Protocolo de extraccion de ADN bacteriano E.

coli 1

PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN BACTERIANO E. Coli

Iran Fernando Duarte Ibarra

7BM

LABORATORIO DE BIOLOGIA CELELAR Y GENETICA

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INTRODUCCION

Toda la información genética esencial para la vida de la bacteria está contenida en una única molécula de
ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace covalente. Dicha molécula
se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen además ADN Extra cromosómico, también
circular y cerrado, denominado ADN plasmídico por estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan
información génica para muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de
crecimiento.

En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos nucleicos bacterianos es la misma que
para cualquier célula. Conviene recordar brevemente que los ácidos nucleicos son macromoléculas
compuestas de nucleótidos unidos de forma covalente, por medio de enlaces fosfodiéster entre los carbonos
de las posiciones 3’ y 5’ de dos residuos de azúcares adyacentes. Esta estructura forma un esqueleto de
azúcares y fosfatos constante en toda la macromolécula.

La variación entre los nucleótidos que constituyen la cadena de ácido nucleico está dada por sus bases
nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina (C) y guanina (G) y para el ácido
ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo (U). La A y G se denominan bases púricas o purinas,
mientras que T, U, y C se denominan bases pirimidínicas o pirimidinas. Así, una cadena o hebra de ácido
nucleico, tendrá una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El
ADN, como macromolécula, está compuesto por dos cadenas nucleotídicas o hebras antiparalelas que se
enlazan entre sí formando una doble hélice. Los enlaces entre ambas hebras de ADN están determinados por
puentes de hidrógeno entre las purinas de una cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma
dos puentes de hidrógeno con la T, mientras que la C forma tres puentes de hidrógeno con la G. Dicho
fenómeno se conoce como complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo
es para la G. Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice de ADN. En esta estructura de
doble hélice de ADN se pueden distinguir pares de nucleótidos o pares de bases (pb). Estas pb pueden usarse
como unidad de tamaño o longitud para las moléculas de ADN, de esta manera podemos decir por ejemplo
que el ADN cromosómico de Escherichia coli tiene un tamaño de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo
de 4.200 kilo bases (Kb) Todas las células deben enfrentarse al problema de cómo lograr contener en su
estructura moléculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E.coli, los 4.200 Kb de su genoma
implican una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la longitud de la célula. Las bacterias no poseen
histonas asociadas a su genoma y, en consecuencia, no pueden compactar su ADN en estructuras tipo
nucleosomas como las células eucariotas. Por lo tanto, deben compactar su ADN de otra manera. Esto se
logra porque el ADN circular cerrado puede adoptar una estructura terciaria llamada superenrollamiento,
que implica enrollar el eje de la doble hélice sobre sí mismo. Este superenrollamiento se dice que tiene
sentido negativo porque tiene el sentido contrario al enrollamiento de una hebra de ADN sobre la otra. Esta
estructura de superenrollamiento también supone para la bacteria una fuente de almacenamiento de energía
para ser usada en muchos procesos fisiológicos que la requieren, por ejemplo, la separación de las dos
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hebras de ADN necesaria para la replicación y la transcripción. El cromosoma bacteriano es suficientemente

largo como para formar muchos lazos circulares, que como tales pueden superenrollarse formando una serie
de dominios topológicos independientes. Esta organización en dominios colabora a la compactación general
del genoma bacteriano e impide que, con la ruptura de una hebra (en cualquier sitio del cromosoma) se
pierda el superenrollamiento total, manteniendo la energía almacenada.

3. COMPONENTES:
Pellets bacterianos E.coli 25 unidades
Solución de Lisis 20 ml
Solución Precipitación de Proteínas
Solución de Hidratación 10 ml 20 ml

Componentes necesarios y NO suministrados

Microcentrífuga.
Microtubos y micropipetas.
Baño de Incubación.
Etanol 70% e Isopropanol.
Sistema de electroforesis básico (aparatos y reactivos).
Sistema de detección de ácidos nucleicos.

PRÁCTICA:
Esta práctica permite aislar el ADN cromosómico de células bacterianas de E.coli, estas bacterias son Gram
(-) así que no se necesita el tratamiento con lisozima que si necesitan las bacterias Gram (+) que son más
difíciles de lisar y necesitan para ellos enzimas líticos.

Este protocolo permite la extracción rápida del ADN cromosómico de forma rápida en una clase práctica
con alumnos. Las células bacterianas se han obtenido {insertar de donde se obtuvo la muestra} células de
E.coli .

El primer paso es la incubación del pellet bacteriano con una solución de lisis que romperá las membranas
celulares y liberará los ácidos nucleicos. Luego se eliminarán las proteínas y restos celulares con la adición
de una solución de precipitación de proteínas. Después de una centrifugación nos quedaremos con el
sobrenadante y haremos precipitar los ácidos nucleicos con isopropanol, seguido de un lavado con etanol
70% y finalmente la hidratación del ADN.

Lisis celular
1. Añadir 1.5 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.
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3. Añadir 600 ul de Solución de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y lisar las células. 4.
Incubar las muestras a 80ºC durante 5-10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.

Precipitación de proteínas
1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
2. Añadir 300 ul de Solución de precipitación de proteínas (isopropanol y etanol 70%)
3. Vórtex vigorosamente durante 20-30 segundos.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 5 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet.

Precipitación del ADN

1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600ul de isopropanol
Mezclar por inversión varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 3 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 ul de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el etanol. Vigilar no perder el
pellet de ADN
5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos.

Hidratación del ADN

1. Añadir 500-750 ul de Solución de Hidratación del ADN (agua estéril). Resuspender mediante micropipeta
el pellet blanco. La incubación a 55-65ºC con periódicas agitaciones con vortéx ayudará a la disolución del
ADN. Si la solución de lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas, incubar a 37ºC y
mezclar para disolver el precipitado

5. RESULTADOS
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A. Fundamento teórico Para preparar el buffer de lisis descrito por Collins et al. (1987),

utilizado en la extracción de ADN, es necesario emplear los reactivos que se describen a continuación, los
cuales cumplen papeles fundamentales en la lisis de la célula para

obtención de ADN. SDS (sodio dodecil sultafo): Es un detergente aniónico que solubiliza los lípidos y
proteínas, y desestabiliza la estructura de la membrana celular (Rocha, 2002).

Sucrosa: Esta provoca una desestabilización de la estructura celular a través del cambio de la presión
osmótica (Rocha, 2002).

NaCl (cloruro de sodio): Los grupos fosfato tienden a repelerse por su carga negativa, lo que permite
disolver el ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor Preparación de solución de
lisis para extracción de ADN descrito por Collins et al. (1987) Bajo estas condiciones, se favorece la unión
con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que
el ADN se precipite (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989). Tris (hidroximetil amino metano): Es un tampón
biológico usado para estabilizar el pH de la solución (entre 7,0 y 8,0) (Rocha, 2002).

EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético): Una vez el ADN es liberado del núcleo, queda expuesto a las
enzimas DNAsas de la célula que degradan el ADN. Para evitar la degradación se usa el EDTA, agente
quelante que atrapa los iones Mg2+ usados por las DNAasas como cofactores ( Sambrook, Fritsch &
Maniatis, 2001). La inhibición de las enzimas también puede realizarse mediante métodos físicos, como la
desnaturalización por calor (a temperaturas de 65 °C) (Rocha, 2002).

HCl (ácido clorhídrico): Sólo se usa si es necesario para ajustar el pH a 8,6. Teniendo en cuenta que el ADN
puede ser destruido (depurinado) a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble a pH 5,6 pero soluble a pH 8,0. Por
lo tanto, los procesos de extracción, purificación y almacenamiento del ADN deben mantener el pH optimo
y brindar una alta concentración iónica (Rocha, 2002).
B. Objetivo Preparar el buffer de lisis descrito por Collins et al. (1987) para la extracción de ADN. C.
Requerimientos Materiales
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• Espátula
• Tubos falcón de 15 ml y 50 ml
• Marcador indeleble
• Agitador magnético
• Erlenmeyer
• Probeta graduada 95 Del campo al laboratorio: (para preparación de 50 ml)
• 30 ml de H2 O destilada
• 2,5 ml de EDTA (1M)
• 2,5 ml de SDS (10 %)
• 5 ml de NaCl (1M)
• 5 ml de sucrosa (1M)
• 5 ml de Tris (1 M)
• HCl
• NaCl
Equipos
• Balanza analítica
• pH-metro

D. Procedimiento de preparación de buffer de lisis Inicialmente se deben preparar las soluciones

individuales de los reactivos, que luego serán mezclados. Las concentraciones finales a las que debe quedar
cada uno de los reactivos después de mezclados son las siguientes: NaCl 0,1 M; Sucrosa 0,1 M; Tris 0,1 M;
EDTA 0,05 M, y SDS 0,5 % Preparaciones de soluciones

Preparación de NaCl Para preparar una solución de 40 ml de NaCl a una concentración de 1 M, se deben
hacer los siguientes cálculos:
PM (peso Molecular) NaCl: 58,4 g/mol 1 M = 1 mol/1000 ml 58,4 gr → 1000 ml xgr → 40 ml x= (58,4
×40) ÷1000 x=2,34 g, Por tanto, se deben tomar 2,34 g de NaCl y completar con un volumen de 40 ml de
agua destilada. Agitar hasta lograr una solución homogénea. 96 del campo al laboratorio:

Preparación de sucrosa Para preparar una solución de 40 ml de sucrosa a una concentración de 1 M, se

deben hacer los siguientes cálculos:
PM sucrosa: 342,30 g/mol 1 M = 1 mol/1000 ml 342,3 g → 1000 ml x g → 40 ml x= (342,3×40) ÷1000
x=13,7g, Por tanto, se deben tomar 13,7 g de sucrosa y completar con un volumen de 40 ml de agua
destilada. Agitar hasta lograr una solución homogénea.

Preparación de TRIS Para preparar una solución de 40 ml de Tris a una concentración de 1 M, se deben
hacer los siguientes cálculos:
PM TRIS: 121,14 g/mol 1 M = 1 mol/1000 ml 121,14 g → 1000 ml x g → 40 ml = ((121,1440) ÷1000
=4,84g, Por tanto, se deben tomar 4,84 g de Tris y completar con un volumen de 40 ml de agua destilada.
Agitar hasta lograr una solución homogénea.

Preparación de EDTA Para preparar una solución de 40 ml de EDTA a una concentración de 1 M, se deben
hacer los siguientes cálculos:
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PM EDTA: 292,24 g/mol 1M: 1 mol/1000 ml 292,24 g → 1000 ml x g → 40 ml = ((292,440) ÷÷1000

x=11,68 g, Por lo tanto, se deben agregar 11,68 g de EDTA y llevar hasta alrededor de 20 ml. Ajuste el pH a
8 añadiendo gotas de HCl, mezclando y midiendo constantemente con el pH-metro. El EDTA se disolverá
cuando alcance este pH. Para finalizar, afore con agua destilada hasta alcanzar un volumen de 40 ml. Agitar
hasta lograr una solución homogénea.

Preparación de SDS Para preparar una solución de 40 ml de SDS a una concentración de 10 %, se deben
hacer los siguientes cálculos:
PM SDS: 288,38 gr/mol 10 %: 10 g/100 ml*100 10 g → 100 ml x g → 40 ml x= (10×40) ÷100 x=4 g, Por
tanto, se deben tomar 4 g de SDS, y completar con un volumen de 40 ml de agua destilada y homogenizar.
Mezcla de soluciones Para 50 ml de buffer de lisis medir cada una de las cantidades de los reactivos
mediante probetas así:

5 ml de NaCl (1 M),
5 ml de Sucrosa (1 M),
5 ml de Tris (1 M),
2,5 ml de EDTA (1 M) y
2,5 ml de SDS (10 %).
Mezclarlos en un Erlenmeyer, completar con 30 ml de agua destilada. Utilizar el agitador magnético para
homogenizar. Medir el pH y ajustar con HCl o NaCl a 8,6. Finalmente, transferir a un tubo tipo Falcon, el
cual se marca con el nombre del reactivo, la fecha de preparación y el nombre de quien prepara.

https://dspace.tdea.edu.co/bitstream/handle/tdea/1476/Preparaci%C3%B3n%20de%20soluci%C3%B3n%20
de%20lisis%20para%20extracci%C3%B3n%20de%20ADN%20descrito%20por%20Collins%20et%20al.%
20%281987%29.pdf?sequence=1&isAllowed=y