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    2A-Tecnicas Basicas de Analisis de Acidos Nucleicos

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    LETICIA LIZZETH HUAMAN PAREJAS
    Este documento describe técnicas básicas para el análisis de ácidos nucleicos como la electroforesis de ADN y ARN, la hibridación con sondas y el Southern blot. La electroforesis permite separar fragmentos por tamaño mientras que la hibridación con sondas específicas identifica la ubicación de secuencias particulares de ADN o ARN. El Southern blot combina ambas técnicas para localizar genes específicos.

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    2A-Tecnicas Basicas de Analisis de Acidos Nucleicos

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    LETICIA LIZZETH HUAMAN PAREJAS
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    Este documento describe técnicas básicas para el análisis de ácidos nucleicos como la electroforesis de ADN y ARN, la hibridación con sondas y el Southern blot. La electroforesis permite separar fragmentos por tamaño mientras que la hibridación con sondas específicas identifica la ubicación de secuencias particulares de ADN o ARN. El Southern blot combina ambas técnicas para localizar genes específicos.

    Título original

    2A-Tecnicas_basicas_de_analisis_de_acidos_nucleicos

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    Este documento describe técnicas básicas para el análisis de ácidos nucleicos como la electroforesis de ADN y ARN, la hibridación con sondas y el Southern blot. La electroforesis permite separar fragmentos por tamaño mientras que la hibridación con sondas específicas identifica la ubicación de secuencias particulares de ADN o ARN. El Southern blot combina ambas técnicas para localizar genes específicos.

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    2A-Tecnicas Basicas de Analisis de Acidos Nucleicos

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    LETICIA LIZZETH HUAMAN PAREJAS
    Este documento describe técnicas básicas para el análisis de ácidos nucleicos como la electroforesis de ADN y ARN, la hibridación con sondas y el Southern blot. La electroforesis permite separar fragmentos por tamaño mientras que la hibridación con sondas específicas identifica la ubicación de secuencias particulares de ADN o ARN. El Southern blot combina ambas técnicas para localizar genes específicos.

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    TECNICAS BASICAS PARA EL

    ANALISIS DE ACIDOS
    NUCLEICOS
    ELECTROFORESIS DE DNA

    Fragmentos de DNA

    Migración

    Gel de Agarosa o Poliacrilamida Separación por tamaño


    (ELECTROFORESIS DE DNA-continuación)
    Marcador (Estándar)

    Tinción con
    Bromuro de Etidio

    Observación en un
    transiluminador de
    luz UV.

    Gel de Agarosa Gel de Poliacrilamida


    Determinación del
    tamaño de
    fragmento de DNA
    por electroforesis
    Mediante la electroforesis
    se logran separar
    fragmentos de diferentes
    tamaños.

    ¿Cómo saber
    cuál de aquellos
    fragmentos
    contiene el gen
    de interés?
    La electroforesis de ácidos
    nucleicos, sea estándar o de
    tipo PFGE , permite separar
    fragmentos de DNA y
    determinar su tamaño.
    Sin embargo, esta
    información no es
    suficiente para saber en
    cuál de los fragmentos se
    encuentra un gen o
    secuencia de DNA en
    particular.

    Siguiente paso:
    Hibridación con una
    sonda específica
    HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

    El DNA puede sufrir un proceso reversible de separación y


    reasociación de hebras

    DNA en estado nativo Denaturado Renaturado


    Sonda : molécula de hebra simple (DNA o RNA) de
    secuencia conocida, con una marca radioactiva o fluorescente

    Sonda de
    DNA
    marcada

    DNA o RNA
    inmovilizado
    Southern blot
    • Animación:
    https://www.youtube.com/watch?v=-
    SaKbLTQ4WI
    • Filmación:
    https://www.youtube.com/watch?v=-
    SaKbLTQ4WI
    DETECCION Y ANALISIS DE BIOMOLECULAS

    Molécula Detección específica


    transferida con:
    Southern DNA sonda marcada
    (DNA o RNA)
    Northern RNA sonda marcada
    (DNA o RNA)
    Western Proteína Anticuerpos

    Luego de la separación por tamaño mediante electroforesis,


    las moléculas de DNA, RNA o Proteínas pueden ser
    transferidas del gel hacia una membrana o filtro de
    nitrocelulosa o nylon, para luego ser detectadas con sondas o
    anticuerpos especìficos.
    La hibridación con sondas específicas
    permite determinar la ubicación o identidad
    de un fragmento de DNA

    Southern
    HIBRIDACION EN NORTHERN

    Paso 1:
    Separación de fragmentos
    de RNA por electroforesis
    en gel.
    Paso 2: Transferencia del RNA al
    filtro o membrana. Las
    moléculas de RNA son
    arrastradas por el buffer
    que sube por capilaridad.
    Paso 3: Hibridación de la sonda marcada con el
    mRNA inmovilizado (interacción específica por
    complementariedad de bases)

    Sonda de
    DNA
    marcada

    Membrana
    de nylon
    RNA
    inmovilizado
    Paso 4: Lavado (se elimina el
    exceso de sonda no hibridada)
    y Detección de la marca de la
    sonda (localización del mRNA
    específico)
    La hibridación en
    condiciones de mayor
    estringencia garantiza
    una mayor especificidad
    en la interacción.
    TIPOS DE HIBRIDACION

    1. Tipo de interaccion: DNA – DNA


    DNA – RNA
    RNA – RNA
    2. Hibridación en filtro:
    - Southern o Northern
    - Colony Hibridization
    - Dot-blot
    3. Hibridacion en solución
    4. Hibridacion in situ (en tejidos fijados sobre láminas
    portaobjeto)
    FISH: hibridación in situ fluorescente

    Sonda de DNA
    con marca
    fluorescente
    La electroforesis convencional en gel de
    agarosa, no logra resolver moléculas de
    DNA mayores a 10-20 Kb
    ¿Cómo hacer para separar fragmentos de
    DNA de tamaño mas grandes (por ejemplo
    cromosomas enteros)?

    PFGE : Pulse Field Gel Electrophoresis


    (Electroforesis en gel de campo pulsado)
    Principio de separación por PFGE
    (Electroforesis en gel de campo pulsado)
    -
    - -

    + +
    +
    La migración de los fragmentos de DNA cambia de dirección, según el
    campo eléctrico que se active. La activación se da por tiempos cortos
    (“pulsos”)
    Fig 1: Electrode configuration of commonly used
    pulsed field gel electrophoresis (PFGE) units.
    Figure 2. Increased
    separation of the 20-50 kb
    range with field inversion gel
    electrophoresis (FIGE).
    Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16
    hrs., 50 msec. pulse,
    forward:reverse pulse ratio = 2.5:1,
    1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10
    C.a) 1 kb ladder, 0.5-12 kb; b)
    Lambda/Hind III, 0.5-23 kb; and c)
    High molecular weight markers,
    8.3-48.5 kb
    Fig. 3. Rotating gel
    electrophoresis (RGE)
    separation Saccharomyces
    cercevisiae chromosomes (245-
    2190 kb). Run conditions: 180 V,
    5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-
    120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE,
    1.2% GTG agarose, 10 C. Two
    combs were used on the same gel
    to load 32 samples, a maximum
    of 72 are possible
    Fig. 4. Rotating gel electrophoresis
    (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA
    Schizosaccharomyces pombe chromosomes.
    Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs,
    100 angle, concatamated multiple runs:
    2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs,
    0.5X TBE, 0.8% megarose (Clontech),
    10 C.
    Preparación de PLUGS de agarosa para PFGE
    SECUENCIAMIENTO DE SANGER
    • Uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs)
    • Se coloca el mismo DNA templado en 4 tubos, para
    realizar las reacciónes de secuenciamiento en
    paralelo.
    • Separación de fragmentos producidos por
    electroforesis en gel de secuenciamiento
    Secuenciamiento de ADN

    • El método Sanger permite secuenciar


    fragmentos de 1000 bp.
    • El método utiliza di-deoxi-
    ribonucleótidos, que interrumpen la
    replicación, lo que da como resultado
    fragmentos de diferentes tamaños.
    • Se colocan en solución ddNTPs con
    marcadores fluorescentes ATCG. Cada
    tamaño, con 1nt de resolución, debe dar
    un color diferente.
    LE 20-12
    DNA Primer Deoxyribonucleotides Dideoxyribonucleotides
    (template strand) 3 (fluorescently tagged)
    5

    5

    DNA
    polymerase

    3

    DNA (template Labeled strands


    5 strand) 3

    3

    Direction
    of movement
    of strands

    Laser Detector

    SANGER:
    http://www.youtube.com/watch?v=AV35C36bBto

    Illumina:
    http://www.youtube.com/watch?v=Zqr8_KiuzHU
    Nanopore
    • El genoma humano se resolvió mediante el
    camino de mapeo de ligamiento, mapeo físico,
    y secuenciamiento de ADN.
    • Un camino alternativo comienza con el
    secuenciamiento de fragmentos de ADN.
    Requiere mayor redundancia y capacidad de
    cómputo.
    • Los sistemas informáticos pueden ensamblar
    las secuencias identificando las regiones de
    superposición.
    LE 20-13
    Cut the DNA from
    many copies of an
    entire chromosome
    into overlapping frag-
    ments short enough
    for sequencing

    Clone the fragments


    in plasmid or phage
    vectors

    Sequence each fragment

    Order the
    sequences into one
    overall sequence
    with computer
    software
    El mismo DNA templado en 4 tubos en paralelo

    Oligonucleótido o Primer
    Templado
    LECTURA RECOMENDADA

    1. Nelson D. &Cox M.- LEHNINGER Principles of Biochemistry


    Capítulo 8 – Nucleotides & Nucleic Acids

    2. Mathews, Van Holde & Ahern - Bioquímica (3era edición


    Capítulo 25 - Sección Herramientas de la Bioquímica
    - Tema 25C – Secuenciamiento de DNA
    - Tema 25D – Transferencia en Southern & Hibridación

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