MICROARRAYS O BIOCHIPS

1º Anatomía patológica y citodiagnóstico

Laura Lorenzo y Carmen López

1
 ÍNDICE
1. Resumen…………………………………………………………………………………………………………………………………3
2. Introducción………………….…………………………………………………………………………………………..…….…….3
3. Objetivos……………………………………………………………………………………………………………………………..…4
4. Historia y desarrollo…….……………………………………………………………………………………………………....4
5. Metodología………………………………………………………………………….……………………………………….……….5
4.1. Fabricación…………………………………………………………………………..……………………………….…..……5
4.2. Funcionamiento……………………………………………………………………………………………………………..6
4.3. Protocolo de trabajo genérico………………………………………………………………………………………9
6. Aplicaciones de los microarrays………………………………………………………………….……………………..10
6.1. Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH).......................................................10
6.2. Estudios de expresión génica………………………………………………………………………………………11
6.3. Otras aplicaciones……………………………………………………………………………………………………….12
7. Resultados y discusión…………………………………………………………………………………………………….…12
8. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………………..……12
9. Referencias bibliograficas…………………………………………………………………………………………...…….13

2
 RESUMEN
Los microarrays o “chips de genes” han hecho posible identificar, clasificar y asignar funciones a muchos genes no
caracterizados, simplemente mediante la determinación de cuando los genes se expresan o están reprimidos.
Los microarrays permiten el análisis de la expresión génica, la variación de la secuencia de ADN, los niveles de
proteínas, los tejidos, las células y otras moléculas biológicas y químicas en un formato masivamente paralelo.

INTRODUCCIÓN
Los análisis genéticos permiten el estudio de la expresión de distintos genes presentes en un organismo.
Anteriormente sólo era posible el estudio de un gen a la vez, lo que ralentizaba demasiado el proceso. Sin embargo,
hoy en día existen métodos que permiten el estudio de múltiples genes al mismo tiempo, como es el caso de los
microarrays. Los microarrays de ADN son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN (sondas) distintos fijados
a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio). Consisten en unas estructuras de una superficie aproximada de 4
cm2 , la cual puede contener más de 10.000 poros.
Los microarrays son una tecnología que reduce procesos que se han utilizado en los laboratorios de genética
molecular desde hace años. Permiten la detección de moléculas de ADN o ARN por hibridación o adherencia de las
moléculas en cuestión de ADN o ARN en un portaobjetos de vidrio, y detección del ADN o ARN adherido mediante
diferentes etiquetas o colores que les permiten ser detectados al microscopio.
La tecnología de microarrays sirve para estudiar la expresión de muchos genes a la vez, es decir, nos permite
determinar si el ADN o ARN de un individuo en particular contiene una mutación en genes. Consiste en colocar miles
de secuencias génicas en lugares determinados sobre un portaobjetos de vidrio llamado chip. Se pone en contacto
una muestra que contiene ADN o ARN con el chip. Así, el apareamiento de las bases complementarias entre la
muestra y las secuencias de genes en el chip produce una cantidad de luz que se puede medir. Permitiendo que las
áreas del chip que producen luz identifiquen los genes que se expresan en esa muestra.

Los tipos de sondas que se pueden fijar en un microarray son ADN bicatenario, normalmente fragmentos de PCR de
longitud variable; sondas de ADNc y oligonucleótidos sintetizados in situ por fotolitografía o in vitro y luego unidos al
soporte. Estos oligonucleótidos pueden ser cortos (menos de 40 nucleótidos) o largos (más de 100 nucleótidos).
Además, tambien hay diferentes soportes posibles que se pueden usar. Pueden ser soportesde nylon con carga
positiva en el caso de los macroarrays, portaobjetos de vidrio con grupos reactivos en los microarrays e incluso
algunos cartuchos especiales para arrays de oligonucleótidos (sintetizados in situ).

3
 OBJETIVOS
El objetivo es comprender los conceptos básicos de la técnica de microarrays y como se aplica a la genómica
funcional. Nos permite realizar análisis genéticos diversos basados en la miniaturización de procesos biológicos.
Esta técnica es además un análisis genético de los tumores
que permite identificar, de una forma clara y directa, una
lista de fármacos que combaten cada caso concreto, así
como una lista de los medicamentos a los que el tumor es
resistente.
El análisis de microarrays se usa en la biología molecular
estándar, con la principal ventaja de un mayor rendimiento
y una mayor precisión que las técnicas tradicionales de
filtro y secado.
En síntesis, los objetivos principales de esta técnica incluyen la detección de cambios entre dos muestras
diferentes, tanto a nivel de ADN como de ARNm.

HISTORIA Y DESARROLLO
Esta técnica está basada en la técnica de biología molecular denominada Southern-blot, en la que en un gel de
agarosa se corren fragmentos de ADN, y tras su correcta separación, éstos se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa, en donde se efectúa una hibridación con una sonda marcada. En un Southern-blot como máximo sólo
se pueden analizar 50 secuencias mientras que en un microarray se pueden analizar hasta 500000 secuencias a la
vez.

4
Esta técnica fue desarrollada por Mark Schena en el año 1995, con élla probó la expresión diferencial de 45 genes
de Arabidopsis thaliana, tanto entre plantas mutantes, como entre diferentes órganos de una planta normal. A partir
de este año, esta técnica sufrió un gran avance, pudiéndose monitorizar hoy en día miles de genes a la vez. En la
actualidad, esta técnica se utiliza principalmente para el estudio de genes que se expresan diferencialmente entre
varias condiciones, para la clasificación molecular en enfermedades complejas e identificación de genes
característicos de una patología, para la predicción de la respuesta a un tratamiento, y para la detección de
mutaciones y de polimorfismos de un único gen. Nuestro trabajo se va a centrar en las aplicaciones de los
microarrays de ADN en el estudio del cáncer.

Arabidopsis thaliana

METODOLOGÍA
FABRICACIÓN
En la fabricación de los microarrays se pueden seguir dos diferentes estrategias:
En el primer caso se usan como sondas fragmentos
de ADNc, oligonucleótidos sintéticos específicos o
productos de amplificación por PCR con un solo
primer. Estas sondas, sean del tipo que sean, son
colocadas una a una en posiciones determinadas del
soporte sólido utilizando un brazo robotizado que
cuenta con una matriz de pequeñas agujas
encargadas de sumergir las sondas y depositar
microgotas. De esta forma contienen picogramos de
sonda en las posiciones concretas del soporte sólido.

Como resultado final obtendremos un soporte con

una matriz de puntos sobre él, cada uno de ellos

5
formado por cientos de miles de moléculas de una misma sonda.
Gracias a este método nos permite fabricar microarrays con decenas de miles de sondas en puntos microscópicos
en una superficie de incluso solamente 2 cm².

Por otro lado, la fabricación de los microarrays también se puede llevar a cabo sintetizando las sondas directamente
sobre la misma superficie sólida. En este caso, las sondas serán pequeños oligonucleótidos, por norma general de 25
bases, sintetizados in situ en la correspondiente superficie sólida gracias a técnicas fotolitográficas o
electroquímicas.
La ventaja de este método de fabricación es que nos hace posible elaborar matrices con cientos de miles de sondas
en una superficie de 1 a 2 cm².

FUNCIONAMIENTO

La aparición de la tecnología de microarrays de ADN ha hecho posible producir y analizar los datos de medición de
los niveles de ARNm de miles de genes en un solo experimento.

Cada chip se compone de unas piezas cortas de una sola hebra de ADN llamados oligonucleótidos que están fijadas a
un portaobjetos de vidrio. Este chip contiene una rejilla que comprende miles de oligonucleótidos, cada uno con una
secuencia conocida que corresponde a un gen particular a analizar.

Debido a que un solo chip contiene miles de puntos, en cada experimento se puede analizar con precisión los niveles
de expresión de miles de genes.

Ejemplo de chip de genes

Partiendo de una única muestra y realizando un único proceso de hibridación, un microarray detecta
simultáneamente miles de secuencias distintas, cualitativa y cuantitativamente. La inmensa cantidad de información

6
que aportan en una única reacción los convierte en potentes herramientas para estudios genómicos y de expresión
génica.

Las sondas ancladas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se marca con fluorocromos la muestra
que se va a estudiar. La lectura del resultado obtenido tras la hibridación requiere un escáner de lectura basado en
tecnología láser y un potente software de análisis.

Por ello, podemos distinguir cuatro pasos básicos que intervienen en un microarray de dos colores:

1. Preparación de muestras: Inicialmente, tanto con las células sanas (muestra de control) como con
las enfermas (muestra experimental) realizamos un cultivo y extraemos el ARNm total.
2. Síntesis de ARNc: Se generan bibliotecas de ADN complementario (ADNc) a partir de las muestras de
ARN usando la transcriptasa inversa, una enzima que utiliza el ARN como molde para producir ADN. Las
bibliotecas de ADNc son etiquetadas con sondas fluorescentes.

Una biblioteca de ADN complementario es la representación de todo el ADN genómico de un organismo, incluyendo
regiones codificantes y no codificantes por igual.

3. Hibridación: EL ADNc marcado a partir de la muestra de control y experimental se coloca en el chip del
microarray, donde se une o se hibrida con el punto que contiene el oligonucleótido con una secuencia
complementaria. Estos resultados de hibridación dan lugar a una doble hélice de ADN estable. Despues de
la hibridación, el chip se lava varias veces para eliminar cualquier ADNc que no se ha unido a un
oligonucleótido en el chip.

A fin de determinar si un individuo posee una mutación para una enfermedad específica, lo primero que hace el
científico es obtener una muestra de ADN de la sangre del paciente, así como una muestra de control, es decir, una
que no contiene una mutación en el gen de interés. Luego, el investigador desnaturaliza el ADN en las muestras, un
proceso que separa las dos hebras complementarias del ADN en moléculas de una sola hebra. El siguiente paso es
cortar las largas hebras del ADN en fragmentos más pequeños y más fáciles de manejar, y luego marcar cada
fragmento con un tinte fluorescente (hay otras maneras de hacer esto, pero éste es un método común).

4. Búsqueda y análisis de datos: El chip se escanea con un láser que excita los marcadores
fluorescentes. La información de la fluorescencia en cada punto se recoge y se procesa mediante un
programa especializado que crea una imagen en color del microarray. La imagen se analiza utilizando un
programa que interpreta la fluorescencia de cada punto.

7
Pueden aparecen distintos colores:

➔ Aparecen manchas amarillas cuando el control y las muestras experimentales se hibridan en cantidades
equivalentes.
➔ Cuando aparece el color negro significa que no tiene expresión, es decir, el gen no se transcribio en la
muestra y por lo tanto no se puede utilizar.
➔ Cuando aparece un punto verde nos indica la presencia de más de ADNc a partir de la muestra control
(célula sana) que de la muestra experimentar (célula enferma). Por lo tanto, un punto verde revela que hay
menos ARNm presentes en la célula de cáncer de la normal, y el gen se dice que tiene una “baja expresión”.
➔ Cuando aparece una mancha roja significaría que el gen tiene una “elevada expresión” en la muestra del
cáncer.

El ADN del individuo se marca con un tinte verde y el ADN de control, o normal, se marca con un tinte rojo. Ambos
conjuntos de ADN marcado se insertan entonces en el chip y se deja hibridar, o unirse, al ADN sintético en el chip.

➔ Si el individuo no tiene una mutación en el gen, tanto la muestra roja como la verde se unirán a las
secuencias en el chip que representan la secuencia sin la mutación (es decir, la secuencia "normal").
➔ Si el individuo, de hecho, posee una mutación, el ADN del individuo no se unirá correctamente a las
secuencias del ADN en el chip que representan la secuencia "normal" sino que se unirá a la secuencia en el
chip que representa el ADN mutado.

8
 Principios del análisis de microarrays de los colores

PROTOCOLO DE TRABAJO GENÉRICO

Los protocolos para la hibridación con microarrays varía mucho según el fabricante y la muestra que se quiere
analizar. Sin embargo, en todos los protocolos hay unos pasos comunes:
- Marcaje de la muestra. Las sondas fijadas al microarray no están marcadas, por lo que el primer paso
de la técnica consiste en marcar la muestra con un fluorocromo:
A. Para estudios de expresión génica, lo habitial es purificar el ARNm y sintetizar el ADNC con
nucleótidos marcados. Algunos fabricantes recomiendan obtener ADNc sin marcar y hacer una
transcripción in vitro de el gen empleando nucleótidos marcados con biotina.
B. Para estudios genómicos se purifca el ADN y se marca, por ejemplo, mediante nick translation o
random priming.
El método de marcaje denominado nick translation consiste en marcar sondas de ADN bicatenario
de gran tamaño mediante la tecnología del ADN recombinente, utilizando la ADN asa I, ADN
polimerasa I y una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato marcados radiactivamente.
Por otro lado, el método de marcaje random priming consiste en marcar sondas de ADN
bicatenario de gran tamaño o genomas completos radiactivamente, utilizando una mezcla de

9
 oligonucleótidos de 6 basas denominados hexámeros, un fragmento de Klenow de ADN
polimerasa I y una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfatos marcados radiactivamente.
- Hibridación y lavados de poshibridación. Se llevan a cabo siguiendo las condiciones de
rigurosidad recomentadas por el fabicante. Si el marcaje de la muestra se ha realizado con biotina, depsues
de los lavados de poshibridación se realiza un paso extra de tinción, que consiste en incubar el microarray
con estreptavidina marcada con fluorocromo.
- Lectura del microarray. Se realiza mediante un escáner que dispone de un láser que excita cada
punto de la matriz con la longitud de onda adecuanda al fluorocromo utilizado y de un detector que mide la
intensidad de la fluorescencia emitida por cada punto de la matriz.
- Análisis e interpretación de los resultados. Se realiza mediante un software específico-

APLICACIONES
Se han descrito muchas aplicaciones de la tecnología de microarrays, pero las dos más destacadas son la
hibridación genómica comparada y los estudios de expresión génica.

● Estudios de expresión: cuantificar un conjunto de ARNm o microARN de una muestra concreta.

● Inmunoprecipitación de cromatina con el objetivo de identificar la unión de proteínas al ADN.
● Análisis de variaciones de nucleótidos.
● Hibridación genómica comparada, por ejemplo para analizar la localización de reordenaciones genéticas
cromosómicas.
● Secuenciar e identificar cambios en la secuencia nucleotídica.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA EN ARRAYS (aCGH)

Permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en pérdida (deleciones y microdeleciones) o
ganancia (duplicaciones y microduplicaciones) de material genético mediante la comparación del ADN de una
muestra con un ADN de referencia.
La clave del método consiste en marcar el ADN de la muestra que se quiere analizar y el ADN de referencia con
fluorocromos distintos (habitualmente en verde y rojo respectivamente).

Una vez marcados, se mezclan en la misma proporción y se utilizan para hibridar un array fabricado con fragmentos
de ADN clonado ADNc u oligonucleótidos.
En cada punto de la matriz, ambos ADN compiten por hibridar con la sonda, de manera que el color de la
fluorescencia final va a depender de la proporción de ambos en la mezcla: los puntos rojos indican deleciones en el

10
ADN problema, los puntos amarillos indican genes inalterados y los puntos verdosos indican duplicaciones en el ADN
problema.
En un único array se pueden estudiar múltiples genes de interés, y cada gen puede estar representado por múltiples
sondas específicas de distintas regiones del gen. La sensibilidad del método permite detectar microdeleciones y
microduplicaciones de 5 a 10 kb.
Esta es una técnica especialmente útil para realizar estudios genómicos de células tumorales, en el diagnóstico de
enfermedades genéticas y el diagnóstico prenatal.
Su principal limitación es que no detecta alteraciones cromosómicas estructurales como translocaciones o
inversiones, puesto que las secuencias diana están presentes en cantidades normales, aunque se sitúan en
localizaciones cromosómicas anómalas.

ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA

La hibridación en microarrays permite análisis detallados de perfiles de expresión génica de poblaciones celulares, al
estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes. Estos estudios pueden realizarse:

A. En términos absolutos, hibridando en microarray con el ADNc obtenido a partir del ARNm de una población
celular. Con estos estudios se puede saber qué genes se expresan y con qué intensidad relativa
(dependiendo de la intensidad de fluorescencia en cada punto) en una población celular en un momento
determinado y en unas condiciones concretas y qué genes están reprimidos (ausencia de fluorescencia
esos puntos).

11
 B. En términos comparativos, hibridando el microarray con una mezcla del ADNc de la muestra problema y un
ADNc de referencia marcados con distintos fluorocromos. En este caso, el color de la fluorescencia en cada
punto dependerá de las proporciones de un ADNc concreto en ambas muestras. Los estudios de expresión
génica comparada permiten también comparar la misma población celular en distintos estados metabólicos
o en distintas situaciones. Esto es muy útil, por ejemplo, para estudiar los efectos de las medicaciones y las
respuestas ante agentes físicos, químicos o infecciosos.

OTRAS APLICACIONES
Los microarrays son útiles para estudiar a gran escala todo tipo de polimorfismos y mutaciones con una gran
repercusión en el diagnóstico, pronóstico y evolución de las enfermedades, así como de la predisposición a
padecerlas.
Otros ejemplos de aplicaciones son la detección de microorganismos contaminantes en alimentos y muestras
biológicas, el estudio de splicing alternativos del ARN, genes de difusión, etc.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La tecnología utilizada en el diseño de los microarrays se apoya en la propiedad de biología molecular fundamental
del ADN que es la complementariedad de las bases nitrogenadas. Esta tecnología se ha aplicado al estudio de casi
cualquier tipo de problema biológico, en la clasificación molecular de enfermedades complejas, en la detección de
mutaciones y en la identifiación de genes característicos de una patología.

CONCLUSIONES
Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes mediante la hibridación, un proceso de
unificación de dos cadenas monocatenarias complementarias de ADN o ARN a una molécula bicatenaria.
Esta técnica nos permite detectar genes que producen ciertas enfermedades mediante la comparación de los niveles
de expresión entre células sanas y células que estan desarrollando ciertos tipos de enfermedades como el cáncer. Y
así, poder realizar un correcto diagnótico e informe para poder combatir la enfermedad y proceder realizar el
correcto tratamiendo de la enfermedad.

12
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Uso de chips de ADN (microarrays) en medicina: fundamentos técnicos y procedimientos básicos para el
análisis estadístico de resultados | Medicina Clínica (elsevier.es)
Tendencias en el análisis de microarrays | Medicina de la naturaleza (nature.com)
Libro biología molecular
https://youtu.be/hJMdso9SaIo
https://youtu.be/itZq0DMk404

13