GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

LABORATORIO DE PRODUCCIÓN VEGETAL (2006)

Tecnicatura en Laboratorio / Lic. en Biotecnología

 LABORATORIO DE PRODUCCIÓN VEGETAL - 2006
Guía de Trabajos Prácticos

Normas generales de seguridad de trabajo en Laboratorio

Se presentan las Normas generales de Seguridad para los estudiantes que realicen prácticas
en los Laboratorios de la UNAHUR. El objeto de las mismas es generar en los estudiantes los
conocimientos necesarios para trabajar de manera segura, cuidando así a su persona, a sus
compañeros y docentes, a las instalaciones y a toda la comunidad de la Universidad en
general.

1. Antes de realizar la práctica

Antes de cada práctica, los docentes a cargo entregarán a los estudiantes la guía
correspondiente, en la cual encontrarán toda la información necesaria para su correcta
ejecución. Previo a cada práctica, es responsabilidad de los estudiantes realizar una lectura
crítica del material aportado por los docentes para tomar conocimiento de los
procedimientos a realizar y de los potenciales peligros que conlleve la práctica:

1- Leer detenidamente la práctica que figura en la guía

2- Identificar los objetivos y el procedimiento. Hacer un esquema de las acciones a llevar
adelante.
3- Identificar los reactivos involucrados en la práctica.
4- Buscar las hojas de seguridad correspondientes a los reactivos y leerlas críticamente.
5- Detectar los potenciales riesgos que podrían surgir en la operatoria de la práctica.

Dentro del laboratorio, previo a la realización de la práctica, lxs docentes a cargo explicarán
los procedimientos y los estudiantes deben evacuar todas las dudas relacionadas a las
acciones a llevar a cabo. Es importante que los estudiantes tomen conciencia de que el
análisis previo de la práctica les permitirá obtener los resultados esperados y prevenir
accidentes, además de una mejor posibilidad de toma de decisiones.

2. Durante la práctica
Cada práctica a ser ejecutada posee sus propios riesgos particulares, los cuales serán
explicados por los docentes. Sin embargo, existen una serie de pautas de conducta que los
estudiantes deben seguir en términos generales para proteger tanto la salud personal como
la de los compañeros, docentes y la comunidad en general, así como para evitar accidentes y
episodios de contaminación, tanto dentro del ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las
recomendaciones generales aquí indicadas resultan de un conjunto de prácticas de sentido
común. Resulta clave en este punto trabajar de manera calma y respetuosa y en todos los
casos deben seguirse las indicaciones del docente responsable a cargo y en caso de duda
siempre consultar.

Recomendaciones generales
1. No está permitido a los estudiantes trabajar solos fuera de las horas normales previstas.
2. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad tales como: matafuegos,
salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos, gabinetes para contener derrames,
etc.
3. No se permitirá comer, beber o maquillarse, a fin de evitar la inhalación, la ingestión y/o
el contacto con sustancias tóxicas.
4. Está prohibido fumar, entre otras razones porque en el laboratorio existen elementos
inflamables o explosivos, algunos de alto riesgo por su volatilidad. Además, el olor del
cigarrillo podría enmascarar olores que nos adviertan de potenciales peligros o que nos
sirvan para la identificación de sustancias.
5. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan
drogas.
6. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa
de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares de uso común.
7. Las mesadas de trabajo deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni objetos
personales. En éstas únicamente estará el material de la práctica y el cuaderno de
laboratorio.
8. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de
laboratorio y antes de retirarse del mismo.
9. No se permitirá correr en los laboratorios.
10. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas, equipos,
máquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación.
11. Toda herida o abrasión, aún los pequeños cortes, deben ser informados al docente. Los
laboratorios cuentan con botiquín de primeros auxilios para atender casos de
emergencia.
12. Respete las señales de advertencia.
13. Está terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el docente. No
sustituir nunca un producto químico por otro en una práctica. Si se debiera alterar o
modificar la realización de una experiencia, consulte primero al docente o personal
auxiliar del laboratorio.
14. Se sugiere tener la vacuna antitetánica al día.

Elementos de protección personal

15. Se debe utilizar vestimenta apropiada: guardapolvo abrochado (preferentemente de
algodón y de mangas largas), y zapatos cerrados. Evitar el uso de accesorios colgantes
(aros, pulseras, collares, etc.) y usar el cabello recogido.
16. Cuando la práctica lo requiera se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el
contacto con sustancias químicas o material biológico. Las personas cuyos guantes se
encuentren contaminados no deberá tocar sus mejillas, objetos o superficies tales
como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
17. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se
utilizarán anteojos de seguridad u otro dispositivo de protección. Cuando se manipulen
productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el
uso de lentes de contacto.

Gestión de residuos en el laboratorio

18. Todo residuo generado deberá colocarse en los recipientes destinados para tal fin,
indicados por el docente a cargo previo a la ejecución de la práctica.
19. No se devolverá reactivo sobrante de un ensayo al frasco general dado que se
contaminaría, y porque podría provocar una reacción no deseada, con consecuencias tal
vez peligrosas.
20. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Se deberá informar
al docente para que disponga correctamente del mismo.

Procedimientos de trabajo
21. No se permitirá pipetear con la boca. Tampoco se permitirá probar el sabor de ningún
producto químico.
22. Para percibir el olor de una sustancia nunca se colocará la nariz directamente sobre la
boca del recipiente, sino que se abanicará con la mano dirigiendo vapor hacia la nariz.
23. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, y que puedan ser
riesgosas por inhalación, deben llevarse a cabo bajo campana.
24. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de
ignición. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llama directa o
cerca de la misma.
25. No utilizar el contenido de un recipiente que no esté identificado. Los envases que
contengan agentes químicos estarán adecuadamente etiquetados
26. Se deben extremar los cuidados al abrir un frasco que contenga gases en equilibrio con la
solución, como el ácido clorhídrico, ácido nítrico y en especial, amoníaco. Estos frascos
deber abrirse con sumo cuidado y apuntando el tapón hacia donde no haya nadie.
27. No se calentarán líquidos en recipientes de vidrio no resistentes al calor.
28. Cuando se caliente un líquido en un tubo de ensayo, se tomará el tubo con una pinza de
madera, inclinándolo 45° y se calentará por la parte más alta donde llegue el líquido,
nunca por el fondo del tubo. De no hacerlo así, el líquido podría proyectarse
violentamente. La boca del tubo debe ubicarse en dirección opuesta al operador y a sus
compañeros.
29. Nunca debe dejarse material de vidrio caliente sobre la mesa de trabajo. A diferencia de
otros materiales, el vidrio caliente tiene el mismo color que el vidrio frío, y al tocarlo
inadvertidamente puede ocasionar severas quemaduras.
30. No se debe utilizar material de vidrio roto o con rajaduras. Podría fracasar la experiencia
y/o producir lesiones. El material de vidrio en malas condiciones debe ser descartado.
31. No utilizar equipos sin haber recibido entrenamiento previo y sin supervisión durante su
uso. No se puede conectar ningún equipo a la red eléctrica sin la autorización del
docente.

Al terminar las prácticas de laboratorio, la mesada deberá quedar limpia, los reactivos
utilizados ordenados, y las llaves de gas y de agua, cerradas. Se realizará la limpieza del
material utilizado de acuerdo a los procedimientos indicados por los docentes.

3. Acciones en caso de emergencias

Frente a un accidente o incidente, de aviso inmediatamente al docente. Es más grave el
ocultamiento o mentira respecto del hecho, que su ocurrencia. Los responsables de
determinar los procedimientos frente a una situación de emergencia serán lxs docentes a
cargo, por lo que en dicho caso resultará de suma importancia seguir sus instrucciones.

Emergencias médicas
En caso de una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental
de algún producto químico, tóxico o peligroso, tanto propio como de un compañero, dar
aviso de inmediato al docente o responsable a cargo.

Incendio
En caso de observar un foco de incendio, debe mantenerse la calma. Lo más importante es
ponerse a salvo y dar aviso a los demás. Si hay alarma, debe accionarse, en caso contrario,
gritar para alertar al resto. El docente a cargo determinará el procedimiento a llevar
adelante. Siga sus instrucciones para llevar a cabo la evacuación por la ruta asignada. No
correr, caminar rápido. No llevar consigo objetos, pueden entorpecer la salida. Al salir, no
volver a entrar.

Derrame de productos químicos

Se debe notificar al docente o responsable a cargo para que lleve adelante el procedimiento
de limpieza adecuado. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición
y las fuentes de calor. Evite respirar los vapores del material derramado.
 Trabajo Práctico N°1 Parte A
Procedimiento para preparar una solución madre de MS

Objetivos:

Conocer los componentes del medio Murashige-Skoog (MS) y preparar las soluciones salinas
que lo constituyen.

Preparar soluciones de una auxina y una citocinina.

Materiales:

Balanza analítica, vasos de precipitado y matraces, Erlenmeyer, frascos para almacenar

soluciones, microtubos, varillas de vidrio, heladera, freezer, agua ultrapura / ósmosis, drogas
pro análisis.

Procedimiento:

La solución salina de Murashige y Skoog (1962) se prepara de la siguiente manera:

Solución Nº1: Macronutrientes y micronutrientes:

1. En una probeta colocar 1000 ml de agua ultrapura / ósmosis.

2. Pesar, añadir y agitar hasta disolver (uno a uno), los siguientes compuestos

NOTA: Para preparar soluciones concentradas se debe multiplicar los valores de referencia para 1
litro por un factor X (de concentración). Luego, para calcular la concentración de uso de ese
concentrado, se debe dividir los ml preparados por el factor X de concentración.

Macronutrientes 10X (para uso de 100 ml/l)

NO3NH4……………………………… 16,50 gr/l

NO3K………………………………….. 19,00 gr/l

Cl2Ca.2H2O………………………….. 4,40 gr/l

SO4Mg.7H2O……………………….. 3,70 gr/l

PO4H2K………………………………… 1,70 gr/l

Micronutrientes 50X (para uso de 20 ml/l)

H3BO3………………………………….. 0,31 gr/l

SO4Mn.4H2O……………………….. 1,115 gr/l

SO4Zn.4H2O…………………………..0,43 gr/l

IK………………………….………………. 0,0415 gr/l

MoO4Na2.2H2O…………………… 0,0125 gr/l

SO4Cu.6H2O………………………….0,00125 gr/l

Cl2Co.6H2O…………………………. 0,00125 gr/l

3. Envasar, rotular y colocar la solución en la heladera.

Solución Nº2: Quelato de hierro 10X (para uso de 100 ml/l)

1. Pesar 0,373 gr de Na2 EDTA y disolver en 350 ml de agua ultrapura / ósmosis, con calor.

2. Pesar 0,278 gr de FeSO4 7H2O y disolver en 350 ml de agua ultrapura / ósmosis, con calor.

3. Mezclar ambas soluciones y completar el litro.

4. Envasar en un frasco acaramelado, rotular y colocar la solución en la heladera.

Solución Nº3: Vitaminas 1000X (para uso de 1 ml/l)

1. En una probeta colocar 1000 ml de agua ultrapura / ósmosis.

2. Pesar, añadir y agitar hasta disolver (uno a uno), las siguientes vitaminas:

Glicina…………………………. 0,020 gr/l

Ac. Nicotínico……………… 0,5 gr/l

Tiamina………………………. 0,1 gr/l

Piridoxina……………………. 2 gr/l

Mio inositol se agrega directamente al preparar el medio de cultivo………… 0.1 gr/l

3. Envasar, rotular y colocar la solución en la heladera.

Solución Nº4: AUXINAS: (IBA) Ácido indolbutírico 1 mg/ml

1. Disolver 10 mg de hormona con gotas de NaOH 1 N con pipeta pasteur.

2. Agitar y agregar 10 ml de agua ultrapura / ósmosis.

3. Fraccionar en 1 ml (uso) y guardar en freezer (-20°C).

Solución Nº5: CITOCININAS: (BAP) 6-benzilaminopurina 1 mg/ml

1. Disolver 25 mg de hormona con gotas de NaOH 1N con pipeta pasteur.

2. Agitar hasta disolver bien y agregar 25 ml de agua ultrapura / ósmosis.

3. Fraccionar en 1 ml (uso) y guardar en freezer (-20°C).

ANEXO I: Componentes del MEDIO MURASHIGE SKOOG
ANEXO II: Nombre compuestos químicos
ANEXO III: Equivalencias en concentraciones de reguladores de crecimiento
 Trabajo Práctico N°1 Parte B
Procedimiento para preparar medio de cultivo MS

Objetivos:

Conocer la dinámica para preparar un medio de cultivo base, sus componentes y

esterilización.

Materiales:

Soluciones madres preparadas en la Parte A o polvo comercial de medio de cultivo MS

(completo).

Sacarosa, agar.

Balanza granataria y/o analítica, vasos de precipitado y probetas, varillas de vidrio, agua
ultrapura / ósmosis. Agitador, microondas, pH metro, soluciones KOH y HCl 1N.

I) Procedimiento a partir de soluciones madres, para 1 LITRO DE MEDIO:

1. Pesar en una balanza 30 gr de sacarosa, 7 gr de agar y 0.1 gr de mio inositol.

2. En un vaso de precipitados de 1 litro agregar 300 ml de agua ultrapura / ósmosis (PH 7).

3. Agregar 100 ml de la solución madre de macronutrientes, 20 ml micronutrientes de MS,

agitar; 100 ml de la solución de quelato de hierro, agitar y 1 ml de la solución de vitaminas
de MS, agitar. Incorporar el mio inositol. Agitar

4. Agregar la sacarosa. Mezclar en agitador o con una varilla de vidrio hasta disolver todo
completamente.

5. Aforar a 900 ml

6. Ajustar el pH en 5.6 con gotas de KOH 1N o 0.5N. Aforar a 1000 ml.

7. Agregar el agar, agitar.

8. Cocinar el medio de cultivo en el microondas, durante 10 o 12 minutos aproximadamente

en períodos de 2-3 minutos cada uno (al finalizar cada período se mezcla con varilla de
vidrio).

NOTA: Es muy importante cuidar de no llegar a ebullición. Al momento que se empiezan a

notar burbujas, se debe retirar del microondas (con guantes de aislamiento térmico) y
revolver con la varilla de vidrio.
Realizar este procedimiento hasta que no visualicen restos de agar sin disolver.

9. Una vez finalizada la cocción dispensar el medio de cultivo en tubos/frascos. Si se utilizan

tubos, colocar aproximadamente 10 ml de medio por tubo. Si se utilizan frascos, entre 20 y
30 ml.

Taparlos con papel aluminio y ajustar el papel al borde del tubo/frasco.

NOTA: el medio estará muy caliente. Es muy importante usar protección térmica en todo
momento.

10. Colocar los tubos/frascos dentro del autoclave (verificar que tenga agua suficiente) y
autoclavar durante 20 minutos a 120ºC y 1 atmósfera de presión.

II) Procedimiento a partir de polvo comercial (mezcla de sales y vitaminas), para 1 LITRO
DE MEDIO:

1. Pesar la cantidad de polvo indicada por el fabricante (ver etiqueta del frasco).

2. Pesar en una balanza 30 gr de sacarosa y 7 gr de agar.

3. En un vaso de precipitados de 1 litro colocar 900 ml de agua ultrapura / ósmosis (PH 7) y

agregar el polvo de MS. Luego agregar la sacarosa. Mezclar en agitador o con una varilla de
vidrio hasta disolver todo completamente.

4. Ajustar el pH en 5.6 con gotas de KOH 1N o 0.5N. Aforar a 1000 ml.

5. Agregar el agar, agitar.

6. Cocinar el medio de cultivo en el microondas, durante 10 o 12 minutos aproximadamente

en períodos de 2-3 minutos cada uno (al finalizar cada período se mezcla con varilla de
vidrio).

NOTA: Es muy importante cuidar de no llegar a ebullición. Al momento que se empiezan a

notar burbujas, se debe retirar del microondas (con guantes de aislamiento térmico) y
revolver con la varilla de vidrio.

Realizar este procedimiento hasta que no visualicen restos de agar sin disolver.

7. Una vez finalizada la cocción dispensar el medio de cultivo en tubos/frascos. Si se utilizan

tubos, colocar aproximadamente 10 ml de medio por tubo. Si se utilizan frascos, entre 20 y
30 ml.

Taparlos con papel aluminio y ajustar el papel al borde del tubo/frasco.

NOTA: el medio estará muy caliente. Es muy importante usar protección térmica en todo
momento.

8. Colocar los tubos/frascos dentro del autoclave (verificar que tenga agua suficiente) y
autoclavar durante 20 minutos a 120ºC y 1 atmósfera de presión.

IMPORTANTE: este procedimiento es para 1 litro de medio MS. La cantidad a preparar

para el TP se resolverá durante la misma práctica. Tener en cuenta realizar los cálculos en
función de la cantidad determinada.
 Trabajo Práctico N°1 Parte C
Procedimiento para preparar medio de cultivo MS con reguladores de
crecimiento

Objetivos:

Conocer la dinámica para preparar un medio de cultivo base con reguladores de crecimiento
termoestables.

Materiales:

Medio MS previamente preparado en el TP N°1 parte B.

Soluciones stock de reguladores de crecimiento: ácido naftalenacético (ANA) 1 mg/ml y

bencilaminopurina (BAP) 1 mg/ml.

Micropipetas y tips.

Tratamientos con reguladores (A DETERMINAR DURANTE LA PRÁCTICA):

……………………………………………….
……………………………………………….
……………………………………………….
……………………………………………….

Procedimiento desde MS sin reguladores:

1. Colocar una cantidad (ml) determinada de medio MS en caliente en un vaso de

precipitados.

2. Tomar el tubo stock del regulador de crecimiento (1 mg/ml) a utilizar, y adicionarlo con
micropipeta según la concentración de uso determinada y previamente establecida (mg/l).

Para determinar el volumen que se necesita tomar del stock, utilizar la siguiente fórmula:

V1 x C1 = V2 x C2

donde:

V1 es volumen del regulador que se debe tomar del stock (ml), (incógnita)
C1 es la concentración stock del regulador (mg/ml)
V2 es el volumen del medio de cultivo a utilizar (ml)
Cf es la concentración de uso del regulador (mg/l)

finalmente, transformar el volumen obtenido en ml a µl.

teniendo en cuenta que: 1 ml = 1000 µl

3. Realizar esta ecuación para cada regulador y concentración de uso requeridas.

NOTA: recordar que el medio estará muy caliente. Es muy importante usar protección
térmica en todo momento.

4. Colocar los tubos dentro del autoclave (verificar que tenga agua suficiente) y autoclavar
durante 20 minutos a 120ºC y 1 atmósfera de presión.
 Trabajo Práctico N°2
Generación y Manipulación de explantes

Objetivos:

Experimentar la manipulación y acondicionamiento del material vegetal de partida

requeridas para una posterior introducción en condiciones in vitro.

Obtener explantes.

Simular la introducción de explantes en condiciones de cultivo.

Materiales:

Medio de cultivo “falso”: éste consistirá en una mezcla de agua con agar (sin nutrientes).

Material vegetal.

Pinzas, bisturí, tijeras, placas de petri de vidrio.

Procedimiento:

1. Utilizando tijeras, cortar segmentos nodales conteniendo 2 o 3 nudos. Utilizando las

mismas tijeras o el bisturí, recortar las hojas a la mitad, o remover completamente
cortando a la altura del pecíolo.
2. Con un bisturí, separar segmentos nodales dejando un nudo por segmento nodal y
separar porciones de entrenudos. En lo posible, realizar los cortes a 45 grados.
3. Por otro lado, utilizando tijeras separar hojas a la altura de los pecíolos. Utilizando el
bisturí, recortar y generar segmentos de aproximadamente 1 cm2.
4. Tomar los explantos con las pinzas e introducirlos de a uno en el recipiente con el
medio de cultivo.
5. Tapar los recipientes.
 Trabajo Práctico N°3
Introducción in vitro
Organogénesis

Objetivos:

Acondicionar el material vegetal de partida para su introducción.

Obtener explantes.

Introducir explantes en condiciones de cultivo en esterilidad.

Inducir la organogénesis directa/indirecta.

Materiales:

Material vegetal empleado (especie/s):

………………………………………………………………..

Medios de cultivo preparados en el TP N°1, esterilizado.

Material vegetal.

Solución de alcohol etanol 70%. Solución de hipoclorito de sodio (lavandina) 20%. Agua
bidestilada estéril. Tween 80 o Detergente comercial.

Material estéril: placas de petri de vidrio, papel de filtro, papel secante, pinzas, bisturí.

Material no estéril: vasos de precipitados, gasas, tijeras, rollo de film, esterilizador infrarrojo
o mechero de alcohol. Agitador.

Procedimiento para la preparación de soluciones desinfectantes:

Solución de alcohol etanol 70%:

Por cada 100 ml: Medir 70 ml de alcohol 96°. Llevar a volumen de 100 ml con agua
bidestilada

Solución de hipoclorito de sodio (lavandina) 20%:

Por cada 100 ml: Medir 20 ml de lavandina comercial (marca Ayudín, no menor a 35 g Cl/l).
Llevar a volumen de 100 ml con agua de ósmosis.
Agregar unas gotas de Tween 80 o detergente comercial.
Procedimiento para la desinfección del material vegetal:

6. Para explantos desde segmentos nodales, porciones de tallos conteniendo de 2 a 3

nudos. En lo posible, realizar los cortes a 45 grados. Recortar las hojas a la mitad, o
remover completamente cortando a la altura del pecíolo.
7. En caso de utilizar también hojas como explantos, separar hojas a la altura de los
pecíolos.
8. Colocar los explantos en un vaso de precipitados y taparlo con una gasa, ajustándolo
con una bandita elástica.
9. Incorporar agua de ósmosis y llevar el vaso a agitación durante 10 minutos.
10. Quitar el agua del vaso y agregar la solución de etanol al 70%. Dejar en inmersión con
agitación contínua durante 1 minuto.
11. Remover el alcohol, y agregar inmediatamente la solución de lavandina. Dejar en
inmersión con agitación contínua durante 15-20 minutos (revisar contínuamente el
estado de los explantos, evitando el “blanqueo” de los mismos).
12. Transferir el vaso de precipitados a la cabina de flujo laminar. Remover la lavandina y
descartar en un nuevo vaso de precipitados.
13. Enjuagar los explantos al menos 3 veces con agua destilada estéril. Conservar sólo
una mínima porción de agua del último enjuague y mantener allí a los explantos.

Procedimiento para la introducción en condiciones in vitro

1. Ir retirando las porciones de tallos y/o hojas del vaso con agua con las pinzas y
transferirlos a papel secante estéril. Una vez seco, transferirlo a una placa de petri de
vidrió estéril y comenzar a acondicionar el explanto.
2. Para esto, sosteniendo el explanto con una pinza y con un bisturí, retirar los extremos
de los tallos y bordes de las hojas que se vean blanqueados (por efecto de la solución
desinfectante).
3. Si se trabaja con tallos, con un bisturí realizar cortes a la altura de los entrenudos
separando de a un segmento nodal por explanto. Si se trabaja con hojas, utilizando el
bisturí cortar desde la parte central de la lámina de la hoja generando segmentos de
aproximadamente 1 cm2.
4. Sembrar cada segmento nodal / segmento de hoja (explanto) en un tubo de cultivo.
Cerrar el tubo con flim.
5. Repetir este último paso tantas veces como explantos haya. Tener en cuenta
esterilizar las pinzas y bisturíes cada vez que se siembra un explanto.
6. Finalizada la introducción, transferir los explantos a la cámara de cría.
7. Realizar observaciones periódicas, cada 2-3 días.
Plantilla para el control
Fecha de siembra:

Nro de explantos inicial:

Fecha Descarte Descarte Explantos Explantos Explantos

de por por viables con raíces con
control contami necrosis brotaciones
nación

Al finalizar el cultivo, obtener los % finales de cada columna

 Trabajo Práctico N°4
Subcultivos:
Multiplicación y Organogénesis indirecta

Objetivos:

Generar nuevos explantes a fin de aumentar el número de individuos.

Evaluar diferentes reguladores de crecimiento para observar sus efectos.

Evaluar la multiplicación de los explantes a fin de seleccionar el mejor tratamiento.

Observar la organogénesis in vitro a partir de un callo generador de brotaciones.

Materiales:

Material vegetal empleado (especie/s):

………………………………………………………………..

Medios de cultivo del TP N°1 esterilizados.

Tubos con plántulas in vitro.

Material estéril: placas de petri de vidrio, pinzas, bisturí.

Material no estéril: rollo de film, esterilizador infrarrojo o mechero de alcohol.

Procedimiento

1. Abrir el tubo en la cabina de flujo laminar y retirar con una pinza y con cuidado de no
romper/dañar los tallos.
2. Apoyar la plántula en una placa de vidrio estéril, y con ayuda de una pinza y bisturí, remover
las raíces y hojas dejando estos restos en una placa de descarte.
3. Para emplear segmentos nodales como explantes, cortar a la altura de los entrenudos y
separar segmentos nodales. Sembrar cada uno en un tubo con medio de cultivo fresco según
tratamiento a evaluar.
4. Para emplear hojas como explantes, seccionar la hoja desde la parte central de la lámina
obteniendo segmentos de 1 cm2. Sembrar cada uno en un tubo con medio de cultivo fresco
según tratamiento a evaluar.
5. Cerrar cada tubo con film.
6. Esterilizar las pinzas y bisturí de manera periódica.
7. Finalizado el subcultivo, transferir las plántulas a la cámara de cría y observar cada 3-5 días.
Plantilla para el control
Fecha de subcultivo:

Tratamiento:

Fecha Respuestas
de
control

Explantos Callos con Explantos Explantos Explantos

con Brotaciones con necrosados contamina
desarrollo Raíces dos
de callo

Fecha de subcultivo:

Tratamiento:

Fecha Respuestas
de
control

Explantos Callos con Explantos Explantos Explantos

con Brotaciones con necrosados contamina
desarrollo Raíces dos
de callo
Fecha de subcultivo:

Tratamiento:

Fecha Respuestas
de
control

Explantos Callos con Explantos Explantos Explantos

con Brotaciones con necrosados contamina
desarrollo Raíces dos
de callo

Fecha de subcultivo:

Tratamiento:

Fecha Respuestas
de
control

Explantos Callos con Explantos Explantos Explantos

con Brotaciones con necrosados contamina
desarrollo Raíces dos
de callo
Tasas de multiplicación Final (brotes/explanto) (si corresponde)

Tratamiento: ………………………………….
TM = ………………………………

Tratamiento: ………………………………….
TM = ………………………………

Tratamiento: ………………………………….
TM = ………………………………

Tratamiento: ………………………………….
TM = ………………………………
ANEXO IV: Equivalencias en concentraciones de reguladores de crecimiento
 Trabajo Práctico N°5
Enraizamiento y aclimatación de plántulas

Objetivos:

Generar raíces en las nuevas plántulas obtenidas. Transferir estas plántulas de condiciones in
vitro a ex vitro.

Materiales:

Material vegetal empleado (especie/s):

………………………………………………………………..

Tubos con plántulas in vitro, previamente enraizadas.

Sustrato para aclimatación: mezcla de turba-perlita-vermiculita (3:1:1)

Plugs, o macetas, o bandejas de plástico

Bolsas de polietileno

Agua

Procedimiento para iniciar la aclimatación

1. Preparar la mezcla de sustrato y remojarlo con una mínima cantidad de agua (debe
quedar lo suficientemente compacto sin que escurra agua).
2. Fraccionar la mezcla en plugs/ bandejas/macetas.
3. Realizar un pequeño hoyo en el sustrato.
4. Extraer las plántulas del tubo con mucho cuidado de no romper las raíces.
5. Lavar con agua las raíces hasta remover el agar que haya quedado adherido. Esto
debe hacerse con mucho cuidado.
6. Colocar cada plántula en los plugs o las macetas, procurando que las raíces queden
bien enterradas. Tapar el hoyo con sustrato.
7. En el caso de usar plugs: tapar con una cubierta polipropileno. En el caso de usar
macetas, colocar una bolsa de polietileno por sobre la maceta, ajustándola con una
banda elástica. En el caso de usar bandeja, si tienen tapa, tapar directamente; sino
cubrir con polipropileno.
8. Transferir las macetas a la cámara de cultivo o de aclimatación.
Procedimiento para continuar la aclimatación

1. Revisar periódicamente las bolsas hasta notar condensación de agua en las paredes.
2. Si se utilizaron plugs, remover la cubierta durante un período de tiempo. Volver a
tapar. Si se utilizaron macetas, día a día, realizar una pequeña incisión con bisturí en
cada bolsa.
3. Repetir este procedimiento hasta no detectar condensación. Llegado ese punto se
deben retirar las cubiertas o las bolsas.
4. Regar las macetas periódicamente

Procedimiento para transferencia final a invernáculo

1. Remojar el sustrato de transferencia y fraccionar en macetas.

2. Remover el sustrato de aclimatación y transferir las plántulas a las macetas con el
nuevo sustrato.
3. Regar las macetas periódicamente.