Taller Ingeniería Genética.g

TALLER INGENIERÍA GENÉTICA (ADN Y PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y SU APLICACIÓN
EN LA AGROINDUSTRIA)
PRESENTADO POR:
YENCY PATRICIA MUÑOZ CHACÓN
YASMIN CASTRO SOLANO
ALISSON DANIELA PEREZ
PRESENTADO A:
RICARDO CAMACHO MUÑOZ
UNIVERSIDAD DEL CAUCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
BIOTECNOLOGÍA
POPAYÁN – CAUCA, 2022

1. Que son las enzimas de restricción, como es su mecanismo de acción, cuál
es su función principal en la biología de los organismos y cuáles son sus
aplicaciones en biotecnología.
RTA//: Las enzimas de restricción son enzimas que reconocen y cortan las
moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas específicas (Klug y col., 2006).
Aunque estas enzimas desempeñan una función propia en las células procariotas
en las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo
experimental en varias áreas de la biología molecular, de interés tanto básico
como aplicado al diagnóstico clínico; en especial, se utilizan en el proceso de
clonación molecular del DNA. Además, tienen aplicación en otras técnicas como la
secuenciación del genoma y el estudio de los polimorfismos (Luque y Herráez,
2002).
Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes).
Reconocen secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se
unen a ellas. Cada enzima de restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de
restricción. Cuando encuentra su secuencia blanco, la enzima de restricción
cortará las dos cadenas de una molécula de ADN. Por lo general, el corte es en o
cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y predecible.
Las enzimas de restricción son una herramienta básica en Biología molecular: en
laboratorios de PCR, creación de sondas para hibridación, laboratorios de
secuenciación de ADN, ingeniería genética, procesos de clonación, manejo de
genotecas y en muchas otras áreas de genómica.
2. Suponga que el gen del punto anterior fue aislado con éxito y se incluye en
la siguiente secuencia. Indique que fragmentos son obtenidos al digerir el
gen con las enzimas de restricción descritas
ATCAGGCTGCAGCCGGCCGCTCGCTCTGTTCGGCCGTCAACTGAAGCTTTTCGCCC
GCATAGTAGGCCCGCACCTTGGGGTCGACCGCCCGCCACAGCGGCGGGATCAGCG
CCAGCACCACCATCCCGGCATAAGCTTGCTGGGCATCTGCGGGCTATCGTCACTGCA
GCGGAAATCTTCTGATAGGGGCGTTTGGCGCATGCATGATGGTCGGAATGCCGTTGC
AGATGGAACAGGACCAAGCTTGGTGAAGACGAAGTTGCTGTTCCAAACATA
a) SphI
b) HindIII
c) PstI
RTA//:
A. SphI 5’ G’CATGC
ATCAGGCTGCAGCCGGCCGCTCGCTCTGTTCGGCCGTCAACTGAAGCTTTTCGCCCGCATAGTAGG
CCCGCACCTTGGGGTCGACCGCCCGCCACAGCGGCGGGATCAGCGCCAGCACCACCATCCCGGCA
TAAGCTTGCTGGGCATCTGCGGGCTATCGTCACTGCAGCGGAAATCTTCTGATAGGGGCGTTTGG
CGCATGCATGATGGTCGGAATGCCGTTGCAGATGGAACAGGACCAAGCTTGGTGAAGACGAAGT
TGCTGTTCCAAACATA
B. HindIII 5’ A’AGCTT
TGCTGTTCCAAACATA
C. PstI 5’ CTGCA^G
TGCTGTTCCAAACATA
3. A que hacen referencia los términos: Clonación, Transformación,

Transfección y Transducción.
RTA//: La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un

fragmento de ADN denominado inserto dentro de una molécula de ADN
denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente
del genoma de la célula hospedera. El resultado es la obtención de millones de
copias de una molécula recombinante o clona molecular compuesta por ADN
proveniente del inserto y del vector.
Transformación se refiere a la introducción de material genético a través de
vectores a las bacterias
Transducción describe la introducción del ácido nucleico exógeno en una célula

por medio de un vector viral, y el término
Transfección implica la introducción del material genético en las células

empleando agentes químicos o físicos.
4. Que el ADN recombinante
RTA//: El ADN recombinante (rADN) es una tecnología que utiliza enzimas para
cortar y unir secuencias de ADN de interés. Las secuencias de ADN recombinado
se pueden colocar en unos vehículos llamados vectores que transportan el ADN
hacia el lugar adecuado de la célula huésped donde puede ser copiado o
expresado.
La introducción del ADN recombinante tiene como propósito la transformación

celular, es decir, que el material genético se incorpore de manera
extracromosómica y se replique, transcriba y traduzca empleando la maquinaria
enzimática de la célula huésped.
5. Que es un vector de clonación y/o expresión que tipos puede identificar.
RTA//: Los vectores son de clonación si su finalidad es el almacenamiento de

secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN insertado o de la
molécula recombinante.
Los vectores de clonación suelen ser plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y
cromosomas artificiales bacterianos o de levadura.
Los vectores de expresión: son aquellos cuyo objetivo es producir un transcrito

(ARN) o la proteína producto de ese transcrito. Los vectores de expresión pueden
ser plásmidos o fagos.
Vector de clonación y expresión: Un vector de clonación contiene elementos

como el origen de replicación, un sitio múltiple de clonación (SMC), que es una
secuencia específica reconocida por diversas enzimas de restricción para poder
insertar el ADNc del gen de interés y un marcador de selección. Un vector de
expresión se utiliza para producir una proteína recombinante y contiene, además
de los elementos mencionados, un promotor y un sitio IRES (sitio de entrada
interna al ribosoma), así como una secuencia de poliadenilación.
6. Para que se aplican las técnicas de clonación y/o expresión y posterior

inserción de los vectores en células procariotas o eucariotas.
RTA//: Los investigadores usan rutinariamente técnicas de clonación para producir

copias de genes que quieren estudiar. El procedimiento consiste en insertar un
gen de un organismo, a menudo denominado "ADN exógeno", en el material
genético de un portador denominado vector.
7. Observe el siguiente vector de expresión, explique cada uno de los elementos

genéticos observados y cuál es su función.
8. ¿Qué mecanismos son utilizados para verificar que una bacteria fue
transformada exitosamente con un plásmido con un gen clonado?
RTA//: Transformación en bacterias: La transformación bacteriana consiste en la

adquisición de ADN exógeno, que le confiere un nuevo fenotipo a la célula
huésped. Entre los métodos más comunes se encuentran la transformación
química y la transformación por electroporación.
Cabe resaltar que el termino transformación se refiere a la introducción de material
genético a través de vectores a las bacterias; el término transducción describe la
introducción del ácido nucleico exógeno en una célula por medio de un vector viral,
y el término transfección implica la introducción del material genético en las células
empleando agentes químicos o físicos.
A) Transformación química. Para la transformación química se añade el

plásmido deseado a las células químicamente competentes que se encuentran
en una solución con CaCl2, que junto con el vector forma un complejo
insoluble. Un choque térmico a 42 °C facilita la entrada del complejo ADN-
CaCl2 a la célula. Se añade medio LB para que las células crezcan y se
reproduzcan con el plásmido insertado. Posteriormente, se siembran en agar
con antibiótico del gen de resistencia que contiene el plásmido y se
seleccionan las colonias resistentes que contienen el vector recombinante.
B) Transformación por electroporación. En la transformación por
electroporación la diferencia estriba en que en lugar de un choque térmico se
aplican pulsos eléctricos que desestabilizan la membrana celular y permiten la
entrada del vector.
9. ¿En qué consiste el screening de microrganismos transformados mediante

la técnica de la alfa complementación?
RTA//: El rastreo (screening) de la genoteca nos permitirá encontrar el clon de

interés (que tiene el fragmento del genoma que nos interesa estudiar). Sin
embargo, la complementación no ocurre si el plásmido introducido en la bacteria
es un plásmido recombinante. Ello es porque las diferentes dianas de inserción se
localizan dentro del gen lacZ en lo que se conoce como polylinker (región rica en
diferentes dianas de restricción únicas). Así, en un experimento de clonación,
cualquier inserto de ADN foráneo interrumpiría el gen lacZ del plásmido y la
bacteria con plásmido recombinante carecería de función β-galactosidasa como
las bacterias DH5α sin plásmido pUC18.
10. ¿Qué mecanismo de regulación génica se utiliza en los plásmidos y cuál

cree usted que es la razón por la cual estos mecanismos son
implementados?
RTA//: Un plásmido es una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra

en las bacterias y algunos otros organismos microscópicos. Los plásmidos están
separados físicamente del ADN cromosómico y se replican de manera
independiente. Habitualmente tienen un número reducido de genes (cabe señalar,
algunos asociados a la resistencia a los antibióticos), y se pueden transmitir de
una célula a otra.
 Plásmidos
 DNA de virus
 Cosmidos
 Cromosomas artificiales de levadura
11. Lea el artículo “Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa

derivada de meta genomas de suelos agrícolas colombianos”. Explique cómo se
aplican las técnicas de biología molecular (extracción de ADN, PCR,
secuenciación y bioinformática) estudiadas, en el proceso descrito por los autores
y como es el mecanismo general para la clonación y transformación de la bacteria.
Explique los elementos genéticos del plásmido utilizado (imagen). Finalmente
reflexivo como se pudieron emplear las ciencias ómicas para la identificación del
gen codificante para la esterasa obtenida.
RTA//: El análisis bioinformático sobre insertos de ADN metagenómico

provenientes de un suelo dedicado al cultivo de papa criolla (Calderón et al.,
manuscrito en preparación), permitió realizar la identificación de una secuencia
codificante de 591 pares de bases (pb) para una enzima lipasa putativa con
dominio α/β hidrolasas (PFAM: PF07859.7). Esta enzima de 317 aminoácidos (aa),
denominada LipM, mostró un peso teórico de 42 kDa y punto isoeléctrico (pI) de
5.8. El análisis de la secuencia de nucleótidos de este gen en la base de da-tos del
NCBI, no evidenció identidad con ninguna secuencia reportada hasta ahora. Por
su parte, el análisis por BLASTp evidenció que la proteína LipM presentó una
identidad de 49% en su secuencia de aminoácidos con una proteína lipasa de
Mycobacterium thermoresistibileATCC 19527 (gbEHI10768.1) y de 47 % con la
lipasa/esterasa de Mycobacterium abscessus (gbEIU36003.1).
El producto de PCR obtenido fue purificado, completamente digerido con la

enzima XbaI e insertado utilizando la enzima T4 ligasa, en el vector de expresión
pBADgiiiA del kit pBADgiii_man (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EEUU),
previamente digerido con la misma enzima de restricción y siguiendo las
recomendaciones del fabricante. La correcta inserción de la secuencia codificante
de LipM en el vector de expresión fue confirmada por secuenciación Sanger. El
plásmido resultante, pBADgiiiALipM, fue transforma-do por electroporación en la
bacteria Escherichia coli TOP10 (Thermo Fisher Scientific), siguiendo el protocolo
del fabricante. El análisis de la secuencia de nucleótidos de este gen en la base de
da-tos del NCBI .no evidenció identidad con ninguna secuencia reportada hasta
ahora.
El gen LipM, con dominio α/β hidrolasa fue amplifica-do de su clon metagenómico
parental usando los iniciadores pBADgiiiALipM directo 5’- CG TCT AGA GCC TGT
CGA TCA GCC AAC -3’ y pBADgiiiALipM reverso 5’- CG TCT AGA ACC AGG
TGC GCC CTC -3’. Para la amplificación por PCR se inició con un paso de
desnaturalización a 95 °C por 5 min, seguido por 35 ciclos de:
a) Desnaturalización a 95°C por 45 s,
b) anillaje a 56 °C por 45 s y
c) extensión a 72 °C por 1 min.
Finalmente se incluyó una extensión final de 8 min a 72 °C. El producto de PCR
obtenido fue purificado, completamente digerido con la enzima XbaI e insertado
utilizando la enzima T4 ligasa, en el vector de expresión pBADgiiiA del kit
pBADgiii_man (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EEUU), previamente
digerido con la misma enzima de restricción y siguiendo las recomendaciones del
fabricante
La secuenciación de genomas individuales y el método tradicional de cultivo,

radica en que permite analizar la informa-ción genética de la gran mayoría de
microorganismos que no son cultivables en condiciones de laboratorio (hasta el
99%). Los metage-nomas derivados de ambientes naturales, como es el caso
específico de suelos, tienen ventajas adicionales ya que debido a las condiciones
ambientales de este tipo de ecosistema, la comunidad microbiana que allí se
encuentra es sumamente rica y diversa. Esto convierte a la metagenómica en una
herramienta poderosa para explorar el potencial biocatalítico de las comunidades
microbianas y/o sus moléculas provenientes de los ambientes edáficos.
12. ¿Qué aplicaciones agroindustriales tiene a su parecer de microrganismo con
ADN recombinante?
RTA//: El ADN recombinante tiene aplicación en varios campos como en la industria

farmacéutica, la industria alimentaria, la industria agrícola o en la investigación
biosanitaria, entre otros.
En la industria farmacéutica, la insulina humana, con el tiempo esta insulina ADN

recombinante, demostró ser más eficiente y segura, que la insulina que se obtenía del
páncreas de vacas y cerdos.
Otra aplicación interesante del ADN recombinante son las vacunas. La última
generación de vacunas biotecnológicas son las conocidas como vacunas ADN
(también llamadas de ADN desnudo). La vacuna de ADN consiste en la inyección
directa de ADN a través de un plásmido bacteriano. Este ADN codifica una proteína
viral antigénica de interés que inducirá la respuesta inmunitaria.
Finalmente, otro ejemplo de la aplicación de la ingeniería genética en la Industria

farmacéutica es la síntesis de nuevos antibióticos.
En el campo de la agricultura, la aplicación del ADN recombinante ha permitido

obtener plantas transformadas más productivas, resistentes a herbicidas, o a los
virus que destruyen los cultivos y a sobrevivir a condiciones climáticas extremas o con
mayor producción de vitaminas (ejemplo del arroz). A estos productos se les llaman
organismos genéticamente modificados o transgénicos.

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YENCY PATRICIA MUÑOZ CHACÓN

YASMIN CASTRO SOLANO

ALISSON DANIELA PEREZ

RICARDO CAMACHO MUÑOZ

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

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3. A que hacen referencia los términos: Clonación, Transformación,

RTA//: La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un

Transducción describe la introducción del ácido nucleico exógeno en una célula

Transfección implica la introducción del material genético en las células

La introducción del ADN recombinante tiene como propósito la transformación

5. Que es un vector de clonación y/o expresión que tipos puede identificar.

RTA//: Los vectores son de clonación si su finalidad es el almacenamiento de

Los vectores de expresión: son aquellos cuyo objetivo es producir un transcrito

Vector de clonación y expresión: Un vector de clonación contiene elementos

6. Para que se aplican las técnicas de clonación y/o expresión y posterior

RTA//: Los investigadores usan rutinariamente técnicas de clonación para producir

7. Observe el siguiente vector de expresión, explique cada uno de los elementos

RTA//: Transformación en bacterias: La transformación bacteriana consiste en la

A) Transformación química. Para la transformación química se añade el

9. ¿En qué consiste el screening de microrganismos transformados mediante

RTA//: El rastreo (screening) de la genoteca nos permitirá encontrar el clon de

10. ¿Qué mecanismo de regulación génica se utiliza en los plásmidos y cuál

RTA//: Un plásmido es una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra

11. Lea el artículo “Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa

RTA//: El análisis bioinformático sobre insertos de ADN metagenómico

El producto de PCR obtenido fue purificado, completamente digerido con la

La secuenciación de genomas individuales y el método tradicional de cultivo,

RTA//: El ADN recombinante tiene aplicación en varios campos como en la industria

En la industria farmacéutica, la insulina humana, con el tiempo esta insulina ADN

Finalmente, otro ejemplo de la aplicación de la ingeniería genética en la Industria

En el campo de la agricultura, la aplicación del ADN recombinante ha permitido

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