10 - Hibridación Molecular - 2024

Técnica de Hibridación de ácidos nucleicos
Cuaderno 114 = Oomicas
http://www.biorom.uma.es/contenido/av_bma/apuntes/T3/hibridac.html
https://www.youtube.com/watch?v=-S1chNhHl3U
https://www.youtube.com/watch?v=pEK-GLEExCE
Northen: https://www.youtube.com/watch?v=pS1kHY7JkFw
https://www.youtube.com/watch?v=rSBVJn6srUY
https://www.youtube.com/watch?v=VWRT7Tpz1wY
https://www.youtube.com/watch?v=lXZIpaUKwJA
https://www.youtube.com/watch?v=SBGqXHdHKmU
Hibridación
Es la construcción artificial de ácidos nucleicos
bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando
la complementariedad de bases.
Hibridación de ácidos nucleicos
• Principio: Cadenas simples de DNA/RNA
que presentan complementariedad de
bases forman una cadena dupla estable. El
fragmento de ácido nucléico
complementario al del patógeno
previamente fijado a la membrana de
nitrocelulosa se denomina sonda
• La estabilidad de una cadena dupla es

directamente proporcional al grado de
complementariedad entre las cadenas
simples
• DNA/DNA: “Southern blot”

DNA/RNA: “Northern blot”
Dot - Blot
http://www.biorom.uma.es/contenido/av_bma/apuntes/T3/hibridac.html
Hibridación
Es un proceso de unión de dos cadenas complementarias de
ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido
nucleico de doble cadena.
Las Técnicas de Hibridación se basa en la secuenciación de
fragmentos de ADN y ARN para su posterior identificación
y cuantificación à SONDA
DESARROLLAN EL CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN
• 1975 Edward Southern (DNA/DNA)

• En 1977, James Alwine, David Kemp y George Stark en la
Universidad de Stanford desarrollaron el Northern
blot (DNA/RNA)
Objetivos
1. Permitir estudiar el grado de relación genética entre dos
ácidos nucleicos
2. Cuantificar el contenido de ácido nucleico especifico
3. Identificar un gen en particular
a través de secuencias conocidas
= sondas
Sondas
• Sonda radioactiva = cadena simple marcada con P32, S35 o I25
Se visualiza con rayos X
• Sonda con Flourocromo = Se visualiza con película de luz
• Sonda Colorimetrica (enzimas) = Biotina o digoxigenina
Se visualiza con el microscopio en histologia
Sonda? Versus Primer?

Moduladores de la Hibridación
• Complementaridad de bases
– Purina con Pirimidina
• A=T
• C⁞G
• Temperatura
• Denaturación > 90°C
• Renaturación ≈ 54 -59
– DNA:DNA y ADN:ARN
Temperatura baja. 20 y 30 renaturación
• pH y productos químicos (con grupos carbonilo y amino)

– pH > 11 denaturación y posterior degradación
– Agentes químicos : Urea, Formamida y Formaldheido
– Agua destilada: impide la neutralización de los grupos fosfatos
Factores que influyen en la hibridación
• Número de copias de la secuencia diana: ADN o
ARN
• Tamaño de la sonda
• Concentración de la sonda
• Cantidad de CG de la secuencia que se hibrida
• Rigor de la hibridación Temperatura
Tiempo
Fuerza iónica
pH
Concentración de agentes denaturalizantes
Adición de ciertos polimeros
Temperatura
Molécula de DNA
Temperatura – desnaturación reversible.
Descenso brusco – reasociarse consigo
misma
Denaturación
Versus
Annealing
Técnicas basadas en la Hibridación
1. Blodding
• Técnica de Southern (ADN) = dot blot
• Técnica Northern (ARN) = slot blot
2. Micro arrays
3. Hibridación genómica comparada (HGC)
4. Hibridación insitu
Microscopio de flourescencia,
Marcadores moleculares basados en la técnica de
Hibridación
• RFLP: Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción
de ADN
• VNTR: o Minisatélites
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica inventada

en 1984 por el científico inglés Alec Jeffreys durante la investigación de enfermedades
hereditarias. Se utiliza para el análisis de patrones únicos en fragmentos de ADN para
diferenciar genéticamente entre organismos; estos patrones se denominan número
variable de repeticiones en tándem (VNTR).
Enzimas de restricción
Enzima que corta ADN y que reconoce sitios específicos en él.
Muchas hacen cortes escalonados en o cerca a su sitio de reconocimiento y producen extremos

sobresalientes de cadena sencilla.
Explicar el polimorfismo genético en dos individuos
Qué es un fotodocumentador, transiluminador?

Southern blot - ADN
Fue desarrollado por E. M. Southern para la detección de genes
específicos en el ADN y caracterizarlos
1. Restricción
2. Separación fijación del DNA
3. Denaturación
Metodología Southern blot
4. Transferencia
5. Hibridación ADNc
6. Detección
1 2 3
10000
5000
1000
https://youtu.be/LNVdOdNQyCM
Metodología Southern blot
1. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños
mediante una electroforesis en un gel.
2. Se realiza tinción con bromuro de etidio para comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN
3. Los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un ácido débil y
desnaturalizados con NaOH para permitir la transferencia.
4. El ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa, en el filtro queda representada una réplica de la
disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel.
5. El filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un
fluorocromo)
6. Durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de
secuencia complementaria (o muy parecida).
7. La sonda se puede visualizar en el filtro mediante una exposición a una película de rayos X para
sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo.
Southern Blot con sonda no radioactiva (digoxigenina)
Figura 1. Detección de virus mediante hibridación

molecular no radioactiva. A) Esquema del proceso
de detección de virus y viroides basado en la
hibridación molecular con sondas marcadas con
digoxigenina. Tras aplicar las muestras en
membrana de nylon y fijar los ácidos nucleicos con
luz ultravioleta se hibridaron toda la noche con
sonda de RNA o DNA marcada con digoxigenina. Al
día siguiente, se eliminaron los restos de sonda y
se incubaron las membranas con el anticuerpo
que reconoce la molécula de digoxigenina y que
va conjugado con la enzima fosfatasa alcalina, la
cual permite revelar la membrana con diferentes
substratos. B) Ejemplo de análisis de dos virus de
clavel en tejido de clavel (Sánchez-Navarro et al.
1999). Cada membrana se hibridó con una sonda
de RNA marcada con digoxigenina complementaria
al gen de la proteína de cubierta del virus de RNA
del moteado del clavel (Carnation mottle virus,
CarMV) o del virus de DNA del anillo grabado del
clavel (Carnation etched ring virus, CERV). Las
membranas se revelaron con substrato
quimioluminiscente CSPD (Roche) y se expusieron
durante 30 minutos.
Southern Blot con sonda no radioactiva (digoxigenina)
• Detección específica del ToRMV en muestras de tomate colectadas en campo

Northern blot - ARN
• Detección de ARN en un organismo
– ARN Total
– ARN Mensajero
– ARN Vírico, etc.
Se utiliza para saber el tamaño de los ARNs y

sobre el modelo de expresión de los genes
Metodología Northern blot
• Se separan por electroforesis en condiciones desnaturalizantes:
formaldehído en la composición del gel
• ARN forman complejas estructuras secundarias que dificultan
la migración en el gel
• Se transfiere a una membrana de filtro y se hibridan con
sondas de ADN marcada
ADN
Dot-Blot con sonda no radioactiva
(digoxigenina)
• Detección de diferentes especies de Begomovírus en muestras de soya
y malezas colectadas en campo.
Otras técnicas de
hibridación
2. Microarrays de ADN:
Basado en la síntesis o
fijación de sondas que
representan genes (o
proteínas, o metabolitos)
sobre un sustrato sólido
(cristal, plástico, silice)
expuesto a las moléculas
de estudio (diana)
Cómo funcionan
los microarrays
El nivel de hibridación
entre la sonda específica
y la molécula diana; se
indica mediante
flourescencia y se mide
por análisis de imagen e
indica el nivel de
expresión del gen
correspondiente a la
sonda en la muestra
problema Ver video
https://www.youtube.com/watch?v=uc0z7l4jDgY
https://youtu.be/yLcDM3re2hc?si=jN3l3iBGb9skLkp0
Tipos de Microarrays
• De expresión de genes
• De proteína
• De tejidos
• De ADN
Objetivos de Microarrays
• Estudiar genes que se expresan
diferencialmente entre varias
condiciones.
Sanos & enfermos
Mutantes & salvajes
Tratados & no tratados
• Clasificar molecularmente una
enfermedad
• Identificar genes característicos
de una patología
Detección de fitovirus por microarray
Hibridación - Microarray
• “Chips” de DNA o RNA – centenas,
millones de sondas – genoma del
organismo objetivo.
• Multiplex – diagnóstico de
múltiples patógenos
• Extracción de ácidos nucleicos, PCR
y detección directamente en el
array – potencial para
automatización.
Boonham et al., 2007

https://youtu.be/16V1q4nctdg?si=gH39kM9W06h5rUiy
Limitaciones del método de hibridación
• Se requiere considerable tejido de muestra biológica; mínimo
10 ug de ácido nucléico.
• La sensibilidad de la técnica está relacionada con la cantidad de
ADN o RNA
• El tiempo de la técnica es de tres días.
Estas limitaciones fueron

superadas
con la técnica de la PCR
fin
Qué debió aprender
• El concepto de hibridación molecular
• Los usos de la hibridación molecular
• Los factores básicos de la hibridación molecular en laboratorio
• El Concepto de sonda y su expresión diferente a la de primer
• Nombres de los métodos de hibridación
• Los pasos para realizar la Técnicas de Hibridación
• Marcadores moleculares basados en la hibridación
• El concepto de polimorfismo
• La actuación de la enzima de restricción
• Limitación de la técnica de hibridación que con llevo al uso de
la PCR
• La forma como se sucede la hibridación y como se observa el
polimorfismo genético
• Limitación de la técnica de hibridación que con llevo al uso de
la PCR
• Diferencia entre hibridación y PCR
Realice el gel de agarosa que se produce después de usar la técnica
Southern para estas muestras de naranja
1. Enzima de restricción GA↓GC
2. Sonda para el virus de la tristeza: GGCCTAT
Realice el gel de agarosa y fotografía Souther

Individuo 1:AATGAGCTATGGGCCTATGAGCCGTA
Individuo 2:GGAGCCGGCCTATGTAAATGCTATGAGCCG
Individuo 3: CGAGCTCCGGATACGAGCGACCGGATATTAGCC
Individuo 4: GGAGCTCATGCCGGATACTAAT GGCCTATCGGTGCCA
Individuo 5: TCGAGCGCCGGATAAGGCCGTATAGGCCCTATCGAGAGCTA
Realice el gel de agarosa que se produce después de usar la técnica
Southern para estas muestras de naranja
1. Enzima de restricción GA↓GC
2. Sonda para el virus de la tristeza: GGCCTAT
Realice el gel de agarosa y fotografía Souther

Individuo 1:AATGAGCTATGGGCCTATGAGCCGTA
Individuo 2:GGAGCCGGCCTATGTAAATGCTATGAGCCG
Individuo 3: CGAGCTCCGGATACGAGCGACCGGATATTAGCC
Individuo 4: GGAGCTCATGCCGGATACTAAT GGCCTATCGGAGCCA
Individuo 5: TCGAGCGCCGGATAAGGCCGTATAGGCCCTATCGAGAGCTA
MPM 1 2 3 4 5
31
27
23
15
14
13
¿Identifica polimorfismo?
Realice el gel de agarosa y el de Nylon que se produce
después de usar la técnica Southern para estas muestras
de papaya
• Sonda para el virus de la mancha anular de la
papaya: GGCCTAT
• Enzima AATT
Individuo 1: AAAATTGCCGGATATGCCGGATATCAAATTGTA
Individuo 2:GTCAAATTAATCGGCCTATGGGCCTATATGCTTAAACG
Individuo 3: CAATTTATCCGGATACTAAAGGCCTATAGCAAA
Individuo 4: GTAATTCATGCTATAGGCCTATCGGATCAATTGCA
Individuo 5: TAATTCGTACATAGGGCCTATCTAAATT
Realice el gel de agarosa y el de Nylon que se produce
después de usar la técnica Southern para estas muestras
de papaya
papaya: GGCCTAT
• Enzima AATT
Individuo 1: AAAATTGCCGGATATGCCGGATATCAAATTGTA
Individuo 2:GTCAAATTAATCGGCCTATGGGCCTATATGCTTAAACG
Individuo 3: CAATTTATCCGGATACTAAAGGCCTATAGCAAA
Individuo 4: GTAATTCATGCTATAGGCCTATCGGATCAATTGCA
Individuo 5: TAATTCGTACATAGGGCCTATCTAAATT
Interprete el gráfico de la derecha
MPM 1 2 3 4 5 MPM 1 2 3 4 5
27 27
26 26
24 24
23 23
21 21
Realice el gel de agarosa que se produce después de usar
la técnica Southern para estas muestras de papaya
papaya: GGCC
• Enzima: AATG
Individuo 1: AATGCTATGGCCTAATGCA
Individuo 2:GTAATGGGCCGGAATGGCTAATCCGGAATGCA
Individuo 3: C AATG GTATCCGGATACT AATG A
Individuo 4: G AATG CGGCCCTAATCCG AATG G

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• La estabilidad de una cadena dupla es

• DNA/DNA: “Southern blot”

• 1975 Edward Southern (DNA/DNA)

Sonda? Versus Primer?

• pH y productos químicos (con grupos carbonilo y amino)

El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica inventada

Muchas hacen cortes escalonados en o cerca a su sitio de reconocimiento y producen extremos

Qué es un fotodocumentador, transiluminador?

Figura 1. Detección de virus mediante hibridación

• Detección específica del ToRMV en muestras de tomate colectadas en campo

Se utiliza para saber el tamaño de los ARNs y

Boonham et al., 2007

Estas limitaciones fueron

Realice el gel de agarosa y fotografía Souther

Realice el gel de agarosa y fotografía Souther

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