Equipo 1: Hernndez Tamayo Abraham Martnez Gonzlez Luis Enrique Montoya Herrera Karla Gabriela Tejas Hernndez Cristina

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Caractersticas

El HPLC utiliza presiones elevadas para que el disolvente pase por la columna que tiene partculas muy finas consiguiendo separaciones de alta resolucin. Este tipo de cromatografa se usa debido a que los compuestos no son lo suficientemente voltiles para poder usarlos en la cromatografa de gases.

Caractersticas

Proceso cromatografico

En la cromatografa de lquidos de alta eficiencia, existe un liquido (fase mvil) que circula y esta en contacto con un solido o liquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir la muestra en la corriente de fase mvil, cada analito avanzara a lo largo de el sistema con velocidades diferentes.

Despus de pasar por la columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema eluira con un tiempo diferente ( estarn separadas).

Clasificacin
Cromatografa de adsorcin (liquido-solido): La fase estacionaria es un adsorbente y la separacin se basa en repetidas etapas de adsorcion-desorcion. Cromatografa de reparto/adsorcin: La separacin en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria.

Cromatografa de intercambio inico: Se da cuando la fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados, capases de retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase mvil. Cromatografa de exclusin molecular: La fase estacionaria es de un material de tamao de poro controlado que permite la entrada de ciertas molculas pequeas de manera selectiva.

Cromatografa de fase normal: La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen con el soluto son especificas del grupo activo. Cromatografa de fase inversa: La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar y las interacciones que se producen son inespecficas.

Componentes del equipo

Dispositivos de suministro de eluyentes ( bomba y dispositivo de mezclado). Dispositivo de inyeccin. Conducciones y conexiones. Detector y registrador.

Columna.

Sistema de suministro de fase mvil

BOMBA: Administra un caudal constante y libre de pulsos de la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin en cabeza de columna, ya que puede variar por obstruccin de las lneas de conduccin, del filtro de la cabeza de la columna, etc.

Un sistema de bombeo ideal tiene las siguientes caractersticas: Esta construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil. Ser capaz de trabajar a altas presiones. Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas.

Tipos de Bombas

Bombas neumticas:

Bombas de motor elctrico:

Sistemas de mezcla de fase mvil

Mezclado de alta presin: este sistema utiliza una bomba para cada uno de los disolventes que se van a mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una conexin en T o a una pequea cmara de mezcla.

Sistemas de mezcla de fase mvil

Mezclado a baja presin: El mezclado de los diferentes componentes se lleva a cabo antes de que estos entren en la bomba, controlndose el caudal del sistema cromatogrfico por medio de una sola bomba.

La columna
La columna es el lugar donde tiene lugar la separacin, las columnas ms utilizadas son las de relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo de separacin que se quiera llevar.

La slice utilizada realiza una de las tres funciones siguientes: Superficie adsorbente: responsables de la separacin. Soporte de la fase estacionaria. Actuacin como substrato microporoso: En este caso, la slice permite la seleccin de molculas en funcin de su tamao

Mecanismos de separacin ms generalmente utilizados en cromatografa de lquidos.

Sistema de inyeccin
Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas: Introducir la muestra en la columna como una banda lo mas estrecha posible Ser de fcil manejo Dar resultados reproducibles, tanto en la cantidad de la muestra inyectada como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatografa. Ser capaz de trabajar a presiones elevadas

Existen 2 tipos de inyectores manuales:

De jeringa De vlvula

Inyectores de jeringa

En este tipo de inyectores, la introduccin de la muestra en la columna se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatogrfico a travs de una membrana (septum), lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la columna

Inyectores de vlvula

Consiste en una vlvula de seis vas, 2 de las cuales estn conectadas entre s por medio de una espira (loop). Esta espira es un tubo de volumen conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyeccin.

La introduccin de la muestra se lleva a cabo en 2 etapas:

La 1ra se realiza a presin atmosfrica, y consiste en cargar la muestra en la espira con ayuda de una jeringa La 2da mediante un giro de la vlvula, se hace pasar el eluyente a travs de la espira hacia la columna

Conducciones y conexiones

El tubo de conduccin puede considerarse como un volumen muerto del sistema y, por lo tanto es de vital importancia la utilizacin para esta finalidad de tubos capilares en los que el dimetro interno sea pequeo y evitar al mximo posible la utilizacin de grandes longitudes de tubo de conexin; de este modo, se consigue reducir en la medida de lo posible el volumen muerto del sistema.

El tubo de conduccin debe ser inerte frente a la fase mvil y a las substancias a separar; generalmente se utiliza tubos de acero inoxidable, en casos especiales, se utilizan tubos de titanio

Las conexiones son necesarias para lograr eliminar la presencia de volmenes muertos
Existen 2 tipos de conexiones De unin (empleadas para conectar tubos del mismo dimetro) De reduccin (empleadas para modificar el dimetro de la conduccin en los extremos de la columna)

Detectores

Es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que deber depender de la composicin de est.

Las caractersticas de un detector para cromatografa, son principalmente

1.

Caractersticas que no afectan a la eficacia de la separacin

Respuesta Ruido Deriva Sensibilidad Rango dinmico.

2.

Caractersticas que afectan a la eficacia de la separacin

Volumen de la cubeta Constante de tiempo

Clasificacin
Los detectores se clasifican en 5 tipos, los cuales son:
Detector

ndice de refraccin Detector de ultravioleta y/o visible Detector de fluorescencia Detector de conductividad elctrica Detector electroqumico

Detector ndice de refraccin

La deteccin se basa en equilibrar el detector, a caudal constante, con fase mvil pura y medir el cambio de ndice de refraccin cuando aparece la muestra eluida junto con la fase mvil. Cuando mayor sea la diferencia entre los ndices de refraccin de la muestra y de la fase mvil, mayor ser el desequilibrio, por tanto, la mxima sensibilidad se obtendr cuando exista una diferencia mxima entre los respectivos ndices de refraccin.

Detectores ultravioleta/visibles

En los detectores de absorcin ultravioleta, la lnea de base representa la mxima transmisin de luz, y cualquier desviacin de ella indicara perdida o absorcin de radiacin.
La absorcin de luz UV o visible es un parmetro especifico para cada compuesto, ya que este debe presentar una absorcin adecuada en alguna regin del espectro o, en caso, debe combinarse con un reactivo adecuado para formar un derivado que presente absorcin.

Detectores de fluorescencia

Se utiliza para compuesto que presentan fluorescencia natural, as como para los que pueden convertirse en fluorescentes por medio de una derivacin simple, es el tipo de deteccin ms sensible que se aplica a la CL. La sensibilidad del detector de fluorescencia es de 1000 veces mayor que la del detector UV.

Los solutos que no tienen fluorescencia natural se pueden unir a determinadas molculas muy reactivas que presenten fluorescencia y convertirse a su vez en fluorescentes, por medio de una tcnica de derivatizacin fluorescente. Algunos reactivos utilizados para esta tcnica son: cloruro de dansilo y fluorescamina, o pueden ser dependiendo de la naturaleza de los compuestos a analizar

Detector de conductividad elctrica

En esta tcnica de sistema de deteccin cromatogrfico, la clula de inmersin utilizada normalmente para medir conductividad se sustituye por una clula de flujo pequeo de volumen, registrndose continuamente las variaciones en la conductividad de la fase mvil. La repuesta de los detectores conductimtricos es lineal frente a la concentracin en un intervalo muy amplio, de manera que es posible cuantificar la seal de salida por medio de una correcta calibracin prelimina.

Detectores electroqumicos

Se basan en la oxidacin del analito eludo mediante un electrodo adecuado, registrndose la intensidad de la corriente, mantenida mediante la electrolisis de los analitos Para la aplicacin de esta tcnica en la deteccin de cromatografa liquida, se utilizan electrodos de pasta de carbn, carbn pulimentado y amalgama de oro y mercurio, junto con un contra electrodo de plata-cloruro de plata.

Bibliografa

Daniel C. Harris. Anlisis Qumico Cuantitativo 3ra edicin. http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_E S/investigacion/cromatografia/cromatografia_li quida_de_alta_eficacia.pdf