Extracción de Adn

EXTRACCIÓN DE ADN.
1. Eliminar el medio de cultivo de las células en la caja de Petri.

2. Lavar el cultivo celular 2 veces con 2 mL de PBS.
3. Eliminar completamente el PBS con la ayuda de una micropipeta.
4. Adicionar 1 mL de TRIzolR (ThermoFisher Scientific) sobre la monocapa celular
y despegar las celulas con una espatula de plastico esteril (scrapper)
5. Recuperar la suspension celular con ayuda de una micropipeta y colocarla en
un microtubo.
6. Homogenizar la suspension celular durante 2 min con pipeteo constante.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
8. Adicionar 200 μL de cloroformo.
9. Mezclar con un vortex durante 15 s.
10. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min.
11. Centrifugar a 14,000 rpm durante 15 min a 4 °C.
12. Transferir cuidadosamente la fase orgánica a otro microtubo, evitando tocar la
fase acuosa. LA FASE ORGÁNICA CORRESPONDE AL ADN Y LA ACUOSA AL
ARN
PRECIPITACIÓN DE ADN
1. Eliminar cualquier resto de la fase acuosa

2. Añadir 0.3 mL de etanol al 100% por cada tubo de trizol usado para la lisis
(aquí no entiendo si se refiere a lo que salió de ADN)
3. Cerrar el tubo y mezclar invirtiendo el tubo varias veces
4. Incubar 2-3 (es temperatura ambiente?)
5. Centrifugar por 5 min a 2000 xg a 4°C
6. FASE ORGANICA ADN FASE ACUOSA PROTEÍNAS
LAVADO ADN
1. Resuspender el pellet en 1mL de 0.1 M de citrato de Na en 10% de

etanol,pH 8.5 por cada mL de trizol (aquí se debe ajustar el pH del etanol?)
2. Incubar por 30 min a temperatura ambiente, mezclar ocasionalmente
invirtiendo el tubo
3. Centrifugar durante 5 min a 2000 xg a 4°C
4. Descartar el sobrenadante con la micropipeta
5. Repetir 1 vez el lavado de ADN
6. Resuspender el pellet en 1mL de 0.1 M de citrato de Na en 10% de
etanol,pH 8.5 por cada mL de trizol
7. Incubar por 30 min a temperatura ambiente, mezclar ocasionalmente
invirtiendo el tubo
8. Centrifugar durante 5 min a 2000 xg a 4°C
9. Descartar el sobrenadante con la micropipeta
10. Secar pellet de ADN x 10-15 min
SOLUBILIZACIÓN ADN
1. Resuspender el pellet con 0.3-0.6 mL de NaOH 8 mM pipetenado hacia
arriba y abajo
2. Centrifugar 10 min a 12 000 x g a 4°C para eliminar material insoluble
3. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, posteriormente ajustar pH con
HEPES (aquí literal se pone un electrodo?)
4. Almacenar a -20 °C
2ª SESIÓN
CUANTIFICACIÓN DE ADN CON NANODROP

MEZCLA PCR, SE VA A UTILIZAR BETA ACTINA
ENCONTRÉ EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO PERO DEBO PEDIR LA TABLA
DEL COCTEL?
1. Rotular 2 microtubos de 0.2 mL: uno para la reacción de PCR experimental y
otro para el control negativo. Mantener siempre los tubos en hielo.
2. Descongelar los reactivos necesarios (excepto la Taq polimerasa) y mantener
en hielo. Agitar los reactivos con vórtex, excepto el ADN y la enzima. Antes de
abrir los reactivos, dar un pulso en la microcentrífuga durante 5 s para hacer que
el líquido quede en el fondo del microtubo.
! Sacar la polimerasa del congelador al momento de usarla y mantenerla en hielo
en todo momento. Regresar la enzima al congelador inmediatamente después de
usarla.
3. En los microtubos de 0.2 mL sobre hielo, agregar los reactivos para hacer el
coctel de reacción. Seguir el orden indicado en la Tabla 1, comenzando por el
agua.
Cerciorarse que los reactivos se coloquen en el fondo de los microtubos.
4. Mezclar los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo y dar un
pulso en la microcentrífuga durante 5 s para hacer que el líquido quede en el
fondo del microtubo y se mezclen todos los componentes.
5. Programar el termociclador con las condiciones de amplificación necesarias,
siguiendo como guía la Tabla 2 y colocar los microtubos en el equipo.
6. Al terminar la reacción, visualizar lo amplificado por medio de electroforesis en
un gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X. No olvidar cargar un carril con marcador de
ADN. Utilizar el 10% de cada reacción de PCR.
! Dependiendo del tamaño de los fragmentos esperados, el porcentaje de agarosa
sugerido puede variar.
7. Almacenar las reacciones de PCR a -20 °C.
3ª. SESIÓN
ELECTROFORESIS
1. Limpiar y secar las charolas de preparación de geles y los peines con agua
destilada y ensamblarlos. Colocar las charolas en una superficie horizontal y
nivelada.
2. Acomodar los peines en cada charola a 0.5 -1.0 mm del fondo de ellas.
3. Preparar en un matraz Erlenmeyer, 50 mL de una solución de agarosa al 0.7%
(p/v), en otro al 1.2% y finalmente en un tercero al 1.5% en TBE 0.5X. Disolver la
agarosa calentando las mezclas en horno de microondas. Verificar que la agarosa
este completamente disuelta por medio de agitación.
! La solución de agarosa se calienta mucho y puede hervir violentamente si se
calienta por largos periodos en el horno de microondas.
4. Dejar enfriar las soluciones de agarosa por debajo de 60 °C.
5. Verter la agarosa tibia en cada charola nivelada y esperar a que solidifique.
6. Remover cuidadosamente los peines y montar los geles con cada charola en las
cámaras de electroforesis.
7. Verter el TBE 0.5X en las cámaras hasta cubrir el gel (∼1 mm por encima del
gel).
8. Descongelar en hielo las muestras de ADN, y los marcadores de ADN.
9. En un segmento de ParafilmR M, mezclar las muestras de ADN, y los
marcadores de ADN con el amortiguador de carga 5X y agua Milli-QTM hasta un
volumen final de 12 μL.
! Calcular los volúmenes de ADN, agua y amortiguador de carga 5X para tener
cantidades finales de ADN de 1 μg/pozo, 500 ng de ARN/pozo y una
concentración final 1X del amortiguador de carga.
10. Utilizando la micropipeta, cargar lentamente los marcadores de ADN en el
pozo correspondiente al primer carril y ultimo carril de cada gel.
! No tocar el fondo del pozo con la punta para evitar perforar el gel. Evitar
burbujear con la micropipeta mientras se coloca la muestra para que esta no se
salga del pozo.
11. De la misma forma, cargar las muestras de ADN en los pozos siguientes
(registrar el orden de las muestras en los pozos).
12. Cerrar las cámaras de electroforesis y aplicar una corriente de 85 V.
! Si la Cámara se coloca adecuadamente, se observará la formación de burbujas
en los electrodos.
13. Cuando el azul de bromofenol, contenido en el amortiguador de carga, haya
migrado lo suficiente (∼. partes del gel), apagar la fuente de poder y sacar el gel
de la cámara.
14. Teñir los geles en una solución de agua Milli-QTM con bromuro de etidio (0.5
μg/mL) o SYBRR Green I 1X durante 30 min. Utilizar una charola específica para
la tinción y usar un volumen de agua suficiente para cubrir el gel. Si se utiliza
SYBRR Green I, la charola se debe proteger de la luz.
! El bromuro de etidio es un agente mutagénico y debe manejarse con cuidado,
utilice guantes para manipular cualquier material o solución que contenga este
químico. Hay que evitar que se derrame la solución de bromuro de etidio o la
solución de tinción o tener contacto directo con estas. En caso de derrame sobre
ojos y piel, lavar abundantemente con agua durante 15 minutos usando una ducha
de seguridad o un lavaojos. En caso de derrame, secar la zona con papel
absorbente y limpiar con abundante agua hasta eliminar toda traza de esta
sustancia. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un
recipiente especial para material contaminado con bromuro de etidio. La solución
de tinción puede ser re-usada varias veces durante un mes hasta descartarse en
un contenedor especial para su posterior descontaminación.
15. Examinar los geles en el transiluminador UV a 254 nm y fotodocumentar.
! La luz UV es mutagénica, por lo que su exposición debe ser mínima y empleando
siempre protección para cara, ojos y manos.
! Para análisis de ADN, el TBE 0.5X puede ser reutilizado hasta 5 veces. después
de su uso, colocarlo en una botella distinta a la del TBE que no se ha utilizado.

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