HECHO POR AKIRA LIZ LLANQUE BIOLOGIA MOLECULAR

INGENIERIA BIOTECNOLOGICA

Práctica 9: Amplificación genética empleando reacción en cadena de la

polimerasa (PCR).
1. CUESTIONARIO:
A. De los pasos que tiene la PCR, cuál cree que juega un rol importante en la
obtención de resultados.
El paso de la amplificación es el que juega un rol crucial en la obtención
de resultados. Durante cada ciclo de amplificación, se producen dos
etapas principales: la desnaturalización, en la cual las hebras de ADN se
separan mediante la aplicación de calor, y la síntesis de ADN
complementario, en la cual se agregan los primers específicos y la enzima
ADN polimerasa, que sintetiza nuevas hebras de ADN complementarias a
las plantillas originales. Este proceso se repite en múltiples ciclos, lo que lleva
a una duplicación exponencial de la cantidad de ADN de la secuencia
objetivo. La amplificación repetida de la región de interés permite detectar
incluso cantidades mínimas de ADN y amplificar señales específicas sobre
el ruido de fondo. Esto es especialmente útil en muestras con cantidades
limitadas de ADN, como muestras clínicas o forenses. La amplificación
eficiente y precisa de la secuencia objetivo es crucial para obtener
resultados confiables en la PCR. Cualquier variación en los parámetros de
amplificación, como la temperatura, el tiempo o la concentración de
reactivos, puede afectar la eficiencia y la especificidad de la reacción. Por
lo tanto, es importante optimizar los protocolos de amplificación para
garantizar la obtención de resultados consistentes y reproducibles. En
conclusión, el paso de la amplificación desempeña un papel fundamental
en la obtención de resultados en la PCR. Este paso permite la generación
de una gran cantidad de copias de la secuencia de interés, lo que facilita
la detección y cuantificación precisa de la misma. Una amplificación
eficiente y específica es esencial para lograr resultados confiables y
reproducibles en la PCR.

B. ¿Qué consideraciones se debe tener a la hora de diseñar los Primers?

Al diseñar los primers para la PCR, se deben considerar la especificidad de
la secuencia objetivo, la longitud y temperatura de fusión adecuadas,
evitar auto-complementariedad y dimerización, equilibrar el contenido de
nucleótidos, evitar secuencias repetitivas y modificaciones, y considerar
aspectos económicos y de escalabilidad. Estas consideraciones aseguran
la eficiencia y la especificidad de la amplificación de la secuencia de
interés.
C. ¿Cuántos grados podría variar la temperatura de Hibridación si la
empleada no da resultado, fundamente su respuesta?
La temperatura de hibridación en la PCR es crítica para lograr una unión
específica y estable entre los primers y la secuencia objetivo durante la
amplificación. Normalmente, se recomienda establecer la temperatura de
hibridación alrededor de 5°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm)
de los primers. Si la temperatura de hibridación utilizada inicialmente no da
resultados satisfactorios, es posible ajustarla para optimizar la reacción.
Generalmente, se recomienda variar la temperatura de hibridación en
incrementos o decrementos de aproximadamente 2-3°C. Sin embargo, la
cantidad exacta de variación dependerá de la naturaleza de los primers y
la secuencia objetivo. Si la temperatura de hibridación inicial es demasiado
alta, es posible que la unión entre los primers y la secuencia objetivo sea
demasiado débil o ineficiente, lo que puede resultar en una baja
especificidad y sensibilidad de la amplificación. En este caso, se puede
intentar disminuir la temperatura de hibridación en incrementos de 2-3°C
para favorecer una unión más estable. Por otro lado, si la temperatura de
hibridación inicial es demasiado baja, la unión entre los primers y la
secuencia objetivo puede ser demasiado fuerte, lo que puede generar
productos no específicos o amplificación ineficiente. En este caso, se
puede intentar aumentar la temperatura de hibridación en incrementos de
2-3°C para favorecer una unión más específica y reducir la formación de
productos no deseados. Es importante realizar pruebas y evaluaciones
sistemáticas al ajustar la temperatura de hibridación para determinar la
temperatura óptima que brinde los mejores resultados en términos de
especificidad y eficiencia de amplificación. Además, es recomendable
utilizar herramientas de optimización de la PCR y seguir los protocolos
establecidos para obtener resultados consistentes y reproducibles.

D. ¿Cuántos tipos de técnicas de PCR existen? ¿Cuál cree Ud. es la aplicación

de la PCR en el campo del Químico Farmacéutico?

- PCR convencional: Es la técnica básica de amplificación de ADN que

involucra ciclos de desnaturalización, hibridación de primers y síntesis de
ADN. Se utiliza ampliamente en investigación básica, diagnóstico
molecular y análisis genético.
- PCR en tiempo real (qPCR): Esta técnica permite la detección y
cuantificación en tiempo real de la amplificación de ADN. Se basa en
la detección de una señal fluorescente generada durante la
amplificación y se utiliza para cuantificar la expresión génica, detectar
patógenos, realizar análisis de mutaciones, entre otros.
 - PCR digital: Es una técnica que permite la cuantificación precisa de
copias de ADN individuales en una muestra. Se utiliza en aplicaciones
de medicina personalizada, detección de enfermedades y análisis de
muestras de baja abundancia.

- PCR en cadena de la ligasa (LAMP): Esta técnica utiliza múltiples primers

y enzimas de ligasa para amplificar de manera rápida y eficiente
secuencias de ADN específicas. Es útil en aplicaciones de diagnóstico
rápido, detección de enfermedades infecciosas y análisis de alimentos.

- PCR de punto final: Es una variante simplificada de la PCR convencional

que solo detecta la amplificación al final de la reacción. Se utiliza en
aplicaciones de cribado genético, identificación de marcadores
genéticos y análisis de polimorfismos.
- Análisis de pureza y autenticidad de ingredientes farmacéuticos: La PCR
se utiliza para verificar la presencia o ausencia de contaminantes o
adulterantes en productos farmacéuticos, como la detección de ADN
de origen animal en productos de origen vegetal o la identificación de
microorganismos patógenos.
- Desarrollo y control de calidad de medicamentos: La PCR se utiliza para
la identificación y cuantificación de material genético específico en
medicamentos, como la detección de residuos de ADN de organismos
modificados genéticamente en productos biotecnológicoS

E. ¿Investigue sobre la PCR digital, explique su fundamente y compárela con

el tipo de PCR empleado en la práctica
La PCR digital es una técnica que permite contar y analizar individualmente
copias de ADN en una muestra. Se diluye la muestra de forma que cada
reacción contenga en promedio una sola molécula de ADN, y luego se
realiza la amplificación. Al analizar cada reacción de forma individual, se
puede calcular la cantidad exacta de copias de ADN presentes en la
muestra original. La PCR digital ofrece mayor sensibilidad, precisión y
resolución en la detección y cuantificación de ADN. Sin embargo, requiere
más tiempo, recursos y equipos especializados en comparación con otros
tipos de PCR.

F. Elabore una lista de 10 genes que pueden ser amplificados por PCR
- Gen ACTB (Actina Beta)
- Gen GAPDH (Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa)
- Gen TP53 (Tumor Protein 53)
- Gen EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)
- Gen MYC (MYC Proto-Oncogene)
- Gen BRCA1 (Breast Cancer 1) Gen BRCA2 (Breast Cancer 2)
- Gen HBB (Hemoglobina Beta)
- Gen IL-6 (Interleucina-6)
- Gen TNF (Factor de Necrosis Tumoral)

Trabajo adicional:
1. ¿Cuántas copias de un amplicon pueden obtenerse después de 35
ciclos dePCR?
Después de 35 ciclos de PCR, se pueden obtener aproximadamente
34.4 mil millones de copias de un amplicon.

2. Veinte nanogramos de DNA genómico humano son necesarios para

una PCR.La solución stock del molde se encuentra a una concentración
de 0.2mgDNA/mL. ¿Cuántos microlitros de la solución stock deberían
utilizarse?
20 nanogramos de DNA genómico equivalen a 0.02 miligramos (ya
que 1 nanogramo es igual a 0.001 miligramos).

La concentración de la solución stock es de 0.2 mg DNA/mL, lo que

significa que hay 0.2 miligramos de DNA en cada mililitro de la
solución.

Para determinar los microlitros de la solución stock que se deben

utilizar, podemos aplicar una regla de tres:

0.2 mg DNA -> 1 mL solución stock

0.02 mg DNA -> X mL solución stock
X = (0.02 mg DNA * 1 mL solución stock) / 0.2 mg DNA
X = 0.1 mL

Por lo tanto, se deben utilizar 0.1 microlitros de la solución stock para

obtener los 20 nanogramos de DNA genómico requeridos en la PCR.

3. Partiendo de 600 moléculas de DNA molde, ¿Cuantos amplicones se

generarán después de 25 ciclos de PCR?
Número de amplicones = Número inicial de moléculas x 2^n
Donde:
- Número inicial de moléculas = 600
- n = 25
= 600 x 2^25
Número de amplicones = 600 x 33,554,432 = 20,132,659,200

4. Un producto de PCR de 800bp que tiene un contenido de G + C del 55%

es sintetizado en una reacción que contiene 50mM KCl y 2.5mM MgCl2.
¿Cuál esla Tm del amplicon?
𝑇𝑚 = 4(𝐺 + 𝐶) + 2(𝐴 + 𝑡)
𝑇𝑚 4(55) + 2(45) = 220 + 90 = 310℃
 La Tm del amplicon será de 310℃.

5. Un stock de cebadores que consiste en dos cebadores necesarios para

una PCRtiene una concentración de 25uM. ¿Qué volumen del stock de
cebadores deberíaser añadido a 100uL de reacción para que la
concentración de cebadores en lareacción sea de 0,4uM?
(0.4𝑢𝑀) × (100𝑢𝐿)
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑏𝑎𝑑𝑜𝑟𝑒𝑠 = = 1.6𝑢𝐿
(25𝑢𝑀)