PRÁCTICA 2. CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO.

Medios de cultivo. Métodos de esterilización. Manejo de muestras microbianas

y toma de inóculos. Siembra en medios sólidos y líquidos.
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE SUPERFICIES ORGÁNICAS (MUESTRAS
CORPORALES) MEDIANTE EL MÉTODO DEL HISOPO. AISLAMIENTO EN
CULTIVO PURO. ENSAYOS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA

CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO: CONDICIONES

REQUERIDAS

Medio de cultivo: "solución acuosa (incorporada o no a un coloide en estado de

gel) en la que están presentes todas los nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes necesarios para el crecimiento de un microorganismo“.

a) Tipos de medios según la composición

Medios definidos o sintéticos: composición química conocida
Medios complejos (composición cuantitativa desconocida): extractos (patata,
carne, levadura), infusiones (cerebro-corazón) o digeridos proteicos (peptonas de
caseína, de ternera, soja).
Medios semisintéticos: con componentes de naturaleza y cantidad conocida junto a
sustancias de naturaleza y composición indefinidas.

b) Medios según la finalidad

Medios comunes o generales: permiten el crecimiento de la mayoría de las
bacterias (sin presión selectiva) (p.e. TSA)
Medios mínimos: medios definidos en los que se encuentran los nutrientes
necesarios para el crecimiento de la estirpe prototrofa (auxotrofía)
Medios de enriquecimiento: Son aquellos que favorecen el crecimiento de un
determinado tipo de microorganismo sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento
de los demás
Medios selectivos: son aquellos que sólo permiten el crecimiento de algunos
microorganismos, debido a la presencia en el medio de sustancias que inhiben el
crecimiento de los demás (cristal-violeta o las sales biliares).
Medios diferenciales: permiten distinguir tipos de bacterias p.e por la producción
de ácidos o sustancias básicas (indicador de pH), actividad hemolítica (sangre),
actividad proteasa (leche, gelatina), presencia de citocromos (CTT).
Medios selectivos y diferenciales: combinación de los dos anteriores, empleada
con frecuencia en el laboratorio para el aislamiento de grupos concretos de
bacterias (McConkey)

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c) Medios según el estado físico
Medio líquido: solución nutritiva disuelta en agua o tampón. Repartidos en tubos,
matraces, frascos…
En ellos los microorgansimos crecen de forma dispersa y enturbian el medio.
Utilidad: seguir el crecimiento bacteriano (curva crecimiento), obtención de cultivos con
gran número de células o preparación de inóculos

Medio sólido (agar 1,5-2%) o semisólido (agar 0,75%): medio líquido adicionado de un
agente gelificante que le da consistencia al medio y permite el crecimiento en superficie.
Utilidad:
-si se reparte en tubos y se inclinan antes de gelificar
(tubos inclinados) aumenta la superficie de inoculación lo
que facilita obtener masa de ese microorganismo.
- si se reparte en placas, se podrán hacer aislamientos
(siembra en estrías) o bien recuentos del número de
UFC/mL mediante diluciones seriadas.

CONSTITUYENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO COMPLEJOS

-Agua: componente mayoritario de protoplasto y medio en el que se producen
las reacciones biológicas
-Extractos (órganos o tejidos animales o vegetales)
-Peptonas (mezclas complejas digeridas enzimáticamente)
-Infusiones (cerebro-corazón)
-Fluidos corporales (sangre, plasma o suero sanguíneo)
-Factores de crecimiento: moléculas orgánicas específicas (coenzimas o sus
precursores, vitaminas) requeridas por bacterias que carecen de su vía de síntesis
- Agar: utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
El agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se obtiene
de algas marinas y presenta la indudable ventaja de que a excepción de algunos
microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente.

OTROS CONSTITUYENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO COMPLEJOS

Sistemas amortiguadores del pH (sistema tampón)
Indicadores de pH: rojo fenol, azul de bromofenol
Agentes reductores: cisteína, tioglicolato
Agentes selectivos: cristal violeta, sales biliares, azida sódica, antibióticos

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 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
https://www.youtube.com/watch?v=miga09gVMyY. Univ. Sevilla.
https://www.youtube.com/watch?v=YGoPu0cn9ms Univ. Miguel Hernández. Elche

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran

comercializados, bajo la forma de liofilizados a los que es
preciso rehidratar. En estos casos la preparación del
medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la
cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada
siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cuando no se dispone de este tipo de medios hay que

prepararlos pesando y adicionando cada uno de los componentes en el volumen de
agua o tampón indicado.

Para la preparación de medios sólidos se adiciona agar-agar como agente

solidificante (2,5% medios sólidos y 0,75% semisólidos). Si es un medio sólido que
se ha de distribuir en tubos o en matraces será necesario fundir el agar en baño
María y una vez fundido y homogenizado, se distribuye en caliente a los tubos o
matraces, se tapa y se esteriliza en el autoclave.

Las sustancias termolábiles del medio (urea, vitaminas, etc..), se esterilizan por
filtración y se añaden en condiciones asépticas al resto de los componentes
después de que éstos hayan sido previamente esterilizados en autoclave y
enfriados a temperatura ambiente o a 40-50 ºC si se trata de medios con agar.

Una vez finalizada la esterilización, los medios líquidos se dejan enfriar a

temperatura ambiente y se guardan a 4 ºC hasta su uso. Si se trata de medios
sólidos repartidos en tubos deberán, en su caso, inclinarse para que al solidificar
adopten la forma de agar inclinado o pico de flauta según la finalidad y se
conservarán a 4 ºC hasta su uso.

Si han de ser repartidos en placas, se verterá el medio sólido estéril en las placas
en un ambiente aséptico (en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen). Es
conveniente homogenizar el medio en el transcurso de la operación para evitar que
el agar sedimente en el fondo del recipiente y no se distribuya por igual en todas
las placas. Las placas se conservan a 4 ºC en posición invertida.

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 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

a) Calor: Autoclave
Permite aplicar Tª superiores a 100 oC sin que hierva el agua (120 oC durante 15-20
minutos), ya que a 1 atm de sobrepresión el agua hierve por encima de los 124ºC.
Mata toda forma de vida, incluidas las endosporas: esterilización. Para confirmarlo,
se ponen cintas indicadoras de esterilización

b) Filtración
https://www.youtube.com/watch?v=ggpzNduZz_4. Univ. Miguel Hernández. Elche
https://www.youtube.com/watch?v=QcuYjK6Q7sc. Univ. de la Laguna

La filtración permite la eliminación de los microorganismos de un medio líquido.

Para ello se hace pasar la muestra líquida por el Kitasato a través de un filtro de
membrana con tamaño de poro inferior al tamaño de los microorganismos (0,2-
0,45 micras). Los microorganismos quedarán retenidos en el filtro y el fluido
obtenido tras la filtración estará estéril.

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Para pequeños volúmenes se pueden emplear jeringas a las que se adaptan los
filtros

c) Radiaciones:
- Rayos gamma -. Radiaciones ionizantes
- Rayos Ultravioleta: son de escasa penetración (útil para eliminación de
microorganismos de superficies).

d) Agentes químicos
Para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plástico) que son
termolábiles: autoclave de óxido de etileno

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 MANEJO DE MUESTRAS MICROBIANAS Y TOMA DE INÓCULOS
https://www.youtube.com/watch?v=bYFG6DT_Jl8. Univ. de Sevilla.

La toma del inóculo a partir de una muestra microbiana tiene que hacerse siempre en
condiciones asépticas en la proximidad de la llama (mechero bunsen) y con mucha
precaución para evitar que se contaminen.
 Si partimos de cultivos en medio líquido podemos emplear una micropipeta
usando puntas estériles para hacer diluciones y/o inoculaciones.
 Si están en medio sólido (tubo o placa) se requiere disponer de un
asa/hilo/espátula de Drigalsky que en todo caso tienen que estar estériles

1. Toma del inóculo

A partir de tubos
1.- Flamear el asa o hilo con el que se va a tomar el inóculo por
calentamiento en la llama de un mechero Bunsen hasta que se ponga
al rojo vivo. Esperar un tiempo corto hasta que se enfríe.
2.- Toma del inóculo
Abrir el tubo retirando el tapón con el dedo meñique y flamear
ligeramente la boca del tubo. Nunca se deja el tapón encima de
la mesa.
Introducir el asa/hilo estéril y frío en el tubo y tomar una
pequeña porción del cultivo, tocando ligeramente la superficie
del medio de cultivo. Volver a flamear ligeramente la boca del
tubo y tapar.

A partir de placas
Para tomar una muestra la placa debe estar invertida sobre la mesa y se abre la
placa cogiendo la parte de abajo, se acerca al mechero y se toma el inóculo con el
asa/hilo.

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 2. Inoculación de la muestra

2.1.- Siembra en tubos para obtener masa

- tubos de agar inclinado: inocularlo con el asa haciendo zig-zag desde abajo hacia arriba
para permitir el crecimiento en superficie (a).

- tubos con agar: introducir en profundidad el hilo (b)

-tubos con medio líquido: inocularlo frotando las paredes del tubo con el asa

Siempre hay que esterilizar el asa/hilo antes de dejarlo sobre la mesa de

trabajo.

Marcar/rotular los tubos inoculados e

incubarlos a la Tª adecuada para permitir el
crecimiento en masa.
En la estufa (a la temperatura adecuada 37 ºC o
28 ºC) con objeto de que crezcan las colonias. La
incubación se hará en aerobiosis (en reposo o en
agitación) o en anaerobiosis (estufa de anaerobiosis o jarra), en función de las
características del microorganismo

Pasado el tiempo necesario para que crezcan las bacterias (muchas bacterias con tiempos
breves de generación generan colonias patentes a las 24-48h) los tubos estarán crecidos
y se podrá observar el crecimiento en superficie/profundidad en medios sólidos o por
turbidez en medios líquidos.

2.2.- Siembra en placa: diseminación en estrías con objeto de obtener

colonias separadas y proceder a su aislamiento en cultivo puro.
La mayor parte de los estudios que se realizan con microorganismos (estudios
estructurales, bioquímicos, genéticos, etc.) no se realizan con células aisladas, sino con
poblaciones extensas y homogéneas de microorganismos, por lo que el microbiólogo utiliza
técnicas que permiten obtener un cultivo puro o axénico, para luego cultivar a gran
escala dicho microorganismo.

Este aislamiento es un paso básico antes de emprender cualquier estudio con bacterias en
laboratorio, y se suele lograr mediante ciertas técnicas sencillas de siembra en medios
sólidos a partir de la mezcla bacteriana. El objetivo es que, tras la incubación de dicho
medio así inoculado, aparezcan colonias separadas, cada una de las cuales procede de una
sola bacteria o de una sola unidad formadora de colonia (UFC), correspondiente a una
determinada cepa de las presentes en la mezcla original. A partir de cada colonia de cada

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tipo presente en ese medio sólido puede aislar la cepa correspondiente, obteniéndose un
cultivo puro.

Material necesario
a) Muestra de la que se desea aislar bacterias
b) Placa con medio común o general (Tripticaseína Soja Agar, TSA)
c) Tubos de agar inclinado con medio TSA
d) Asa de siembra

Procedimiento
A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a través
de la obtención de colonias aisladas. Cada colonia (clon) representa una población de
microorganismos procedentes de una sola célula, a partir de la cual se posee la
seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.
Consiste en tomar, con el asa de siembra una gota/porción de la mezcla bacteriana, y
extenderla de forma continua sobre la superficie del agar para obtener colonias aisladas,
ya sea por:

- Agotamiento: la muestra se extiende sobre la superficie según se indica en la figura, de

forma que al final de dicha siembra “por agotamiento”, la cantidad de inóculo se espera
sea lo suficientemente bajo como para que se depositen células aisladas y distanciadas en
la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras incubar, colonias aisladas.

- Estrías escocesas. Se procede de forma similar al caso anterior, pero se realizan una
serie continua de zigzags muy apretados y se elimina la sobrecarga esterilizando el asa
antes de hacer la 2ª y la 3ª extensión.

Una vez inoculadas las placas, se llevan a la estufa de 28/37ºC para permitir el
crecimiento bacteriano. Muchas bacterias con tiempos breves de generación originan
colonias a las 24-48 h

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Observación de las colonias

Se deben observar con la ayuda de la lupa y describir los siguientes caracteres, en orden
a diferenciar las colonias aparecidas en el medio:
- Forma de la colonia: punteada, circular, filamentosa, rizoide, irregular, etc.
- Forma de los bordes: liso, ondulado, lobulado, desgastado, filamentoso, etc.
- Elevación respecto del sustrato: plana, elevada, convexa, pulvinada, umbilicada
- Consistencia: más o menos cremosa, más o menos mucosa, etc.
- Caracteres ópticos: transparente, traslúcida, opaca. etc.
- Aspecto de la superficie: más o menos brillante, etc.
- Tamaño relativo de unas respecto de otras de la misma zona de la placa.
- Pigmentos no difusibles (la colonia presenta un color propio) o difusibles (el
medio se colorea alrededor de la colonia)

http://www.dailymail.co.uk/sciencetech/article-3269542/Microbial-masterpieces-Scientists-paint-detailed-
works-art-growing-bacteria-petri-dishes.html

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 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE SUPERFICIES ORGÁNICAS (MUESTRAS
CORPORALES) MEDIANTE EL MÉTODO DEL HISOPO.
AISLAMIENTO EN CULTIVO PURO.
ENSAYOS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA

Objetivo
Poner de manifiesto la presencia de microorganismos en una superficie orgánica
(corporal), aislamiento en cultivo puro, obtención de masa y valoración de su posible
actividad biológica.

Material necesario
-Hisopos estériles
-Placas con medio TSA

Procedimiento
El método consiste en tomar una muestra de la nariz, orejas, frente, manos o mucosas
(nariz o boca) con un hisopo estéril.

Inocular con el hisopo una placa de TSA mediante estrías por agotamiento, aplicándolo
directamente sobre la superficie del agar. Rotular la placa con el origen de la
muestra/fecha/alumno y llevarla a incubar en aerobiosis a 37 ºC durante 24 horas.

Transcurrido este tiempo observar las placas, y describir las características

morfológicas de las colonias que hayan crecido.

Obtener cultivos puros de los diferentes microorganismos crecidos, mediante siembra

en estría escocesa aplicando el método descrito en el apdo 2.2

Seleccionar una colonia y obtener masa aplicando el método descrito en el apdo 2.1

Realizar los ensayos de actividad biológica mediante el método de difusión en placa

por si algunas de las bacterias crecidas tuvieran actividad antibacteriana frente a una
bacteria indicadora

Finalmente para completer este estudio se debería hacer la tinción de Gram (para
saber forma y el tipo de pared que presentan) y aplicar las técnicas bioquímicas para su
identificación.

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ENSAYOS DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA. MÉTODO DE DIFUSIÓN EN PLACA

Para determinar actividad antibacteriana hay que partir de cultivos

productores de sustancias antagonistas
 específicas: bacteriocinas o antibióticos
 inespecíficas: ácidos, agua oxigenada, compuestos básicos…
y ensayar la actividad frente a bacterias "indicadoras"
 de un cultivo: mediante la técnica de la doble capa
 de un sobrenadante: por el método de los discos, las gotas o los pocillos

En estas prácticas vamos a hacer

-búsqueda de colonias con actividad antagonista mediante la técnica de la
doble capa
-ensayos de sensibilidad a antibióticos mediante discos: Antibiograma

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 Técnica de la doble capa
Material necesario:
 placas con medio común o general (TSA) con la superficie seca
 tubos de 6-8 mL de agar blando (TSI con 0,7% agar)
 Placa con colonias de una cepa productora
 cultivo en medio líquido de una cepa indicadora
 Baño a 45 ºC

Método
Para detectar la producción de sustancias antagonistas específicas se utilizan placas donde
la bacteria produzca la sustancia antagonista que queremos poner de manifiesto. Para ello:

Sobre la placa (con la superficie seca) se pone una gota (3 µL) o un se hace una cruz a partir
del cultivo de una cepa productora previamente aislada y se incuba a la temperatura
adecuada (28-37 ºC) durante 24 h. Alternativamente podemos usar las placas del
aislamiento se nuestra superficie corporal para comprobar si hay alguna bacteria que
produzca alguna sustancia antagonista. Para ello se cubre la placa en donde han crecido
las colonias de las muestras corporales, con una sobrecapa (6-8 mL) de medio con agar
blando (0,7%) mantenido en sobrefusión (45 ºC) previamente inoculada con 0,1 mL de un
cultivo fresco (de una noche) de la bacteria indicadora.

Una vez solidificada la sobrecapa, la placa se lleva a incubar 24 h a 28-37 ºC para permitir el
crecimiento de la bacteria indicadora, observando al día siguiente la posible aparición de
zonas de inhibición del crecimiento en torno a las bacterias crecidas en la capa base.

Otros ensayos de actividad biológica

Se pueden hacer con los sobrenadantes crudos o bien con muestras purificadas, usando el
método de los pocillos o de las gotas

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 Técnica de los discos: Antibiograma (Kirby-Bauer)
El método de Kirby-Bauer es una prueba de sensibilidad por difusión en agar que se
utiliza fundamentalmente cuando el microorganismo de interés es aerobio o
facultativo y de crecimiento rápido.

El antibiograma es importante para establecer un tratamiento de cualquier enfermedad

infecciosa y se realiza como última fase de un análisis microbiológico, cuando ya se tiene al
microorganismo problema en cultivo puro, con objeto de emitir un informe acerca del
tratamiento a seguir.

La técnica consiste en colocar discos de papel de filtro impregnados con una

concentración conocida de antibióticos, sobre una placa con un medio de cultivo que ha
sido previamente inoculado en superficie con la suspensión de la bacteria objeto de
estudio. El disco capta la humedad del medio y los antimicrobianos difunden hacia fuera
en forma radial, produciendo un gradiente decreciente de antibiótico. Cuando el agente es
capaz de inhibir el crecimiento del microorganismo se formará un anillo claro alrededor
del disco al que se denomina “zona o halo de inhibición”. La zona de inhibición está
relacionada con la concentración del antibiótico. Cuanto mayor es el diámetro del halo,
más sensible es el microorganismo al antimicrobiano.

El método de Kirby-Bauer No se puede utilizar para determinar la Concentración Mínima

Inhibidora (CMI) de un agente quimioterápico, ni para comparar la eficacia de
antibióticos diferentes, pero es muy utilizada porque es una técnica rápida, barata y útil
para mostrar qué agentes son más eficaces frente a un determinado patógeno.

Material necesario
Cultivo en placa de bacterias de interés (S. aureus y E. coli)
Preparar el inóculo con aproximadamente 108 células/mL utilizando la escala de Mac Farland
Placas de Petri con medio de cultivo adecuado (TSA)
Pipetas y puntas estériles
Espátula de Driglaski
Discos de antibióticos

Método
Preparación del inóculo: realizar una suspensión con 4 ó 5 colonias de la bacteria problema
en solución salina. La preparación del inóculo es importante y debe ser aproximadamente de

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108 UFC/mL. Un inóculo más denso conduce a una disminución del halo de inhibición. Por el
contrario los inóculos bacterianos excesivamente bajos pueden aumentar en apariencia la
sensibilidad.

Siembra: se toman 0.2 mL de dicha suspensión y se inoculan sobre la superficie de una placa
de Petri, extendiendo con la espátula de Drigalski. Es importante que la bacteria quede
perfectamente distribuida en la placa para que el crecimiento sea homogéneo en toda la
superficie del medio.
Colocación de los discos de antibióticos: con la ayuda de unas pinzas previamente
esterilizadas, flameándolas con alcohol sobre la superficie de dicha placa. Efectuar una
ligera presión sobre el disco.
Predifusión: esperar unos minutos para que difunda adecuadamente el antibiótico.
Incubación de las placas: a 37 ºC durante 24 horas.

Resultados
Tras la incubación se mide el diámetro (en milímetros) del halo de inhibición aparecido,
con una regla o papel milimetrado. La acción de un antibiótico u otro depende de la
concentración del mismo en el disco, así como de su capacidad de difusión y de su
solubilidad en el medio, datos que deben ser tenidos en cuenta para no juzgar
comparativamente el valor de un antibiótico frente a otro.

Interpretación
Los resultados de la prueba de Kirby-Bauer se interpretan utilizando unas tablas
normalizadas que relacionan el diámetro de la zona de inhibición con el grado de resistencia
microbiana: Resistente, Intermedio o Sensible. Los valores de la tabla se han obtenido
utilizando los valores de la CMI de un determinado antibiótico y las zonas de inhibición
frente a diferentes cepas de microorganismos. Esta correlación puede establecerse por una
recta de regresión tras el estudio de un gran número de aislamientos bacterianos frente a
un determinado antimicrobiano. Una vez establecida la recta de regresión, es posible inferir
el valor de la CMI a partir del correspondiente halo de inhibición.

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