Gi 3 Práctica Aislamiento de Adn de Celulas Eucariontes

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
ASIGNATURA: GENÉTICA BÁSICA
Práctica 3. AISLAMIENTO DE ADN DE CELULAS EUCARIONTES
Introducción
La extracción de ADN de células eucariotas se basa en los mismos
principios que aquellos descritos para las células procariotas, sin embargo a
diferencia de las bacterias, las células eucariotas también requieren la eliminación
de la membrana nuclear para liberar los ácidos nucleícos, lo cual no implica
mayores complicaciones. Para la extracción de ADN, animal o vegetal, se puede
disponer de una gran variedad de tejidos y por lo general en cantidades pequeñas.
Los procedimientos han sido depurados y por lo general no existen grandes
problemas que impidan hacer extracciones exitosas. El análisis de ADN de células
eucariotas es ampliamente requerido, no solo para el conocimiento del número de
bases y orden de sus secuencias (genómica), sino con otros muchos fines que
incluyen aspectos tan importantes como la taxonomía, la evolución, la genómica
comparativa, la Ingeniería genética entre otros campos de la biología.
Existen un gran número de procedimientos para extracción de ADN.

Estos varían de acuerdo al tejido del que se hace la extracción, el grado de pureza
que se requiere y los fines que se persiguen. En la actualidad es posible obtener
muestras de ADN de huesos, manchas de sangre, semen, saliva, lo que ha
permitido que los estudios de ADN se conviertan en herramientas importantes
para la medicina legal y forense, así como para la criminalística.
Aunque es posible disponer de procedimientos comerciales, rápidos y

efectivos, las técnicas de extracción tradicionales siguen siendo extensamente
utilizadas en los laboratorios.
Objetivo: Realizar extracciones de ADN de células eucariotas (a partir de tejido

animal y vegetal) y comprobar su presencia por medio de espectrofotometría y
electroforesis en geles de Agarosa.
Método 1: SANGRE PERIFÉRICA
Materiales, equipo y reactivos
 3 tubos de plástico 12 ml
 Pipeta Pasteur
 Ultracentrífuga
 Agua destilada
 Sangre 3 ml.
 Isopropanol frío
 Varilla de vidrio
 Tubos Eppendorf de 0.2, 0.5, 1.5 y 2 µl
 Tritón X-100 al 1%
 SDS al 1%
 NaCl 0.1 M
Procedimiento:
1. Centrifugar 2.5 ml de sangre (fresca de preferencia) con anticoagulante

para separar el plasma de los elementos formes de la sangre. Separar con
una pipeta Pasteur la capa blanca (células blancas) entre plasma y los
eritrocitos. Llevar las células blancas a un tubo de centrífuga y agregar 10
ml de agua. Tapar el tubo con un tapón de hule e invertir el tubo 3 veces.
2. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm. y decantar el sobrenadante.
3. Al sedimento (pequeño botón blanco) se le agrega 10 ml de Tritón X-100 al
1%. Tapar el tubo y agitar suavemente de manera constante durante unos
minutos.
4. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm. Decantar el sobrenadante
5. Al sedimento se le agregan 10 ml de SDS al 1% (agitar suavemente
teniendo cuidado de que quede bien resuspendido). Vaciar en un matraz y
agitar suavemente durante unos minutos más.
6. Agregar 10 ml de NaCl 0.1 M. Agitar y dejar reposar unos minutos
7. Se le agrega 10 ml de isopropanol frío permitiendo que se desplace por las
paredes del tubo. Al cabo de unos
minutos, observar cómo se precipitan
los filamentos de ADN
8. Si no se alcanza a observar los
filamentos de ADN a simple vista, repita
el paso 5.
9. Colectar el ADN con una varilla de
vidrio (girándola suavemente) y
resuspender en ependorf que será
proporcionado por el auxiliar.
10.El ADN aislado se guarda a –20ºC,
resuspendido en agua para ser
utilizado en la práctica de electroforesis
de ácidos nucleicos.
Método 2: HIGADO DE RES O DE POLLO
Materiales, equipo y reactivos:
 Pipetas de 3 ml.
 Tubos eppendorf de 0.2, 1, 1.5 y 2 µl
 Hígado de pollo.
 Tubos de plástico
 SDS al 1%
 Hidróxido de sodio
 Mortero y pistilo
 Isopropanol helado.0.2N
 Puntas de micropipetas de 10, 200 y 1000 µl
Procedimiento
1. Se toman 2 gramos de hígado de pollo y se colocan en el mortero, se

agregan 6 ml de NaOH 0.2N y 6 ml de SDS 1%. Se macera el tejido
fuertemente.
2. Se transfiere el macerado a un par de tubos de plástico equitativamente y
se le agrega a cada tubo 3 ml de NaOH 0.2N y 3 ml de SDS 1% y se agita
con la varilla de vidrio hasta homogenizar el macerado.
3. Se deja reposar por 12 minutos.
4. Se centrífuga a 4 000 r.p.m x 10 minutos (verificar que los tubos no toquen
el rotor).
5. Se transfiere el sobrenadante a otro tubo y se descarta el precipitado.
6. Al sobrenadante se le agregan 3 ml de isopropanol helado. Se agita
volteando el tubo suavemente 2 veces. Se observara la presencia de un
consensado blanco en todo el tubo.
OPCIONAL. Se puede refrigerar en este paso por 1 minuto en congelador si no se

observan bien las fibras.
7. Se toman 1.5 ml de este condensado y se colocan en un tubo eppendorf, se

centrífuga a 13 000 rpm x 30 segundos.
8. Se descarta sobrenadante y se deja secar el precipitado invirtiendo el tubo
en papel secante.
9. Se le agregan 150 µl de agua destilada y se da vórtex hasta homogenizar el
precipitado, se refrigera a –20°C. Para realizar la electroforesis.
Método 3:
ADN DE CEBOLLA
 Cebolla rebanada
 Licuadora de plástico
 Tubos de ensayo
 Tubos eppendorf
 Palillos de madera
 Sol. Lisis (jabón)
 Soporte universal
 Embudo para filtro
 Isopropanol
 Filtros
 Tubos de centrífuga de 50 ml
Procedimiento:
1. Corte la cebolla y ponga en la licuadora.

2. Agregue 60 ml de agua.
3. Licuar 30 segundos en bajo para moler la cebolla.
4. Licue la mezcla 10 segundos, haga una pausa y verifique si hay una
partícula grande y licue si es necesario.
5. Repita el cuarto paso dos veces. La cebolla debe estar liquida ahora.
6. Ponga 7 ml de mezcla de la cebolla en el tubo de 15 ml.
7. Agregue 7 ml de la solución para Lisis celular; invirtiendo la mezcla. No
agite.
8. Colocar en baño maría a 60-65ºC por 15 min.
9. Colocar un filtro en el tubo de 50 ml. Agregue despacio la mezcla lisada de
cebolla en el filtro. Permita que el líquido rosa se filtre por goteo en el tubo.
10.Agregue lentamente un volumen de solución de precipitación de ADN
(etanol) previamente enfriada dejándolo caer sobre las paredes del tubo.
Precaución: ADN no puede deshacerse en carrete si la precipitación de ADN se

mezcla con la solución del filtro. Sostenga el tubo a un ángulo ligero, vierta la
solución de la precipitación suavemente, poniendo de lado el tubo para asegurarse
que no se salpique el filtro.
11.La solución de la precipitación de ADN clara dividirá la mezcla. Los filtrados

rosas claros, estarán en el fondo de la mezcla, y el ADN de la solución de la
cebolla aparecerá en la interfase de la solución del ADN y el filtrado. El
ADN se parecerá una fina nube de hilos viscosos.
12.Use la varilla de madera y girándolo suavemente forma un carrete de la
nube de ADN. Colócalo en un tubo eppendorf.
Método 4: GERMINADO DE ALFALFA

 Pipetas de 3 ml.
 Germinado de alfalfa
 Hidroxido de sodio 0.2N
 Tubos de plástico
 SDS al 1%
 Tubos eppendorf de diferente tamaño
 Micropipetas
 Isopropanol helado
 Microcentrífuga
 Mortero con brazo
 Punta de micropipeta
Procedimiento:
1. Se toman 2 gramos de germinado de alfalfa y se colocan en el mortero,
se agregan 3 ml de NaOH 0.2N y 3 ml de SDS 1%. Se macera el
germinado fuertemente.
2. Se transfiere el macerado a un par de tubos de plástico equitativamente y
se le agrega a cada tubo 3 ml de NaOH 0.2N y 3 ml de SDS 1% y se
agita con la varilla de vidrio hasta homogenizar el macerado.
3. Se deja reposar por 10 minutos.
4. Se centrífuga a 4 000 rpm x 10 minutos (verificar que los tubos no toquen
el rotor).
5. Se transfiere el sobrenadante a otro tubo y se descarta el precipitado.
6. Al sobrenadante se le agregan 2 ml de isopropanol helado. Se agita
volteando el tubo suavemente 2 veces. Se observara la presencia de un
consensado blanco en todo el tubo.
OPCIONAL. Se puede refrigerar en este paso por 1 minuto en congelador
si no se observan bien las fibras.
7. Se toman 1.5 ml de este condensado y se colocan en un tubo eppendorf,
se centrífugo a 13 000 rpm x 1 minuto.
8. Se descarta sobrenadante y se deja secar el precipitado invirtiendo el
tubo en papel secante.
9. Se le agregan 100 µl de agua destilada y se da vórtex hasta homogenizar el
precipitado, se refrigera a –20°C. Para realizar la electroforesis.
Bibliografia
Winchester A.M, Wejks N., Peter J. 1996, Laboratory Manual Of Genetics, Mc

Graw Hill, 4ta Edicion, Usa
Griffiths J. F. Anthony., Gelbart M. William., Miller H. Jeffrey., Lewontin C.
Richard.
Rosas M. L., 1990, Manual De Investigaciones De Laboratorio Y Campo
Para El Curso De Biologia 1, Unam, Mexico D.F. Pags 61
Resultados
1. Método 1
2. Método 2
3. Método 3
4. Método 4
Cuestionario
1. Menciona que precauciones se deben tomar para realizar un análisis de

ADN confiable en casos clínicos o legales.
2. Que consideraciones existen para el transporte y almacenamiento de
ADN de un sitio de un crimen a un laboratorio para ser analizado.
3. Explica cómo es posible obtener ADN de una colilla de cigarro o de un cabello
humano para la identificación de un individuo.
4. El análisis de ADN puede tener muchas aplicaciones en diferentes campos de
la biología de cualquier organismo vivo. Menciona cinco ejemplos donde los
estudios de ADN hayan aportado información relevante en cualquier aspecto
relacionado con la especie.
5. Conociendo los fundamentos de la extracción de ADN de células eucariotas,

diseña un experimento casero que te permita obtener ADN de tejidos vegetales
o animales, valiéndote de insumos que se encuentren en tu casa.

Gi 3 Práctica Aislamiento de Adn de Celulas Eucariontes

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Gi 3 Práctica Aislamiento de Adn de Celulas Eucariontes

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Gi 3 Práctica Aislamiento de Adn de Celulas Eucariontes

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD DE CORDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

Práctica 3. AISLAMIENTO DE ADN DE CELULAS EUCARIONTES

Existen un gran número de procedimientos para extracción de ADN.

Aunque es posible disponer de procedimientos comerciales, rápidos y

Objetivo: Realizar extracciones de ADN de células eucariotas (a partir de tejido

Método 1: SANGRE PERIFÉRICA

Materiales, equipo y reactivos

1. Centrifugar 2.5 ml de sangre (fresca de preferencia) con anticoagulante

Método 2: HIGADO DE RES O DE POLLO

Materiales, equipo y reactivos:

1. Se toman 2 gramos de hígado de pollo y se colocan en el mortero, se

OPCIONAL. Se puede refrigerar en este paso por 1 minuto en congelador si no se

7. Se toman 1.5 ml de este condensado y se colocan en un tubo eppendorf, se

Materiales, equipo y reactivos:

1. Corte la cebolla y ponga en la licuadora.

Precaución: ADN no puede deshacerse en carrete si la precipitación de ADN se

11.La solución de la precipitación de ADN clara dividirá la mezcla. Los filtrados

Método 4: GERMINADO DE ALFALFA

Materiales, equipo y reactivos:

Winchester A.M, Wejks N., Peter J. 1996, Laboratory Manual Of Genetics, Mc

1. Menciona que precauciones se deben tomar para realizar un análisis de

5. Conociendo los fundamentos de la extracción de ADN de células eucariotas,

También podría gustarte