AISLAMIENTO DE ADN PLASMÍDICO

Acevedo, S. Lusdey , Anaya, M. Aura2 ,Begambre, M. Nataly3 , Cárdenas, H. Melissa4 ,Ríos,

1

F. Yulieth5
1,2,3,4,5
Estudiantes de Ingeniería Genética, Programa de Biología, Departamento de Biología y
Química, Facultad de Educación y Ciencias, Universidad de Sucre.

RESUMEN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular extracromosómico capaces de llevar
a cabo su replicación en forma autónoma, es decir, independientemente del cromosoma;
aparecen en el citoplasma de la mayoría de las especies de Archae y Eubacteria. Los
plásmidos son un recurso importante de la ingeniería genética, por ser un sistema simple de
clonación (vector de clonación) en la amplificación de un fragmento de ADN de interés, o en
la expresión y síntesis de proteínas, gracias a su reducido tamaño que varía de uno hasta
varios cientos de kilobases (Kb), que facilita su extracción y su manipulación. Existen
distintas técnicas para aislar ADN plasmídico, no obstante, todos tienen en común las
siguientes etapas: cultivo y crecimiento de las bacterias que contienen el plásmido de interés,
lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico. Por tanto, el objetivo de este trabajo
fue aislar y purificar el ADN plasmídico con genes Lux contenido en una cepa de
Escherichia coli, el cual está implicado en la luminiscencia de algunas bacterias. Se obtuvo
ADN plasmídico de E. coli aislado en cuatro muestras diferentes (1,2,3 y 4), se identificò que
la muestra 2 tiene una mejor calidad presentando bandas nítidas, seguida de la muestra 1 que
es un poco menos intensa pero con una calidad considerable; mientras que las muestras 3 y 4
presentaron bandas opacas, lo cual señala que la concentración de ADN plasmídico aislado
en estas muestras fue baja. La obtención de altas cantidades de ADN plasmídico puro es
fundamental a la hora de analizarlo o utilizar éste como vector en aplicaciones posteriores.

PALABRAS CLAVES: aislamiento, plásmido, ADN plasmídico, lisis alcalina.

ABSTRACT

Plasmids are small molecules of extrachromosomal circular DNA capable of carrying out
their replication autonomously, i.e. independently of the chromosome; they appear in the
cytoplasm of most species of Archae and Eubacteria. Plasmids are an important resource in
genetic engineering, as they are a simple cloning system (cloning vector) for the
amplification of a DNA fragment of interest, or in the expression and synthesis of proteins,
thanks to their small size, ranging from one to several hundred kilobases (Kb), which
facilitates their extraction and manipulation. There are different techniques to isolate plasmid
DNA, however, they all have in common the following steps: culture and growth of bacteria
containing the plasmid of interest, lysis of the bacteria and purification of the plasmid DNA.
Therefore, the aim of this work was to isolate and purify the plasmid DNA with Lux genes
contained in a strain of Escherichia coli, which is involved in the luminescence of some
bacteria. E. coli plasmid DNA isolated from four different samples (1,2,3 and 4) was
obtained, it was identified that sample 2 has a better quality presenting clear bands, followed

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by sample 1 which is a little less intense but with a considerable quality; while samples 3 and
4 presented opaque bands, which indicates that the concentration of plasmid DNA isolated in
these samples was low. Obtaining high amounts of pure plasmid DNA is essential when
analyzing it or using it as a vector in subsequent applications.

KEY WORDS: isolation, plasmid, plasmid DNA, alkaline lysis.

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular extracromosómico, que aparecen en
el citoplasma de la mayoría de las especies de Archae y Eubacteria. Son capaces de llevar a
cabo su replicación en forma autónoma, es decir, independientemente del cromosoma.
Aunque los plásmidos no son esenciales para la supervivencia celular, contribuyen
significativamente en la diversidad genética bacteriana y la plasticidad al aportar genes que
codifican para distintos caracteres fenotípicos como: resistencia a antibióticos, producción de
antibióticos, resistencia en ambientes especiales, degradación de compuestos, etc.

Los plásmidos son un recurso importante de la ingeniería genética, por ser un sistema simple
de clonación (vector de clonación) en la amplificación de un fragmento de ADN de interés, o
en la expresión y síntesis de proteínas (el fragmento de ADN insertado codifica para alguna
proteína de interés) (Hardy, K. G. 1987), gracias a su reducido tamaño que varía de uno hasta
varios cientos de kilobases (Kb), que facilita su extracción y su manipulación (Checa, R. A.
(2017); procedimientos en los que se requiere del aislamiento de ADN plasmídico de alta
pureza. Existen distintas técnicas para aislar ADN plasmídico, no obstante todos tienen en
común las siguientes etapas: cultivo y crecimiento de las bacterias que contienen el plásmido
de interés, lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico (Checa et al. 2017).

El aislamiento del plásmido inicia con la lisis celular; se rompen las paredes celulares para
liberal el material interno (ADN cromosómico y plasmídico) y desnaturalizarlo. La lisis
produce una solución de plásmidos contaminada con restos de ADN genómico y proteínas,
por lo tanto, se deben eliminar mediante centrifugación, donde los restos son sedimentados y
el ADN plasmídico se mantiene en solución. Luego se procede con la precipitación o
separación de ácidos nucleicos de la solución, para después aislar el ADN plasmídico de
impurezas mediante una nueva centrifugación, que finalmente se resuspende y analiza
(Moore, D. y Dowhan, D. 2002; Maniatis, T. y J Sambrook. 1982).

Una de las técnicas más empleadas para aislar plásmidos es la lisis alcalina, método que
consiste en someter a las células a choques alcalinos agregando secuencialmente soluciones
como NaOH y detergentes como el SDS (dodecil sulfato de sodio); el detergente rompe la
membrana de fosfolípidos y la base fuerte (NaOH) desnaturaliza las proteínas en esta, y se
recupera el ADN plasmídico por precipitación con Etanol. Este método constituye la base de
varios protocolos de extracción de ADN plasmídico, ya que se puede aislar solo el ADN
plasmídico de una mezcla de ADN plásmido y cromosómico, que tienen las mismas
propiedades químicas (Sasagawa, N. 2018). Por tanto, el objetivo de este trabajo fue aislar y

2
purificar el ADN plasmídico con genes Lux contenido en una cepa de Escherichia coli, el
cual está implicado en la luminiscencia de algunas bacterias.

METODOLOGÍA

El procedimiento se llevó a cabo en la cámara de flujo vertical, donde se dispuso los

materiales correspondientes; se conservó y enfrió cada reactivo y muestra a utilizar en la
práctica. Con anterioridad junto a la ayuda de los técnicos de laboratorio, se plaqueó en
medio LB/Amp sólido, las cepas de E. coli (MM294 pAMP) durante 12 horas a 37°C. De la
muestra, se tomó una colonia (individual) y se cultivó en 10 ml de medio líquido LB + 100
uL de Amp(1%). De este modo, se tomó un subcultivo de 1000 uL de la bacteria y a las dos
horas posteriores, se transfirió a un tubo de micropipeta. Se agitó y se dejó una noche para
efectuar el crecimiento. Posteriormente, se transfirió a (2) tubos eppendorf y se centrifugó a
12000 rpm durante 3 minutos, luego se descargó el sobrenadante y se dejó secar el pellet con
papel absorbente. Seguido, se le agregó 150 ml del tampón de lisis con glucosa TRIS- EDTA
(GTE) frío y se resuspendió completamente con ayuda del vórtex para diluir los grumos
existentes.

Luego, se agregó 200 uL de SDS/NaOH, se mezcló por inversión 5 minutos y se mantuvieron

los tubos eppendorf en hielo durante los 5 minutos posteriores. Este último procedimiento se
repitió pero esta vez se utilizó acetato de potasio/ácido acético (KOAc/HOAc) frío en lugar
de SDS/NaOH. Seguido a esto, se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. A partir de la
centrifugación, se tomó 500 uL del sobrenadante en 2 nuevos tubos eppendorf, se adicionó a
cada uno 500 uL de Isopropanol, se mezcló por inversión 5 veces y se dejó reposar a 25°C
durante 2 minutos, para así obtener el precipitado del ácido nucleico. Seguidamente, se
realizó una tercera centrifugación a 14000 rpm por 10 minutos; se decantó el isopropanol y se
secó el pellet de ADN plasmídico (reconocidos como puntos blancos). A este, se le adicionó
200 uL de Etanol al 95% y se centrifugó a 14000 rpm durante 3 minutos. Se descartó el
Etanol y se secó el pellet en la cámara de flujo laminar durante 30 minutos.

Por último, se disolvió cada pellet en 100-200 uL TRIS-EDTA (pH 8.0), se adicionó 0.5 uL
de Rnasa (1ug/ml) y se conservó a -20°C. Para analizar la calidad de extracción, se procedió
a visualizar el ADN plasmídico por electroforesis en gel de agarosa (0.8%), con buffer TRIS-
BORATO- EDTA (10X) para un gel de 70 ml. A los 65°C, se agregó y diluyó el colorante
Sybr Safe, por lo que posteriormente se depositó en el molde para preparar el gel de corrida.
Se procedió a la preparación de las muestras del ADN plasmídico en papel parafilm (mezcla
de 3 uL de buffer de corrida Orange G + Glicerol y 7 uL de la muestra de ADN) y posterior
siembra de estas. La electroforesis en gel de agarosa se realizó a 75 V por 60 minutos y se
visualizó en el transiluminador (VWR) y fotodocumentador (UVP).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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Figura 1. Crecimiento de colonias individuales de E. coli MM294 pAMP en medio LB.
En 10 ml del medio líquido LB + 100 µL de AMP (1%).

Figura 2. Aislamiento del ADN plasmídico (A; B), luego de la tercera centrifugación a
14 RPM por 10 minutos (A; a). Decante del isopropanol y secado pellet de ADN
plasmídico (B; a).

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Figura 3. Visualización del ADN plasmídico por electroforesis en gel de agarosa (0.8%),
con buffer TRIS- BORATO- EDTA (10X), en el transiluminador (VWR) y
fotodocumentador (UVP).

Los plásmidos bacterianos son círculos de ADN covalentemente encerrados y enrollados en

forma de Superhélice. Estos elementos genéticos son capaces de replicarse en forma
autónoma, y en general, no incluyen genes esenciales para la supervivencia de la célula que
los porta en condiciones normales, pero sí pueden contener genes que determinan su
supervivencia bajo condiciones de estrés. Por ejemplo, algunos plásmidos denominados R
contienen genes de resistencia a antibióticos. También, y con frecuencia, algunos de los genes
que codifican proteínas que determinan la patogenia de una bacteria, tales como toxinas, pilis,
etc., se encuentran asociados a plásmidos. La casi invariable presencia de plásmidos en
aislamientos bacterianos naturales, por lo menos en algunos géneros, y su gran diversidad en
tamaño y estructura, permite utilizar el análisis de estos elementos genéticos como un arma
epidemiológica muy poderosa, ya que prácticamente cada aislamiento independiente
presentará un perfil plasmídico característico (Denoya CD, Zorzópulos J., 1984 y Denoya et.
Al, 1986).

Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la

electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en función de su tamaño. Esta técnica
consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un
campo eléctrico, las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta
negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfatos. Las moléculas más pequeñas
migran más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su
desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución
que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV (Repullo, J. L. C., Moyano, E.,
& Muñoz, J. 38.). En la Figura 3 se observa el ADN plasmídico de E. coli aislado en cuatro
muestras diferentes (1,2,3 y 4). Se logra identificar que la muestra 2 tiene una mejor calidad
presentando bandas nítidas, seguida de la muestra 1 que es un poco menos intensa pero con
una calidad considerable; mientras que las muestras 3 y 4 presentan bandas opacas, lo cual
señala que la concentración de ADN plasmídico aislado en estas muestras fue baja. Estas

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bajas concentraciones pueden estar relacionadas con errores durante el procedimiento,
indicando así que la manipulación adecuada de los reactivos y equipos durante la
preparación de las muestras para el aislamiento y posterior electroforesis garantiza la
obtención de mejores resultados. La obtención de altas cantidades de ADN plasmídico puro
es fundamental a la hora de analizarlo o utilizar éste como vector en aplicaciones posteriores.

CONCLUSIONES

Los plásmidos aportan genes que codifican para distintos caracteres fenotípicos, como la
resistencia a condiciones extremas, degradación de compuestos, resistencia y producción de
antibióticos. Estas moléculas contienen fragmentos de ADN de interés científico, que gracias
a su pequeño tamaño en comparación con el ADN cromosómico, facilitan su extracción y su
manipulación, en este estudio el aislamiento en E. coli mostró diversidad de plásmidos con
perfil característico que implica la existencia de mecanismos de variación muy dinámicos.

CUESTIONARIO

1. Describe el porqué de cada uno de los tratamientos con: NaOH, SDS, acetato de
potasio, etanol y RNasa.

Lisis alcalina: Este método explota las diferencias en las propiedades de

desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico (pequeños círculos de
DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosómico (fragmentado). La
alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS),
provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas,
y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven menos afectados por su
pequeño tamaño y estructura superenrollada. La neutralización del medio en
presencia de una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca la
precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la
insolubilidad de la sal potásica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosómico (por re
asociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas y DNA
cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el
sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa (Prieto, 2012). El
RNasa se utiliza para remover RNA.

2. Realiza un esquema de la purificación según se utilice la RNasa:

a. En el tampón de lisis

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 b. ó Al final. ¿Se podría prescindir de ella?

Teniendo en cuenta que las RNasas son enzimas catalíticas que ayudan a realizar
hidrólisis de ADN, se vería más lógico usarla en el buffer de lisis, ya que al momento
de romperse los envoltorios biológicos, tiene que haber algo que ayude a qué se
rompa en fragmento más pequeños, estas serían RNasas. Se podría prescindir de ellos,
ya que estas enzimas poseen muchos homólogos que podrían realizar el mismo
trabajo (Zapata, 2012).

3. ¿Cuál es la función de cada componente del tampón de lisis?

El tris se utiliza como amortiguador porque es una sustancia inocua para la mayor
parte de las proteínas, es el agente disociador más habitual para desnaturalizar
proteínas nativas en sus polipéptidos individuales. El ​EDTA es un ​quelante de
cationes divalentes cuya función es secuestrar el Mg​2+​, con lo que se evita que las
posibles nucleasas presentes degradan los ácidos nucleicos de la muestra (la mayoría
de las ​nucleas​as requieren Mg​2+ como ​cofactor​) (Checa et al. 2017).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Checa, A., Santillan, O., Dominguez, A. (2017). Método: Extracción de ADN plasmídico
(Lisis alcalina modificado). Conogasi.

Denoya CD, Zorzópulos J. (1984). Plásmidos de importancia en Medicina. Fundación

Argentina (ed.), Buenos Aires.

7
Denoya CD, Ruiz Trevisan A, Zorzópulos J. (1986). Adherence of multiresistant strains of
Klebsiella ro cerebrospinal fluid shunts: correlation with plasmid content. J Med Microbiol
21:225.

Hardy, K. G. (1987). Plasmids, a practical approach. IRL Press.

Maniatis, T. y J Sambrook. (1982). Clonación molecular: Un manual de laboratorio. New

York: Cold Spring Harbor Laboratory.

Mendez BS. (1984). Elementos genéticos móviles en procariotas. en adelantos microbiología

y enfermedades infecciosas, Vol. 3, CE, Coto, J Esparza, R A de Torres (Eds.), Buenos Aires,
p 137.

Moore, D. y Dowhan, D. (2002). Purificación y concentración de ADN de soluciones

acuosas. Protocolos actuales en biología molecular. 59: I: 2.1 A:2.1.1 -- 2.1.10.

Prieto, M., López, J., Pueyo de la Cuesta, C. Purificación de ácidos nucleicos. 2012.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba.

Repullo, J. L. C., Moyano, E., & Muñoz, J. 38. Purificación de ADN plasmídico y
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Sasagawa, N. (2018). Purificación de plásmido, plásmido, gaviota Munazza, IntechOpen,

DOI: 10.5772 / intechopen.76226.

Zapata, E. 2012. Extracción ADN Plasmídico. ref. ADN plásmido. Bioted.