Trabajo 9.

Teoría de inmovilización: métodos de inmovilización de enzimas: aplicaciones de inmovilización de

enzimas, inmovilización de células: aplicaciones de la inmovilización de células.

Doc1 https://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf

Documento: https://www.redalyc.org/journal/1812/181268228007/html/

nmovilización una mirada a los métodos, soportes y

retos.
Immobilization a look at the methods, supports and
challenges.

Rosa I. Meneau Hernández *

Instituto de Ciencias y Tecnología de Materiales Universidad de la Habana, Cuba

Katia Borrego Morales

Instituto de Ciencias y Tecnología de Materiales Universidad de la Habana, Cuba

Maria Liva Garrido

Instituto de Ciencias y Tecnología de Materiales Universidad de la Habana, Cuba

 Tania Fariñas Piñera

Instituto de Ciencias y Tecnología de Materiales Universidad de la Habana, Cuba

Inmovilización una mirada a los métodos, soportes y retos.

Revista CENIC Ciencias Biologicas, vol. 52, núm. 1, pp. 059-078, 2021

Centro Nacional de Investigaciones Científicas

Recepción: 16 Septiembre 2020

Aprobación: 05 Octubre 2020

RESUMEN:La inmovilización enzimática puede ser utilizada en una amplia gama de procesos.
Durante los últimos años se han implementado variedades de técnicas para la inmovilización,
aumentando la eficiencia y un mayor uso. Hoy día, se prefiere trabajar con las enzimas
inmovilizadas que con enzimas libres debido a que se aumenta su disponibilidad y los rendimientos
por ciclos de trabajo, reduciendo así los costos de operación en determinados sectores industriales.
Las aplicaciones están enfocadas, principalmente, a las aplicaciones en la industria azucarera,
biotecnológicas bioremediación de aguas y suelos entre otros. Las enzimas inmovilizadas también
encuentran una aplicación significativa en el metabolismo de fármacos, la producción de biodiesel,
antibióticos y la industria alimentaria. El uso generalizado de enzimas inmovilizadas se debe en
gran parte al hecho de que son más baratas, respetuosas con el medio ambiente y mucho más fáciles
de usar en comparación con tecnologías equivalente. Este estudio es una revisión de la extensa
variedad de literatura existente sobre los diferentes soportes para la inmovilización de enzimas, sus
principales características y usos, así como los procesos de inmovilización que pueden verse
afectado por el tipo y características de los materiales de soporte.

Palabras claves:Inmovilización, soportes de inmovilización, inmovilización

enzimática.

ABSTRACT:Enzymatic immobilization can be used in a wide range of processes. During the last
few years, varieties of techniques for immobilization have been implemented, increasing its
operational efficiency and its higher use. Nowadays, immobilized enzymes are preferred over free
enzymes, since their availability and yields per work cycles are superior, hence, operating costs
happen to be reduced in industrial sectors. The applications are mainly focused on sugar industry,
biotechnology, bioremediation of waters and soils, among others. Immobilized enzymes have also
demonstrated significant application in drug metabolism, biodiesel and antibiotic production, and
food industry. The widespread use of immobilized enzymes is largely due to the fact that they are
cheaper, more environmentally friendly, and much easier to use compared to equivalent
technologies.This study is a review of the extensive variety of existing papers on the different
supports for the immobilization of enzymes, their main characteristics and uses, as well as the
immobilization processes that can be affected by the type and characteristics of the support
materials.

Keywords:Immobilization, immobilization supports, enzyme immobilization.

Introducción

El termino inmovilización en la biotecnología se refiere al confinamiento de

células, enzimas u otros organismos de manera que se encuentren localizadas
dentro de cierta región, manteniendo propiedades biológicas para ser utilizadas
tanto en la degradación como en la obtención de un producto determinado. Una
gran variedad de procesos que son llevados a cabo mediante el uso de soportes de
inmovilización. En los últimos años, la biotecnología ha tenido importantes
avances en la aplicación de estos. Por ejemplo, los procesos industriales para la
obtención de productos químicos, alimentarios y farmacéuticos, así como en el
área ambiental

Los trabajos realizados sobre inmovilización de microrganismos y enzimas han

generado gran interés en la comunidad científica, debido a sus ventajas técnicas y
económicas con respecto a los procesos tradicionales. Entre las principales
ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos, que utilizan células
inmovilizadas, se encuentran su facilidad para el manejo de una mayor densidad
celular, un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de la
biomasa para su posterior reutilización.

De igual manera, los procesos de inmovilización de enzimas, tanto de forma

nativa como de complejos enzimáticos presentes en los organismos, han sido un
punto de estudio de varias investigaciones científicas. Las enzimas o
"biocatalizadores" son un descubrimiento notable en el campo de la tecnología de
bioprocesos. La biocatálisis ha sido ampliamente aceptada en diversos sectores
debido a su facilidad de producción, especificidad de sustrato y factibilidad para
su reúso (Kawaguti et al., 2006; Datta et al., 2012). Sin embargo, el uso de
enzimas en su forma nativa es un proceso generalmente costoso, además existe la
posibilidad de un bajo funcionamiento en cuanto a su estabilidad, recuperación y
reutilizaciones (Hartmann, 2013).

El primer informe sobre la inmovilización de enzimas se remonta a 1916.

Nelson y Griffin demostraron que la enzima invertasa, adsorbida físicamente en
el carbón, retiene completamente su actividad catalítica (Nelson J, 1916). Desde
entonces, la inmovilización de enzimas se ha estudiado durante casi 100 años
(Krishna et al., 2018). La primera enzima inmovilizada utilizada industrialmente
fue la aminoacilasa, adsorbida físicamente en el polímero DEAE-Sephadex y
utilizada para la producción industrial de L-metionina por Tanabe Seiyaku Co. en
1969 (Liese K et al., 2001).

Actualmente, la inmovilización de enzimas y de microorganismos se utiliza en

infinidad de procesos industriales. Algunos ejemplos son: en la industria
farmacéutica para la obtención del ácido 6-aminopenicilánico (APA) que se
emplea como núcleo para la producción de antibióticos semisintéticos,
especialmente ampicilina y amoxicilina (Min, 2016); en la industria alimenticia
para la producción de fructuosa a partir del almidón (Faber, 2004; Hartmann,
2013). A diferencia de la industria farmacéutica y algunos casos de la industria
química, los objetivos en la industria alimentaria son producir cantidades muy
grandes de productos a bajo costo, por lo que, la enzima inmovilizada, debe tener
una buena estabilidad operativa que permita realizar una gran cantidad de ciclos
(Basso, 2019).

En el campo de la biorremediación y la protección del medio ambiente, los

métodos de inmovilización de células y enzimas también han desempeñado un
papel primordial (Stadimair et al., 2018, 2019). Por citar un ejemplo, en la
producción de biocombustibles se han empleado para disminuir la carga
ambiental y obtener biocombustibles de excelente calidad y menos emisión de
gases nocivos como el CO2 (Raman, 2011; Chapman, 2018). También ha sido
utilizada en la industria textil para la eliminación de colorantes, cuyos residuales
son muy tóxicos al ser vertidos en los cuerpos de aguas (Darwesh, 2019). En
cuanto a los contaminantes emergentes presentes en las aguas residuales de la
industria farmacéutica, varios autores han expuesto resultados satisfactorios en
cuanto a estabilidad, factibilidad de reutilización y la capacidad de degradación
de las enzimas inmovilizadas en la reducción de antibióticos, disruptores
endocrinos y metales, entre otros. La comunidad científica ha prestado gran
atención a estos contaminantes, en los últimos años, debido a los daños
potenciales que provocan a la salud humana y animal, así como a ecosistemas
cercanos a los cuerpos de agua (Carmalin et al., 2018; Bilal et al., 2019; Faird et
al., 2020).

En este artículo se exponen las principales técnicas utilizadas en la

inmovilización, características de los soportes y propiedades de estos que
influyen en el proceso de inmovilización.

Métodos más usados en la inmovilización.

A DSORCIÓN .
 Durante los procesos de adsorción, la enzima se une a un soporte mediante
interacciones iónicas por fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno.
Durante este proceso las moléculas de enzima se adhieren a la superficie del
soporte mediante una combinación de interacciones hidrofóbicas y la formación
de varios enlaces salinos por la molécula de enzima. Esto se logra embebiendo el
material de soporte en una suspensión de la enzima, logrando una interacción
directa entre los dos compuestos (Spahn C, 2008; Cordeiro et al., 2011).

Este método logra fuertes vínculos entre el material de soporte y la enzima,

aunque varios factores pueden afectar estas interacciones. La temperatura, el pH,
las condiciones fisiológicas y la adición de sustratos no degradables pueden
debilitar este enlace. Soportes como las fibras de coco, que presentan una
excelente capacidad de retención de agua y altas propiedades de intercambio
catiónico; caolín con alta retención de enzimas por acetilación química y
materiales micro/mesoporosos, que tienen una gran área superficial ideal para
reacciones de reducción y oxidación; permiten que las enzimas adsorbidas tengan
una gran resistencia a la proteólisis y una fuerte agregación debido a su
interacción hidrófoba con las interfaces (Karagulyan et al., 2008; Huang et al.,
2011; Mitchell et al., 2011).

Varios estudios de adsorción se han centrado en la inmovilización de enzimas

en silicatos como principales portadores. Soportes porosos como las silicas
mesoporosas del tipo material MCM-41 han sido utilizadas para adsorber la
enzima lacasa, mejorando su estabilidad térmica, de pH y su capacidad operativa
(Wang et al., 2008). Se plantea que una opción para la mejora en el proceso de
adsorción es la modificación previa de los grupos funcionales, lo que aumenta su
efectividad. Estudios realizados en este sentido muestran que, al modificar,
previamente, enzimas con glutaraldehído, mejoraron los procesos de adsorción y
la funcionalidad enzimática.

Varios autores reportan la inmovilización de la enzima ureasa, adsorbida sobre

1,4 butenodiol diglicidil éter. Estos estudios evidenciaron mayor estabilidad
frente pH y la capacidad para retener más del 50% de la actividad de la enzima
en condiciones de deshidratación. Demostrandose, una vez más,que la
inmovilización es un método adecuado de utilización de materiales
biocompatibles con el ambiente, económicos, duraderos y eficientes en sus
funciones (Mishra et al., 2011; Pontón et al., 2011).

Unión Covalente.

La unión covalente de una enzima a un soporte es quizás el método de

inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología
de unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para
que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. Entre los 20 aminoácidos
diferentes que pueden encontrarse en la estructura de las enzimas, los más
empleados para la formación del soporte son lisina, cisteína, tirosina, histidina y
en menor cuantía arginina, ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos
debidos a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de
la superficie proteica y no pueden intervenir en la unión covalente. No obstante,
la reacción depende de la presencia de diferentes grupos funcionales como son:
grupo carboxilo, amino, indol, sulfhídrilo, tiol, imidazol e hidroxilo. Por otro
lado, una mayor actividad específica y una mejor estabilidad puede lograrse si se
utilizan superficies modificadas por péptidos para lograr la unión enzimática (Fu
et al., 2001). Los grupos amina expuestos en los residuos de lisina reaccionan
fácilmente con soportes que llevan ésteres activos, siendo los más comunes los
ésteres de N-hidroxi-succinimida (NHS), para formar enlaces amida estables. Sin
embargo, cuando se usan ésteres de NHS pueden no ser muy favorable ya que los
mismos son inestables en condiciones acuosas y, por tanto, la unión de proteínas
en tampones acuosos competirá con la hidrólisis del éster, lo que posiblemente
resulte en un modesto rendimiento de inmovilización (Abolpour et al., 2013).

El soporte óptimo para la inmovilización por formación de enlaces covalentes

debe contener brazos espaciadores cortos y una alta densidad de grupos reactivos.
Estas características son necesarias para la fijación multipunto de la enzima,
aportando su rigidez (Fernández, 2012). Se han empleado muchos soportes para
la inmovilización enzimática a través de la formación de enlaces covalentes,
entre ellos soportes a base de sílice como caolinita o nanopartículas de sílice
mesoporosa (Liu et al., 2008; Salis et al., 2009). (Liu et al. 2008) utilizaron
nanopartículas de sílice silanizadas y activadas con glutaraldehído en el soporte,
estos materiales mejoraron las estabilidades térmicas y operativas de la enzima,
como lo mostró la retención del 61% de la actividad residual después de 4h a 60
°C y la retención del 55% de la actividad después de 10 ciclos de operación. Sin
embargo, otros estudios mostraron una alta estabilidad y la retención de más del
70% de la actividad de la enzima lacasa al ser inmovilizada en esferas magnéticas
mesopososas de sílice. En este sentido, las esferas magnéticas fueron tratadas con
glutaraldehído mostrando una disminución en el proceso de inmovilización, ya
que, en la superficie del soporte, dos grupos -COH del glutaraldehído se unieron
a los grupos aminos de la superficie del material de soporte (Zhu et al.,2007). Los
procesos de unión covalente pueden ocurrir de diferentes maneras y dependerá
del balance entre el material que se utilice como soporte y la enzima o
microorganismo a inmovilizar.

Muchas veces las interacciones físicas entre las enzimas y la sílice no son lo
suficientemente fuertes para mantener las enzimas dentro de los poros. La
lixiviación de la enzima es una limitante de este material para ser usado como
material de soporte, por lo que si se requiere un enlace covalente y evitar este
lixiviado enzimático, se debe modificar químicamente la superficie de apoyo.

La modificación de superficies de sílice es un método bien establecido y una

técnica ampliamente usada en esta inmovilización. Este método se describe en la
literatura ofreciéndose numerosos protocolos (Yiu et al., 2005; Zhou et al., 2012).
La ventaja de la modificación de superficies es que las moléculas de enzima están
fuertemente fijadas, por lo que la desorción de la enzima de los soportes de sílice
no ocurre con facilidad (Hartmann, 2010).

Xu (2011) comparó la inmovilización de la lipasa pancreática porcina (PPL) en

SBA-15 modificada con (3-aminopropil)-trietoxisilano y demostró que la PPL,
anclada químicamente, mostraba una mejor unión enzimática, así como, una
mejor actividad en comparación con la PPL adsorbida físicamente. Además, la
PPL inmovilizada covalentemente mostró una estabilidad mejorada frente a los
cambios de temperatura y pH del medio y mejor capacidad de reutilización.

Hay dos vías generales para introducir grupos orgánicos en un soporte de

sílice, es decir, modificación in situ durante la síntesis, denominada co-
condensación o posmodificación, también conocido como injerto. La co-
condensación permite la modificación de sílices mesoporosas por
copolimerización de tetraalcoxisilanos [(RO)4]Si (típicamente,
tetraetilortosilicato (TEOS) o tetrametilortosilicato (TMOS)) con
trialcoxiorganosilanos terminales del tipo (R´0)3SiR en presencia de un
tensoactivo. Esta técnica de modificación proporciona una carga superior y más
homogénea de la superficie con grupos organosilanos en comparación a
materiales funcionalizados mediante injerto. Sin embargo, el método de co-
condensación tiene varias deficiencias: la cantidad de trialcoxiorganosilanos
incorporados en los materiales de sílice es generalmente menor de lo que cabría
esperar de su concentración inicial en el medio de reacción. El aumento de la
concentración de trialcoxiorganosilanos en el medio puede resultar en la
formación de productos con una estructura muy desordenada, lo que conlleva a
una superficie reducida y un menor grado de carga orgánica. Además, el
alcoxisilano funcionalizado debe hidrolizarse en una tasa similar a la del
alcoxisilano no funcionalizado, de lo contrario se formará un gel heterogéneo y,
por lo tanto, el grupo funcional no se distribuirán uniformemente. El injerto se
logra mediante la unión covalente de organotrialcoxisilanos u otras especies de
silano reactivo como tricloroorganosilanos o sililaminas con la superficie libre de
silanol grupos en el soporte de sílice (ordenado o desordenado). Al utilizar las
especies de organosilanos adecuadas, grupos funcionales como cloruro, alquilo,
tiol, ciano/isociano, grupos vinilo/alilo, organofosfina, fenilo, alcoxi o amino se
puede unir a la superficie de los portadores de sílice. De esta manera, los restos
funcionales de las enzimas pueden reaccionar con un soporte de sílice.

Los grupos funcionales de las enzimas más comúnmente utilizadas y la ruta

más popular para la inmovilización covalente de enzimas en soportes de sílice
porosa es la funcionalización de la superficie del material con grupos amino
(principalmente a través de (3-aminopropil) trietoxisilano, APTES) seguido de la
reacción con glutaraldehído (GA) para proporcionar un enlazador adecuado (Fig.
1). Los grupos aldehído de la superficie del soporte de sílice reaccionan
posteriormente con los grupos aminos de la enzima formando enlaces de imina.
En algunos protocolos de inmovilización, las uniones de imina se redujeron aún
más mediante el uso de NaBH4.Otros organosilanos disponibles comercialmente,
pueden ser utilizados en la modificación de la superficie, el 3-(glicidoxipropil)-
imetoxisilano y 3- (mercaptopropil)-trietoxisilano, lo que aportan los grupos
epoxi o grupos tiol, respectivamente. Las sílices modificadas con 3-
(mercaptopropil)-trietoxisilano pueden reaccionar además con grupos tiol de
residuos de cisteína, lo que da como resultado la formación de enlaces disulfuro.

Fig. 1
Inmovilización enzimática covalente, sílice mesoporosa modificada con (3-
aminopropill) triethoxysilane, reaccionando con Glutaraldehidos y el N-
terminal de la enzima.

Una de las principales ventajas de la unión covalente de enzimas en sílice es

que el biocatalizador resultante puede ser utilizado en disolventes polares y el
agua. Mientras que las enzimas adsorbidas físicamente, solo se pueden utilizar en
disolventes orgánicos o con reactivos hidrófobos puros para evitar la lixiviación.
La desventaja más marcada de la inmovilización covalente de enzimas es la
menor actividad específica de los biocatalizadores resultantes en comparación
con las enzimas libres en solución (Jung et al., 2010; Petkova et al., 2012).

A TRAPAMIENTO

El atrapamiento se basa en la retención de las enzimas por enlaces covalente o

no covalente dentro de geles o fibras (Datta et al., 2013). Se ha logrado una
encapsulación eficiente con vehículos híbridos de alginato-gelatina-calcio que
evitan la fuga de enzimas y proporcionaron una mayor estabilidad mecánica
(Shen et al., 2011). El atrapamiento en estructuras nanoestructuradas como las
nanofibras electrohiladas y materiales novedosos, como nanopartículas de sílice,
oro, magnética y de poliacrilamidacon; ha revolucionado el campo de la
inmovilización enzimática. Estos soportes están basados en la utilización de nano
estructuras, mayor campo de investigación para la inmovilización, pues ofrecen
grandes posibilidades con amplias aplicaciones en la química, los biosensores y
la obtención de biocombustibles (Wang et al. 2009; Wen et al.2011).

El atrapamiento por materiales como la sílice mesoporosa es atribuido

principalmente a su alta superficie, distribución uniforme de poros, tamaño de
poro y alta capacidad de adsorción (Ispas et al., 2009). Se han utilizado matrices
sol-gel con polímeros supramoleculares de calixareno para atrapar la lipasa
de Candida rugosa, teniendo en cuenta su capacidad de unión y transporte
selectiva (Erdemir et al., 2011). Se ha reportado que las lipasas k-carrageninas
son altamente termoestables y muy tolerantes a los solventes orgánicos
(Jegannathan et al., 2010).

I NMOVILIZACIÓN POR AFINIDAD

La inmovilidad por afinidad se basa, fundamentalmente, en la especificidad de

la enzima con su soporte en diferentes condiciones fisiológicas.

El aumento de la afinidad enzima/soporte es lograda y aumentada mediante dos

técnicas. Un primer caso donde la matriz está acoplada previamente a un ligando
afin a la enzima o un segundo caso en el que la enzima se conjuga a una entidad
que desarrolla afinidad hacia la matriz (Sardar et al. 2000).

La bioafinidad de capas es una variante de esta técnica que aumenta

exponencialmente la capacidad de unión a enzimas y su reutilización debido a la
presencia de enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, etc. (Haider y
Husain 2008).

Cuando se pretende realizar un proceso de inmovilización de una enzima se

deben tener en cuenta muchos factores. No basta con tener un material
adsorbente y que se conozca las propiedades de degradación o de obtención de
producto que pueda tener la enzima que se requiere inmovilizar. Las condiciones
de pH, temperatura, la técnica de inmovilización, las condiciones de degradación
y los solventes a utilizar deben ser seleccionadas de manera eficiente para el
propósito que se persigue. El proceso debe ser simple, barato y que no requiera
ciclos de regeneración a corto plazo. La eficiencia de inmovilización de la
enzima debe ser lo más elevado posible y evitar su saturación en periodos cortos
de tiempo.

Materiales utilizados como soportes en la inmovilización.

Muchos son los materiales que se utilizan como soportes de inmovilización. Su

selección viene dada, principalmente, por el medio en que serán empleados y por
el tipo de material biológico que será adherido a él.

Las características de la matriz son de suma importancia para determinar el

éxito. Entre las características de lo soporte ideales se incluyen:

Deben ser de bajo costo y ecológico.

Deben ser totalmente inertes después de la inmovilización y no bloquear la

reacción deseada.

Tener resistencia térmica y mecánica, permitiendo que la enzima inmovilizada

se use en diversas condiciones operativas.

Ser muy estables.

 Ser de fácil regeneración después de la vida útil.

Mejorar la especificidad de la enzima.

Contener una gran cantidad de enzima.

Tener un rango adecuado de porosidad y tamaño de poro. Cuando los poros son
pequeños apenas excluirá la proteína, el diámetro del poro debe estar en un rango
apropiado.

El soporte debe poder cambiar el pH óptimo para la enzima.

Debe tener propiedades de adsorción antimicrobianas y no específicas.

Sobre la base de su composición química, las matrices de soporte se clasifican

en dos categorías principales. Los materiales de soporte inorgánico y los
materiales de soporte orgánico que pueden subdividirse en naturales y sintéticos.

Polímeros Naturales.

El alginato es un polisacárido aniónico derivado de la pared celular de las algas

pardas. Está constituido, además, de sales de calcio, magnesio y sodio
proveniente del ácido algínico y se ha utilizado ampliamente para la
inmovilización en forma de perlas de alginato, geles de alginato-poliacrilamida y
perlas de calcio-alginato. El enrejado de alginato con iones divalentes de Ca2+ Y
glutaraldehído han mostrado una gran estabilidad en la inmovilización de
enzimas. (Flores-Maltos et al., 2011).

La quitina y el quitosano son polímeros naturales muy usados como soportes

para la inmovilización (Coello, 2019; Hernández, 2019). El quitosano se ha
utilizado en combinación con alginato; las enzimas recubiertas de quitosano,
sufren menos el efecto de lixiviación en comparación con el alginato debido a las
interacciones iónicas entre la enzima y el soporte (Betigeri et al., 2002). Del
mismo modo, un compuesto quitosano-arcilla mostró resultados favorables en el
atrapamiento de enzima al tener grupos hidroxilo y amino, que enlazan
fácilmente con las enzimas, junto a una alta porosidad. El quitosano en forma de
perlas mostró también excelentes resultados al permitir la inmovilización del
doble de enzimas (Chang et al., 2007).

(Chern 2005), demostró que la unión de la quitina al dominio de quitinasa A1

de Bacillus circulans, tuvo una alta afinidad por lo que se empleó en la retención
de D-hidaninasa.
 Colágeno Las propiedades del colágeno lo convierten en un buen sistema de
soporte, es de naturaleza proteica y presenta buena capacidad para la retención de
agua y una buena porosidad.

Durante la inmovilización, se forma un enlace covalente entre las cadenas

laterales del colágeno y la enzima, lo que mantiene firmemente la enzima sobre
el soporte. El colágeno es un polímero natural que se ha utilizado con éxito en la
inmovilización de la enzima tanasa empleando glutaraldehído como agente de
retención (Katwa et al., 1981). Las fibras de colágeno-Fe3 demostraron ser una
excelente matriz de soporte para la inmovilización de catalasa al mantener una
actividad significativa, incluso, después de 26 reutilizaciones (Chen et al., 2011).

Gelatina

La gelatina es un material hidrocoloide, rico en aminoácidos, y puede adsorber

hasta diez veces su peso en agua. Se ha utilizado como sistema de vehículo mixto
con poliacrilamida, donde la reticulación con acetato de cromo (III), resultó
mejor que el sulfato de cromo (III) y el sulfato de potasio y cromo (III) (Emregul
et al., 2006). De igual manera, el alginato de calcio con gelatina forma una
plantilla para la deposición de fosfato de calcio que ha mostrado excelentes
resultados en la inmovilización de enzimas y la gelatina en combinación con
poliéster mostró una eficiencia de carga del 75%, en comparación con otros
estudios que tenían una eficiencia de carga del 50% de la enzima (Shen et al.,
2011; Ates, 2010).

Celulosa

La celulosa es el polímero natural más abundante y ha sido ampliamente

utilizado para inmovilizar lacasa, glucoamilasa, a-amilasa, tirosinasa, lipasa entre
otras enzimas (Mislovicova et al., 2004; Bryjak et al., 2007; Namdeo et al.,
2009; Labus et al., 2011; Huang et al., 2011; Klein et al., 2011).

Los soportes celulósicos modificados han mostrado una gran capacidad de

almacenamiento. En la degradación de almidón la enzima α-amilasa se
inmovilizó en nanopartículas magnéticas recubiertas con dialdehído de celulosa
que resultó en la formación de un nuevo sistema de degradación de almidón
(Namdeo y Bajpai, 2009). Del mismo modo, se obtuvo un aumento de la
tolerancia y la viabilidad de la enzima inmovilizándola sobre una película de
celulosa líquida iónica activada con glutaraldehído (Klein et al., 2011).

Pectina
 La Pectina es un polisacárido estructural de las plantas presente en la pared
celular. Es un gelificante con buena capacidad de retención de agua. En la
medicina se ha utilizado en el tratamiento de las lesiones cutáneas e
inmovilizando la enzima papaína junto al glicerol (Ceniceros et al., 2003).
Pectina-quitina y pectina-alginato de calcio, han sido estudiadas por su capacidad
de formar complejos polielectrolitos altamente estables donde las enzimas
quedan bien atrapadas. Mantienen una resistencia térmica y se evita la
desnaturalización, además las propiedades catalíticas de las enzimas
inmovilizadas fueron significativamente mayores (Gómez et al., 2006; Satar et
al., 2008).

Polímeros sintéticos como soportes

Las resinas/polímeros de intercambio iónico son soportes insolubles con

superficie porosa que han demostrado ser excelentes materiales para la retención
de enzimas. Las resinas amberlite y celulósica son matrices renovables de gran
superficie que se han utilizado en la inmovilización de una gran variedad de
enzimas como las amilasas (Kumari et al., 2011). Algunos polímeros sintéticos
utilizados como soportes enzimáticos se indican a continuación:

- cloruro de polivinilo, mostró excelentes resultados en la inmovilización de las

enzimas glucosiltransferasa y alcohol deshidrogenasa e inhibiendo la inactivación
térmica de la enzima (Shinde et al, 2018).

- micropartículas de poliuretano derivadas de alcohol polivinílico han sido

empleadas en la inmovilización de enzimas de Aspergillus para producciones
industriales. (Gonzalez et al., 2010).

- Epoxi modificado con ácido fumárico/metacrilado utilizado en aplicaciones

industriales para la degradación de olefinas (Mohammadikish et al., 2019).

- Polianilina es un polímero semiflexible que se ha utilizado como soporte

mediante uniones covalentes de las enzimas amilasa activadas (Xiangli et al.,
2010; Ashly et al., 2011).

Materiales inorgánicos como soporte.

Una gran cantidad de materiales de naturaleza inorgánica pueden ser

empleados como materiales de soporte en los procesos de inmovilización. El
vidrio, los geles de sílice, alúmina, óxidos metálicos, zirconia y muchos otros son
ampliamente utilizados ya que presentan una resistencia térmica y mecánica.
Estos materiales también ofrecen resistencia a la degradación por los
microorganismos al no funcionar como sustratos para el crecimiento o
mantenimiento de hongos y bacterias. Las características fundamentales de los
soportes inorgánicos son la rigidez y la porosidad. Estos soportes también tienen
la característica no variar el diámetro y el volumen de sus poros, manteniendo un
volumen y una forma fija. (Sirisha et al.,2016).

Sílice

Los soportes inorgánicos a base de sílice como el dióxido de silicio y el

tetraóxido de silicio se utilizan, generalmente, para la inmovilización de enzimas.
Existen polímeros que presentan los grupos SiO4 rígidos pero los grupos SiO2 son
flexibles, además de esto presentan sitios hidrófilos como hidrófobos que le
confieren propiedades de adsorción muy complejas.

Los soportes inorgánicos a base de sílice necesitan modificaciones y activación

adecuada. Estas modificaciones, generalmente, se logran por tratamiento químico
permitiendo la introducción de grupos aminos y la activación se logra por varios
métodos de inmovilización. Un ejemplo clásico es la inmovilización de la enzima
penicilina G amidasa, unida primero a dextrano e inmovilizada en gel de sílice
con amino. Los resultados mostraronque se lograba una elevada estabilidad
térmica, sirviendo de base para futuras inmovilizaciones (Burteau et., 1989).

De igual manera los trabajos de Dezott en 1995, mostraron las bases para la
inmovilización en sílice activada. En este caso, la enzima peroxidasa eliminaba
de manera más efectiva la contaminación por clorolignina del efluente de
eucalipto. (Dezott et al., 1995).

Otros informes mostraron resultados muy favorables en la inmovilización de la

enzima α-amilasa en nanopartículas de sílice. El biocomposito obtenido es
introducido en la fabricación de detergentes (Soleimani et al., 2011).

En cuanto a la inmovilización de compuestos de naturaleza no proteica,

también se ha reportado el rendimiento de inmovilización en este tipo de
soportes. Sustancias con actividad antimicrobiana como los aceites esenciales
fueron inmovilizadas en sílice amorfa. Se evaluó la actividad antimicrobiana de
los compuestos una vez inmovilizados, resultando en un aumento de su actividad.
(Ruiz et al., 2017).

Zeolita
 Uno de los soportes microporosos de silíceo más utilizado es la zeolita, la cual
presenta una gran superficie específicas que le aporta buenas propiedades para la
inmovilización de enzimas y microorganismos.

Las zeolitas o 'tamices moleculares' son sólidos cristalinos microporosos con

estructuras bien definidas y de alta selectividad según la forma. Son ampliamente
utilizadas en procesos de adsorción molecular. Tienen una amplia aplicación en
campos tan diversos como la petroquímica, procesos de intercambio iónico,
separación de gases, etc.

Las zeolitas son una familia de materiales porosos muy importantes, académica
e industrialmente. Sin embargo, el reducido tamaño de poro de estos materiales
(generalmente inferior a 1,2 nm), supone una importante limitación para la
difusión de moléculas voluminosas involucradas en procesos tan importantes
como el craqueo de catalítico u otros en química fina o industria farmacéutica,
donde necesariamente se requiere una porosidad en el rango del mesoporo
(García et al.,2002; Zhang et al., 2018; Taghizadeh et al., 2020).

Disímiles son los reportes de trabajos relacionados con la inmovilización

enzimáticas que han mostrado su utilización. Xing (2000) comprobó las
excelentes propiedades para la inmovilización de α-quimotripsina en zeolitas
microporosas usando diferentes solventes orgánicos en el proceso de
atrapamiento. De igual manera, Chang y Chu (2007), demostraron que las
zeolitas Y tenían mejores propiedades para la inmovilización de lisozima,
aumentando la actividad de la enzima en comparación con otros soportes. Se
considera que la superficie heterogénea de las zeolitas con múltiples sitios de
adsorción es adecuada para modular las interacciones de la enzima y el soporte.
(Datta et al., 2013)

Cerámica

Los materiales cerámicos están formados por fases cristalinas y/o vitrieas. En
general los componentes de estos materiales, fases cristalinas y/o vitrieas, están
constituidos por elementos metálicos y no metálicos. Los enlaces en las
diferentes fases pueden tener naturaleza iónica o covalente. Estos materiales son
empleados ampliamente en procesos de inmovilización. Reportes relacionados
con la inmovilización de la enzima lipasa de Candida antartica sobre cerámica
señalan que este soporte inerte podría ser empleado para realizar reacciones
hidrolíticas y sintéticas; limitando la inhibición por retroalimentación
(Weinberger et al. 2018; Mulinar et al., 2020). Otro ejemplo de material cerámico
es la toyonita, cuya estructura de poros variable se puede modificar utilizando
diferentes recubrimientos orgánicos (Kamori et al., 2000).
Vidrio

Las perlas de vidrio son uno de los soportes inorgánicos más utilizados. Su
naturaleza porosa estándar y su dureza las convierten en un excelente material de
soporte. Se han utilizado para inmovilizar varias enzimas como la α-amilasa. En
este proceso, se encontró que las perlas de vidrio se funcionaban con grupos
amino que contienen cloruro. De manera similar, la ureasa, cuando se inmovilizó
en electrodos de pH de vidrio, sirvió como biosensor para monitorear la urea en
muestras de sangre a niveles tan bajos como 52 mg/mL (Sahney et al., 2005). En
una investigación más reciente la inmovilización de β-galactosidasa, en perlas de
vidrio, para la producción de galacto-oligosacáridos mostró un aumento en la
producción comparada; con la enzima libre. Adicionalmente se evidenció un
aumento en la resistencia a los cambios bruscos de pH y temperatura.
(Eskandarloo et al., 2018)

Carbón activado

Tanto el carbón activado natural como el modificado con ácido clorhídrico han
mostrado excelentes propiedades para la retención de enzimas. La inmovilización
de proteasa ácida y lipasas ácidas en partículas de carbón activado mesoporoso
mostraron una eficiencia catalítica significativamente elevada. Mostrando que
podían reutilizarse después de durante 21 ciclos de reacción. Estos estudios
mostraron además el eficiente uso del área superficial del carbón activado para
los procesos de atrapamiento enzimático (Kumar et al., 2010; Ramani et al.,
2012; Daoud et al., 2010). Otros estudios mostraron excelentes resultados en la
producción de bio-hidrógeno cuando se emplearon microorganismos
inmovilizados sobre carbón activado. (Zhang et al., 2017)

Factores que influyen en la inmovilización.

Como se ha definido, la inmovilización exitosa de enzimas u otros materiales

biológicos sobre soportes y las propiedades del biocatalizador resultante están
determinadas en gran medida por varios factores. Estos incluyen en las
condiciones experimentales, como el pH y la temperatura de la solución tampón;
las propiedades del material, el tamaño de la enzima y las propiedades
fisicoquímicas de los materiales de soportes, su porosidad y tamaño, morfología,
tamaño de partícula, composición y otras. Específicamente en el caso de las
enzimas, la presencia de grupos polares (grupos amino de lisina y/o grupos ácido
de ácido glutámico), regiones superficiales apolares o residuos de azúcar influyen
en gran medida en la inmovilización (Nair et al., 2018). En este caso
abordaremos tres propiedades de los materiales de soportes que influyen
significativamente en los procesos de inmovilización.
Tamaño de poro

Numerosos estudios han mostrado que la carga y la actividad de la enzima

dependen, claramente, del tamaño de los poros del soporte. Por lo tanto, no todos
los materiales porosos son aplicables para la inmovilización enzimática. Los
portadores con diámetros de poro demasiado pequeños para acomodar moléculas
enzimáticas, como las zeolitas microporosas, no proporcionan un soporte estable,
debido a que las moléculas enzimáticas se adsorberán en la superficie externa y
no estarán protegidas (Hartmann et al., 2010; Hartmann et al., 2013) Por el
contrario, si los poros son mucho más grandes que las moléculas de la enzima,
estas últimas no se pueden proteger y retener como en poros más pequeños. En el
caso de la adsorción física, es posible que ocurra una lixiviación de la enzima.

Los materiales porosos a menudo se asocian con una gran superficie específica,
sin embargo, no es una garantía para la obtención de altas cargas enzimáticas. Por
ejemplo, aunque los materiales MCM-41 poseen una superficie muy grande, a
menudo, para estos materiales se ha informado de una carga enzimática baja y
tasas de inmovilización lentas. Dado que el tamaño de los poros de MCM-41 es
típicamente de alrededor de 4 nm, están restringidos a la inmovilización de
enzimas con tamaños relativamente pequeños. Por lo tanto, para alcanzar una alta
carga de enzimática y una alta retención de actividad, se debe encontrar un
compromiso entre el tamaño de los poros del soporte y el sitio de la enzima
(Wang et al., 2005; Schlipf et al., 2013).

Tamaño de partícula y morfología

La morfología y el tamaño de las partículas del soporte tienen una fuerte

influencia en la capacidad de inmovilización. Además, con respecto a las
aplicaciones industriales a gran escala, estas propiedades del soporte a menudo
influyen en la selección del sistema de reacción y la configuración del reactor.
Por ejemplo, para un reactor de lecho fijo se requieren partículas de gran tamaño
para reducir la caída de presión (Cao, 2005).

Lei et al., 2004 estudiaron la influencia de la morfología del soporte en el

comportamiento de inmovilización de la lisozima. Se demostró que la cantidad
de enzima que penetra a los poros aumenta con la disminución del tamaño de
partícula de las sílices mesoporosas, lo que llevó a una mejora en la adsorción de
enzimas. Por otro lado, Zhou et al., 2009 investigaron la influencia que ejerce la
morfología de las partículas en la inmovilización de lipasa proveniente
de Candida rugosa. Se observó que la inmovilización sobre sílice, en forma de
vesícula, da como resultado una mayor estabilidad térmica y reutilización; en
comparación con la inmovilización en la sílice en forma de varilla.

Otras investigaciones comparan tres tipos de soportes de sílice mesoporosa con

diferentes tamaños de partículas (40 nm, 300 nm y 1000 nm) pero con el mismo
tamaño de poro. En estos estudios las silices fueron utilizadas para la
inmovilización de lipasas. Los resultandos mostraron que, aunque la carga de
enzima fue similar, la actividad fue superior en las lipasas inmovilizadas en las
esferas de 300 nm (Popat et al., 2011; Gustafsson et al., 2012).

Superficie química.

La naturaleza química de la superficie desempeña un papel muy importante en

la unión de la enzima. La misma influye directamente en las fuerzas de
interacción entre las biomoléculas y el soporte de inmovilización.

La hidrofobicidad o hidrofilicidad del soporte puede tener una fuerte influencia

sobre el comportamiento de inmovilización y la actividad catalítica de las
enzimas inmovilizadas. La mayoría de las enzimas tienen carácter hidrófilo y, por
tanto, se adsorben más bien en soportes hidrófilos con una superficie
polar. Sörensen et al., (2010), inmovilizaron lipasas de Thermomyces
lanuginosus en superficies de soporte hidrófilos e hidrófobas. La actividad
específica de la lipasa inmovilizada sobre el soporte hidrófilo fue superior a la
enzima inmovilizada en soporte hidrófobo, así como su estabilidad en el
almacenamiento.

Conclusiones.

Con un gran número de reportes científicos y una amplia gama de aplicaciones,

la inmovilización de enzimas y productos biológicos es una de las técnicas más
prometedoras para el desarrollo de los procesos biotecnológicos, altamente
eficientes y económicamente competentes en el campo del monitoreo ambiental,
biotransformación, diagnóstico, industrias farmacéuticas y alimentarias.

Constantemente se desarrollan nuevas estrategias de funcionalización de

superficies que incluyen el uso de líquidos iónicos, soluciones metálicas,
fabricación de geles y nanopartículas que logran modificar las propiedades del
soporte.

Durante la revisión concienzuda de la bibliografía se encontraron solo reportes

de estudios preliminares de la inmovilización de dos enzimas sobre un mismo
soporte o el uso de una sola enzima en la eliminación de varios sustratos. Serían
de interés investigaciones enfocadas en estos dos aspectos, las que contribuirían a
un uso más eficiente de estos biomateriales. Por otro lado, deben divulgarse más
las aplicaciones industriales en todo tipo soportes especialmente los materiales
porosos como las zeolitas.

Las estrategias basadas en enzimas están reemplazando cada vez más los
métodos químicos convencionales, tanto en laboratorios como en industrias, las
mismas presentan una alta eficiencia y excelentes rendimientos. Sin embargo, la
comercialización de enzimas inmovilizadas todavía se encuentra a un ritmo
menor debido a sus costos y problemas de almacenamiento. La investigación
debe centrarse en superar las limitaciones actuales relacionadas con las técnicas
de inmovilización expresadas en nuestra revisión, a fin de ampliar el horizonte de
aplicación integral.

Referencias Bibliográficas

Abolpour, A.H., Sariri, R., Vianello, F., Stevanato, R. (2013). Enzyme immobilization:
an update. J Chem Biol. 6,185-205.

Ashly, P.C., Joseph, M.J., Mohanan, P.V. (2011). Activity of diastase amylase
immobilized on polyanilines (PANIs). Food Chem. 127:1808-1813.
Ates, S., Dogan, N.S. (2010). Properties of immobilized phenylalanine ammonia lyase
and investigation of its use for the prediagnosis of phenylketonuria. Turk J Biochem.
35,58-62.

Basso, A., Serban, S. (2019). Industrial applications of immobilized enzymes-A review,

Molecular Catalysis, 479.

Betigeri, S.S., Neau, S.H. (2002). Immobilization of lipase using hydrophilic polymers
in the form of hydrogel beads. Biomaterials. 23, 3627-3636.

Bilal, M., Adeel, M., Rasheed, T., Zhao, Y., Iqbal, H.M. Emerging contaminants of high
concern and their enzyme-assisted biodegradation - A review. (2019). Environment
International, 124, 336-353.

Bryjak, J., Aniulyte, J., Liesiene, J. (2007). Evaluation of man-tailored cellulose-based

carriers in glucoamylase immobilization. Carbohyd Res. 342,1105-1109.

Burteau, N., Burton, S., and Crichton, R. R. (1989). Stabilization and immobilization of
penicillin amidase. FEBS Letters, 258, 185-189.

Cao, L. (2005). Introduction: Immobilized enzymes: Past, present and prospects.

Carrier-bound immobilized enzymes: principles, application and design, 1, 1-52.

Carmalin, S. A., Eder, C. L. (2018). Removal of emerging contaminants from the

environment by adsorption, Ecotoxicology and Environmental Safety.150,1-17.

Ceniceros, E. P. S., Ilyina, A., Esquivel, J. C. C., Menchaca, D. R., Espinoza, J. C. F.,
and Rodriguez, O. E. M. (2003). Entrapment of enzymes in natural polymer extracted
from residue of food industry: Preparation methods, partial characterization and
possible application. Becth Mock, 44, 84-87.

Chang, M.Y., Juang, R.S. (2007). Use of chitosan-clay composite as immobilization

support for improved activity and stability of b-glucosidase. Biochem Eng J. 35,93-
98.

Chang, Y.K., Chu, L. (2007). A simple method for cell disruption by immobilization of
lysozyme on the extrudate-shaped Na Y. zeolite. Biochem Eng J. 35,37-47.

Chapman, J., Ismail, A.E., Dinu, C.Z. (2018). Industrial Applications of Enzymes:
Recent Advances, Techniques, and Outlooks. Catalysts. 8, 238

Chen, S., Song, N., Liao, X., and Shi, B. (2011). Immobilization of catalase on ferric
modified collagen fibers. Chinese Journal of Biotechnology, 27, 1076-1081.

Chern, J.T., Chao, Y.P. (2005). Chitin-binding domain based immobilization of D-

hydantoinase. Journal Biotechnol. 117:267-275.
Coello, C. P., y Vélez, F. E. (2019). Inmovilización de la enzima lipasa en soporte de
quitosano para el tratamiento de agua con contenido de grasas y aceites de origen
animal. Universidad de Guayaquil. Facultad de Ingeniería Química.

Cordeiro, A. L., Lenk, T., and Werner, C. (2011). Immobilization of Bacillus

licheniformis α-amylase onto reactive polymer films. Journal of Biotechnology, 154,
216-221.

Daoud, F. B. O., Kaddour, S., and Sadoun, T. (2010). Adsorption of

cellulose Aspergillus niger on a commercial activated carbon: Kinetics and
equilibrium studies. Colloid Surface B Biointerfaces, 75, 93-99.

Darwesh, O.M., Matter, I.A., Eida, M.F. (2019). Development of Peroxidase Enzyme
Immobilized Magnetic Nanoparticles for Bioremediation of Textile Wastewater Dye,
Journal of Environmental Chemical Engineering, 7(1),102805

Datta, S., Christena, L. R., Rajaram, Y. R. S. (2013). Enzyme immobilization: an

overview on techniques and support materials. Biotech, 3(1), 1-9.

Dezott, M., Innocentini-Mei, L. H., and Durán, N. (1995). Silica immobilized enzyme
catalyzed removal of chlorolignins from eucalyptus kraft effluent. Journal of
Biotechnology, 43, 161-167.

Emregul, E., Sungur, S., Akbulut, U. (2006). Polyacrylamide-gelatin carrier system used
for invertase immobilization. Process Biochem. 38:27-30.

Erdemir, S., Yilmaz, M. (2011). Catalytic effect of calix[n]arene based sol-gel

encapsulate or covalent immobilized lipases on enantio selective hydrolysis of (R/S)-
naproxen methyl ester. J Incl Phenom Macrocycl Chem, 72(1),189-196.

Eskandarloo, H., & Abbaspourrad, A. (2018). Production of galacto-oligosaccharides

from whey permeate using β-galactosidase immobilized on functionalized glass
beads. Food chemistry, 251, 115-124.

Faber K. (2004). Biotransformations in Organic Chemistry, Springer- Verlag, Berlin,

5th edn,

Shakerian, F., Zhao, J., Li, S.P. (2020). Recent development in the application of
immobilized oxidative enzymes for bioremediation of hazardous micropollutants - A
review. Chemosphere,239,124716.

Fernández-Fernández, M. (2012). Recent developments and applications of immobilized

laccase, Biotechnol Advance, 31(8),1808-1825.
Flores-Maltos, A., Rodríguez-Durán, L.V., Renovato, J., Contreras, J.C., Rodríguez, R.,
Aguilar, C.N. (2011). Catalytical properties of free and immobilized Aspergillus
niger tannase. Enzyme Research, 2011.

Fu, J., Reinhold, J., and Woodbury, N. W. (2011). Peptide-modified surfaces for enzyme
immobilization. PLoS One, 6(4), e18692.

García-Martínez, J., y Perez-Pariente, J. (2002). Materiales zeolíticos: síntesis,

propiedades y aplicaciones. Editorial Universidad de Alicante, España

Gómez, L., Ramírez, H. L., Neira-Carrillo, A., and Villalonga, R. (2006).

Polyelectrolyte complex formation mediated immobilization of chitosan-invertase
neoglycoconjugate on pectin-coated chitin. Bioprocess and Biosystems Engineering,
28, 387-395.

González, D. V., Rivero, M. G., Venegas, I. M., Osorio, G. A., & Martínez, A.
2015.Caracterización del proceso de inmovilización de células de Aspergillus niger
sp en espuma de poliuretano para la producción de xilanasas. XVI Congreso
Biotecnología y Bioingeniería.

Gustafsson, H., Johansson, E. M., Barrabino, A., Odén, M., & Holmberg, K. (2012).
Immobilization of lipase from Mucor miehei and Rhizopus oryzae into mesoporous
silica-The effect of varied particle size and morphology. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 100, 22-30.

Haider T, Husain Q (2008). Concanavalin A layered calcium alginate-starch beads

immobilized b-galactosidase as a therapeutic agent for lactose intolerant patients. Int J
Pharm, 359:1-6.

Hartmann, M. & Kostrov, X. (2013). Immobilization of enzymes on porous silicas-

benefits and challenges. Chemical Society Review. 42, 6277-6289.

Hartmann, M., and Jung, D. (2010). Biocatalysis with enzymes immobilized on

mesoporous hosts: the status quo and future trends. Journal of Materials
Chemistry, 20(5), 844-857.

Hernández, A. D., (2019). Co-inmovilización de una xilanasa y celulasa en un soporte

magnético de quitosano para la obtención de oligosacáridos a partir de un desecho
agroindustrial. Repositorio Institucional Universidad Autonoma de Queretalo,
Facultad de Química. México. Disponible
en: http://ri-ng.uaq.mx/handle/123456789/1337

Huang, XJ., Chen, PC., Huang, F., Ou, Y., Chen, MR., Xu, ZK., (2011). Immobilization
of Candida rugosa lipase on electrospun cellulose nanofiber membrane. Journal Mol
Catal B-Enzym. 70,95-100.
Ispas, C., Sokolov, I., Andreescu, S., (2009) Enzyme-functionalized mesoporous silica
for bioanalytical applications. Anal bioanal Chem, 393:543-554

Jegannathan KR, Jun-Yee L, Chan ES, Ravindra P. (2010). Production of biodiesel from
palm oil using liquid core lipase encapsulated in j-carrageenan. Fuel, 89:2272-2277

Jung, D., Streb, C., & Hartmann, M. (2010). Covalent anchoring of chloroperoxidase
and glucose oxidase on the mesoporous molecular sieve SBA-15. International
Journal of Molecular Sciences, 11(2), 762-778.

Kamori, M., Hori, T., Yamashita, Y., Hirose, Y., Naoshima, Y. (2000). Immobilization
of lipase on a new inorganic ceramics support, toyonite, and the reactivity and
enantioselectivity of the immobilized lipase. Journal Mol Catal B-Enzym, 9, 269-274.

Karagulyan, H., K., Gasparyan, V., Kand., Decker, S. R. (2008). Immobilization of

fungal betaglucosidase on silica gel and kaolin carriers. Applied Biochemistry and
Biotechnology, 146,39-47.

Katwa, L. C., Ramakrishna, M., & Rao, M, R., R. (1981). Spectrophotometric assay of
immobilized tannase. Journal of Bioscience, 3, 135-142.

Kawaguti, H. Y., Buzzato, M. F., Orsi, D. C., Suzuki, G. T., & Sato, H. H. (2006).
Effect of the additives polyethylenimine and glutaraldehyde on the immobilization of
Erwinia sp. D12 cells in calcium alginate for isomaltulose production. Process
Biochemistry, 41(9), 2035-2040.

Klein, M.P., Scheeren, C.W., Lorenzoni, A.S.G., Dupont, J., Frazzon, J., Hertz, P.F.
(2011). Ionic liquid-cellulose film for enzyme immobilization. Process Biochem,
46,1375-1379

Krishna, K., Swain, Sunil Bhand. (2018). A Dual-Readout Magnetic Nanoparticle-Based

Enzyme Assay for the Sensitive Detection of Hg(II) Ions in Drinking Water. ACS
Earth and Space Chemistry. 2(12), 1312-1322.

Kumar, A. G., Perinbam, K., Kamatchi, P., Nagesh, N., & Sekaran, G. (2010). In situ
immobilization of acid protease on mesoporous activated carbon packed column for
the production of protein hydrolysates. Bioresource Technology, 101, 1377-1379.

Kumari, A., Kayastha, AM. (2011). Immobilization of soybean (Glycine max) ɑ-

amylase onto chitosan and amberlite MB-150 beads: optimization and
characterization. Journal Mol Catal B-Enzym 69,8-14

Labus, K., Turek, A., Liesiene, J., Bryjak, J. (2011) Efficient Agaricus bisporus
tyrosinase immobilization on cellulose-based carriers. Biochem Eng J, 56:232-240
Lei, J., Fan, J., Yu, C., Zhang, L., Jiang, S., Tu, B., & Zhao., D. (2004). Immobilization
of enzymes in mesoporous materials: controlling the entrance to nanospace.
Microporous and mesoporous materials, 73(3), 121-128.

Liese, K., Seelbach, and C., Wandrey, Wiley-VCH. (2001). Industrial

Biotransformations. By A.DM 198 (102 Eu). 425 pp. ISBN: 3-527-30094-5.

Liu, Y., Guo, C., Wang, F., Liu, C., Liu, H. (2008). Preparation of magnetic silica
nanoparticles and their application in laccase immobilization. The Chinece Journal of
process engineering, 8(3),583-588.

Min, Su., Hua, Sun., Yingying, Zhao., Aidang, Lu., Xiaohui, Cao., Jingkang, Wang.
(2016). Degradation Kinetics and Mechanism of a β-Lactam Antibiotic Intermediate,
6-Aminopenicillanic Acid, in a New Integrated Production Process, Journal of
Pharmaceutical Sciences, 105, (1), 139-146

Mishra, N., Pithawala, K., & Bahadur, A. (2011). Byssus thread: A novel support
material for urease immobilization. Applied Biochemistry and Biotechnology. 165,
1568-1576.

Mislovicova, D., Masarova, J., Vikartovska, A., Germeine,r P., Michalkova, E. (2004).
Biospecific immobilization of mannan-penicillin G acylase neoglycoenzyme on
Concanavalin A-bead cellulose. J Biotechnol. 110,11-19

Mitchell, S., Ramırez, J. P. (2011). Mesoporous zeolites as enzyme carriers: Synthesis,

characterization, and application in biocatalysis. Catalysis Today, 168, 28-37.

Mohammadikish, M., and Hashemi, S. H. (2019). Functionalization of magnetite-

chitosan nanocomposite with molybdenum complexes: new efficient catalysts for
epoxidation of olefins. Journal of Materials Science, 54(8), 6164-6173.

Mulinari, J., Oliveira, J. V., and Hotza, D. (2020). Lipase immobilization on ceramic
supports: An overview on techniques and materials. Biotechnology Advances,
107581.

Nair, N., Thakur, A., Agrawal, M., Thakur, J., Gupta, S., Sahu, B. and Kaushik, N.
(2018). Enzyme Immobilization: A Bridge of Understanding between Biotechnology
and Pharmacy. Research Journal of Pharmaceutical Dosage Forms and Technology,
10(2), 109-113.

Namdeo, M., Bajpai, SK. (2009) Immobilization of a-amylase onto cellulose-coated

magnetite (CCM) nanoparticles and preliminary starch degradation study. J Mol Catal
B-Enzym 59:134-139

Nelson, J., Griffin, E. G. (1916) Adsorption of invertase. Journal of the American

Chemical Society1, 38 (5), 1109-1115.
Petkova, G. A., Záruba, K., & Král, V. (2012). Synthesis of silica particles and their
application as supports for alcohol dehydrogenases and cofactor immobilizations:
conformational changes that lead to switch in enzyme stereoselectivity. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1824(6), 792-801.

Pontón, P. I., d’Almeida, J. R., Marinkovic, B. A., Savi_c, S. M., Mancic, L., Rey, N. A.
(2011). Mesoporous silica nanoparticles for bioadsorption, enzyme immobilization
and delivery carriers. Nanoscale, 3, 2801-2818.

Popat, A., Hartono, S. B., Stahr, F., Liu, J., Qiao, S. Z., & Lu, G. Q. M. (2011).
Mesoporous silica nanoparticles for bioadsorption, enzyme immobilization, and
delivery carriers. Nanoscale, 3(7), 2801-2818

Raman, J.K., Ting, V.F.W., Pogaku, R. (2011). Life cycle assessment of biodiesel
production using alkali, soluble and immobilized enzyme catalyst processes. Biomass
Bioenergy. 35, 4221-4229.

Ramani, K., Karthikeyan, S., Boopathy, R., Kennedy, L. J., Mandal, A. B., & Sekaran,
G. (2012). Surface functionalized mesoporous activated carbon for the immobilization
of acidic lipase and their application to hydrolysis of waste cooked oil: Isotherm and
kinetic studies. Process Biochemistry, 47(3), 435-
445. http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2011.11.025.

Ruiz, M.R., Pérez, É., Bernardos, A., Sancenón, F., Martínez, R.M., M , María. D.,
Barat, J.M. (2017). Enhanced antimicrobial activity of essential oil components
immobilized on silica particles, Food Chemistry, 42, 233.

Sahney, R., Puri, B. K., and Anand, S. (2005). Enzyme coated glass pH electrode: Its
fabrication and applications in the determination of urea in blood samples. Analytical
Chimica Acta, 542, 157-161.

Salis, A., Pisano, M., Monduzzi, M., Solinas, V., Sanjust, E. (2009). Laccase from
Pleurotus sajor-caju on functionalised SBA-15 mesoporous silica: immobilization and
use for the oxidation of phenolic compounds. J. Molec. Catal. B. 58,175-80.

Sardar, M., Roy, I., Gupta, M.N. (2000). Simultaneous purification and immobilization
of Aspergillus niger xylanase on the reversibly soluble polymer Eudragit (TM) L-100.
Enzyme Microb Tech. 27:672-679

Satar, R., Matto, M., and Husain, Q. (2008). Studies on calcium alginate-pectin gel
entrapped concanavalin A-bitter gourd (Momordica charantia) peroxidase complex.
Journal of Scientific and Industrial Research,67, 609-615.

Schlipf, D. M., Rankin, S. E., & Knutson, B. L. (2013). Pore-size dependent protein
adsorption and protection from proteolytic hydrolysis in tailored mesoporous silica
particles. ACS applied materials & interfaces, 5(20), 10111-10117.
Shen, Q., Yang, R., Hua, X., Ye, F., Zhang, W., Zhao, W. (2011). Gelatintemplated
biomimetic calcification for b-galactosidase immobilization. Process Biochem,
46:1565-1571.

Shinde, P., Musameh, M., Gao, Y., Robinson, A.J., Kyratzis, I. (2018). Immobilization
and stabilization of alcohol dehydrogenase on polyvinyl alcohol fibre, Biotechnology
Reports, 19

Sirisha, V. L., Jain, A., & Jain, A. (2016). Enzyme immobilization: an overview on
methods, support material, and applications of immobilized enzymes. In Advances in
food and nutrition research.79, 179-211. Academic Press.

Soleimani, M., Khani, A., and Najafzadeh, K. (2011). α-Amylase immobilization on the
silica nanoparticles for cleaning performance towards starch soils in laundry
detergents. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 74, 1-5.

Sörensen, M. H., Ng, J. B., Bergström, L., & Alberius, P. C. (2010). Improved
enzymatic activity of Thermomyces lanuginosus lipase immobilized in a hydrophobic
particulate mesoporous carrier. Journal of colloid and interface science, 343(1), 359-
365.

Spahn, C., Minteer, S.D. (2008). Enzyme immobilization in biotechnology. Recent Pat
Eng. 2,195-200

Stadlmair, L.F., Grosse, S., Letzel, T., Drewes, J.E., Grassmann, J. (2019).
Comprehensive MS-based screening and identification of pharmaceutical
transformation products formed during enzymatic conversion. Anal. Bioanal. Chem.
411, 339:351.

Stadlmair, L.F., Letzel, T., Drewes, J.E., Grassmann, J. (2018). Enzymes in removal of
pharmaceuticals from wastewater: a critical review of challenges, applications and
screening methods for their selection. Chemosphere. 205, 649:661.

Taghizadeh, T., Talebian-Kiakalaieh, A., Jahandar, H., Amin, M., Tarighi, S., and
Faramarzi, M. A. (2020). Biodegradation of bisphenol A by the immobilized laccase
on some synthesized and modified forms of zeolite Y. Journal of Hazardous
Materials, 386, 121950.

Wang, ZG., Wan, LS., Liu, ZM., Huang, XJ., Xu, ZK. (2009). Enzyme immobilization
on electrospun polymer nanofibers: an overview. Journal Mol Catal B-Enzym 56:189-
195.

Wang, Y., & Zheng, X.-H., & Zhao, M. (2008). Study of immobilization of laccase on
mesoporous molecular sieve MCM-41. Gao Xiao Hua Xue Gong Cheng Xue
Bao/Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 22, 83-87.
Wang, Y., and Caruso, F. (2005). Mesoporous silica spheres as supports for enzyme
immobilization and encapsulation. Chemistry of Materials, 17(5), 953-961.

Weinberger, S., Pellis, A., Comerford, J. W., Farmer, T. J., and Guebitz, G. M. (2018).
Efficient physisorption of Candida Antarctica Lipase B on Polypropylene Beads and
application for polyester synthesis. Catalysts, 8(9), 369.

Wen, H., Nallathambi, V., Chakraborty, D., Barton, S.C. (2011). Carbon fiber
microelectrodes modified with carbon nanotubes as a new support for immobilization
of glucose oxidase. Microchim Acta 175, 283-289

Xiangli, Q., Zhe, L., Yinglin, Z., Zhengjia, Z. (2010). Immobilization of activated
sludge in poly (ethylene glycol) byUVtechnology and its application inmicro-polluted
wastewater. BiochemEng J. 50,71-76

Xing, G.W., Li, X.W., Tian, G.L., Ye, Y.H. (2000). Enzymatic peptide synthesis in
organic solvent with different zeolites as immobilization matrices. Tetrahedron. 56,
3517-3522.

Xu, Y., Zhou, G. W., Wu, C. C., Li, T. D., and Song, H. B. (2011). Improving
adsorption and activation of the lipase immobilized in amino-functionalized ordered
mesoporous SBA-15. Solid state sciences, 13(5), 867-874.

Yiu, H. H., and Wright, P. A. (2005). Enzymes supported on ordered mesoporous solids:
a special case of an inorganic-organic hybrid. Journal of Materials Chemistry, 15(35-
36), 3690-3700.

Zhang, C., Kang, X., Liang, N., and Abdullah, A. (2017). Improvement of biohydrogen
production from dark fermentation by cocultures and activated carbon
immobilization. Energy and Fuels, 31(11), 12217-12222.

Zhang, J., Wang, L., Zhang, B., Zhao, H., Kolb, U., Zhu, Y and Su, D. S. (2018). Sinter-
resistant metal nanoparticle catalysts achieved by immobilization within zeolite
crystals via seed-directed growth. Nature Catalysis, 1(7), 540-546.

Zhou, G., Chen, Y., and Yang, S. (2009). Comparative studies on catalytic properties of
immobilized Candida rugosa lipase in ordered mesoporous rod-like silica and vesicle-
like silica. Microporous and mesoporous materials, 119, (1-3), 223-229.

Zhou, Z., and Hartmann, M. (2012). Recent progress in biocatalysis with enzymes
immobilized on mesoporous hosts. Topics in Catalysis, 55(16-18), 1081-1100.

Zhu, Y., Kaskel, S., Shi, J., Wage, T., and Karl-Heinz, van Pée. (2007). Immobilization
of Trametes versicolor laccase on magnetically separable mesoporous milica spheres.
Chem. Mater. 19 (26).
Notas de autor

*Email:rosaibis@imre.uh.cu

https://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art96/
Introducción
Las enzimas son proteínas especializadas capaces de acelerar la velocidad de una reacción
química, promoviendo así la transformación de diferentes moléculas en productos específicos. La
alta especificidad con la que se llevan a cabo dichas transformaciones, el volumen reducido de
desechos que generan dichos procesos y las condiciones poco agresivas en las que se operan,
han permitido que estos biocatalizadores se posicionen como elementos preponderantes en
diversos sectores industriales. En efecto, se considera que en aquellos sectores industriales en
donde está involucrada al menos una reacción química, existe la posibilidad de integrar una enzima
al proceso de transformación.
Las enzimas son proteínas
especializadas capaces de
acelerar la velocidad de una
reacción química, promoviendo
así la transformación de
diferentes moléculas en
productos específicos.

No obstante que las enzimas se han utilizado desde hace varios siglos en industrias como la
cervecera, láctea, de panificación o peletera, es hasta finales del siglo XIX y principios del XX que
se establece su naturaleza o mecanismo de acción. De hecho, aun cuando la compañía Röhm
(Alemania) utilizó por primera vez en 1914 la enzima tripsina en la industria de detergentes, la
naturaleza proteica de las enzimas fue probada hasta 1926 por Sumner. Más aún, se considera
que su producción por fermentación a gran escala la inició formalmente la compañía Novo Industri
(actualmente Novozymes) en la primera parte de los años sesenta, al producir una glucoamilasa
útil en la transformación de almidón en glucosa.

Es indiscutible el interés que ha despertado durante las últimas décadas el uso de estos exquisitos
catalizadores en diferentes procesos industriales. En gran medida, gracias a los grandes avances
que ha tenido la biotecnología en áreas como la microbiología industrial, la biología molecular, la
ingeniería de proteínas y la ingeniería enzimática. Estas técnicas han centrado su atención en la
producción eficiente de biocatalizadores que al mismo tiempo que conserven su alta quimio-, regio-
y estereoselectividad, mejoren su estabilidad, puedan ser reutilizadas y sean compatibles con
tecnologías sustentables y procesos ambientalmente más limpios.

En este sentido, es apartir de los años ochenta que se desarrollan nuevas herramientas
fermentativas para la producción y comercialización de enzimas a gran escala, dando lugar a una
industria de las enzimas con valores netos de comercialización en el orden de los miles de millones
de dólares (POLANA y MACCABE, 2007). Al mismo tiempo, mediante las técnicas del ADN
recombinante, se establecen las estrategias necesarias para expresar de manera heteróloga
enzimas de diferentes orígenes (animal, vegetal o microbiano) en organismos huéspedes y
aumentar de manera significativa las concentraciones de enzima en los cultivos (AEHLE, 2007).
Actualmente, con el desarrollo de áreas como la genómica y la proteómica y de herramientas útiles
para el análisis y la manipulación de la estructura de proteínas, es posible no solamente tener
acceso a un extenso universo de nuevas actividades enzimáticas de diferente origen, sino también
manipular, diseñar y mejorar las actividades enzimáticas nuevas y tradicionales.

Las enzimas en solución generalmente son utilizadas una sola vez debido a la dificultad que
representa su recuperación al término de una reacción. Esta limitante las convierte a las enzimas
en un gasto fijo e impacta directamente el costo total del proceso. Ante este panorama, una de las
grandes preguntas planteadas a lo largo del desarrollo de la enzimología industrial ha sido ¿Las
enzimas se pueden reutilizar eficientemente? Es claro que un biocatalizador no soluble que sea
fácil de recuperar, no pierda su efectividad, se pueda reutilizar y/o permita su operación en
procesos continuos a escala industrial impactará de manera positiva la economía de un proceso.

En este sentido, un gran avance en la consolidación del uso de enzimas a escala industrial se debe
en gran medida al desarrollo de métodos eficientes de inmovilización de enzimas, es decir,
enzimas unidas física- o químicamente a un soporte inerte lo cual permite su fácil recuperación y
reutilización (Figura 1).
 Figura 1. Métodos generales de inmovilización de enzimas.

Si bien desde principios del siglo XX se realizaron esfuerzos para el desarrollo de métodos que
permitieran la reutilización de los biocatalizadores, no es sino hasta los años sesenta que los
primeros procesos con enzimas inmovilizadas fueron escalados a nivel industrial, permitiendo su
reutilización en diferentes ciclos de proceso. Así, en 1969 la compañía japonesa Tanabe-Seiyaku
reportó la producción industrial de L-aminoácidos mediante el uso de un reactor enzimático con L-
aminoacilasa inmovilizada, y las compañías Bayer AG (Alemania) y Beecham Pharmaceuticals
(Inglaterra) reportan el uso de la enzima penicilino G acilasa inmovilizada para la producción de
precursores de penicilinas semisintéticas (POULSEN, 2003). Es importante mencionar que desde
principios de los años setenta, el proceso para la obtención de jarabes de alta fructosa a partir de
almidón de maíz se coloca entre los procesos enzimáticos con los mas altos volúmenes de
producción, y que la viabilidad económica de este proceso se debe en gran medida al uso de la
enzima glucosa isomerasa inmovilizada (Figura 2) (POULSEN, 2003).

Figura 2. Proceso para la obtención de jarabes de alta fructosa a partir de almidón de maíz utilizando glucosa

isomerasa inmovilizada como catalizador. Adaptado de Renneberg R. (2008).

El desarrollo de procesos industriales utilizando enzimas inmovilizadas se ha incrementado de

manera sustancial en las últimas décadas. Esto se debe a que no sólo se ha comprobado que la
inmovilización de las enzimas permite reciclar el catalizador, sino que, además, la inmovilización
contribuye de manera importante a incrementar la estabilidad operacional biocatalizador, permite
un diseño más racional del reactor y en algunos casos, a mejorar incluso su eficiencia catalítica.

La alta selectividad con la que las enzimas participan en diferentes procesos de transformación
química y las condiciones suaves de reacción en las que se operan dichos procesos industriales,
traen en consecuencia un ahorro energético y económico. En los últimos años, el uso de las
enzimas a nivel industrial ha impactado en sectores estratégicos tales como el de la química fina o
el de los biocarburantes. De hecho, esta participación industrial ha contribuido al desarrollo de
nuevas áreas de investigación en biotecnología tales como el de la biotecnología verde y el de la
biotecnología blanca.
La alta selectividad con la que las
enzimas participan en diferentes
procesos de transformación
química y las condiciones suaves
de reacción en las que se operan
dichos procesos industriales,
traen en consecuencia un ahorro
energético y económico.

La primera está asociada principalmente al desarrollo de procesos ecológicamente sustentables,

tales como la producción de biocarburantes, donde el impacto ambiental y el uso de recursos
renovables juegan un papel preponderante. La segunda, dedicada al desarrollo y optimización de
procesos industriales en donde el uso de organismos vivos o del material derivado de ellos (i.e.
enzimas) permite remplazar tecnologías contaminantes por otras más limpias o amigables con el
medio ambiente, tal es el caso del uso de enzimas en procesos de síntesis química (DASILVA,
2004).

Desde un punto de vista del mercado y de la disponibilidad de enzimas industriales, las compañías
Novozymes (Dinamarca) y DuPont (USA), a través de sus filiales Danisco/Genencor, dominan el
mercado de las enzimas con casi el 75% de las ventas globales. Con volúmenes de ventas
menores, pero con una participación importante en el sector se encuentran las compañías
alemanas BASF y Henkel, la holandesa DSM, así como las japonesas Amano y Ajinomoto. En la
actualidad (2013), se calcula que el mercado global de las enzimas es de alrededor de 4.5 billones
de dólares y se espera que crezca para el 2020 a un ritmo del 8.3% y alcance cifras de más de 7.5
billones de dólares (GRAND VIEW RESEARCH, 2014). Dentro de este mercado se estima que las
enzimas destinadas al procesamiento de alimentos y bebidas captan alrededor de 40% del
mercado global y que dentro de este sector al menos 45% están destinadas a la modificación de
carbohidratos, particularmente, aquellas destinadas a la transformación de almidones. En segundo
lugar, se calcula que la industria de los detergentes capta alrededor del 30% del mercado, la
industria textil y la industria del papel entre del 12 y el 10% del mercado respectivamente y el resto
del mercado se divide en aplicaciones diversas para industria química, farmacéutica y biológica.

Presentación del tema: "INMOVILIZACION Y

ESTABILIZACION DE ENZIMAS INDUSTRIALES"—
Transcripción de la presentación:

1 INMOVILIZACION Y ESTABILIZACION DE ENZIMAS INDUSTRIALES

2 1 LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES EN LA INDUSTRIA QUIMICA
Industria
QuímicaEnzimasEnzimas paraLa industriaQuímicaMODIFICACIÓN y MEJORA
DE SUS PROPIEDADESCIENCIAS DELA BIOTECNOLOGIA E INGENIERIA
ENZIMATICA1

3 INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Enzima solubleEnzima inmovilizadaS + ERe-uso ó uso continuoMejor
control de la reacciónProceso mas sencillo y mas limpioEnzima-electrodo2

4 BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA DE SUPERFICIES

+ ESoporte+Conservar o aumentarla actividadMejorar la estabilidadMejorar
la selectividad5

5 3 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS

DE INMOVILIZACIÓN Y POST-INMOVILIZACIONMejorar notablementelas
propiedades del biocatalizadorCual es la región que participa en la
inmovilizaciónCuantos residuos participan en la inmovilizaciónUtilización de
brazos espaciadoresModificación química adicionalModificación física
adicional3

6 INGENIERIA DE ENZIMAS INDUSTRIALES ALTERACION DE

ESPECIFICIDAD
ESTABILIZACIONREACTIVACIONHIPERACTIVACIONALTERACION DE
ESPECIFICIDAD

7 6 ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACION DE ENZIMAS POR

INMOVILIZACION
COVALENTE MULTIPUNTUALMuchos residuos de la enzimaBrazos
espaciadores muy cortosSoporte rígidoPosiciones relativas invariables
durante cualquier cambio conformacionalinducido por cualquier agente
distorsionarteESTABILIZACION 3D6COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE
INMOVILIZACIONES??

8 LA MORFOLOGIA DEL SOPORTE

7

9 LOS BRAZOS ESPACIADORES

+ - + 9

10 LOS RESIDUOS Y LA REGION

- NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación)..Los grupos amino:
un amino terminal muy reactivoy numerosos residuos lisina poco
reactivosLa región : a.- el amino mas reactivob.- las mas ricas en grupos
amino8

11 INMOVILIZACION DE ENZIMAS A TRAVES DE SUS GRUPOS AMINO

H2NNH3+INMOVILIZACION DE ENZIMASA TRAVES DE SUS GRUPOS
AMINOH2NR’ +H2NR C O H OCH2+H2NR

12 LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS

Y SOPORTES GLIOXILNH2NH2H2NpH (NO)pH (NO)NH2H2NRegiones muy
ricasen grupos aminospH (SI)10

13 61 Orientacion correcta: regiones muy ricas en aminos

No inmoviliza soportes muy activados a pH 7.0No inmoviliza soportes poco
activados a pH 10.0Inmovilizacion muy rapida sobre soportes muy activados
a pH 10.0Inmovilizacion muy rapida de tripsina (autolisada) sobre
soportesmuy activados a pH 7.0Efecto espectacular de la concentracion de
grupos activossobre la velocidad inmovilizaciónEfecto espectacular de la
temperatura sobre lavelocidad de inmovilizaciónEstabilización muy elevada
de todas las enzimas evaluadasglioxil muy diferente de BrCN,
glutaraldehido…61

14 EL PROCESO DE MULTI-INTERACCIÓN ENZIMA - SOPORTE

Tiempo hasta 72 horas después del final de la primera
inmovilizaciónTemperatura (25 ºC >>> 4 ºC)11

15 PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION ENZIMA-SOPORTE

NaBH41mg/ml12

16 LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO

Muy estables y muy cercanos al soporte rígidoReacción unipuntual
reversible con grupos aminoa.- orientación adecuada para inmovilización
multipuntualb.- multi-interacción no distorsionarteAusencia de
impedimentos estéricos..NH2Modificación química mínima+Soportes
completamente inertes e hidrofílicos13

17 14 alta densidad superficial de grupos glioxil, µEq. / m2

SOPORTES GLIOXIL PARA LA ESTABILIZACION DE ENZIMASalta densidad
superficial de grupos glioxil, µEq. / m2Soportes formados por grandes
superficies con un elevado grado de activaciónBrazos espaciadores muy
pequeñosLa enzima se inmoviliza siempre por regiones muy ricas en
NH2Los grupos glioxil son muy estables y no tienen impedimentos
estéricosdurante la multi-interacciónLa modificación química de la enzima
es mínima14
18 16 >>> << ENZIMAS ESTABILIZADAS
POR INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL SOBRE SOPORTES
GLIOXILENZIMAACTIVIDADESTABILIZACIONTripsinaQuimotripsinaPenicilin
a G acilasa de E. ColiPenicilina G acilasa de K. citrophilaFerredoxina NADP
reductasa de AnabaenaLipasa de C. rugosaGlutamato racemasaEsterasa de
B. stearothermofilusTermolisina de B.
thermoproteolyticus75%70%60%50%100%10.00060.0008.0007.0001.000150
100>>>estable<<16

19 18 Descenso del 50% en residuos lisina

UNION MULTIPUNTUAL TRIPSINA (AMIN0)- 6% AGAROSA
(GLIOXIL)Descenso del 50% en residuos lisinauna media de 7 enlaces por
molécula de tripsinaHIDRÓLISIS DE BAEERIGIDEZACTIVIDAD %ACTIVIDAD,
%20 40 60 80 501001502002 4 6 8 50100ETANOL, %UREA, MDERIVADO
UNIPUNTUALDERIVADO MULTIPUNTUALESTABILIZACIONESTABILIZACIÓN
TERMICA=ACIVIDAD INTRINSECA = 75%18

20 15 ESTABILIZACIÓN DE Ferredoxin NADP reductasa

POR UNION COVALENTE MULTIPUNTUALcondiciones experimentalespH 7.0
, 60ºCpH 10.0 , 30ºCpH 5.0, ºCpH 7.0 , 25 ºC, 50 % etanolpH 7.0 , 25ºC, etil
acetatoEstabilización6002002000500Estabilidadcomparada con el derivado
unipuntual15

21 17 INMOVILZIACION DE ENZIMAS SOBRE

GELES GLIOXIL Y SOBRE OTROS SOPORTES
CONVENCIONALESinactivacionde derivados de PGAinactivacion de
derivados delipasa de c.
antarcticaglioxilglioxilglutaraldehidobromocianogeno17

22 19 ESTABILIZACION DE ENZIMAS POR INMOVILIZACION COVALENTE

MULTIPUNTUAL
SOBRE SOPORTES GLIOXILActividad – estabilidad excelentepara
muchísimas enzimas y todas las condicionesLos mejores resultados
reportados en la literaturaProtocolos de inmovilización muy
sencillosProblema académico árido y multidisciplinarNo se puede “ver” lo
que ocurre19

23 62 REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

DESPUES DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTESpH 7.0, 25ºC90%
dioxanoagua ??Estructura primaria intactaPuentes disulfuro intactosUnión
covalente multipuntualSuperficie del soporte inerte (-OH)62

24 REACTIVACION RAPIDA Y COMPLETA

replegamientopH 7.025ºCaguadesplegamientoUreaguanidinaDisolventesUso
industrial64
25 Medio acuoso 8M Guanidina
REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS - ESTABILIZADASDESPUES
DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTEQT EN 90 % DIOXANOMedio
acuosoActividad residual, (%)8M GuanidinaTiempo (dias)inactivación
totalreactivación 24 h.reactivación 30 min.desplegamiento- replegamiento

26 20 ESTABILIZACION DE ENZIMAS MULTIMERICAS

IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADESENTRECRUZAMIENTO CON
POLIMEROS POLIFUNCIONALES(poli aldehídos)20

27 21 INACTIVACION -aminoácido ester hidrolasa Actividad residual,(%)

Tiempo, (horas)5mM de fosfato sódico pH 6,5; 25ºCConcentración de
proteína 5g / ml21

28 36 REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMERICAS

ESTABILIZADAS EN CONDICIONES DISOCIANTES36

29 37 EFECTO DE LA ESTABILIDAD DEL DERIVADO EN LA REACCION

DE SINTESIS DE AMPICILINA CATALIZADA POR-aminoacidoester
hidrolasaRendimientos de síntesis de
ampiccilinaóptimaestándar“óptima”37tiempo, minCondiciones estandar: 25
mM fosfato pH6,5; 4ºCCondiciones óptimas: 40% metanol pH 6,5 4ºC;
ausencia de fosfato

30 23 Polietilenimina + dextrano sulfato  poli [ NH4 (SO4)2]

ESTABILIZACION DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTESGENERACION DE
MICROAMBIENTES HIPERHIDROFILICOSNH3+Enzima mas rígidaMenor
concentración de disolventeen el micro-entorno de la
enzimaSO4=Polietilenimina + dextrano sulfato  poli [ NH4 (SO4)2]23

31 INACTIVACION DE PGA INMOVILIZADA POR DISOLVENTES ORGANICOS

25 50 751002004006008001000Actividad residual, (%)Tiempo (horas)95%
dixano, pH 7, 25ºC24

32 UTILIZACION DE DEXTRANOS COMO BRAZOS ESPACIADORES

OH HOenzima casi-idéntica a la enzima solubleningún efecto “negativo” de
la proximidad de lasuperficie del soportea.- enzimas sobre substratos
macromolecularesb.- cromatografía de afinidad proteína - proteínac.-
proteómica (proteína-proteína, proteína-ADN..)22

33 25 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS DE

INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACIONOrientación // rigidez // brazo
espaciador // modificaciones post-inmovilización+ 25
34 43 PURIFICACION DE GUANIDINO BENZOATASA POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD SOBRELIGANDOS CON CARGA
POSITIVA+ + - + + - + + - + + - + +Intercambio iónicode numerosas
proteínasImpedimentos estéricos parala afinidad de la proteína
“diana”Cromatografíade afinidadselectiva y eficienteMuy baja densidad de
ligandosBrazos espaciadores+Interacción fármacos yBiomacromoleculas43

35 PROCESOS RELACIONADOS: BIOTECNOLOGIA DE SUPERFICIES

Anticuerpos (orientaciones correctas)Sondas de ADN (alteración
nula)Polisacáridos (alteración mínima)Placas multipocilloPartículas
magnéticasPorta-muestras para “chips de ADN”DiagnosticoAnálisis
alimentosAnálisis de agua49

36 39 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS

DE INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACIONResultados
espectaculares(estabilidad, actividad, selectividad)Protocolos
experimentales muy sencillosIngeniería multidisciplinar:biotecnología de
superficies + polímerosLos cambios estructurales “no se pueden ver”Avance
un “poco árido”sobre una serie de evidencias experimentales...39

37 53 Microbiología y biología molecular

Química orgánicaINGENIERIA DE LA ENZIMAPurificación, inmovilización,
estabilización, hiperactivación,mejora de la selectividad,
reactivaciónActividadbiocatalizadorEstabilidadbiocatalizadorIngenieríade
lareacciónenzimáticaSolubilidadsubstratos
yproductosSelectividadbiocatalizadorpHtemperaturacodisolventesRendimie
ntossíntesis/hidrólisisMedioambienteEstabilidad desubstratos53

38 Ingeniería de la reacción Ingeniería del reactor

BIOTECNOLOGIA ENZIMATICABúsquedas deNuevos enzimasMejora de
enzimasexistentesInmovilizaciónpurificaciónestabilizaciónIngeniería de la
reacciónIngeniería del reactorAnálisis, alimentos, química orgánica, medio
ambiente,…PROCESOS INDUSTRIALES CATALIZADOS POR ENZIMAS

39 Biotecnología enzimática
MultidisciplinaridadEnfoque integradoMicrobiologíaBiología
MolecularCiencia de MaterialesQuímica de
ProteínasBioquímicaBiofísicaQuímica analíticaQuímica orgánicaIngeniería
químicaBiotecnología de SuperficiesPROCESO QUIMICO
INDUSTRIALCATALIZADO POR ENZIMAS

40 IMPLANTACION DE ENZIMAS COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES

Mejora deenzimaspormétodosbiológicosMejora deEnzimasportécnicas
deinmovilizaciónypost-inmovilizacióningenieríade lareaccióny delreactor
41 MEJORA DE LAS PROPIEDADES DE UNA ENZIMA INDUSTRIAL
NATURALEZASeres vivosADN ambientalextremófilosMutagénesisal
azarMutagénesisdirigida- más sencillas- más efectivasInmovilización+Post-
inmovilizaciónPROCESO QUIMICO CATALIZADO POR UN ENZIMA

Aquí: https://slideplayer.es/slide/13443547/

Otro

Inmovilización de enzimas

Esquema de un biorreactor de membrana con lipasas inmovilizadas en la membrana

Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos industriales

para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o alimentarios se ha recurrido al
uso de enzimas. Éstas presentan grandes ventajas sobre catalizadores no biológicos,
entre ellas gran actividad catalítica, a temperatura ambiente y presión atmosférica, y gran
especificidad de sustrato.

La inestabilidad que presentan en los procesos químicos industriales y la dificultad de

poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas
no se puedan reutilizar. Como alternativa se ideó el método de inmovilizarlas a un soporte
inerte para hacer factible que un proceso biotecnológico sea rentable.
 Reactores enzimáticos que utilizan enzimas inmovilizadas

Se denomina una “enzima inmovilizada” aquella que está físicamente localizada en una
región definida del espacio, manteniendo su actividad catalítica y pudiendo ser usada
repetida y continuamente.

Las ventajas del proceso: a) aumento de la estabilidad b) reutilización de los componentes

c) la enzima no permanece en la solución al finalizar el tratamiento y d) diseño de
reactores adaptables para cada enzima inmovilizada, permitiendo un reciclado de
producto que aumente su pureza. Básicamente un reactor comprende un recipiente o
tanque con agitación con las enzimas inmovilizadas, una vía de entrada para sustrato y
otra de salida para el producto.

Las desventajas a) alteración de la enzima respecto de su estado nativo b)

heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas proteínas
inmovilizadas c) pérdida de actividad d) el sistema puede ser más caro que la enzima
nativa.

Según se observa en el gráfico los métodos de inmovilización se pueden clasificar en 2

grandes categorías: retención física y unión química.
Retención física

Atrapamiento: Es la retención de la enzima en cavidades interiores de una matriz sólida

porosa constituida por prepolímeros entrecruzables o polímeros de tipo poliacrilamida,
colágeno, carraginato o resinas de poliuretano. Una suspensión de la enzima a inmovilizar
se la incluye en una solución del monómero. Se inicia la polimerización con cambio de
temperatura o adición de reactivo químico. El atrapamiento pueden ser en geles o en
fibras, más resistentes éstas últimas. No hay alteración estructural de la enzima pero hay
que vigilar el proceso de polimerización.

Inclusión en membranas

Microencapsulación: las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que

permiten el paso de sustratos y productos. Las microcápsulas tienen diámetros de 1 a
100 μm permitiendo encapsular enzimas, otro tipo de biomoléculas y células.

Reactores de membrana: se emplean membranas permeables al producto final,

permeables o no al sustrato y no permeables a la enzima. Mediante una bomba se
establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa al reactor. La enzima se adsorbe
previamente sobre la membrana.

Métodos de inmovilización de enzimas mediante retención física

Unión química

Unión a soportes: son los más utilizados y de los que se tiene mayor información. Se han
utilizado gran variedad de soportes. Estos deben cumplir ciertas normas para ser
empleados: aumentar la interacción con el sustrato, disminuir la inhibición por producto,
cambiar el pH aparente óptimo hasta el valor deseado, frenar el crecimiento microbiano y
ser fácilmente recuperable para su reutilización. Deberá ser estable en solución y rígido
mecánicamente en procesos de flujo continuo. Cuando la enzima inmovilizada se utilice
en aplicaciones médicas no deberá provocar reacciones inmunes o de coagulación.
Los soportes pueden ser a) inorgánicos naturales (arcilla, bentonita, piedra pómez) o
inorgánicos manufacturados (óxido de metales, vidrios de tamaño de poro controlado,
cerámicas) y b) orgánicos naturales (polisacáridos o proteínas fibrosas) o sintéticos
(poliolefinas, polímeros acrílicos, poliamidas).

Las enzimas se pueden unir por adsorción, unión iónica, metálica o por unión covalente.

Adsorción: la enzima se une por fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofóbicas y
por puentes de hidrógeno. Se deben controlar pH del medio, fuerza iónica y diámetro del
poro. Tiene la ventaja de la preparación sencilla, bajo costo, no cambia la especificidad
enzimática y los derivados son estables con baja humedad. Desventajas: unión débil al
soporte (afectadas por concentraciones elevadas de sustrato, cambios de pH y de fuerza
iónica) y poco estables mecánicamente.

Unión iónica: se utilizan intercambiadores orgánicos de iones (DEAE, CM, etc) e

inorgánicos (sílice). Tiene las mismas desventajas que el método anterior.

Quelación o unión metálica: utiliza metales de transición, normalmente titanio, como una
forma de activar la superficie del soporte. La enzima se acopla a este soporte.

Unión covalente: es el método de inmovilización más utilizado en la industria. El

procedimiento de inmovilización consiste en 1) la activación de los grupos químicos del
soporte 2) los grupos activados de los soportes reaccionan con aminoácidos de la enzima
con la formación de enlaces peptídicos, de arilación, de alquilación, de formación de
enlace diazo, base de Schiff o de intercambio tiol-disulfuro. Los aminoácidos de las
proteínas más empleados para la formación de enlaces con el soporte son Lys, CysSH,
Tyr, Trp.

Ventajas: al tener su estructura terciaria estabilizada poseen mayor resistencia a la

inactivación.

Desventajas: se puede alterar el sitio activo. Se usan bloqueadores del sitio activo y luego
se procede a la inmovilización.
Reticulado: también denominado entrecruzamiento o cross-linking. Utiliza reactivos
bifuncionales (dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bis diazonio) que
originan uniones intermoleculares irreversibles entre las moléculas de enzima, insolubles
en agua pero que no necesitan el uso de soportes adicionales. Son capaces de resistir
condiciones extremas de pH y temperatura.

El co-reticulado es el entrecruzamiento de la enzima con proteínas sin actividad

enzimática, ricas en Lys (albúmina bovina). Impide la pérdida de actividad por efectos de
difusión del sustrato.

Uno de los métodos más novedosos en entrecruzamiento consiste en la cristalizacion de

enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído. La propia enzima actúa como su
soporte. Estos cristales soportan altas temperaturas, pHs extremos y la acción de
proteasas.

Métodos de inmovilización de enzimas mediante unión química

Efectos de la inmovilización de enzimas

La inmovilización altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente se incrementa

la estabilidad conformacional de las mismas (métodos de uniones de tipo covalente y aun
más, con la adición de grupos bifuncionales), se aumenta la protección frente a proteasas
y se evita la agregación intermolecular. Se produce una alteración del microentorno de la
enzima debido a su interacción con el soporte, haciendo por ejemplo que enzimas
sensibles al oxígeno, como nitrogenasas ó hidrogenasas, vean favorecida su actividad
cuando están inmovilizadas, debido a que la fuerza iónica que tiene el entorno disminuye
la concentración efectiva de oxígeno en el medio.

Fuente: Arroyo, Miguel. Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones.

1998. Ars. Pharmaceutica. 39:2.

Publicado 14th September 2014 por cneyoysiari2046

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