PROCESOS DE

SEPARACION Y
PURIFICACION DE
PRODUCTOS
 I.- PROCESOS BIOTECNOLOGICOS
•El biorreactor no existe aislado, en un proceso biotecnológico.
•La eficiencia y éxito del proceso depende de adecuados
procesos previos (upstream processing) que incluye desde el
diseño del medio de cultivo hasta la esterilización del mismo, y
de la recuperación del producto final mediante operaciones de
separación y purificacion (SP) (downstream processing).

Los procesos biotecnológicos constan de tres fases:

•Aguas arriba.(preparación del inoculo, preparación del
medio, esterilización)
•Proceso principal (fermentación o bioreacción)
•Aguas abajo (separación y purificación). Estas operaciones
comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo,
una vez finalizado, para la obtención del producto en las
condiciones de pureza y actividad deseadas
 Procesos biotecnológicos: fases
El objetivo de estas operaciones es recuperar la mayor cantidad
de producto con la pureza requerida al menor costo.
 Fases del proceso biotecnológico
1.-Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo
donde se conserva la cepa de interés. Se propaga en el
laboratorio progresivamente aumentando el volumen del
medio.
2.- Bioproceso: Se prepara el medio de nutrientes y se
esteriliza. Se siembra un tanque de inóculos cuyo volumen
depende de la escala industrial.
3.- Separación y purificación: operaciones mecánicas de
ruptura de células; separación y purificación de metabolitos
4.- Tratamiento de Efluentes: No tiene relación directa con el
producto pero es una etapa imprescindible por los volúmenes
involucrados y para preservar el medio.
1.1.- Operaciones de separación
y purificación
• La fase del downstream
processing, comprende dos acciones
principales:
•Recuperación del producto.
•Purificación del producto
•Las operaciones de separación y
purificación constituyen las
operaciones necesarias para la
recuperación y purificación del
producto biotecnológico.
•El producto puede ser:
•La célula misma.
•Un compuesto intracelular.
•Un compuesto extracelular.
•Estas operaciones pueden
representar un 60% del costo de
producción
 II.- CASOS DE PROCESOS DE DOWN STREAM
Depende de la eficiencia del proceso y del producto a obtener
A.- Cuando el producto son las células.
•Las células se separan del medio de cultivo. Se lleva a cabo por
procesos de filtración, centrifugación o por membrana.
B.- Cuando el producto es un metabolito.
•Se siguen procesos y operaciones cuya complejidad depende
del compuesto químico especifico.
 III.- SEPARACION Y PURIFICACION DE METABOLICOS

La estrategia a seguir puede resumirse en:

1-Conocer las propiedades físicas y químicas del producto final

(pureza requerida). Para agentes terapéuticos se requiere un
alto grado de pureza. (máximo 100 ppm de impurezas)

2-Definir el material de partida. Pueden existir componentes

del medio de cultivo (agua de hidrolizado de maíz, extracto de
malta, etc) que posean sustancias que, interfieren en la
purificación. En este caso se debe eliminar ese componente del
medio de cultivo.

3. Los esquemas tentativos de Separación y Purificación se

llevan a etapas de laboratorio y piloto.
3.2.- ETAPAS EN LA
SEPARACION DE
METABOLITOS
•Separación sólido-líquido.
Filtración y centrifugación
•Ruptura celular: métodos
mecánicos, permeabilización,
métodos químicos y biológicos.
(para productos intracelulares)
•Separación de restos celulares:
filtración y centrifugación.
•Concentración: ultrafiltración,
precipitación, destilación,
extracción con solventes,
extracción liquido-liquido
•Purificación: Se busca separar las
impurezas mas abundantes y
eliminar la mayor cantidad de
agua.
CONCENTRACIONES TÍPICAS DE ALGUNOS PRODUCTOS
BIOTECNOLÓGICOS A LA SALIDA DEL REACTOR
 3.2.1.- Separación sólido-líquido.
a.- Filtración.
•En el caso de productos
biotecnológicos puede presentar
tres problemas:
•Tamaños de partículas muy
pequeños.
•Compresibilidad del sólido.
•Carácter no newtoniano de
suspensiones.

Los filtros mas usados son:

•De tambor rotatorio. Se
usan en industria
alimentaria, y farmacéutica •Filtro prensa. Utiliza presión para
impulsar la suspensión a través de
como en la producción de las placas filtrantes.
penicilina.
•Filtro prensa. Se usan en la •Las placas filtrantes son
industria cervecera, vinícola, desmontables de polipropileno, y las
mallas pueden ser de tipo selladas,
en la recuperación de no selladas o membranas de alta
bacterias y hongos. resistencia.
b.- Filtro de tambor rotatorio
•Se caracterizan por tener una
tela sobre un cilindro rotatorio, la
cual se encarga de filtrar el flujo
que pasa a través de éste.

•Dicha tela es unida sobre la

periferia de uno de los tambores
sobre los que se está llevando a
cabo el proceso de filtrado,
aplicando así mayormente la
fuerza de vacío.

Clasificación de filtros rotatorios:

•Filtros rotatorios con tanque
para la formación de pre capa
•Filtros rotatorios construidos
de acero inoxidable,
•Son imposibles de operar en
condiciones estériles
c.- Centrifugación.
•Los factores determinantes para la
separación son:
•el tamaño de partícula,
•la diferencia de densidad con el
medio,
•la viscosidad del caldo.
•Las velocidad requerida es
proporcional al cuadrado del diámetro
de partícula.
•Para separar partículas pequeñas,
existen centrifugas que generan 14000
a 15000 g. Pero el esfuerzo que se
produce, limita el tamaño máximo de la
centrifuga a rendimientos de 300 a 500
L/h, con partículas de 0.5 um
•El gran esfuerzo que se genera, obliga
a construir equipos refrigerados

•El tipo de centrifuga mas usado es el

tipo disco (Scragg)
 3.2.2.- Disrupción de células
Es el proceso por el cual se produce la ruptura de las células
para librar el producto acumulado en su interior.
 a.- Métodos de disrupción
La elección del método depende de las características de
las células y la estabilidad de los productos.
•Se debe conocer:
•Membrana celular.
•Pared celular. Tipo de célula (bacteria, hongo, algas,
etc)

Orden de dificultad para la disrupción:

Células animales, micelios, bacilos Gram (-), Bacilos Gram
(+), células vegetales, levaduras, cocos Gram (-), esporas.

•Pueden ser:

•Mecánicos.
•No mecánicos (físicos, químicos, enzimáticos)
 a.- Métodos mecánicos
• Se basan en la aplicación de fuerzas de corte que
deforman la cubierta de las células hasta su
rompimiento.
Características:
• Suelen ser mas efectivos que los químicos
• Son inespecíficos.
• Generan elevadas temperaturas.
• Requieren mucha energía.
• Pueden dañar productos lábiles.
Métodos:
• homogenización,
• molinos de bolas,
• sonicadores,
Homogenización.
•Se somete la suspensión
de células a alta presión
(400 a 500 bar), y luego se
hace pasar a través de una
válvula.
•Se crean así velocidades
de corte muy altas
•Esta operación eleva la
temperatura unos 1.5 oC
por cada 70 bar de presión.
•Se debe usar una
suspensión celular al 50%,
en solución tampón
adecuada
•La suspensión debe recibir
un pre y un post enfriado.
 Molino de bolas.
•Consiste en un agitador de discos
montado sobre un motor central, que
gira en una cámara, cargada con
esferas de vidrio, metal u otro
material.
•Las esferas pueden tener diámetros
de 0.2 a 15 mm
•La eficacia del rompimiento celular
depende de la concentración celular, y
de las bolas de vidrio.
•El efecto de la concentración celular
es mayor a menores velocidades de
agitación. La concentración ideal se
encuentra entre 30-60% .
•La concentración de las bolas debe
estar entre el 70 al 90% del volumen
del molino.
•La operación genera calor, por lo que
se requiere sistemas de refrigeración.
Sonicadores
•Se utiliza ultrasonido con
frecuencias de 20 a 50 KHz.
•Las ondas de ultrasonido
crean muchas microburbujas
en la suspensión celular.
•Las burbujas colapsan
implosionando durante el
periodo de compresión de la
onda. (Cavitación)
•La cavitación, produce un
shock de ondas muy intenso,
con un fuerte estrés local,
ocasionando la deformación y
ruptura de las células.
 b.-Métodos no mecánicos

Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis

celular a través de medios químicos, físicos o
enzimáticos.
Características:
• No generan daños en la célula facilitando su posterior
separación.
• Suelen ser poco eficientes.
• Son mas específicos.
• Son difícilmente escalados
 b.1.- Tratamientos químicos
•Tratamiento con solventes orgánicos.
(cloroformo, tolueno)
•Permeabilizan las membranas celulares,
disolviendo componentes hidrófobos de la
pared y los fosfolípidos de la membrana
interna en bacterias Gram (-)
•Tratamiento con álcalis. (hidróxido de
sodio e hipoclorito)
•Producen la saponificación de los lípidos
de la membrana. Es una técnica muy
severa, pero efectiva y de bajo costo,
siempre y cuando el producto de interés
sea resistente a la degradación a pH
elevado.
•Agentes caotrópicos (urea, clorhidratos
de guanidina)
•Interfieren con los enlaces no covalentes
(puentes de hidrogeno, fuerzas de Van der
Walls), desorganizando la estructura del
agua y haciéndola menos hidrofílica,
debilitando las interacciones soluto-
soluto.
Quelantes (EDTA)
Quela los iones Ca2+
y Mg 2+, que unen
los iones LPS,
conteniendo
proteínas y
fosfolípidos de la
membrana Gram (-)

Antibióticos.
Los B-lactámicos, son
efectivos para
tratamiento de
bacterias Gram (-),
•No se utilizan a gran
escala.
Tratamiento con
detergentes.
•Los detergentes son
anfipáticos
•Forman micelas con los
lípidos de las membranas,
desestabilizandolas.
Se clasifican en tres tipos:
•Aniónicos (sales de tetra-
alquil-amonio, pH básico)
•Catiónicos (SDS, pH acido)
•No iónicos (triton-X)
b.2.- Tratamientos físicos.
•No requieren acción
mecánica.
•Shock osmótico,
congelamiento/desconge
lamiento,
descompresión,
termólisis,

Shock osmótico.
•Se produce cuando las
células son sometidas a
medios hipertónicos ó
hipotónicos
•Las células con pared
celular, son mas difíciles
de romper.
 Congelamiento/descongelamiento
•Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el
congelamiento, si se desarrollan en el citoplasma, rompen
la membrana celular.
•La congelación lenta no funciona tan bien como la rápida.
 b.3.- Métodos enzimáticos.
Disrupción enzimática.
•Es un método muy preciso pero requiere una clara
comprensión de la estructura de la pared celular de las células
que se quiere lisar.
•La principal limitación del método es el costo
•Ejemplo: enzima Lisozima (muramidasa)

Autolisis:
•Método en el cual las células inducen su propia disrupción,
por que se producen señales que inducen la liberación de
enzimas que degradan los organelos y membranas celulares.
•Es un método lento.
•Se inducen mutaciones en la célula, introduciendo genes que
codifican antibióticos o enzimas que degradan las organelas y
membrana celular
 Medida de la Eficiencia de la disrupción

Métodos directos
• Se cuenta las células destruidas y las intactas.
• Técnicas: recuento en cámara, contador electrónico,
recuento en placa, centrifugas analíticas.

Métodos indirectos.
• Determinación del grado de liberación de un metabolito
al medio externo
3.2.3.- Concentración
a.- Técnicas de membrana.
(microfiltración, ultrafiltración, y
osmosis inversa).
a.1.- Ultrafiltración. ( o filtración de
flujo cruzado)
•Es la separación selectiva usada para
concentrar o para purificar
compuestos de medio y alto peso
molecular como: proteínas,
carbohidratos, y enzimas.
•Se usa en la separación de células,
restos celulares o proteínas.

•La desventaja principal es el

ensuciamiento de la membrana.
 Aplicación.
- Clarificación de jarabe de maíz como dextrosa y fructosa
- Concentración del agua de lavado de almidón
- Enriquecimiento de dextrosa
 R.O. Se revierte el flujo de moléculas
a.2.- Osmosis inversa (RO) de agua a través de la membrana
Osmosis. Proceso natural semipermeable, como resultado de
mediante el cual moléculas de aplicar presión a la solución de mayor
agua fluyen a través de una concentración.
membrana semipermeable, desde •Es posible obtener agua pura a partir
una solución de baja de una solución de alta concentración.
concentración a otra de mayor
concentración.
Algunas aplicaciones
Industria Azucarera
•La industria de azúcar, adiciona cal y floculan, para clarificar
el jugo y remover impurezas como ceras, dextrinas y gomas
previo al refinamiento del jugo para su evaporación y
cristalización.
•La filtración por membranas puede clarificar el jugo natural,
eliminando el uso de químicos y mejorando la calidad y el
rendimiento del jugo.
Industria Farmacéutica /Biotecnología
•La filtración por membranas reemplaza a los métodos de
separación como los filtros rotativos al vacío o la
centrifugación, mejorando en forma significativa el
rendimiento del proceso.
Otras aplicaciones incluyen:
•Purificación y concentración de aminoácidos
•Recuperación y purificación de péptidos y proteínas
•Concentración y desmineralización de plasma sanguíneo
…algunas aplicaciones.
Industrias Química y Ambiental
• La filtración por membranas puede usarse para procesar
efluentes líquidos para reducir DBO, DQO (Demanda Biológica
y Química de Oxigeno) produciendo agua limpia.

Aplicaciones típicas:
• Tratamiento de efluentes líquidos en plantas de la
industria láctea y alimenticia
• Ajuste final de las características del condensado
proveniente de un evaporador
• Recuperación y reutilización de soluciones de limpieza
agotadas
• Desalinización y purificación de tinturas y pigmentos
• Tratamiento de efluentes de lavados en la industria textil
• Concentración y eliminación de agua de minerales como
caolin, dióxido de titanio y carbonato de calcio
 b.- Destilación.
•Se usa para la concentración de productos biotecnológicos no lábiles
como etanol.
•Es la operación de separar, por vaporización y condensación en los
diferentes componentes líquidos, o gases licuados de una mezcla,
aprovechando los diferentes puntos de ebullición de cada una de
las sustancias.
•La destilación azeotrópica es una de las técnicas usadas para
romper un azeótropo en la destilación. Un caso común es el
azeótropo de la mezcla etanol-agua. En la mezcla al 95/5 %
etanol/agua, los coeficientes de actividad del agua y del etanol son
iguales, entonces la concentración del vapor de la mezcla también es
de 95/5 % etanol-agua, y la destilación no es efectiva.
•El azeótropo 95/5 % debe romperse para lograr una mayor
concentración.
•Un método consiste en adicionar un material agente de separación.
Por ejemplo, benceno a la mezcla, que cambia la interacción
molecular y elimina el azeótropo.
•La desventaja, es la necesidad de otra separación para retirar el
benceno.
Destilación al vacío.
•La variación de presión en la
destilación, se basa en el hecho de que
un azeótropo depende de la presión y
que este es un punto en el que los
coeficientes de actividad se cruzan.
•El azeótropo se puede saltar para
continuar la destilación. Esto se logra
cambiando la presión.
•Comúnmente, la presión se fija de
forma tal que el azeótropo quede cerca
del 100 % de concentración, para el
caso del etanol, éste se puede ubicar
en el 97 %.
Método de tamiz molecular.
•El azeotropo 95/5 %, se hace pasar
por un lecho de moléculas que
absorben el agua de la mezcla. Luego
el tamiz se calienta para eliminar el
agua y puede reutilizarse.
 c.- Absorción.
•Consiste en la separación de uno o más
componentes de una mezcla gaseosa con la ayuda
de un solvente líquido con el cual forma solución
(un soluto A, o varios solutos, se absorben de la
fase gaseosa y pasan a la líquida).
•Un ejemplo es la absorción de amoníaco A del
aire B por medio de agua líquida C.
•Las torres empacadas, o torres de relleno,
utilizadas para el contacto continuo del líquido y
del gas tanto en el flujo a contracorriente como a
corriente paralela, son columnas verticales que se
han llenado con empaque o con dispositivos de
superficie grande.
•El líquido se distribuye sobre éstos y escurre hacia
abajo, a través del lecho empacado, de tal forma
que expone una gran superficie al contacto con el
gas.
 PROCESOS DE PURIFICACION

•Pre-tratamiento y
acondicionamiento.
Adsorción,
precipitación.
•Alta resolución:
cromatografía de
intercambio,
cromatografía de
afinidad, cromatografía
de ligando,
cristalización.
•Terminación: filtración
por geles, HPLC.
 Métodos de laboratorio. Cromatografía.
•En cromatografía, las moléculas se
distribuyen entre dos fases distintas, y
la separación tiene relación directa con
su diferencia de solubilidad en cada
fase.
•Los compuestos mas afines a la fase
móvil que a la fase estacionaria
recorren una distancia mayor que los
demás.
•Los diversos métodos cromatográficos
difieren con respecto a la fase móvil
(líquido o gas), la fase estacionaria
(papel, gel o empaque sólido) y la
fuerza que impulsa a la fase móvil
(presión, gravedad o un campo
eléctrico).
•En la investigación fitoquímica.
•Después de triturada la planta se lleva
a un proceso de maceración en donde
el material vegetal esta en contacto
con un disolvente, para
posteriormente aplicar cromatografía.
Precipitación
•Se concentra el soluto de
una solución convirtiéndolo
en sólido mediante la acción
de un agente precipitante.

Ventajas:
1. Operación que se adapta
fácilmente a gran escala
2. Puede realizase en forma
continua
3. El equipo que se utiliza es
sencillo
4. Se dispone de diversos
agentes precipitantes y en
muchos casos éstos son
baratos
 Precipitación salina (Salting-out)
•En altas concentraciones salinas (o
alta fuerza iónica) algunos solutos
como proteínas
ó polímeros precipitan debido al
aumento de las interacciones
hidrofóbicas entre ellos.

•La concentración salina y el tipo de

sal requerida para la precipitación
varían con el soluto.

•Este fenómeno es empleado para la

separación de proteínas.

•Mecanismo: La adición de sales

elimina el agua de la proteína
hidratada, dejando las regiones
hidrofóbicas en libertad de combinarse
intermolecularmente
 Ecuación de la precipitación con sales
Log S = A−m[Sal]
•Donde: S = Solubilidad de la proteína a un valor dado de
concentración salina.
•A = Constante que depende la proteína, del pH y la
temperatura. (toma un valor mínimo en el punto isoeléctrico)
•m = Pendiente de la curva de solubilización por salado. Ésta
es independiente del pH y la temperatura, pero varía con el
tipo de sal y de proteína. (Las sales con aniones polivalentes
tales como sulfatos y fosfatos tienen m mayores que las sales
univalentes, y los cationes polivalentes como el calcio y el
magnesio disminuyen el valor de m)
•Naturaleza de la sal:
•Los aniones son más efectivos en el siguiente orden (Series de
Hofmeister):

•Los cationes son efectivos en el siguiente orden:

Precipitación isoeléctrica
•Esta técnica se basa en la
disminución de la
solubilidad en el punto
isoeléctrico
Mecanismo
•Las proteínas por su
naturaleza anfotérica
presentan una carga neta
negativa a pH altos y una
carga neta positiva a pH
bajos.
• En el pH isoeléctrico, la
carga neta de la proteína es
cero.
•A este pH la repulsión
entre moléculas es mínima
y se produce agregación.
Precipitación con solventes
•Disminución de la solubilidad
Constantes dieléctricas a 20 oC
por adición de un solvente
orgánico ligeramente polar
Mecanismo
•El agua se caracteriza por su
alta constante dieléctrica, lo
cual significa que los iones en
solución acuosa presentan
interacciones débiles entre si.
•Un solvente orgánico (etanol o
acetona), presenta una
constante dieléctrica menor que
•Log S= log So + K / D2S
la del agua, lo cual produce una
disminución en el grado de •S = Solubilidad de la proteína
ionización de los radicales de las •DS = Constante dieléctrica de la
proteínas, y en consecuencia mezcla solvente-agua.
una disminución en la •K = Constante dieléctrica original
solubilidad de ésta. del medio acuoso.
•So = Es la solubilidad extrapolada
 Precipitación de proteínas por
desnaturalización selectiva
•El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las
condiciones en las cuales la proteína de interés no se
desnaturaliza o su desnaturalización es mínima
•Si la proteína que se desea purificar presenta estabilidad
en condiciones extremas de temperatura, pH, o en
solventes orgánicos, puede utilizarse esta propiedad en las
primeras etapas del proceso de purificación.

Métodos de desnaturalización:
•Por temperatura.
•Por pH
•Por solventes orgánicos.
 Precipitado industrial
•En el diseño de un proceso de precipitación debe tomarse como
base el comportamiento cinético de las partículas en solución. El
conocimiento de este comportamiento permite hacer la selección
adecuada de la geometría en la que se realizará el proceso.

Se puede idealizar la precipitación como un mecanismo de 6

etapas:
1. Mezclado inicial: La alimentación conteniendo el soluto es
mezclada con el no-solvente o la sal
2. Nucleación: Aparecen pequeñas semillas e inicia la precipitación
3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por
difusión
4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es
ayudado por mezclado
5. Floculación: Partículas coloides se agregan en flóculos grandes
6. Centrifugación: Los flóculos son separados por los métodos ya
descritos Alguno de estos procesos ocurrirán simultáneamente,
pero se discutirán como si ocurriesen secuencialmente
 TERMINADO DEL PRODUCTO

• Etapa final del proceso.

• El producto se lleva a su concentración final, se
agregan conservantes y se envasa.
REFERENCIAS
• Dow. Liquid Separations. FILMTEC. Reverse Osmosis
Membranes, Technical Manual . January 2004.
• Espinel, Esperanza; López, Elizabeth. Purificación y
caracterización de a-amilasa de penicillium commune
producida mediante fermentación en fase sólida. Revista
Colombiana de Química, vol. 38, núm. 2, 2009, pp. 191-208,
Universidad Nacio.
• Uyazán, A.M.* Gil, I.D. Aguilar, J.L. Rodríguez, G. Caicedo, L.A.
Produccion de alcohol carburante por destilación azeotrópica
homogénea con glicerina. Grupo de Procesos Químicos y
Bioquímicos - Departamento de Ingeniería Química,
Universidad Nacional de Colombia – Bogotá, Colombia.
amuyazanr@unal.edu.co
• Ivonne ximena cerón Salazar. Separación de metabolitos de
los aceites esenciales de eucalipto y cidrón por destilación
molecular. Departamento de Ingeniería Química, Universidad
Nacional de Colombia Sede Manizales. Manizales, Colombia
2009