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    Unidad 4 - PCR

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    PCR

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    Unidad 4 - PCR

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    PCR

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    Unidad 4_PCR (1)

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    UNIDAD 4

    PCR
    ¿Para qué necesitamos realizar PCR?

    Técnica de BM específica, rápida, sensible y versátil que


    permite amplificar un fragmento de DNA de interés.

    2
    What natural process is PCR based on?
    • La PCR se vale de un proceso básico celular: LA REPLICACIÓN DEL DNA.

    3
    Replicación vs. PCR

    4
    Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4

    Amplificación
    exponencial
    in vitro

    Gen de interés: - - 2 copias 8 copias


    Otra longitud: 2 copias 4 copias 6 copias 8 copias

    9
    10
    Componentes de la reacción de PCR

    • gDNA o cDNA (RNA).


    • Primers (delimitar fragmento & 3’-OH).
    • Taq DNA pol (95ºC).
    • Mg+2 (reacción centro activo).
    • dNTPs (3’OH).
    • Termociclador (ciclos de Tº).

    11
    Taq DNA polimerasa
    • Temperatura óptima: 72ºC.
    • No tiene actividad 3’-5’ exonucleasa.

    Mg+2

    12
    Primers
    • Secuencia altamente específica.
    • Primer sentido (complementario a 3’-5’) (Forward).
    • Primer antisentido (complementario a 5’-3’) (Reverse).

    13
    Etapas de los Ciclos de PCR
    • Helicasa?? Desnaturalización

    • Primer sentido / Primer antisentido


    • Secuencia primers  Tº annealing

    14
    Etapas PCR
    • Etapa previa (95ºC): desnaturalizar todo el DNA.
    • Desnaturalización (95ºC) + Hibridación (55-65ºC) + Elongación (72ºC).
    • Etapa final (72ºC): elongar todos los fragmentos.

    15
    Visualización Resultados
    • Electroforesis en gel de agarosa para detectar el producto amplificado.

    16
    Aplicaciones de la PCR

    • Diagnóstico de enfermedades genéticas.


    • Rastreo de mutaciones, de SNPs.
    • Detección de infecciones bacterianas y virales.
    • Estudios de evolución molecular.
    • Estudios de medicina forense (DNA fingerprinting).
    • Preparación de muestras para Secuenciación.
    • Producción de sondas para Hibridación.
    • Terapia Génica.

    17
    PCR cuantitativa (qPCR, quantitative-PCR)
    • Amplificación de DNA + Detección en tiempo real.
    • En cada ciclo de PCR, se mide la intensidad de compuestos fluorescentes unidos al
    DNA de interés.

    18
    PCR cuantitativa (qPCR, quantitative-PCR)
    • Mide la velocidad a la que se forma el producto final.
    • Cuantifica el número de ciclos que han sido necesarios para alcanzar una cantidad
    mínima del DNA de interés.

    Muestras Cuanto mayor es la


    [DNA amplificado]

    Amplificadas concentración inicial de la


    muestra, antes se alcanza
    la cantidad mínima que el
    termociclador puede
    Umbral detección
    detectar (Ct).

    19
    PCR vs. qPCR

    20
    ¿PCR para RNA?

    21
    RT-PCR (retrotranscriptase-PCR)
    • Se extrae el RNA (mRNA – expresión génica, genoma RNA viral).
    • Transcriptasa reversa sintetiza cDNA (DNA complementario al RNA molde).
    • El cDNA se utliza para la PCR.

    1 2

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