CARRERA(S): Medicina Humana

PRÁCTICA DE LABORATORIO

CURSO: Bioquímica

DOCENTE: Quispe Martinez,Sandra Cristel

INFORME DE PRÁCTICA

N° PRÁCTICA: 1

TÍTULO: Espectrofotometría

INTEGRANTES:

● Camasi Curo, Evelin Sandra - 100115900@cientifica.edu.pe - 100%

HORARIO DE PRÁCTICA

FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 30/08/23

FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 01/09/23

2023 - ll

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 ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………3

II. OBJETIVO (S)......................................................................................6

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL……………………………………..7

IV. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………… 9

V. RESULTADOS……………………………………………………………..11

VI. DISCUSIÓN………………………………………………………………...14

VII. CONCLUSIONES………………………………………………………….16

VIII. RECOMENDACIONES………………………………………………… 17

IX. ANEXOS……………………………………………………………………18

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………20

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I.- INTRODUCCIÓN:

La luz es una fuente principal energética en el cual, en ella,

encontramos energía esencial para diversos procesos metabólicos

como la fotosíntesis en las plantas por ejemplo. Según Darwin A.

León-Figueroa “El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula

requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su

determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización

físico-química y biológica” [3]. La espectrofotometría forma parte de

aquel pilar en donde se pueden obtener ciertos datos estadísticos

respecto al tema a hablar el día de hoy, su implicancia constituye a la

investigación científica de acuerdo a calcular el nivel de absorbancia

en soluciones acuosas. Por ello, se pone hincapié sobre los principales

usos que presenta, puesto que, es una herramienta que se utiliza en

diferentes disciplinas y que necesita ser utilizada según el tipo de

espectro de luz que necesita ser medido.

ABSORBANCIA:

Los rayos de luz que van pasando a nuestro alrededor tienden a tener

energía luminosa en ellos, por el cual pueden ser transmitidos hacia

3
otros objetos, esto igual pasa en el espectrofotómetro trayendo como

consecuencia la medición de la absorbancia dependiendo de la

cantidad de muestra que haya.

LEY DE LAMBERT Y BEER:

Según Yojani S. “Se relaciona la absorción de luz con las propiedades

del material atravesado” [2]. Esta ley viene de Lambert (recorrido de la

distancia de la luz) y beer (concentración).

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 CURVA DE CALIBRACIÓN:

Para la obtención de una curva de calibrado de un compuesto se

preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo,

determinando para cada una de ellas el valor de absorbancia a λmax.

Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas

(eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se

observará que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración

se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de

cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la

linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las

medidas son poco fiables.

Il.- OBJETIVOS:

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 ● Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.

● Aplicar la Ley de Lambert – Beer en el empleo del espectrofotómetro.

● Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de metileno.

● Aplicar el espectrofotómetro para medir los niveles de absorbancia en cada

muestra.

III.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

● Para determinar la longitud de onda óptima de la solución del azul de

metileno a través de un gráfico de espectro de absorción.

● Para elaborar una curva de espectro de absorción, se siguió los siguientes

pasos:

1. Colocamos los volúmenes de los reactivos mencionados en un tubo de

ensayo de 13 x 100 mm

2. Solución de azul de metileno 1 mg/dL - 1 mL

3. Agua destilada 4 mL

4. Para la medición de los volúmenes usamos pipetas volumétricas de 5 mL con

propipetas o micropipetas de 100-100 uL.

5. Luego, se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las

siguientes longitudes de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.

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6. Graficamos utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las

longitudes de onda y determinar el pico de máxima absorción de azul de

metileno, el cual corresponde al mayor valor de la absorbancia (véase en la

figura 1).

Figura 1. Espectro de absorción de la solución de azul de metileno a 1 mg/dL

● Procedimiento experimental para determinar la concentración de diferentes

patrones de la solución del azul de metileno a 1 mg/dL a través de curva de

calibración. Preparamos el experimento de la siguiente manera:

Preparación de soluciones patrones diferentes concentraciones:

1. Adicionamos en diferentes tubos de ensayos de 13 x 100 mm identificados

con números arábigos (1,2,3,4,5) los volúmenes de los reactivos se

muestran a continuación:

Reactivos 1 2 3 4 5

Azul de metileno 0,5 1 2 3 4

Agua destilada 4,5 4 3 2 1

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2. Hallamos la concentración de cada estándar preparados con la siguiente

fórmula:

C1 X V1 = C2 X V2

C1 = Concentración de la solución de azul de metileno 1 mg/dL

V1 = Volumen que se adicionó de la solución de azul de metileno 1 mg/dL

C2 = Concentración que se quiere hallar

V2 = Volumen final de la reacción (5 mL)

3. Adicionamos en cubetas de espectrofotómetro un mL de agua destilada para

ajustar el equipo de lectura a 0 absorbancia y 100% de transmitancia a 660

nm. También, en otras 5 cubetas agregamos un mL de cada una de las

soluciones patrones preparadas a la longitud de onda descrita (660 nm).

4. Graficamos en un papel milimetrado o en una hoja de cálculo de Excel los

resultados de absorbancias a 660 nm (eje Y) versus las concentraciones de

los estándares (eje X). Luego trazamos una línea.

5. Determinamos la concentración de una solución de azul de metileno que se

debe preparar 2,5 mL de la solución del azul de metileno 1 mg/dL y 2,5 mL de

agua destilada .

6. Utilizamos la curva de calibración y el factor de calibración determinará la

concentración de la solución preparada en el apartado 5.

FACTOR DE CALIBRACIÓN= CONCENTRACIÓN DEL ESTÁNDAR

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IV. MATERIALES Y MÉTODOS:

● 01 gradilla.

● 06 tubos de ensayo 13x100mm.

● 01 piseta con agua destilada.

● 01 solución de azul de metileno 1 mg/dL frasco 100mL.

● 01 espectrofotómetro.

● Cubetas para espectrofotometría.

● Puntas descartables respectivas.

● 01 pipeta.

● 01 Propipeta.

Métodos utilizados:

1) Limpieza del equipo: limpiar las cubetas de muestra y cualquier otro

equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada.

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 2) Calibración del espectrofotómetro: usar las soluciones de referencia

para establecer la línea de base y asegurarse de que el instrumento

esté correctamente calibrado.

3) Preparación de las soluciones: preparar las soluciones de referencia y

las soluciones de muestra en las concentraciones deseadas.

4) Medición de la absorbancia: colocar la solución de muestra en la

cubeta de muestra y colocarla en el compartimento del

espectrofotómetro. Ajustar los parámetros del espectrofotómetro para

medir la absorbancia de la muestra a una longitud de onda específica.

5) Análisis de datos: registrar las lecturas de absorbancia y utilizar una

curva de calibración para determinar la concentración de la muestra.

6) Repetición de medidas: realizar varias mediciones de cada muestra

para asegurar una mayor precisión y reducir errores aleatorios.

V. RESULTADOS:

● Determinación de curva de calibración:

10
 Fuente: Elaboración propia.

● Determinación del pico de máxima absorción del azul de metileno:

Fuente: Elaboración propia.

11
 ● Determinación de la concentración:

Fuente: Elaboración propia.

VI. DISCUSIÓN:

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Las tablas y resultados indican las lecturas del espectrofotómetro a las

longitudes de onda vistas en las clases de laboratorio del curso para el

correcto desarrollo de este informe. Para esto, es importante mencionar que

para la realización de los resultados se utilizó la aplicación de hojas de

cálculo Microsoft Excel. Las longitudes de onda analizadas en este informe

serán 560 nm, 580 nm, 600 nm, 620 nm, 640 nm, 660 nm, 680 nm y 700 nm

respectivamente.

El tema realizado en este informe juega un rol importante, ya que en el

campo de la medicina la espectrofotometría tiene una alta capacidad para

analizar sustancias biológicas y químicas en alta presión. En los diagnósticos

clínicos, se utiliza para medir concentraciones de biomoléculas en fluidos

biológicos, como la sangre y/o la orina. Midiendo así la concentración de

compuestos como colesterol , proteínas, glucosa e incluso enzimas. Por lo

que incluso, se puede realizar la Espectrofotometría de Reflexión Difusa de

una manera no invasiva (sin procedimientos dolorosos y sin muestras de

tejido) en la dermatología, por lo que en lugar de medir la luz directamente

reflejada, mide la luz que ha sido dispersada en muchas direcciones, es lo

que se conoce como reflexión difusa, ya que la piel no es una superficie

perfectamente lisa ni uniforme, y la luz dispersada proporciona información

completa sobre la composición y características de la piel, esta luz

dispersada es recogida por el espectrofotómetro y se analiza su espectro de

absorción y reflexión [7].

En la Universidad Mayor De San Andrés (La Paz - Bolivia), un estudiante

elaboró en el año 2020 un informe de Espectrofotometría en base a lo visto

13
en las respectivas clases de laboratorio de química analítica cuantitativa [9].

En primer lugar, en el laboratorio a contrastar se utilizó como reactivo al

Permanganato de potasio (KMnO4), por lo que estos se diferencian

principalmente en sus propósitos y aplicaciones. El permanganato de potasio

encuentra su principal aplicación en análisis redox y titulaciones, en

contraste, el azul de metileno es un tinte empleado en diversas situaciones,

como pruebas químicas y procesos de tinción en biología. Aunque ambos

compuestos pueden resultar útiles en espectrofotometría para cuantificar

absorbancias, es fundamental destacar que las reacciones y las variaciones

de color asociadas varían sustancialmente entre ellos [5,4]. En segundo lugar,

en el informe del estudiante podemos observar que nos brinda informaciones

más detalladas acerca de la Ley de Lambert y Beer, sabiendo que estas

establecen la relación entre la absorbancia de una muestra, la concentración

de la sustancia absorbente y la longitud de la trayectoria a través de la cual

pasa la luz [2]. En tercer lugar, en el informe a contrastar se realizó un

procedimiento experimental muy extenso, ya que mencionan técnicas como

el enfriamiento y el calentamiento e incluso mencionan AgNO3 al 1%, 0.5 de

KlO4, H2SO4 y H3PO4, no obstante, no detallan de el porqué de cada

solución a verter.

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VII. CONCLUSIONES:

● Mediante la realización de esta práctica hemos profundizado nuestros

conocimientos sobre el uso y la aplicación del espectrofotómetro, puesto que

es un instrumento de uso constante en los laboratorios para la obtención de

un diagnóstico acertado.

● Teniendo en cuenta la Ley de Lambert – Beer podemos decir que es un

principio fundamental en la espectrofotometría que establece una relación

lineal entre la absorbancia de una sustancia y la concentración de soluto

presente en una muestra. Esta relación matemática, expresada como A = εcl,

donde A es la absorbancia, ε es la coeficiente de extinción molar, c es la

concentración y l es la longitud de la celda, proporciona una herramienta

esencial para cuantificar la concentración de compuestos en soluciones y

determinar su absorbancia a diferentes longitudes de onda.

● Según los resultados desarrollamos las curvas de calibración, logrando

posteriormente comprobar que la concentración y la absorbancia se

encuentran relacionadas directamente, es decir, a mayor concentración

mayor absorbancia.

● El informe realizado sobre la espectrofotometría ha demostrado los principios

fundamentales de esta técnica, así como su aplicabilidad en el análisis

cuantitativo y cualitativo de muestras. Además, se ha destacado la

importancia de la calibración de los equipos y la correcta preparación de las

muestras para obtener resultados precisos y confiables

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VIII. RECOMENDACIONES:

● En laboratorio, emplear de manera adecuada el equipo de

espectrofotometría, así como también respetar las medidas de bioseguridad

ya establecidas para la realización exitosa de un experimento de

espectrofotometría y garantizan la validez y la precisión de los resultados

obtenidos.

● Conocer adecuadamente el proceso en el cual se hace a la hora de medir

una absorbancia propiamente de nuestra solución que tengamos, saber

identificar muy bien al factor más alto ya que con ello se van a trabajar los

demás datos que al final se pondrán en un gráfico en donde nos indican los

niveles de absorbancia de distintas muestras al nivel alto hallado.

● Considerar la posibilidad de realizar mediciones espectrofotométricas a

diferentes longitudes de onda para evaluar si existen picos de absorción

adicionales que puedan brindar información adicional sobre las muestras.

● Investigar posibles aplicaciones adicionales de la espectrometría con el azul

de metileno en el campo de la bioquímica, como la determinación de

concentraciones de biomoléculas específicas o la evaluación de reacciones

químicas específicas.

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IX. ANEXOS:

(Figura 1)

Adicionando la concentración de la solución, en la cubeta del espectrofotómetro.

17
 (Figura 2)

Medición de la concentración de absorbancia (determinar la concentración de una

solución de azul de metileno).

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X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Guijarro M, Remedios M. Análisis Instrumental. Espectrometría de Absorción

Atómica (EAA). 2020 [citado el 1 de septiembre de 2023];138418. Disponible en:

https://riunet.upv.es/handle/10251/138418

2. Konika Minolta. Espectrofotometría de Absorción vs. Rango de Espectrofotometría

Ultravioleta Visible. [Internet] [consultado el 29 de agosto del 2023]. Disponible en:

https://sensing.konicaminolta.us/mx/blog/espectrofotometria-de-absorcion-vs-rango-d

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3. León-Figueroa DA. ESPECTROFOTOMETRÍA. ESPECTROFOTOMETRÍA

[Internet]. 2020; Disponible en:

https://www.academia.edu/43667221/ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA

4. López-Salazar R, González-Cervantes G, Vázquez-Alvarado RE, Olivares-Sáenz E,

Vidales-Contreras JA, Carranza de la Rosa R, et al. Metodología para obtener ácidos

húmicos y fulvicos y su caracterización mediante espectrofotometría infrarroja. Rev

Mex De Cienc Agric [Internet]. 2014 [citado el 1 de septiembre de

2023];5(SPE8):1397–407. Disponible en:

https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-0934201400100

1397

5. Moreno A, Figueroa D, Hormaza A. Adsorción de azul de metileno sobre cascarilla

de arroz. Prod Limpia [Internet]. 2012 [citado el 1 de septiembre de 2023];7(1):9–18.

Disponible en:

http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S1909-04552012000100002&script=sci_artt

ext.

19
6. UCO. Espectrofotometría. [Internet] [consultado el 19 de abril 2020] URL disponible:

https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.

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7. Vivas S, Pardo E, Martínez C, Álvarez I, Muñoz A. Método Diagnóstico no Invasivo

en Dermatología: Espectrofotometria de Reflexión Difusa. IM [Internet]. 2015 [citado

el 31 de agosto de 2023]; 17(2). Disponible en:

http://saber.ucv.ve/ojs/index.php/rev_im/article/view/9143

8. Yojani S. Clase02 espectrofotometría [Internet]. Genial.ly. Disponible en:

https://view.genial.ly/5e93fbf2e0ea7a0de37f36af/presentation-clase02-espectrofotome

tria.

9. Informe de Espectrofotometria [Internet]. Scribd. [citado el 31 de agosto de 2023].

Disponible en:

https://es.scribd.com/document/467896000/Informe-de-Espectrofotometria

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