BIOLOGíA MOLECULAR.

REPLICACIÓN DEL DNA.

DRA. MARIELA ARGÜELLO

 REPLICACIÓN DEL DNA.

El proceso de replicación de DNA es el mecanismo que

permite al DNA duplicarse (es decir, sintetizar una
copia idéntica).

Esta duplicación del material genético se produce de

acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que
indica que las dos cadenas complementarias del DNA
original, al separarse, sirven de molde cada una para
la síntesis de una nueva cadena complementaria de la
cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice
contiene una de las cadenas del DNA original.
 El DNA se replica desenrollando la hélice y rompiendo
los puentes de hidrógeno entre las hebras
complementarias.
CARACTERÍSTICAS
GENERALES.
Cuando hablamos de replicación del ADN, se
mencionan tres características:

Semiconservativa

 Bidireccional

 Discontinua o Asimetrica
 EXISTEN TRES POSIBLES
MODELOS DE REPLICACIÓN.
Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las
moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales.

Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente

nueva, copia de la original.

Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de

fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.
Formas alternativas de
replicación del dna.
 La replicacion es Semiconservativa

Significa que como resultado de la

Duplicacion, se obtienen
dos moléculas de ADN-dos dobles
hélices- ambas compuestas
por una hebra parental, y una
recientemente sintetizada.
Experimento de Meselson y
Stahl: REPLICACIÓN
SEMICONSERVATIVA.
La copia de DNA fue marcada con el isótopo N15.

Este DNA entró a una ronda de replicación con N14 y

después la mezcla fue centrifugada de manera que el
DNA pesado (2 hebras N15) formara una banda baja en
el tubo, el DNA intermedio (1 hebra N15 y 1 hebra N14)
una banda más ligera y más arriba del tubo y el DNA
ligero (N14) formara una banda más arriba de los dos
anteriores.
 ORIGEN DE REPLICACIÓN.
La replicación comienza en sitios específicos conocidos
como “origen de replicación”.

Los orígenes de replicación son los puntos fijos que están

a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que
avanza de forma secuencial formando estructuras con
forma de horquilla.

 Procariontes: Un origen de replicación.

 Eucariontes: Múltiples orígenes de replicación.

 BIDIRECCIONALIDAD.
A partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en
ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los
organismos, pero se dan excepciones en algunos
procariontes debido a que los mecanismos de
replicación que tienen lugar dependen de la propia
estructura de su material hereditario (si el DNA es
circular, lineal, bicatenario o monocatenario).

Replicación bidireccional en bacteria con DNA circular.

 Bidireccional
Origenes de replicacion

Como la molecula de ADN es muy larga, existen multiples

Origenes de replicacion para hacer la duplicacion mas rapida
( si lo hiciera a partir de un extremo, tardaría 30 días!!!!)
 Discontinua o Asimetrica
Por que? Si yo miro el resultado de la duplicación, me
encuentro con dos hebras perfectamente formadas,
y sin ningun “hueco”.

Pero, si analizo el proceso en forma más detallada, y

paso a paso, veré que la duplicación no es tan sencilla
como parece.

El problema surge a partir del modo de acción de la enzima

Encargada de agregar los nucleotidos a la cadena en crecimiento
La ADN polimerasa δ es la encargada de copiar la doble hebra
a partir del ORI, en una de las cadenas.
 DISCONTINUA.
La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3',
siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual
se produce la elongación del DNA.

Esto planteó un problema, y es que las cadenas tienen

que crecer simultáneamente a pesar de que son
antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el
extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra
cadena. Por ello, una de las cadenas debería ser
sintetizada en dirección 3' → 5'.
 SECUENCIALIDAD.
oSueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos
de complementación de mutaciones que permitieron
determinar que desde los orígenes la replicación avanza
de forma secuencial.

oLas dos hebras nuevas se van alargando

progresivamente, por adición secuencial de nucleótidos.
ESQUEMA DE LA DNA POLIMERASA
 Polimerasas de mamiferos

ENZIMA FUNCIÓN

Síntesis Hélice retardada. Síntesis del cebador: 10 bases de

ADN Pol α
ADN y 25 de ARN.

ADN Pol δ Síntesis de la Hélice conductora.

Unión de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente

ADN Pol β
250 pb).

ADN Pol γ Síntesis ADN mitocondrial.

La ADN polimerasa δ solamente puede agregar
nucleótidos a un cadena polinucleotidica que ya
esta apareada con una cadena complementaria,
o, mejor aún: necesita un extremo 3´libre para
poder comenzar a polimerizar.
No puede INICIAR la sintesis de una cadena
“de novo”.

Quien le va a dar ese extremo 3´libre? Otra

enzima que recibe el nombre de PRIMASA o
ADN primasa. Sintetiza una pequena porcion de
ARN que recibe el nombre de cebador o primer,
de unos 10 nucleotidos de longitud.
 5´ 3´
¿ Como hace la ADN polimerasa para
sintetizar las cadenas en
ambos sentidos?

La DNA polimerasa solamente es

capaz de agregar nucleótidos
a partir de un extremo 3´libre, y
haciendo crecer la cadena
en sentido 5´-3´.

NUNCA lo hace en sentido opuesto.

5´ 3´ 5´ 3´
¿Cómo se logra que ambas se cadenas se copien?
En esa hebra “problema”, otra ADN polimerasa (la ADN
polimerasa α), se adelanta un poco, y sintetiza un fragmento
pequeño.
A medida que la burbuja crece, este ciclo se repite nuevamente.

Estos fragmentos reciben el nombre de

FRAGMENTOS DE OKAZAKI, en honor a su descubridor.
Finalmente, esos cebadores de ARN son removidos o sacados
Por una nucleasa reparadora, y el espacio que queda es
Rellenado por una tercera ADN polimerasa especial, la ADN
Polimerasa β

Sintesis de la cadena adelantada

Sintesis de la cadena atrasada

Crece la horquilla
de replicacion

Cadena de ADN
recien sintetizada
 Proteinas que ayudan a desestabilizar la doble helice

5´
3´

5´

3´

5´

3´

Topoisomerasas I y II
o Girasa y Topo II
Enzimas que intervienen en la Replicación.
Enzima Acción Función en la célula.

DNA Polimerasa I Añade nucleótidos a la Llena huecos en el DNA,

molécula de DNA en para reparación.
formación. Remueve Remueve los cebadores
cebadores de RNA. de RNA.

DNA Polimerasa III Añade nucleótidos a la Replica DNA.

molécula de DNA en
formación. Revisa y
corrige la secuencia.

DNA girasa Promueve el Mantiene la

(topoisomerasa II) superenrrollamiento. compactación del DNA.

DNA helicasa Se une al DNA cerca de Promueve la separación

la horquilla de de las hebras de DNA.
replicación.
Topoisomerasa I Relaja el DNA Mantiene el nivel
superenrrollado. adecuado de
enrollamiento.
Primasa Hace cadenas Necesaria para que la
pequeñas de RNA DNA polimerasa replique
usando DNA como la hebra “retrasada”.
Cual es la función de las
topoisomerasas?
INICIACIÓN.
Para que pueda formarse la horquilla de replicación es
necesario que las dos cadenas se separen para
sintetizar el cebador y el DNA de la cadena de nueva
síntesis.

Para ello el ADN debe desenrollarse y el punto de

partida viene determinado por una secuencia
específica de nucleótidos conocida como origen de
replicación en la que hay gran cantidad de T y A.
Esta secuencia es reconocida por proteínas iniciadoras
que controlan este proceso y enzimas conocidas como
helicasas, que rompen los puentes de hidrógeno de
forma que una vez unidas las proteínas iniciadoras al
DNA provocan el desenrollamiento de estas regiones.
PARA INICIAR LA REPLICACIÓN SE REQUIEREN LAS
HELICASAS Y ES ASÍ COMO TAS CONTRIBUYEN A LA
FORMACIÓN DEL ORIGEN DE REPLICACIÓN.
Una vez abierta la cadena de DNA se unen otras
proteínas y enzimas adicionales:

 Proteínas SSB: encargadas de la estabilización del ADN

monocatenario, impiden que el ADN se renaturalice o
forme de nuevo la doble hélice, de manera que pueda
servir de molde.
 Las topoisomerasas evitan que se retuerzan y formen
superenrrollamientos cortando una o ambas cadenas
de DNA reponiéndolos.
ELONGACIÓN.
 En el siguiente paso, la holoenzima DNA Pol III cataliza
la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo
nucleótidos sobre el molde.

 La DNA polimerasa sintetiza las nuevas cadenas,

complementarias a cada una de las cadenas
primitivas.

 Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada

origen, con dos horquillas de replicación que avanzan
en sentido opuesto.
 Se sintetiza el DNA en sentido 5’→ 3’ partiendo de un
ARN cebador – molécula formada por nucleótidos de
ARN catalizados por ARN primasas que contiene un
grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases con
una hebra molde complementaria y actúa como
punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin
de copiar la hebra molde.
Inicio de la síntesis de DNA con
un cebador .
TERMINACIÓN.
oCuando una DNA polimerasa hace contacto con el
extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo , el
ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la
DNA ligasa conecta los dos fragmentos de Okazaki de
DNA recién sintetizado.

oUna vez que se han juntado todos se completa la

doble hélice de ADN.
SÍNTESIS DE CEBADORES, UNIÓN DE FRAGMENTOS
DE OKAZAKI Y ELIMINACIÓN DE LOS CEBADORES.
 FIN DE LA REPLICACIÓN.
 La Replicación termina cuando la secuencia de bases
nitrogenadas corresponden a un triplete AUG que
indica una pausa en la replicación y hasta ese punto se
codifica la proteína, para dar paso a la traducción.
 RESUMEN.
 La replicación es el proceso mediante el cual, a partir
de una molécula de DNA progenitora, se sintetiza una
nueva, originándose así dos moléculas de DNA hijas, de
secuencia idéntica a la del DNA original.
 Esta constituida por tres pasos:
 Iniciación:
-DNA doble cadena debe abrirse.
-Ocurre desenrollamiento.
 Elongación:
-Copia simultánea de ambas cadenas.
- Replicación en dirección 5’ → 3’.
 Terminación:
-Se completa la doble hélice de DNA y se da una pausa
en la replicación.
 Actualmente, los conocimientos acerca de la duplicación del
ADN se han incrementado notablemente. Todo el proceso se
divide, para su estudio, en dos fases: fase de iniciación y fase
de elongación

Para explicar el proceso , vamos a utilizar el

siguiente esquema para representar al ADN.
5´ 3´
3´ 5´

Las dos hebras del ADN son complementarias y

antiparalelas
 FASE DE INICIACIÓN

A partir de los puntos de iniciación se originan las denominadas

burbujas de replicación, las cuales presentan dos zonas con forma
de Y llamadas horquillas de replicación que se van abriendo
gradualmente a medida que se sintetiza nuevas hebras
complementarias de ADN
Burbujas de
replicación

3´
5´
3´ 5´

Horquillas de
replicación
 FASE DE INICIACIÓN
Para que el proceso se lleve a cabo con la máxima celeridad, la
duplicación comienza simultáneamente en muchos puntos de la doble
cadena, puntos de iniciación (oriC) en los que abundan las secuencias
GATC.

...ACGTGATCGGGCTA....ACCGATCACATCGG.....AGGCGATCTTACG...
...TGCACTAGCCCGAT....TGGCTAGTGTAGCC .... TCCGCTAGAATGC...

Los puntos de iniciación son reconocidos por proteínas específicas,

entre las que caben citar a las helicasas, que rompen los puentes
de hidrógeno entre las bases nitrogenadas, las girasas, las
topoisomerasas, y las proteínas SSB (single Strand Binding-DNA)
o proteínas estabilizadoras de las dos hebras de ADN cuando
están separadas.

©
 FASE DE ELONGACIÓN
Es la fase en la que tiene lugar la síntesis de nuevas hebras de
ADN complementarias a cada una de las dos hebras de ADN
originales. En esta fase intervienen varios tipos de ADN
polimerasas que se nombran como α, β y δ. La actividad de estos
enzimas es por una parte polimerasa, es decir que seleccionan y
unen entre sí los nucleótidos que corresponden a los
complementarios de la hebra molde a medida que la van
recorriendo, y actividad exonucleasa, por la cual se eliminan
nucleótidos erróneos o mal apareados y fragmentos de ARN
colocados provisionalmente, como se verá posteriormente.

Para entender el proceso, vamos a centrar la atención en una sóla

horquilla de replicación, y para un mejor entendimiento se verá
independientemente lo que sucede en cada hebra, sabiendo que el
proceso transcurre casi simultáneamente en las dos hebras.
 FASE DE ELONGACIÓN
Se inicia con la enzima PRIMASA, que coloca en cada horquilla unas hebras
cortas de ARN complementarias llamadas CEBADORES en el sentido 5´ a 3´.
Posteriormente, la ADN polimerasa comienza la síntesis añadiendo
nucleótidos en el extremo 3´
3´
5´
PRIMASA

5´
3´
ADN polimerasa 3´

CEBADOR 3´
ADN COMPLEMENTARIO 5´

La hebra que vemos arriba crece de forma continua, mientras

que la otra lo va a hacer de forma discontinua
 FASE DE ELONGACIÓN
Vamos seguidamente a ver como a medida que la horquilla de replicación se va
abriendo y se produce el avance en la síntesis de las nuevas hebras
complementarias.
Para que siga creciendo la otraSeguidamente las ADN polimerasas
hebra se ha de formar un nuevo continuan en esta hebra colocando
cebador alejado del primero. desoxirribonucleótidos, llegando hasta
sustituir al primer cebador. A esta hebra
En la hebra que vemos arriba lase le llama retardada o de crecimiento 3´
ADN polimerasa sigue avanzando discontinuo.
ininterrumpidamente, por ello se
5´
llama de crecimiento continuo

5´
3´

ARN
3´
Fragmento de OKAZAKI
5´

Hemos visto que las ADN polimerasas colocan desoxirribonucleótidos

complementarios de la hebras moldes (3´a 5´) y que también sustituye los
ribonucleótidos de las cadenas cortas de ARN (5´a 3´), pero no une los
nucleotidos vecinos de la misma hebra.
 FASE DE ELONGACIÓN
Para que los nucleótidos de la hebra de crecimiento discontinuo tengan
continuidad hace falta la acción de un enzima llamado LIGASA.

3´
Ligasa 5´

5´
3´

3´
5´
 FASE DE ELONGACIÓN
El proceso visto se repite en las dos horquillas de replicación de cada
burbuja hasta que se llegan a encontrar las nuevas hebras que se han
formado en horquillas vecinas y con sentido opuesto.

3´
5´

5´
3´

3´
5´
 FASE DE ELONGACIÓN

El avance en la hebra superior es continuo. En la inferior se forma

otro nuevo cebador y un fragmento de ADN (OKAZAKI)

3´
5´

5´
3´

3´
5´
 FASE DE ELONGACIÓN

Ha desaparecido un cebador. Ahora queda que la ligasa una

los desoxirribonucleótidos de la hebra de crecimiento
discontinuo.
3´
5´

5´
3´

3´
5´

Ligasa
 FASE DE ELONGACIÓN

Ya hay continuidad en la hebra inferior.

3´
5´

5´
3´

3´
5´
Supongamos que sólo queda un fragmento de ADN por copiar.
 FASE DE ELONGACIÓN

Aquí vemos que se ha colocado el último cebador en la

cadena inferior y que la ADN polimerasa aún no ha
terminado su trabajo sustituyendo al penúltimo cebador, 3´
5´

5´
3´
5´
3´

3´
5´

©
 FASE DE ELONGACIÓN

Ya ha sido sustituido el penúltimo cebador, pero falta unir los

desoxirribonucleótidos mediante la ligasa.

3´
5´

5´
3´
5´
3´

3´
5´
 FASE DE ELONGACIÓN

Finalmente, vemos total continuidad en las dos hebras, pero

observamos que en las copias hijas hay fragmentos de ARN.

3´
5´

5´
3´
5´
3´

3´
5´
 FASE DE ELONGACIÓN

En ésta imagen vemos, nuevamente, al resultado de la duplicación todavía

con las cadenas cortas de ARN o cebadores que le hicieron falta a la
ADN polimerasa para llevar a cabo el proceso.

3´
5´
3´ 5´

3´
5´
5´
3´

Para concluir la duplicación, esos dos cebadores colocados en los extremos

han de ser eliminados mediante la actividad exonucleasa de el enzima ADN
polimerasa I.
 FASE DE ELONGACIÓN

Apreciamos como el resultado final son dos moléculas de ADN a las

que le falta en una de sus hebras un pequeño fragmento final.

5´ 3´
3´ 5´

5´ 3´
3´
5´
 CONCLUSIÓN

La replicación es un proceso clave en el ciclo celular y necesario para que

se lleve a cabo la división celular.

Las ADN polimerasas necesitan siempre un fragmento corto de ARN,

cebador, con un extremo hidroxilo 3´ libre para añadir nucleótidos. Las
ADN polimerasas siempre recorren la hebra molde en el sentido 3´- 5´.

Las hebras que se sintetizan en cada división celular siempre son

ligeramente más cortas que las parentales, debido al hueco dejado por
los ARN cebadores.
Como es fácil de adivinar, con las sucesivas divisiones celulares se irán
acortando progresivamente las copias de las nuevas hebras que se
sinteticen. Estos déficits son los causantes de los acortamientos de los
TELÓMEROS. La pérdida de los telómeros trae consecuencias fatales
para las células.
 Telomeros
Los telómeros son estructuras
nucleoproteicas especializadas
que constituyen las
extremidades de los
cromosomas.

Son regiones de ADN no codificante, altamente

repetitivas, cuya funcion principal es brindar
estabilidad estructural a los cromosomas de las
células eucariotas durante:
la división celular.
en el tiempo de vida de las estirpes celulares.
Telomerasas
 la enzima que sintetiza el ADN telomérico y, por tanto,
controla la síntesis de los telómeros, jugaría un papel
importante en el proceso de inmortalización de las
células. Es una transcriptasa inversa que sintetiza ADN a
partir de un molde de ARN. Se trata de una
ribonucleoproteína que contiene en su molécula la
secuencia AAUCCC capaz de crear e insertar los
fragmentos TTAGGG que se pierden en cada división.
Telomerasas
 Cuando la DNA polimerasa llega al extremo de la cadena de
DNA, se encuentra con otro problema más, ya que no tiene
molde para copiar.
¿ Como lo solucionan las células?
Daños en el ADN
La reparación del ADN es un proceso constante en la célula,
esencial para La SUPERVIVENCIA.

Se producen unas 500.000 lesiones/molecula/dia.

Cuando la célula no puede mantener la tasa de reparación

SENESCENCIA
APOPTOSIS
CARCINOGENESIS

La tasa es de 500.000 lesiones/molecula: aun así algunos

factores pueden hacer que esta tasa sea mayor.
ORIGEN DE LOS DAÑOS
ENDOGENO

 ATAQUE POR RADICALES REACTIVOS DEL OXIGENO.

EXOGENO

• RADIACION UV
• RADIACION X Y RADIACION GAMMA
• HIDRÓLISIS O RUPTURAS TERMICAS
• PRODUCTOS QUIMICOS MUTAGENICOS
SINTETIZADOS POR EL HOMBRE
• TRATAMIENTO DE QUIMIOTERAPIA Y
RADIOTERAPIA
Tipos de daño
OXIDACION DE BASES

ALQUILACION DE BASES (normalmente

metilacion)

HIDRÓLISIS DE BASES (depurinacion y

depirimidizacion.)

ERRORES EN EL APAREAMIENTO DE BASES.

MUTACIONES

Los errores en la molécula de DNA completa son muy pocos,

de hecho encontramos 1 cada 109 bases.
Sin embargo, durante el proceso de duplicación la tasa de error
es bastante mas alta, 1 / 100.000 (1x105) bases puede estar mal.

Como se logra esto?

Hay diversos mecanismos, veremos los mas importantes.

Mecanismo de reparacion general:
 La lleva a cabo la misma ADN polδ, con su act. Exonucleasa 3´-5´)
Lectura de prueba

Sistema por nucleasa reparadora, ADN polimerasa β y ADN ligasa

Sistema de escicion- reparación

Se desenrolla la doble helice, y las dos hebras
simple cadena se exponen como molde
(helicasas, SSBP y topoisomerasas I y II)

Sintesis de la cadena Sintesis de la cadena

adelantada: atrasada
 Iniciacion del fragmento
 Iniciacion: Primasa de Okazaki: primasa
 Elongacion del
 Elongacion: DNA
polimerasa fragmento:
 Reemplazo del DNA polimerasa
iniciador o primer de  Reemplazo del iniciador
RNA por DNA: DNA o primer de RNA por
polimerasa DNA: DNA polimerasa.
 Union de los
fragmentos: ligasa
 DNA Polimerasas.
Dichas enzimas catalizan la síntesis de las nuevas
cadenas añadiendo nucleótidos sobre la cadena
molde. La enzima copia la cadena de nucleótidos de
forma complementaria para dar a cada célula hija
una copia del ADN durante la replicación.
Modo en que operan:

En cada horquilla de replicación, la ADN polimerasa y

otras enzimas sintetizan dos nuevas cadenas de DNA
que son complementarias respecto a las 2 cadenas
originales. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el
esqueleto de azúcar-fosfato de la cadena hija.
 Además de participar en la elongación, desempeñan
una función correctora y reparadora gracias a su
actividad exonucleasa 3', que les confiere la
capacidad de degradar el ADN partiendo de un
extremo de éste.