Lab1 BQ Enf 2016

BIOQUÍMICA - LABORATORIO
Espectrof
otometría
Absorción de
Molecular
Pro fes o ra: 
nic a
Veró tana
San
P l aza
 
Objetivos
0 Reconocer el espectro de absorción y su utilidad.
0 Conocer y familiarizarse con la Ley Lambert-Beer y su
importancia.
0 Distinguir las limitaciones de la ley de Lambert-Beer.
0 Reconocer una curva de calibración.
0 Identificar distintas maneras de conocer la
concentración de una muestra problema.
Espectro Electromagnético
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se

les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el
violeta, ultravioletas.
Tipos de interacción
Absorción: la luz se absorbe por un átomo, ion o molécula que

adquiere un estado superior de energía.
Emisión: se libera energía de un átomo, ion o molécula que

adquiere un estado inferior de energía.
ESPECTROFOTOMETRÍA
0 Medición de la cantidad de energía

radiante que absorbe un conjunto de
elementos o un elemento en su estado
puro, en función de la longitud de onda
de la radiación lumínica (UV-Visible) y a
las mediciones a una determinada
longitud de onda
ESPECTRO DE ABSORCIÓN
ABSORCIÓN DE RADIACIÓN
ELECTROMAGNÉTICA (Luz)
a Proceso por el cual una especie en un medio

transparente, capta selectivamente ciertas frecuencias
de la radiación.
La ABSORCIÓN de luz por una sustancia tiene lugar cuando la luz posee la
energía precisa para provocar los cambios precisos. Estos cambios
(siempre discretos), pueden ser:
• Electrónicos (átomos y/o moléculas)

• Vibracionales (sólo moléculas)
• Rotacionales ( sólo moléculas)
Ley de Lambert
a Cuando un rayo de luz monocromático (I0) pasa a

través de un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente (I) a medida que la
longitud del medio absorbente aumenta.
I0 I I0 I I0 I
1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer
Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentración del
medio absorbente aumenta.
I I
I0 I I0 I0
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de
Lambert- Beer donde la fracción de luz incidente que es absorbida
por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al
espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (I0) y la luz transmitida(I) dará una
idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la
muestra.
Términos comunes
Absortividad (a): es una constante de proporcionalidad que

comprende las características químicas de cada compuesto o,
molécula y su magnitud depende de las unidades utilizadas para b y
c.
Cuando se expresa la concentración en moles/litro y la trayectoria a
través de la celda en centímetros , la absortividad se denomina
absortividad molar (también llamado coeficiente de extinción molar)
y se representa por el símbolo .
A=  bc
Donde A representa la absorbancia del compuesto en estudio.
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0 pasa a
través de una solución, parte de la luz es absorbida resultando que la
luz emergente I es menor que I0
Luz incidente Luz absorbida Luz transmitida

( I0 ) (I)
a = absortividad
a
T
c c = concentración
b (número de partículas por cm3)
Longitud del medio absorbente o ancho
de la celda
LEY DE LAMBERT - BEER
Intensidad del haz antes de

atravesar el blanco
Absortividad molar
Absorbancia
total medida a I0 [M] de las
la longitud de
Al = log =ebc especies
I absorbentes
onda l camino
óptico
A = - log T
Intensidad del
I = Transmitancia (T) haz luego de A = log 1
I0 atravesar la T
muestra
La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de luz
transmitida por una muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (I0):
T = I / I0
Se expresa como % T
T = I x 100
I0
La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del
recorrido b a través de la solución y la concentración c del color
absorbente. Estas relaciones se dan como:
A = a· b· c
A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro,
entonces la absortividad tiene unidades de L·g–1·cm–1.
¿Qué relación guardan la
transmitancia y la absorbancia?
De acuerdo a las características de la sustancia analizada, la luz

que no se absorbe atraviesa la solución
LUZ A
B
S
Luz incidente O Luz transmitida
R
I0 B
I
D
I
A
T= I/Io
Representación gráfica correspondiente a absorbancia y
transmitancia en un gradiente de concentraciones
Concent
ración
LIMITACIONES DE LA LEY DE
LAMBERT-BEER
REALES
• Variación de la absortividad debida al disolvente
• Concentración
APARENTES
• Instrumentales: radiación policromática

• Químicas: cambios químicos de las especies
absorbentes por
interacción con el disolvente
Desviaciones a la Ley de Lambert-Beer
La mayor parte de las especies cumplen con la ley en un determinado intervalo

de concentraciones. Fuera de él, experimentan desviaciones positivas o
negativas. Esto se observa bien en el calibrado:
Absorbancia
Respuesta debida
a la autoabsorción
o a la luz escasa que
atraviesa la cubeta
Respuesta del blanco,
interferencias o escasa
sensibilidad
Concentración (mM)
Es preciso asegurar que se está trabajando en

el intervalo lineal.
Componentes básicos de los instrumentos para
medidas de absorción molecular en el UV-Visible
DISPOSITIVO
DE LECTURA
DETECTOR
Muestra
CUBETAS
coloreada:
(Muestra)
Cromógeno
SELECTOR DE
LONGITUD DE ONDA
FUENTE DE ENERGÍA
RADIANTE
¿Cómo determino la longitud de
onda indicada?
0 Realizando un barrido de longitudes de onda para

conocer el espectro de absorción del compuesto en
estudio.
Ejercicio
0 ¿Cuál es la longitud de onda más adecuada para
cuantificar a este compuesto?
Curva de Calibración
El razonamiento para el proceso de determinación de
una concentración desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las cuales
también se sabe su absorbancia (curva patrón), es
posible interpolar (intercalar) la concentración del
problema sabiendo su absorbancia.
Curva de Calibración de la glucosa según el método
Somogyi-Nelson
A (540 nm)
0.6
0.5
0.4
Absorbancia del problema
0.3
0.2 Interpolación
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/mL
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la
concentración, se comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.
Si despejamos C1 = Concentración del problema
A1 (problema) x Conc estándar

Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Aplicaciones analíticas
La espectrofotometría de absorción molecular se puede aplicar tanto al
análisis cualititativo como cuantitativo.
Análisis cualitativo: los espectros de la muestra se han de
comparar con los correspondientes a estándares con el fin de
identificar las bandas de absorción coincidentes. Este tipo de análisis
es mas frecuente en UV e IR para identificar compuestos orgánicos y
mas rara vez se utiliza el Vis.
Análisis cuantitativo: está basado en la ley de Lambert -Beer en el

intervalo de concentraciones de cumplimiento de la ley. Se establece
la curva de calibrado usando estándares y la absorbancia de la
muestra de concentración desconocida se remite a la curva ( a veces
basta con un solo estándar).
Problemas:
¿Cuál es la longitud de onda

optima para KMnO4 ?
Determine, mediante una
curva de calibración la
concentración de una muestra
problema
Problemas:
¿Cómo se puede medir la
cantidad de Carboxihemoglobina
en un paciente?
% HbCO = (2,44
–A558/A532)X67.
Se consideran valores normales en
personas sanas, no fumadores, aquellos
menores a un 10% de HbCO.

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Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se

Absorción: la luz se absorbe por un átomo, ion o molécula que

Emisión: se libera energía de un átomo, ion o molécula que

0 Medición de la cantidad de energía

a Proceso por el cual una especie en un medio

• Electrónicos (átomos y/o moléculas)

a Cuando un rayo de luz monocromático (I0) pasa a

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Absortividad (a): es una constante de proporcionalidad que

Luz incidente Luz absorbida Luz transmitida

Intensidad del haz antes de

De acuerdo a las características de la sustancia analizada, la luz

• Instrumentales: radiación policromática

La mayor parte de las especies cumplen con la ley en un determinado intervalo

Es preciso asegurar que se está trabajando en

0 Realizando un barrido de longitudes de onda para

Si despejamos C1 = Concentración del problema

A1 (problema) x Conc estándar

Análisis cuantitativo: está basado en la ley de Lambert -Beer en el

¿Cuál es la longitud de onda

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