ANEXOS

Anexo 1
Propagacin In Vitro De Las Accesiones:

Se preparar Medio MS de acuerdo al protocolo establecido por Murashige and Skoog,
1962):
-25 ml medio MS se dispensar en frascos de vidrio de 200 ml de capacidad.
-la boca de los frascos se taparn con lminas de papel aluminio.
-los frascos con el medio MS sern esterilizados por 15 minutos a una presin de 15
PSI
-La propagacin se realizar a partir de los brotes juveniles de los tubrculos de las
papas recolectadas en campo previamente desinfectados en hipoclorito de sodio a una
concentracin de 0.1 % durante 20 minutos y aclarados dos veces en agua por 5
minutos cada uno.
- los brotes juveniles pasarn por un proceso de desinfeccin en alcohol potable al 70
% durante 10 segundos y colocados en 25 ml de agua destilada estril
-En la cmara de flujo laminar los brotes juveniles se los colocar en hipoclorito de
sodio a una concentracin de 1.6% por 5 minutos y aclarado dos veces por 2 minutos
respectivamente.
-Luego los brotes juveniles son colocados en una servilleta estril para eliminar el
exceso de humedad, y proceder a eliminar con ayuda de un bistur una pequea parte
de la base del brote por ltimo colocar el brote juvenil en el medio MS.
-Se realizar dos repiques una vez que los brotes juveniles de cada accesin ya
presenten yemas apicales y laterales de dos a tres centmetros.
Anexo 2
Determinacin de Ploida de las Accesiones recolectadas en campo:
Segn el Protocolo de Citometra de Flujo (Orillo M, Bonierbale M, 2009),
Se colectar aproximadamente 500 mg de hojas jvenes apicales

Colocar en 0.5 ml de buffer de extraccin (Cystain UV ploidy)
Picar muy suavemente y de arriba hacia abajo
Adicionar 1.5 de Cystain UV ploidy e incubar por cinco minutos.
Filtrar la muestra en filtros de 30m (Partec Cell Trics 30)
Colocar la muestra en el Clitmetro de Flujo
Citmetro de Flujo Ploidy Analyzer (PA) Partec I
Se establece los parmetros para la lectura de la muestra para plodas 2, 4 y
<4.
Caracterizacin de la cepa de Phytophthora infestans recolectada en el invernadero

de Biotecnologa Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrcolas para lo cual se utilizar
diferenciales de papa para ver cuantos genes de virulencia tiene la cepa. Segn
Manual del CIP.
Anexo 3
Preparacin del inculo de Phytophthora infestans (Fry, Shaw,Flier,W., 2007).
Tomar Hojas con tejido esporulado del campo, lavarlos en agua fresca y
colocarlas en cmara hmeda (Cajas Petri invertidas con agar agua) con el
envs hacia arriba.
Los platos son incubados a una temperatura de 15-18 C por 1 da o hasta
que aparezca una esporulacin fresca.
Pequeas piezas de tejido infectado de los bordes esporulados de las
lesiones son cortados y colocados en hojas sanas de papa en cmara
hmeda con agar agua
La cmara es incubada a una temperatura de 15 a 18 C por una semana,
hasta que hay abundante esporulacin sobre la hoja infectada.
Una vez obtenido el inculo se proceder a lavar la hoja con agua destilada y
el lquido obtenido ser pasado por un filtro por el cual nicamente pasarn
los esporangios.
El lquido que contiene los esporangios ser transferido a un vaso de
precipitacin y puesto a una temperatura de 5 C durante tres horas para
obtener zoosporas.
Anexo 4
Inoculacin de P. infestans en foliolos de las accesiones de Solanum spp en un
ambiente de cmara hmeda para medir el tamao de la lesin:
En una bandeja de aluminio colocar en capas 15 toallas absorbentes y aadir

300 ml de agua destilada
Sobre las toallas humedecidas colocar una malla de plstico
Sobre la malla de plstica colocar una hoja compuesta por por cinco foliolos
con el envs hacia arriba ( tres accesiones por bandeja)
Colocar con una micropipeta 20 ul del inculo a una concentracin de 15000
esporangios/ml en cada foliolo
Cubrir la bandeja con una funda plstica para mantener la humedad relativa
a una temperatura de 18 C
Tomar los datos a partir del tercer da de la inoculacin hasta que los foliolos
queden completamente invadidos por el patgeno segn sea el caso. Se
medir el d1 y d2 de la mancha y se aplicar la frmula del rea de la elipse
=3,1416*(d1*d2)/4
Anexo 5
AMPLIFICACIN DE REGIONES MICROSATLITES
Extraccin del ADN (Arahana V, Enrquez M, Escobar J., 2010):
Pesar 0.125 g de hojas jvenes de cada accesin in vitro.

Colocar las hojas en un mortero y se agregar 800 ul de buffer de extraccin
(2X CTAB).
Triturar las hojas lo ms finamente posible, con el pistilo.
Transferir los extractos desde los morteros a su respectivo tubo eppendorf de
1.5 ml previamente rotulados con un cdigo.
Se incubarn los tubos en bao Mara a 62 C por 45 minutos a una hora.
Se agregarn 600 ml de la mezcla cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) y
agitar vigorosamente hasta que adquiera un aspecto lechoso.
Dejar reposar el tubo por 5 minutos sobre la mesa.
Centrifugar a 13000 rpm por 10 minutos.
Colectar el sobrenadante con una micropipeta, sin tocar la interfase
blanquesina, y transferirlo a un tubo eppendorf limpio.
Agregar 600 ul de isopropanol fro e invertir el tubo eppendorf varias veces
hasta observar una especie de hilos que se condensan (el ADN).
Transferir el ADN a otro tubo usando una punta de micropipeta de boca
ancha. (Si no se condens el ADN, centrifugar por 1 minuto a 12000 rpm).
Lavar el ADN con 1000 ul etanol al 75%. Eliminar el exceso de etanol y dejar
secar por 5 a 10 minutos.
Resuspender al ADN con 50 ul de TE y guardarlo en refrigeracin o
congelacin
Anexo 6
Cuantificacin de ADN mediante espectrofotometra UV:
Colocar 3ml de agua destilada en las dos cubetas de cuarzo

Aadir 5 l de dH2O o TE en una de las cubetas (blanco)
Encerar el espectrofotmetro en 260 y 280 nm de longitud de onda
Aadir 5 l de la muestra de DNA en la segunda cubeta
Leer la absorbancia de la muestra en el espectrofotmetro a 260 y 280nm.
Calcular la concentracin del DNA y su calidad
Guardar las muestras de DNA a -20oC.
Anexo 7
Condiciones de la amplificacin de SSR (Ghislain M,Spooner D. M, Rodrguez F,
Villamn F, Nez J, Vsquez C, Waugh R, Bonierbale M, 2003):
Las reacciones de PCR sern realizadas en un volumen dde 20 ul que contiene 100
mM Tris HCl, 20 mM (NH4)2SO4, 2.5 mM MgCl2,0.2 mM de cada dNTP,0.5uM de cada
primer (derecho y revs), 1 unidad de Taq Polimerasa y 10 ng de ADN genmico.
La reaccin de PCR ser llevada en un termociclador establecido en el siguiente
programa: 3 min a 94 C, 2 min a temperatura de Hibridacin (Ta), 1 min 30 s a 72 C,
29 ciclos de 1 min a 94 C, 2 min a (Ta), 1 min 30 s a 72 C con un paso de extensin
final de 5 min a 72 C.
Los productos de la amplificacin sern detectados por electroforesis en gel de
polyaclilamida

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Anexo 1

Propagacin In Vitro De Las Accesiones:

Se colectar aproximadamente 500 mg de hojas jvenes apicales

Caracterizacin de la cepa de Phytophthora infestans recolectada en el invernadero

En una bandeja de aluminio colocar en capas 15 toallas absorbentes y aadir

Pesar 0.125 g de hojas jvenes de cada accesin in vitro.

Colocar 3ml de agua destilada en las dos cubetas de cuarzo

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