Bioquímica y Biología Molecular. Grado Nanociencia y Nanotecnología. Curso 2.

Identificación de la flora del Campus de Móstoles de la URJC usando

nano-códigos basados en DNA
Ordás, María del Camino; Quintana, Julia; Pérez, Álvaro
Afiliación de las autoras:
Escuela Superior de Ciencias Experimentales y Tecnología. Campus de
Móstoles. Calle Tulipán s/n. 28923, Móstoles, Madrid
* Correspondencia a: julia.quintana@urjc.es

RESUMEN

El uso de etiquetas de identificación única, los códigos de barras (del inglés, barcode) es muy común.
Por extensión, cualquier tecnología que genere códigos distintivos que permitan diferenciar de manera
unívoca entre muestras de interés se conoce como barcoding. Cuando los códigos de barras se usan a
escala micro- o nano-, las posibilidades son infinitas, desde diagnóstico de enfermedades hasta análisis
de muestras biológicas de origen dudoso. A pesar de que el uso de códigos de barras basados en DNA
es muy habitual para la identificación de especies, nunca se había usado esta tecnología para analizar
las plantas que conviven con nosotros en el Campus de Móstoles de la URJC. Esta práctica pretende
generar huellas moleculares de la flora del campus usando el gen de cloroplasto rbcL. Para ello, se
extraerá DNA de cuatro especies problema, se amplificará una región del gen rbcL y se secuenciará dicha
región usando oligonucleótidos universales (wet lab). A continuación, las secuencias consenso se
emplearán para minar las bases de datos e identificar las distintas especies (dry lab). Este estudio nos
permitirá evaluar el uso de huellas moleculares basadas en DNA en las especies del Campus de Móstoles
de la URJC.

RESUMEN GRÁFICO

Figura 1. El estudio “a vista de pájaro”. A) Palabras clave en formato de nube de palabras B) Diseño
experimental ordenado cronológicamente.
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INTRODUCCIÓN
Los códigos de barras son etiquetas legibles que se emplean para identificar y rastrear
una gran cantidad de información. En el mundo macroscópico que nos rodea vemos cada
día códigos de barras tradicionales, compuestos de líneas o barras paralelas de diferente
grosor con espacios entre ellas. De ahí su nombre original. Simplemente cambiando el
número de barras, su grosor y los espacios entre ellas se pueden generar un número
ilimitado de códigos. Estos códigos de barras se pueden ver en los productos del
supermercado, paquetes de mensajería, e incluso en los hospitales y centros de salud
para identificar a cada paciente. Los beneficios de este sistema de identificación son
tantos que no se tardó demasiado en trasladar esta tecnología a escala micro- o nano-.
Ya no son barras y espacios, sino que han evolucionado a una miríada de estructuras
denominados micro-códigos o nano-códigos que codifican información suficiente para
unirse de manera específica a elementos en la escala micro- y nano- (Shikha et al., 2017).
Los nano-códigos (del inglés, nanobarcodes) son estructuras de escala nanométrica que
contienen información suficiente para identificar dianas de manera específica. Un nano-
código típico contiene una estructura base fija y un elemento codificante variable que
lleva información para su especificidad (Figura 1) (Shikha et al., 2017). Los elementos
codificantes pueden tener distintas propiedades ópticas (fluorescentes y no
fluorescentes), magnéticas, morfológicas o estructurales que determinan el método de
síntesis del nano-código y su rango de aplicación. Los elementos codificantes pueden
estar embebidos dentro de la estructura, en superficie o auto ensamblados (sin
necesidad de estructura) (Shikha et al., 2017). Tanto las estructuras como los elementos
codificantes pueden ser preformados o sintetizarse desde precursores en el momento
de la adición de elementos codificantes. Los nano-códigos deben cumplir los criterios
de: (i) ser fáciles de preparar, (ii) ser robustos y (iii) ser reproducibles.

Figura 2. Figura obtenida de (Shikha et al., 2017)

Diferentes estructuras para nano-barcoding. a) nano-perlas con los elementos codificantes en el interior
(i) o en la superficie (ii); b) nano-clusters, con partículas ensambladas y estabilizadas con biopolímeros; c)
nano-cables; d) nano-barras; e) nanotubos con partículas encapsuladas en el interior; f) nano-láminas con
partículas en el interior; g) nano-estrellas; h) nano-discos; i) nano-soportes cónicos con terminaciones
puntiagudas; j) estructura organometálica que consiste en enlaces entre iones metálicos y ligandos
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orgánicos con partículas fluorescentes encapsuladas dentro y k) códigos codificados genéticamente

hechos de nucleótidos o péptidos (los que sintetizaremos en este trabajo)

Una de las ventajas más interesantes de los nano-códigos es su capacidad de unirse y

etiquetar células y biomoléculas, para las cuales los micro-códigos son demasiado
grandes. Con una oferta y diversidad cada vez más grande, los nano-códigos tienen
aplicaciones muy interesantes en Nanomedicina, tales como la detección de
biomoléculas (ácidos nucleicos y proteínas) (Nam et al., 2003; He et al., 2006), la
adquisición de imágenes (Lu et al., 2018) o la administración de medicamentos (Lu et al.,
2018).
Uno de los ejemplos de barcoding más relacionados con la Biología Molecular son los
nano-códigos basados en secuencias de aminoácidos o nucleótidos, y dentro de éstos,
los basados en DNA. Son fáciles de generar y tienen un número ilimitado de
combinaciones de código. Son además fáciles de leer, usando un secuenciador. La
desventaja que tienen, no obstante, es que son inestables a temperatura y pH extremos.
(Nam et al., 2002; Mead et al., 2014; Yang et al., 2021). El barcoding basado en DNA
consiste en la amplificación y secuenciación de fragmentos génicos por PCR. Esas
secuencias se usan para generar un código de barras para ese organismo que permita
distinguirlo de otras especies (Lebonah et al., 2014).
La síntesis de secuencias de DNA para la identificación de especies tanto de animales
como de plantas a nivel molecular es unas aplicaciones más sencillas, y por ello más
empleadas, de nano-códigos. El objetivo fundamental del barcoding basado en DNA es
establecer genes marcadores aceptados por la comunidad científica que se pueden usar
para identificación de organismos y diagnóstico taxonómico. Para dicha selección se
emplean los estándares de universalidad, calidad de secuencia y poder discriminante
establecidos por el CBOL, del inglés Consortium for the Barcode of Life's
(https://www.ibol.org/phase1/cbol/). En plantas, se han caracterizado y probado
muchos genes marcadores para establecer códigos estándar (Group1 CBOL Working
Group et al., 2009; Hollingsworth et al., 2011; DeSalle and Goldstein, 2019; Bell et al.,
2017). Entre ellos, el gen que codifica para la subunidad grande de la enzima RuBisCO,
rbcL, y el gen que codifica para la proteína D1 del Fotosistema II, matK, son de los más
empleados. rbcL ofrece alta universalidad y buena amplificación, pero su poder
discriminante es limitado. matK, por otro lado, ofrece mucha resolución, pero menor
universalidad (Group1 CBOL Working Group et al., 2009).
En este artículo pretendemos evaluar el uso de dos nano-códigos basados en secuencias
de genes cloroplásticos para la identificación de especies de plantas del Campus de
Móstoles de la URJC. Para ello, hemos sintetizado nano-códigos basados en rbcL
mediante PCR. A continuación, los hemos leído usando secuenciación de DNA por el
método Sanger o método por terminación de cadena
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-
regulation/biotechnology/a/dna-sequencing. Por último, hemos empleado las
secuencias obtenidas para identificar las especies que han sido muestreadas y realizar
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estudios comparativos. Nuestros resultados aportan una identificación de la flora del

campus basada en nano-códigos.

MATERIAL Y MÉTODOS
Recogida de muestras
Para la extracción de DNA se emplearon hojas. El material vegetal se recogió en el
Campus de Móstoles de la Universidad Rey Juan Carlos en noviembre de 2023. Se
recogieron un total de dos hojas por cada individuo y el DNA se extrajo de cada una de
las hojas por separado. Por cada especie se muestrearon dos individuos. Para cada
muestra se anotaron la fecha y hora de recogida. Las muestras se etiquetaron con un
código único y se guardaron en un lugar fresco hasta la extracción de DNA. Como control
positivo se usaron hojas de la especie modelo Arabidopsis thaliana.

Extracción de DNA y secuenciación

Para la extracción de DNA se recortó un disco de hoja de 6 mm de diámetro empleando
la tapa del tubo Eppendorf de 1.5 mL, equivalente a 5-10 mg de material vegetal. El DNA
genómico total se extrajo empleando el método de Edwards (Edwards et al., 1991) con
pequeñas modificaciones. Los discos de hoja se introdujeron en un tubo Eppendorf de
1.5 mL de volumen al que se añadieron 400 µL de tampón de lisis (200 mM TrisHCl pH7.5,
250 mM NaCl, 25 mM EDTA•Na2 pH 8.0, 0.5% SDS). El tejido se maceró a temperatura
ambiente durante 15 segundos con un pistilo de plástico previamente esterilizado.
Después de agitar con vortex 5 segundos se centrifugó el homogeneizado durante 1
minuto a máxima velocidad en la centrífuga de mesa. El sobrenadante se transfirió a un
tubo nuevo, se añadieron 300 µL de isopropanol y se invirtió el tubo 5 veces. Después
de 2 minutos de incubación se centrifugó el DNA precipitado 5 minutos a máxima
velocidad en una centrífuga de mesa. Se retiró el isopropanol y el DNA precipitado se
secó al aire durante 20 minutos y una vez seco se resuspendió en 100 µL de tampón T10E1
(10mM Tris-HCl con 1mM EDTA•Na2). Para conseguir su completa disolución el DNA se
incubó a 55 ºC durante 10 minutos y se agitó 5 segundos. Las impurezas y el DNA no
disuelto se eliminaron por centrifugación (5 minutos a máxima velocidad en centrífuga
de mesa). El DNA obtenido se cuantificó con un lector de microplacas (Tecan Infinite®
200 PRO) para una estimación del rendimiento de la extracción y la pureza del DNA.

Se realizaron un total de tres reacciones de PCR: dos reacciones para amplificar las dos
extracciones independientes de DNA, una reacción para amplificar el control positivo y
otra reacción para amplificar el control negativo. Para cada PCR se usó como molde 2 µL
de DNA total e iniciadores universales para rbcL barcoding de plantas (Tabla 1; Kress and
Erickson, 2007; Cuénoud et al., 2002). La mezcla de reacción para PCR se realizó en un
volumen final de 25 µL que contenía: 2.5 µL de tampón de reacción de PCR con MgCl2
10x, 0.5 µL de dNTPs 10 mM cada uno, 0.25 µL de polimerasa (Biotools; concentración final:
1x de tampón, 200 μM de cada dNTP, 0.05 U/μL de polimerasa), 0.5 µL de cada iniciador
10 μM (concentración final: 0.2 µM), 2 µL de DNA molde y 16.25 µL de agua purificada.
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Cada ciclo de PCR se programó de la siguiente manera: desnaturalización inicial de 3

minutos a 94 ºC seguida de 30 ciclos de desnaturalización 94 ºC 30 segundos, unión a 55
ºC 30 segundos y extensión 72 ºC 30 segundos, y una extensión final de 5 minutos a 72
ºC. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa 1%.
Aquellos productos de PCR que mostraron amplificación positiva se purificaron usando
los reactivos del Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit (NEB)
(https://international.neb.com/protocols/2019/01/16/protocol-for-exo-ciprapid-pcr-
cleanup-e1050) en un volumen final de reacción de 7 uL que contiene: 1 µl del tubo Exo-
CIP A (Exo I termolábil), 1 µl del tubo Exo-CIP B (CIP termolábil) y 5 µL de producto de
PCR para degradar el exceso de cebadores y dNTPs. La mezcla se incubó a 37°C durante
4 minutos, seguida de una incubación de 1 minuto a 80°C para inactivar
irreversiblemente ambas enzimas. Se enviaron 3 µL de reacción a Macrogen Inc (Seoul,
South Korea-http://dna.macrogen.com) para secuenciación bidireccional por el método
Sanger usando los iniciadores universales M13 forward y reverse.
Tabla 1. Secuencias de iniciadores empleadas
Temperatura
Región Primer Secuencia 5’-3’
de unión
rbcLaf-M13_F TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 55
rbcL
rbcLar-M13_R CAGGAAACAGCTATGACTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC 55

Análisis de secuencias
Los análisis de secuencia se realizaron en el formato gratuito de la plataforma Benchling
(San Francisco, CA). En primer lugar, se generó una secuencia consenso a partir de los
cromatogramas de las secuencias forward y reverse (archivos con los nombres
Examplex_rbcL_M13_xP.ab1) usando el algoritmo Local pairwise (MAFFT). Ese
alineamiento inicial se refinó mediante inspección visual de los cromatogramas para la
detección de errores de secuencia y la eliminación de bordes con poca calidad. Ambos
fragmentos, ya limpios de ruido, se realinearon para generar la secuencia o contig
consenso o código de barras. La secuencia consenso se usó como molde para una
búsqueda en las bases de datos de nucleótidos del NCBI con la herramienta BLAST tipo
blastn (Basic Local Alignment Tool; nucleótido-nucleótido).
Identificación de especies
Se usaron los parámetros de similitud y cobertura de la tabla resumen de la búsqueda
BLAST para identificar las especies problema, a nivel de género y /o especie. La tabla
resumen con las secuencias que produjeron alineamientos significativos se ordenó de
mayor a menor usando el Max Score (puntuación de la calidad del alineamiento en
función del número de nucleótidos coincidentes). Como criterio para la asignación de
especie se consideró la asignación más probable aquella con la puntuación más alta y el
valor e el más bajo. En el caso de múltiples resultados, se escogió aquel con el porcentaje
de identidad más alto. En la situación de que existan dos o más resultados con idéntica
puntuación/valor e/porcentaje de identidad (la base de datos o nuestro código no tienen
información discriminatoria suficiente para llegar a especie), se consideró que la
identificación a nivel específico no es posible y se procedió a asignar un género. Una vez
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identificada la especia/género, se procedió a un estudio de la similitud usando el primer

resultado del BLAST como secuencia para construir el alineamiento. Para alinear las
secuencias, se empleó la herramienta Clustal Omega ofrecida por el European
Bioinformatic Institute (https://wwwdev.ebi.ac.uk/services). El resultado se presentó en
forma de alineamiento y se evaluaron los porcentajes de similitud con la matriz de
alineamiento.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción de DNA y PCR

Partiendo de nuestra especie problema, la número dos y primera planta, tal y como
muestra la Tabla 1 obtuvimos una concentración de 40,7ng/μL y 12,1ng/μL para la
primera y segunda hoja, respectivamente. Las cuales presentan una pureza de 1,57 para
la primera y 2,02 para la segunda. Además, he de destacar que el control positivo
presentaba un mayor valor tanto para la concentración como para la pureza.
Nuevamente, observando los valores de la Tabla 1, observamos que las concentraciones
oscilan entre valores ciertamente similares que alcanzan picos máximos en 172,5 ng/μL
y mínimos de 4,8ng/μL (ambos procedentes de la especie 3). Tras la PCR realizada
concluimos que tan sólo amplifico una sola de ellas, tal y como se observa en la Tabla 2.
Se trata de una amplificación específica debido a que el cebador utilizado codifica
únicamente secuencias de RbcL. Finalmente, la misma presenta un tamaño de entre 500-
700pb, como se muestra en la Figura 3.

Análisis de secuencias
Tras las dos lecturas, la forward y la reverse, no pude construir un contig completo ya
que perdimos parte de la información a la hora de recortar la secuencia. Tratábamos de
alcanzar un tamaño de 650bp, sin, embargo, tras recortar obtuve un tamaño final de
contig de 624bp, por lo que efectivamente se perdió información. Se debió
principalmente un problema y es que las zonas iniciales y finales del cromatograma no
eran claras. Por otro lado, para la especie 1, 3y 4 obtuve un tamaño de contig de 537bp,
520bp y 488bp respectivamente. El tamaño de los contigs comparado con el tamaño del
producto de la PCR es un gran indicador de la fidelidad de la secuencia obtenida con
respecto al gen original, en este caso el valor de la PCR es mayor. Al secuenciar estamos
cortando parte de la secuencia de bases, y de esta manera, a su vez perdemos parte de
información, pudiendo dificultar la lectura de dicha secuencia.
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Identificación de especies y alineamiento de secuencias

A partir del clustal hemos podido obtener una matriz de similitudes entre las secuencias
y, tal y como se observa en la Figura 4.A, se han obtenido resultados de alta similitud
positivos entre las cuatro especies problema, que oscilan entre valores de 92-96% con
una similitud máxima del 95,83% entre la especie 3 y 4. Para las especies 1, 2,3 y 4,
obtuvimos hits máximos de 5, 3, 4 y 10 respectivamente. Para las cuatro, los hits
corresponden a especies diferentes, por lo que no se puede concluir a ciencia cierta el
nivel de especie. Sin embargo, sí que se ha podido determinar el tipo de género, dicha
información figura en la Tabla 3. Para poder llegar a un posible nivel de especie
deberíamos de realizar una secuenciación con un menor numero de recortes, con esto
conseguiríamos no perder tanta información y obtener un mayor grado de coincidencia
que nos permitiese conocer el nivel de especie.

Las especies alineadas presentan grandes similitudes en la proteína escogida, la RbcL

(que codifica para la enzima de la rubisco), tal y como muestran los datos de la Figura
4.A que oscilan entre el 92- 96% de similitud. La principal razón de por qué dicho gen
tiene que estar tan conservado es debido a su gran relevancia en la fotosíntesis de los
organismos fotoautótrofos. Una variación de este gen afectaría en la actividad
fotosintética de dichos organismos, no expresando la proteína codificada por dicho gen
y pudiendo verse gravemente afectados, llegando a provocar incluso la muerte del
organismo. Por último, la manera más sencilla de modificar el gen RbcL sería mediante
la CRISPR-Cas9, técnica procedente del campo de la ingeniería genética que permitiría
realizar una modificación mediante la inserción, modificación o eliminación de
secuencias genéticas.
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FIGURAS

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa para visualizar las amplificaciones de los códigos rbcL. Las
bandas pertenecen a amplificaciones de rbcL en DNA total de hojas pertenecientes a cuatro especies
problema. DNA de hojas de Arabidopsis thaliana se ha empleado como control positivo. Los números
encima de las bandas indican hojas distintas; c (+) indica control positivo; c (-) denota control negativo.
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(A)

(B)

Figura 4. Matriz de similitud entre secuencias de DNA rbcL de las especies identificadas (A) y
alineamiento T-Coffee de secuencias de proteína de rbcL (B) de acuerdo con el servicio disponible en la
página web del European Bioinformatics Institute.
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TABLAS
Tabla 1. Cuantificación de DNA extraído de hojas recogidas en el Campus de Móstoles de la URJC
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Tabla 2. Resumen de la amplificación de rbcL (basado en Figura 3 o en los resultados de clase)

%
Muestra
amplificación
Especie problema 1
0%

Especie problema 2 0%

Especie problema 3 17%

Especie problema 4 0%
5

Tabla 3. Resumen de los resultados del BLAST

Número de hits con

Muestra Género asignado Especie / Especies
máximo score
Especie
5 PINUS NO SE SABE
problema 1
Especie
3 NARCISSUS NO SE SABE
problema 2
Especie
4 MUSA NO SE SABE
problema 3
Especie
10 SILENE NO SE SABE
problema 4

Recalcar que para realizar el análisis y discusión del artículo se ha hecho uso de inteligencia artificial
en ciertos momentos clave, con la finalidad de poder mejorar la expresión y redacción de las
respuestas.
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BIBLIOGRAFÍA

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