AB surface where no
significant differences with control values could be detected at the end of the
infection process.
At 5 dpi, both surfaces of control S leaves showed a very uniform F440/F690
and F440/F740 pattern, with slightly increased values of these ratios on the main
veins (Fig. 5b). At 17 dpi, this situation continued without great changes. PMMoV
infected plants showed similar F440/F690 and F440/F740 values at 5 dpi compared
to the controls. Increased values registered in the AD surface were not significant
(Table 2). Nevertheless, an increment of the ratios was clear in S leaves of infected
plants at 17 dpi. The whole leaf exhibited increased F440/F690 values, emitting the
vascular tissues the highest amount of fluorescence. This vein-associated pattern,
very similar to that found in AS leaves of infected plants, was more apparent in the
AB surface of the S leaves.
F690/F740. AD surface of the 3 treatments displayed lower values of
F690/F740 than the AB one (Fig. 4). Changes in the ratios related to a decrease in
Chl content of S leaves from PMMoV-S-infected plants were only visible at 17 dpi
in the AD surface (Table 2), whereas AB one displayed less Chl content from 10 to
17 dpi (Fig. 4). On the other hand, the two surfaces of the S leaf of PMMoV-I
infected plants exhibited a different behaviour depending on the considered leaf
surface (Fig. 5b, Table 2.)

Fluorophores determination
HPLC analyses of methanolic extracts from S leaves of Nicotiana
benthamiana plants revealed the presence of chlorogenic acid (Fig. 6), whose
concentration increase during the viral infection. Significant differences with
respect to the controls appeared from 7 to 21 dpi for PMMoV-S plants, whereas
PMMoV-I infected plants displayed differences only at 14 dpi. The delay is in
agreement with the lower virulence of this strain; at the beginning of the recovery

151
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

phase (21 dpi), no significant differences could be detected between control and
PMMoV-I- infected plants.

0.20

Control ***
Chlorogenic acid (mg·mm-2) (x10-2)

PMMoV-I
PMMoV-S
0.15

Fig. 6. Time-course of chlorogenic


acid concentrations (mg mm-2) (x10-2)
0.10 *** of symptomatic leaves of Nicotiana
benthamiana control and PMMoV-
* **
infected plants.
0.05

0.00
7 14 21 28
t (days post-inoculation)

Viral immunolocalization in symptomatic leaves


To establish a correlation between fluorescence patterns and PMMoV
localisation in S plant leaves, tissue prints were carried out using an antibody
against the viral coat protein (CP). In S leaves of plants infected with PMMoV-S,
the virus was detected at 4 dpi, only in the leaf base (Fig. 7). At 5 dpi the virus was
present in almost the whole leaf, while at 6 dpi the leaf appears to be completely
invaded. In plants infected with PMMoV-I, the virus localisation pattern was
similar, but delayed in time; the first detection occurred at 6 dpi, when the virus
had spread through the whole leaf. PMMoV-I was detected even during the
symptoms recovery phase (data not shown). The apparent signal detected in control
leaves corresponded to rests of Chl due to the imprint technique.

Discussion
Albeit in the last years UV-excited MCF imaging has emerged as a sensitive
and specific tool for presymptomatic and non-destructive monitoring of changes in

152
C. Resultados

the physiological state of plants, the application of this technique has not gained
ground in the investigation of pathogen attacks, especially viral infections.
Nevertheless, Chl-FI has been broadly employed to study such interactions (van
Kooten et al. 1990; Balachandran and Osmond 1994; Balachandran et al. 1994;
Técsi et al. 1994; Osmond et al. 1998; Lohaus et al. 2000; Chaerle et al. 2004,
2006; Pérez-Bueno et al. 2006). Information about BGF imaging and the
corresponding accumulation of secondary metabolites in virus-infected plants is
only available for the HR induced by TMV (Chaerle et al. 2007); the present
contribution is the first in elucidating such changes during a systemic infection.

Fig. 7. Tissue prints using a


specific antibody against the viral
CP at different post-infection times
(dpi) from symptomatic leaves.

PMMoV infection in Nicotiana benthamiana plants produced an increment


in BGF that was higher in the AB side of AS leaves and in the case of PMMoV-S
infection; the response of the plant to PMMoV-I is delayed, according to the
symptomatology (Rahoutei et al. 2000) and the lower virulence of this strain
demonstrated in our previous studies (Chaerle et al. 2006). Areas surrounding the
veins showed the highest BGF values; viral-induced BGF increase in the
interveinal tissue, is stronger for F520, probably due to the higher accumulation of
green fluorophores under long-term stress (Buschmann and Lichtenthaler 1998)
and the fact that F520 is less efficiently absorbed by the Chl than F440

153
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

(Lichtenthaler et al. 1996). This is supported by the decrease of the F440/F520


ratio during the experiment (Fig. 4). F520 and F440 increase detected in control old
leaves (corresponding to the AS in infected plants, Figs. 1 and 2) along the
experiment is probably due to accumulation of phenolic compounds and changes in
leaf optical properties associated to leaf ageing (Chappelle et al. 1984; Heisel et al.
1996; Cerovic et al. 1999).
BGF measurements in the AB leaf side seem more adequate for following up
the viral infection. It is well documented that UV-induced fluorescence signals
sensed from the upper and lower leaf side differ considerably in dicotyledonous
plants. High amounts of Chl from packed palisade cells of the AD leaf side
reabsorb F440 and F690 more efficiently than in the spongy parenchyma of the AB
side (Buschmann and Lichtenthaler 1998; Cerovic et al. 1999) and can account for
this observation.
Imaging of red fluorescence (F690) in PMMoV-infected plants is well in
accordance with our previous data using different Chl-FI setups (Chaerle et al.
2006; Pérez-Bueno et al. 2006). From 14 (PMMoV-S, data not shown) and 17 dpi
onwards (PMMoV-I), Chl-F showed a heterogeneous leaf pattern in the AD side,
with increased values in the tissue surrounding the main veins. It was demonstrated
that this pattern is directly related to the spread of the virus in AS leaves (Chaerle
et al. 2006; Pérez-Bueno et al. 2006). Fluorescence changes during pathogenesis in
this kind of leaves could not be attributed to alterations in Chl content, because it
did not change significantly along the analysed period (Chaerle et al. 2006). The
present work also supports this fact, since F690/F740 ratio is similar (PMMoV-S)
or even lower (PMMoV-I) than the control values (Figs. 4 and 5). F690/F740 of the
AB surface of AS leaves of PMMoV-S infected plants display higher values than
the control only very late in the infection process (17 dpi, the last day assayed), but
the changes on Chl-F pattern start earlier (14 dpi).
BGF changes preceded (10 dpi PMMoV-S; 12 dpi PMMoV-I) the viral
detection by tissue print (14 and 17 dpi, respectively for the two viral strains;

154
C. Resultados

Chaerle et al. 2006) or Northern Blot (Pérez-Bueno 2003) in AS leaves, suggesting


an earlier activation of the secondary plant metabolism and the subsequent
fluorophore accumulation.
Increases in BGF emission of PMMoV-infected plants are also reflected in
the higher F440/F690 and F440/F740 ratios, even on the AD leaf side (Table 2,
Fig. 4). Similar increases were reported in Chinese cabbage infected with turnip
yellow mosaic virus (Szigeti et al. 2002). These ratios have demonstrated to be the
best-suited stress indicators (Schweiger et al. 1996). With the F440/F690 ratio it
was possible to detect virus-induced stress earlier (5 dpi AD side and 7 dpi AB
side) than with other fluorescence parameters analysed in the case of PMMoV-I
infection. F440/F520 was not as efficient as BGF/Chl-F to follow the PMMoV
infection.
The recovery phase of PMMoV-I infected plants (21-28 dpi) seem to be also
evident in the old leaves, since no significant differences could be found in
fluorescence values of either AD or AB surfaces of AS leaves of these plants with
respect to the control ones (Fig. 1, Table 1). In addition, the fluorescence ratios
decreased to reach values close to the control ones (Table 2, Fig. 4).
A profile analysis of the fluorescence yield along a broader line across the
leaf area is possible (Moon et al. 2001; Hideg et al. 2002). Lichtenthaler et al.
(2005) used horizontal transepts to demonstrate that BGF and Chl-F show a
negative contrast in variegated leaves. In the case of Nicotiana benthamiana (Fig.
3), this relationship is evident in the vein area of AS leaves. Profiles display the
heterogeneous accumulation of blue-green fluorophores, but the Chl-F
heterogeneity is poorly represented by these transepts, establishing once again that
images offer more information about changes originated by PMMoV infection
(Chaerle et al. 2006; Pérez-Bueno et al. 2006).
Focusing now on S leaves, first we have to summarize some data about viral
movement in the host plant. It is well known that tobamoviruses, such as PMMoV,
move rapidly from the inoculated basal leaves to the plant apex (Samuel 1934) via

155
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

phloem (Roberts et al. 1997; Cheng et al. 2000; Oparka and Santa Cruz 2000).
Tissue prints taken from 7-28 dpi of the young leaves showed a quick viral
accumulation in the whole leaf during the early infection steps (Chaerle et al 2006).
In the present work, we could detect the PMMoV-S entrance in the leaf at 4 dpi
and later (5-6 dpi) for the less virulent strain (PMMoV-I), the first visual symptoms
appearing one day later. This confirms the rapid viral movement to S leaves in
contrast to AS leaves (Chaerle et al. 2006), and could explain the absence of a
dynamic imaging Chl-F pattern in S leaves (Fig. 2b). However, averaged whole
leaf Chl-F values could distinguish infected leaves from controls, but never in a
presymptomatic way (Fig. 1, Table 1). These changes in Chl-F emission preceded
the decrease of the Chl content (Chaerle et al. 2006), as F690/F740 ratio showed
(Fig. 4, Table 2).
PMMoV detection in the S leaf (Table 1) either preceded alterations in BGF
emission or the two processes took place concomitantly (F520 of AB surface of S
leaves of PMMoV-S infected plants). As in the case of AS leaves, and due to the
same reasons described above, the changes in fluorescence emission on the AB
surface of S leaves were more significant. The accumulation of phenolic
compounds in S leaves induced by PMMoV, contrary to AS ones, did not precede
virus detection. The decrease of BGF values in the S leaves of infected plants
between 21-28 dpi, compared with previous points of measurement, was indicative
of the symptom recovery phase affecting the young leaves in PMMoV-I infected
plants.
To identify the major compounds responsible for the emission of BGF in N.
benthamiana plants, HPLC analyses of leaves were carried out. Wolfbeis et al.
(1985) reviewed a series of natural compounds known to be present in leaves, that
emit BGF upon UV excitation. The two main classes of BGF emitters are HCAs
and nicotinamide and flavine nucleotides (Lang et al. 1991; Morales et al. 1994;
Cerovic et al. 1999). In the methanolic extracts of S leaves from control and
PMMoV-infected N. benthamiana plants, among the HCAs, chlorogenic acid was

156
C. Resultados

the only HCA detected at high concentrations. Increase in chlorogenic acid


concentration in these leaves correlates with the virulence of the viral strain
analysed, inducing PMMoV-S the most dramatic changes and reaching this HCA
in PMMoV-I infected plants values close to the controls during the recovery phase.
In addition, the chlorogenic acid concentrations in S leaves are well in accordance
with the BGF values (F440, F520), increasing both of them during the infection
with both viral strains. The characteristics of the UV-induced absorption and
excitation spectra that we have recorded previously (Sajnani 2005) in leaf pieces
from PMMoV-infected plants match those of the chlorogenic acid. This HCA was
found to be the most abundant in tobacco plants (Cerovic et al. 2002), being also
present in these plants under different environmental conditions (Ounis et al.
2001).
It is well known that biotic and abiotic stress factors induce the
phenylpropanoid metabolism (Nicholson and Hammerschmidt 1992; Dixon and
Paiva 1995). Increase in the content of phenolic compounds has been demonstrated
in plants infected with wheat streak mosaic virus (Kofalvi and Nassuth 1995), as
well as during a combined infection with TMV and the potato virus X (PVX)
(Balogun and Teraoka 2004). However, little information is available about leaf
distribution of phenolic compounds produced during pathogenesis, the existing
data only concerning the HR (Chaerle et al. 2007).
Interestingly, in AS leaves of PMMoV-infected plants with a defined spatial
pattern of BGF emission at 10-12 dpi (data not shown), we could find similarities
between these images and those of the leaf thermal pattern (Chaerle et al. 2006) at
7-10 dpi (viral strain dependent) as well as with the NPQ at 17 dpi (PMMoV-I)
(Pérez Bueno et al. 2006) from our previous studies. In addition, those images
matched well with the later viral inmunolocalization on tissue print at 14-17 dpi.
Being the thermal changes (temperature increase due to stomatal closure) the
earliest ones during pathogenesis and previous to the viral detection, some systemic
plant factors would be involved in them; in our system increase in BGF emission

157
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

corresponding to activation of the secondary metabolism occurred 3 days later than


thermal changes for every viral strain analysed. Changes in the photosynthetic
apparatus, reflected in alteration of the Chl-F pattern, were evident when the virus
was already present in the leaf. Some of these changes have to play a role in the
defence against the pathogen, because photoinhibition indicating PSII damage was
only evident in PMMoV-infected plants at the final infection steps (Rahoutei et al.
2000; Pérez Bueno et al. 2006).
In conclusion, the BGF imaging measured in the AB leaf side could
distinguish between the two viral strains, the magnitude of the changes correlating
with their virulence. The timing of the response was also delayed in the less
virulent one. A symptoms recovery phase in PMMoV-I-infected plants, affecting
only the young S leaves, was also demonstrated with these measurements in the
last infection steps. BGF emission differs also in S and AS leaves. BGF imaging
could detect viral-induced metabolic changes in the absence of symptoms in AS
leaves preceding even the viral detection. The situation in S leaves, to which the
virus arrives earliest, is more complex, due to the quick invasion by the pathogen;
viral spread and changes in BGF emission take place concomitantly. Chlorogenic
acid was demonstrated to be the main contributor to the BGF emission in N.
benthamiana plants. In addition there was a correlation between its levels in
developing leaves and the virulence of the tobamovirus.
Taking together, these results indicate that UV-induced fluorescence is a
promising tool to visualize a systemic infection before the appearance of visible
symptoms and before the pathogen is present.

Acknowledgements
This research and MP´s contract was supported by grants from the Spanish

Ministry of Science and Education (MEC-FEDER, grant BIO2004-04968-C02-02

to M.B.A.) The authors are very grateful to Drs. Isabel García Luque and Maite

158
C. Resultados

Serra (Centro Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid) for providing all

PMMoV solutions and antibodies against the viral coat protein, and to Ruth

Sagardoy for her assistance with the HPLC analyses which were supported by an

University of Valencia/EEAD-CSIC contract – within the ESA ESRIN contract

19187/05/I-EC – to F.M.. The travel associated with this work was supported by

the Spanish-Hungarian Intergovernmental Scientific and Technological Fund

(Project number: E-19/04 in Hungary) and Acciones Integradas Programme

(HH2004-0032 in Spain).

References
Alonso, E., García-Luque, I., Avila-Rincón, M.J., Wicke, B., Serra, M.T. and Díaz-Ruiz, J.R. (1989)
A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. J. Phytopathol. 125:
67-76.
Apostol, S., Viau, A.A., Tremblay, N., Briantais, J.M., Prasher, S., Parent, L.E. and Moya I. (2003)
Laser-induced fluorescence signatures as a tool for remote monitoring of water and nitrogen
stresses in plants. Can. J. Remote Sens. 29: 57-65.
Balachandran, S. and Osmond, B.C. (1994) Susceptibility of tobacco leaves to photoinhibition

following infection with two strains of tobacco mosaic virus under different light and nitrogen

nutrition regimes. Plant Physiol. 104: 1051-1057.

Balachandran, S., Osmond, B.C. and Daley, F.P. (1994) Diagnosis of the earliest strain-specific

interactions between tobacco mosaic virus and chloroplasts of tobacco leaves in vivo by

means of chlorophyll fluorescence imaging. Plant Physiol. 104: 1059-1065.

Balachandran, S., Hurry, V.M., Kelley, S.E., Osmond, C.B., Robinson, S.A., Rohozinski, J., Seaton,
G.G.R. and Sims, D.A. (1997) Concepts of plant biotic stress. Some insights into the stress
physiology of virus-infected plants, from the perspective of photosynthesis. Physiol. Plant.
100: 203-213.
Balogun, O.S. and Teraoka, T. (2004) Time-course analysis of the accumulation of phenols in tomato
seedlings infected with Potato Virus X and Tobacco mosaic virus. Biokemistri 16: 112-120.
Barón, M., Rahoutei, J., Lázaro, J.J. and García-Luque, I. (1995) PSII response to biotic and abiotic

159
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

stress. Mathis P (ed) Photosynthesis: From Light to Biosphere. Kluwer Academic Publishers.
Dordrecht. 4: 897-900.
Berger, S., Papadopoulos, M., Schreiber, U., Kaiser, W. and Roitsch, T. (2004) Complex regulation
of gene expression, photosynthesis and sugar levels by pathogen infection in tomato. Physiol.
Plant. 122: 419-428.
Berger, S., Benediktyová, Z., Matouš, K., Bonfig, K., Mueller, M.J., Nedbal, L. and Roitsch, T.
(2007) Visualization of dynamics of plant-pathogen interaction by novel combination of
chlorophyll fluorescence imaging and statistical analysis: Differential effects of virulent an
avirulent strains of P. syringae and of oxylipins on A. thaliana. J. Exp. Bot. 58: 797-806.
Buschmann, C. and Lichtenthaler, H.K. (1998) Principles and characteristics of multi-colour
fluorescence imaging of plants. J. Plant Physiol. 152: 297-314.
Buschmann, C., Langsdorf, G. and Lichtenthaler, H.K. (2000) Imaging of the blue, green, and red
fluorescence emission of plants: An overview. Photosynthethica 38: 483-491.
Cartelat, A., Cerovic, Z.G., Goulas, Y., Meyer, S., Lelarge, C., Prioul, J.-L., Barbottin, A., Jeuffroy,
M.-H., Gate, P., Agati, G. and Moya, I. (2005) Optically assessed contents of leaf
polyphenolics and chlorophyll as indicators of nitrogen deficiency in wheat (Triticum
aestivum L.). Field. Crop. Res. 91: 35-49.
Cerovic, Z.G., Samson, G., Morales, F., Tremblay, N. and Moya, I. (1999) Ultraviolet-induced
fluorescence for plant monitoring: present state and prospects. Agronomie 19: 543-578.
Cerovic, Z.G., Ounis, A., Cartelat, A., Latouche, G., Goulas, Y., Meyer, S. and Moya, I. (2002) The
use of chlorophyll fluorescence excitation spectra for the non-destructive in situ assessment of
UV-absorbing compounds in leaves. Plant Cell. Environ. 25: 1663-1676.
Chaerle, L. and Van Der Straeten, D. (2001) Seeing is believing: imaging techniques to monitor plant
health. Biochim. Biophys. Acta 1519: 153-166.
Chaerle, L., Hagenbeek, D., De Bruyne, E., Valcke, R. and Van Der Straeten, D. (2004) Thermal and
chlorophyll-fluorescence imaging distinguish plant-pathogen interactions at an early stage.
Plant Cell Physiol. 45: 887-896.
Chaerle, L., Pineda, M., Romero-Aranda, R., Van Der Straeten, D. and Barón, M. (2006) Robotized
thermal and chlorophyll fluorescence imaging of pepper mild mottle virus infection in
Nicotiana benthamiana. Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336.
Chaerle, L., Lenk, S., Buschmann, C. and Van Der Straeten, D. (2007) Multicolor fluorescence

imaging for early detection of the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus. J. Plant

Physiol. 164: 253-262.

Chappelle, E.W., Wood, F.M., McMurtrey, J.E. and Newcomb, W.W. (1984) Laser-induced
fluorescence of green plants. 1: A technique for the remote detection of plant stress and

160
C. Resultados

species differentiation. Appl. Opt. 23: 134-138.


Cheng, N.-H., Su, C.-L., Carter, S.A. and Nelson, R.S. (2000) Vascular invasion routes and systemic
accumulation patterns of tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Plant J. 23: 349-
362.
Chou, H.M., Bundock, N., Rolfe, A.S. and Scholes, J.D. (2000) Infection of Arabidopsis thaliana

leaves with Albugo candida (white blister rust) causes a reprogramming of host metabolism.

Mol. Plant Pathol. 2: 99-113.

Dixon, R.A. and Paiva, N.L. (1995) Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell 7 :1085-

1097.

Gitelson, A.A., Buschmann, C. and Lichtenthaler, H.K. (1998) Leaf chlorophyll corrected for re-

absorption by means of absorption and reflectance measurements. J. Plant Physiol. 152: 283-

296.

Gitelson, A.A., Buschmann, C. and Lichtenthaler, H.K. (1999) The chlorophyll fluorescence ratio

F735/F700 as an accurate measure of the chlorophyll content in plants. Remote Sens. Environ.

69: 296-302.

Harris, P.J. and Hartley, R.D. (1976) Detection of bound ferulic acid in cell walls of the Gramineae

by ultraviolet fluorescence microscopy. Nature 259: 508-510.

Heisel, F., Sowinska, M., Miehé, J.A., Lang, M. and Lichtenthaler, H.K. (1996) Detection of nutrient

deficiencies of maize by laser induced fluorescence imaging. J. Plant Physiol. 148: 622-631.

Hideg, É., Juhász, M., Bornmann, J.F. and Asada, K. (2002) The distribution and possible origin of
blue-green fluorescence in control and stressed barley leaves. Photochem. Photobiol. Sci. 1:
934-941.
Kofalvi, S.A. and Nassuth, A. (1995) Influence of wheat streak mosaic virus infection on
phenylpropanoid metabolism and the accumulation of phenolics and lignin in wheat. Physiol.
Mol. Plant Pathol. 47: 365-377.
Lang, M., Stober, F. and Lichtenthaler, H.K. (1991) Fluorescence emission spectra of plant leaves and
plant constituents. Radiat. Environ. Biophys. 30: 333-347.
Lang, M., Lichtenthaler, H.K., Sowinska, M., Heisel, F. and Miehé, J.A. (1996) Fluorescence imaging
of water and temperature stress in plant leaves. J. Plant Physiol. 148: 613-621.

161
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Langsdorf, G., Buschmann, C., Sowinska, M., Babani, F., Mokry, M., Timmermann, F. and
Lichtenthaler, H.K. (2000) Multicolour fluorescence imaging of sugar beet leaves with
different nitrogen status by flash lamp UV-excitation. Photosynthethica 38: 539-551.
Lenk, S. and Buschmann, C. (2006) Distribution of UV-shielding of the epidermis of sun and shade
leaves of the beech (Fagus sylvatica L.) as monitored by multi-colour fluorescence imaging. J.
Plant Physiol.. 163: 1273-1283.
Lichtenthaler, H.K., Lang, M., Sowinska, M., Heisel, F. and Miehé, J.A. (1996) Detection of
vegetation stress via a new high resolution fluorescence imaging system. J. Plant Physiol.
148: 599-612.
Lichtenthaler, H.K. and Miehé, J.A. (1997) Fluorescence imaging as a diagnostic tool for plant stress.
Trends Plant Sci. 2: 316-320.
Lichtenthaler, H.K. and Schweiger, J. (1998) Cell wall bound ferulic acid, the major substance of the
blue-green fluorescence emission of plants. J. Plant Physiol. 152: 272-282.
Lichtenthaler, H.K. and Babany, F. (2000) Detection of photosynthetic activity and water stress by
imaging the red chlorophyll fluorescence. Plant Physiol. Biochem. 38: 889-895.
Lichtenthaler, H.K., Langsdorf, G., Lenk, S. and Buschmann, C. (2005) Chlorophyll fluorescence
imaging of photosynthetic activity with the flash-lamp fluorescence imaging system.
Photosynthethica 43: 355-369.
Lohaus, G., Heldt, H.W. and Osmond, C.B. (2000) Infection with phloem limited Abutilon mosaic
virus causes localized carbohydrate accumulation in leaves of Abutilon striatum: relationships
to symptom development and effects on chlorophyll fluorescence quenching during
photosynthetic induction. Plant Biol. 2: 161-167.
Lüdeker, W., Dahn, H.-G. and Günther, K.P. (1996) Detection of fungal infection of plants by laser-
induced fluorescence: An attempt to use remote sensing. J. Plant Physiol. 148: 579-585.
Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A.R., Gruissem, W. and Varner, J.E. (1995) Methods in Plant
Molecular Biology: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor
New York.
Moon, S.K., McMurtrey, J.E., Mulchi, C.L., Daughtry, C.S.T., Chappelle, E.W. and Chen, Y.-R.
(2001) Steady-state multispectral fluorescence imaging system for plant leaves. Appl. Opt. 40:
157-166.
Morales, F., Cerovic, Z.G. and Moya, I. (1994) Characterization of blue-green fluorescence in the
mesophyll of sugar beet (Beta vulgaris L.) leaves affected by iron deficiency. Plant Physiol.
106: 127-133.
Morales, F., Cerovic, Z.G. and Moya, I. (1996) Time resolved blue-green fluorescence of sugar beet
(Beta vulgaris L.) leaves. Spectroscopic evidence for the presence of ferulic acid as the main
fluorophore of the epidermis. Biochim. Biophys. Acta 1273: 251-262.

162
C. Resultados

Morales, F., Cerovic, Z.G. and Moya, I. (1998) Time-resolved blue-green fluorescence of sugar beet
leaves. Temperature-induced changes and consequences for the potential use of blue-green
fluorescence as a signature for remote sensing of plants. Aust. J. Plant Physiol. 25: 325-334.
Morales, F., Cartelat, A., Álvarez-Fernández, A., Moya, I. and Cerovic, Z.G. (2005) Time-resolved
spectral studies of blue-green fluorescence of artichoke (Cynara cardunculus L. Var.
Scolymus) leaves: Identification of chlorogenic acid as one of the major fluorophores and age-
mediated changes. J. Agric. Food Chem. 53: 9668-9678.
Nedbal, L. and Whitmarsh, J. (2004) Chlorophyll fluorescence imaging of leaves and fruits.
Papageorgiou CG, Govindjee (eds) Chlorophyll a Fluorescence: A Signature Photosynthesis.
Springer, Dordrecht. 389-407.
Nicholson, R.L. and Hammerschmidt, R. (1992) Phenolic compounds and their role in disease

resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 30: 369-389.

Niemann, G.J., van der Kerk, A., Niessen, W.M.A. and Versluis, K. (1991) Free and cell wall-bound
phenolics and other constituents from healthy and fungus-infected carnation (Dianthus
caryophylus L.) stems. Physiol. Mol. Plant Pathol. 38: 417-432.
Nilsson, H.-E. (1995) Remote sensing and image analysis in plant pathology. Annu. Rev. Phitopathol.
15: 489-527.
Oparka, K.J. and Santa Cruz, S. (2000) The great escape: phloem transport and unloading of
macromolecules. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 323-347.
Osmond, C.B., Daley, P.F., Badger, M.R. and Lüttge, U. (1998) Chlorophyll fluorescence quenching
during photosynthetic induction in leaves of Abutilon striatum Dicks. infected with Abutilon
mosaic virus observed with a field-portable system. Bot. Acta 111: 390-397.
Ounis, A., Cerovic, Z.G., Briantais, J.M. and Moya, I. (2001) Dual excitation FLIDAR for the
estimation of epidermal UV absorption in leaves and canopies. Rem. Sens. Environ. 76: 33-48.
Pérez-Bueno M (2003) Photosystem II and viral infection. Chlorophyll fluorescence imaging analysis
and biosynthesis regulation of the oxygen-evolving-complex proteins during pathogenesis.
PhD Thesis, University of Granada, Granada, Spain.
Pérez-Bueno, M.L., Rahoutei, J., Sajnani, C., García-Luque, I. and Barón, M. (2004) Proteomic
analysis of the oxygen-evolving complex of photosystem II under biotic stress. Studies on
Nicotiana benthamiana infected with tobamoviruses. Proteomics 4: 418-425.
Pérez-Bueno, M.L., Ciscato, M., vandeVen, M., García-Luque, I., Valcke, R. and Barón, M. (2006)
Imaging viral infection. Studies on Nicotiana benthamiana plants infected with the pepper
mild mottle tobamovirus. Photosynth. Res. 90: 111-123.

163
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Plumbe, A.M. and Willmer, C.M. (1986) Phytoalexins, water-stress and stomata. III. The effects of
some phenolics, fatty acids and some other compounds on stomatal responses. New Phytol.
103: 17-22.
Rahoutei, J., García-Luque, I., Cremona, V. and Barón, M. (1998) Effect of tobamovirus infection on

PSII complex of infected plants. Garab G (ed) Photosynthesis: from light to biosphere.

Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. 4: 2761-2764.

Rahoutei, J., Barón, M., García-Luque, I., Droppa, M., Neményi, A. and Horváth, G. (1999) Effect of

tobamovirus infection on the thermoluminiscence characteristics of chloroplast from infected

plants. Z Naturforsch. 54c: 634-639.

Rahoutei, J., García-Luque, I. and Barón, M. (2000) Inhibition of photosynthesis by viral infection:

Effect on PSII structure and function. Physiol. Plant 110: 286-292.

Roberts, A.G., Santa Cruz, S., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Turgeon, R. and Oparka, K.J. (1997)

Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana comparison of a fluorescent solute

with fluorescent virus. Plant Cell 9: 1381-1396.

Rolfe, A.S. and Scholes, J.D. (1995) Quantitative imaging of chlorophyll fluorescence. New Phytol.
131: 69-79.
Ruíz del Pino, M., Moreno, A., García de Lacoba, M., Castillo-Lluva, S., Gilardi, P., Serra, M.T. and
García-Luque, I. (2003) Biological and molecular characterization of P101 isolate, a
tobamoviral pepper strain from Bulgaria. Arch Virol. 148: 2115-2135.
Sajnani, C. (2005) Viral infections as stress factor in photosynthesis. PhD Thesis, University of

Granada, Granada, Spain.

Samuel, G. (1934). The movement of tobacco mosaic virus within the plant. Ann. Appl. Biol. 21: 90-

111.

Scharte, J., Schon, H. and Weiss, E. (2005) Photosynthesis and carbohydrate metabolism in tobacco
leaves during an incompatible interaction with Phytophthora nicotianae. Plant Cell Environ.
28: 1421-1435.
Scholes, J.D. and Rolfe, S.A. (1996) Photosynthesis in localised regions of oat leaves infected with

crown rust (Puccinia coronata): quantitative imaging of chlorophyll fluorescence. Planta 199:

573-582.

164
C. Resultados

Schweiger, J., Lang, M. and Lichtenthaler, H.K. (1996) Differences in fluorescence excitation spectra

of leaves between stressed and non-stressed plants. J. Plant Physiol. 148: 536-547.

Szigeti, Z., Almási, A. and Sárvári, É. (2002) Changes in the photosynthetic functions in leaves of

Chinese cabbage infected with turnip yellow mosaic virus. Acta Biologica Szegediensis 46:

137-138.

Técsi, L.I., Maule, A.J., Smith, A.M. and Leegood, R.C. (1994) Complex, localized changes in CO2

assimilation and starch content associated with the susceptible interaction between cucumber

mosaic virus and a cucurbit host. Plant J. 5: 837-847.

van Kooten, O., Meurs, C. and Van Loon, L.C. (1990) Photosynthetic electron transport in tobacco

leaves infected with tobacco mosaic virus. Physiol. Plant 80: 446-452.

Wetter, C., Conti, M., Alschuh, D., Tabillion, R. and van Regemortel, M.H.V. (1984) Pepper mild
mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Phytopathology 74: 405-410.
Wolfbeis, O.S. (1985) Fluorescence of organic natural products. In: Schulman SG (ed) Molecular
luminescence spectroscopy: Methods and application. Part I. John Wiley & Sons, New York,
167.

165
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

166
C. Resultados

C.3. Conventional and combinatorial chlorophyll fluorescence imaging


of tobamovirus--infected plants

Pineda, M.1, Soukupová, J.2, Matouš, K.2, Barón, M1,*. and Nedbal, L2,*.

1. Department of Biochemistry, Molecular and Cell Biology of Plants. Estación Experimental del
Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas. C/ Profesor Albareda, nº 1. C.P. 18008.
Granada, Spain
2. Institute of Systems Biology and Ecology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Zámek
136, Nové Hrady 37333, Czech Republic / Institute of Physical Biology, University of S. Bohemia,
Zámek 136, Nové Hrady 37333, Czech Republic.

Corresponding authors: nedbal@greentech.cz, Phone: +420 386361231 Fax: +420


386361231; mbaron@eez.csic.es, Phone +34958181600 Fax +34958129600.

Abstract: Chlorophyll fluorescence imaging (Chl-F) has probed to be an useful


tool to study the spatial and temporal heterogeneity of leaf photosynthesis under
biotic stress. In the present work we have compared the effect of two strains of the
same virus (Italian and Spanish strains of the pepper mild mottle virus, PMMoV-I
and –S, respectively) in the host plant Nicotiana benthamiana by means of kinetic
Chl fluorescence imaging. We have followed the viral infections using
conventional quenching protocols to obtain images of Chl-F parameters that are
related to well-established photosynthetic processes or pathways; in addition, we
have carried out advanced statistical approach in order to obtain a combinatorial set
of images showing differences between control and PMMoV-infected plants earlier
in the infection process. From our results, NPQ consolidates as a good PMMoV
infection reporter in symptomless leaves of Nicotiana benthamiana in the
intermediate infection steps. However, the newly found fluorescence signals
obtained by combinatorial imaging (including feature selection) revealed the

167
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

infection earlier than the standard Chl-F parameters (4 and 6 dpi: PMMoV-S and –
I, respectively).

Abbreviations: A, photosynthesis rate; AS, asymptomatic; Chl, chlorophyll; Chl-


F, chlorophyll fluorescence; Chl-FI, chlorophyll fluorescence imaging; dpi, days
post-inoculation, dpi, days post-inoculation; F0, minimum chlorophyll fluorescence
in the dark adapted state; F5/F0, chlorophyll fluorescence value at 5 s of the
induction curve normalized to the minimum fluorescence in the dark-adapted state
(protocol 3); FM, maximum chlorophyll fluorescence in the dark adapted state; FM’,
maximum chlorophyll fluorescence in the light adapted state; FM(1)’, maximum
chlorophyll fluorescence at 2 s of the induction kinetic (protocol 2); FM(2)’,
maximum chlorophyll fluorescence at 90 s of the induction kinetic (protocol 2);
FM(1)’’, maximum chlorophyll fluorescence after 5 s of switching off the actinic
light (protocol 2); FM(2)’’, maximum chlorophyll fluorescence after 16 s of
switching off the actinic light (protocol 2); FP, maximum chlorophyll fluorescence
reached at the induction curve without saturating flashes; Ft, chlorophyll
fluorescence value prior to the saturating pulse; FV/FM, maximum PSII quantum
yield in the dark-adapted state; HL, high light (200 µmol (photons)·m-2·s-1); LL,
low light (50 µmol (photons)·m-2·s-1); IRGA, infrared gas analyzer; ΦPSII, PSII
quantum yield; ΦPSIIt, PSII quantum yield at referred kinetics time; NPQ, non
photochemical quenching; NPQ20, non photochemical quenching at 20 s of the
induction kinetic; PMMoV-S and –I, Spanish and Italian strains of the pepper mild
mottle virus; PSII, photosystem II;

Introduction
Chlorophyll fluorescence imaging (Chl-FI) is an useful tool to study the
spatial and temporal heterogeneity of leaf photosynthesis under biotic stress
(Nedbal and Whitmarsh 2004), allowing the diagnosis and quantification of
different stress responses on the basis of their characteristic disease-specific

168
C. Resultados

signatures (Chaerle et al. 2004, 2007). Chl-FI, combined with other imaging
techniques, allowed distinguishing between infections with different pathogens
(Chaerle et al. 2004). Changes in red fluorescence emission (Chl-F) could be
related with physiological alterations on infected plants (Scholes and Rolfe 1996,
Chou et al. 2000, Berger et al. 2004, 2007, Bonfig et al. 2006, Swarbrick et al.
2006). Photoinhibitory damage in infected plants (Balachandran and Osmond
1994, Balachandran et al. 1994) has been also detected by the measurement of
changes on fluorescence parameters.
Recent Chl–FI instruments allow application of complex measuring
protocols with different dark adaptation-times of the plant and periods of constant
actinic light, both supplemented by saturating bright flashes. Thus, different types
of light protocols have been used to reveal differences between healthy and
stressed plants: obtaining fluorescence values after just one saturating flash
(Chaerle et al. 2004, 2006), Kautsky kinetics (Kautsky and Hirsch 1931), harmonic
oscillations (Nedbal and Brezina 2002, Nedbal et al. 2003, Matouš et al. 2007),
quenching analysis with different number of saturating flashes (Pérez-Bueno et al.
2006) and combined with various actinic light intensities (Berger et al. 2007,
Matouš et al. 2007).
During the quenching analysis, huge information is provided because of the
great number of fluorescence parameters obtained associated to the photosynthetic
function. Some coefficients are related with photochemical processes, as FV/FM and
ΦPSII, which indicate the maximum and effective quantum yield of photosystem
(PSII) (Genty et al. 1989); or with the non photochemical processes, the most
straightforward is NPQ (non photochemical quenching, Bilger and Björkman
1990). A coefficient giving information about the vitality of the plants (RFD,
Lichtenthaler and Rinderle 1988) has also been broadly used, and can be calculated
from Kautsky kinetics and quenching analysis. Lists of Chl-F parameters related to
different physiological functions have been reviewed by several authors (e.g.,
Schreiber et al. 1986, Roháček and Barták 1999, Maxwell and Johnson 2000).

169
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Images of them obtained in every kinetic point could provide a good/early stress
indicator to follow pathogenesis (Pérez-Bueno et al. 2006).
However, standard Chl-F parameters not always reveal the maximal
differences between healthy and infected tissues along the infection, when complex
spatial and temporal changes are occurring. In this context, Soukupová et al. (2003)
proposed a simple experimental algorithm to assess the impact of the treatment by
fungal phytotoxins in canola and white mustard. More recently, Berger et al.
(2007) and Matouš et al. (2007) described combinatorial imaging methods to map
bacterial infection in Arabidopsis. This method searches small sets of images,
obtained during Chl-F transient, giving the highest contrast between the stressed
and control leaf tissue and can be used to image the pathogen action during the
early infection phase.
The experimental host-pathogen system studied was Nicotiana benthamiana
plants infected with the Italian and Spanish strains of the pepper mild mottle virus
(PMMoV-I and –S, respectively). In previous studies (Barón et al. 1995, Rahoutei
et al. 1998, 1999, 2000, Pérez-Bueno et al. 2004), we have analysed the effect of
both PMMoV-I and –S infection upon photosynthesis in these plants, and propose
the oxygen-evolving complex (OEC) as main target of tobamovirus on the electron
transport chain. Chl-FI studies of Nicotiana benthamiana plants infected with
PMMoV-I revealed that NPQ was a good reporter of the infection process as early
as 17 days post-inoculation (dpi). In leaves, which remain asymptomatic (AS)
during the infection process, NPQ changes were parallel to the virus spreading in
these leaves (Pérez-Bueno et al. 2006). Chaerle et al. (2006) studied thermal and
fluorescence responses in Nicotiana benthamiana plants infected with either
PMMoV-S or –I. They found that infection with PMMoV-S induced earlier
alterations than PMMoV-I (14 dpi vs. 17 dpi) in the fluorescence pattern of AS
leaves from infected plants. However, as the first reporter of viral infection was
observed the temperature increment registered near the main veins (7 dpi in the

170
C. Resultados

case of PMMoV-S infection, 10 dpi in the case of PMMoV-I one), which expanded
to the rest of the leaf tissues in successive days.
The aim of the present study was to identify differences between the
infection processes induced by distinct strains of the same virus (PMMoV), using
conventional Chl-F parameters that are related to well-established photosynthetic
processes or pathways. In addition, we investigated PMMoV infection in Nicotiana
benthamiana plants using novel protocols and statistical approaches that were
earlier shown to reveal very early phases of infection with pathogenic bacteria
(Berger et al. 2007, Matouš et al. 2007).

Material and methods


Plant and virus
Four experiments were carried out in quadruplicates. N. benthamiana Gray
plants were cultivated in a growth chamber at 100 µmol (photons)·m-2·s-1 PAR
(photosynthetically-active radiation), generated by cool white fluorescent lamps,
with a 16/8 h light/dark photoperiod, a temperature regime of 24/18ºC (day/night)
and a relative humidity of 65%.
At the 6-7 fully-expanded leaves stage, plants were inoculated with PMMoV
in the three lower leaves, using 25 µl of inocula per leaf (50 µg of tobamovirus per
ml of 20 mM sodium phosphate/biphosphate buffer pH 7.0). Two strains of
PMMoV were used in the experiment: Italian (PMMoV-I) and Spanish strain
(PMMoV-S). Mock-inoculated plants were treated with buffer only. The origin of
the Italian and Spanish strain of PMMoV has been previously reported (Alonso et
al. 1989, Wetter et al. 1984, respectively).
Starting with the lowest inoculated leaf and numbering leaves in ascending
order, we have analysed leaf number 5 as the AS one.

171
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Chlorophyll fluorescence measurements


Chl-F measurements were performed by a commercial kinetic chlorophyll
fluorescence instrument FluorCam (PSI, Ltd. Czech Republic; www.psi.cz),
described by Nedbal et al. (2000). Chl-F emission from a leaf is emitted by two
panels of light emitting diodes (LEDs) (λmax ≈ 635 nm) that generate measuring
light flashes and actinic light. Brief intense saturating light pulses were generated
by a 250 W halogen lamp. The Chl-F emission transients are captured by a CCD
(charged coupled device) camera in series of images with a resolution of 512x512
pixels. The scattered excitation light is blocked by RG697 filter.
N. benthamiana plants were dark-adapted for 40 min prior each
measurement. The kinetic of pathogenesis of both PMMoV-S and PMMoV-I in
Nicotiana benthamiana plants was followed by capturing images of fluorescence
kinetic from AS leaves of infected plants and their respective controls under three
measuring protocols:
1) Protocol 1. This quenching analysis was previously described by Pérez-
Bueno et al. (2006). Here, F0 and FM measurement on dark-adapted
leaves was followed by 16 s of dark. Then, the leaves were illuminated
with continuous actinic light (100 µmol (photons)·m-2·s-1) for 302 s
supplemented with 11 saturating pulses to measure FM’ (1500 µmol·m-
2
·s-1, 1s; at 2, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 and 300 s of actinic
irradiance).
2) Protocol 2. This quenching analysis was carried out using two actinic
light irradiance levels and four saturating light pulses. After
measurements of F0 and FM levels, a short dark relaxation (16 s)
followed. Then, the leaf was exposed to a low actinic light (LL, 50 µmol
(photons)·m-2·s-1) for 100 s and the corresponding Chl-F induction was
recorded. Two saturation pulses (1500 µmol (photons)·m-2·s-1, at 2 and
90 s after switching on the actinic light) were applied to measure FM(1)’
and FM(2)’ (respectively), to probe the light-induced quenching. A short

172
C. Resultados

dark adaptation (16 s) followed by two other saturating pulses (5 s -


FM(1)’’- and 16 s -FM(2)’’- after switching off the actinic light) allows the
measurement of NPQ recovery. These measurements followed by 600 s
of dark-adaptation and then by an identical sequence of measurements
under higher actinic light intensity (HL, 200 µmol (photons)·m-2·s-1).
3) Protocol 3. The Chl-F induction curve (Kautsky effect) was measured
under continuous actinic irradiance at both LL and HL. Previously, F0
was recorded. A dark period (600 s) was established between LL and HL
measurements.

Image selection and data analysis


A large amount of information was obtained as a function of the post-
infection time, virus strain and selected fluorescence parameter. Images of the
fluorescence parameters showing the highest contrast between leaves from control
and infected plants were selected.
When using protocols 1 and 2, Chl-F signal was integrated over the entire
leaf area and standard Chl-F parameters were calculated, according to Maxwell and
Johnson (2000). Among them, NPQ and ΦPSII were the best indicators of the
PMMoV infection, as we describe in Results.
NPQ = (FM-FM’)/FM’
ΦPSII = (F’M-Ft)/F’M
Differences between the Chl-F transients under actinic light (protocols 2 and
3) from infected leaves and their corresponding controls were displayed in % and
calculated according to following equation:
Differences=100· [(FI-FC)/FC]
where: FI – Chl-F yield of infected leaf; FC – Chl-F yield of control leaf.
Images of both standard and novel Chl-F parameters showing high difference
between control and infected leaves were displayed in false-scale color scale,

173
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

where the blue color represents the lowest value and the red color represents the
highest one.

Combinatorial imaging
For selection of the relevant images during tobamoviral infection on
Nicotiana benthamiana, we used the method of Sequential Forward Floating
Search (Pudil et al. 1994). As a separability criterion we used error rate of k-NN
classifier (k=3), which is a method classifying unknown objects (in our case Chl-F
kinetics) on the base of their Euclidian distance to the training samples.
Here, we use measurements of Chl-F transient under protocol 2 as a dataset
for the combinatorial imaging. Measurements (4 repetitions) carried out in AS
leaves of every plant group –control, PMMoV-I and PMMoV-S-infected- were
analyzed. The Chl-F transients of control leaves were used as the first (control)
class and those of plants infected with PMMoV-S as the second (infected) class.
PMMoV-S infected plants were chosen because of the higher virulence of this
virus strain (Rahoutei et al. 2000). The classifier was trained to find the differences
between controls and PMMoV-S infected leaves at 16 dpi, the middle phase of the
infection, and to resolve these two classes. When the set of the 3 most contrasting
features (images) with the lowest error rate was found, it was used to evaluate the
difference among control and PMMoV-S as well as PMMoV-I infected plants
during the whole infection.
LDA (Linear Discriminant Analysis) algorithm (Fukunaga 1990) was used to
find the linear combination of the 3 most contrasting images into one. This
resultant image was shown in false colour scale. The method is described in detail
by Matouš et al. (2007).

IRGA measurements
Photosynthesis rate (A) was determined on a 100 mm2 leaf area at the leaf
apex by IRGA (infrared gas analyzer) in an open system at ambient partial

174
C. Resultados

pressures of carbon dioxide and water vapor, using a portable photosynthesis


system (LI-6400, Li-Cor Inc., Lincon NE, USA, www.licor.com). Within the
cuvette, average leaf temperature was 29 ± 1ºC. During gas exchange
measurements, constant irradiance (300 µmol (photons)·m-2·s-1) was supplied by
Qbeam solid state LED lighting system attached to the leaf cuvette (6400-02B
LED, Li-Cor Inc., Lincon NE, USA). Flow rate through the assimilation chamber
was maintained at 800 µmol·s-1. Six different leaves were considered for data
calculation.

Results
Study of standard Chl-F parameters during quenching analysis (protocol 1)
We have analysed different conventional Chl-F parameters after
measurements using protocol 1, in order to find those that can discriminate the
infection with two similar strains of the PMMoV in the early infection steps and in
absence of symptoms. NPQ and ΦPSII were found to be the best reporters of
PMMoV infection in N. benthamiana plants among the standard parameters.

The earliest changes on NPQ pattern were detected at 17 dpi, as Fig. 1a


shows. NPQ images of AS leaves of plants infected with the two virus strains
(PMMoV-I and PMMoV-S) were compared with the corresponding leaves from
control plants. A heterogeneous pattern of energy dissipation in the AS leaves of
infected plants, consisting in different NPQ values in leaf tissue surrounding main
veins and in the interveinal tissue. The NPQ pattern started to be visible in NPQ
images taken 20 s after switching on the actinic light (NPQ20), the highest contrast
was achieved at 60 s and became less patent from 90-120 s.

Figure 1b displays dynamics of NPQ20 distribution over the leaves during the
first 28 dpi. NPQ20 was the kinetic point showing the biggest differences between
control and PMMoV-infected plants along the whole infection. Prior to 17 dpi, we
could not find any significant response in NPQ20 pattern, except in the case of AS

175
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

leaf from PMMoV-S infected plant, which displayed certain higher NPQ20 beside
the petiole at 14 dpi, depending on the sample assayed.

Considering the signal over the whole leaf, NPQ was higher in the infected
plants compared to control at 17 dpi (Fig.1a) and the relationship became inverse
between 19 and 28 dpi (Fig. 1b).

Fig. 1: Images of classical Chl-F parameters obtained by measurements using protocol 1 in AS leaves
from control and both PMMoV-I and PMMoV-S infected plants. (a) NPQ kinetic at 17 dpi. (b) NPQ20
pattern at different dpi (displayed at the bottom of the figure). (c) ΦPSII pattern at different dpi. The
2

colour scale indicates the intensity of the signal.

176
C. Resultados

The analysis of the spatial pattern of ΦPSII, other frequently used


conventional Chl-F reporter parameter, displayed differences between PMMoV-S
infected and control plants, first at 17 dpi. The ΦPSII pattern was obvious only at 2 s
after switching on the actinic light (ΦPSII2). We have followed the ΦPSII2 pattern

along the infection (Fig. 1c). AS leaves of PMMoV-S-infected plants displayed a


characteristic spatial pattern between 17-24 dpi, with higher ΦPSII2 in the tissues

surrounding the main veins than in interveinal tissues. The ΦPSII2 pattern was more

homogeneous over the whole leaf in case of PMMoV-I and control plants. This
parameter allows a good differentiation between the infections with either viral
strain.

Fig. 2: Analysis of data obtained under fluorescence measuring protocol 1 or by means of IRGA in
AS leaves from control and infected plants. (a) Net photosynthesis rates (A) measured at different dpi
by the IRGA; (b) Linear correlation between A and ΦPSII . Correlation factor (r) were 0.927
300

(control), 0.956 (PMMoV-I infected plants) and 0.859 (PMMoV-S infected plants).

To link changes on fluorescence parameters with alteration in the


photosynthetic process, infrared gas analysis (IRGA) measurements were carried
out in AS leaves from infected plants and their corresponding controls (Fig. 2a).
The rate of net photosynthesis (A) decreased both in controls and infected plants

177
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

from 14 dpi onwards. A significant decrease of this rate compared with the control
values was observed in infected plants at 17 dpi (PMMoV-S) and 19 dpi (PMMoV-
I). This delay agrees with the less virulence of the last viral strain. In addition, we
have made a correlation analysis between ΦPSII300 (PSII quantum yield at the steady

state, i.e. at 300 s of the induction kinetic) averaged in the whole leaf and the rate
of net photosynthesis (Fig. 2b). A positive correlation was established in the case
of control and infected plants, with r = 0.927 (control plants), r = 0.956 (PMMoV-
I-infected plants) and r = 0.859 (PMMoV-S-infected plants).

Fig. 3: Images obtained under measuring protocol 2 at different dpi (indicated at the bottom of the
figure). NPQ at 5 s after switching off the actinic light at low light (a) and high light (b).

Analysis of Chl-F parameters and Chl-F kinetics (protocol 2)


To test whether we can detect viral-induced changes in the host plant earlier
than 17 dpi in AS leaves, we applied measuring light protocols with two intensities
of actinic irradiances (measuring protocol 2), more suitable for early pathogen
detection (see Discussion).

178
C. Resultados

Fig. 4: Chl fluorescence transients of AS leaves measured with protocol 2 at different dpi. A brief
picture of the protocol is at the top of the figure, and the distinct peaks (FM, FP, FM(1)’, FM(2)’, FM(1)’’
and FM(2)’’) are depicted in the 9 dpi transient Chl-F kinetic.

Here, we also calculated several standard Chl-F parameters. As we expected,


the first differences between control and PMMoV-infected plants were detected at
16 dpi in the NPQ under LL and HL; at the second saturation pulse in light (FM(2)’,
90 s), and at the both saturating pulses during the short dark period at the end of the
measurement (FM(1)’’ and FM(2)’’, i. e., 5 and 16 s after switching off the actinic

179
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

light). Fig. 3 shows the NPQ images of the AS leaves obtained at the first
saturating pulse in the dark under both LL and HL, where the contrast between
control and infected leaves was the highest.
Since the analysis of standard Chl-F parameters was not successful in
revealing differences between controls and infected plants prior to 16 - 17 dpi, we
evaluated difference between the Chl-F transients of control and infected plants
under measuring protocol 2 (Fig. 4). The integrative Chl-F signal over the AS
leaves of infected plants started to differ from control at 13 dpi under LL; and
became more evident at 16 dpi under both light intensities. The differences
between the Chl-F transients of control and infected plants were observed during
the Chl-F decline from the local transient maximum level (FP).

Fig. 5: Kautsky kinetics registered under protocol 3 at low (LL, a) and high light (HL, b) in AS leaves
from control and infected plants (left panels). Differences (%) between control and infected plants
(right panels) at different dpi.

180
C. Resultados

Analysis of Kautsky kinetic (protocol 3)


Since the main changes between control and infected plants were found
during the Chl-F decline from FP, we applied only actinic irradiance without
saturating flashes and measured the Kautsky curve of AS leaves under LL and HL
(Fig. 5a and b, left panels). The remarkable differences (%) between Chl-F
transients of control and infected plants were found in the first part of the curve,
during the Chl-F increase and decline from FP (Fig. 5a and b, right panels). At 9
dpi, transients of AS leaves from PMMoV-infected plants differed from that of
control at 1 s (F1/F0) and 5 s (F5/F0) after switching on the incident irradiance. The
feature for F5/F0 was observed both under LL and HL, being the difference slightly
higher in HL. Although at 13 dpi this feature persisted even at lower values,
another peak appeared at 7 s, which was associated with the PMMoV-S infection;
and the difference between the transient of PMMoV-I infected leaf and control was
lowered (≤ 10%). At 16 dpi the transients differed in various time points.
Images of Chl-F distribution over the leaves confirmed these results. Fig. 6
displays dynamics of F5/F0 distribution over leaves during infection, since it was
the parameter in which both PMMoV-S and PMMoV-I infected leaves differed
from controls at 9 dpi. AS leaves of both infected plants showed a spatial pattern of
F5/F0 at 9 dpi under HL, with a lower intensity of the Chl-F signal surrounding
main veins, whereas control leaf exhibited homogeneous distribution of the Chl-F
emission. Along the infection progress, the infected leaves showed a higher value
of this parameter in the interveinal parts, started from the edges. Chl-F signal of
control leaf remained low and homogeneous until 16 dpi.

Combinatorial imaging (protocol 2)


We applied the advanced statistical method (see Material and Methods,
Matouš et al. 2007) to find the most contrasting images between control and
infected plants captured during the Chl-F transients under measuring protocol 2.

181
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fig. 6: Images of F5/F0 parameter under high light (HL) at different dpi captured using measuring
protocol 3.

Fig. 7: Feature selection analysis of AS leaves measured by protocol 2. The colour scale indicates the
intensity of the signal.

We found the biggest difference during the transient decrease from FP, in the
images [I(t)] taken at t1 = 5 s, t2 = 21 s, and t3 = 736 s (i.e., at 5 and 21 s of LL, and

182
C. Resultados

16 s of HL). Once applied the LDA algorithm, we found a linear combination of


the 3 most contrasting images into one resultant image, which displayed the best
contrast between the control and infected plants. The resultant image (R) was
calculated pixel-by-pixel according to this equation:
R = - 0.155·I(5 s) - 0.574·I(21 s) + 0.804·I(736 s)
Fig. 7 shows the resultant images of AS leaves from controls as well as
PMMoV-I and PMMoV-S infected plants at different dpi. Using this combinatorial
imaging was the PMMoV infection detected already at 4 and 6 dpi (for PMMoV-S
and –I, respectively).

Discussion
Chl-FI has been broadly applied to study biotic stress on plants (Nedbal and
Whitmarsh 2004), since it makes possible to follow the physiological alterations
that stress factors induce in leaves from infected plants (Lichtenthaler and Miehé
1997). This technique was successful to follow the effect of folivory damage
(Zangerl et al. 2002, Aldea et al. 2006, Tang et al. 2006), as well as fungal (Scholes
and Rolfe 1996, Chou et al. 2000, Swarbrick et al. 2006), bacterial (Berger et al.
2004, 2007, Bonfig et al. 2006) and viral infections (Balachandran and Osmond
1994, Balachandran et al. 1994, Osmond et al. 1998, Lohaus et al. 2000, Chaerle et
al. 2004). Our previous works with PMMoV-infected plants showed that images of
both Chl-F under one saturating flash (Chaerle et al. 2006) and NPQ (Pérez-Bueno
et al. 2006) could reflect the viral distribution on leaves which remain
asymptomatic during the viral infection. Some authors (Osmond et al. 1998,
Lohaus et al. 2000) have proposed that NPQ images reproduce the state of
symptom development
In this study, conventional and combinatorial Chl-F imaging of leaf was used
to detect the early phase of infection and to differentiate the infection with two
viral strains of PMMoV on Nicotiana benthamiana plants. .
According to Pérez-Bueno et al. (2006), in the present study PMMoV-I

183
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

infection induced in the AS leaf from the host plant a complex and characteristic
NPQ pattern from 16-17 dpi onwards (Fig. 1a, 1b, 3). This pattern is better defined
in PMMoV-S infected plants. NPQ pattern at 17 dpi corresponds with the viral
location in these leaves at the same infection points, tested by tissue print in our
previous work (Chaerle et al. 2006, Pérez-Bueno et al. 2006). Changes on NPQ
pattern could not be attributed to a viral-induced decrease of the leaf Chl content;
only at the last infection steps Chl amount decreased even in the case of control
plants (Rahoutei et al 2000, Chaerle et al. 2006). At this time, senescence processes
are predominant in the old leaves, since non-photochemical as well as
photochemical processes are totally down-regulated, as the lowest NPQ and ΦPSII
values reflect (Fig. 1). According to our results and those by other authors (Chou et
al. 2000, Berger et al. 2004), changes in NPQ values in the regions colonized by
the pathogen are a relevant phenomenon in plant pathogenesis. NPQ increase may
have different origins. It is well established that virus induce disturbances in the
donor site of PSII due to a decrease in the amount of the extrinsic protein levels
(Rahoutei et al. 2000, Pérez-Bueno et al. 2004) that may lead to the appearance of
dissipative PSII centres (van Wijk et al. 1993, Critchley and Russell 1994). Viruses
also induce disturbances in the Benson-Calvin cycle that can increase the
intrathylakoidal pH gradient, which modulates the NPQ process (Ruban and
Horton 1995). Other process regulating the intrathylakoidal pH gradient is the
cyclic electron transport around PSI (photosystem I) (Horton et al. 2005), which is
stimulated during viral infection (Sajnani et al. 2007). The higher NPQ values
during the viral infection could be a host defence response delaying photoinhibition
until the final infection steps (Balachandran et al. 1997), as revealed as a late (19-
21 dpi onwards for PMMoV-S and –I, respectively) decrease in FV/FM (images not
shown; point measurements by Rahoutei et al. 2000).
Analysis of the ΦPSII kinetic at different infection points revealed that, only at
2 s after switching on the actinic light (ΦPSII2), AS leaves from PMMoV-S-infected
plants displayed a differential pattern from control plants from 17 to 21 dpi,

184
C. Resultados

undetectable in the case of PMMoV-I infection (Fig. 1b). This allows the
differentiation between the infections with every viral strain. The ΦPSII2 pattern, as
the NPQ one, also correlates with the viral presence (Chaerle et al. 2006, Pérez-
Bueno et al. 2006) in the infected leaf.
Changes on both standard Chl-F parameters correlated with a decrease on the
net photosynthesis rate from 17-19 dpi (PMMoV-S and PMMoV-I, respectively) in
infected plants (Fig. 2a). Chl-F imaging demonstrates to be more powerful than
IRGA points measurements to detect the PMMoV-I infection, showing earlier
changes (17 dpi) in the spatial pattern of the fluorescence parameters.
The standard Chl-F parameters measured under protocol 1 and 2 detected the
PMMoV-infection as early as 16 – 17 dpi (Fig. 1,3). However if the combinatorial
imaging was applied (Matouš et al. 2007), the first significant changes between
control and infected plants were visible at 4 and 6 dpi (for PMMoV-S and –I,
respectively; Fig. 7). This is in accordance with previous results, demonstrating
that such method could identify the infection process earlier than classical Chl-F
parameters (Berger et al. 2007, Matouš et al. 2007).
When we analysed the Chl-F transients under two levels of actinic
irradiances (Kautsky effect, measuring protocol 3), the first differences between
PMMoV-infected and control plants were displayed at 9 dpi during the Chl-F
increase and decline from the FP (Fig. 5). This result is in well accordance with the
data obtained from statistical analysis of Chl transient under light protocol 2, which
indicated Chl-F images at 5 s of the kinetics as one of the most contrasting. These
changes were reflected in the F5/F0 images of the leaves (Fig. 6), displaying a
heterogeneous Chl-F pattern in infected plants. Regions emitting less Chl-F yield
corresponded with zones of higher NPQ (Fig 1a, 1b) and viral presence (Chaerle et
al. 2006, Pérez Bueno et al. 2006). In the later post-infection days, there was an
increment of kinetic time points displaying differences between infected and
control plants (Fig. 5), that could be associated to the last infection steps connected
with the senescence process. Changes on the parameter F5/F0 may reflect PMMoV-

185
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

induced alterations on the Benson-Calvin cycle, since this time point is very near to
the kinetic peak corresponding to the activation of the cycle (Ireland et al. 1984);
the fact that the differences between AS leaves from infected plants and control are
emphasized by HL is an additional evidence for it.
Images obtained by the combinatorial imaging and those of F5/F0 identified
the viral infection before the virus is detected in AS leaves by tissue printing
(Chaerle et al. 2006, Pérez-Bueno et al. 2006).
Summarizing, Chl-F was a very useful tool to follow the PMMoV infection
on AS leaves of N. benthamiana plants. The technique provided specific signatures
(Chaerle et al. 2004, 2007) of the pathogenesis induced by two different strains of
the same virus, allowing us to distinguish between PMMoV-I and PMMoV-S
infection. Classical Chl-F parameters gave us information about the physiological
processes taking place in the AS leaves (decrease in photosynthesis and increase in
the energy dissipated as heat), correlated with the viral movement on these leaves.
Analysis of Chl-F transients by advanced statistical approach and F5/F0 let us to
detect the infection earlier than classical parameters. The use of complementary
imaging biophysical techniques, as thermography or multicolour fluorescence
induced by ultraviolet light, would provide a signature of the complete PMMoV
infection process, allowing us to elaborate stress-catalogues that might be used for
diagnostic and quantification of the stress responses (Chaerle et al. 2007).

References
Aldea, M., Hamilton, J.G., Resti, J.P., Zangerl, A.R., Berenbaum, M.R., Frank, T.D. and de Lucia,
E.H. (2006) Comparison of photosynthetic damage from arthropod herbivory and pathogen
infection in understory hardwood saplings. Oecologia. 149: 221-232.
Alonso, E., García-Luque, I., Avila-Rincón, M.J., Wicke, B., Serra, M.T. and Díaz-Ruiz, J.R. (1989)
A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. J. Phytopathol. 125:
67-76.
Balachandran, S. and Osmond, B.C. (1994) Susceptibility of tobacco leaves to photoinhibition
following infection with two strains of tobacco mosaic virus under different light and nitrogen
nutrition regimes. Plant Physiol. 104: 1051-1057.

186
C. Resultados

Balachandran S., Osmond B.C. and Daley, F.P. (1994) Diagnosis of the earliest strain-specific
interactions between tobacco mosaic virus and chloroplasts of tobacco leaves in vivo by means
of chlorophyll fluorescence imaging. Plant Physiol. 104: 1059-1065.
Balachandran S., Hurry, V.M., Kelley, S.E., Osmond, C.B., Robinson, S.A., Rohozinski, J., Seaton,
G.G.R. and Sims, D.A. (1997) Concepts of plant biotic stress. Some insights into the stress
physiology of virus-infected plants, from the perspective of photosynthesis. Physiol. Plant. 100:
203-213.
Barón, M., Rahoutei, J., Lázaro, J.J. and García-Luque, I. (1995) PSII response to biotic and abiotic
stress. In Photosynthesis: from light to biosphere, 4: 897-900. P Mathis, ed., Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht.
Berger, S., Papadopoulos, M., Schreiber, U., Kaiser, W. and Roitsch, T. (2004) Complex regulation
of gene expression, photosynthesis and sugar levels by pathogen infection in tomato. Physiol.
Plant. 122: 419-428.

Berger, S., Benediktyová, Z., Matouš, K., Bonfig, K., Mueller, M.J., Nedbal, L. and Roitsch, T.
(2007) Visualization of dynamics of plant-pathogen interaction by novel combination of
chlorophyll fluorescence imaging and statistical analysis: Differential effects of virulent an
avirulent strains of P. syringae and of oxylipins on A. thaliana. 58: 797-806.

Bilger, W. and Björkman, O. (1990) Role of the xantophyll cycle in photoprotection elucidated by
measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in Hedera
canariensis. Photosynth. Res. 25: 173-185.
Bonfig, K.B., Schreiber, U., Gabler, A., Roitsch, T. and Berger, S. (2006) Infection with virulent and
avirulent P. syringae strains differentially effects photosynthesis and sink metabolism in
Arabidopsis leaves. Planta. Planta 225: 1-12.
Chaerle, L., Hagenbeek, D., De Bruyne, E., Valke, R. and Van Der Straeten, D. (2004) Thermal and
chlorophyll-fluorescence imaging distinguish plant pathogen interaction at an early stage. Plant
Cell Physiol. 45: 887-896.
Chaerle, L., Pineda, M., Romero-Aranda, R., Van Der Straeten, D. and Barón, M (2006) Robotized
thermal and chlorophyll-fluorescence imaging of pepper mild mottle virus infection in
Nicotiana benthamiana. Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336.
Chaerle, L., Leinonen, I., Jones, H.G. y Van Der Straeten, D. (2007) Monitoring and screening plant
populations with combined thermal and chlorophyll fluorescence imaging. 58: 773-784.
Chou, H.M., Bundock, N., Rolfe, A.S. and Scholes DJ (2000) Infection of Arabidopsis thaliana
leaves with Albugo candida (white blister rust) causes a reprogramming of host metabolism.
Mol. Plant Pathol. 2: 99-113.

187
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Critchley, C. and Russell, A.W. (1994) Photoinhibition of photosynthesis in vivo: The role of protein
turnover in photosystem II. Physiol. Plantarum 92: 188-196.
Fukunaga, K. (1990) Introduction to statistical pattern recognition. 2nd Ed. Academic Press, New
York.
Genty, B., Briantais, J.-M. and Baker, N.R. (1989) The relationship between quantum yield of
photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys.
Acta 990: 87-92.
Horton, P., Wentworth, M. and Ruban, A.V. (2005) Control of the light harvesting function of
chloroplast membranes: The LHCII-aggregation model for non-photochemical quenching.
FEBS Lett. 579: 4201-4206.
Ireland, C.R.; Long, N.R. and Baker, N.R. (1984) The relationship between carbon dioxide fixation
and chlorophyll a fluorescence during induction of photosynthesis in maize leaves at different
temperatures and carbon dioxide concentrations. Planta 160: 550-558.
Kautsky, H. and Hirsch, A. (1931) Neue versuche zur kohlensauerassimilation. Naturwissenschaften
48: 964-964.
Lichtenthaler, H.K. and Rinderle, U. (1988) The role of chlorophyll fluorescence in the detection of
stress conditions in plants. CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 19: 29-85.
Lichtenthaler, H.K. and Miehé, J.A. (1997) Fluorescence imaging as a diagnostic tool for plant stress.
Trends Plant Sci. 2: 316-320.
Lohaus, G., Heldt, H.W. and Osmond, C.B. (2000) Infection with phloem limited Abutilon mosaic
virus causes localized carbohydrate accumulation in leaves of Abutilon striatum: relationships
to symtom development and effects on chlorophyll fluorescence quenching during
photosynthetic induction. Plant Biol. 2:161-167.
Matouš, K., Benediktyová, Z., Berger, S., Roitsch, T. and Nedbal, L. (2007) Case study of
combinatorial imaging: What protocol and what chlorophyll fluorescence image to use when
visualizing infection of Arabidopsis thaliana by Pseudomonas syringae? Photosynth. Res. doi:
10.1007/s11120-006-9120-6.
Maxwell, K and Johnson, G.N. (2000) Chlorophyll fluorescence – a practical guide. J. Exp. Bot. 51:
659–668.
Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J. and Trtílek, M. (2000) Kinetic imaging of
chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynth Res. 66: 3-12.
Nedbal, L. and Březina, V. (2002) Complex metabolic oscillations in plants forced by harmonic
irradiance. Biophys.J. 83: 2180-2189.
Nedbal, L., Březina, V., Adamec, F., Štys, D., Oja, V., Laisk, A. and Govindjee (2003) Negative
feedback regulation is responsible for the non-linear modulation of photosynthetic activity in

188
C. Resultados

plants and cyanobacteria exposed to a dynamic light environment Biochim. Biophys. Acta 1607:
5-17.
Nedbal, L. and Whitmarsh, J. (2004) Chlorophyll fluorescence imaging of leaves and fruits. En
Chlorophyll a fluorescence: A signature photosynthesis. Papageorgiou, C.G., Govindjee, eds.
14: 389-407. Springer. Dordrecht.
Osmond, C.B., Daley, P.F., Badger, M.R. and Lüttge, U. (1998) Chlorophyll fluorescence quenching
during photosynthetic induction in leaves of Abutilon striatum Dicks infected with Abutilon
mosaic virus observed with a field-portable system. Bot. Acta 111: 390-397.
Pérez-Bueno, M.L., Rahoutei, J., Sajnani, C., García-Luque, I. and Barón, M. (2004) Proteomic
analysis of the oxygen-evolving complex of photosystem II under biotic stress. Studies on
Nicotiana benthamiana infected with tobamoviruses. Proteomics 4: 418-425.
Pérez-Bueno, M.L., Ciscato, M., van deVen, M., García-Luque, I., Valcke, R. and Barón, M. (2006)
Imaging viral infection. Studies on Nicotiana benthamiana plants infected with the pepper mild
mottle tobamovirus. Photosynthesis Res. 90: 111-123.
Pudil, P., Novovicova, J. and Kittler, J. (1994) Floating search methods in feature selecdtion. Pattern
Recognition Letters 15: 1119-1125.
Rahoutei, J., García-Luque, I., Cremona, V. and Barón, M. (1998) Effect of tobamovirus infection on
PSII complex of infected plants. In Photosynthesis: from light to biosphere, G Garab, ed, Vol 4.
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 2761-2764.
Rahoutei, J., Barón, M., García-Luque, I., Droppa, M., Neményi, A. and Horvath, G. (1999) Effect of
tobamovirus infection on the thermoluminiscence characteristics of chloroplast from infected
plants. Z. Naturforsch 54c: 634-639.
Rahoutei, J., García-Luque, I. and Barón, M. (2000) Inhibition of photosynthesis by viral infection:
Effect on PSII structure and function. Physiol. Plant. 110: 286-292.
Roháček, K. and Barták, M. (1999) Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic
concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica 37: 339-363, 1999.
Ruban, A.V. and Horton, P. (1995) Regulation of non-photochemical quenching of chlorophyll
fluorescence in plants. Aust. J. Plant Physiol. 22: 221-230.
Sajnani, C., Zurita, J.L., Doncel, M., Ortega, J.M., Barón, M. and Ducruet, J.-M. (2007) Changes in
photosynthetic metabolism induced by tobamovirus infection in Nicotiana benthamiana studied
in vivo by chlorophyll thermoluminescence. New Phytol. In press.
Scholes, J.D. and Rolfe, S.A. (1996) Photosynthesis in localised regions of oat leaves infected with
crown rust (Puccinia coronata): quantitative imaging of chlorophyll fluorescence. Planta 199:
573-582.

189
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Schreiber, U., Schliwa, U. and Bilger, W. (1986) Continuous recording of photochemical and
nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation
fluorometer. Photosynthesis Res. 10: 51-62.
Soukupová, J., Smatanová, S., Nedbal, L. and Jegorov, A. (2003) Plant response to destruxins
visualized by imaging of chlorophyll fluorescence. Physiol Plantarum 118: 399-405.
Swarbrick, P.J., Schulze-Lefert, P. and Scholes, J.D. (2006) Metabolic consequences of susceptibility
and resistance (race-specific and broad-spectrum) in barley leaves challenged with powdery
mildew. Plant Cell Environ. 29: 1061-1076.
Tang, J.Y., Zielinski, R.E., Zangerl, A.R., Crofts, A.R., Berenbaum, M.R. and de Lucia, E.H. (2006)
The differential effects of herbivory by first and fourth instars of Trichoplusia ni (Lepidoptera:
Noctuidae) on photosynthesis in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 57: 527-536.
van Wijk, K.J., Schnettger, B., Graf, H. and Krause, G.H. (1993) Photoinhibition and recovery in
relation to heterogeneity of photosystem II. Biochim. Biophys Acta 1142: 59-68.
Wetter, C., Conti, M., Alschuh, D., Tabillion, R. and van Regemortel, M.H.V. (1984) Pepper mild
mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Phytopathology 74: 405-410.
Zangerl, A.R., Hamilton, J.G., Miller, T.J., Crofts, A.R., Oxborough, K., Berenbaum, M.R. and de
Lucia, E.H. (2002) Impact of folivory on photosynthesis is greater than the sum of its holes. P.
Natl. Acad. Sci. USA 22: 1088-1091.

190
C. Resultados

C.4. Changes induced by the pepper mild mottle tobamovirus on the


chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana

The analysis of chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana in the pH


range 4-7 has been carried out by Carlota Sajnani, and was described in her PhD
Thesis work (Sajnani 2005).

The analysis of chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana in the pH


range 6-11 has been carried out by Mónica Pineda for the present PhD Thesis
work.

191
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

192
C. Resultados

C.4. Changes induced by the pepper mild mottle tobamovirus on the


chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana

Pineda, M*,1, Sajnani, C*,1., and Barón, M.1,2.

1: Department of Biochemistry, Molecular and Cellular Biology, Estación Experimental del Zaidín.
CSIC, Granada, Spain.
2: Corresponding author: mbaron@eez.csic.es
*: These authors have contributed equally to this work and are placed in alphabetical order.

Abstract: In this work, we have analysed the chloroplast proteome of Nicotiana


benthamiana by using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry
followed by database searching. To improve the resolution of the 2D gels, we have
made separate maps for the low and the high pH range. At least 200 spots were
detected and 72 identified, being some of them isoforms of different multiprotein
families. In addition, changes in this chloroplast proteome induced by the infection
with the Spanish strain of the pepper mild mottle virus (PMMoV-S) were
investigated after 14 days post-inoculation. Viral infection induced the down-
regulation of several photosynthetic proteins and surprisingly, the expression level
of two PsbQ proteins from the oxygen-evolving-complex was enhanced during the
viral infection.

Keywords: Bidimensional electrophoresis – Biotic stress – Chloroplast proteome –


Nicotiana benthamiana – Pepper Mild Mottle Virus – Oxigen evolving complex

Abbreviations: 1D, one-dimensional; 2D, two-dimensional; IEF,


isoelectrofocusing; 2-DE, two dimensional gel electrophoresis; CF1, ATP synthase
catalytic portion; CP, coat protein; Cyt. f, cytochrome f; FNR, ferredoxina-NADP+
reductase; GS, glutamine synthetase; Hsp70, heat shock protein 70 kDa; Lhca:
photosystem I chlorophyll a/b binding proteins; Lhcb: photosystem II chlorophyll

193
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

a/b binding proteins; MALDI, matrix-assisted laser desorption/ionization; MS,


mass spectrometry; Mr, relative molecular mass; OEC, oxygen-evolving complex;
PGK, phosphoglycerate kinase; pI, isoelectrical point; PMMoV-S, Spanish strain
of pepper mild mottle virus; PRK, phosphoribulo-kinase; PsaC, PsaD and PsaE, C,
D and E proteins, respectively, of the photosystem I core complex; PsbO, PsbP and
PsbQ, 33, 24 and 16 extrinsic proteins of the photosystem II oxygen-evolving
complex; PSI, photosystem I; PSII, photosystem II; RbcL and RbcS, ribulose 1,5
bisphosphate carboxilase oxygenase large and small subunits; RuBisCO, ribulose
1,5 bisphosphate carboxilase oxygenase; Rca, ribulose 1,5 bisphosphate
carboxilase oxygenase activase; SBPase, sedoheptulose-1,7-bisphosphatase;
TOF/TOF, time of flight tandem mass spectrometry.

Introduction
Proteomics is nowadays an irreplaceable tool to study the response of living
organisms to their environment. However, less attention has been applied to plant
proteome, although some revisions about this topic were published in last years
(Rossignol 2001, Bagginsky and Gruissem 2004, Cánovas et al. 2004, Newton et
al. 2004, Rose et al. 2004, van Wijk 2004, Rossignol et al. 2006). In order to
improve the understanding of plant proteome expression, a number of studies are
focused in organelles subproteomes, as those of chloroplast and mitochondria
responsible of the plant energy metabolism. 2-DE (two dimensional gel
electrophoresis), consisting in isoelectrofocusing (IEF) followed by SDS-PAGE
electrophoresis (IEF/SDS-PAGE), was one of the first techniques applied to study
the chloroplast proteome. This approach has demonstrated to be successful for the
analysis of both luminal and peripheral thylakoid proteins from Pisum sativum
(Peltier et al. 2000) and Arabidopsis (Kieselbach et al. 2000, Peltier et al. 2002,
Schubert et al. 2002). 2D-BN/SDS-PAGE (Blue-native polyacrylamide gel
electrophoresis followed by SDS-PAGE), commonly used to characterize
chloroplast protein complexes in plants and algae (Schägger et al. 1994), has also

194
C. Resultados

provided an excellent two dimensional (2D) alternative for the IEF/SDS-PAGE of


the most hydrophobic thylakoid proteins. This technique has provided an insight in
the chloroplast proteome of Hordeum vulgaris (Ciambella et al. 2005) and
Cucurbita pepo (Aro et al. 2005). Several strategies (fractionation followed by
multidimensional protein separation steps) have been also used for identification of
the hydrophobic thylakoid integral membrane proteome (Friso et al. 2004, Peltier
et al. 2004) as well as the chloroplast envelope proteomes (Ferro et al. 2002) of
Arabidopsis. In addition, novel non-gel proteomic techniques have revealed the
pathway abundance and novel protein functions in the photosynthetic membranes
(Huber et al. 2004, Kleffman et al. 2004).
Fewer efforts have been done to identify the changes on the proteomic
profile of chloroplast from plants suffering under different biotic and abiotic stress
factors. Phee et al. (2004) and Giacomelli et al. (2006) analysed in Arabidopsis
thaliana the response to high light of the chloroplast proteome, Andaluz et al.
(2006) studied the proteomic changes induced by iron deficiency in the thylakoid
membranes from Beta vulgaris and Cui et al. (2005) investigated in Oryza sativa
the chloroplast proteome as main target of cold stress. Jones et al. (2006) using 2-
DE detected significant changes in the chloroplast proteome of Arabidopsis plants
infected with Pseudomonas syringae pv. tomato, affecting mainly photosystem II
(PSII) and components of the Benson-Calvin cycle. Zhou et al. (2006) carried out a
proteomic analysis of the compatible interaction Fusarium graminearum and
Triticum aestivum and concluded that the chloroplast is the organelle mostly
affected by the infection. A leaf proteomic approach was also carried out to study
pea responses to powdery mildew, and showed changes in proteins involved in
photosynthesis and carbon metabolism in the host plant (Curto et al. 2006).
We had investigated by 2-DE the changes on the protein pattern of the
oxygen-evolving complex (OEC) of PSII during the infection of Nicotiana
benthamiana plants with the Spanish strain of the pepper mild mottle tobamovirus
(PMMoV-S) (Pérez-Bueno et al. 2004). Previously, we had demonstrated that the

195
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

OEC is one of the main targets of the viral infection in the chloroplast (Rahoutei et
al. 2000). The proteomic analysis of the OEC from the infected plants showed that
the PsbO and PsbP proteins correspond to protein families in Nicotiana
benthamiana, and the content of the PsbP polypeptides decreased dramatically with
respect to PsbO during the progress of the infection. Interestingly, there was a
differential decrease of the different PsbP proteins, indicative of a distinct
regulation of their expression during pathogenesis (Pérez-Bueno et al. 2004).
In the present work we go further insight in the analysis of the chloroplast
proteome of Nicotiana benthamiana by 2-DE and mass spectrometry (MS)
followed by database searching. In addition, changes in this chloroplast proteome
induced by the infection with PMMoV-S were studied after 14 days post-
inoculation (dpi). Viral infection induced the down-regulation of several
photosynthetic proteins, while expression of other chloroplast proteins was
enhanced by the virus.
N. benthamiana is one of the most common experimental hosts and it is used
in many studies about compatible interaction plant-virus, because of its ability to
be infected by many different viral families. Progress in the knowledge of the N.
benthamiana chloroplast proteome would be of high interest in the field of the
impact of biotic stress on photosynthesis.

Material and methods


Plant and virus material
Nicotiana benthamiana Gray plants were cultivated in a growth chamber at
100 µmol·m-2·s-1 PAR (photosynthetically active radiation), provided by cool white
fluorescent lamps, with a 16/8 h light/dark photoperiod, a temperature regime of
23/18ºC (day/night) and a relative humidity of 65%. Plants at the 6–7 fully-
expanded leaves stage were inoculated in the three lower leaves with 25 µl of
inocula per leaf at 50 µg of purified PMMoV/ml of 20 mM sodium phosphate
buffer pH 7.0. Mock-inoculated plants were treated with buffer only. The Spanish

196
C. Resultados

strain of PMMoV (genus Tobamovirus) was isolated in Almería (Spain) (Alonso et


al. 1989).

Sample isolation
Chloroplast-enriched preparations from virus-infected plants and their
corresponding controls were isolated according to Reche et al. (1997) at 14 dpi.

Sample solubilisation for protein electrophoresis


Sample solubilisation was carried out according to Schuster and Davies
(1983) with minor modifications. 200 µl from a chloroplast preparation containing
1µg Chl/µl was incubated with 200 µl extraction buffer [0.7 M sucrose, 0.5 M Tris,
30 mM HCl, 50 mM EDTA, 0.1 M KCl, 2% (v/v) 2-mercaptoethanol and 2 mM
PSMF] for 20 min at 4ºC, vortexing several times. Then, 400 µl of 0.1 M Tris-HCl-
saturated phenol (Amresco, Ohio, USA) were added. After shaking for 15 min at
4ºC, the phases were separated by 10 min centrifugation at 16000 g and 4ºC. The
phenolic phase was recovered and re-extracted three times with an equal volume of
extraction buffer, as above. Proteins were precipitated from the phenol phase by
adding 6 volumes of 0.1 M ammonium acetate in methanol (HPLC grade) and
incubated at -20ºC overnight. The pellet obtained after a centrifugation during 10
min at 16000 g and 4ºC was washed three times with the ammonium acetate-
methanol solution and then 8 volumes of 100% HPLC acetone was added. Proteins
were kept at -20ºC at least 4 h and then precipitated by the same centrifugation
conditions. The pellet was dried and solubilised in ReadyPrep Sequential
Extraction Reagent 3 (BioRad, Hercules, CA, USA), containing 5 M urea, 2 M
thiourea, 2% (w/v) CHAPS, 2% (w/v) SB 3-10, 40 mM Tris, 0.2% Bio-Lyte 3/10
and 2 mM TBP. The sample was incubated for 2 h at room temperature and gentle
shaking. Insoluble material was removed by centrifugation during 10 min at 16000
g and 25ºC. Protein content of the sample was measured using the 2-D Quant Kit
(GE Health Care, St. Giles Chalfont, United Kingdom). In the case of the samples

197
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

used for alkaline pH range gels, pI (isoelectrical point) standards (2-D SDS-PAGE
Standards, BioRad) were added to them after the quantification.

First dimension electrophoresis: isoelectrofocusing (IEF)


IEF was carried out on 11 cm ReadyStrip IPG Strip gels (BioRad) as well as
on Immobiline DryStrip gels (GE Health Care) for the 4-7 and 6-11 pH ranges,
respectively. The strips were allowed to rehydrate in a PROTEAN IEF Cell
(BioRad) for 14-16 h at 50 V and 20ºC with 200 µl of chloroplast preparation,
containing 75 µg of proteins and a trace of bromophenol blue. Proteins were
separated in the pH range 4-7 by IEF using a three step procedure: 15 min at 250
V, followed by 2 h at 8000 V and a final step of 8000 Vh to complete 35000 V. In
the case of the 6-11 pH range , some intermediate steps were required according to
Görg et al. (2000): 1 h at 150 V, 1 h at 300 V, 1 h at 1000 V, 1 h at 3000 V, 1 h at
6000 V and 6000 Vh to complete 25000 V. After focusing, the strips were
immediately run or frozen at -80ºC.

SDS-PAGE
Focused IEF strips were incubated at room temperature for 20 min with two
changes of equilibration buffer Tris-HCl 50 mM pH 8.8 containing 6 M urea, 2%
(w/v) SDS, 0.02% (w/v) bromophenol blue, 30% glycerol, and 0.5% (w/v) DTT.
Strips were then layered on the top of a SDS 12% polyacrylamide gel and sealed
with melted 0.8% agarose in running buffer. 2 gels were run simultaneously, one
for each treatment, in order to reduce variations. Running conditions were 17 mA
for 30 min and 48 mA for 5-6 h. After electrophoresis, gels were silver stained (pH
6-11 map; Yan et al. 2000) or Sypro Ruby stained (pH 4-7 map; Bio-Rad,
Steinberg et al. 1996). To ensure the reproducibility of the results, triplicate 2D
gels were made from 3 independent chloroplast preparations, each from a different
batch of plants. Figures show the most representative gels.

198
C. Resultados

Mass spectrometry and protein identification


Spots from silver- or Sypro Ruby-stained gels were manually excised and
stored in milli-Q water at 4ºC until MALDI-TOF/TOF analysis. Protein spots were
digested automatically using a Proteineer DP protein digestion station (Bruker-
Daltonics, Bremen, Germany). The digestion protocol used was that of
Schevchenko et al. (1996) with minor variations. For peptide mass fingerprinting
and TOF/TOF spectra acquisition an aliquot of a-cyano-4-hydroxycinnamic acid in
33% aqueous acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid was mixed with an aliquot
of the above digestion solution and the mixture was deposited onto an AnchorChip
MALDI probe (Bruker-Daltonics).Peptide mass fingerprint spectra were measured
on a Bruker Ultraflex MALDI TOF/TOF mass spectrometer (Bruker-Daltonics)
(Suckau et al. 2003) in positive ion reflector mode. When possible, mass
measurements were performed automatically through fuzzy logic based software.
Each spectrum was internally calibrated with mass signals of trypsin autolysis ions
to reach a typical mass measurement accuracy of ±25 ppm. The measured tryptic
peptide masses were transferred through MS BioTools program (Bruker-Daltonics)
as inputs to search the NCBInr database using Mascot software (Matrix Science,
London, UK). When available, MS/MS data from LIFT TOF/TOF spectra were
combined with MS peptide mass fingerprint data for database searching. Positively
identified proteins are listed in Tables 1 and 2.

Results
Chloroplastidic proteins from both control and PMMoV-S infected Nicotiana
benthamiana plants were separated by 2-DE and the gels were analysed to study
the changes induced by the viral infection. To improve the gel resolution and avoid
troubles due to the difficult focusing of proteins with alkaline pI, we made separate
2D maps for the low (4-7) and high (6-11) pH range.

199
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fig. 1. A) Sypro-stained 2D maps of chloroplast preparations from control Nicotiana benthamiana


plants. Proteins were separated in the first dimension in a linear pH (4-7) IPG gel strips and in the
second dimension in 12% polyacrylamide vertical gels. Identified spots by means of MALDI/TOF-
TOF are listed in Table 1. LHCII proteins were detected by Western Blot analysis.The region
enclosed by a dotted box is shown in detail in B. B) Detail of the map in the pH 4-7 range, where
proteins from # 42 to # 54 are better resolved.

200
C. Resultados

Chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana in the pH range 4-7


Most of the chloroplastidic proteins were found in this pH range. At least
150 spots could be distinguished in the 2D-gels (Fig. 1A, B). Based on the
reproducibility of the spot pattern and relative amount of the proteins, 78 spots
were selected for the MALDI-TOF/TOF analysis. A number of 55 proteins could
be identified, corresponding to 29 different proteins (Table 1, spots # 1-55). Most
of the identified proteins (31) were members of the different photosynthetic
complexes of the thylakoid membrane: 16 polypeptides from PSII, 3 proteins from
photosystem I (PSI), 2 cytochrome f (Cyt. f) polypeptides from the cytochrome
complex and 10 spots corresponding to the ATP synthase. PSII proteins belonging
to the OEC were one of the most abundant proteins in the gels. Six spots
corresponding to the PsbO multiprotein family were found (# 1-6), showing the
same Mr and different pI. The PsbP multiprotein family contributed with 10 spots
(# 7-16), 6 of them (# 7-11, 16) with similar Mr and differing in pI and 4 spots (#
12-15) of lower Mr. From PSI, we detected the ferredoxin-NADP+-reductase (#
19), PsaC (# 31) and a cab protein from the light harvesting complex (Lhca; # 32).
In addition, we identified 2 Cyt. f polypeptides (# 18 and 20) from the cytochrome
complex. The ATP synthase macrocomplex was represented by 10 proteins (# 21-
30), corresponding to the five subunits of the CF1 catalytic portion: α (# 25-27), β
(# 22-24), γ (# 21), δ (# 28) and ε (# 29 and 30). Spots corresponding to the same
subunit showed the same Mr but different pI.
From the proteins involved in the reactions of the Benson-Calvin cycle, the
RuBisCO (ribulose 1,5 bisphosphate carboxilase oxygenase) protein was the most
prominent one in the 2D-gels. RcbL (RuBisCO large subunit; # 36) was present in
the high Mr range of the gels with a pI of 6.9, and RcbS (RuBisCO small subunit)
in the low Mr range with 2 spots, showing the same Mr but different pIs (# 34 and
35). We could also detect in the 2D-gels other proteins from the same metabolic
pathway: sedoheptulose-1,7-biphosphatase (SBPase, # 45), phosphoribulokinase
(PRK, # 46), RuBisCo activase (Rca, # 47-50), phosphoglycerate kinase (PGK, #

201
202

Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped


Table 1. Proteins identified by MALDI/TOF-TOF from the 2D gels showed in Figs. 1 and 3 and marked by the same number. Each polypeptide is
annotated with the homology found, including protein name, plant species and the corresponding protein accession number. Asterisks indicate
Nicotiana tabacum. Theoretical and experimental pIs and Mr are also provided. Homologies include the % coverage reached, the number of matched
and unmatched peptides, and the MASCOT score details. Scores>76 are significant (p<0.05). CF1: ATP synthase catalytic portion; CP: viral coat
protein; Cyt. f: cytochrome f; FNR: ferredoxin-NADP+ reductase; GS: glutamine synthetase; Hsp70, heat shock protein 70 kDa; Lhca: PSI
chlorophyll a/b binding proteins ; Lhcb: PSII chlorophyll a/b binding proteins; PGK: phosphoglycerate kinase; PRK: phosphoribulo-kinase; Psa
proteins: PSI proteins codified by psa genes; Psb proteins: PSII proteins codified by psb genes; RbcL: RuBisCO large subunit; RbcS: RuBisCO small
subunit; Rca: RuBisCO activase; SBPase: sedoheptulose-1,7-bisphosphatase; SFBA: sedoheptulose/fructose-bisphosphate aldolase.

Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %


Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
1 PsbO * gi|30013657 35 5.3 35.4 5.1 152 10 3 26
2 PsbO * gi|30013657 35 5.3 35.4 5.2 85 5 1 20
3 PsbO * gi|30013657 35 5.3 35.4 5.3 124 7 1 27
4 PsbO * gi|30013657 35 5.3 35.4 5.5 96 6 3 33
5 PsbO * gi|30013657 35 5.3 35.4 5.7 182 11 2 42
6 PsbO * gi|30013657 35 5.3 35.4 5.8 189 10 0 37
7 PsbP * gi|19911 29 7.5 26.2 5.1 125 6 1 33
8 PsbP * gi|19911 29 7.5 26.2 5.3 108 7 6 39
9 PsbP * gi|49259455 19 5.1 26.2 5.5 105 5 2 37
10 PsbP * gi|49259455 19 5.1 26.2 5.8 105 5 2 37
11 PsbP * gi|49259455 19 5.1 26.2 6.1 106 5 2 37
12 PsbP * gi|1345550 29 7.5 23.2 5.3 96 5 1 26
13 PsbP * gi|1345550 29 7.5 23.2 5.5 121 6 1 29
14 PsbP * gi|1345550 29 7.5 23.2 5.8 113 6 2 33
15 PsbP * gi|1345550 29 7.5 23.2 6.1 80 4 1 25
16 PsbP * gi|49259455 19 5.1 26.2 6.4 82 4 2 37
Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %
Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
Plastid lipid
17 * gi|2632088 29 4.6 37.9 5.0 122 7 4 25
associated protein
18 Cyt. f * gi|65614 35 8.2 37.9 6.5 163 9 - 42
Capsicum
19 FNR, chain b gi|47169164 34 - 37.9 6.3 171 7 16 -
annuum
20 Cyt. f * gi|11465970 35 8.2 37.9 6.1 92 6 4 18
21 CF1γ * gi|19785 42 7.6 43.8 6.6 109 7 2 17
Nicotiana
22 CF1β gi|114556 54 4.9 59.0 5.7 196 13 7 37
plumbaginifolia
Nicotiana
23 CF1β gi|114556 54 4.9 59.0 5.9 230 16 10 42
plumbaginifolia
Nuphar
24 CF1β gi|14718153 51 4.7 59.0 6.1 108 6 0 16
variegata
25 CF1α * gi|55977763 55 4.9 59.0 5.5 240 15 2 31
26 CF1α * gi|55977763 55 4.9 59.0 5.7 269 16 1 35
27 CF1α Atropa belladona gi|28261702 55 5 59.0 5.9 183 11 1 23
28 CF1δ * gi|19787 27 8.1 20.1 5.3 85 6 5 24
29 CF1ε Atropa belladona gi|28261723 15 5 16.1 5.4 114 5 1 43
30 CF1ε * gi|11465963 15 5 16.2 5.7 117 6 4 51

C. Resultados
203
Table 1 (continued). Proteins identified by MALDI/TOF-TOF from the 2D gels showed in Figs. 1 and 3 and marked by the same number. Each
204

Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped


polypeptide is annotated with the homology found, including protein name, plant species and the corresponding protein accession number. Asterisks
indicate Nicotiana tabacum. Theoretical and experimental pIs and Mr are also provided. Homologies include the % coverage reached, the number of
matched and unmatched peptides, and the MASCOT score details. Scores>76 are significant (p<0.05). CF1: ATP synthase catalytic portion; CP: viral
coat protein; Cyt. f: cytochrome f; FNR: ferredoxin-NADP+ reductase; GS: glutamine synthetase; Hsp70, heat shock protein 70 kDa; Lhca: PSI
chlorophyll a/b binding proteins ; Lhcb: PSII chlorophyll a/b binding proteins; PGK: phosphoglycerate kinase; PRK: phosphoribulo-kinase; Psa
proteins: PSI proteins codified by psa genes; Psb proteins: PSII proteins codified by psb genes; RbcL: RuBisCO large subunit; RbcS: RuBisCO small
subunit; Rca: RuBisCO activase; SBPase: sedoheptulose-1,7-bisphosphatase; SFBA: sedoheptulose/fructose-bisphosphate aldolase.

Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %


Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
Solanum
31 Putative PsaC gi|34787119 9 6.9 11.1 6.3 145 6 1 71
tuberosum
Lycopersicon
32 Lhca Type III gi|19182 29 - 30.1 6.4 67 - - -
esculentum
Thylakoid
Arabidopsis
33 lumenal 16.5 kDa gi|7388292 26 - 14.8 5.0 80 - - -
thaliana
protein
Flaveria
34 RbcS gi|13241101 16 - 12.9 5.7 98 4 8 -
ramosissima
Chrysanthemum
35 RbcS gi|28139169 21 - 12.9 6.0 116 5 7 -
x morifolium
Nolana
36 RbcL gi|11182397 6,5 / 52 6.5 58.5 6.9 87 6 3 16
albescens
Hypothetical Arabidopsis
37 gi|7267602 49 - 57.7 4.7 62 - - -
protein thaliana
60 kDa
chaperonin α
38 Brassica napus gi|1351030 58 4.6 66.7 5.2 123 7 0 18
subunit, RuBisCo
binding-protein
39 FtsH like * gi|4325041 75 6 69.3 5.6 101 6 0 12
40 Hsp70 Pisum sativum gi|445605 76 - 73.1 5.1 108 5 1 -
41 Hsp70 Pisum sativum gi|445605 76 - 72.5 5.1 106 4 0 -
Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %
Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
Nicotiana
42 GS gi|40457328 48 6,8 49.9 5.9 94 6 3 16
attenuata
Nicotiana
43 GS gi|40457328 48 6,8 49.9 6.0 92 6 2 12
attenuata
Nicotiana
44 GS gi|40457328 48 6,8 49.9 6.1 125 8 3 22
attenuata
Spinacia
45 SBPase gi|3914940 43 - 47.3 5.3 80 - - -
oleracea
Spinacia
46 PRK gi|21279 45 5,8 45.5 5.5 89 6 4 15
oleracea
47 Rca * gi|19990 49 7,6 48.7 5.6 176 13 9 29
48 Rca * gi|19990 49 7,6 48.7 5.7 119 10 12 25
49 PGK * gi|1161600 50 8.5 48.7 5.8 206 8 - 20

Rca * gi|445628 43 5.5 48.7 5.8 - 8 7 22

50 PGK * gi|1161600 50 8.5 48.7 5.9 205 8 - -

Rca * gi|445628 43 5.5 48.7 5.9 - 7 3 -

51 PGK * gi|1161600 50 7.8 48.7 6.0 104 7 4 21


Nicotiana
52 SFBA gi|4827251 43 7 41.2 5.8 94 6 3 16
paniculata

C. Resultados
205
206

Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped


Table 1 (continued). Proteins identified by MALDI/TOF-TOF from the 2D gels showed in Figs. 1 and 3 and marked by the same number. Each
polypeptide is annotated with the homology found, including protein name, plant species and the corresponding protein accession number. Asterisks
indicate Nicotiana tabacum. Theoretical and experimental pIs and Mr are also provided. Homologies include the % coverage reached, the number of
matched and unmatched peptides, and the MASCOT score details. Scores>76 are significant (p<0.05). CF1: ATP synthase catalytic portion; CP: viral
coat protein; Cyt. f: cytochrome f; FNR: ferredoxin-NADP+ reductase; GS: glutamine synthetase; Hsp70, heat shock protein 70 kDa; Lhca: PSI
chlorophyll a/b binding proteins ; Lhcb: PSII chlorophyll a/b binding proteins; PGK: phosphoglycerate kinase; PRK: phosphoribulo-kinase; Psa
proteins: PSI proteins codified by psa genes; Psb proteins: PSII proteins codified by psb genes; RbcL: RuBisCO large subunit; RbcS: RuBisCO small
subunit; Rca: RuBisCO activase; SBPase: sedoheptulose-1,7-bisphosphatase; SFBA: sedoheptulose/fructose-bisphosphate aldolase.

Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %


Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
Nicotiana
53 SFBA gi|4827251 43 7 41.2 6.1 90 6 4 16
paniculata
Nicotiana
54 SFBA gi|4827251 43 7 41.2 6.2 99 5 2 15
paniculata
ToMV
55 CP gi|10719965 17 - 17.6 5.2 159 9 7 -
(tobamovirus)
56 Cyt. f * gi|11845 35 8.2 40.2 7.0 145 8 1 23
Nicotiana
57 PsaD gi|19748 22 8.8 17.9 8.7 106 6 2 32
sylvestris
Nicotiana
58 PsaD gi|19748 22 8.8 17.9 9.0 112 6 1 31
sylvestris
Nicotiana
59 PsaD gi|19748 22 8.8 17.9 9.2 113 6 1 28
sylvestris
Nicotiana
60 PsaD gi|19748 22 8.8 17.9 9.3 129 7 3 44
sylvestris
Nicotiana
61 PsaD gi|417544 23 8.8 16.7 9.3 105 6 4 26
sylvestris
Nicotiana
62 PsaD gi|19748 22 8.8 16.7 9.2 133 7 2 43
sylvestris
Nicotiana
63 PsaD gi|19748 22 8.8 16.7 9.0 107 - - -
sylvestris
Nicotiana
64 PsaD gi|19748 22 8.8 16.7 8.7 85 - - -
sylvestris
Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %
Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
Nicotiana
65 PsbQ gi|58700507 24 8.7 10.9 9.4 163 8 0 32
benthamiana
Nicotiana
66 PsbQ gi|58700507 24 8.7 10.9 9.5 123 6 0 24
benthamiana
Nicotiana
67 PsaE gi|632722 15 8.6 13.9 8.2 133 7 6 43
sylvestris
Nicotiana
68 PsaE gi|632724 15 8.7 13.9 8.8 130 7 7 54
sylvestris
Ribosomal Nicotiana
69 gi|78102574 14 - 7.3 9.2 220 6 0 -
protein L14 sylvestris
70 CF1α * gi|76559637 55 4.9 77.3 6.4 117 7 1 18
Nicotiana
71 Lhcb gi|3036944 28 - 34.8 6.7 96 4 6 -
sylvestris

C. Resultados
207
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

49-51) and chloroplastidic sedoheptulose/fructose biphosphate aldolase (SFBA, #


52-54). Spots 49 and 50 contained a combination of two proteins: Rca and PGK.
Other stromal proteins identified corresponded to enzymes of the nitrogen
metabolism (glutamine synthetase, GS, # 42-44).
Some proteins related with stress processes were found in the gels: a
RuBisCO-binding chaperonin (# 38), heat shock 70 kDa protein (Hsp70, # 40-41)
and the FtsH-like protein (# 39), related to the D1 turnover and to the
hypersensitive response in incompatible host-pathogen interactions. Finally, three
proteins with unknown function were present in the 2D gels: hypothetic protein (#
37), thylakoid lumenal 16.5 kDa protein (# 33) and a plastid lipid associated
protein (# 17).

Fig. 2. Changes in the expression levels of different chloroplastidic proteins (pH 4-7 range) detected
by 2-DE. Left panels correspond to control plants and right panels to PMMoV-S infected plants. All
the proteins (excepting # 55, the coat protein of PMMoV-S) present lower expression levels in
infected plants. Numbers correspond with those of Table 1.

208
C. Resultados

Comparative analysis of 2D-gels (Fig. 2) in the acid pH range of chloroplasts


isolated from control and PMMoV-S infected Nicotiana benthamiana plants at 14
dpi, let us to identify some proteins down-regulated by the viral infection: Cyt. f (#
18 and 20), FNR (# 19), δ and ε subunits of CF1 (# 28-30), RbcL (# 36), RbcS (#
34 and 35), hypothetical protein (# 37), GS (# 42-44), SBPase (# 45), PRK (# 46),
Rca (# 47-50), PGK (# 49-51), Lhca (# 32) and SFBA (# 52-54). They are related
with the photosynthetic electronic transport chain and Benson-Calvin cycle. Only
one new protein appeared in the chloroplast from infected plants: the viral coat
protein (CP; # 55) with a Mr and pI of 17.6 kDa and 5.2, respectively.

Chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana in the pH range 6-11


In the 2D map of chloroplastidic proteins separated in the basic range 53
spots appear (Fig 3A, B) and were analysed by MALDI-TOF/TOF. Only 28 spots
could be identified (Table 1), 7 spots corresponded to the pI standards (Table 2)
and 21 spots are chloroplastidic proteins. Due to the overlapping between acidic
(pH 4-7) and basic (pH 6-11) pH ranges, some proteins present in the acid 2D-map
appeared again in the basic one: PsbP from the OEC (# 16), the Cyt. f (# 18) the γ
subunit of CF1 (# 21), Lhca (# 32) and RcbL (# 36). In the overlapping range (6-7)
also appears a chlorophyll a/b binding protein from PSII (Lhcb; # 71) not identified
in the gels of the acidic range. New forms corresponding to proteins already
identified in the acidic range appear in the 6-7 pH range: Cyt. f (# 56) and CF1 α
subunit (# 70).
The other proteins identified in the range 6-11 were: 2 spots for the E subunit
of PSI (PsaE), with the same Mr and different pI (# 67 and 68); 8 spots
corresponding to D subunit of PSI (PsaD) with 4 of them with similar Mr and
differing in pI (# 57-60) and another group of 4 PsaD proteins with lower Mr (# 61-
64). The PsbQ protein from the OEC was detected in the low Mr region of the gel,
matching with two spots (# 65 and 66). The ribosomal protein L14 was the lowest
Mr identified protein (# 69).

209
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fig. 3. Silver-stained 2D maps of chloroplast preparations from control (A) and PMMoV-S infected
(B) Nicotiana benthamiana plants. Proteins were separated in the first dimension in a linear (pH 6-11)
IPG gel strips and in the second dimension in 12% polyacrylamide vertical gels. Identified spots by
means of MALDI/TOF-TOF are listed in Table 1. Black and gray numbers in (A) represent proteins
suffering no changes or down-regulated, respectively, during the PMMoV-S infection. Numbers
enclosed in circles in (B) display up-regulated proteins in infected plants. Black boxes frame human
keratins. Dotted arrows in (A) represent pI standards, named by letters and listed in Table 2.

Comparative analysis of the basic 2D map from chloroplast isolated from


control (Fig 3A) and PMMoV-S infected (Fig. 3B) plants showed that, as in the
case of acidic map, the RbcL (# 36) diminished in the infected plants. Other
proteins whose expression levels were reduced were all PsaD forms and the
ribosomal protein L14 (# 57-64, and 69). In turn, PsbQ augmented due to the viral
infection (# 65 and 66).

210
Table 2. pI standards identified by MALDI/TOF-TOF from gels displayed in Fig. 3. Each polypeptide is annotated with the homology found,
including protein name, species and the corresponding protein accession number. Theoretical and experimental pIs and Mr are also provided.
Homologies include the % coverage reached, the number of matched and unmatched peptides, and the MASCOT score details. Scores>76 are
significant (p<0.05).

Theoretical Theoretical Experimental Experimental Mascot Matched Unmatched %


Spot Homology Species Accesion #
mass pI mass pI score peptides peptides Coverage
Glyceraldehyde-
a 3-phosphate - gi|2506441 36 7.9 47.6 7.5 105 6 1 16
dehydrogenase
Glyceraldehyde-
b 3-phosphate - gi|1169794 36 7.9 46.0 8 126 7 1 20
dehydrogenase
Glyceraldehyde-
c 3-phosphate - gi|40889053 36 7.8 46.0 8.4 188 10 1 28
dehydrogenase
Glyceraldehyde-
d 3-phosphate - gi|1169794 36 7.9 46.0 8.6 107 6 1 16
dehydrogenase
Bovine carbonic
e anhydrase II, - gi|46016009 29 6.5 35.0 6.4 202 10 1 33
chain B
Horse Herat
f Equus caballus gi|2554649 17 7.5 10.9 7.8 185 9 2 63
myoglobin

C. Resultados
g Albumin Bos taurus gi|162648 71 5.8 10.0 8.9 145 11 4 21
211
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Discussion
2-DE has been applied successfully to the analysis of the chloroplast
proteome, and especially, to the peripheral and luminal one in plants as
Arabidopsis and Pisum sativum (Kieselbach et al. 2000, Peltier et al. 2000, van
Wijk 2001, Whitelegge 2003). Few authors have investigated changes in the
chloroplast proteome under abiotic or biotic stress factors, Andaluz et al. (2006)
analysed the effect of Fe-deficiency in Beta vulgaris, Cui et al. (2005) that of cold
stress in Oryza sativa and Jones et al. (2006) evaluated changes in the chloroplast
proteome of Arabidopsis plants infected with Pseudomonas syringae pv. tomato.
We have also carried out a proteomic analysis of the OEC from N. benthamiana
infected with PMMoV (Pérez-Bueno et al. 2004); the OEC proteins were the most
abundant one in the chloroplast proteome and we had previously described them as
target of the infection with this tobamovirus (Rahoutei et al. 1998). In the present
work we go further insight in the analysis of the chloroplast proteome of N.
benthamiana by 2-DE and MS followed by database searching.
More than 200 spots could be visualised in the 2D gels from chloroplast
preparations isolated from control plants: 150 spots in the pH range 4-7, most of
them in the 20-43 kDa Mr region (Fig. 1A, B), and 53 spots in the pH range 6-11
(Fig. 3A, B). From the analysis by MALDI-TOF/TOF MS, 71 proteins were
identified (35,5%); in addition, several LHCII proteins were visible in the gels
(Fig.1A) and identified by Western Blot (data not shown).
It was very remarkable the high resolution grade reached in the case of PsbO
and PsbP proteins, extrinsic proteins of the OEC (Fig. 1A). Our previous works
only let us identify 4 isoforms of every protein family (Rahoutei et al. 1998, Pérez-
Bueno et al. 2004), both encoded by a multigene family with at least 4 isogenes
(Pérez-Bueno 2003). In turn, we have identified in the present work 6 spots
corresponding to PsbO and 10 belonging to PsbP (Table 1). Multigene families
coding for different isoforms of PsbO have been described in Pisum sativum
(Wales et al. 1989), Licopersicum esculentum (Görlach et al. 1993) and

212
C. Resultados

Arabidopsis thaliana (Kieselbach 2000, Peltier et al. 2002, Schubert et al. 2002).
Gene families for PsbP were found in Nicotiana tabacum (Hua et al. 1991a and b,
Hua et al. 1993, Takahashi et al. 1991), Arabidopsis thaliana (Peltier et al. 2002)
and Sinapis alba (Merkle et al. 1990). It has been demonstrated in Nicotiana
tabacum that the 4 PsbP isoforms are functionally equivalents in vivo, but it is
required the expression of the 4 isogenes for optimal PSII activity (Ishihara et al.
2005). We have also demonstrated that the expression level of the distinct PsbP
isoforms is differentially affected by the PMMoV infection in Nicotiana
benthamiana (Pérez-Bueno et al. 2004). Analysis of the 2 PsbO isogenes from A.
thaliana revealed that they were not equivalent; the down-regulation of the
expression from every isogene induced that of other PSII proteins and a reduced
activity of this photosynthetic complex (Murakami et al. 2005).
The higher number of PsbP and PsbO spots found in this work compared
with our previous one (Pérez-Bueno et al. 2004), could be explained because in the
earlier work we have used self-made disc gels for the IEF; in the present one we
carried out the first dimension by ready made IPG Strip gels. This technique allows
higher resolution, more reproducible patterns and better focusing of the basic
proteins (Corbett et al. 1994; Gorg et al. 2000). From the 6 and 10 spots detected
for the PsbO and PsbP proteins, respectively, some of them may be the result of
post-transcriptional modifications, because we have found only 4 isogenes
codifying every protein family (Pérez-Bueno 2003). Further analysis of these spots
carried out by electrospray ionization-MS will clarify this point.
The reported decrease due to the viral infection on the levels of PsbP
isoforms (Pérez-Bueno et al. 2004) was not evident in the present acidic 2D maps.
Being the OEC proteins the most prominent ones in this pH range, the PsbO and
Psb P signals were saturated (Fig. 2), because we have loaded a higher amount of
protein in these gels in order to identify minor proteins in the N. benthamiana
chloroplast proteome.

213
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

In the alkaline 2D map (pH 6-11) we detected two spots for the PsbQ protein
(pI 9.4 and 9.5; Fig. 3A, B and Table 1), in accordance with the 2 psbQ isogenes
that we have reported for N. benthamiana (Pérez-Bueno 2003). Two PsbQ
isoforms were identified by 2-DE on chloroplast preparations (Kieselbach et al.
2000, Schubert et al. 2002). However, Peltier et al. (2000) could only detect one
spot in 2D gels from Pisum sativum chloroplasts. The 2D gels in the alkaline pH
range displayed increased levels of the PsbQ proteins in chloroplast from PMMoV-
S infected plants (Fig. 3B). Ifuku et al. (2005a and b) showed that under standard
growth conditions, PsbP protein, but not PsbQ, is indispensable for the normal PSII
function in vivo. In contrast, Yi et al. (2006) found that under stressful low light
conditions, the PsbQ suppression led to a loss of different PSII components,
decrease in PSII quantum yield and disturbances on electron transfer from QA- to
QB. Other authors (Ifuku and Sato 2002, Ifuku et al. 2005a) conclude that PsbQ is
required for optimum PSII function under conditions in which PsbP is impaired.
This could explain why PsbQ are accumulated in PMMoV-S plants, whereas PsbP
expression is diminished.
The different subunits of the CF1 are together with the OEC proteins the
most abundant polypeptides in the acidic pH range (Fig. 1A, B). These data are in
accordance with the 2D-maps from the thylakoid proteome of Arabidopsis thaliana
investigated by Friso et al. (2004). We have found in our gels all subunits of the
CF1 fragment from the ATP synthase. Due to the analogy with Friso et al. (2004)
gels, we propose that proteins with the same Mr close to CF1 α and CF1 β (Fig. 1A)
would be protein trains of these subunits.
We have also identified several high Mr chaperons (Fig. 1, Table 1): the 60
kDa chaperonin collaborating in RuBisCo assembly (Buchanan et al. 2000) and
Hsp70 involved in PSII stress protection (Schroda et al. 2001). The FtsH-like
related to PSII repair (Nixon et al. 2005, Cheregi et al. 2005) and turnover
(Zaltsman et al. 2005a and b) was also present in the 2D gels. Two of the identified
spots in our 2D maps (hypothetical protein and the thylakoid lumenal 16.5 kDa

214
C. Resultados

proteins) have unknown function; the hypothetical protein amount decreased in the
PMMoV-S infected plants.
Comparative analysis of the chloroplastidic proteome from control and
PMMoV-S infected plants revealed that the expression levels of some proteins
implicated in Benson-Calvin cycle, electron transport chain and nitrogen
metabolism decreased during the PMMoV-S infection (Fig. 2).
The proteins involved in the Benson-Calvin cycle affected by the PMMoV
infection are: RbcL, RbcS, Rca, SFBA, SBPase, and PRK. The decrease on the
amounts of both RuBisCO subunits and Rca is in agreement with the diminished
transcript levels of these proteins during pathogenesis (Pérez-Bueno, 2003). The
degradation of the RcL subunit under different stress conditions (UV radiation,
ozone, osmotic, etc.) is for some authors a consequence of oxidative modifications
on this enzyme (Houtz et al. 2003 and references therein). Oxidative stress is
usually induced in infected plants (Foyer and Harbinson 1994, Vranová et al.
2002). The Rca has a dual function, activating the RuBisCO complex, and as a
chaperonin, protecting protein synthesis under stress conditions (Sánchez de
Jiménez et al. 1995, Rokka et al. 2001). SFBA is codified by two genes in
Nicotiana with differential expression levels under salt stress (Yamada et al. 2000).
A similar situation seems to occur in our PMMoV-infected plants. We have
identified three proteins spots corresponding to SFBA, being number 52 the most
affected by the PMMoV-S infection. Probably, the exceeding spot is due to post-
translational modifications. To evaluate the impact of the diminished levels of the
SBPase -one of the key regulatory enzymes of the Benson-Calvin cycle- and PRK
in infected plants, we take as model transgenic plant showing lower expression
levels of both enzymes. Decrease on SBPase amounts induced limitations on CO2
fixation and leaf carbohydrates content (Harrison et al. 1998); diminished PRK
expression could be compensated by the higher activity of the remaining PRK in
the plant (Banks et al. 1999). In general it is well documented that the decline on
the Benson-Calvin enzymes levels induced adverse effects on CO2 fixation,

215
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

carbohydrates accumulation and plant growth (Haake et al. 1998, Raines 2003).
We have also documented (unpublished data, chapter C.3 in this work) a decrease
of the net photosynthesis rate during the infection with PMMoV.
The plastid GS, a key protein in the nitrogen metabolism, is also diminished
in PMMoV-S infected plants. Senescent plants present also decreased protein and
mRNA levels of this enzyme, whereas the cytosolic one is induced (Masclaux-
Daubresse et al. 2005, Teixeira et al. 2005). PMMoV-S infection on Nicotiana
benthamiana shows similarities with senescence processes. In clover (Trifolium
repens L.) senescence induced diminished levels of PsbO, both RuBisCO subunits
and Rca, as well as GS (Wilson et al. 2002). This down-regulation pattern is
similar to that found in symptomless leaves of PMMoV-infected Nicotiana
benthamiana plants for the transcripts of these proteins (Pérez-Bueno 2003), and
confirm that viral infection accelerates senescence processes.
In the 2D maps of the alkaline pH range from Nicotiana benthamiana
chloroplasts appeared some PSI proteins, as the PsaD and PsaE (Fig. 3A, B, Table
1). These highly hydrophilic proteins, together with PsaC, that could be
distinguished in the low pH range gels (Fig. 1A, Table 1), are located on the PSI
stromal side being involved in the ferredoxin-docking (Sétif et al. 2002). PsaD and
PsaE are codified by nuclear genes, existing two isogenes for both of them in
Arabidopsis thaliana (Naver et al. 1999, Ihnatowicz et al. 2004) and Nicotiana spp.
(Obokata et al. 1993, 1994, Yamamoto et al. 1993). In the case of Nicotiana
sylvestris, the two psaE isogenes codify for 4 different polypeptides; however, we
could detect only 2 PsaE spots in N. benthamiana. In N. sylvestris PsaD is also a
protein family with two isoforms (PsaD1 and PsaD2), functionally redundant,
encoded by 2 isogenes. However, we could detect up 8 PsaD spots, whose
expression levels diminished due to the viral infection. Because of the high
homology between PsaD1 and PsaD2 proteins (96/95% similarity/identity,
Ihnatowicz et al. 2004), they could not be distinguished by the MALDI-TOF/TOF
analysis. The psaD genes are differentially expressed during leaf development in

216
C. Resultados

Nicotiana sylvestris (Yamamoto et al. 1993). Arabidopsis PsaD double mutants


showed that this protein is essential for photosynthesis (Ihnatowicz et al. 2004). Its
down-regulation induces both a high non-photochemical quenching and steady
state chlorophyll fluorescence (Haldrup et al. 2003), a similar phenomenon was
observed in our PMMoV-infected plants (Chaerle et al. 2006, Pérez-Bueno et al.
2006). Other proteins from the electron transport chain whose levels are diminished
due to the PMMoV infection are Cyt. f, FRN and some belonging to the light
harvesting complexes from both photosystems. The impact of the PMMoV
infection on the photosynthetic electron transport that we have described in our
previous works (Rahoutei et al. 2000, Pérez Bueno et al. 2004), could be explained
by the down-regulation of proteins involved in this photosynthetic step as well as
in light harvesting.
Other chloroplastidic protein present in the alkaline pH range and affected by
the PMMoV infection is the ribosomal protein L14, a protein from the
chloroplastidic large ribosomal subunit (Tanaka et al. 1986). The significance of its
decrease in PMMoV-S infected plants remains unclear.
The presence of multigene families for different chloroplastidic proteins –
PsbO, PsbP, PsbQ, PsaD, PsaE, SFBA- in Nicotiana benthamiana would allow the
host plant to react in a more flexible way to environmental stimuli and different
stress factors (Koiwa et al. 2002).
The understanding of the chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana, a
promiscuous host for different viral families, is of high interest for the study of the
virus-plant interactions. In spite of the limitations of the 2-DE technique, it was
powerful enough to obtain maps with about 200 polypeptides. Taking into account
that Nicotiana benthamiana genome is not completely sequenced, we could
identify a high number of proteins, similar to that reported in other publications
here cited. The future application of non-gel-proteomics techniques for the study of
the N. benthamiana chloroplastidic proteome, together with the progress in
sequencing the genome of this host plant, will contribute to enlarge an emergent

217
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

investigation field lacking on these types of studies: influence of biotic stress


factors in the photosynthetic apparatus proteome.

Acknowledgements
This research and M.P. contract was supported by grants from the Spanish
Ministry of Science and Education (BIO2004-04968-C02-02, to M.B.) and FEDER
Funds. The authors are very grateful to Drs. Isabel García Luque and Maite Serra
(Centro Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid) for providing all PMMoV
solutions and antibodies against the viral coat protein. In addition, they thank to
J.A. López, E.Camafeita and E. Calvo from the Proteomic Unit of the National
Centre for Cardiovascular Research (Madrid, Spain) for the skilful assistance with
the MALDI/TOF-TOF analysis and protein identification.

References
Alonso, E., García-Luque, I., Avila-Rincón, M.J., Wicke, B., Serra, M.T. and Díaz-Ruiz, J.R. (1989)
A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. J. Phytopathol. 125:
67-76.
Andaluz, S., López-Millán, A.F., De Las Rivas, J., Aro, E.M., Abadía, J. and Abadía, A. (2006)
Proteomic profiles of thylakoid membranes and changes in response to iron deficiency.
Photosynth. Res. 89: 141-155.
Aro, E.M., Soursa, M., Rokka, A., Allahverdiyeva, Y., Paakkarinen, V., Saleem, A., Battchikova, N.
and Rintamaki, E. (2005) Dynamics of photosystem II a proteomic approach to thylakoid
protein complexes.
Bagginsky, S. and Gruissem, W. (2004) Chloroplast proteomics: potentials and challenges. J. Exp.
Bot. 400: 1213-1220.
Banks, F.M., Driscoll, S.P., Parry, M.A.J., Lawlor, D.W., Knight, J.S., Gray, J.C. and Paul, M.J.
(1999) Drecrease in phosphoribulokinase activity by antisense RNA in transgenic tobacco.
Relationship between photosynthesis, growth and allocation at different nitrogen levels. Plant
Physiol. 119: 1125-1136.
Buchanan, B.B., Wilhelm, G. and Jones, R.L. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants.
Buchanan, B.B., Gruissem, W. and Jones, R.L. ed., American Society of Plant Biologist,
Rockville, USA.

218
C. Resultados

Cánovas, F.M., Dumas-Gaudot, E., Recorbet, G., Jorrín, J., Mock, H.-P. and Rossignol, M. (2004)
Plant proteome analysis. Proteomics 4: 285-298.
Chaerle, L., Pineda, M., Romero-Aranda, R., Van Der Straeten, D. and Barón, M. (2006) Robotized
thermal and chlorophyll fluorescence imaging of pepper mild mottle virus infection in
Nicotiana benthamiana. Plant Cell Physiol. 47: 1323-1336.
Cheregi, O., Sicora, C., Kos, P.B., Nixon, P.J. and Vass, I. (2005) The FtsH protease is required for
the repair of photosystem II in the cyanobacterium Synechocystis 6803 damaged by UV-B
radiation. BMC Plant Biology 5: S8. Meeting Abstract.
Ciambella, C., Roepstorff, P., Aro, E.M. and Zolla, L. (2005) A proteomics approach for investigation
of photosynthetic apparatus in plants. Proteomics 5: 746-757.
Corbett, J.M., Dunn, M.J., Posch, A. and Görg, A. (1994). Positional reproducibility of protein spots
in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilized pH gradient
isoelectric focusing in the first dimension: an interlaboratory comparison. Electrophoresis 15:
1205-1211.
Cui, S., Huang, F., Wang, J., Ma, X., Cheng, Y. and Liu, J. (2005) A proteomic analysis of cold stress
responses in rice seedlings. Proteomics 5: 3162-3172.
Curto, M., Camafeita, E., López, J.A., Maldonado, A.M., Rubiables, D. and Jorrín, J.V. (2006) A
proteomic approach to study pea (Pisum sativum) responses to powdery mildew (Erysiphe
pisi). Proteomics 6: S163-S174.
Ferro, M., Salvi, D., Riviére-Rolland, H., Vermat, T., Seigneurin-Berny, D., Grunwald, D., Garin, J.,
Joyard, J. and Rolland, N. (2002) Integral membrane proteins of the chloroplast envelope:
identification and subcellular localization of new transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:
11487-11492.
Foyer, C.H. and Harbinson, J. (1994) Oxygen metabolism and the regulation of photosynthetic
electron transport. In: Causes of photooxidative stress and amelioration of defense system in
plants, Foyer, C.H. and Mullineaux, P.M. eds, 1-42. Boca Raton CRC Press.
Friso, G., Giacomelli, L., Ytterberg, J.A., Peltier, J.B., Rudella, A., Sun, Q. and van Wijk, K.J. (2004)
In-depth analysis of the thylakoid membrane proteome of Arabidopsis thaliana chloroplasts:
new proteins, new functions, and a plastid proteome database. Plant Cell 16: 478-499.
Giacomelli, L., Rudella, A. and van Wijk, K.J. (2006) High light response of the thylakoid proteome
in Arabidopsis wild type and the ascorbate-deficient mutant vtc2-2. A comparative proteomics
study. Plant Physiol. 141: 685-701.
Görg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Harder, A., Scheibe, B., Wildgrupber, R. and Weiss, W. (2000)
The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.
Electrophoresis 21: 1037-1053.

219
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Görlach, J., Schmid, J. and Amrhein, N. (1993) The 33 kDa protein of the oxygen-evolving complex:
a multi-gene family in tomato. Plant Cell Physiol. 34: 479-501.
Haake, V., Zrenner, R., Sonnewald, U. and Stitt, M. (1998) A moderate decrease of plastid aldolase
activity inhibits photosynthesis, alters the levels of sugars and starch, and inhibits growth of
potato plants. Plant J. 14: 147-157.
Haldrup, A., Lunde, C. and Scheller, H.V. (2003) Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D
subunit of photosystem I suffer photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and
altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278: 33276-33283.
Harrison, E.P., Willingham, N.M., Lloyd, J.C. and Raines, C.A. (1998) Reduced sedoheptulosoe-1,7-
bisphosphatase levels in transgenic tobacco lead to decreased photosynthetic capacity and
altered carbohydrate accumulation. Planta 204: 27-36.
Houtz, R.L. and Portis, A.R. Jr. (2003) The life of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase –
Posttranslational facts and mysteries. Arch. Biochem. Biophys. 414: 150-158.
Hua, S.B., Dube, S.K., Barnett, N.M. and Kung, S.D. (1991a) Nucleotide sequence of a cDNA clone
encoding 23 kDa polypeptide of the oxygen-evolving complex of photosystem II in tobacco,
Nicotiana tabacum L. Plant Mol. Biol. 16: 749-750.
Hua, S.B., Dube, S.K., Barnett, N.M. and Kung, S.D. (1991b) Nucleotide sequence of gene oee2-A
and its cDNA encoding 23 kDa polypeptide of the oxygen-evolving complex of photosystem
II in tobacco. Plant Mol. Biol. 17: 551-553.
Hua, S.B., Dube, S.K. and Kung, S.D. (1997) Molecular evolutionary of the pspP gene family of the
photosystem II oxygen-evolving complex in Nicotiana. Genome 36: 483-488.
Huber, C.G., Walcher, W., Timperio, A., Troiani, S., Porceddu A. and Zolla, L. (2004)
Multidimensional proteomic analysis of photosynthetic membrane proteins by liquid
extraction-ultracentrifugation-liquid chromatography-mass spectrometry. Proteomics 4: 3909-
3920.
Ifuku, K. and Sato, F. (2002) A truncated mutant of the extrinsic 23-kDa protein that absolutely
requires the extrinsic 17-kDa protein for Ca2+ retention in photosystem II. Plant Cell Physiol.
43: 1244-1249.
Ifuku, K., Yamamoto, Y., Ono, T., Ishihara, S. and Sato, F. (2005a) PsbP protein, but not PsbQ
protein, is essential for the regulation and stabilization of photosystem II in higher plants.
Plant Physiol. 139: 1175-1184.
Ifuku, K., Yamamoto, Y., Ishihara, S. and Sato, F. (2005b) Down-regulation of psbO, psbP and psbQ
genes in Nicotiana tabacum by RNA interference technique. Plant Cell Physiol. 46: S27-S27.
Ihnatowicz, A., Pesaresi, P., Varotto, C., Richly, E., Schneider, A., Jahns, P., Salamini, F. and Leister,
D. (2004) Mutants for photosystem I subunit D of Arabidopsis thaliana: effects on

220
C. Resultados

photosynthesis, photosystem I stability and expression of nuclear genes for chloroplast


functions. Plant J. 37: 839-852.
Ishihara, S., Yamamoto, Y., Ifuku, K. and Sato, F. (2005) Functional analysis of four members of the
PsbP family in photosystem II in Nicotiana tabacum using differential RANA interference.
Plant Cell Physiol. 46: 1885-1893.
Jones, A.M.E., Bennett, M.H., Mansfield, J.W. and Grant, M. (2006) Analysis of the defence
phosphoproteome of Arabidopsis thaliana using differential mass tagging. Proteomics 6:
4155-4165.
Kieselbach, T., Hagman, a., Andersson, B. and Schröder, P.W. (2000) The thylakoid lumen of
chloroplast. Isolation and characterization. J. Biol. Chem. 273: 6710-6716.
Kleffman, T., Russenberger, D., von Zychlinski, A., Christopher, W., Sjölander, K., Gruissem, W.,
and Baginsky, S. (2004) The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway
abundance and novel protein functions. Curr. Biol. 14: 354-362.
Koiwa, H., Barb, A.W., Xiong, L., Li, F., McCully, M.G., Lee, B., Sokolchik, I., Zhu, J., Gong, Z.,
Reddy, M., Sharkhuu, A., Manabe, Yl., Yokoi, S., Zhu, J.K., Bressan, R.A. and Hasegawa,
P.M. (2002) C-terminal domain phosphatase-like family members (AtCPLs) differentially
regulate Arabidopsis thaliana abiotic stress signalling, growth, and development. Proc. Nat.
Acad. Sci. 99: 10893-10898.
Masclaux-Daubresse, C., Carrayol, E. and Valadier, M.H. (2005) The two nitrogen mobilisation- and
senescence-associated GS1 and GDH genes are controlled by C and N metabolites. Planta
221: 580-588.
Merkle, T.H., Krenz, M., Wenng, A. and Schäfer, E. (1990) Nucleotide sequence and deduced amino
acid sequence of a gene encoding the 23 kDa polypeptide of the oxygen-evolving complex
from mustard (Sinapis alba L.). Plant Mol. Biol. 14: 889-890.
Murakami, R., Ifuku, K., Takabayashi, A., Shikanai, T., Endo, T. and Sato, F. (2005) Functional
dissection of two Arabidopsis PsbO2. FEBS J. 272: 2165-2175.
Naver, H., Haldrup, A. and Scheller, H.V. (1999) Cosuppression of photosystem I subunit PSI-H in
Arabidopsis thaliana. Efficient electron transfer and stability of photosystem I is dependent
upon the PSI-H subunit. J. Biol. Chem. 274: 10784-10789.
Newton, R.P., Brenton, A.G., Smith, C.J. and Dudley, E. (2004) Plant proteome analysis by mass
spectrometry: principles, problems, pitfalls and recent developments. Phytochemistry 65:
1449-1485.
Nixon, P.J., Barker, M., Boehm, M., de Vries, R. and Komenda, J. (2005) FtsH-mediated repair of the
photosystem II complex in response to light stress. J. Exp. Bot. 56: 357-363.

221
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Obokata, J., Mikami, K., Hayashida, N., Nakamura, M. and Sugiera, M. (1993) Molecular
heterogeneity of photosystem I. psaD, psaE, psaF, psaH and psaL are all present in isoforms in
Nicotiana spp. Plant Physiol. 102: 1259-1267.
Obokata, J., Mikami, K., Yamamoto, Y. and Hayashida, N. (1994) Microheterogeneity of PSI-E
subunit of photosystem I in Nicotiana sylvestris. Plant Cell Physiol. 35: 203-209.
Peltier, J.B., Friso, G., Kalume, E.D., Roepstorff, P., Nilsson, F., Adamska, I. and van Wijk, K.J.
(2000) Proteomics of the chloroplasts: systematic identification and targeting analysis of
lumenal and peripheral thylakoid proteins. Plant Cell 12: 319-341.
Peltier, J.B., Emanuelsson, O., Kalume, D.E., Ytterberg, J., Friso, G., Rudella, A., Liberles, D.A.,
Söderberg, L., Roepstorff, P., von Heijne, G. and van Wijk, K.J. (2002) Central functions of
the lumenal and peripheral thylakoid proteome of Arabidopsis determined by experimentation
and genome-wide prediction. Plant Cell 14: 211-236.
Peltier, J.B., Ytterberg, J.A., Sun, Q. and van Wijk, K.J. (2004) New functions of the thylakoid
membrane proteome of Arabidopsis thaliana revealed by a simple, fast, and versatile
fractionation strategy. J. Biol. Chem. 279: 49367-49383.
Pérez-Bueno, M.L. (2003) Photosystem II and viral infection: Analysis of fluorescence imaging and
regulation of the synthesis of the oxygen-evolving-complex proteins during pathogenesis. Ph.
D. Thesis, Granada University, Spain.
Pérez-Bueno, M.L., Rahoutei, J., Sajnani, C., García-Luque, I. and Barón, M. (2004) Proteomic
analysis of the oxygen-evolving complex of photosystem II under biotic stress. Studies on
Nicotiana benthamiana infected with tobamoviruses. Proteomics 4: 418-425.
Pérez-Bueno, M.L., Ciscato, M., vandeVen, M., García-Luque I., Valcke, R. and Barón, M. (2006)
Imaging viral infection. Studies on Nicotiana benthamiana plants infected with the pepper
mild mottle tobamovirus. Photosynth. Res. 90: 111-123.
Phee, B.-K., Cho, J.-H., Park, S., Jung, J.H., Lee, Y.-H., Jeong, J.-S., Bhoo, S.H. and Hahn, T.-R.
(2004) Proteomic analysis of the response of Arabidopsis chloroplast proteins to high light
stress. Proteomics 4: 3560-3568.
Rahoutei, J., García-Luque, I., Cremona, V. and Barón, M. (1998) Effect of tobamovirus infection on
PSII complex of infected plants. In Photosynthesis: from light to biosphere. 4: 2761-2764. G
Garab, ed., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Rahoutei, J., García-Luque, I. and Barón, M. (2000) Inhibition of photosynthesis by viral infection:
Effect on PSII structure and function. Physiol. Plant. 110: 286-292.
Raines, C.A. (2003) The Calvin cycle revisited. Photosynth. Res. 110: 286-292.
Reche, A., Lázaro, J.J., Hermoso, R., Chueca, A. and López Gorgé, J. (1997) Binding and activation
of pea chloroplast fructosa-1,6-biphosphatase by homologous thioredoxins m and f. Physiol.
Plantarum 101: 463-470.

222
C. Resultados

Rokka, A., Zhang, L. and Aro, E.M. (2001) RuBisCo activase: an enzyme with a temperature-
dependent dual function? Plant J. 25: 463-471.
Rose, J.K., Bashir, S., Giovannoni, J.J., Jahn, M.M. and Saravanan, R.S. (2004) Tackling the plant
proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools. Plant J. 39: 715-733.
Rossignol, M. (2001) Analysis of the plant proteome. Curr. Opin. Biotech. 12: 131-134.
Rossignol, M., Peltier, J.-B., Mock, H.-P., Matros, A., Maldonado, A.M. and Jorrín, J.V. (2006) Plant
proteome analysis: A 2004-2006 update. Proteomics 6: 5529-5548.
Sánchez de Jiménez, E., Medrano, L. and Martínez-Barajas, E. (1995) RuBisCo-activase, a possible
new member of the molecular chaperone family. Biochem. 34: 2826-2831.
Schägger, H., Cramer, W.A. and von Jagow, G. (1994) Analysis of molecular masses and oligomeric
states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein
complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217: 220-230.
Schevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of
proteins from silver stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68: 850-858.
Schroda, M., Kropat, J., Oster, U., Rudiger, W., Vallon, O., Wollman, F.A. and Beck, C.F. (2001)
Possible role for molecular chaperones in assembly and repair of photosystem II. Biochem.
Soc. Trans. 29: 413-418.
Schubert, M., Petersson, U.A., Haas, B.J., Funk, C., Schöder, w.P. and Kieselbach, T. (2002)
Proteome map of the chloroplast lumen of Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 277: 8354-
8365.
Schuster, A.M. and Davies, E. (1983) Ribonucleic acid and protein metabolism in pea epicotyls. Plant
Physiol. 73: 809-816.
Sétif, P., Fischer, N., Lagoutte, B., Bottin, H. and Rochaix, J.-D. (2002) The ferredoxin docking site
of photosystem I. Biochim. Biophys. Acta 1555: 204-209.
Steinberg, T.H., Jones, L.J., Haugland, R.P. and Singer, V.L. (1996) SYPRO Orange and SYPRO
Red Protein gel stains: One-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of
nanogram levels of protein. Anal. Biochem. 239: 223-237.
Suckau, D., Resemann, A., Schuerenberg, M., Hufnagel, P., Franzen, J. and Holle, A. (2003) A novel
MALDI LIFT-TOF/TOF mass spectrometer for proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 376: 952-
965.
Takahashi, H., Ehara, Y. and Hirano, H. (1991) A protein in the oxygen-evolving complex in the
chloroplasts is associated with symptom expression on tobacco leaves infected with cucumber
mosaic virus strain Y. Plant Mol. Biol. 16: 689-698.
Tanaka, M., Wakasugi, T., Sugita, M., Shinozaki, K. and Sugiura, M. (1986) Genes for the eight
ribosomal proteins are clustered on the chloroplast genome of tobacco (Nicotiana tabacum):

223
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Similarity to the S10 and spc operons of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
6030-6034.
Teixeira, J., Pereira, S., Cánovas, F. and Salema, R. (2005) Glutamine synthetase of potato (Solanum
tuberosum L. cv. Desiree) plants: cell- and organ-specific roles in nitrogen assimilation and
mobilization. J. Exp. Bot. 56: 663-671.
van Wijk, K.J. (2001) Challenges and prospects of plant proteomics. Plant Physiol. 126: 501-508.
van Wijk, K.J. (2004) Plastid proteomics. Plant Physiol. Biochem. 42: 963-977.
Vranová, E., Inzé, d. and Van Breusegem, F. (2002) Signal transduction during oxidative stress. J.
Exp. Bot. 53: 1227-1236.
Wales, R., Nweman, B.J., Pappin, D. and Gray, J.C. (1989) The extrinsic 33 kDa polypeptide of the
oxygen-evolving complex of photosystem II is a putative calcium-binding protein and is
encoded by a multi-gene family in pea. Plant Mol. Biol. 12: 439-451.
Whitelegge, J.P. (2003) Thylakoid membrane proteomics. Photosynth. Res. 78: 265-277.
Wilson, K.A., McManus, M.T., Gordon, M.E. and Jordan, T.W. (2002) The proteomics of senescence
in leaves of white clover, Trifolium repens L. Proteomics 2: 1114-1122.
Yamada, S., Komori, T., Hashimoto, A., Kuwata, S., Imaseki, H. and Kubo, T. (2000) Differential
expression of plastidic aldolase genes in Nicotiana plants under salt stress. Plant Sci. 54: 61-
69.
Yamamoto, Y., Tsuji, H. and Obokata, J. (1993) Structure and expression of a nuclear gene for the
PSI-D subunit of photosystem I in Nicotiana sylvestris. Plant. Mol. Biol. 22: 985-994.
Yan, J.X., Wait, R., Berkelman, T., Harry, R.A., Westbrook, J.A., Wheeler, C.H. and Dunn, M.J.
(2000) A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with
matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray-mass spectrometry.
Electrophoresis 21: 3666-3672.

224
D. Discusión

D. DISCUSIÓN

El uso combinado e incluso simultáneo de varias técnicas de imagen


(termografía, Chl-FI, MCFI) para el diagnóstico del estrés vegetal permitiría, en el
caso de las interacciones patógeno-planta huésped, la elaboración de catálogos de
estrés basados en las marcas específicas que cada patógeno deja en la planta
huésped, modificando su metabolismo y activando sus mecanismos de defensa.
Esto constituiría una potente herramienta en la diagnosis y cuantificación de
diferentes respuestas a estrés biótico (Chaerle et al. 2004, 2007a). La marca de
actuación de PMMoV en N. benthamiana se encuentra resumida en la tabla 2, que
recoge los resultados de la presente Tesis Doctoral y datos previos de nuestro
grupo (Pérez Bueno 2003, Pérez Bueno et al. 2004, 2006, Sajnani 2005, Sajnani et
al. 2007), obtenidos en colaboración con el de la Dra. García Luque (CIB, CSIC,
Madrid) y otros grupos europeos.

Tabla 2: Marca de actuación de PMMoV-I y PMMoV–S en Nicotiana benthamiana. Los resultados


han sido obtenidos en nuestro laboratorio y en colaboración con el de la Dra. I. García-Luque
(CIB.CSIC. Madrid), mediante diversas aproximaciones experimentales durante el desarrollo de este
trabajo y de otros anteriores. La tabla muestra las diferencias significativas encontradas entre hojas de
las plantas control e infectadas en cada uno de los dpi analizados. En negro, se describe la
sintomatología. Los diferentes colores identifican los resultados obtenidos con cada una de las
técnicas empleadas en nuestros estudios. Rojo: medidas de Chl-FI con el FluorCam; rosa:
inmunodetección de la CP en impronta de hojas; azul oscuro: medidas de MCFI; púrpura: detección
por Northern Blot de mRNAs de proteínas cloroplastídicas (Pérez-Bueno 2003); marrón: análisis de
TL en hoja (Sajnani 2005, Sajnani et al. 2007); amarillo: detección por HPLC de compuestos
fenólicos emisores de BGF; verde claro: medidas de concentración de Chl; verde oscuro: medidas de
Chl-FI y termografía de imagen mediante un sistema de imagen robotizado; naranja: determinación
del patrón proteico cloroplastídico mediante electroforesis 2D (el rango de pH 4-7 es obra de Pérez-
Bueno et al. 2004 y Sajnani 2005); gris: estudios de apertura estomática en impresiones epidérmicas;
azul claro: determinación de parámetros de intercambio gaseoso con IRGA. AS: hojas asintomáticas;
S: hojas sintomáticas. * No hay ensayos de Northern Blot entre 14 y 21 dpi. mRNAs: CP, proteína de
la cápside viral; gox, glicolato oxidasa; lhcb1, proteína de unión a clorofila a/b tipo I del PSII; psaK,
subunidad K del PSI; psbA, proteína D1 del PSII; psbO, psbP, psbQ, proteínas del OEC (33, 24 y 16
kDa, respectivamente); rbcL, subunidad grande de la RuBisCO; rbcS, subunidad pequeña de la
RuBisCO rca, RuBisCO activasa. AB: abaxial; AD: adaxial; F440: fluorescencia azul; F520:
fluorescencia verde; F690: fluorescencia roja; F740: fluorescencia en el rojo lejano. HL: alta
intensidad lumínica (200 µmol·m-2·s-1). AG: banda afterglow; B: banda B; C: banda C; HTL: bandas
de termoluminiscencia a altas temperaturas. Chl: clorofila. gs: conductancia estomática.

225
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

PMMoV-I PMMoV-S
dpi AS S AS S
Infección detectada por Presecia del virus en la
4 “selección de base
características”
F690 cara AB F520 cara AD Curvamiento
F440/F690 cara AD Hoja completa con virus
5
F520 cara AB
F690 cara AB
Infección detectada por Curvamiento
6 “selección de Hoja completa con virus
características”
F690 cara AD Curvamiento Temperatura en la  Ácido clorogénico
F740 ambas caras F690 cara AD zona de venas F440 ambas caras
F440/F690 cara AB F740 cara AD mRNA: psaK, rca, F520 cara AD
F440/F740 cara AD F440/F690 cara AD gox F690 cara AD
mRNA CP detectado mRNA CP detectado Desplazamiento leve F740 ambas caras
mRNA: psaK, gox mRNA: lhcb1, rca, banda AG hacia F440/F690 ambas
rbcS, psaK, gox, rbcL y mayores temperaturas caras
psbA Aparición banda HTL2 F440/F740 ambas
 Proporción AG/B caras
7 Desplazamiento banda  F690/F740 cara AD
AG hacia mayores Chl
temperaturas mRNA CP detectado
mRNA: lhcb1, rca,
rbcS, psaK, gox, rbcL y
psbA
proporción AG/B
Desplazamiento banda
AG hacia mayores
temperaturas
Alteración patrón F5/F0 Alteración patrón F5/F0
9
en régimen de HL en régimen de HL
Temperatura en la F440 ambas caras F440 cara AB F690/F740 cara AB
zona de venas F520 cara AB F520 cara AB
F440/F740 cara AB F690 cara AB
10 F740 cara AB
F440/F690 cara AB
F440/F740 ambas caras
F690/F740 cara AB
F440 cara AB F690/F740 cara AD F440/F520 cara AB
12 F520 cara AB F440/F690 cara AB
F690/F740 cara AD

226
D. Discusión

PMMoV-I PMMoV-S
dpi AS S AS S
Enanismo planta Temperatura en hoja Enanismo planta Temperatura en hoja
completa completa completa completa
 Chl  Ácido clorogénico Patrón Chl-F alterado Chl
F440/F520 cara AB F520 cara AD  Chl  mRNA: psbO, psbP,
CP no detectada en  mRNA: psbO, psbP, F440/F740 ambas psbQ
geles 2D psbQ caras Banda C
proteínas (mezcla hoja Banda C Presecia del virus en la Banda HTL2
ASIN +SIN): 18-20, 29, base
30, 32, 34-37, 42-50 CP detectada en geles
 mRNA: lhcb1, rbcS, 2D
rca, psbO, psbP, psbQ proteínas: 7-15, 18-
Desplazamiento bandas 20, 28-30, 34-37, 42-54,
AG y B hacia mayores 57-67, 69
14 temperaturas  o aparecen proteínas
 Proporción AG/B (mezcla hoja ASIN
Banda C +SIN):
16, 21, 32, 65, 66, 70,
71
mRNA CP detectado
mRNA: lhcb1, rbcS,
psbO, psbP, psbQ
Desplazamiento
significativo bandas AG
y B hacia mayores
temperaturas
 proporción AG/B
banda C
16  apertura estomática  apertura estomática  apertura estomática  apertura estomática

Patrón Chl-F alterado Temperatura en hoja F440/F520 cara AD


Presencia del virus en la completa F690/F740 cara AD
base F740 cara AB
Chl F440/F520 cara AD
F440/F520 cara AD F690/F740 cara AB
17
Alteración patrón Chl
NPQ20 Alteración patrón
NPQ20
Alteración patrón ΦPSII2
tasa fotosíntesis
 gs  gs  gs
19
tasa fotosíntesis  FV/FM
Temperatura en hoja Inicio fase recuperación:  mRNA: psbA, rbcL
completa hojas sin curvar y
mRNA CP detectado* crecimiento en altura
 mRNA: psbA, rbcL Temperatura de la hoja
21  FV/FM similar al control
Chl
Niveles de ácido
clorogénico similares al
control
F440/F520 cara AD Fase de recuperación mRNA: psbO, psbP, mRNA: psbO, psbP,
F690/F740 cara AD completa psbQ, lhcb1, rbcS, psaK, psbQ, lhcb1, rbcS, psaK,
mRNA: rbcL, psbA Chl equivalente a la del psbA prácticamente psbA prácticamente
28 control indetectables indetectables
mRNA: lhcb1, rca,
rbcS, psaK, gox, rbcL,
psbA, psbO, psbP, psbQ

227
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Las diferentes técnicas de imagen empleadas en este trabajo para el análisis


de la interacción compatible Nicotiana benthamiana-PMMoV han revestido
especial importancia para el seguimiento de las hojas AS (no desarrollan síntomas
visibles) a lo largo de la infección. Cambios en parámetros termográficos o de
fluorescencia en estas hojas de plantas infectadas anteceden a la detección del virus
en las mismas y manifestarían, en ocasiones, posibles respuestas defensivas de la
planta. Los patrones espaciales que adoptan estos parámetros en momentos
cruciales de la infección podrían asimismo ser reflejo del movimiento viral en la
planta huésped.
La situación en las hojas S, que desarrollan los primeros síntomas visibles
(curvamiento) a 5-7 dpi, es más compleja ya que los cambios en los parámetros
analizados por termografía, Chl-FI o MCFI en las plantas de N. benthamiana
infectadas con PMMoV ocurren al mismo tiempo o con posterioridad al desarrollo
de la sintomatología.
Las primeras diferencias entre plantas de N. benthamiana control e
infectadas con PMMoV, se han logrado detectar a 4 dpi para la infección con
PMMoV-S y a 6 dpi para PMMoV-I (Tabla 2), tras el registro de las cinéticas de
Chl-F con el FluorCam y la búsqueda mediante métodos estadísticos avanzados
como la “selección de características” (feature selection, A.2.3.3) de imágenes que
ofrezcan un alto contraste entre las plantas sanas y las infectadas, usando nuevos
algoritmos. Dichos cambios se registraron en plantas sin síntomas visibles de la
infección y en hojas AS (Fig. 7, sección C.3) en las que aún no se había detectado
el virus (Fig. 7, sección C.1). La “selección de características” ya había sido
empleada con éxito en el estudio de plantas de Arabidopsis infectadas con
Pseudomonas syringae, siendo capaz de detectar la infección con anterioridad a los
parámetros tradicionales de Chl-F (Berger et al. 2007, Matouš et al. 2007). Sin
embargo, su principal desventaja respecto a éstos es que las imágenes obtenidas no
representan ningún parámetro que refleje cambios fisiológicos en las plantas
analizadas.

228
D. Discusión

Ateniéndonos a esta limitación, podríamos decir que la medida de BGF


realizada con el equipo de MCFI diseñado en la Universidad ELTE de Budapest ha
sido realmente la técnica más precoz a la hora de detectar cambios en las plantas de
N. benthamiana infectadas con PMMoV. A 5 dpi se registra un aumento de F520
tanto en la hoja AS como en la S en las plantas infectadas con PMMoV-S,
ocurriendo de forma más temprana que en las inoculadas con PMMoV-I (7 dpi),
como corresponde a la sintomatología y a la menor virulencia de dicha cepa
(Rahoutei et al. 2000). El incremento de BGF en las hojas S de las plantas
infectadas es mucho más acentuado que en hojas AS. Los cambios en BGF
suceden, por regla general, de una forma más acentuada en la cara AB de las hojas
analizadas (Fig. 1-5, sección C.2).
La medida de BGF aporta información sobre el metabolismo secundario de
las plantas, ya que son los compuestos derivados de la ruta del shikimato los
implicados en esta emisión (Buschmann y Lichtenthaler 1998, Cerovic 1999). Si
las medidas se realizan, como en nuestro caso, en aparatos de MCFI que permiten
detectar también la emisión de Chl-F, analizaríamos en paralelo los procesos
fotosintéticos primarios. La capacidad de obtener imágenes de dichas emisiones de
fluorescencia y de los diferentes cocientes entre ellas, abre la posibilidad de
visualizar espacialmente los efectos causados tanto por factores de estrés abióticos
como bióticos en el vegetal (Lang et al. 1996, Lichtenthaler et al. 1996,
Lichtenthaler y Miehé 1997). Pese a ello, y a diferencia de las de Chl-FI, las
medidas de BGF -puntuales o de imagen- han sido usadas en escasas ocasiones en
el seguimiento de la infección por patógenos (Niemann et al. 1991, Buschmann y
Lichtenthaler 1998, Szigeti 2002, Sajnani 2005, Swarbrick et al. 2006). En el caso
de la infección por virus, el único trabajo sobre MCFI publicado hasta la fecha
corresponde a Chaerle et al. (2007b), que detectaron un aumento de BGF durante la
HR provocada por TMV en tabaco resistente, atribuyéndola a un aumento de
escopoletina. La carencia de información sobre la infección sistémica en este

229
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

campo, hace aún más valiosos nuestros datos obtenidos durante la infección por
PMMoV en N. benthamiana.
Los cambios en BGF suceden de forma más acentuada en la cara AB de las
hojas (Fig. 1-5, sección C.2), así que en general son recomendables las medidas en
el envés de la hoja para la detección del estrés biótico. La diferencia en la emisión
de fluorescencia de la cara AD y AB incluso en una hoja sana está relacionada con
la diferente anatomía y contenido de Chl de ambas caras de la hoja. Las hojas de
plantas dicotiledóneas como N. benthamiana son bifaciales (Fig. 8A), lo que
supone que la luz de medida puede penetrar mejor en la cara AB debido al menor
empaquetamiento del parénquima lagunar y lograr una mayor eficiencia de
excitación (A.2.2.1, Sajnani 2005). Asimismo, el contenido de Chl de la cara AD
es mayor (Cerovic et al. 2002 y referencias incluidas), como lo demuestran
nuestros datos del cociente F690/F740 (Fig. 4 y 5, sección C.2), que es
inversamente proporcional al contenido de Chl de las hojas (Lichtenthaler et al
1986, Stober y Lichtenthaler 1992, Babani y Lichtenthaler 1996, Gitelson et al.
1998, 1999, Buschmann et al. 2000); la mayor cantidad de Chl de la cara AD
reabsorbe la BGF emitida por la propia hoja con mayor eficiencia que en la cara
AB (Buschmann y Lichtenthaler 1998, Cerovic et al. 1999).
Aunque el incremento en BGF inducido por la infección viral afecta a toda la
hoja AS, las imágenes obtenidas en plantas infectadas muestran un característico
patrón espacial a 17 dpi, registrando las venas principales de la hoja los mayores
niveles de BGF (Fig. 2, 3, sección C.2). El incremento de BGF en el resto de la
hoja es mayor en el caso de F520 que en el de F440, probablemente por una
acumulación de compuestos que fluorescen en el verde bajo estreses que actúan a
largo plazo (Buschmann y Lichtenthaler 1998) y que hasta el momento no hemos
identificado debido a la presencia mayoritaria de ácido clorogénico, como veremos
más adelante; además F520 es reabsorbida por otros pigmentos fotosintéticos con
menor eficacia que F440 (Lichtenthaler et al. 1996). Las hojas S presentan también
un patrón similar de BGF aunque peor definido, con altos valores de esta emisión

230
D. Discusión

en la zona de venas. La aparición de este tipo de patrón en ambos tipos de hojas se


ve favorecida por el hecho de que, a diferencia de la Chl-F, la BGF es más alta en
la zona vascular de la hoja incluso en plantas no estresadas, debido a un menor
contenido de Chl de las venas que evita la reabsorción de la fluorescencia emitida
(Lichtenthaler et al. 1996). Naturalmente, el contraste entre zona vascular y el resto
del limbo foliar respecto a emisión de BGF, es mucho mayor en las hojas de
plantas infectadas que en las sanas (Fig. 2, sección C.2).
La tabla 2 nos muestra también que los cocientes entre las distintas
emisiones de fluorescencia medidas con el equipo de MCFI son buenos indicadores
de la infección viral, a partir de 5 y 7 dpi (PMMoV-I y –S, respectivamente), tanto
en hoja AS como S (Fig. 4, 5, sección C.2). De entre todos los cocientes
estudiados, F440/F520 fue el más tardío en revelar la infección viral, de acuerdo
con datos previos que afirman que es un indicador de estrés a largo plazo
(Buschmann y Lichtenthaler 1998). F440/F690 y F440/F740 se consideran
indicadores tempranos de estrés (Schweiger et al. 1996, Buschmann y
Lichtenthaler 1998), aumentando en hojas de col china infectadas con el virus del
mosaico amarillo del nabo (Zsigeti et al. 2002); en nuestro caso, F440/F690 es el
más precoz de ambos. Los dos cocientes aumentan durante de la infección viral, y
en el caso de las plantas control lo hacen con la edad de la planta, debido al
progresivo aumento de la BGF y al descenso de la fluorescencia emitida por la Chl
(Fig. 1, sección C.2). El hecho de que este aumento sea también apreciable en la
cara AD de las hojas, hace que estos cocientes sean especialmente útiles a la hora
de aplicar esta técnica en campo, donde normalmente se mide esta cara de la hoja y
no la AB. Esto, junto con la capacidad de distinguir entre dos cepas de un mismo
virus, estableciendo que la magnitud de los cambios en los parámetros medidos es
acorde con la virulencia de los mismos, incluyendo la fase de recuperación que
sólo presentan las plantas infectadas con PMMoV-I, hacen de la MCFI una técnica
muy prometedora para caracterizar los cambios que la infección sistémica ocasiona
en el metabolismo fotosintético y secundario de las plantas infectadas.

231
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Paralelamente a las medidas de MCFI, hemos registrado mediante HPLC un


aumento de los niveles de un ácido hidroxicinámico que podría ser el principal
responsable de la emisión de BGF: el ácido clorogénico (Fig. 6, sección C.2). Los
niveles de este compuesto, mayoritario en plantas de tabaco (Takahama 1998,
Ounis et al. 2001, Cerovic et al. 2002) y alcachofa (Morales et al. 2005),
aumentaron en las hojas AS (no se muestra) y S de plantas infectadas comparadas
con sus respectivos controles. La concentración de ácido clorogénico aumenta con
la edad de la hoja debido a la continua exposición a la luz (Takahama 1998,
Cerovic et al. 1999, 2002, Ounis et al. 2001), lo que podría originar el incremento
de BGF en las hojas AS de plantas control a partir de 21 dpi (Fig. 1, 2, sección
C.2). Los niveles de ácido clorogénico en las hojas S de las plantas infectadas se
corresponden con el incremento de BGF registrado en las mismas y con la
virulencia de la cepa viral empleada, mostrando un mayor contenido de este
compuesto fenólico las plantas infectadas con PMMoV-S. A su vez, las hojas S de
las plantas infectadas con PMMoV-I muestran un descenso de ácido clorogénico (y
consecuentemente, una tendencia a la baja de BGF) a partir de 21 dpi, lo que
corresponde a la fase de recuperación de los síntomas, a pesar de que el virus sigue
presente en dichas hojas (Fig. 7, sección C.1). La mayor concentración de ácido
clorogénico en las plantas infectadas confirma resultados previos de nuestro grupo
(Sajnani 2005), en los que las características de los espectros de excitación por UV
de discos de hojas de N. benthamiana se corresponden con las del espectro del
ácido clorogénico puro. Sin embargo, la detección de este ácido en la hoja no
excluye la presencia de otros polifenoles minoritarios que también podrían
contribuir a la BGF.
A los cambios durante la infección viral detectados en la emisión de BGF en
plantas infectadas, les siguen los que afectan al patrón termal de la hoja, que
incrementa su temperatura (Tabla 2). Las primeras hojas afectadas son las AS de
las plantas infectadas con PMMoV-S (7 dpi); la respuesta a PMMoV-I es idéntica,
pero está retrasada 3 días (10 dpi; Tabla 1, sección C.1). El aumento de

232
D. Discusión

temperatura comenzó en la zona adyacente a las venas principales, para luego


expandirse progresivamente, hasta que toda la hoja mostró una mayor temperatura
que el control a 17 y 22 dpi (PMMoV-S e –I, respectivamente; Fig. 1 y 2, sección
C.1). El control registró un aumento de temperatura a partir de 22 dpi (Fig. 1,
sección C.1), que sin embargo fue homogéneo y no progresivo (Fig. 2, sección
C.1), probablemente por el comienzo de la fase de senescencia de la hoja
equivalente a la AS. A ello apuntan el menor contenido de Chl de las hojas con
respecto a días anteriores (Fig. 6A, sección C.1), la disminución de la conductancia
estomática de estas hojas (Fig. 3C, sección C.1) que puede ser indicativa de un
envejecimiento del aparato estomático (Wardle y Short 1983, Willmer et al. 1988)
y la reducción de la tasa de fotosíntesis neta (A) con respecto a días anteriores (Fig.
2, sección C.3). El valor medio de temperatura de la hoja AS completa de las
plantas infectadas no mostró diferencias significativas con respecto al control (Fig.
3A, sección C.1), lo que muestra el mayor poder resolutivo de las imágenes y la
enorme utilidad de la termografía de imagen en el seguimiento de la infección por
PMMoV en N. benthamiana.
Al contrario que en las hojas AS, el incremento de temperatura en la hoja S
de las plantas infectadas fue homogéneo y tuvo lugar a partir de los 14 dpi (Fig.
3B, 4, sección C.1), detectándose tanto en imágenes como en los valores de
temperatura medios de la hoja completa.
La temperatura de las hojas está asociada a la transpiración de las mismas y,
por tanto, a la conductancia estomática (Fuchs y Tanner 1966, Jones 1998), lo que
ha sido confirmado por diversos autores empleando: porómetros o IRGAs (Chaerle
et al. 1999, 2001), peelings o impresiones epidérmicas (Boccara et al. 2001),
además de una combinación de ambas técnicas (Lindenthal et al. 2005, Oerke et al.
2006), como ha sido nuestro caso. El número de estomas o su grado de apertura
pueden también determinar la temperatura de las hojas (Jones 1998). Las
impresiones epidérmicas mostraron que el número de estomas de las hojas AS y S
de plantas infectadas es el mismo que el de sus respectivos controles (Fig. 5,

233
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

sección C.1, anexo 1); sin embargo, el grado de apertura de los estomas a 16 dpi
era menor en las plantas infectadas. Por tanto, el cierre estomático estaría
provocando el incremento de temperatura, lo que fue confirmado mediante las
mediciones realizadas con el IRGA (Fig. 3C, 3D, sección C.1). Otros estudios
empleando diferentes sistemas virus-planta huésped ya habían demostrado una
reducción de la conductancia estomática del vegetal (Levy y Marco 1991, Sampol
et al. 2003, Bertamini et al. 2004, Zhou et al. 2004, Guo et al. 2005a y b). Sin
embargo, el IRGA detectó el cierre estomático más tarde que la termografía de
imagen, a partir de 19 dpi en hojas S y en la hoja AS de las plantas infectadas con
PMMoV-S, o incluso no lo detecta, como es el caso de la hoja AS de las plantas
infectadas con PMMoV-I (Fig. 3C, 3D, sección C.1). La aparente falta de
sensibilidad del IRGA podría deberse a que, durante la medida, la pinza se situó en
el extremo apical de la hoja, donde el incremento de temperatura tiene lugar más
tarde que en las zonas centrales (Fig. 1, sección C.1). Ya que este aparato no puede
revelar patrones espaciales de transpiración, la termografía de imagen resulta más
resolutiva que otras técnicas equivalentes, y podemos afirmar con Jones (1999) que
posee suficiente resolución espacial como para proporcionar información sobre la
variabilidad de la conductancia estomática a lo largo de la superficie de una hoja.
Para tratar de correlacionar el movimiento del virus en las hojas AS con el
efecto térmico, se realizaron impresiones de hojas donde la proteína de la cápside
viral fue detectada con un anticuerpo específico. Los resultados mostraron que el
virus comienza a penetrar en las hojas AS con posterioridad al aumento de
temperatura (14 y 17 dpi, en plantas infectadas con PMMoV-S e –I,
respectivamente; Fig. 7, Tabla 1, sección C.1), de acuerdo con resultados previos
de Northern Blot (Pérez-Bueno 2003).
Respecto al agente directo causante del cierre estomático durante la infección
viral, está bien documentada la acumulación de varias sustancias que afectan la
apertura estomática durante las interacciones planta-patógeno: ácido salicílico
(Malamy et al. 1990, Van Der Straeten et al. 1995, Chaerle et al.1999), óxido

234
D. Discusión

nítrico (Del Río et al. 2004, Mur et al. 2005), las hormonas vegetales ABA y
auxina (Whenham y Fraser 1981, Whenham et al. 1986, Grabov y Blatt 1998) y
hasta compuestos fenólicos (Bhatia et al. 1986, Nicholson y Hammerschmidt 1992,
Kofalvi y Nassuth 1995, Chaerle et al. 2001, Balogun y Teraoka 2004). Al ácido
clorogénico se le atribuye la propiedad de inhibir la apertura estomática (Plumbe y
Willmer 1986) y la de cerrar los estomas (Einhellig y Kuan 1971). Sin embargo, el
aumento de BGF en las hojas AS y S no correlaciona temporalmente con el
aumento de temperatura de las mismas (Tabla 1, C.1 y C.2), ni el patrón de BGF
(Fig. 2 y 3, sección C.2) con el efecto expansivo del aumento de temperatura en la
hoja AS (Fig. 1 y 2, sección C.1). Por tanto, la subida de temperatura no parece ser
consecuencia directa de la acumulación de fenoles, si bien éstos, una vez presentes
en las hojas, podrían contribuir al descenso de la conductancia estomática. La
sustancia causante del cierre estomático y/o de la acumulación de ácido
clorogénico está aún por determinar.
Más tardíos que los cambios en el patrón termal de las hojas de plantas
infectadas son los que afectan a la emisión de Chl-F, que aparecen a 9 dpi en la
hoja AS. Se detectan registrando la curva de Kautsky con el FluorCam a bajas (LL,
50 µmol m-2 s-1) y altas (HL, 200 µmol m-2 s-1) intensidades de luz actínica. Tras
aplicar estudios estadísticos a las cinéticas de inducción de Chl-F (Fig. 5, C.3), se
encontró un parámetro que evidenciaba diferencias entre las hojas AS de las
plantas infectadas con ambas cepas virales y sus respectivos controles en medidas
realizadas a HL, mucho antes que con los protocolos tradicionales (17 dpi; Pérez-
Bueno et al. 2006, Fig. 1, sección C.3, Tabla 2). Este parámetro es la emisión de
Chl-F a los 5 s de la cinética de inducción de fluorescencia (es decir, tras el
encendido de la luz actínica), con respecto a la fluorescencia basal o F0 (F5/F0). Las
imágenes del mismo evidencian un patrón asociado a venas característico de
plantas infectadas que no se vislumbra en las hojas correspondientes de las plantas
control (Fig. 6, sección C.3). El cambio en la emisión de Chl-F a los 5 s de la
cinética con respecto a los controles, ocurre en torno al pico de emisión de

235
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

fluorescencia que tiene lugar cuando se induce el ciclo de Benson-Calvin (Ireland


et al. 1984), lo que reflejaría algún tipo de perturbación en este proceso durante la
patogénesis, como discutiremos posteriormente.
Si avanzamos en la infección (14 dpi) los cambios ocurridos a nivel
fisiológico son claros tanto en hoja S como AS y se ponen de manifiesto con el
amplio rango de técnicas utilizadas por nuestro grupo. En este momento, la
inhibición del crecimiento en plantas infectadas es evidente, con un efecto más
drástico en las inoculadas con PMMoV-S. En estas últimas se detecta además la
llegada del virus en las improntas de hojas (Fig. 7, sección C.1), los geles 2D de
preparaciones cloroplastídicas (Fig. 1, 2, sección C.4) y en los ensayos previos de
Northern Blot (Pérez-Bueno 2003). A 14 dpi, las imágenes de Chl-FI de hojas AS
de plantas infectadas con PMMoV-S captadas con el sistema robotizado del
laboratorio de la Dra. Van Der Straeten (Fig. 1, sección C.1), y a 17 dpi con el
FluorCam (no se muestran) y el sistema de MCFI (Fig. 2, sección C.2), exhiben un
patrón espacial en el que las venas principales presentan una diferente emisión de
Chl-F que el resto de la hoja; en etapas más tardías, el patrón en torno a venas se
expande a las zonas circundantes, mostrando el tejido intervenal una menor
emisión de Chl-F. Este patrón espacial puede correlacionarse con el avance del
virus en la hoja (Fig. 1, 7, sección C.1), como también ocurre con el patrón de NPQ
estudiado en trabajos anteriores de nuestro grupo (Pérez-Bueno et al. 2006) y en el
presente (Fig. 1, sección C.3). En el caso de la hoja AS de las plantas infectadas
con PMMoV-I, tiene lugar el mismo fenómeno de alteración del Chl-FI de la hoja
asociado al movimiento viral (Fig. 1, sección C.1) a 17 dpi, cuando ya el virus es
detectable en esa hoja (Fig. 7, sección C.1). En todos estos ensayos la Chl-FI
aparece como una potente herramienta para determinar el avance del virus en
tejidos que permanecen asintomáticos.
El incremento en Chl-F en las zonas de avance viral de la hoja AS de las
plantas infectadas podría atribuirse a una inhibición del transporte electrónico
fotosintético en el PSII, ya que en ensayos anteriores hemos descrito daños en el

236
D. Discusión

OEC por los tobamovirus objeto de este estudio, debidos a perturbaciones en la


transcripción de los genes codificadores de las proteínas de este complejo
(Rahoutei et al. 1999, 2000, Pérez-Bueno 2003, Pérez-Bueno et al. 2004). Las
medidas puntuales realizadas con el PAM sobre el mismo sistema huésped-parásito
indicaron que el número de CR abiertos disminuye durante la patogénesis
(Rahoutei et al. 2000); un mayor número de CR cerrados podría ser el responsable
del incremento de emisión de Chl-F. También se ha detectado una disminución de
la eficiencia del transporte electrónico en el PSII durante la infección con otros
tobamovirus (van Kooten et al. 1990, Balachandran y Osmond 1994, Balachandran
et al. 1994; Balachandran 1997 y referencias incluídas), así como con virus
pertenecientes a otras familias (Bertamini et al. 2004).
A 14 dpi, también son patentes cambios en el proteoma cloroplastídico de las
plantas de N. benthamiana infectadas con PMMoV al compararlo con el de sus
controles. Si se analiza el rango de pH 4-7 en geles de electroforesis proteica 2D,
es evidente que la infección induce un descenso en al menos 26 polipéptidos
pertenecientes a 13 proteínas diferentes; la mayoría de ellas pertenecen al ciclo de
Benson-Calvin y a la cadena de transporte electrónico fotosintético (Fig. 1 y 2,
sección C.4; Sajnani 2005). Como era de esperar, PMMoV-S induce las mayores
alteraciones.
Si nos atenemos al rango de pH 6-11, del que solamente tenemos datos
correspondientes a la infección por PMMoV-S, conseguimos visualizar en geles
2D, 53 manchas (Fig. 3A, 3B, sección C.4), de las cuales resultaron proteínas de
interés 21 (Tabla 1, sección C.4). Cinco de ellas eran proteínas cloroplastídicas que
ya aparecían en los geles de rango ácido realizados por Sajnani (2005), debido al
solapamiento de ambos rangos en una unidad de pH (6-7). Nos referimos a PsbP
(número 16), citocromo f (número 18), la subunidad γ de la ATP sintasa (número
21), una proteína de unión a clorofila del PSI (Lcha, número 32) y la subunidad
grande de la RuBisCO (RbcL, número 36). No hemos analizado en los geles de
rango de pH 6-11 el comportamiento durante la infección de estas proteínas, ya que

237
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

en esta ocasión no están resueltas de forma óptima (Fig. 1, 3, sección C.4) y


además este análisis ya se realizó por Sajnani (2005). Por tanto, los geles del rango
4-7 son más fidedignos resolviendo proteínas en torno a pH 6, por lo que el análisis
de la expresión proteica en los geles de rango básico sólo es fiable a partir de pH 7.
De esta manera, el total de nuevas proteínas pertenecientes al proteoma
cloroplastídico era de 16 (Tabla 1, sección C.4), 15 de ellas correspondientes a la
cadena de transporte electrónico fotosintético, y una proteína ribosomal.
De las proteínas implicadas en el transporte electrónico fotosintético, hemos
encontrado polipéptidos que forman parte del PSI (PsaD y PsaE), del OEC (PsbQ),
del complejo citocromo b6/f (citocromo f), de la ATP sintasa (subunidad α de la
porción catalítica o CF1) y de la antena del PSII (Lhcb).

Fig. 29: La cadena de transporte electrónico fotosintético formada por los cuatro macrocomplejos
proteicos embebidos en la membrana tilacoidal del cloroplasto: PSII, Cyt b6/f y la ATP sintasa.

Las proteínas del PSI localizadas en los geles de rango básico, PsaD y PsaE
(8 y 2 polipéptidos, respectivamente), son altamente hidrofóbicas y localizadas en
el lado estromático de este fotosistema junto con PsaC, que aparecía en los geles
del rango ácido. Todas ellas forman el complejo encargado del anclaje de la

238
D. Discusión

ferredoxina (Fig. 29), uno de los miembros de la cadena transportadora de


electrones fotosintética (Fromme et al. 2001, Scheller et al. 2001, Sétif et al. 2002,
Jensen et al. 2003). PsaD y PsaE están codificadas por genes nucleares, existiendo
dos isogenes en Arabidopsis thaliana (Naver et al. 1999, Ihnatowicz et al. 2004) y
Nicotiana spp. (Obokata et al. 1993, 1994, Yamamoto et al. 1993) para cada una de
ellas. Los 2 isogenes de la proteína PsaE de N. sylvestris codifican 4 isoproteínas
diferentes, mientras que en nuestros geles tan sólo hemos detectado 2 manchas. Las
isoformas de PsaD son dos, una por cada isogen codificante, que se expresan de
forma diferencial durante el desarrollo de la hoja de N. sylvestris (Yamamoto et al.
1993); ambas isoformas son funcionalmente redundantes, lo que permitiría a la
célula vegetal reaccionar más flexiblemente ante los estímulos ambientales, al tener
más de una copia disponible del mismo gen. En nuestro caso, pudimos detectar
hasta 8 manchas diferentes de esta proteína que, dada la alta homología existente
entre estas proteínas (96/95% similitud/identidad, Ihnatowicz et al. 2004), no
hemos podido asociar a gen alguno.
Debido a la infección con PMMoV-S, la expresión de las 8 proteínas
correspondientes a PsaD disminuye (Fig. 3A y B, sección C.4). Los dobles
mutantes de Arabidopsis para los genes psaD, demuestran que esta proteína es
esencial para la fotosíntesis (Ihnatowicz et al. 2004) y además es conocido que los
bajos niveles de expresión de la proteína PsaD producen descensos similares en
otras subunidades del PSI y dan lugar a un incremento del NPQ y de la emisión de
Chl-F en el estado estacionario (Haldrup et al. 2003). Altos niveles de estos
parámetros de fluorescencia han sido detectados en este estudio (Fig. 1, sección
C.1; Fig. 1, sección C.3) y en otros previos de nuestro grupo (Pérez-Bueno et al.
2006). El descenso en los niveles de PsaD podría así contribuir a la inhibición del
transporte electrónico que detectamos en nuestras plantas infectadas.
Pese a la disminución de los niveles de PsaD, el descenso del contenido de la
subunidad PsaE en las plantas infectadas, en nuestro caso, es muy pequeño o no
tiene lugar, dependiendo de la muestra analizada.

239
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Otra de las proteínas que encontramos en los geles de rango básico es la


proteína del OEC PsbQ. Hasta el momento, dos isoformas de esta proteína han sido
identificadas mediante electroforesis 2D en preparaciones del lumen tilacoidal de
Arabidopsis thaliana (Kiesselbach et al. 2000, Schubert et al. 2002). Sin embargo,
Peltier et al. (2002) sólo han podido identificar en el correspondiente proteoma de
guisante una única forma de PsbQ. En nuestros geles en el rango de pH 6-11 hemos
sido capaces de detectar dos isoformas de esta proteína (Fig. 3, sección C.4), de
acuerdo con los resultados previos de nuestro grupo, ya que Pérez-Bueno (2003)
identificó dos genes codificadores de PsbQ en N. benthamiana. La expresión de
PsbQ está regulada al alza en plantas de N. benthamiana infectadas con PMMoV-S
(Fig. 3A, 3B, sección C.4). En nuestros trabajos previos Rahoutei et al. (2000)
detectaron un descenso en los niveles de esta proteína en membranas tilacoidales
aisladas de plantas infectadas con PMMoV, cuando se comparan con sus
respectivos controles. Sui et al. (2006) encontraron en preparaciones similares que
la cantidad de proteínas OEC PsbO, PsbP y PsbQ se mantiene en plantas de N.
benthamiana infectadas con TMV. El diferente procedimiento experimental para
obtener cada tipo de muestra, membranas tilacoidales o preparaciones de
cloroplastos, podría explicar que las primeras pierdan algunas proteínas periféricas.
Es conocido que, bajo condiciones normales de crecimiento, la proteína PsbP
y no PsbQ, es indispensable para el funcionamiento normal del PSII de las plantas
superiores in vivo (Ifuku et al. 2005a y b). Sin embargo, cuando las plantas crecen a
bajas intensidades lumínicas, la supresión de la proteína PsbQ condujo a la pérdida
de varios componentes del PSII, un descenso en Fv/FM y deficiencias en el
transporte electrónico desde QA- a QB-(Yi et al. 2006). Además, se ha encontrado
que PsbQ es requerida para el funcionamiento óptimo del PSII bajo condiciones en
las que la proteína PsbP está deteriorada. En estas ocasiones, PsbQ podría actuar
como una subunidad accesoria para apoyar la función de PsbP en plantas
superiores, o alternativamente, PsbQ podría ser requerida in vivo bajo condiciones
estresantes (Ifuku et al. 2005a). Esto podría explicar por qué PsbQ se acumula en

240
D. Discusión

las plantas infectadas con PMMoV-S donde la expresión de PsbP ha disminuido,


según resultados previos de nuestro grupo (Pérez-Bueno 2004, Sajnani 2005).
La presencia de familias multigénicas para diferentes proteínas
cloroplastídicas como son PsaD, PsaE, PsbO, PsbP y PsbQ en Nicotiana
benthamiana, permitiría a la planta huésped reaccionar de manera flexible a un
ambiente cambiante que puede llegar a constituirse en factor de estrés (Koiwa et al.
2002).
La única de las proteínas identificadas en los geles de rango básico que no
pertenece a la cadena de transporte de electrones fotosintética es la proteína
ribosomal L14, que forma parte de la subunidad 50S del ribosoma cloroplastídico
(Tanaka et al. 1986). Esta proteína muestra un descenso en los geles 2D debido a la
infección por PMMoV-S, lo que podría tener una influencia negativa en la
expresión de polipéptidos codificados en el cloroplasto.
Tras el análisis proteómico pormenorizado del cloroplasto que realizamos a
14 dpi, las técnicas de imagen nos siguieron suministrando información de fases
más tardías de la infección.
A 17 dpi es posible detectar mediante el análisis de los coeficientes de
quenching con el FluorCam un aumento de NPQ en las hojas AS de las plantas
infectadas con ambas cepas virales (Fig. 1A, sección C.3), lo cual amplía nuestros
datos previos obtenidos durante la infección con PMMoV-I (Pérez-Bueno et al.
2006).
El trabajo con el FluorCam en nuestro laboratorio ha sido amplio y arduo.
Hemos realizado un gran número de medidas a diferentes dpi, registrando en cada
uno de ellos la cinética de emisión de la Chl-F, lo que permite la obtención de un
elevado número de parámetros de quenching (revisados, entre otros, en Schreiber
et al. 1986, Rohácek y Bartak 1999, Maxwell y Johnson 2000), así como de sus
respectivas imágenes. Los valores medios de la mayoría de estos parámetros
considerando la hoja entera enmascaraban las diferencias entre las plantas control y
aquellas infectadas con PMMoV. Por tanto, y al igual que ocurría con la

241
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

termografía, las imágenes han sido mucho más resolutivas a la hora de realizar el
seguimiento de la infección viral en la hoja AS.
Con anterioridad a 17 dpi, no hay cambios destacables en las imágenes de los
diferentes parámetros analizados: F0, FM, FV/FM, Rfd, ΦPSII, ΦII, NPQ, qCN, qTQ.
A 17 dpi, el parámetro que maximizó las diferencias entre plantas control e
infectadas y mostró un complejo patrón espacio-temporal en estas últimas fue el
NPQ, en especial NPQ20 (Fig. 1, sección C.3), de acuerdo con los resultados
previos de nuestro grupo durante la infección por PMMoV-I empleando otro
sistema de Chl-FI diferente (Pérez-Bueno et al. 2006). En el presente trabajo, los
experimentos con el FluorCam mostraron también un patrón heterogéneo de NPQ
en las hojas AS de plantas infectadas con PMMoV-S. En las etapas finales de la
infección, las hojas AS de las plantas infectadas muestran los valores más bajos de
NPQ, demostrando que los procesos de senescencia son predominantes y que los
procesos no fotoquímicos están totalmente regulados a la baja. Diferentes trabajos
señalan al NPQ como uno de los mejores indicadores de estrés en plantas
infectadas, revelando una compleja heterogeneidad metabólica en la zona de
infección (Chou et al. 2000, Repka 2002, Berger et al. 2004, Swarbrick et al.
2006). Autores como Osmond et al. (1998) y Lohaus et al. (2000) encuentran que
NPQ reflejaba el desarrollo estado de de los síntomas provocados por un
geminivirus restringido a floema en plantas de Abutilon striatum Dicks. La ventaja
de nuestro trabajo con respecto a los anteriormente citados, es que amplía las
posibilidades de uso del NPQ al detectar la infección en zonas asintomáticas de la
planta (Pérez-Bueno et al. 2006), situación similar a la encontrada en nuestros
trabajos de colaboración con el grupo del Dr. C. Ramos en plantas de judía
infectadas con distintas cepas de Pseudomonas (comunicación personal).
El incremento del NPQ durante la infección viral es una respuesta defensiva
de la planta infectada que podría retrasar el proceso de fotoinhibición hasta las
fases finales del proceso infectivo (Wright et al. 1995a, b, Balachandran et al.
1997). De hecho, la fotoinhibición sólo es evidente en las plantas infectadas con

242
D. Discusión

PMMoV-S e –I a partir de 19-21 dpi (respectivamente), como demuestra el


descenso del parámetro FV/FM (datos obtenidos con el FluorCam mostrados en el
anexo 2 y medidas puntuales en Rahoutei et al. 2000).
El aumento de NPQ en las zonas de expansión viral en hojas AS podría estar
ocasionado por perturbaciones en el ciclo de Benson-Calvin, como apuntábamos
anteriormente al hablar del parámetro F5/F0. La disminución en los niveles de
proteínas implicadas en la ruta asimilatoria de la fotosíntesis y sus correspondientes
transcritos (Fig. 1-3, sección C.4; Pérez-Bueno 2003, Sajnani 2005) durante la
infección de Nicotiana benthamiana por PMMoV, corroboraría este hecho. Ello
conduciría a un aumento del pH intratilacoidal que a su vez induce el incremento
de NPQ (Ruban y Horton 1995, Holt et al. 2004, Horton et al. 2005, Szabó et al.
2005, Sajnani et al. 2007). Nuestros estudios anteriores en este sistema empleando
TL, muestran también la inducción de un flujo cíclico de electrones en torno al PSI
en hojas AS de plantas infectadas (Sajnani 2005) que llevaría a elevados valores de
NPQ (Horton et al. 2005), lo que también se vería favorecido por un incremento en
el número de CR cerrados (Rahoutei et al. 2000) que podrían actuar como centros
disipativos en un PSII con el lado donador dañado (Rahoutei et al. 1998, 1999,
2000, Pérez-Bueno et al. 2004). La bajada en los niveles de las distintas
subunidades de la ATP sintasa en cloroplastos de plantas infectadas que hemos
detectado, podría también influir en el desarrollo de NPQ, ya que se ha descrito que
esta enzima puede modular el proceso de disipación energética no fotoquímica
(Kanazawa y Kramer 2002, Avenson et al. 2004).
Un fenómeno distintivo de la infección por PMMoV-S en la hoja AS, que no
ocurre en el caso de la inoculación con PMMoV-I ni en el de las plantas control, es
el aumento de ΦPSII en la zona de venas tras 2 s de iluminación con luz actínica
(ΦPSII2, Fig. 1C, sección C.3). A partir de los 2 s, las diferencias entre la zona de
venas y la intervenal desaparecen (no se muestra). Sin embargo, el diferente
comportamiento de PMMoV-S e –I en cuanto a ΦPSII2 hace a este parámetro útil
para la diferenciación de dos cepas diferentes del mismo virus.

243
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

La tasa de fotosíntesis en el estado estacionario calculada mediante el


FluorCam (ΦPSII300) se correlacionó con la tasa de fotosíntesis neta calculada
mediante el IRGA (Fig. 2, sección C.3), lo que hace al coeficiente de Chl-F un
buen indicador de este parámetro fotosintético (Genty et al. 1989).
Todas las alteraciones detectadas en los patrones de Chl-FI, así como en los
diferentes parámetros de quenching de las hojas AS infectadas con PMMoV, no se
deben a una disminución en el contenido de Chl de las hojas AS, ya que muestran
una concentración igual o mayor de este pigmento que los respectivos controles en
el momento en que los cambios en Chl-FI son detectados. Esto último fue evidente
en las medidas del cociente F690/F740 mediante MCFI (Fig. 4, 5, sección C.2) y
en las del contenido de Chl foliar (Fig. 6, sección C.1), así como en resultados
previos de nuestro grupo (Rahoutei et al. 2000).
El análisis de las imágenes de Chl-FI y los coeficientes de quenching
obtenidas con el FluorCam de las hojas S de plantas infectadas no muestra ningún
patrón espacial característico que nos permita un seguimiento de la infección (no se
muestra); igual ha ocurrido con las medidas de fluorescencia roja realizadas con el
equipo robotizado del laboratorio de la Dra. Van Der Straeten (Fig. 4, sección C.1).
La veloz invasión de la hoja joven por el virus siguiendo el flujo del fotoasimilado
(Samuel 1934, Roberts et al. 1997, Santa Cruz 1999, Cheng et al. 2000) podría ser
una limitación para esta técnica, que parece más adecuada para detectar el
movimiento tardío y más lento, aunque sea en ausencia de síntomas, caso de la hoja
AS. Sin embargo, la termografía de imagen (Fig. 3B, 4, sección C.1) y la BGF
(Fig. 1, 2, 4, 5, sección C.2) sí han sido de utilidad para detectar cambios inducidos
por la patogénesis en las hojas S.
Reviste especial interés el análisis de la fase de recuperación de los síntomas,
sólo registrada en las plantas infectadas con PMMoV-I, que comienza a 21 dpi y se
completa a 28 dpi, manifestándose con un incremento del porte de la planta y con
la aparición de hojas jóvenes sin curvar. Muchos de los parámetros analizados -
termográficos, de intercambio de gases y de fluorescencia- alcanzan en este estadío

244
D. Discusión

valores próximos a los de las plantas control (Tabla 2). En este sentido, registramos
una disminución de la temperatura de las hojas S (Fig. 3B y 4, sección C.1) y una
tendencia al alza de la conductancia estomática (Fig. 3D, sección C.1). Muchos de
los parámetros calculados con el equipo de MCFI tienen una clara tendencia a
alcanzar los valores de las plantas control, tanto en hoja S como AS (Fig. 1, 4,
Tabla 1, 2, sección C.2), lo que sorprende, ya que la fase de recuperación sólo
afecta a las hojas jóvenes de la planta huésped. El descenso de BGF en la hoja S se
corresponde con una caída en los niveles de ácido clorogénico, como cabía esperar
(Fig. 1, 6, sección C.2). Los niveles de Chl se recuperan completamente a 28 dpi
(Fig. 6, sección C.1), así como los de la mayor parte de transcritos de proteínas
cloroplastídicas analizadas (lchb1, rca, rbcS, psaK, gox, rbcL, psbA, psbO, psbP, y
psbQ; Pérez Bueno et al. 2003).
La fase de recuperación es un fenómeno del que se conoce muy poco. Es
posible que la recuperación de la enfermedad sea consecuencia del silenciamiento
de RNA mediado por virus, por el cual se produce de forma específica la
destrucción enzimática del RNA viral (Hiriart et al. 2002, Mlotshwa et al. 2002), y
por la activación coordinada de mecanismos de defensa generales de la planta
durante los procesos de floración y/o senescencia (Somssich y Hahlbrook 1998,
Malek y Dietrich 1999, Ji y Ding 2001, Obregón et al. 2001). Sin embargo, durante
la fase de recuperación aún es posible detectar el virus mediante Northern Blot
(Pérez-Bueno 2003) o impresiones de hojas (Fig. 7B, sección C.1), y por el
momento se desconoce si estos focos de acumulación están formados por células
que fueron invadidas antes del proceso de recuperación o simplemente éste no es
completamente eficaz.
Llegados a este punto, resumiremos el trabajo presentado, considerando
también los trabajos previos de nuestro laboratorio y aquellos realizados en
colaboración con el grupo de la Dra. I García Luque (CIB. CSIC. Madrid) en el
sistema huésped-patógeno Nicotiana benthamiana-PMMoV. En esta Tesis se han
caracterizado, mediante varios sistemas de captación de imágenes, diversas

245
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

respuestas fisiológicas de la planta a la infección viral. Para ello se han empleado


técnicas que revelan el nivel de transpiración de las hojas (termografía), la
eficiencia fotosintética y los mecanismos disipativos de la energía no fotoquímicos
(fluorescencia roja de la clorofila), así como la activación del metabolismo
secundario (fluorescencia multiespectral inducida por luz UV) de la planta
huésped. También se han utilizado otras aproximaciones experimentales que
apoyan los resultados obtenidos mediante las técnicas de imagen, como son las
medidas de parámetros de intercambio gaseoso con el IRGA, de compuestos
fenólicos emisores de BGF mediante HPLC, la de apertura estomática mediante
impresiones epidérmicas y la inmunodetección de la CP viral en improntas de
hojas. Asimismo se han investigado los cambios inducidos por PMMoV-S en el
proteoma cloroplastídico de Nicotiana benthamiana, ampliando además el número
de proteínas cloroplastídicas identificadas hasta la fecha en este huésped
experimental.
En todo momento, a excepción de los análisis proteómicos, se ha comparado
el efecto de dos cepas del virus, PMMoV-S y PMMoV-I, que difieren en su grado
de virulencia y en el desarrollo de la sintomatología.
Con nuestro abordaje experimental hemos detectado alteraciones en las hojas
AS de plantas infectadas con ambos virus en estadíos iniciales de la infección,
mediante nuevos métodos estadísticos aplicados al análisis de la emisión de Chl-F.
Estos cambios son más tempranos aún en plantas infectadas con PMMoV-S, la
cepa más virulenta, como también ocurre con los resultados ofrecidos por las
diversas técnicas de imagen empleadas en este trabajo. Los algoritmos matemáticos
empleados discriminan en el tiempo la infección con cada uno de los virus y
pueden llevar a una detección temprana y presintomática de la infección viral, pero
a diferencia de los parámetros de fluorescencia convencionales no se corresponden
con cambios fisiológicos en el vegetal.
Pero es en la etapa intermedia del proceso infectivo, de 7 a 17 dpi, donde se
manifiesta más claramente el impacto de PMMoV en N. benthamiana. Si

246
D. Discusión

descartamos los síntomas visibles, la primera hoja en manifestar cambios es la AS,


así como la hoja S de las plantas infectadas con PMMoV-S, y consisten en un
incremento en la emisión de BGF de ambos tipos de hojas. Este hecho es más
evidente, en general, en la cara AB de las hojas, debido a que las de plantas
dicotiledóneas son bifaciales; si bien, los coeficientes de fluorescencia también
muestran diferencias en la cara AD, lo que hace a la MCFI una herramienta muy
adecuada para su aplicación como técnica de diagnóstico precoz en campo. La
emisión de BGF se correlaciona con el contenido de ácido clorogénico, así como
con el grado de virulencia de la cepa viral empleada; la fase de recuperación de las
plantas infectadas con PMMoV-I se ve también acompañada de un descenso en la
emisión de BGF. Sin embargo, no podemos descartar la contribución a la BGF de
otros compuestos fenólicos minoritarios.
Durante este periodo también tienen lugar las alteraciones en el patrón de
transpiración foliar, manifestado antes en hojas AS que en S, y en las plantas
infectadas con PMMoV-S que en la infectadas con PMMoV-I. En las hojas AS, se
experimenta un cierre estomático inducido por la infección viral, que se hace
visible mediante un aumento de temperatura en los tejidos próximos a las venas
principales y que se extiende en días sucesivos al resto de la hoja. Este fenómeno
tiene lugar cuando el virus aún no se halla presente en dichas hojas. La naturaleza
del factor que induce el cierre estomático es aún desconocida. En la hoja S, el
incremento de temperatura afecta homogéneamente a toda la hoja, y durante la fase
de recuperación de las plantas infectadas con PMMoV-I, se reduce la temperatura
de las mismas, no ofreciendo diferencias con respecto al control. La termografía de
imagen demostró ser más potente que el IRGA, mostrando cambios más tempranos
en el intercambio gaseoso y revelando la heterogeneidad en el patrón de
transpiración de la hoja AS de las plantas infectadas.
En la etapa intermedia de la infección por PMMoV, también se detectaron
cambios en el patrón de Chl-F y de NPQ, que pueden correlacionarse con la
distribución viral en la hoja AS, por lo que estos parámetros de fluorescencia

247
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

podrían ser buenos indicadores del movimiento viral. El NPQ se postularía como
un mecanismo de defensa del cloroplasto para evitar la fotoinhibición. El ΦPSII se
ha revelado como un parámetro diferenciador de la infección por PMMoV-S,
puesto que muestra un patrón característico que no presentan las hojas AS de las
plantas control o infectadas con PMMoV-I. Las alteraciones que tienen lugar en la
cinética de emisión de Chl-F de hojas de plantas infectadas aparecen en un punto
cercano a FP, lo que es indicativo de perturbaciones en el ciclo de Benson-Calvin.
Esta hipótesis parece confirmarse con nuestros resultados previos y los expuestos
en esta Tesis, que muestran descensos en los niveles de transcritos y de proteínas
implicadas en esta ruta metabólica.
Considerando los resultados de todas las técnicas utilizadas en esta Tesis
Doctoral, es evidente una vez más la enorme complejidad de la interacción
compatible planta-virus, que resulta dependiente de otros factores ambientales y
del estado de desarrollo del vegetal en el momento de la infección. La respuesta de
la planta a la infección viral, que es un factor de estrés biótico, tiene patrones
comunes a la que presenta frente a factores adversos de origen abiótico y, en
determinados momentos, se asemeja a los procesos de senescencia.
La activación del metabolismo secundario, el equilibrio entre procesos
fotoinhibitorios y fotoprotectores así como entre fotoquímica y fase asimilatoria de
la fotosíntesis, la inhibición de procesos fotoquímicos y activación de rutas
electrónicas alternativas, el descenso en los niveles de proteínas claves en las dos
fases del proceso fotosintético y la inhibición progresiva de genes nucleares y
cloroplastídicos que las codifican, es clave para la respuesta de la planta huésped al
patógeno.
Los resultados de este trabajo abren nuevas líneas de investigación que se
abordarán próximamente. Por un lado, el estudio del proteoma cloroplastídico de
N. benthamiana utilizando técnicas proteómicas sin geles permitirá aumentar el
número de proteínas identificadas y caracterizar las modificaciones post-
traduccionales que pueden sufrir, así como sus isoformas. El empleo de la técnica

248
D. Discusión

2D-DIGE llevará, asimismo, a un análisis cuantitativo más minucioso de los


cambios inducidos por PMMoV en la expresión proteica del cloroplasto de plantas
infectadas. Por otra parte, se hace necesaria la identificación de la/s sustancia/s
responsables del aumento de temperatura de las hojas de plantas infectadas, así
como de la activación del metabolismo secundario en las mismas. El análisis del
sistema antioxidante de la planta huésped también ayudará al entendimiento de su
interacción con el virus.

249
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

250
E. Conclusiones / Concluding remarks

E. CONCLUSIONES

1. El análisis por termografía de imagen de Nicotiana benthamiana infectada


con PMMoV, reveló un incremento de la temperatura superficial de las
hojas ocasionado por un cierre estomático inducido por el virus. El
aumento de temperatura en la hoja S fue homogéneo y no presintomático;
mientras que en la AS fue progresivo, comenzando en las venas principales
para extenderse luego al resto de la hoja, y teniendo lugar antes de la
detección del virus en las mismas.
2. Las técnicas de imagen de captación de fluorescencia inducida por luz UV
registraron un aumento de la fluorescencia verde y azul durante la
infección con PMMoV, que se correspondería con una activación del
metabolismo secundario. Los cambios detectados son más drásticos en el
envés de las hojas y en hojas S más que en AS. El principal compuesto
responsable del aumento de la BGF fue el ácido clorogénico.
3. La fase de recuperación de los síntomas en las plantas infectadas con
PMMoV-I se manifestó con un descenso de temperatura de las hojas S, así
como con una bajada de la fluorescencia verde y azul acompañada de una
caída del contenido de ácido clorogénico en estas hojas.
4. En las medidas de la cinética de inducción de la fluorescencia roja, NPQ y
sus correspondientes imágenes se confirmaron como uno de los parámetros
que mejor señalan la infección por PMMoV en las hojas AS, revelando un
característico patrón que se correlacionó con las áreas de expansión viral.
5. El uso de nuevos parámetros de fluorescencia roja obtenidos mediante la
aplicación de nuevos protocolos de medida de la cinética de inducción de
la fluorescencia y el uso de métodos estadísticos avanzados, ha permitido

251
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

la detección de la infección con PMMoV antes de la aparición de los


primeros síntomas visibles.
6. El estudio proteómico del cloroplasto de N. benthamiana mediante
electroforesis bidimensional en el rango de pH 6-11 nos ha permitido
elevar el número de proteínas detectadas en geles 2D para este proteoma
hasta 203, con un total de 71 identificadas. De los polipéptidos que
muestran un pI básico, sufrieron un descenso en sus niveles durante la
infección con PMMoV-S: PsaD, RbcL y la proteína ribosomal L14,
mientras que la proteína PsbQ del OEC experimentó un incremento.

252
E. Conclusiones / Concluding remarks

E. CONCLUDING REMARKS

1. Analysis of PMMoV-infected Nicotiana benthamiana plants by means of


imaging thermography revealed an increase of leaf temperature due to a viral-
induced stomatal closure. In S leaves, temperature increase was homogeneous
and occurred before the symptom appearance, whereas AS leaves showed
higher temperatures first in the main veins, expanding to the rest of the leaf in
the next days. In AS leaves, the temperature increment precedes the viral
detection in these leaves.
2. UV-induced fluorescence imaging showed higher blue-green fluorescence
emission levels in PMMoV-infected plants due to an up-regulation of the
secondary metabolism in these plants. BGF emission is higher in the AB side,
as well as in the S leaves compared with AS ones. Chlorogenic acid was
detected as the main hydroxicynamic acid contributing to BGF.
3. On PMMoV-I infected plants, recovery phase manifested as a decrease in S
leaf temperature, as well as a reduced blue-green fluorescence emission,
accompanied by a diminished content of chlorogenic acid of these leaves.
4. Red chlorophyll fluorescence measurements confirmed NPQ images as one of
the best Chl-FI parameters reporting PMMoV infection on AS leaves,
revealing a complex, time-varying spatial pattern correlated with the viral
spreading in the leaf.
5. The application of new measuring protocols and combinatorial imaging to the
red chlorophyll fluorescence transient kinetics, allowed the detection of
PMMoV infection before visible symptoms appeared, reporting also damages
on the Benson-Calvin cycle.

253
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

6. The study of the chloroplast proteome of N. benthamiana plants by means of


bidimensional electrophoresis in the 6-11 pH range, let us to increase the
number of spots detected in 2D gels up to 203, been 71 proteins identified.
Some polypeptides with an alkaline pI were down-regulated in PMMoV-S
infected plants (PsaD, RbcL and ribosomal protein L14), while PsbQ protein
from the OEC was up-regulated.

254
F. Bibliografía

F. BIBLIOGRAFÍA

Abbinck, T.E.M., Peart, J.R., Moss, N.M., Baulcombe, D.C., Bol, J.F. y Linhorst,
H.J.M. (2002) Silencing of a gene encoding a protein component of the
oxygen-evolving complex of photosystem II enhances virus replication in
plants. Virology 295: 307-319.
Aebersold, R. y Mann, M. (2003) Mass spectrometry-based proteomics. Nature
422: 198-207.
Agati, G., Galardi, C., Gravano, E., Romani, A. y Tattini, M. (2002) Flavonoid
distribution in tissues of Phillyrea latifolia L. leaves as estimated by
microspectrofluorometry and multispectral fluorescence microimaging.
Photochem. Photobiol. 76: 350-360.
Agrawal, G.K., Yonekura, M., Iwahashi, Y., Iwahashi, H. y Rakwal, R. (2005a)
System, trends and perspectives of proteomics in dicot plants. Part I:
Technologies in proteome establishment. J. Chromatogr. B 815: 109-123.
Agrawal, G.K., Yonekura, M., Iwahashi, Y., Iwahashi, H. y Rakwal, R. (2005b)
System, trends and perspectives of proteomics in dicot plants. Part II:
Proteomes of the complex developmental stages. J. Chromatogr. B 815: 109-
123.
Alban, A., Davi, S.O., Bjorkesten, L., Andersson, C., Sloge, E., Lewis, S. y Currie,
I. (2003) A novel experimental design for comparative two-dimensional gel
analysis: two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a
pooled internal standard. Proteomics 3: 36-44.
Aldea, M., Hamilton, J.G., Resti, J.P., Zangerl, A.R., Berenbaum, M.R., Frank,
T.D. y de Lucia, E.H. (2006) Comparison of photosynthetic damage from

255
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

arthropod herbivory and pathogen infection in understory hardwood saplings.


Oecologia 149: 221-232.
Alfondillo, T., Sigalotti, G.B., Tomasi, M., Semenzato, P. y Valentini, R. (1993)
Applications of a thermal imaging technique in the study of the ascent of sap
in woody species. Plant Cell Environ. 16: 997-1001.
Alleyne, V., Larsen, F.E. y Stewardt, S.H. (1989) Water relations of container-
grown virus-tested and common apple (Malus domestica Borkh.) rootstocks.
Scientia Horticulturae 38: 117-129.
Alonso, E., García-Luque, I., Avila-Rincón, M.J., Wicke, B., Serra, M.T. y Díaz-
Ruiz, J.R. (1989) A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper
crops in Spain. J. Phytopathol. 125: 67-76.
Amme, S., Matros, A., Schlesier, B. y Mock, H.-P. (2006) Proteome analysis of
cold stress response in Arabidopsis thaliana using DIGE-technology. J. Exp.
Bot. 57: 1537-1546.
Andaluz, S., López-Millán, A.F., De Las Rivas, J., Aro, E.M., Abadía, J. y Abadía,
A. (2006) Proteomic profiles of thylakoid membranes and changes in
response to iron deficiency. Photosynth. Res. 89: 141-155.
Apostol, S., Viau, A.A., Tremblay, N., Briantais, J.M., Prasher, S., Parent, L.E. y
Moya, I. (2003) Laser-induced fluorescence signatures as a tool for remote
monitoring of water and nitrogen stresses in plants. Can. J. Remote Sens. 29:
57-65.
Apostol, S. (2006) Leaf fluorescence as diagnostic tool for monitoring vegetation.
From cells to proteins: imaging nature across dimensions 3: 423-430.
Argüello-Astorga, G. y Herrera-Estrella, L. (1998) Evolution of light-regulated
plant promoters. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 79: 525-555.
Ariana, D., Guyer, D.E. y Shrestha, B. (2006) Integrating multispectral reflectance
and fluorescence imaging for defect detection on apples. Comput. Electron.
Agr. 50: 148-161.

256
F. Bibliografía

Aro, E.-M., Suorsa, M., Rokka, A., Allahverdiyeva, Y., Paakkarinen, V., Saleem,
A., Battchikova, N. y Rintamäki, E. (2005) Dynamics of photosystem II: a
proteomic approach to thylakoid protein complexes. J. Exp. Bot. 56: 347-
356.
Avenson, T.J., Cruz, J.A. y Kramer, D.M. (2004) Modulation of energy-dependent
quenching of excitons in antennae of higher plants. P. Natl. Acad. Sci. USA.
101: 5530-5535.
Ayres, P.G. (1992) Plants versus pests and pathogens: an old story but the same
story? En: Pests and Pathogenes: Plant responses to foliar attack, Ayres,
P.G. eds. Bios. Scientific Publishers, Oxford.
Babani, F. y Lichtenthaler, H.K. (1996) Light-induced and age-dependent
development of chloroplasts in etiolated barley leaves as visualized by
determination of photosynthetic pigments, CO2 assimilation rates and
different kinds of chlorophyll fluorescence ratios. J. Plant Physiol. 148: 555-
566.
Babani, F., Lichtenthaler, H.K. y Richter, P. (1996) Changes of chlorophyll
fluorescence signatures during greening of etiolated barley seedlings as
measured with the CCD-OMA fluorometer. J. Plant Physiol. 148: 471-477.
Babani, F., Langsdorf, G., Knapp, M., Buschmann, C. y Lichtenthaler, H.K. (2005)
UV-A induced fluorescence images in sun and shade leaves. BMC Plant
Biology 5: S3. Meeting abstract.
Baginsky, S. y Gruissem, W. (2006) Arabidopsis thaliana proteomics: from
proteome to genome. J. Exp. Bot. 57: 1485-1491.
Baker, N. (1991) A possible role for photosystem II in environmental perturbations
of photosynthesis. Physiol. Plantarum 81: 563-570.
Balachandran, S. y Osmond B.C. (1994) Susceptibility of tobacco leaves to
photoinhibition following infection with two strains of tobacco mosaic virus
under different light and nitrogen nutrition regimes. Plant Physiol. 104:
1051-1057.

257
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Balachandran, S., Osmond, B.C. y Daley, F.P. (1994) Diagnosis of the earliest
strain-specific interactions between tobacco mosaic virus and chloroplasts of
tobacco leaves in vivo by means of chlorophyll fluorescence imaging. Plant
Physiol. 104: 1059-1065.
Balachandran, S., Hurry, V.M., Kelley, S.E., Osmond, C.B., Robinson, S.A.,
Rohozinski, J., Seaton, G.G.R. y Sims, D.A. (1997) Concepts of plant biotic
stress. Some insights into the stress physiology of virus-infected plants, from
the perspective of photosynthesis. Physiol. Plantarum 100: 203-213.
Balogun, O.S. y Teraoka, T. (2004) Time-course analysis of the accumulation of
phenols in tomato seedlings infected with Potato Virus X and Tobacco
mosaic virus. Biokemistri 16: 112-120.
Banerjee, N., Wang, J.Y. y Zaitlin, M. (1995) A single nucleotide change in the
coat protein gene of tobacco mosaic virus is involved in the induction of
sever chlorosis. Virology 297: 234-239.
Banks, F.M., Driscoll, S.P., Parry, M.A.J., Lawlor, D.W., Knight, J.S., Gray, J.C. y
Paul, M.J. (1999) Drecrease in phosphoribulokinase activity by antisense
RNA in transgenic tobacco. Relationship between photosynthesis, growth
and allocation at different nitrogen levels. Plant Physiol. 119: 1125-1136.
Barber, J. (1995) Molecular basis of the vulnerability of photosystem II to damage
by light. Aust. J. Plant Physiol. 22: 201-208.
Barber, J. (1998) Photosystem two. Biochim. Biophys. Acta 1365: 269-277.
Barón, M., Rahoutei, J., Lázaro, J.J. y García-Luque, I. (1995a) PSII response to
biotic and abiotic stress. In Photosynthesis: From Light to Biosphere. Mathis,
P., ed. Vol. IV: 897-900. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht.
Barón, M., Arellano, J.B. y Gorgé, J.L. (1995b) Copper and photosystem II: a
controversial relationship. Physiol. Plantarum 94: 174-180.
Beranova-Giogianni, S. (2003) Proteome analysis by two-dimensional gel
electrophoresis and mass spectrometry: strengths and limitations. Trends
Anal. Chem. 22: 273-281.

258
F. Bibliografía

Berger, S., Papadopoulos, M., Schreiber, U., Kaiser, W. y Roitsch, T. (2004)


Complex regulation of gene expression, photosynthesis and sugar levels by
pathogen infection in tomato. Physiol. Plantarum 122: 419-428.
Berger, S., Benediktyová, Z., Matouš, K., Bonfig, K., Mueller, M.J., Nedbal, L. y
Roitsch, T. (2007) Visualization of dynamics of plant-pathogen interaction
by novel combination of chlorophyll fluorescence imaging and statistical
analysis: Differential effects of virulent an avirulent strains of P. syringae
and of oxylipins on A. thaliana. J. Exp. Bot. 58: 797-806.
Bertamini, M., Muthuchelian, K. y Nedunchezhian, N. (2004) Effect of grapevine
leafroll on the photosynthesis of field grown grapevine plants (Vitis vinifera
L. cv. Lagrein). J. Phytopathol. 152: 145-152.
Bertone, P. y Snyder, M. (2005) Prospects and challenges in proteomics. Plant
Physiol. 138: 560-562.
Bhatia, D.S., Jindal, V. y Malik, C.P. (1986) Effect of salicylic acid and tannic acid
on stomatal aperture and some enzyme changes in isolated epidermal
peelings of Euphorbia hirta L. Biochem. Physiol. PFL. 181: 261-264.
Bilger, W. y Björkman, O. (1990) Role of the xanthophylls cycle in
photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance
changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.
Photosynth. Res. 25: 173-186.
Björkman, O. y Demming, B. (1987) Photon yield of O2-evolution and chlorophyll
fluorescence characteristics at 77K among vascular plants of diverse origins.
Planta 170: 489-504.
Björn, L. y Forsberg, A. (1979) Imaging by delayed light emission
(phyoluminography) as a method for detecting damage to the photosynthetic
system. Physiol. Plantarum 47: 215-222.
Blomberg, A., Blomberg, L., Norbeck, J., Fey, S.J., Larsen, P.M., Larsen, M.,
Roepstorff, P., Degand, H., Boutry, M. y Posch, A. (1995) Interlaboratory
reproducibility of yeast protein patterns analyzed by immobilized pH

259
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

gradient two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 16: 1935-


1945.
Boccara, M., Boue, C., Garmier, M., De Paepe, R. y Boccara, A.C. (2001) Infra-
red thermography revealed a role for mitochondria in pre-symptomatic
cooling during harpin-induced hypersensitive response. Plant J. 28: 663-670.
Bonfig, K.B., Schreiber, U., Gabler, A., Roitsch, T. y Berger, S. (2006) Infection
with virulent and avirulent P. syringae strains differentially effects
photosynthesis and sink metabolism in Arabidopsis leaves. Planta 225: 1-12.
Bongi, G., Palliotti, A., Rocchi, P., Moya, I. y Goulas, Y. (1994) Blue-green
fluorescence excited by UV laser on leaves of different species originates
from cutin and is sensitive to leaf temperature. Plant Cell Environ. 17: 777-
780.
Buchanan, B.B., Wilhelm, G. y Jones, R.L. (2000) Biochemistry and molecular
biology of plants. Buchanan, B.B., Gruissem, W. y Jones, R.L. ed., American
Society of Plant Biologist, Rockville, USA.
Buschmann, C. y Lichtenthaler, H.K. (1998) Principles and characteristics of
multi-colour fluorescence imaging of plants. J. Plant Physiol. 152: 297-314.
Buschmann, C. (1999) Photochemical and non-photochemical quenching
coefficients of the chlorophyll fluorescence: comparison of variation and
limits. Photosynthetica 37: 217-224.
Buschmann, C., Langsdorf, G. y Lichtenthaler, H.K. (2000) Imaging of the blue,
green, and red fluorescence emission of plants: An overview.
Photosynthetica 38: 483-491.
Butz, P., Hofmann, C. y Tauscher, B. (2005) Recent Developments in non-invasive
techniques for fresh fruit and vegetable internal quality analysis. J. Food Sci.
70: R131-R141.
Campo, S., Carrascal, M., Coca, M., Abián, J. y San Segundo, B. (2004) The
defense response of germinating maize embryos against fungal infection: a
proteomics approach. Proteomics 4: 383-396.

260
F. Bibliografía

Cánovas, F.M., Dumas-Gaudot, E., Recorbet, G., Jorrín, J., Mock, H.-P. y
Rossignol, M. (2004) Plant proteome analysis. Proteomics 4: 285-298.
Cartelat, A., Cerovic, Z.G., Goulas, Y., Meyer, S., Lelarge, C., Prioul, J.-L.,
Barbottin, A., Jeuffroy, M.-H., Gate, P., Agati, G. y Moya, I. (2005)
Optically assessed contents of leaf polyphenolics and chlorophyll as
indicators of nitrogen deficiency in wheat (Triticum aestivum L.). Field Crop
Res. 91: 35-49.
Casado-Vela, J., Sellés, S. y Bru-Martínez, R. (2006) Proteomic análisis of tobacco
mosaic virus-infected tomato (Lycopersicon esculentum M.) fruits and
detection of viral coat protein. Proteomics 6: S196-S206.
Castillejo, M.A., Amiour, N., Dumas-Gaudot, E., Rubiales, D. y Jorrín, J.V. (2004)
A proteomic approach to studying plant response to crenate broomrape
(Orobanche crenata) in pea (Pisum sativum). Phytochemistry 65: 1817-1828.
Catena, G. (1992) Application of thermography in Phytopathology. Diagnosis of
sanitary state of ornamental trees. Phytoma 439: 46-48.
Cerovic, Z.G., Samson, G., Morales, F., Tremblay, N. y Moya, I. (1999)
Ultraviolet-induced fluorescence for plant monitoring: present state and
prospects. Agronomie 19: 543-578.
Cerovic, Z.G., Ounis, A., Cartelat, A., Latouche, G., Goulas, Y., Meyer, S. y Moya,
I. (2002) The use of chlorophyll fluorescence excitation spectra for the non-
destructive in situ assessment of UV-absorbing compounds in leaves. Plant
Cell Environ. 25:1663-1676.
Chaerle, L., Van Caeneghem, W., Messens, E., Lambers, H., Van Montagu, M. y
Van der Straeten, D. (1999) Presymptomatic visualization of plant-virus
interactions by thermography. Nat. Biotechnol. 17: 813-816.
Chaerle, L. (2000) Thermographically-aided analysis of early plant-pathogen
interactions and related cell-death phenomena. Tesis doctoral. Universidad
de Gante, Bélgica.

261
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Chaerle, L. y Van der Straeten, D. (2000) Imaging techniques and the early
detection of plant stress. Trends Plant Sci. 5: 495-501.
Chaerle, L. y Van der Straeten, D. (2001) Seeing is believing: imaging techniques
to monitor plant health. Biochim. Biophys. Acta 1519: 153-166.
Chaerle, L., De Boever, F., Van Montagu, M. y Van Der Straeten (2001)
Thermographic visualisation of cell death in tobacco and Arabidopsis. Plant
Cell Environ. 24: 15-25.
Chaerle, L., Hulsen, K., Strasser, R.J., Valcke, R., Höfte, M. y Van Der Straeten,
D. (2003) Robotized time-lapse imaging to assess in-planta uptake of
phenylurea herbicides and their microbial degradation. Physiol. Plantarum
118: 613-619.
Chaerle, L., Hagenbeek, D., De Bruyne, E., Valcke, R. y Van der Straeten, D.
(2004) Thermal and chlorophyll-fluorescence imaging distinguish plant-
pathogen interactions at an early stage. Plant Cell Physiol. 45: 887-896.
Chaerle, L., Saibo, N. y Van Der Straeten, D. (2005) Tuning the pores: towards
engineering plants for improved water use efficiency. Trends Biotechnol. 23:
308-315.
Chaerle, L., Pineda, M., Romero-Aranda, R., Van Der Straeten, D. y Barón, M.
(2006) Robotized thermal and chlorophyll fluorescence imaging of pepper
mild mottle virus infection in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Physiol. 47:
1323-1336.
Chaerle, L., Leinonen, I., Jones, H.G. y Van Der Straeten, D. (2007a) Monitoring
and screening plant populations with combined thermal and chlorophyll
fluorescence imaging. J. Exp. Bot. 58: 773-784.
Chaerle, L., Lenk, S., Hagenbeek, D., Buschmann, C. y Van Der Straeten, D.
(2007b) Multicolour fluorescence imaging for early detection of the
hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus. J. Plant Physiol. 164: 253-
262.

262
F. Bibliografía

Chapelle, E.W., Wood, F.M., McMurtrey, J.E y Newcomb, W.W. (1984) Laser-
induced fluorescence of green plants. 1: A technique for the remote detection
of plant stress and species differentiation. Appl. Opt. 23: 134-138.
Chapelle, E.W., Wood, F.M., Newcomb, W.W. y McMurtrey, J.E (1985) Laser-
induced fluorescence of green plants. 3: LIF spectral signatures of five major
plant types. App. Opt. 24: 74-80.
Chappelle, E.W. y Lichtenthaler, H.K. (1994) Fluorescence measurements of
vegetation - Preface. Remote Sens. Environ. 47: 1-1.
Cheng, N.-H., Su, C.-L., Carter, S.A. y Nelson, R.S. (2000) Vascular invasion
routes and systemic accumulation patterns of tobacco mosaic virus in
Nicotiana benthamiana. Plant J. 23: 349-362.
Cheregi, O., Sicora, C., Kos, P.B., Nixon, P.J. y Vass, I. (2005) The FtsH protease
is required for the repair of photosystem II in the cyanobacterium
Synechocystis 6803 damaged by UV-B radiation. BMC Plant Biology 5: S8.
Meeting abstract.
Chernushevich, I.V., Loboda, A.V. y Thomson, B.A. (2001) An introduction to
quadrupole-time-of flight mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 36: 849-
865.
Chinnasamy, G. y Rampitsch, C. (2006) Efficient solubilization buffers for two-
dimensional gel electrophoresis of acidic and basic proteins extracted from
wheat seeds. Biochim. Biophys. Acta 1764: 641-644.
Chivasa, S., Hamilton, J.M., Pringle, R.S., Ndimba, B.K., Simon, W.J., Lindsey, K.
y Slabas, A.R. (2006) Proteomic analysis of differentially expressed proteins
in fungal elicitor-treated Arabidopsis cell cultures. J. Exp. Bot. 57: 1553-
1562.
Chou, H.M., Bundock, N., Rolfe, A.S. y Scholes, J.D. (2000) Infection of
Arabidopsis thaliana leaves with Albugo candida (white blister rust) causes a
reprogramming of host metabolism. Mol. Plant Pathol. 2: 99-113.

263
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Chow, W.S., Lee, H.Y., Park, Y.I., Park, Y.M., Hong, Y.N. y Anderson, J.M.
(2002) The role of inactive photosystem II-mediated quenching in a last-
ditch community defence against high light stress in vivo. Philos. Trans. R.
Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357: 1441-1450.
Ciambella, C., Roepstorff, P., Aro, E.M. y Zolla, L. (2005) A proteomics approach
for investigation of photosynthetic apparatus in plants. Proteomics 5: 746-
757.
Ciscato, M. (2000) Development of a fluorescence imaging system for the quality
assessment of fruits and vegetables. Tesis doctoral, Universidad de Limburg,
Bélgica.
Clover, G.R.G., Jaggard, K.W., Smith, H.G. y Azam-Ali, S.N. (2001) The use of
radiation interception and transpiration to predict the yield of healthy,
droughted and virus-infected sugar beet. J. Agr. Sci. 136: 169-178.
Cohen, Y., Alchanatis, V., Meron, M., Saranga, Y. y Tsipris, J. (2005) Estimation
of leaf water potential by thermal imagery and spatial analysis. J. Exp. Bot.
56: 1843-1852.
Colditz, F., Nyamsuren, O., Niehaus, K., Eubel, H., Braun, H.-P. y Krajinski, F.
(2004) Proteomic approach: identification of Medicago truncatula proteins
induced in roots after infection with the pathogenic oomycete Aphanomyces
euteiches. Plant Mol. Biol. 55: 109-120.
Cooper, B., Ecker, D., Andon, N.L., Yates 3rd, J.R. y Haynes, P.A. (2003)
Investigative proteomics: identification of an unknown plant virus from
infected plants using mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14:
736-741.
Corbett, J.M., Dunn, M.J., Posch, A. y Görg, A. (1994) Positional reproducibility
of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using
immobilized pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: an
interlaboratory comparison. Electrophoresis 15: 1205-1211.

264
F. Bibliografía

Corp, L.A., McMurtrey, J.E., Middleton, E.M., Mulchi, C.L., Chappelle, E.W. y
Daughtry, C.S.T. (2003) Fluorescence sensing systems: In vivo detection of
biophysical variations in field corn due to nitrogen supply. Remote Sens.
Environ. 86: 470-479.
Cottrell, J.S. (1994) Protein identification by peptide mass fingerprinting. Pept.
Res. 7: 115-124.
Critchley, C. y Russell, A.W. (1994) Photoinhibition of photosynthesis in vivo: The
role of protein turnover in photosystem II. Physiol. Plantarum 92: 188-196.
Crouchman, S., Ruban, A. y Horton, P. (2006) PsbS enchances nonphotochemical
fluorescence quenching in the absence of zeaxanthin. FEBS Lett. 580: 2053-
2058.
Cui, S., Huang, F., Wang, J., Ma, X., Cheng, Y. y Liu, J. (2005) A proteomic
analysis of cold stress responses in rice seedlings. Proteomics 5: 3162-3172.
Curto, M., Camafeita, E., López, J.A., Maldonado, A.M., Rubiales, D. y Jorrín,
J.V. (2006) A proteomic approach to study pea (Pisum sativum) responses to
powdery mildew (Erysiphe pisi). Proteomics 6: S163-S174.
Daley, P.F., Raschke, K., Ball, J.T. y Berry, J.A. (1989) Topography of
photosynthetic activity of leaves obtained from video images of chlorophyll
fluorescence. Plant Physiol. 90: 1233-1238.
Dat, J., Vandenabeele, S., Vranova, E., Van Montagu, M., Inze, D. y Van
Breusegem, F. (2000) Dual action of the active oxygen species during plant
stress responses. Cell. Mol. Life Sci. 57: 779-795.
Dawson, O.W. (1992) Tobamovirus-plant interactions. Virology 186: 359-367.
Del Río, L.A., Corpas, F.J. y Barroso, J.B. (2004) Nitric oxide and nitric oxide
synthase activity in plants. Phytochemistry 65: 783-792.
DeRocher, E.J. y Bohnert, H.J. (1993) Development and environmental stress
employ different mechanisms in the expression of a plant gene family. Plant
Cell 5: 1611-1625.

265
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Demmig-Adams, B. y Adams W.W. 3rd. (2000) Harvesting sunlight safely. Nature


403: 371-374.
Dixon, R.A. y Paiva, N.L. (1995) Stress-induced phenylpropanoid metabolism.
Plant Cell 7: 1085-1097.
Dixon, R.A., Achnine, L., Kota, P., Liu, C.-J., Srinivasa Reddy, M.S. y Wang, L.
(2002) The phenylpropanoid pathway and plant defence – A genomics
perspective. Mol. Plant Pathol. 3: 371-390.
Dunkley, T.P., Dupree, P., Watson, R.B. y Lilley, K.S. (2004) The use of isotope-
coded affinity tags (ICAT) to study organelle proteomes in Arabidopsis
thaliana. Biochem. Soc. Trans. 32: 520-523.
Edman, P. (1970) Sequence determination. Mol. Bio. Biochem. Biophys. 8: 211-
255.
Einhellig, F.A. y Kuan, L.-Y. (1971) Effects of scopoletin and chlorogenic acid on
stomatal aperture in tobacco and sunflower. B. Torrey Bot. Club 98: 155-162.
Ephritikhine, G., Ferro, M. y Rolland, N. (2004) Plant membrane proteomics. Plant
Physiol. Biochem. 42: 943-962.
Esfeld, P., Siebke, K. y Weis, E. (1995) Local defence-related shift in the carbon
metabolism in chickpea leaves induced by a fungal pathogen. In
Photosynthesis: from light to biosphere. 5:663-666. P Mathis, ed., Kluwer
Academic Publisher. Dordrecht.
Eubel, H., Braun, H.-P. y Millar, H. (2005) Blue-native PAGE in plants: a tool in
analysis of protein-protein interactions. BMC Plant Methods 1: 11.
Fenn, J.B., Mann, M., Meng, C.K., Wong, S.F. y Whitehouse, C.M. (1989)
Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science
246: 64-71.
Ferro, M., Salvi, D., Riviére-Rolland, H., Vermat, T., Seigneurin-Berny, D.,
Grunwald, D., Garin, J., Joyard, J. y Rolland, N. (2002) Integral membrane
proteins of the chloroplast envelope: identification and subcellular

266
F. Bibliografía

localization of new transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11487-
11492.
Ferry-Dumazet, H., Houel, G., Montalent, P., Moreau, L., Languella, O., Negroni,
L., Vincent, D., Lalanne, C., de Daruvar, A., Plomion, C., Zivy, M. y Joets,
J. (2005) PROTICdb: A web-based application to store, track, query, and
compare plant proteome data. Proteomics 5: 2069-2081.
Finazzi, G., Johnson, G.N., Dallosto, L., Joliot, P., Wollman, F.-A. y Bassi, R.
(2004) A zeaxanthin-independent nonphotochemical quenching mechanism
localized in the photosystem II core complex. P. Natl. Acad. Sci. USA. 101:
12375-12380.
Fito, P.J., Ortolá, M.D., De los Reyes, R., Fito, P. y De los Reyes, E. (2004)
Control of citrus surface drying by image analysis of infrared thermography.
J. Food Eng. 61: 287-290.
Foyer, C.H. y Harbinson, J. (1994) Oxygen metabolism and the regulation of
photosynthetic electron transport. En: Causes of photooxidative stress and
amelioration of defense system in plants, Foyer, C.H. and Mullineaux, P.M.
eds, 1-42. Boca Raton CRC Press.
Friso, G., Giacomelli, L., Ytterberg, J.A., Peltier, J.B., Rudella, A., Sun, Q. y van
Wijk, K.J. (2004) In-depth analysis of the thylakoid membrane proteome of
Arabidopsis thaliana chloroplasts: new proteins, new functions, and a plastid
proteome database. Plant Cell 16: 478-499.
Fromme, P., Jordan, P. y Krauss, N. (2001) Structure of photosystem I. Biochim.
Biophys. Acta 1507: 5-31.
Fryer, M.J., Ball, L., Oxborough, K., Karpinski, S., Mullineaux, P.M. y Baker,
N.R. (2003) Control of ascorbate peroxidasa 2 expression by hydrogen
peroxide and leaf water status during excess light stress reveals a functional
organisation of Arabidopsis leaves. Plant J. 33: 691-705.
Fuchs, M. y Tanner, C.B. (1966) Infrared thermometry of vegetation. Agronomy J.
58: 597-601.

267
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Fukunaga, K. (1990) Introduction to statistical pattern recognition. 2nd Ed.


Academic Press, New York.
Funayama-Noguchi, S. (2001) Ecophysiology of virus-infected plants: A case
study of Eupatorium makinoi infected by geminivirus. Plant Biol. 3: 251-
262.
Gaspar, T., Franck, T., Bisbis, B., Kevers, C., Jouve, L., Hausman, J.F. y Dommes,
J. (2002) Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue
cultures. Plant Growth Regul. 37: 263-285.
Genty, B., Briantais, J.M. y Baker, R.N. (1989) The relationship between the
quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of
chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta 990: 87-92.
Georgieva, K., Szigeti, Z., Sarvari, E., Gaspar, L., Maslenkova, L., Peeva, V., Peli,
E. y Tuba, Z. (2006) Photosynthetic activity of homoiochlorophyllous
desiccation tolerant plant Haberlea rhodopensis during dehydration an
rehydration. Planta. 10.1007/s00425-006-0396-8.
Gevaert, K., Demol, H., Martens, L., Hoorelbeke, L., Puype, M., Goethals, M., Van
Damme, J., De Boeck, S. y Vandekerckhove, J. (2001) Protein identification
based on matrix assisted laser desorption/ionization-post source decay-mass
spectrometry. Proteomics 22: 1645-1651.
Giacomelli, L., Rudella, A. y van Wijk, K.J. (2006) High light response of the
thylakoid proteome in Arabidopsis wild type and the ascorbate-deficient
mutant vtc2-2. A comparative proteomics study. Plant Physiol. 141: 685-
701.
Gitelson, A.A., Buschmann, C. y Lichtenthaler, H.K. (1998) Leaf chlorophyll
fluorescence corrected for re-absorption by means of absorption and
reflectance measurements. J. Plant Physiol. 152: 283-296.
Gitelson, A.A., Buschmann, C. y Lichtenthaler, H.K. (1999) The chlorophyll
fluorescence ratio F735/F700 as an accurate measure of the chlorophyll
content in plants. Remote Sens. Environ. 69: 296-302.

268
F. Bibliografía

Goff, S.A., Ricke, D., Lan, T.H., Presting, G., Wang, R., Dunn, M., Glazebrook, J.,
Sessions, A., Oeller, P., Varma, H., Hadley, D., Hutchinson, D., Martin, C.,
Katagiri, F., Lange, B.M., Moughamer, T., Xia, Y., Budworth, P., Zhong, J.,
Miguel, T., Paszkowski, U., Zhang, S., Colbert, M., Sun, W.L., Chen, L.,
Cooper, B., Park, S., Wood, T.C., Mao, L., Quail, P., Wing, R., Dean, R.,
Yu, Y., Zharkikh, A., Shen, R., Sahasrabudhe, S., Thomas, A., Cannings, R.,
Gutin, A., Pruss, D., Reid, J., Tavtigian, S., Mitchell, J., Eldredge, G., Scholl,
T., Miller, R.M., Bhatnagar, S., Adey, N., Rubano, T., Tusneem, N.,
Robinson, R., Feldhaus, J., Macalma, T., Oliphant, A. y Briggs, S. (2002) A
draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Japonica). Science
296: 92-100.
Goodman, R.N., Király, Z. y Wood, K.R. (1986) The biochemistry and physiology
of plant disease. University of Missouri Press, Columbia.
Görg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Harder, A., Scheibe, B., Wildgrupber, R. y
Weiss, W. (2000) The current state of two-dimensional electrophoresis with
immobilized pH gradients. Electrophoresis 21: 1037-1053.
Görg, A., Weiss, W. y Dunn, M.J. (2004) Current two-dimensional electrophoresis
technology for proteomics. Proteomics 4: 3665-3685.
Görlach, J., Schmid, J. y Amrhein, N. (1993) The 33 kDa protein of the oxygen-
evolving complex: a multi-gene family in tomato. Plant Cell Physiol. 34:
479-501.
Götz, T., Sandmann, G. y Romer, S. (2002) Expression of a bacterial carotene
hydroxylase gene (crtZ) enhances UV tolerance in tobacco. Plant Mol. Biol.
50: 129-142.
Grabov, A. y Blatt, M.R. (1998) Co-ordination of signalling elements in guard cell
ion channel control. J. Exp. Bot. 49:399-406.
Granvogl, B., Reisinger, V. y Eichacker, L.A. (2006) Mapping the proteome of
thylakoid membranes by de novo sequencing of intermembrane peptide
domains. Proteomics 6: 3681-3695.

269
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Guo, Y.-P., Guo, D.-P., Peng, Y. y Chen, J.-S. (2005a) Photosynthetic responses of
radish (Paphanus sativus var. longipinnatus) plants to infection by turnip
mosaic virus. Photosynthetica 43: 457-462.
Guo, D.-P., Guo, Y.-P., Zhao, J.-P., Liu, H., Peng, Y., Wang, Q.-M., Chen, J.-S. y
Rao, G.-Z. (2005b) Photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence in
leaves of stem mustard (Brassica juncea var. tsatsai) after turnip mosaic
virus infection. Plant Sci. 168: 57-63.
Gunasinghe, U.B. y Berger, P.H. (1991) Association of potato virus and gene
products with chloroplasts in tobacco. Mol. Plant Microbe In. 4: 452-457.
Gusta, L.V., Wisniewski, M., Nesbitt, N.T. y Gusta, M.L. (2004) The effect of
water, sugars, and proteins on the pattern of ice nucleation and propagation
in acclimated and nonacclimated canola leaves. Plant Physiol. 135: 1642-
1653.
Gygi, S.P., Rist, B., Gerber, S.A., Turecek, F., Gelb, M.H. y Aebersold, R. (1999)
Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded
affinity tags. Nature Biotech. 17: 994-999.
Gygi, S.P., Rist, B. y Aebersold, R. (2000) Measuring gene expression by
quantitative proteome analysis. Curr. Opin. Biotech. 11: 396-401.
Haake, V., Zrenner, R., Sonnewald, U. y Stitt, M. (1998) A moderate decrease of
plastid aldolase activity inhibits photosynthesis, alters the levels of sugars
and starch, and inhibits growth of potato plants. Plant J. 14: 147-157.
Hák, R., Lichtenthaler, H.K. y Rinderle, U. (1990) Decrease of the chlorophyll
fluorescence ratio F690/F730 during greening and development of leaves.
Radiat. Environ. Biophys. 29: 329-336.
Haldrup, A., Lunde, C. y Scheller, H.V. (2003) Arabidopsis thaliana plants lacking
the PSI-D subunit of photosystem I suffer photoinhibition, have unstable
photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast
stroma. J. Biol. Chem. 278: 33276-33283.

270
F. Bibliografía

Haripal, P.K., Raval, H.K., Raval, M.K., Rawal, R.M., Biswal, B. y Biswal, U.C.
(2006) Three-dimensional model of zeaxanthin binding PsbS protein
associated with nonphotochemical quenching of excess quanta of light
energy absorbed by the photosynthetic apparatus. J. Mol. Model. 12: 847-
853.
Harris, P.J. y Hartley, R.D. (1976) Detection of bound ferulic acid in cell walls of
the Gramineae by ultraviolet fluorescence microscopy. Nature 259: 508-510.
Havaux, M., Triantaphylidès, C. y Genty, B. (2006) Autoluminiscence imaging: a
non-invasive tool for mapping oxidative stress. Trends Plant Sci. 11: 480-
484.
Havelda, Z. y Maule, J.A. (2000) Complex spatial responses to cucumber mosaic
virus photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta 852: 144-155.
Heazlewood, J.L. y Millar, A.H. (2005) AMPDB: the Arabidopsis mitochondrial
protein database. Nucleic Acids Res. 33: D605-D610.
Heisel, F., Sowinska, M., Miehé, J.A., Lang, M. y Lichtenthaler, H.K. (1996)
Detection of nutrient deficiencies of maize by laser induced fluorescence
imaging. J. Plant Physiol. 148: 622-631.
Herbers, K., Takahata, Y., Melzer, M., Mock, P.H. y Hajirezael, M. (2000)
Regulation of carbohydrate partitioning during the interaction of potato virus
Y with tobacco. Mol. Plant Pathol. 1: 51-59.
Hideg, E., Juhasz, M., Bornman, J.F. y Asada, K. (2002) The distribution and
possible origin of blue-green fluorescence in control and stressed barley
leaves. Photochem. Photobiol. Sci. 1: 934-941.
Hirano, H., Islam, N. y Kawasaki, H. (2004) Technical aspects of functional
proteomics in plants. Phytochemistry 1487-1498.
Hiriart, J.B., Lehto, K., Tyystjärvi, E., Junttila, T. y Aro, E.M. (2002) Supression of
a key gene involved in chlorophyll biosynthesis by means of virus-inducing
gene silencing. Plant Mol. Biol. 50: 213-224.

271
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Hochholdinger, F., Sauer, M., Dembinsky, D., Hoecker, N., Muthreich, N., Saleem,
M. y Liu, Y. (2006) Proteomic dissection of plant development. Proteomics
6: 4076-4083.
Hodgson, A.J.R., Beachy, N.R. y Pakrasi, B.H. (1989) Selective inhibition of
photosystem II spinach by tobacco mosaic virus: an effect of the viral coat
protein. FEBS Lett. 245: 267-270.
Holt, N.E., Fleming, G.R. y Niyogi, K.K. (2004) Toward an understanding of the
mechanism of nonphotochemical quenching in green plants. Biochemistry
43: 8281-8289.
Horton, P., Ruban, A.V. y Walters, R.G. (1996) Regulation of light harvesting in
green plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 655-684.
Horton, P. y Ruban, A.V. (2005) Molecular design of the photosystem II light-
harvesting antenna: photosynthesis and photoprotection. J. Exp. Bot. 56: 365-
373.
Horton, P., Wentworth, M. y Ruban, A. (2005) Control of the light harvesting
function of chloroplast membranes: The LHCII-aggregation model for non-
photochemical quenching. FEBS Letters 579: 4201-4206.
Houtz, R.L. y Portis, A.R. Jr. (2003) The life of ribulose 1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase – Posttranslational facts and mysteries. Arch.
Biochem. Biophys. 414: 150-158.
Hua, S.B., Dube, S.K., Barnett, N.M. y Kung, S.D. (1991a) Nucleotide sequence of
a cDNA clone encoding 23 kDa polypeptide of the oxygen-evolving
complex of photosystem II in tobacco, Nicotiana tabacum L. Plant Mol.
Biol. 16: 749-750.
Hua, S.B., Dube, S.K., Barnett, N.M. y Kung, S.D. (1991b) Nucleotide sequence of
gene oee2-A and its cDNA encoding 23 kDa polypeptide of the oxygen-
evolving complex of photosystem II in tobacco. Plant Mol. Biol. 17: 551-
553.

272
F. Bibliografía

Hua, S.B., Dube, S.K. y Kung, S.D. (1997) Molecular evolutionary of the pspP
gene family of the photosystem II oxygen-evolving complex in Nicotiana.
Genome 36: 483-488.
Huala, E., Dickerman, A.W., García-Hernández, M., Weems, D., Reiser, L.,
LaFond, F., Hanley, D., Kiphart, D., Zhuang, M., Huang, W., Mueller, L.A.,
Bhattacharyya, D., Bhaya, D., Sobral, B.W., Beavis, W., Meinke, D.W.,
Town, C.D., Somerville, D. y Rhee, S.Y. (2001) The Arabidopsis
Information Resource (TAIR): a comprehensive database and web-based
information retrieval, analysis, and visualization system for a model plant.
Nucleic Acids Res. 29: 102-105.
Huber, C.G., Walcher, W., Timperio, A., Troiani, S., Porceddu A. y Zolla, L.
(2004) Multidimensional proteomic analysis of photosynthetic membrane
proteins by liquid extraction-ultracentrifugation-liquid chromatography-mass
spectrometry. Proteomics 4: 3909-3920.
Hull, R. (2002) Matthew’s Plant Virology. 4th ed. Academic Press.
Hunt, D.F., Yates 3rd, J.R., Shabanowitz, J., Winston, S. y Hauer, C.R. (1986)
Protein sequencing by tandem mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83: 6233-6237.
Hurkman, W.J. y Tanaka, C.K. (1986) Solubilization of plant membrane proteins
for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 81: 802-
806.
Ifuku, K. y Sato, F. (2002) A truncated mutant of the extrinsic 23-kDa protein that
absolutely requires the extrinsic 17-kDa protein for Ca2+ retention in
photosystem II. Plant Cell Physiol. 43: 1244-1249.
Ifuku, K., Yamamoto, Y., Ono, T., Ishihara, S. y Sato, F. (2005a) PsbP protein, but
not PsbQ protein, is essential for the regulation and stabilization of
photosystem II in higher plants. Plant Physiol. 139: 1175-1184.

273
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Ifuku, K., Yamamoto, Y., Ishihara, S. y Sato, F. (2005b) Down-regulation of psbO,


psbP and psbQ genes in Nicotiana tabacum by RNA interference technique.
Plant Cell Physiol. 46: S27-S27.
Ihnatowicz, A., Pesaresi, P., Varotto, C., Richly, E., Schneider, A., Jahns, P.,
Salamini, F. y Leister, D. (2004) Mutants for photosystem I subunit D of
Arabidopsis thaliana: effects on photosynthesis, photosystem I stability and
expression of nuclear genes for chloroplast functions. Plant J. 37: 839-852.
Ireland, C.R.; Long, N.R. y Baker, N.R. (1984) The relationship between carbon
dioxide fixation and chlorophyll a fluorescence during induction of
photosynthesis in maize leaves at different temperatures and carbon dioxide
concentrations. Planta 160: 550-558.
Ishihara, S., Yamamoto, Y., Ifuku, K. y Sato, F. (2005) Functional analysis of four
members of the PsbP family in photosystem II in Nicotiana tabacum using
differential RANA interference. Plant Cell Physiol. 46: 1885-1893
Issaq, H.J., Veenstra, T.D., Conrads, T.P. y Felschow, D. (2002) The SELDI-TOF
MS approach to proteomics: protein profiling and biomarker identification.
Biochem. Biophys. Res. Co. 292: 587-592.
Jensen, P.E., Haldrup, A., Rosgaard, L. y Scheller, H.V. (2003) Molecular
dissection of photosystem I in higher plants: topology, structure and
function. Physiol. Plantarum 119: 313-321.
Ji, L.H. y Ding, S.W. (2001) The suppressor of transgene RNA silencing encoded
by Cucumber mosaic virus interferes with salicylic acid-mediated virus
resistance. Mol. Plant Microbe In. 14: 715-724.
Jones H.G. (1998) Stomatal control of photosynthesis and transpiration. J. Exp.
Bot. 49: 387-398.
Jones, H.G. (1999) Use of thermography for quantitative studies of spatial and
temporal variation of stomatal conductance over leaf surfaces. Plant Cell
Environ. 22: 1043-1055.

274
F. Bibliografía

Jones, H.G., Stoll, M., Santos, T., de Sousa, C., Chaves, M.M. y Grant, O.M.
(2002) Use of infrared thermography for monitoring stomatal closure in the
field: application to grapevine. J. Exp. Bot. 53: 2249-2260.
Jones, H.G. (2004a) Application of thermal imaging and infrared sensing in plant
physiology and ecophysiology. Advances in Botanical Research
Incorporating Advances in Plant Pathology, Vol. 41: 107-163.
Jones, H.G. (2004b) Irrigation scheduling: advantages and pitfalls of plant-based
methods. J. Exp. Bot. 55: 2427-2436.
Jones, A.M.E., Thomas, V., Truman, B., Lilley, K., Mansfield, J.W. y Grant, M.
(2004) Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial
challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance.
Phytochemistry 65: 1805-1816.
Jones, A.M.E., Bennett, M.H., Mansfield, J.W. y Grant, M. (2006a) Analysis of the
defence phosphoproteome of Arabidopsis thaliana using differential mass
tagging. Proteomics 6: 4155-4165.
Jones, A.M.E., Thomas, V., Bennett, M.H., Mansfield, J. y Grant, M. (2006b)
Modifications to the Arabidopsis defense proteome occur prior to significant
transcriptional change in response to inoculation with Pseudomonas
syringae1[W][OA]. Plant Physiol. 142: 1603-1620.
Jonsson, A.P. (2001) Mass spectrometry for protein and peptide characterisation.
Cell. Mol. Life Sci. 58: 868-884.
Karpinski, S., Reynolds, H., Karpinska, B., Wingsle, G., Creissen, G. y
Mullineaux, P. (1999) Systemic signalling and acclimation in response to
excess excitation energy in Arabidopsis. Science 284: 654-657.
Kautsky, H. y Hirsch, A. (1931) Neue versuche zur kohlensauerassimilation.
Naturwissenschaften 48: 964-964.
Kanazawa, A. y Kramer, D.M. (2002) In vivo modulation of nonphotochemical
exciton quenching (NPQ) by regulation of the chloroplast ATP synthase. P.
Natl. Acad. Sci. USA. 99: 12789-12794.

275
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Karas, M. y Hillenkamp, F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with


molecular masses exceeding 10 000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301.
Keller, P., Lüttge, U., Xue-Chen, W. y Büttner, F. (1989) Influence of rhizomania
disease on gas exchange and water relations of a susceptible and a tolerant
sugar beet variety. Physiol. Mol. Plant P. 34: 379-392.
Kenyon, G.L., DeMarini, D.M., Fuchs, E., Galas, D.J., Kirsch, J.F., Leyh, T.S.,
Moos, W.H., Petsko, G.A., Ringe, D., Rubin, G.M. y Sheahan, L.C. (2002)
Natural Research Council Steering Committee. Defining the mandate of
proteomics in the post-genomics era: workshop report. Mol. Cell Proteomics:
1: 763-780.
Kiesselbach, T., Hagman, a., Andersson, B. y Schröder, P.W. (2000) The thylakoid
lumen of chloroplast. Isolation and characterization. J. Biol. Chem. 273:
6710-6716.
Kim, S.T., Kim, S.G., Hwang, D.H., Kang, S.Y., Kim, H.J., Lee, B.H., Lee, J.J. y
Kang, K.Y. (2004) Proteomic analysis of pathogen-responsive proteins from
rice leaves induced by rice blast fungus, Magnaporthe grisea. Proteomics 4:
3569-3578.
Kitaya, Y., Kawai, M., Tsuruyama, J., Takahashi, H., Tani, A., Goto, E., Saito, T. y
Kiyota, M. (2001) The effect of gravity on surface temperature and net
photosynthetic rate of plant leaves. Adv. Space Res. 28: 659-664.
Kitaya, Y., Kawai, M., Tsuruyama, J., Takahashi, H., Tani, A., Goto, E., Saito, T. y
Kiyota, M. (2003) The effect of gravity on surface temperatures of plant
leaves. Plant Cell Environ. 26: 497-503.
Kleffman, T., Russenberger, D., von Zychlinski, A., Christopher, W., Sjölander,
K., Gruissem, W., y Baginsky, S. (2004) The Arabidopsis thaliana
chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein
functions. Curr. Biol. 14: 354-362.

276
F. Bibliografía

Kofalvi, S.A. y Nassuth, A. (1995) Influence of wheat streak mosaic virus infection
on phenylpropanoid metabolism and the accumulation of phenolics and
lignin in wheat. Physiol. Mol. Plant P. 47: 365-377.
Koiwa, H., Barb, A.W., Xiong, L., Li, F., McCully, M.G., Lee, B., Sokolchik, I.,
Zhu, J., Gong, Z., Reddy, M., Sharkhuu, A., Manabe, Yl., Yokoi, S., Zhu,
J.K., Bressan, R.A. y Hasegawa, P.M. (2002) C-terminal domain
phosphatase-like family members (AtCPLs) differentially regulate
Arabidopsis thaliana abiotic stress signalling, growth, and development.
Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10893-10898.
Komatusu, S., Zang, X. y Tanaka, N. (2006) Comparison of two proteomics
techniques used to identify proteins regulated by gibberellin in rice. Journal
of Proteome Resesearch 5: 270-276.
Konishi, H., Ishiguro, K. y Komatsu, S. (2001) A proteomics approach towards
understanding blast fungus infection of rice grown under different levels of
nitrogen fertilization. Proteomics 1: 1162-1171.
Krapp, A. y Stitt, M. (1995) An evaluation of direct and indirect mechanism for the
“sink-regulation” of photosynthesis in spinach: changes in gas exchange,
carbohydrates, metabolites, enzymes activities and steady-state transcript
levels after cold-girdling source leaves. Planta 195: 313-323.
Krizek, D.T., Middleton, E.M., Sandhu, R.K. y Kim, M.S. (2001) Evaluating UV-
B effects and EDU protection in cucumber leaves using fluorescence images
and fluorescence emission spectra. J. Plant Physiol. 158: 41-53.
Kwon, S.J., Choi, E.Y., Choi, Y.J., Ahn, J.H. y Park, O.K. (2006) Proteomics
studies of post-translational modifications in plants. J. Exp. Bot. 57: 1547-
1551.
Kyle, D.J., Staehelin, L.A. y Arntzen, C.J. (1983) Lateral mobility of the light-
harvesting complex in chloroplast membranes controls excitation energy
distribution in higher plants. Arch. Biochem. Biophys. 222: 527-541.

277
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Laemli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bactriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lang, M., Stober, F. y Lichtenthaler, H.K. (1991) Fluorescence emission spectra of
plant leaves and plant constituents. Radiat Environ Biophys 30: 333-347.
Lang, M., Lichtenthaler, H.K., Sowinska, M., Heisel, F. y Miehé, J.A. (1996)
Fluorescence imaging of water and temperature stress in plant leaves. J.
Plant Physiol. 148: 613-621.
Langsdorf, G., Buschmann, C., Sowinska, M., Babani, F., Mokry, M.,
Timmermann, F. y Lichtenthaler, H.K. (2000) Multicolour fluorescence
imaging of sugar beet leaves with different nitrogen status by flash lamp UV-
excitation. Photosynthetica 38: 539-551.
Larcher, W. (1987) Streß bei Pflanzen. Naturwissenschaften 74: 158-167.
Lehto, K., Tikkanen, M., Hiriart, J.-B., Paakkarinen, V. y Aro, E.M. (2003)
Depletion of the photosystem II core complex in mature tobacco leaves
infected by the Flavum strain of tobacco mosaic virus. Mol. Plant Microbe
In. 16: 1135-1144.
Leigh, A., Close, J.D., Ball, M.C., Siebke, K. y Nicotra, A.B. (2006) Leaf cooling
curves: measuring leaf temperature in sunlight. Functional Plant Biology 33:
515-519.
Leinonen, I. y Jones, H.G. (2004) Combining thermal and visible imagery for
estimating canopy temperature and identifying plant stress. J. Exp. Bot. 55:
1423-1431.
Lenk, S. y Buschmann, C. (2006) Distribution of UV-shielding of the epidermis of
sun and shade leaves of the beech (Fagus sylvatica L.) as monitored by
multi-colour fluorescence imaging. J. Plant Physiol. 163: 1273-1283.
Levy, D. y Marco, S. (1991) Indices of water deficit in susceptible and resistant
cucumber in response to infection by cucumber mosaic virus. Ann. Appl.
Biol. 119: 381-386.

278
F. Bibliografía

Lichtenthaler, H.K., Buschmann, C., Rinderle, U. y Schmuck, G. (1986)


Application of chlorophyll fluorescence in ecophysiology. Radiation Radiat.
Environ. Biophys. 25: 297-308.
Lichtenthaler, H.K. y Rinderle, U. (1988) The role of chlorophyll fluorescence in
the detection of stress conditions in plants. Crit. Rev. Anal. Chem. 19: S29-
85.
Lichtenthaler, H.K. (1996) Vegetation stress: an introduction to the stress concept
in plants. J. Plant Physiol. 148: 4-14.
Lichtenthaler, H.K., Lang, M., Sowinska, M., Heisel, F. y Miehé, J.A. (1996)
Detection of vegetation stress via a new high resolution fluorescence
imaging system. J. Plant Physiol. 148: 599-612.
Lichtenthaler, H.K. y Miehé, J.A. (1997) Fluorescence imaging as a diagnostic tool
for plant stress. Trends Plant Sci. 2: 316-320.
Lichtenthaler, H.K. (1998) The stress concept in plants: an introduction. Ann. NY
Acad. Sci. 851: 187-198.
Lichtenthaler, H.K. y Schweiger, J. (1998) Cell wall bound ferulic acid, the major
substance of the blue-green fluorescence emission of plants. J. Plant Physiol.
152: 272-282.
Lichtenthaler, H.K. y Babani, F. (2000) Detection of photosynthetic activity and
water stress by imaging the red chlorophyll fluorescence. Plant Physiol.
Biochem. 38: 889-895.
Lichtenthaler, H.K., Langsdorf, G., Lenk, S. y Buschmann, C. (2005) Chlorophyll
fluorescence imaging of photosynthetic activity with the flash-lamp
fluorescence imaging system. Photosynthetica 43: 355-369.
Lilley, K.S. y Dupree, P. (2006) Methods of quantitative proteomics and their
application to plant organelle characterization. J. Exp. Bot. 1493-1499.
Lindbeck, A.G.C., Dawson, O.W. y Thomson, W.W. (1991) Coat protein-related
polypeptides from in vitro tobacco mosaic virus coat protein mutants do no

279
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

accumulate in the chloroplast of directly inoculated leaves. Mol. Plant


Microbe In. 4: 89-94.
Lindenthal, M., Steiner, U., Dehne, H.W. y Oerke, E.C. (2005) Effect of downy
mildew development on transpiration of cucumber leaves visualized by
digital infrared thermography. Phytopathology 95: 233-240.
Lin, T.B., Schwartz, A. y Saranga, Y. (1999) Photosynthesis and productivity of
cotton under silverleaf whitefly stress. Plant Physiol. Biochem. 38: 889-895.
Link, A.J., Eng, J., Schieltz, D.M., Carmack, D., Mize, G.J. Morris, D.R., Garvik,
B.M. y Yates 3rd, J.R. (1999) Direct analysis of protein complexes using
mass spectrometry. Nature Biotech. 17: 676-682.
Linsey, D.W. y Gudauskas, R. T. (1975) Effects of maize dwarf mosaic virus on
water relations of corn. Phytopathology 65: 434-440.
Liska, A.J. y Shevchenko, A. (2003) Combining mass spectrometry with database
interrogation strategies in proteomics. Trends Anal. Chem. 22: 291-298.
Lohaus, G., Heldt, H.W. y Osmond, C.B. (2000) Infection with phloem limited
Abutilon mosaic virus causes localized carbohydrate accumulation in leaves
of Abutilon striatum: relationships to symptom development and effects on
chlorophyll fluorescence quenching during photosynthetic induction. Plant
Biol. 2: 161-167.
López, M.M., Bertolini, E., Olmos, A., Caruso, P., Gorris, M.T., Llop, P.,
Penyalver, R. y Cambra, M. (2003) Innovative tools for detection of plant
pathogenic viruses and bacteria. Int. Microbiol. 6: 233-243.
Lucas, J.W., Olesinki, A., Hull, J.R., Haudenshield, S.J., Deom, M.C., Beachy,
N.R. y Wolf, S. (1993) Influence of the tobacco mosaic virus 30-kDa
movement protein on carbon metabolism and photosynthate partitioning in
transgenic tobacco plants. Planta 190: 88-96.
Lüdeker, W., Dahn, H.-G. y Günter, K.P. (1996) Detection of fungal infection of
plants by laser-induced fluorescence: An attempt to use remote sensing. J.
Plant Physiol. 148: 579-585.

280
F. Bibliografía

Lüdeker, W., Günter, K.P y. Dahn, H.-G. (1997) Laser induced leaf fluorescence:
A tool for vegetation status- and stress-monitoring and optical aided
agriculture. En: Advances in laser remote sensing for terrestrial and
oceanographic applications. 3059: 63-75.
Malamy, J., Carr, J.P., Klessig, D.F. y Raskin, I. (1990) Salicylic acid: a likely
endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection.
Science. 250: 1002-1004.
Malek, K. y Dietrich, R.A. (1999) Defense on multiple fronts: how do plants cope
with diverse enemies? Trends Plant Sci. 4: 215-219.
Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A.R., Gruissem, W. y Varner, J.E. (1995)
Methods in Plant Molecular Biology: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY.
Mantha, S.V., Johnson, G.A. y Day, T.A. (2001) Evidence from action and
fluorescence spectra that UV-induced violet-blue-green fluorescence
enhances leaf photosynthesis. Photochem. Photobiol. 73: 249-256.
Masclaux-Daubresse, C., Carrayol, E. y Valadier, M.H. (2005) The two nitrogen
mobilisation- and senescence-associated GS1 and GDH genes are controlled
by C and N metabolites. Planta 221: 580-588.
Matouš, K., Benediktyová, Z., Berger, S., Roitsch, T. y Nedbal, L. (2007) Case
study of combinatorial imaging: What protocol and what chlorophyll
fluorescence image to use when visualizing infection of Arabidopsis thaliana
by Pseudomonas syringae? Photosynth. Res. doi: 10.1007/s11120-006-9120-
6.
Maule, A., Leh, V. y Lederer, C. (2002) The dialogue between viruses and hosts in
compatible interactions. Curr. Opin. Plant Biol. 5: 279-284.
Maxwell, D.P., Laudenbach, D.E. y Huner, N.P.A. (1995) Redox regulation of
light-harvesting complex II and cab mRNA abundance in Dunaliella salina.
Plant Physiol. 109: 787-795.

281
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Maxwell, K. y Johnson, G.N. (2000) Chlorophyll fluorescence – a practical guide.


J. Exp. Bot. 51: 659–668.
Mercure, S.A., Daoust, B. y Samson, G. (2004) Causal relationship between
growth inhibition, accumulation of phenolic metabolites, and changes of UV-
induced fluorescence in nitrogen-deficient barley plants. Can. J. Botanyt. 82:
815-821.
Merkle, T.H., Krenz, M., Wenng, A. y Schäfer, E. (1990) Nucleotide sequence and
deduced amino acid sequence of a gene encoding the 23 kDa polypeptide of
the oxygen-evolving complex from mustard (Sinapis alba L.). Plant Mol.
Biol. 14: 889-890.
Merlot, S., Mustilli, A.C., Genty, B., North, B., Lefebvre, V., Sotta, B., Vavasseur,
A. y Giraudat, J. (2002) Use of infrared thermal imaging to isolate
Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. Plant. J. 30: 601-609.
Messinger, S.M., Buckley, T.N. y Mott, K.A. (2006) Evidence for involvement of
photosynthetic processes in the stomatal response to CO2. Plant Physiol.
140: 771-778.
Meyer, S., Saccardy-Adji, K., Rizza, F. y Genty, B. (2001) Inhibition of
photosynthesis by Colletotrichum lindemuthianum in bean leaves determined
by chlorophyll fluorescence imaging. Plant Cell Environ. 24: 947-955.
Meyer, S., Cartelat, A., Moya, I. y Cerovic, Z.G. (2003) UV-induced blue-green
and far-red fluorescence along wheat leaves: a potential signature of leaf
ageing. J. Exp. Bot. 54: 757-769.
Mlotshwa, S., Voinnet, O., Mette, M.F., Matzke, M., Vaucheret, H., Ding, S.W.,
Pruss, G. y Vance, V.B. (2002) RNA silencing and the mobile silencing
signal. Plant Cell 14: S289-301.
Moon, S.K., McMurtrey, J.E., Mulchi, C.L., Daughtry, C.S.T., Chappelle, E.W. y
Chen, Y.-R. (2001) Steady-state multispectral fluorescence imaging system
for plant leaves. Appl. Opt. 40: 157-166.

282
F. Bibliografía

Morales, F., Cerovic, Z.G. y Moya, I. (1994) Characterization of blue-green


fluorescence in the mesophyll of sugar-beet (Beta vulgaris L) leaves affected
by iron deficiency. Plant Physiol. 106: 127-133.
Morales, F., Cerovic, Z.G. y Moya, I. (1996) Time-resolved blue-green
fluorescence of sugar beet (Beta vulgaris L) leaves. Spectroscopic evidence
for the presence of ferulic acid as the main fluorophore of the epidermis.
Biochim. Biophys. Acta 1273: 251-262.
Morales, F., Cerovic, Z.G. y Moya, I. (1998) Time-resolved blue-green
fluorescence of sugar beet leaves. Temperature-induced changes and
consequences for the potential use of blue-green fluorescence as a signature
for remote sensing of plants. Aust. J. Plant Physiol. 25: 325-334.
Morales, F., Cartelat, A., Álvarez-Fernández, A., Moya, I. y Cerovic, Z.G. (2005)
Time-resolved spectral studies of blue-green fluorescence of artichoke
(Cynara cardunculus L. var. Scolymus) leaves: Identification of chlorogenic
acid as one of the major fluorophores and age-mediated changes. J. Agric.
Food Chem. 53: 9668-9678.
Moya, I., Cartelat, A., Cerovic, Z.G., Ducruet, J.M., Evain, S., Flexas, J., Goulas,
Y., Louis, J., Meyer, S., Moise, N. y Ounis, A. (2003) Possible approaches to
remote sensing of photosynthetic activity. Learning from Earth’s shapes and
sizes, Proceedings of IEEE International Geoscience and Remote Sensing
symposium. I-VII: 588-590.
Mullineaux, P. y Karpinski, S. (2002) Signal transduction in response to excess
light: getting out of the chloroplast. Curr. Opin. Plant Biol. 5: 43-48.
Mur, L.A.J., Edi Santosa, I., Laarhoven, L.J.J., Holton, N.J., Harren F.J.M. y
Smith, A.R. (2005) Laser photoacoustic detection allows in planta detection
of nitric oxide in tobacco following challenge with avirulent and virulent
Pseudomonas syringae pathovars. Plant Physiol. 138: 1247-1258.
Murakami, R., Ifuku, K., Takabayashi, A., Shikanai, T., Endo, T. y Sato, F. (2005)
Functional dissection of two Arabidopsis PsbO2. FEBS J. 272: 2165-2175.

283
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Murphy, A.M., Chivasa, S., Singh, D.P. y Carr, J.P. (1999) Salicylic acid induced
resistance to viruses and other pathogens: a parting of the ways? Trends
Plant Sci. 4: 155-159.
Mustilli, A.C., Merlot, S., Vavasseur, A., Fenzi, F. y Giraudat, J. (2002)
Arabidopsis OST1 protein kinase mediates the regulation of stomatal
aperture by abscisic acid and acts upstream of reactive oxygen species
production. Plant Cell 14: 3089-3099.
Naidu, R.A., Krishnan, M., Ramanajam, P., Gnaman, A. y Nayudu, M.V. (1984a)
Studies on peanut green mosaic virus infected peanut (Arachis hypogaea L.)
leaves. I. Photosynthesis and photochemical reactions. Physiol. Plant.
Pathol. 25: 181-190.
Naidu, R.A., Krishnan, M., Nayudu, M.V. y Gnaman, A. (1984b) Studies on
peanut green mosaic virus infected peanut (Arachis hypogaea L.) leaves. II.
Chlorophyll-protein complexes and polypeptide composition of thylakoid
membranes. Physiol. Plant. Pathol. 25: 191-198.
Naidu, R.A., Krishnan, M., Nayudu, M.V. y Gnanam, A. (1986) Studies on peanut
green mosaic virus infected peanut (Arachis hypogaea L.) leaves. III.
Changes in the polypeptides of photosystem II particles. Physiol. Mol. Plant
P. 29: 53-58.
Naver, H., Haldrup, A. y Scheller, H.V. (1999) Cosuppression of photosystem I
subunit PSI-H in Arabidopsis thaliana. Efficient electron transfer and
stability of photosystem I is dependent upon the PSI-H subunit. J. Biol.
Chem. 274: 10784-10789.
Ndimba, B.K., Chivasa, S., Hamilton, J.M., Simon, W.J. y Slabas, A.R. (2003)
Proteomic análisis of changes in the extracellular matriz of Arabidopsis cell
suspension cultures induced by fungal elicitors. Proteomics 3: 1047-1059.
Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J. y Trtílek, M. (2000a) Kinetic
imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosinth. Res.
66: 3-12.

284
F. Bibliografía

Nedbal, L., Soukupová, J., Whitmarsh, J. y Trtílek, M. (2000b) Postharvest


imaging f chlorophyll fluorescence from lemons can be used to predict fruit
quality. Photosynthetica 38: 571-579.
Nedbal, L. y Březina, V. (2002) Complex metabolic oscillations in plants forced by
harmonic irradiance. Biophys.J. 83: 2180-2189.
Nedbal, L., Březina, V., Adamec, F., Štys, D., Oja, V., Laisk, A. y Govindjee
(2003) Negative feedback regulation is responsible for the non-linear
modulation of photosynthetic activity in plants and cyanobacteria exposed to
a dynamic light environment Biochim. Biophys. Acta 1607: 5-17.
Nedbal, L. y Whitmarsh, J. (2004) Chlorophyll fluorescence imaging of leaves and
fruits. En Chlorophyll a fluorescence: A signature photosynthesis.
Papageorgiou, C.G., Govindjee, eds. 14: 389-407. Springer. Dordrecht.
Newton, R.P., Brenton, A.G., Smith, C.J. y Dudley, E. (2004) Plant proteome
analysis by mass spectrometry: principles, problems, pitfalls and recent
developments. Phytochemistry 65: 1449-1485.
Nicholson, R.L. y Hammerschmidt, R. (1992) Phenolic compounds and their role
in disease resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 30: 369-389.
Niemann, G.J., van der Kerk, A., Niessen, W.M.A. y Versluis, K. (1991) Free and
cell wall-bound phenolics and other constituents from healthy and fungus-
infected carnation (Dianthus caryophyllus L.) stems. Physiol. Mol. Plant P.
38: 417-432.
Nilsson, H.-E. (1995a) Remote sensing and image analysis in plant pathology.
Annu. Rev. Phitopathol. 15: 489-527.
Nilsson, H.-E. (1995b) Remote sensing and image analysis in plant pathology.
Can. J. Plant Pathol. 17: 154-166.
Nixon, P.J., Barker, M., Boehm, M., de Vries, R. y Komenda, J. (2005) FtsH-
mediated repair of the photosystem II complex in response to light stress. J.
Exp. Bot. 56: 357-363.

285
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Niyogi, K.K., Xiao-Ping, L, Rosenberg, V. y Jung, H.-S. (2005) Is PsbS the site of
non-photochemical quenching in photosynthesis? J. Exp. Bot. 56: 375-382.
Obokata, J., Mikami, K., Hayashida, N., Nakamura, M. y Sugiera, M. (1993)
Molecular heterogeneity of photosystem I. psaD, psaE, psaF, psaH and psaL
are all present in isoforms in Nicotiana spp. Plant Physiol. 102: 1259-1267.
Obokata, J., Mikami, K., Yamamoto, Y. y Hayashida, N. (1994)
Microheterogeneity of PSI-E subunit of photosystem I in Nicotiana
sylvestris. Plant Cell Physiol. 35: 203-209.
Obregón, P., Martín, R., Sanz, A. y Castresana, C. (2001) Activation of defence-
related genes during senescence: a correlation between gene expression and
cellular damage. Plant Mol. Biol. 46: 67-77.
Oerke, E-C., Steiner, U., Dehne, H-W. y Lindenthal, M. (2006) Thermal imaging
of cucumber leaves affected by downy mildew and environmental
conditions. J. Exp. Bot. 57: 2121-2132.
O’Farrell, P.Z., Goodman, H.M. y O’Farrell, P.H. (1977) High resolution two
dimentional of basic as well as acidic proteins. Cell 12: 1133-1142.
Omasa, K. y Takayama, K. (2003) Simultaneous measurement of stomatal
conductance, non-photochemical quenching, and photochemical yield of
Photosystem II in intact leaves by thermal and chlorophyll fluorescence
imaging. Plant Cell Physiol. 44: 1290-1300.
Oparka, K.J. y Santa Cruz, S. (2000) The great escape: phloem transport and
unloading of macromolecules. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51:
323-347.
Osmond, C.B., Berry, J.A., Balachandran, S., Büchen-Osmond, C., Daley, P.F. y
Hodgson, R.A.J. (1990) Potential consequences of virus infection for shade-
sun acclimation in leaves. Bot. Acta 103: 226-229.
Osmond, C.B., Daley, P.F., Badger, M.R. y Lüttge, U. (1998) Chlorophyll
fluorescence quenching during photosynthetic induction in leaves of

286
F. Bibliografía

Abutilon striatum Dicks. infected with Abutilon mosaic virus observed with
a field-portable system. Bot. Acta 111: 390-397.
Oswald, O., Martin, T., Dominy, P.J. y Graham, I.A. (2001) Plastid redox state and
sugars: interactive regulators of nuclear-encoded photosynthetic gene
expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 2047-2052.
Ounis, A., Cerovic, Z.G., Briantais, J.M. y Moya, I. (2001) Dual excitation
FLIDAR for the estimation of epidermal UV absorption in leaves and
canopies. Rem. Sens. Environ. 76: 33-48.
Padliya, N.D. y Cooper, B. (2006) Mass spectrometry-based proteomics for the
detection of plant pathogens. Proteomics 6: 4069-4075.
Pearce, R.S. (2001) Plant freezing and damage. Ann. Bot. 87: 417-424.
Pearce, R.S. y Fuller, M.P. (2001) Freezing of barley studied by infrared video
thermography. Plant Physiol. 125: 227-240.
Peltier, J.-B., Friso, G., Kalume, D.E., Roepstorff, P., Nilsson, F., Adamska, I. y
van Wijk, K.J. (2000) Proteomics of the chloroplast: systematic
identification and targeting analysis of lumenal and peripheral thylakoid
proteins. Plant Cell 12: 319-341.
Peltier, J.-B., Emanuelsson, O., Kalume, D.E., Yttergerg, J., Friso, G., Rudella, A.,
Liberles, D.A., Söderberg, L., Roepstorff, P., von Heijne, G. y van Wijk, K.J.
(2002) Central functions of the lumenal and peripheral thylakoid proteome of
Arabidopsis determined by experimentation and genome-wide prediction.
Plant Cell 14: 211-236.
Peltier, J.B., Ytterberg, J.A., Sun, Q. y van Wijk, K.J. (2004) New functions of the
thylakoid membrane proteome of Arabidopsis thaliana revealed by a simple,
fast, and versatile fractionation strategy. J. Biol. Chem. 279: 49367-49383.
Pérez-Bueno, M.L. (2003) Photosystem II and viral infection: Analysis of
fluorescence imaging and regulation of the synthesis of the oxygen-evolving-
complex proteins during pathogenesis. Tesis Doctoral, Universidad de
Granada, España.

287
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Pérez-Bueno, M.L., Rahoutei, J., Sajnani, C., García-Luque, I. y Barón, M. (2004)


Proteomic analysis of the oxygen-evolving complex of photosystem II under
biotic stress. Studies on Nicotiana benthamiana infected with tobamoviruses.
Proteomics 4: 418-425.
Pérez-Bueno, M.L., Ciscato, M., vandeVen, M., García-Luque I., Valcke, R. y
Barón, M. (2006) Imaging viral infection. Studies on Nicotiana benthamiana
plants infected with the pepper mild mottle tobamovirus. Photosynth. Res.
90: 111-123.
Peterson, R.B. y Aylor, D.E. (1995) Chlorophyll fluorescence induction in leaves
of Phaseolus vulgaris infected with bean rust (Uromyces appendiculatus).
Plant Physiol. 108: 163-171.
Pfannschmidt, T. (2003) Chloroplast redox signals: how photosynthesis controls its
own genes. Trends Plant Sci. 8: 33-41.
Phee, B.-K., Cho, J.-H., Park, S., Jung, J.H., Lee, Y.-H., Jeon, J.-S., Bhoo, S.H. y
Hahn, R.-R. (2004) Proteomic analysis of the response of Arabidopsis
chloroplast proteins to high light stress. Proteomics 4: 3560-3568.
Plumbe, A.M. y Willmer, C.M. (1986) Phytoalexins, water-stress and stomata. III.
The effects of some phenolics, fatty acids and some other compounds on
stomatal responses. New Phytol. 103: 17-22.
Porubleva, L., Vander Velden, K., Kothari, S., Oliver, D.J. y Chitnis, P.R. (2001)
The proteome of maize leaves: use of gene sequences and expressed
sequence tag data for identification of proteins with peptide mass
fingerprints. Electrophoresis 22: 1724-1738.
Pudil, P., Novovicova, J. and Kittler, J. (1994) Floating search methods in
feature selecdtion. Pattern Recognition Letters 15: 1119-1125.
Rahoutei, J., García-Luque, I., Cremona, V. y Barón, M. (1998) Effect of
tobamovirus infection on PSII complex of infected plants. In Photosynthesis:
from light to biosphere. 4: 2761-2764. G Garab, ed., Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht.

288
F. Bibliografía

Rahoutei, J., Barón, M., García-Luque, I., Droppa, M., Neményi, A. y Horvath, G.
(1999) Effect of tobamovirus infection on the thermoluminiscence
characteristics of chloroplast from infected plants. Z. Naturforsch. 54c: 634-
639.
Rahoutei, J. (2000) Efecto de la infección en el proceso fotosintético de la planta
huésped. Tesis Doctoral, Universidad de Granada, España.
Rahoutei, J., García-Luque, I. y Barón, M. (2000) Inhibition of photosynthesis by
viral infection: Effect on PSII structure and function. Physiol. Plantarum
110: 286-292.
Raines, C.A. (2003) The Calvin cycle revisited. Photosynth. Res. 110: 286-292.
Raskin, I. y Ladyman, J.A.R. (1988) Isolation and characterization of a barley
mutant with abscisic-acid-insensitive stomata. Planta 173: 73-78.
Raskin, I., Ehmann, A., Melander, W.R. y Meeuse, B.J.D. (1987) Salicylic acid: a
natural inducer of heat production in Arum lilies. Science 237: 1601-1602.
Reche, A., Lázaro, J.J., Hermoso, R., Chueca, A. y López Gorgé, J. (1997) Binding
and activation of pea chloroplast fructosa-1,6-biphosphatase by homologous
thioredoxins m and f. Physiol. Plantarum 101: 463-470.
Reinero, A. y Beachy, N.R. (1986) Association of TMV coat protein with
chloroplast membranes in virus-infected leaves. Plant. Mol. Biol. 6: 291-301.
Reinero, A. y Beachy, N.R. (1989) Reduced photosystem II activity and
accumulation of viral coat protein in chloroplast of leaves infected with
tobacco mosaic virus. Plant Physiol. 89: 111-116.
Rep, M., Dekker, H.L., Vossen, J.H., de Boer, A.D., Houterman, P.M., Speijer, D.,
Back, J.W., de Koster, C.G. y Cornelissen, B.J.C. (2002) Mass spectrometric
identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected
tomato. Plant Physiol. 130: 904-917.
Repka, V. (2002) Chlorophyll-deficient mutant in oak (Quercus petraea L.)
displays an accelerated hypersensitive-like cell death and an enhanced
resistance to powdery mildew disease. Photosynthetica 40: 183-193.

289
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Richards, J.T., Schuerger, A.C., Capelle, G. y Guikema, J.A. (2003) Laser-induced


fluorescence spectroscopy of dark- and light-adapted bean (Phaseolus
vulgaris L.) and wheat (Triticum aestivum L.) plants grown under three
irradiance levels and subjected to fluctuating lighting conditions. Remote
Sens. Environ. 84: 323-341.
Roberts, A.G., Santa Cruz, S., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Turgeon, R. y Oparka,
K.J. (1997) Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana
comparison of a fluorescent solute with fluorescent virus. Plant Cell 9: 1381-
1396.
Roggero, P. y Pennazio, S. (2005) Two-dimensional polyacrylamide gel
electrophoresis of extracellular soybean pathogenesis-related proteins using
PhastSystem. Electrophoresis 11: 86-90.
Roháček, K y Barták, M (1999) Technique of the modulated chlorophyll
fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications.
Photosynthetica 37: 339-363.
Rokka, A., Zhang, L. y Aro, E.M. (2001). Rubisco activase: an enzyme with a
temperature dependent dual function? Plant J. 25: 463-471.
Rolland, N., Ferro, M., Seigneurin-Berny, D., Garin, J., Douce, R. y Joyard, J.
(2003) Proteomics of chloroplast envelope membranes. Photosynth. Res. 78:
205-230.
Rolfe, A.S. y Scholes, J.D. (1995) Quantitative imaging of chlorophyll
fluorescence. New Phytol. 131: 69-79.
Romero-Aranda, R., Soria, T. y Cuartero, J. (2001). Tomato plant-water uptake and
plant-water relationships under saline growth conditions. Plant Science 160:
265-272.
Rose, J.K., Bashir, S., Giovannoni, J.J., Jahn, M.M. y Saravanan, R.S. (2004)
Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental
tools. Plant J. 39: 715-733.

290
F. Bibliografía

Rossignol, M. (2001) Analysis of the plant proteome. Curr. Opin. Biotech. 12: 131-
134.
Rossignol, M., Peltier, J.-B., Mock, H.-P., Matros, A., Maldonado, A.M. y Jorrín,
J.V. (2006) Plant proteome analysis: A 2004-2006 update. Proteomics 6:
5529-5548.
Rowland, D., Dorner, J., Sorensen, R., Beasley, J.P. Jr. y Todd, J. (2005) Tomato
spotted wilt virus in peanut tissue types and physiological effects related to
disease incidence and severity. Plant Pathology 54: 431-440.
Ruban, A.V. y Horton, P. (1995) Regulation of non-photochemical quenching of
chlorophyll fluorescence in plants. Aust. J. Plant Physiol. 22: 221-230.
Ruíz del Pino, M., Moreno, A., García de Lacoba, M., Castillo-Lluva, S., Gilardi,
P., Serra, M.T. y García-Luque, I. (2003) Biological and molecular
characterization of P101 isolate, a tobamoviral pepper strain from Bulgaria.
Arch. Virol. 148: 2115-2135.
Ryšlavá, H., Müller, K., Semorádová, Š., Synková, H. y Čeřovská, N. (2003)
Photosynthesis and activity of phosphoenolpyruvate carboxylase in
Nicotiana tabacum L. leaves infected by Potato virus A and Potato virus Y.
Photosynthetica 41: 357-363.
Saito, Y., Kanoh, M., Hatake, K., Kawahara, T.D. y Nomura, A. (1998)
Investigation of laser-induced fluorescence of several natural leaves for
application to LIDAR vegetation monitoring. App. Opt. 37: 431-437.
Sajnani, C. (2005) Infecciones virales como factor de estrés en fotosíntesis. Tesis
doctoral, Universidad de Granada, España.
Sajnani, C., Zurita, J.L., Doncel, M., Ortega, J.M., Barón, M. y Ducruet, J.-M.
(2007) Changes in photosynthetic metabolism induced by tobamovirus
infection in Nicotiana benthamiana studied in vivo by chlorophyll
thermoluminescence. New Phytol. En prensa.

291
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Sampol, B., Bota, J., Riera, D., Medrano, H. y Flexas, J. (2003). Analysis of the
virus-induced inhibition of photosynthesis in malmsey grapevines. New
Phytologist 160: 403-412.
Samuel, G. (1934). The movement of tobacco mosaic virus within. the plant. Ann.
App. Biol. 21: 90-111.
Sánchez de Jiménez, E., Medrano, L. y Martínez-Barajas, E. (1995).
Rubiscoactivase, a possible new member of the molecular chaperone family.
Biochemistry 34: 2826-2831.
Santa Cruz, S. (1999) Perspective: phloem transport of viruses and macromolecules
– what goes in must come out. Trends Microbiol. 7: 237-241.
Sauer, K. y Debreczeny, M. (1996) Fluorescence. En Biophysical Techniques in
Photosynthesis. Amesz J. y Hoff, J., ed. 3: 41-61. Kluwer Academic
Publishers. Dordrecht.
Sahnoun, I., Déhais, P., Van Montagu, M., Rossignol, M. y Rouzé, P. (2000)
PPMdb: a plant plasma membrane database. J. Biotechnol. 78: 235-246.
Schägger, H. y von Jagow, G. (1991) Blue native electrophoresis for isolation of
membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem.
199: 223–231.
Schägger, H., Cramer, W.A. y von Jagow, G. (1994) Analysis of molecular masses
and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis
and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native
electrophoresis. Anal. Biochem. 217: 220-230.
Schansker, G., Tóth, S.Z. y Strasser, R.J. (2006) Dark recovery of the Chl a
fluorescence transient (OJIP) after light adaptation: The qT-component of
non-photochemical quenching is related to an activated photosystem I
acceptor side. Biochim. Biophys. Acta 1757: 787-797.
Scharte, J., Schon, H. y Weiss, E. (2005) Photosynthesis and carbohydrate
metabolism in tobacco leaves during an incompatible interaction with
Phytophthora nicotianae. Plant Cell Environ. 28: 1421-1435.

292
F. Bibliografía

Scheller, H.V., Jensen, P.E., Haldrup, A., Lunde, C. y Knoetzel, J. (2001) Role of
subunits in eukaryotic PSI. Biochim. Biophys. Acta 1507: 41-60.
Schevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. y Mann, M. (1996) Mass spectrometric
sequencing of proteins from silver stained polyacrylamide gels. Anal. Chem.
68: 850-858.
Schmitz, A., Kiewnick, S., Schlang, J. y Sikora, R.A. (2004) Use of high resolution
digital thermography t detect Heterodera schachtii infestation in sugar beets.
Comm. Appl. Biol. Sci. 69: 359-363.
Scholes, J.D., Lee, P.J., Horton, P. y Lewis, D.H. (1994) Invertase: understanding
changes in the photosynthetic and carbohydrate metabolism of barley leaves
infected with powdery mildew. New Phytol. 126: 213-222.
Scholes, J.D. y Rolfe, S.A. (1996) Photosynthesis in localised regions of oat leaves
infected with crown rust (Puccinia coronata): quantitative imaging of
chlorophyll fluorescence. Planta 199: 573-582.
Schreiber, U., Schliwa, U. y Bilger, W. (1986) Continuous recording of
photochemical and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching
with a new type of modulation fluorometer. Photosynthesis Res. 10: 51-62.
Schroda, M., Kropat, J., Oster, U., Rudiger, W., Vallon, O., Wollman, F.A. y Beck,
C.F. (2001) Possible role for molecular chaperones in assembly and repair of
photosystem II. Biochem. Soc. Trans. 29: 413-418.
Schröder, PW. y Kieselbach, T. (2003) Update on chloroplast proteomics.
Photosynt. Res. 78: 181-193.
Schubert, M., Petersson, U.A., Haas, B.J., Funk, c., Schröder, W.P. y Kieselbach,
T. (2002) Proteome map of the chloroplast lumen of Arabidopsis thaliana. J.
Biol. Chem. 277: 8354-8365.
Schuerger, A.C., Capelle, G.A., Di Benedetto, J.A., Mao, C.Y., Thai, C.N., Evans,
M.D., Richards, J.T., Blank, T.A. y Stryjewski, E.C. (2003) Comparison of
two hyperspectral imaging and two laser-induced fluorescence instruments

293
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

for the detection of zinc stress and chlorophyll concentration in bahia grass
(Paspalum notatum Flugge.). Remote Sens. Environ. 84: 572-588.
Schurr, U., Schuberth, B., Aloni, R., Pradel, K.S., Schmundt, D., Jahne, B. y
Ullrich, C.I. (1996) Structural and functional evidence for xylem-mediated
water transport and high transpiration in Agrobacterium tumefaciens-induced
tumors of Ricinus communis. Bot. Acta 109: 405-411.
Schuster, A.M. y Davies, E. (1983) Ribonucleic acid and protein metabolism in pea
epicotyls. Plant Physiol. 73: 809-816.
Schweiger, J., Lang, M. y Lichtenthaler, H.K. (1996) Differences in fluorescence
excitation spectra of leaves between stressed and non-stressed plants. J. Plant
Physiol. 148: 536-547.
Seigneurin-Berny, D., Rolland, N., Garin, J. y Joyard, J. (1999) Differential
extraction of hydrophobic proteins from chloroplast envelope membranes: a
subcellular-specific proteomic approach to identify rare intrinsic membrane
proteins. Plant J. 19: 217-228.
Selye, H. (1936) A syndrome produced by a various nucuous agents. Nature 138:
32-34.
Seo, J. y Lee, K.-J. (2004) Post-translational modifications and their biological
functions: proteomic analysis and systematic approaches. J. Biochem. Mol.
Biol. 37: 35-44.
Sétif, P., Fischer, N., Lagoutte, B., Bottin, H. y Rochaix, J.-D. (2002) The
ferredoxin docking site of photosystem I. Biochim. Biophys. Acta 1555: 204-
209.
Shalitin, D. y Wolf, S. (2000) Cucumber mosaic virus infection affects sugar
transport in melon plants. Plant Physiol. 123: 597-604.
Shaw M.M. y Riederer M.B. 2003. Sample preparation for two-dimensional gel
electrophoresis. Proteomics 3: 1408-17.
Sheen, J. (1990) Metabolic repression of transcription in higher plants. Plant Cell
2: 1027-1038.

294
F. Bibliografía

Smith, J.A., Blanchette, R.A., Burnes, T.A., Jacobs, J.J., Higgins, L.A., Whitthuhn,
B.A., David, A.J. y Gillman, J.H. (2006) Proteomic comparison of needles
from blister rust-resistant and susceptible Pinus strobus seedlings reveals up
regulation of putative disease resistance proteins. Mol. Plant Microbe In. 19:
150-160.
Somssich, I.E. y Hahlbrook, K. (1998) Patthogen defence in plants – a paradigm of
biological complexity. Trends Plant Sci. 3: 86-90.
Soukupová, J., Smatanová, S., Nedbal, L. y Jegorov, A. (2003) Plant response to
destruxins visualized by imaging of chlorophyll fluorescence. Physiol.
Plantarum 118: 399-405.
Sridhar, R., Mohanty, S.K. y Ramarkrishanayya, G. (1994). Physiology of rice
tungro virus disease: water relations of diseased plants. Acta Phytopatologica
et Entomologica Hungarica 29: 137-145.
Steinberg, T.H., Jones, L.J., Haugland, R.P. y Singer, V.L. (1996) SYPRO Orange
and SYPRO Red Protein gel stains: One-step fluorescent staining of
denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal. Biochem.
239: 223-237.
Stober, F. y Lichtenthaler, H.K. (1992) Changes of the laser-induced blue, green
and red fluorescence signatures during greening of etiolated leaves of wheat.
J. Plant Physiol. 140: 673-680.
Stober, F. y Lichtenthaler, H.K. (1993a) Characterization of the laser-induced blue,
green and red fluorescence signatures of leaves of wheat and soybean grown
under different irradiance. Physiol. Plantarum 88: 696-704.
Stober, F. y Lichtenthaler, H.K. (1993b) Studies on the localization and spectral
characteristics of the fluorescence emission of differently pigmented wheat
leaves. Bot. Acta 106: 365-370.
Stober, F., Lang, M. y Lichtenthaler, H.K. (1994) Blue, green, and red fluorescence
emission signatures of green, etiolated, and white leaves. Remote Sens.
Environ. 47: 65-71.

295
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Subhash, N., Mazzinghi, P., Agati, G., Fusi, F. y Lercari, B. (1995) Analysis of
laser-induced fluorescence line-shape of intact leaves - Application to UV
stress detection. Photochem. Photobiol. 62: 711-718.
Suckau, D., Resemann, A., Schuerenberg, M., Hufnagel, P., Franzen, J. y Holle, A.
(2003) A novel MALDI LIFT-TOF/TOF mass spectrometer for proteomics.
Anal. Bioanal. Chem. 376: 952-965.
Sui, C., Fan, Z., Wong, S.-M. y Li, H. (2006) Cloning of cDNAs encoding the
three subunits of oxygen evolving complex in Nicotiana benthamiana and
gene expression changes in tobacco leaves infected with Tobacco mosaic
virus. Physiol. Mol. Plant P. 68: 61-68.
Swarbrick, P.J., Schulze-Lefert, P. y Scholes, J.D. (2006) Metabolic consequences
of susceptibility and resistance (race-specific and broad-spectrum) in barley
leaves challenged with powdery mildew. Plant Cell Environ. 29: 1061-1076.
Szabó, I., Bergantino, E. y Giacometti, G.M. (2005) Light and oxygenic
photosynthesis: energy dissipation as a protection mechanism against photo-
oxidation. EMBO reports 6: 629-634.
Szigeti, Z., Almási, A. y Sárvári, É. (2002) Changes in the photosynthetic functions
in leaves of Chinese cabbage infected with Turnip Yellow Mosaic Virus.
Acta Biologica Szegediensis 46: 137-138.
Takács, Z., Lichtenthaler, H.K. y Tuba, Z. (2000) Fluorescence emission spectra of
desiccation-tolerant cryptogamic plants during a rehydration - desiccation
cycle. J. Plant Physiol. 156: 375-379.
Takahama, U. (1998) Ascorbic acid-dependent regulation of redox levels of
chlorogenic acid and its isomers in the apoplast of leaves of Nicotiana
tabacum L. Plant Cell Physiol. 39: 681-689.
Takahashi, H., Ehara, Y. y Hirano, H. (1991) A protein in the oxygen-evolving
complex in the chloroplasts is associated with symptom expression on
tobacco leaves infected with cucumber mosaic virus strain Y. Plant Mol.
Biol. 16: 689-698.

296
F. Bibliografía

Takahashi, H. y Ehara, Y. (1992) Changes in the activity and the polypeptide


composition of the oxygen-evolving complex in photosystem II of tobacco
leaves infected with cucumber mosaic virus strain Y. Mol. Plant Microbe In.
5: 269-272.
Tanaka, M., Wakasugi, T., Sugita, M., Shinozaki, K. y Sugiura, M. (1986) Genes
for the eight ribosomal proteins are clustered on the chloroplast genome of
tobacco (Nicotiana tabacum): Similarity to the S10 and spc operons of
Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6030-6034.
Tanaka, K., Waki, H., Ido, Y., Akita, S., Yoshida, Y., y Yoshida, T. (1988) Protein
and polymer análisis up to m/z 100,000 by laser ionization time-of-flight
mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2: 151-153.
Tang, J.Y., Zielinski, R.E., Zangerl, A.R., Crofts, A.R., Berenbaum, M.R. y de
Lucia, E.H. (2006) The differential effects of herbivory by first and fourth
instars of Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) on photosynthesis in
Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 57: 527-536.
Técsi, L.I., Maule, A.J., Smith, A.M. y Leegood, R.C. (1994) Complex, localized
changes in CO2 assimilation and starch content associated with the
susceptible interaction between cucumber mosaic virus and a cucurbit host.
Plant J. 5: 837-847.
Teixeira, J., Pereira, S., Cánovas, F. y Salema, R. (2005) Glutamine synthetase of
potato (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) plants: cell- and organ-specific
roles in nitrogen assimilation and mobilization. J. Exp. Bot. 56: 663-671.
Thévenaz, P., Ruttimann, U.E. y Unser, M. (1998) A pyramid approach to subpixel
registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7: 27-41.
Tollner, E.W., Becht, J.K., Upchurch, B.L., Shewfelt, R.L. y Prussia, S.E. (1993)
Nondestructive evaluation: detection of external and internal attributes
frequently associated with quality or damage. Postharvest handling: a
systems approach A volume in the Food Science and Technology Series:
225-255.

297
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Tonge, R., Shaw, J., Middleton, B., Rowlinson, R., Rayner, S., Young, J., Pognan,
F., Hawkins, E., Currie, I. y Davidson, M. (2001) Validation and
development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis
proteomics technology. Proteomics 1: 377-396.
Ünlü, M., Morgan, M.E. y Minden, J.S. (1997) Difference gel electrophoresis: a
single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis
18: 2071-2077.
Valcke, R. (2003) Fluorescence imaging: the stethoscope of the plant physiologist.
Adv. Plant Phsysiol. 6: 445-462.
Van Der Straeten, D., Chaerle, L., Sharkov, G., Lambers, H. y Van Montagu, M.
(1995) Salicylic acid enhances the activity of the alternative pathway of
respiration in tobacco leaves and induces thermogenicity. Planta 196: 412-
419.
van Kooten, O., Meurs, C. y van Loon, L.C. (1990) Photosynthetic electron
transport in tobacco leaves infected with tobacco mosaic virus. Physiol.
Plantarum 80: 446-452.
van Wijk, K.J., Schnettger, B., Graf, H. y Krause, G.H. (1993) Photoinhibition and
recovery in relation to heterogeneity of photosystem II. Biochim. Biophys.
Acta 1142: 59-68.
van Wijk, K.J. (2001) Challenges and prospects of plant proteomics. Plant Physiol.
126: 501-508.
van Wijk, K.J. (2004) Plastid proteomics. Plant Physiol. Biochem. 42: 963-977.
Vranová, E., Inzé, d. y Van Breusegem, F. (2002) Signal transduction during
oxidative stress. J. Exp. Bot. 53: 1227-1236.
Wales, R., Nweman, B.J., Pappin, D. y Gray, J.C. (1989) The extrinsic 33 kDa
polypeptide of the oxygen-evolving complex of photosystem II is a putative
calcium-binding protein and is encoded by a multi-gene family in pea. Plant
Mol. Biol. 12: 439-451.

298
F. Bibliografía

Walter, R.G. y Horton, P. (1991) Resolution of components of non-photochemical


chlorophyll fluorescence quenching in barley leaves. Photosynth. Res. 27:
121-133.
Wardle, K. y Short, K.C. (1983) Stomatal response of in vitro cultured plantlets. I.
Responses in epidermal strips of Chrysanthemum to environmental factors
and growth regulators. Biochem. Physiol. Pflanzen 178, 619–624.
Wang, Y.B., Holroyd, G., Hetherington, A.M. y Ng, C.K.Y. (2004) Seeing 'cool'
and 'hot'-infrared thermography as a tool for non-invasive, high-throughput
screening of Arabidopsis guard cell signalling mutants. J. Exp. Bot. 55:
1187-1193.
Weis, E., Meng, Q., Siebke, K., Lippert, K. y Esfeld, P. (1998) Topography of leaf
carbon metabolism as analyzed by chlorophyll a-fluorescence. In
Photosynthesis: mechanisms and effects Vol 5. Edited by G. Garab pp. 4259-
4264. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht.
Wetter, C., Conti, M., Alschuh, D., Tabillion, R. y van Regemortel, M.H.V. (1984)
Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily.
Phytopathology 74: 405-410.
Whenham, R.J. y Fraser, R.S.S. (1981) Effect of systemic and local-lesion-forming
strains of tobacco mosaic virus on abscisic acid concentration in tobacco
leaves: consequences for the control of leaf growth. Physiol. Plant Pathol.
18: 267-278.
Whenham, R.J., Fraser, R.S.S., Brown, L.P. y Payne, J.A. (1986) Tobacco-mosaic-
virus-induced increase in abscisic-acid concentration in tobacco leaves:
Intracellular location in light and dark-green areas, and relationship to
symptom development. Planta 168: 592-598.
Whitelegge, J.P. (2003) Thylakoid membrane proteomics. Photosynth. Res. 78:
265-277.

299
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Whitelegge, J.P. (2004) Mass spectrometry for high throughput quantitative


proteomics in plant research: lesson from thylakoid membranes. Plant
Physiol. Bioch. 42: 919-927.
Whitelegge, J.P., Laganowsky, A., Nishio, J., Souda, P., Zhang, H.M. y Cramer,
W.A. (2006) Sequencing covalente modifications of membrane proteins. J.
Exp. Bot. 57: 1515-1522.
Williams, K.L. y Hochstrasser, D.F. (1997) Proteome research: new frontiers in
functional genomics. En: Introduction to the Proteome, Wilkins, M.R.,
Williams, K., Appel, R., y Hochstrasser, D., eds. Springer, Nueva York.
Willmer, C.M., Wilson, A.B. y Jones, H.G. (1988) Changing responses of stomata
to abscisic acid and carbon dioxide as leaves and plants age. J. Exp. Bot. 39:
401-410.
Wilm, M. y Mann, M. (1996) Analytical properties of the nano-electrospray ion
source. Anal. Chem. 68: 1-8.
Wilson, K.A., McManus, M.T., Gordon, M.E. y Jordan, T.W. (2002) The
proteomics of senescence in leaves of white clover, Trifolium repens L.
Proteomics 2: 1114-1122.
Wisniewski, M., Lindow, S.E. y Ashworth, E.N. (1997) Observations of ice
nucleation and propagation in plants using infrared video thermography.
Plant Physiol. 113: 327-334.
Wolfbeis, O.S. (1985) Fluorescence of organic natural products. En: Molecular
luminescence spectroscopy: Methods and application. Part I. Schulman SG
(ed) John Wiley & Sons, New York, 167.
Wright, D.P., Baldwin, B.C., Shephard, M.C. y Scholes, J.D. (1995a) Source–sink
relationships in wheat leaves infected with powdery mildew. I. Alterations in
carbohydrate metabolism. Physiol Mol Plant Pathol 47: 237–253.
Wright, P.D., Baldwin, C.B., Shephard, C.M. y Scholes, J.D. (1995b) Soruce-sink
relationships in wheat leaves infected with powdery mildew. II. Changes in
the regulation of the Calvin cycle. Physiol. Mol. Plant P. 47: 255-267.

300
F. Bibliografía

Wulf, J.S., Herppich, W.B., Geyer, M. y Zude, M. (2003) Laser-induced


fluorescence spectroscopy (LIFS) - a non-destructive method to detect tissue
browning. Acta Horticulturae 1-2: 653-658.
Yamada, S., Komori, T., Hashimoto, A., Kuwata, S., Imaseki, H. y Kubo, T.
(2000) Differential expression of plastidic aldolase genes in Nicotiana plants
under salt stress. Plant Sci. 54: 61-69.
Yamamoto, Y., Tsuji, H. y Obokata, J. (1993) Structure and expression of a nuclear
gene for the PSI-D subunit of photosystem I in Nicotiana sylvestris. Plant.
Mol. Biol. 22: 985-994.
Yan, S.-P., Zhang, Q.-Y., Tang, Z.-C., Su, W.-A y Sun, W.-N. (2006) Comparative
proteomic analysis provides new insights into chiling stress responses in rice.
Mol. Cell. Proteomics 5: 484-496.
Yi, X., Hargett, S.R., Frankel, L.K. y Bricker, T.M. (2006) The PsbQ protein is
required in Arabidopsis for photosystem II assembly/stability and
photoautotrophy under low light conditions. J. Biol. Chem. 281: 26260-
26267.
Yu, J., Hu, S., Wang, J., Wong, G.K., Li, S., Liu, B., Deng, Y., Dai, L., Zhou, Y.,
Zhan, X., Cao, M., Liu, J., Sun, J., Tang, J., Chen, Y., Huang, X., Lin, W.,
Ye, D., Tong, W., Cong, L., Geng, J., Han, Y., Li, L., Li, W., Hu, G., Huang,
X., Li, W., Li, J., Liu, Z., Li, L., Liu, J., Qi, Q., Liu, J., Li, L., Li, T., Wang,
W., Lu, H., Wu, T., Zhu, M., Ni, P., Han, H., Dong, W., Ren, X., Feng, X.,
Cui, P., Li, X., Wang, H., Xu, X., Zhai, W., Xu, Z., Zhang, J., He, S., Zhang,
J., Xu, J., Zhang, K., Zheng, X., dong, J., Zeng, W., Tao, L., Ye, J., Tan, J.,
Ren, X., Chen, X., He, J., Liu, D., Tian, W., Tian, C., Xia, H., Bao, Q., Li,
G., Gao, H., Cao, T., Wang, J., Zhao, W., Li, P., Chen , W., Wang, X.,
Zhang, Y., Hu, J., Wang, J., Liu, S., Yang, J., Zhang, G., Xiong, Y., Li, Z.,
Mao, L., Zhou, C., Zhu, Z., Chen, R., Hao, B., Zheng, W., Chen, s., Guo, W.,
Li, G., Liu, S., Tao, M., Wang, J., Zhu, L., Yuan, L. y Yang, H. (2002) A

301
Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. spp. Indica). Science 296:
79-92.
Žabka, M., Drastichová, K., Jegorov, A., Soukupová, J. y Nedbal, L. (2006) Direct
evidence of plant-pathogenic activity of fungal metabolites of Trichothecium
roseum on apple. Mycopathologia 162: 65-68.
Zangerl, A.R., Hamilton, J.G., Miller, T.J., Crofts, A.R., Oxborough, K.,
Berenbaum, M.R. y de Lucia, E.H. (2002) Impact of folivory on
photosynthesis is greater than the sum of its holes. P. Natl. Acad. Sci. USA
22: 1088-1091.
Zhou, Y.H., Peng, Y.H., Lei, J.L., Zou, L.Y., Zheng, J.H. y Yu, J.Q. (2004) Effects
of potato virus YNTN infection on gas exchange and photosystem 2 function
in leaves of Solanum tuberosum L. Photosynthetica 42: 417-423.
Zhou, W., Eudes, F. y Laroche, A. (2006) Identification of differntially regulated
proteins in response to a compatible interaction between the pathogen
Fusarium graminearum and its host, Triticum aestivum. Proteomics 6: 4599-
4609.
Zivy, M. y de Vienne, D. (2000) Proteomics: a link between genomics, genetics
and physiology. Plant Mol. Biol. 44: 575-580.
Zolla, L., Rinalducci, S., Timperio, A.M. y Huber, C.V. (2004) Separation and
identification of photosynthetic antenna membrane proteins by high-
performance liquid chromatography electrospray ionization mass
spectrometry. Eur. J. Mass Spectrom. 10: 321-333.
Zude, M. (2006) Detection of fruit tissue browning using laser-induced
fluorescence spectroscopy. Acta Horticulturae 1-2: 85-90.

302
G. Anexos

Anexo 1: Imágenes de microscopía óptica realizadas a partir de impresiones epidérmicas de hojas de


Nicotiana benthamiana, que muestran el grado de apertura cada muestra.

Control

PMMoV-I

PMMoV-S

dpi 7 14 17 19 21 24 28

0 1

Anexo 2: FV/FM de la hoja AS de Nicotiana benthamiana control e infectada con PMMoV a


distintos tiempos post-infección.

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