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    PCR en Tiempo Real

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    Este documento describe la técnica de PCR en tiempo real (qPCR), comparándola con la PCR convencional. La qPCR monitorea la fluorescencia emitida durante cada ciclo, permitiendo cuantificar la amplificación en tiempo real. Esto ofrece ventajas como mayor precisión, sensibilidad y rango dinámico. Se utiliza principalmente para cuantificar la expresión génica y cargas virales. Requiere equipamiento especializado y alta destreza técnica, pero proporciona resultados más reproducibles que la PCR convencional.

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    PCR en Tiempo Real

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    Este documento describe la técnica de PCR en tiempo real (qPCR), comparándola con la PCR convencional. La qPCR monitorea la fluorescencia emitida durante cada ciclo, permitiendo cuantificar la amplificación en tiempo real. Esto ofrece ventajas como mayor precisión, sensibilidad y rango dinámico. Se utiliza principalmente para cuantificar la expresión génica y cargas virales. Requiere equipamiento especializado y alta destreza técnica, pero proporciona resultados más reproducibles que la PCR convencional.

    Descripción original:

    PCR en tiemREpo

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    Este documento describe la técnica de PCR en tiempo real (qPCR), comparándola con la PCR convencional. La qPCR monitorea la fluorescencia emitida durante cada ciclo, permitiendo cuantificar la amplificación en tiempo real. Esto ofrece ventajas como mayor precisión, sensibilidad y rango dinámico. Se utiliza principalmente para cuantificar la expresión génica y cargas virales. Requiere equipamiento especializado y alta destreza técnica, pero proporciona resultados más reproducibles que la PCR convencional.

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    PCR en Tiempo Real

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    Este documento describe la técnica de PCR en tiempo real (qPCR), comparándola con la PCR convencional. La qPCR monitorea la fluorescencia emitida durante cada ciclo, permitiendo cuantificar la amplificación en tiempo real. Esto ofrece ventajas como mayor precisión, sensibilidad y rango dinámico. Se utiliza principalmente para cuantificar la expresión génica y cargas virales. Requiere equipamiento especializado y alta destreza técnica, pero proporciona resultados más reproducibles que la PCR convencional.

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    PCR en

    tiempo real
    Ing. José Gabriel Alvarez M.
    PCR convencional (end point)
    PCR convencional (end point)
    Problemas con los geles de agarosa y PCR

    • Baja precisión
    • Baja sensibilidad
    • Bajo rango dinámico
    • Baja resolución
    • No automatizado
    • Discriminación basada en tamaño de banda
    • Resultados no se expresan cuantitativamente
    • Coloración con EtBr no cuantitativa
    PCR en tiempo real (qPCR)

    PCR en tiempo real monitorea la


    fluorescencia emitida durante la reacción
    como un indicador de la producción del
    amplicón en cada ciclo de PCR (tiempo
    real), de manera opuesta a la detección
    de punto final (end point).

    Análisis no Análisis
    basado en gel al computacional de
    fin de la reacción la fluorescencia
    de PCR en cada ciclo
    PCR en tiempo real (qPCR)
    Ventajas de la PCR en tiempo real (qPCR)

    • No influenciada por amplificación no especifica


    • La amplificación puede ser monitoreada en tiempo real
    • No se necesita procesamiento posterior de productos
    • Ciclos ultra rápidos (30 minutos a 2 horas)
    • Rango dinámico amplio, hasta 1010
    • Requiere menos RNA que ensayos convencionales (hasta 1000 veces menos)
    o (3 picogramos = un equivalente genómico)
    • Confirmación de amplificación especifica mediante análisis de curvas de disociación (melting
    curve análisis)
    • Más especifico, sensible y reproducible
    • No mucho más caro que PCR convencional (excepto costos de equipamiento)
    Ventajas de la PCR en tiempo real (qPCR)
    Desventajas de la PCR en tiempo real (qPCR)

    • No ideal para ensayos multiplex


    • Configuración requiere elevada destreza técnica y apoyo
    tecnológico
    • Alto costo de equipamiento
    • Variación intra e inter ensayo
    • Inestabilidad de RNA (en ambos)
    • Contaminación por DNA (en análisis de mRNA)
    Fundamentos de la PCR en tiempo real (qPCR)

    • Se basa en la detección y
    cuantificación de un
    reportero fluorescente.
    • El primer incremento
    significativo en la cantidad de
    producto de PCR
    correlaciona con la cantidad
    inicial de blanco (Ct - ciclo
    umbral, threshold cycle)
    Ciclo umbral (Threshold Cycle)

    • El ciclo umbral es aquel al


    cual se incrementa
    significativamente la
    fluorescencia
    • Es el parámetro utilizado
    para cuantificación
    • Un valor Ct de 40 o más
    significa no amplificación y
    no se incluye en los cálculos
    Métodos generales (Tecnologías)

    a. b. c.
    a. Agentes de unión a DNA
    • (SYBR Green) Actividad exonucleasa 5’
    b. Sondas de hidrólisis del ADN polimerasa

    • (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions)


    c. Sondas de hibridación
    • (Light Cycler)

    FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer


    Análisis e interpretación de los datos

    • Análisis de curvas de Melting


    • Cuantificación absoluta
    • Curva estándar
    • Los estándares deben cuantificarse exactamente
    • Aplicado en determinación de carga viral
    • Cuantificación relativa
    • Curva estándar
    • Los estándares son diluciones seriales del calibrador
    • Método estándar relativo (fold change relativo)
    • Método de umbral comparativo
    • Aplicado para estudios de expresión génica
    Flujo de trabajo

    I. Desarrollo del ensayo


    A. Selección de secuencia
    B. Selección de primers y sondas
    C. Control interno y fluoróforo
    D. Validación del ensayo
    II. Implementación del ensayo
    A. PCR un sólo paso o dos pasos
    B. Configuración del termociclador
    III.Análisis de datos
    A. Línea de base y umbral
    B. Curvas estándar
    C. Variabilidad intra e inter ensayo
    D. Normalización de muestra
    Normalización - Gen endógeno / Control interno

    ▪ Usualmente un gen constitutivo


    abundante y constantemente
    expresado
    ▪ Los mas comúnmente usados son
    los menos confiables
    ▪ Debe correrse un ensayo de
    validación para el control endógeno
    seleccionado
    ▪ Pueden usarse combinaciones de
    controles
    Aplicaciones de PCR en tiempo real

    • Cuantificación de expresión génica • Detección de inactivación en cromosoma X


    • Verificación de arrays • Determinación de identidad en loci HLA altamente
    polimórficos
    • Control de calidad y validación de ensayos
    • Monitoreo postransplante del resultado
    • Pruebas de bioseguridad y estabilidad genética
    • Monitoreo de quimerismo luego de trasplante de células
    • Monitoreo de eficiencia y niveles de medicamentos madre - HSCT
    • Cuantificación viral • Monitoreo de enfermedad residual mínima luego de HSCT
    • Detección de patógenos • Genotipificación (discriminación alélica)
    • Medición de daño de DNA (inestabilidad de microsatélites) • Trisomías y numero de copias de genes
    • Genotipos de microdeleción
    • Evaluación de exposición a radiación
    • Haplotipos
    • Análisis in vivo de procesos celulares • Análisis cuantitativo de microsatélites
    • Estudios de DNA mitocondrial • Diagnostico prenatal a partir de células fetales en sangre
    materna
    • Detección de metilación • Diagnostico intraoperatorio de cáncer
    Ensayo de RT-qPCR para el gen FOXP3

    Curva de disociación y temperaturas


    Curvas de amplificación SYBR® Green Curvas de amplificación TaqMan®
    de melting SYBR® Green
    PCR digital (dPCR)

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