UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

FACULTAD DE ZOOTECNIA

“Técnicas para el aislamiento y estudio del ADN”

❖ Curso:
​ - Bioquímica para la Ciencia Animal
❖ Docente:
​ - Rivera Romero, Cristina
❖ Integrantes:
- Ramos Goicochea, Andres
- Rodrigo Mantilla, Lisseth
- Tacure Sipion, César
- Rojas Fernandez, Rony

2020-II
INTRODUCCIÓN
La molécula de la vida fue aislada por primera vez en el año 1869 por el médico y biólogo

suizo Johan Friedrich Miescher.

El 26 de febrero del año 1869 Miescher detectó la presencia de un precipitado desconocido

hasta el momento durante sus experimentos sobre la composición química de los leucocitos o

glóbulos blancos presentes en vendas quirúrgicas. A este compuesto rico en fósforo y

nitrógeno, Meischer lo denominó nucleína, dada su localización celular. Sin embargo, fue su

discípulo Richard Altmann quien acuñó el término Ácido nucleico.(Megía, R.2019)

La molécula de ADN se identificó por primera vez en la segunda mitad del siglo XIX. Un

siglo después, a mitad del s.XX, empezó la edad dorada de los descubrimientos en genética,

cuando se definió la estructura y funcionamiento del código genético. Hoy en día, los

científicos se centran en investigar cómo editar el ADN para corregir errores y curar

enfermedades de origen genético. ( Barchilón, M. 2019)

Las muestras biológicas se usan para pruebas de laboratorio o se almacenan en un depósito

biológico para usarse en investigación.

Para realizar los metodos de extraccion de ADN las ​muestra de material deberían ser como

orina, sangre, tejido, células, ADN, ARN o proteínas de seres humanos, animales o plantas.

Las muestras biológicas se usan para pruebas de laboratorio o se almacenan en un depósito

biológico para usarse en investigación.

OBJETIVOS

El objetivo de la tercera sesión del curso de Bioquímica para la Ciencia Animal es que el

estudiante sea capaz de comprender las técnicas de extracción, aislamiento y análisis del

ADN en laboratorio, para así no tener dificultades al momento de estudiar el material

genético en especies animales o en su flora interior.

DESARROLLO DEL TEMA

● ADN

El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido nucleico que contiene toda la

información genética hereditaria que utilidad como “manual de instrucción” para

desarrollarnos, vivir y reproducirnos. El ADN lo ubicamos en el núcleo de las células, una

pequeña parte la encontramos en las mitocondrias, de ahí los términos ADN mitocondrial y

ADN nuclear. El ADN está compuesto por estructuras más simples, las bases nitrogenadas.

Estas son 4:

1) Adenina

2) Guanina

3) Citosina

4) Timina

Este orden que adoptan éstas, determinará nuestro código genético.

Además de su función más evidente, la de proveer la información genética que nos

determina, el ADN tiene otras funciones, por ejemplo:

➔ Replicación:​ La capacidad de hacer copias de sí mismo permite que la información

genética se transfiera de una célula a las células hijas y de generación en generación.

➔ Codificación:​ La codificación de las proteínas adecuadas para cada célula se realiza

gracias a la información que provee el ADN.

➔ Metabolismo celular:​ Intervienen en el control del metabolismo celular mediante la

ayuda del ARN y mediante la síntesis de proteínas y hormonas.

➔ Mutación:​ Nuestra evolución como especie está determinada por la función de

mutación del ADN. También la diversidad biológica responde a esta capacidad.

● Tipos de muestras biológicas

- Material genético de cualquier organismo.

- Ácidos nucleicos: ADN en doble hebra, ADN en hebra simple o ARN (previamente

convertido a cDNA).

- Células enteras, células lisadas o incluso ADN degradado.

- Presencia de secuencia de ADN blanco de interés.

● Muestras obtenidas de animales

- Sangre total(venosa, arterial o capilar), biopsias, células fijadas en laminas, sangre en

papel filtro, lancetas, aspirados, heces(coprocultivo, investigación de virus,

investigación de parásitos, entre otros), orina(urocultivo) , saliva(proceso microbiano

o viral), fluidos corporales, huesos(paleontología), etc.

- Consideraciones del tipo de muestra:

Sensibilidad(número de copias del target)

Presencia de inhibidores

Métodos de extracción de ADN

 ● Manipulación de muestras

- Se tendrá una buena calidad del ADN al tener una adecuada manipulación de

muestras.

- Los resultados son mejores cuando se tienen muestras frescas o congeladas.

- Se debe tener una adecuada manipulación y almacenamiento para evitar la

degradación de la muestra y por ende obtener calidad y cantidad de ADN.

- Al tener Dnasa inactivada se tendrá mayor cantidad de ADN.

- Para un rápido congelamiento se utilizan agentes quelantes ya que estos evitan la

degradación.

● Métodos de extracción de ADN

- Disgregar tejidos y lisar células.

El objetivo de la lisis es romper partes de la pared celular o la célula completa para liberar

moléculas biológicas. El denominado lisado puede consistir, por ejemplo, en plásmidos,

ensayos de receptores, proteínas, ADN, ARN, etc. Los siguientes pasos de la lisis son el

fraccionamiento, el aislamiento de orgánulos y / y la extracción y purificación de proteínas.

(Hielscher. T, 2013)

- Denaturar proteínas y complejos nucleoproteicos.

Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior

(secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero

estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

- Inactivar nucleasas endógenas.

- Aislar ADN de otros ácidos nucleicos, proteínas y otros componentes celulares.

 ● Liberación del ADN

Se libera el ADN contenido dentro de las células en el material biológico inicial.

Se inicia con una lisis celular e inactividad de nucleasa endógenas mediante la ruptura

mecánica, tratamiento químico y digestión enzimática que puede ser proteinasa k o lisozima.

Tras la lisis celular y la inactividad de nucleasas, el ADN es separado del debris celular

mediante filtración o precipitación.

● Principales métodos de extracción ADN

Extracción de ADN por Fenol-cloroformo

Este protocolo permite la purificación del ADN mediante la adición de fenol y cloroformo lo

que da lugar a la aparición de 2 fases, una de estas es la fase acuosa superior que contiene los

ácidos nucleicos y la otra es orgánica que contiene las proteínas disueltas en fenol y los

lípidos disueltos en el cloroformo. (Orfao,A et al. 2011)

➔ Calidad de las muestras

- Pureza: ​cuando se utiliza este método de extracción de ADN es determinante

trabajar con mucho cuidado para evitar la contaminación de la solución de ADN por

restos de fenol o cloroformo, ya que esto puede afectar a las relaciones de absorbancia

indicativas de la pureza de dicha muestra.

- Integridad: ​las muestras se observan como una banda definida.

- Funcionalidad:​ las muestras en la mayoría son capaces de amplificar mediante

reacción de PCR fragmentos de ADN de gran tamaño.

Extracción de ADN usando columnas de sílica

“Descubierta en 1979 por Bert Vogelstein, demostró que el ADN se unía al polvo de vidrio

en presencia de yoduro sódico”.

Esta sal caotrópica:

● Desestabiliza las moléculas de agua

● Desnaturaliza las proteínas

● Aumenta la solubilidad de sustancias apolares

● Destruye las interacciones hidrofóbicas

● Lisa las células e inactiva las nucleasas.

Esta metodología se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos a membranas de

sílice, en presencia de sales caotrópicas.

Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa de agua que

mantienen su solubilidad en soluciones acuosas.

Con la adición de iones caotrópicos, se destruye esta capa hidratante, creando un entorno

hidrofóbico, lo cual permite que el ADN se una a la membrana de sílica de las columnas,

mientras que las proteínas y otros contaminantes no se unen y son eliminados durante los

pasos de lavado.

Los ácidos nucleicos se extraen de la membrana utilizando tampones de elución con menores

sales (ligeramente alcalinos) o agua, que permiten recuperar la capa hidratante liberándolos

de la membrana, sin afectar los ácidos nucleicos.

Con este rápido proceso de purificación, se obtienen ácidos nucleicos altamente purificados

para ser usados en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, qPCR, secuenciación, blotting,

clonaje, etc.

Extracción de ADN - lisis por calor

Se rompen las membranas plasmáticas, por medio de sales, liberando al medio su contenido

(ADN), (Buffer de lisis I, elimina glóbulos rojos, Nonidet P40, lisis de células y Buffer de

lisis II, rompe glóbulos blancos y sus núcleos).

Degradación de la fracción proteica asociada al ADN, mediante la adición de una proteasa

(SDS, detergente que se utiliza para eliminar membranas y desnaturalizar proteínas),

haciendo que esta fracción precipite con ayuda de sales (NaCl solución saturada, solubiliza el

ADN).

● Degradación del ADN

Se da por acción de enzimas que cortan el ADN (DNAsa), estas enzimas están presentes en el

laboratorio y en los analistas.

Limpieza con hipoclorito de sodio al 1-5%, OH - 70% o alguna solución comercial

removedora de DNAsas.

● Cuantificación del DNA

La espectrofotometría UV/Visible nos permite confirmar que contamos con cantidad

suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes de llevar a cabo

ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR), análisis de SNPS (Polimorfismos de

nucleótido único) o la secuenciación automática de muestras de DNA de plásmidos,

cósmidos, productos de PCR.

La principal ventaja de trabajar con el espectrofotómetro NanoDrop ND1000 es que la

medida se lleva a cabo a partir de 1 ó 1,5 µl de muestra sin ayuda de ningún tipo de cubeta ya

que la muestra se pipetea directamente sobre la superficie de medida. El rango de medida

para muestras de DNA es de 2-3700 ng/µl y para RNA de 2-3000 ng/µl. El Servicio también

cuenta con un fluorímetro (Qubit) que permite, mediante la utilización de sondas

fluorescentes, cuantificar de forma altamente específica muestras de DNA, RNA o proteínas.

El Servicio dispone de diferentes kits en función del tipo de muestra y su concentración:

CONCLUSIÓN

Hoy en día el uso técnicas moleculares nos abre puertas al estudio de genoma completo o

secuencias específicas de ADN cortas o largas con el fin de detectar y analizar secuencias de

interés para la investigación en las ciencias agronómicas, forenses, diagnóstico clínico e

investigación básica, traslacional y aplicada; cada una de ellas se caracteriza por la

confiabilidad y rapidez en la obtención del resultado, robustez, especificidad, sensibilidad y

flexibilidad, comparado con métodos fenotípicos.

CUESTIONARIO

1) Realiza un resumen de un artículo científico en el que se utilizó ADN(indicando el

objetivo, la parte experimental y la conclusión.

https://doi.org/10.17843/rpmesp.2019.363.4160

El nombre del artículo es:Comparación de métodos de extracción de ADN de Giardia spp.

medidos por PCR convencional.

Objetivo​: El objetivo es optimizar un método de extracción de ADN reproducible, óptimo y

sencillo para la detección de Giardia spp mediante la comparación de diferentes métodos de

extracción de ADN.

Parte experimental​: Las muestras de Giardia fueron extraidas de muestras fecales humanas,

las muestras se cultivaron ​ ​in vitro en medio de cultivo TYI-S-33 modificado (Tripticasa,

extracto de levadura, hierro y suero) enriquecido con suero bovino fetal (10%)

El ADN extraído de quistes se extrajo con los siguientes métodos(Tabla 1)

 (Tabla 1)

El ADN de trofozoitos de extrajo de las siguientes formas(Tabla 2)

(Tabla 2)

La concentración y pureza de las muestras de ADN extraídas se midió mediante

espectrofotometría. Las muestras fueron cuantificadas en una lectora EON Gen5 versión
2.04.11 (BioTek).
La calidad del ADN se evaluó por la proporción entre las absorbancias 260 nm / 280 nm para
cada método.
Luego la región del gen glutamato deshidrogenasa (gdh) fue amplificada mediante PCR
demianidada

Conclusiones​: Despues del analisis de los resultados se concluyo que​ los pretratamientos

mecánicos, de choque térmico y enzimáticos son necesarios para la ruptura de la pared

quística de ​Giardia​ spp​.​, siendo el marcador molecular bg de mayor rendimiento para

detección de ADN de quistes. Los trofozoítos no requieren pretratamientos para lograr

resultados satisfactorios. Se cuenta con una metodología reproducible para la extracción de

ADN de ​Giardia​ spp. a partir de cualquier estadio evolutivo.

2) Seleccione dos publicaciones(tesis o artículo científico) donde se mencione el método

de extracción de ADN y explíquelo mediante un esquema

BIBLIOGRAFÍA

● Tarqui-Terrones .Silva-Molina .Beltrán-Fabián. Zevallos-Vara.

Mayta-Huatuco.(2019). Comparación de métodos de extracción de ADN de Giardia

spp. medidos por PCR convencional. Revista peruana de medicina experimental y

salud pública.36.

● Cervantes,J.L.(2003). Obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN) útil para

análisis genético, a partir de uñas recortadas. Rev Med Hered.

● Baena,J.A., Ramos,J.A., Gómez,C.J. y Gómez,D.E.(2013). Comparación de métodos

de extracción de ADN en tejidos parafinados y utilidad para amplificación por PCR.

Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XV No. 1.

● Branchilón, M. (octubre, 2019). Historia del Descubrimiento del ADN. LA

VANGUARDIA Junior Report. Recuperado de

https://www.lavanguardia.com/vida/junior-report/20191027/471223785960/historia-d

escubrimiento-adn-nucleotidos-doble-helice.html

● Hielscher, T. (octubre,2013). Sonicación Lisis: Alteración celular & extracción.

Tecnología de ultrasonido de Hielscher. Recuperado de

https://www.hielscher.com/es/ultrasonic-lysis-cell-disruption-extraction.htm

● Lizeth, J. (julio, 2019). ​Extraccion de adn​. Slideshare.

● Megía, R. ( junio, 2019). La historia del ADN. Curiosidades de la Genética.

Recuperado de ​https://genotipia.com/la-historia-del-adn/

● Orfao, A. & Morent, M. (mayo,2011). PNT Extracción de Ácidos Nucleicos. Red

Nacional de Biobancos. Recuperado de

https://redbiobancos.es/wp-content/uploads/pnt-extraccion-acidos-nucleicos.pdf
● ROMPECABEZAS. ADN DEGRADADO: UNA LIMITACIÓN EN

IDENTIFICACIÓN​. (2019, 24 enero). Revista Digital.

● Rodríguez Tarduchy, G. (todavía no publicado). CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS. ​SERVICIO DE GENÓMICA DEL IIBm (SQP).​