PRIMERS E. Coli (NUEVO)

PRIMERS
BACTERIANOS ITS 16
Cruz Karla, Guzman Ana,

Jaimes Jessica
Universidad de Pamplona
Biotecnología II
Articulo
 A efectos de comparación, un
conjunto de cebadores
bacterianos universales
también se utilizó:
5'TGCCAGCAGCCGCGGTA
ATAC- 3 '(515 a 535, forward)
y
5‘CGCTCGTTGCGGGACTT
AACC-3' (1107-1087, reverse)
GGTTAAGTCCCGCAACGA
GCG
(E coli, J01859). Estos
cebadores son altamente
conservados entre una amplia
gama de bacterias y amplifican
un fragmento de 593 pb del 16S
rDNA.
PRIMERS BACTERIANOS ITS 16
Forward Primer U515

TGCCAGCAGCCGCGGTAATAC (Han, X. Y. et.
al., 2002)
Reverse Primer U1087
CGCTCGTTGCGGGACTTAACC (Han, X. Y., et.
al. 2002)
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra: Preparar una suspensión translúcida no cuantificada
de un cultivo puro de 3 días.
Tomar 2 a 3 colonias, resuspender en 200 µl de solución de extracción (PrepMan
Ultra, Applied Biosystems).
 Después se llevara a ebullición (10 minutos)

 centrifugación (5 minutos)
 Extraer el ADN genómico
Condiciones PCR
DNA 1% 2µL
Taq polimerasa 2U 1µL
dNTPs 1µmol/L 1µL
Primers 100µmol/ L 1,2 µL
Buffer 1X 10µL
MgCl2 1,5mM 3µL
H2O - 31,8µL
50µL

CICLO PCR
Nombre del protocolo 16s rDNA
Configuración de termociclador
Activación de la polimerasa 95 ° C durante 120 segundos
Denaturacion 30 ciclos de 96 ° C durante 15

segundos
Adhesión de cebadores 60 ° C durante 90 segundos
Extensión 72 ° C durante 120 segundos
Extensión final 72 ° C durante 300 segundos

SECUENCIACION DE AMPLICONES
 Ejecutar un volumen 5 µl en un
gel de agarosa al 1,5% para
verificar la amplificación y el
tamaño del producto.
 El par de cebadores U515 y

U1087 produce una banda de
aproximadamente 550 pb y no
hay bandas secundarias
aparentes.
E. coli J01859
Alineamiento
Forward
Primers
Reverse
Primers
PASOS :
PROGRAMA NEB CUTTER
1. PEGAR LA SECUENCIA
2. SUBMIT
3. CUTOM DIGEST
4. SELECCIONAR ENZIMAS
5. DIGEST
6. VIEW GEL
ENZIMAS
 EcoRI
 HindIII
INGRESAR Y PEGAR LA
SECUENCIA
ENZIMAS DE
RESTRICCION
ENZIMAS para la digestión
Seleccionar las enzimas
• EcoRI
• HindIII
Sitios donde cortan las enzimas
Corrida en gel de Agarosa
Extracción de ADN Escherichia coli
• Cultivos recientes de E.coli

• Amortiguador de lisis
• NaCl 5M
• Cloroformo
• Etanol absoluto frió
• TE
• RNAsa
• Câmara de electroforesis
 1.5 ml de cultivo saturado de
bacterias, centrifugar 5 min. a 13,000
rpm.
 Resuspender el sedimento con 200μl

de amortiguador de lisis
 Añadir 66μl de 5M NaCl y mezclar

bien (para remover la mayor cantidad
de proteínas)*
calentar por 10 minutos a 65ºC para
mayor lisis celular.*
 Centrifugar a 13,000 rpm por 10
min., transferir el sobrenadante a un
microtubo nuevo.
 Añadir 1 Vol. De fenol/cloroformo o
cloroformo y mover invirtiendo el
microtubo gentilmente hasta ver una
solución blancuzca.
 Centrifugar a 13,000 rpm por 3 min.,

transferir sobrenadante a un
microtubo nuevo.
*es recomendable hacer una segunda

extracción con cloroformo para mayor
limpieza del DNA.
 Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto (frío) o 0 .6 volúmenes
de alcohol isopropílico para precipitar el DNA por 15 minutos,
centrifugar 5 min. a 13,000 rpm. (si se coloca en hielo o en
-20ºC se puede precipitar mayor cantidad de DNA)
 Descartar el sobrenadante y añadir 500 μl de etanol al 70%

para lavar el DNA, centrifugar por 5 minutos a 13,000rpm.
 Descartar el sobrenadante y secar.
 Resuspender en 40-70μl TE 1X (RNA se remueve utilizando

RNAsa 10μg/μl, colocando en baño de María 30 min. seguido
de una extracción con cloroformo para remover la RNAsa)
 Guardar a -20 °C
Cuantificación de ADN
 La cuantificación se realiza en un NANO DROP 2000 por
triplicado y se realiza un promedio con el fin de reducir
cualquier error que se pueda haber producido en la lectura.
NANO DROP es un espectrofotómetro

empleado para cuantificar ácidos nucleicos
y proteínas el cual trabaja con muestras de
0.5 μL
 Realiza la medición en menos de 5
segundos.
 Brinda medidas de ADN, RNA, la

concentración de proteínas y la
relación 260/280, que indican una
pureza adecuada.
 Tiene un amplio rango de lectura de

concentración (2 ng/μL – 15,000
ng/μL dsADN).
 Fácil calibración, solo se usa un fluido

de control
 Bajo costo de operación (No requiere

consumibles)
 Tiene un software amigable con el

usuario, el cuales compatible con la
mayoría de las computadoras.
CLONACION
DE AND
1. Aislar el Fragmento
2. Seleccionar el vector adecuado
3. Ligación
4. Inserción del vector en un organismos
5. Propagación
6. Purificación
 Restricción: Las enzimas de restricción o restrictasas
catalizan el corte de ambas cadena azúcar–fosfato del
dsDNA: EcoR; Hind
 Ligación: Las DNA ligasas requieren como sustrato dos
extremos de DNA; un extremo 5’ (portador de un grupo
fosfato) y un extremo 3’ (grupo hidroxilo de la
desoxirribosa).
 Transformación: La célula
se “transforma” o altera
genéticamente).
 Selección: Resistencia a
antibióticos, de forma que
sólo las células que han
incorporado dicho vector
(con o sin pasajero) serán
capaces de crecer en un
medio selectivo
suplementado con dicho
antibiótico.
 Purificación del DNA pasajero (amplicón obtenido por PCR)
 Purificación del DNA vector
 Cuantificación del DNA
 Digestión del DNA vector: generación de extremos romos
 Extensión del DNA vector y pasajero: generación de colas T o
A
TRANSFORMACIÓN DE E. COLI Y
SELECCIÓN DE
TRANSFORMANTES
 Para incrementar la eficacia del
proceso, se somete al cultivo de
células hospedadoras a
determinados tratamientos
químicos y/o físicos para hacerlas
“competentes” (esto es, capaces
de incorporar más fácilmente
DNA externo).
GRACIAS

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Cruz Karla, Guzman Ana,

Forward Primer U515

 Después se llevara a ebullición (10 minutos)

Denaturacion 30 ciclos de 96 ° C durante 15

Extensión 72 ° C durante 120 segundos

Extensión final 72 ° C durante 300 segundos

 El par de cebadores U515 y

• Cultivos recientes de E.coli

 Resuspender el sedimento con 200μl

 Añadir 66μl de 5M NaCl y mezclar

 Centrifugar a 13,000 rpm por 3 min.,

*es recomendable hacer una segunda

 Descartar el sobrenadante y añadir 500 μl de etanol al 70%

 Descartar el sobrenadante y secar.

 Resuspender en 40-70μl TE 1X (RNA se remueve utilizando

NANO DROP es un espectrofotómetro

 Brinda medidas de ADN, RNA, la

 Tiene un amplio rango de lectura de

 Fácil calibración, solo se usa un fluido

 Bajo costo de operación (No requiere

 Tiene un software amigable con el

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