Práctica 3 : Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis de las proteínas de la leche

OBJETIVOS
 Determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína
 Calcular la concentración de proteínas en muestra problema utilizando espectrofotometría
 Conocer los principios de la técnica de electroforesis SDS-PAGE.

 Reparadores: Los alimentos más importantes de

este grupo son las proteínas
INTRODUCCIÓN
La nutrición es la toma y uso de alimentos por un  Reguladores: Estos alimentos contienen
organismo. Este es el proceso por el cual, los seres sustancias que utiliza el organismo en
vivientes obtienen energía de los alimentos y cantidades muy pequeñas para asimilar
bebidas con el propósito de crecer y mantenerse. La correctamente los alimentos y así contribuir a
nutrición es interpretada como un estudio de los coordinar el funcionamiento del cuerpo. Se
procesos orgánicos por los cuales un organismo considera que estos alimentos no aportan
asimila y usa los alimentos para el funcionamiento calorías al organismo. En este grupo se
normal, crecimiento y mantenimiento. La nutrición encuentran las vitaminas; también se incluyen
es un proceso de tres partes: la primera, consumo de los minerales y el agua
comidas y bebidas, la segunda el rompimiento de
esos alimentos o bebidas en nutrientes y la tercera, Uno de los alimentos más importantes que deben
el viaje de esos nutrientes a través del torrente estar en la dieta de un organismo como el ser
sanguíneo a diferentes partes del cuerpo para ser humano es la leche que contiene macromoléculas
usados como “combustible” y para otros propósitos. como los glúcidos y los lípidos que la hacen ser un
Para un organismo obtener una adecuada nutrición, alimento energético, adicionalmente cuenta con una
éste debe comer y beber comidas que contengan cantidad considerable de proteínas formando parte
nutrientes claves. de los alimentos reparadores.

Los alimentos pueden ser clasificados con base en Se entiende como leche al producto integral del
su valor nutritivo, este viene dado por la cantidad de ordeño total e ininterrumpido, en condiciones de
nutrientes que aportan a un organismo cuando son higiene que da la vaca lechera en buen estado de
consumidos. Estos nutrientes pueden ser lípidos, salud y alimentación. Esto además, sin aditivos de
glúcidos, proteínas, vitaminas y minerales. El valor ninguna especie. Agregado a esto, se considera
nutritivo es diferente en cada grupo de alimentos, leche, a la que se obtiene fuera del período de parto.
algunos alimentos poseen más o menos nutrientes La leche de los 10 días anteriores y posteriores al
que otros. Es por eso, que para clasificarlos se debe parto no es leche apta para consumo humano.
tomar en cuenta el nutriente que más abunda en su Siempre el ordeñe debe ser total, de lo contrario al
composición. quedar leche en la ubre, la composición química de
esta cambiará.

Los alimentos también cumplen distintas funciones Leche fluida entera

en el organismo. De acuerdo a su función los Leche a granel higienizada, enfriada y mantenida a
alimentos se clasifican en: 5°C, sometida opcionalmente a terminación,
 Energéticos: Estos alimentos son los glúcidos y pasteurización y/o estandarización de materia grasa,
los lípidos transportada en volúmenes de una industria láctea a
otra para ser procesada y envasada bajo normas de añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada
higiene. una de ellas por separado se forma un complejo de
caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta
La leche fluida entera puede ser sometida a micela está estabilizada por la kappa caseína
procedimientos de higienización por calor. Procesos mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que
de ultra alta temperatura (UAT ó UHT), que precipitan en presencia de iones calcio.
consisten en llevar la leche homogenizada a
temperaturas de 130°C a 150°C durante 2 a 4 La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos
segundos, permiten higienizarla de forma apropiada fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos
y de manera que estas puedan llegar en forma a ella. También tiene todos sus residuos de serina y
segura al consumidor. Las leches pueden ser treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo,
modificadas en su contenido graso. así como los carbohidratos dispuestos en una sola
cara de su superficie por lo que esta parte exterior es
La leche contiene vitaminas (principalmente fácilmente soluble en agua gracias a los grupos
tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas polares que posee. La otra parte de su superficie se
A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo une fácilmente a las alfa y beta caseína insolubles,
y metales en pequeñas cantidades), proteínas lo que da lugar a la formación de la micela.
(incluyendo todos los aminoácidos esenciales),
carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos La propiedad característica de la caseína es su baja
elementos importantes de los que carece la leche solubilidad a pH 4.6. El pH de la leche es 6.6
son el hierro y la vitamina C. aproximadamente, estando a ese pH la caseína
cargada negativamente y solubilizada como sal
Las proteínas se pueden clasificar de manera cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga
general en proteínas globulares y fibrosas. Las negativa de la superficie de la micela se neutraliza
proteínas globulares son aquellas que tienden a (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra
agregarse en formas esferoidales y no establecen precipita.
interacciones intermoleculares como son los puentes
de hidrógeno (característicos de las proteínas La conformación de la caseína es similar a las
fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones proteínas desnaturalizadas globulares. El alto
coloidales. En la leche hay tres clases de proteínas: número de residuos de prolina en la caseína causa
caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas un especial plegamiento en la cadena de proteína e
globulares). inhibe la formación de una fuerte y ordenada
estructura secundaria. La caseína no contiene
La caseína es una proteína conjugada de la leche del puentes disulfuro. De igual manera la falta de
tipo fosfoproteína que se separa de la leche por estructura secundaria es importante para la
acidificación y forma una masa blanca. Las estabilidad de la caseína frente a la
fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están desnaturalización por calor. La carencia de
químicamente unidas a una sustancia que contiene estructura terciaria facilita la situación al exterior de
ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión
grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo entre unidades proteicas y la convierte en
de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en prácticamente insoluble en agua. En cambio es
la leche se encuentra en forma de sal cálcica fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en
(caseinato cálcico). La caseína representa cerca del soluciones salinas tales como oxalato sódico y
77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y acetato sódico.
el 2.7% en composición de la leche líquida.
La función biológica de las micelas de caseína es
La caseína está formada por alpha(α 1), alpha(α2)– transportar grandes cantidades de Ca y P altamente
caseína, β–caseína, y kappa–caseína formando una insoluble en forma líquida a los lactantes y formar
micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína un coagulo en el estómago para favorecer una
son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la
micela formada también contiene citrato, iones, De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un
lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas pH característico al cual su carga neta es cero. A
ocupan del 6 – 12% del volumen total de la leche. este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el
punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el
Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que
cuando se precipita la caseína en medio ácido son la proteína presenta su máxima posibilidad para ser
proteínas globulares, hidrofílicas y fácilmente precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su
solubles en agua así como susceptibles de agregación.
desnaturalización por calor. Las principales son β–
lactoglobulina, α-lactalbumina, bovine serum Si suponemos una proteína formada únicamente por
albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig). aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga
neta de la proteína dependería exclusivamente de la
La caseína se emplea en la industria para la protonación/desprotonación de los grupos amino y
fabricación de pinturas especiales y en el apresto de carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están
tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de formadas por multitud de aminoacidos unidos
preparados farmacéuticos y la fabricación de mediante enlaces peptídicos y la carga va a
plásticos. La pintura de caseína ha sido usada desde depender de los grupos ionizables que poseen los
la antigüedad por los egipcios. aminoacidos que la componen y del pH del medio.
Determinación colorimétrica del contenido de
Punto isoeléctrico proteínas en leche de vaca
Todas las macromoléculas de la naturaleza Con frecuencia se nos presenta el problema de tener
adquieren una carga cuando se dispersan en agua. que analizar proteína en una muestra de alimento,
Una característica de las proteínas y otros como puede ser la leche de vaca. En este tipo de
biopolímeros es que la carga total que adquieren casos es bueno saber el contenido aproximado de
depende del pH del medio. proteína de la muestra (en el caso de la leche de
vaca está en torno al 2-3% p/v) para hacer las
Así, todas las proteínas tienen una carga neta diluciones pertinentes que nos permitan encajar la
dependiendo del pH del medio en el que se muestra en la recta patrón. Lo que se pide en este
encuentren y de los aminoácidos que la componen, caso es que el alumno haga precisamente eso y
así como de las cargas de cualquier ligando que se obtenga un valor exacto del contenido proteico de
encuentre unido a la proteína de forma covalente una muestra de leche de vaca.
(irreversible).
Electroforesis
Debido a la composición en aminoácidos de la La electroforesis de proteínas en geles con una
proteína, los radicales libres pueden existir en tres matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada
formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, electroforesis en poliacrilamida (PAGE,
neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una polyacrilamide gel electrophoresis) es sin duda
carga neta positiva si se encuentra en un medio lo alguna una de las técnicas más ampliamente usada
suficientemente ácido debido a que los grupos para caracterizar mezclas complejas de proteínas.
COOH de los aminoacidos aspártico y glutámico La electroforesis en poliacrilamida es un método
estarían en su forma neutra pero los grupos amino conveniente, rápido y económico a nivel de muestra
de arginina y lisina estarían protonados (–NH3+). pues se requieren sólo cantidades del orden de
microgramos de proteína.
De igual forma si la proteína se encuentra en un
medio con un pH muy alto estaría cargada Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si
negativamente ya que en este caso los grupos se encuentran en un medio que tenga un pH
carboxilo estarían desprotonados (COO–) y los diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen
grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). la propiedad de desplazarse cuando se someten a un
campo eléctrico. La velocidad de migración es
proporcional a la relación entre las cargas de la
proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad el rango 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor
de masa más rápida será la migración. Empleando tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de
geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando gran tamaño.
las proteínas en una zona estrecha en torno a los
electrodos se pueden determinar diferencias de En función del estado de las proteínas (nativo o
carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este desnaturalizado) a lo largo del proceso
método se denomina electroforesis zonal. La matriz electroforético éstas se clasifican en electroforesis
de poliacrilamida no es un buen soporte para este nativas o desnaturalizantes.
método pues la migración de las proteínas en su
seno no sólo es proporcional a la carga neta sino Una electroforesis desnaturalizante, la más común,
también al tamaño y forma de las proteínas. es la que somete a las proteínas a migración
asegurando la completa desnaturalización (pérdida
Una ventaja importante de los geles de de la estructura tridimensional). En esta situación la
poliacrilamida es que son químicamente inertes, migración es proporcional a la carga y al tamaño de
transparentes y estables en un amplio rango de pH, la molécula pero no a su forma. El agente
temperatura y fuerza iónica. Algunas características desnaturalizante más empleado es el
destacables de la electroforesis en geles de sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
poliacrilamida son:
Una electroforesis nativa es la que somete a las
Los geles de poliacrilamida se forman por la proteínas a migración sin desnaturalización. En esta
polimerización de la acrilamida por acción de un situación las proteínas migran en función de su
agente entrecruzador (cross – linking), la bis- carga, de su tamaño y de su forma. Además se
acrilamida en presencia de un iniciador y un mantienen en ciertos casos las interacciones entre
catalizador. Como iniciador se suele utilizar subunidades y entre proteínas, separándose los
TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como complejos. Los sistemas tampón empleados en estos
catalizador el ión persulfato (S 2O8 –) que se añade en caso son: tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-
forma de persulfato amónico. En algunas borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango
situaciones, como por ejemplo en el de pH 7.2 a 8.5).
isoelectroenfoque en el que la presencia de
persulfato puede interferir con la electroforesis se MATERIALES Y REACTIVOS
emplean riboflavina y TEMED. Los siguientes materiales y reactivos son de uso
general:
Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el
oxígeno es un inhibidor de la polimerización.  Soluciones buffer pH 4.0 y 7.0 para calibrar el
Además, durante la polimerización se libera calor potenciómetro
que podría provocar la formación de burbujas en el  Potenciómetro
seno del gel. La velocidad de polimerización viene  Espectrofotómetro
determinada por la concentración de persulfato  Leche de vaca líquida comercial
(catalizador) y TEMED (iniciador).  Cámara de electroforesis
 Fuente de poder
La porosidad del gel la determina las proporciones  Reactivo de Biuret
relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo  Patrón de albúmina de huevo 5 mg/ml
menor el poro cuanta más bisacrilamida vs  Un juego de micropipetas
acrilamida se use.

El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida MATERIAL

REACTIVOS
determina el rango de separación del gel. CANTIDAD TIPO
Habitualmente los geles se denominan en función Vaso de
del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. 10 precipitado de 25 Agua destilada
Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en ml
 Vaso de Al finalizar queda un precipitado blanco de fácil
Acetato sódico
2 precipitado de 50 manipulación, el cual es la caseína.
0.1 N
ml
vaso de Secar la caseína extraída. Pesar la caseína una vez
Ácido acético esté seca.
1 precipitado de
0.01 N
250ml
tubos de ensayo Ácido acético 0.1 Determinar rendimiento de extracción de caseína.
10
N
Probeta de 50ml Ácido acético 1.0
1
N
Matraz aforado Preparación de solución de caseína
1 NaOH 1N Colocar aproximadamente 250mg de caseína en un
de 50 ml
pipeta graduada vaso de precipitado de 50mL. Agregar 20mL de
1 Éter etílico agua destilada y 5mL de NaOH 1N, agitar hasta
de 5.0 ml
pipeta graduada completar la disolución total de la caseína.
1 Etanol al 70%
de 1.0 ml
pipeta graduada Una vez disuelta la caseína se vierte a un matraz
1 aforado de 50mL, adicionar 5mL de ácido acético
de 10.0 ml
Embudo de 1N y diluir con agua destilada hasta 50mL. La
1 solución debe ser clara y limpia. (Se debe guardar
vidrio mediano
1 Termómetro una muestra de la caseína final solubilizada como
Papel de filtro solución C).

Determinación del punto Isoeléctrico de la

Nota: Las soluciones que se requieren para la
caseína
electroforesis se adjuntan en el Anexo 1, estas
Colocar en 10 vasos limpios y secos los siguientes
soluciones ya han sido previamente preparadas para
volúmenes de los reactivos:
la práctica en el laboratorio

Acetato Ácido Ácido pH

sódico acético acético resultante
Tubo
PROCEDIMIENTO 0,1N 0,1N 0,01N aproximado
SESION 1 : Aislamiento de caseína (ml) (ml) (ml)
Calentar en un vaso de precipitado de 50 a 100 mL 1 0,5 9,5 - 3,2
de agua destilada a 38°C, añadir 50mL de leche. 2 1,0 9,0 - 3,6
Luego agregar gota a gota con bureta y con 3 1,5 8,5 - 3,8
agitación ácido acético 1N, hasta que se observe un 4 2,0 8,0 - 4,0
precipitado, es decir, la leche se corte. 5 3,0 7,0 - 4,2
6 4,0 6,0 - 4,5
Centrifugar (2 min a 5000rpm) y guardar el 7 6,0 4,0 - 4,7
sobrenadante para utilizar en procedimiento de 8 8,0 2,0 - 5,1
electroforesis (solución A). Lavar el precipitado con 9 6,0 - 4,0 5,5
20mL de etanol. 10 8,0 - 2,0 6,1
Centrifugar nuevamente (2 min a 5000rpm) y Tabla 1: Volúmenes a utilizar de cada uno de los
guardar nuevamente el sobrenadante para reactivos para determinación del pI
procedimiento de electroforesis (solución B).
Medir los pH de los vasos, los cuales debían cubrir
A continuación adicionar 10mL de éter etílico, un rango aproximado entre 3,0 y 6,5. Anotar los
centrifugar (2 min a 5000rpm). Desechar valores, que deben ser semejantes a los expresados
sobrenadante. anteriormente.
 pH más básico (8.3) de manera que ofrezca mayor
Añadir 1mL de la solución de caseína a cada vaso. resistencia en la corrida a los polipeptidos.
(Para esto usted gastara 10ml de la solución de
caseína). El gel de apilamiento posee baja concentración de
acrilamida (4%) en tampón ligeramente ácido
Agitar suavemente y esperar aproximadamente 3 (Tris/HCl 1M pH 6.8), de forma que ofrezca poca
minutos, luego medir la absorbancia de cada resistencia a la mezcla de proteínas sometidas a
muestra a 640nm con cubetas de colorimetría de electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa
1cm de paso óptico. Anotar los resultados a fin de rapidez.
representar la absorbancia frente al pH y determinar
el pI aproximado de la caseína. Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida,
se prepara, en la parte superior de este el gel de
SESION 2 Cuantificación de proteínas de la apilamiento. Bajo la acción del campo eléctrico, la
leche mezcla proteica, colocada sobre el gel de
Preparar las siguientes reacciones en 10 tubos de apilamiento, comienza a migrar hacia el polo
ensayo: positivo.
Cuando las proteínas atraviesan el gel de
apilamiento, se encuentran con la resistencia
Agua (ml)

Albumina

Muestra

ejercida por el gel de corrida de manera que

Biuret
Leche
Tubo

(ml)

(ml)

(ml)

(ml)

aquellas proteínas retardadas puedan alcanzar al

resto y todas inicien la separación desde el mismo
punto, mejorando así la calidad de la corrida. El gel
B 1,8 - - - 1,2 de apilamiento se prepara siempre a una
1 1,6 0,2 - - 1,2 concentración de acrilamida 4%, mientras que el gel
2 1,4 0,4 - - 1,2 de separación o gel de corrida se prepara según el
3 1,2 0,6 - - 1,2 rango óptimo de resolución:
4 1,0 0,8 - - 1,2
5 0,8 1,0 - - 1,2 Gel de corrida
Leche 1,79 - 0,01 - 1,2 Ensamblar, según instrucciones, el cassette que
Sln A - - - 1,8 1,2 consta de soportes, vidrios y separadores. Preparar
Sln B - - - 1,8 1,2 el gel de corrida. El volumen del gel de corrida
Sln C - - - 1,8 1,2 deberá calcularse dependiendo del grosor del gel.
Tabla 2: Volúmenes a utilizar de cada una de las Por lo general se preparan 10ml de acrilamida 10%
soluciones en la cuantificación de proteínas así:

Agitar suavemente y esperar 15min a que se

desarrolle el color en la oscuridad y medir la
absorbancia de cada tubo a 595nm. Solución Volumen
Agua destilada 3,4mL
Electroforesis de las proteínas de la leche Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.4mL
Geles de corrida y apilamiento Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
La técnica de separación comúnmente utilizada se SDS 10% 100µL
denomina electroforesis discontinua. En esta se Persulfato de amonio 10% 150µL
preparan 2 geles, el de corrida, donde se separan las TEMED 10µL
proteína y el de apilamiento o concentrado, que Tabla 3: Volúmenes a utilizar de los reactivos
como su nombre lo indica, concentra la mezcla. para la preparación del gel de corrida

El gel de corrida que separará las muestras debe Verter cuidadosamente la solución de acrilamida
tener mayor concentración de Acrilamida (10%) y con una pipeta Pasteur en el contenedor
representado por 2 vidrios sujetos al cassette y
distanciados por unos separadores. Dejar  Solución C 10µL
aproximadamente 1,5cm de distancia entre la Colorín 10µL
solución de acrilamida y el vidrio frontal.  Estándar peso molecular 5 µL
Luego de añadido el gel de corrida y previo a la
polimerización, añadir suavemente agua destilada Someterlas a calentamiento (100°C) por 5 minutos e
para evitar que el borde del gel polimerice de inmediatamente sacarlas a hielo, luego sembrar
manera irregular. Esperar unos 15min para una 20µL de las muestra en los pocillos de los geles de
polimerización total del gel. la electroforesis. Incluir un estándar de peso
molecular en uno de los pocillos (5µL).
Gel de apilamiento
Luego de polimerizado el gel de corrida, descargar Someter las muestras a electroforesis aplicando una
el agua de la superficie del mismo y preparar 4ml corriente de 30 mA y observar la corrida por 40
del gel de apilamiento (4%) según se muestra a minutos.
continuación:
Finalizada la corrida extraer los vidrios del cassette
Solución Volumen cuidadosamente y separarlos de manera tal que el
Agua destilada 6,1 mL gel quedara posado sobre uno de los vidrios.
Acrilamida-bisacrilamida 30% 1,3mL Sumergir el gel en una solución colorante (1g de
Tris/HCl 1M pH 6.8 2,5 mL azul de Coomassie, 459ml de metanol, 450ml de
SDS 10% 100µL agua destilada y 100ml de ácido acético glacial) por
Persulfato de amonio 10% 50µL 3 horas. Transcurrido el tiempo, sumergir el gel en
TEMED 10µL una solución decolorante (100ml metanol, 100ml de
Tabla 4: Volúmenes a utilizar de los reactivos ácido acético glacial, 800ml de agua destilada) o en
para la preparación del gel de apilamiento agua caliente por 5 minutos para eliminar las
asociaciones inespecíficas del gel al colorante.
Verter suavemente el contenido del gel de Observar las bandas proteicas y medir la distancia
apilamiento sobre el gel de corrida polimerizado y recorrida por cada banda para determinar su PM y
colocar el peine cuidadosamente para que no se definir que posible banda corresponde a que posible
formen burbujas. Esperar unos 10min hasta que proteína.
polimerice la acrilamida.

Colocación de las muestras PARA INCLUIR EN EL INFORME

Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, 1. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia
colocar el cassette en el tanque de electroforesis con para la determinación del punto isoeléctrico de
aproximadamente 500mL del tapón de corrida en el la caseína?
cual se encuentran los electrodos sumergidos. 2. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima
Quitar cuidadosamente el peine para que quedaran en el pI?
libres los pocillos del gel. Se colocaron 3. ¿Cuál es el peso aproximado de las proteínas de
cuidadosamente las muestras con una micropipeta. la caseína?
4. ¿Cuál es la concentración de la solución de
Muestras: caseína?
 Leche 2µL 5. Que es el lactosuero? Que proteínas contiene?
Buffer sample o de muestra 18µL (Solución 6. Que diferencias hay entre los resultados y
con Azul de Coomassie) análisis de proteínas utilizando el método de
 Solución A 10µL espectrofotometría o electroforesis?
Buffer sample 10µL
 Solución B 10µL
BIBLIOGRAFÍA
Colorín 10µL
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buffer sample o de muestra..
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Proteins in Reconstituted Milk 6. Acrilamida 30% (100ml):
Exposed to Different Heat Treatments Sensors La solución de acrilamida al 30% (p/v) es una
2007, 7, 371-383 mezcla de acrilamida (29,2g) y Bisacrilamida
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For Biochemistry Protocols, A. Singapore: World Pesar 0,5g de persulfato de amonio, disolver en 5ml
Scientific. eBook Academic Collection de agua destilada
(EBSCOhost)
8. Solución Tampón de corrida, 1 L:
ANEXO Pesar 3 g de Tris (25mM), pesar 14,4g de glicina
1. Tris/HCl 1,5M pH 8.8, 100 ml: (192mM), pesar 1g de SDS (0,1%), añadir agua
Pesar 18,15 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de destilada hasta completar 1 litro
agua destilada, añadir gota a gota HCl concentrado
hasta que el pH baje a 8.8, completar con agua NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8,3.
destilada hasta el volumen final (100ml) Se puede preparar una solución 10 veces
concentrada y diluir el volumen necesario en el
2. Tris/HCl 1 M pH 6.8, 100ml: momento de la corrida electroforética. Esta solución
Pesar 12,1 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de puede almacenarse indefinidamente a Temperatura
agua destilada, añadir gota a gota HCl concentrado ambiente.
hasta que el pH baje a 6.8, completar con agua
destilada hasta el volumen final (100ml) 9. Tampón muestra 5X, 10 ml:
0,6ml de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solución 2) 60mM ,
3. SDS 10% (p/v), 100ml: 5ml de Glicerol 50% (solución 4) 25%, 2ml de SDS
Pesar 10 g de SDS, añadir agua destilada hasta 10% (solución 3) 2%, 0.5ml de 2 mercaptoetanol
completar el volumen de 100ml, información de 14.4mM, 1ml de azul de bromofenol (solución 5)
seguridad: El SDS es un polvo fino neurotóxico, por 0,1% 0.9ml de agua destilada
lo tanto se debe usar máscara, guantes y lentes de
protección para su manipulación. NOTA:
Las soluciones 1, 2 y 6 son estables por meses a
4. Glicerol 50% (v/v), 100 ml: 4°C. Las soluciones 7 y 9 deben ser almacenadas a
Tomar un volumen de 50ml de glicerol al 100%, –20°C. El resto a temperatura ambiente.
añadir 50ml de agua destilada. Esta solución se usa
para preparar el buffer sample o de muestra..

5. Azul de Bromofenol 1% (p/v), 10ml: