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    Título original

    02. Microscopía

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    Microscopio Optico Compuesto:

    • Concepto
    Microscopio electrónico:
    • Importancia del microscopio en la Biología • Concepto
    Celular y molecular • Poder de resolución
    • Formación de la imagen • Tipos de microscopio electronico y
    • Partes ópticas y mecánicas: localización y sus aplicaciones
    función
    • Poder de resolución
    • De barrido
    • Manejo del microscopio óptico compuesto • De transmisión.
    • Preparaciones temporales y permanentes
    • Tipos de microscopio óptico y sus
    aplicaciones:
    • Campo claro
    • Contraste de fases
    • Fluorescente
    • Luz polarizada
    • Campo oscuro
    • Confocal
    • Videomicroscopía digital
    Microscopio, del griego: "mikro" = pequeño y
    "scopeõ" = mirar (para mirar cosas pequeñas)

    se clasifican en:

    MICROSCOPÍ MICROSCOPÍA
    MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
    A
    DE LUZ

    De acuerdo con la radiación


    que utilizan
    La naturaleza de la luz
    • Puede ser descrita mediante dos modelos:
    – Por su forma de propagación, naturaleza ondulatoria (James Clerk
    Maxwell)
    – Por su forma de interactuar con la materia, naturaleza
    corpuscular ó fotónica (Albert Einstein)
    • Forma parte del espectro electromagnético
    • Luz blanca está constituida por varios colores diferentes (Isaac
    Newton)

    Espectro electromagnético
    Luz visible
     Forma parte de una estrecha franja que va
    desde longitudes de onda de 400 nm (violeta)
    hasta los 700 nm (rojo). (0.4 – 0.7 mm)
    ESPECTRO
    ELECTROMAGNÉTICO
    ESPECTRO VISIBLE
     El espectro de luz visible puede ser percibido
    por el ojo humano y su frecuencia determina su
    color.
    Las Lentes
    • Objetos que concentran o
    hacen diverger los rayos
    de luz

    • Existen dos tipos


    principales de lentes:
     Convergentes: forman Lentes convergentes
    imágenes reales
     Divergentes: forman
    imágenes virtuales

    Lentes divergentes
    Conceptos en microscopía
     Amplificación: Aumento del Ocular 10x
    Objetivo 10x
    tamaño de la imagen. Aumento Total 100x

     Amplificación total: Dado por el


    producto de la lente ocular por el
    objetivo.
     Amplificación Vacía:
    Incremento de la imagen sin que
    pueda percibirse mayores detalles.
     Poder de Resolución: Medida
    de la capacidad para ver
    puntos vecinos como entidades
    diferentes. El límite de
    resolución del microscopio de
    luz es de 0.2 micrómetros (0.22
    μm) ó 200nm.
     Medidas Microscópicas

    • Milímetro: milésima parte del metro (mm)


    • Micrómetro: milésima parte del milímetro (mm)
    • Nanómetro: milésima parte del micrómetro (nm)
    • Angstrom: décima parte del nanómetro (Aº)
    Microscopio
    compuesto
    fabricado en
    1751 por
    Magny.
    El microscopio compuesto
    • Instrumento óptico que se usa para
    aumentar o amplificar las imágenes
    de objetos y organismos no visibles
    a simple vista.
    • Se utiliza para examinar objetos
    transparentes o cortados en láminas
    tan finas que se transparentan

    • Está conformado por tres sistemas:


    1. Iluminación
    2. Óptico
    3. Mecánico
    Formación de la imagen
    FUENTE DE LUZ
    Imprescindible para que funcione el microscopio

    CONDENSADOR
    Concentra los rayos dispersos e ilumina solo la muestra

    LENTE OBJETIVO
    Amplifica la imagen y forma: IMAGEN REAL E INVERTIDA

    LENTE OCULAR
    Amplifica la imagen anterior y forma una IMAGEN VIRTUAL

    LENTE INTRAOCULAR

    Genera la imagen sobre la retina que es la que el cerebro interpreta


    1. Campo claro, brillante o luminoso:
    La luz proveniente de la fuente converge
    sobre la muestra se forma un campo
    brillante alrededor de la imagen de la
    • El contraste lo provee
    muestra.
    la
    tinción de las muestras

    Imágenes con
    microscopio de
    campo claro
    MICROSCOPIOS DE CAMPO CLARO, BRILLANTE Ó
    LUMINOSO

    Microscopio óptico Microscopio óptico convencional


    convencional con doble óptica para aprendizaje
    TEMPORALES Muestra +Colorante
    +
    Medio de Montaje
    Muestra + Fijadores +
    FIJAS Tinción + Medio de Montaje

    Cubreobjeto

    Portaobjeto
    2. Contraste de Fases:
    Convierte la diferencia
    de índices de refracción
    en diferencias de
    intensidad.

    • Permite observar muestras vivas, o carentes de color.


    • sin uso de colorantes
    3. Fluorescencia:
    Utiliza moléculas fluorescentes que al iluminarlas con
    radiación invisible, emiten radiación visible.
    Utiliza luz de longitud de onda corta (uv) para excitar
    los electrones de la muestra.

    Bacillus subtilis
    esporulando Fibroblastos teñidos con el
    teñidos con FITC, fluorocromo FITC
    DAPI y
    βgalactosidasa.
    La muestra se “tiñe” con una sustancia fluorescente
    (fluorocromos) que absorbe la energía de las ondas cortas
    de la luz y emite la luz de longitudes de ondas más largas
    (verde).
    4. DE LUZ POLARIZADA:
    .
    • Se basa en la birrefringencia (emite
    brillantez) de los objetos.
    • Utiliza luz polarizada plana.
    • Las muestras se colocan entre dos
    láminas polaroid que tienen sus
    direcciones de vibración
    perpendiculares

    Cristales de ácido urico observados


    con microscopio de luz polarizada
    5. MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
    • Dispositivo que permite transmitir la luz de forma
    circular, dejando el centro oscuro.
    • Con esto conseguimos que el fondo de la muestra
    aparezca negro y los especímenes brillantes.
    • El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así
    visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como
    las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol
    que se cuela en una habitación cerrada.
    • Las porciones transparentes del
    espécimen quedan oscuras,
    mientras que las superficies y
    partículas se ven brillantes, por la
    luz que reciben y dispersan en
    todas las direcciones
    • Se utiliza para analizar elementos
    biológicos transparentes y sin
    pigmentar, invisibles con
    iluminación normal, sin fijar la
    muestra, es decir, sin matarla.
    6. Confocal: Combina la microscopía
    fluorescente con el análisis electrónico de
    la imagen para obtener imágenes
    tridimensionales.

    Utiliza muestras
    de cortes seriados
    teñidas con
    fluorescencia,
    para reconstruir
    una imagen
    tridimensional
    Microscopio
    confocal
    CAMPO CLARO Requiere tinciones

    Permite diferenciar
    CONTRASTE DE FASES densidades, no
    tinciones

    Utiliza luz UV, usa


    FLUORESCENCIA fluorocromos
    MICROSCOPIA
    OPTICA
    DE LUZ POLARIZADA Produce birrefringencia

    Permite ver muestras


    CAMPO OSCURO
    vivas, no tinciones

    CONFOCAL Forma imágenes 3D


    HA
    ELEC Z DE
    TRON
    ES

    CÁMARA AL VACÍO

    LENTES: ELECTROIMANES

    MICROSCOPIO
    ELECTRÓNICO

    IMAGEN: EN UNA PANTALLA


    • El factor limitante del poder de resolución del
    microscopio compuesto, es la longitud de onda de la
    luz

    Imagen en
    microscopio Imagen en microscopio
    Debido a que el microscopio
    electrónico utiliza electrones y
    los electrones tienen una
    longitud de onda de 0.004 nm
    (100,000 más corta que la de
    la luz), pueden mostrar
    estructuras mucho más
    pequeñas, por lo que
    presentan alto poder de
    resolución.
    Hay dos tipos básicos de
    Microscopios Electrónicos, en ambos

    • El de transmisión (Transmission
    Electron Microscope, TEM)

    • El de barrido (Scanning Electron


    Microscope, SEM).
    icroscopía de transmisión: Los electrones pasan
    través de la muestra, la cual debe cortarse
    n finas capas. Límite de Resolución de 1 a 2 nm
    icroscopía de Barrido o tridimensional:
    os electrones chocan (barren) con la muestra,
    n lugar de atravesarla. Produce imágenes
    ridimensionales de la superficie del objeto.
    mite de Resolución de 10 nm
    Óvulo de hámster sin zona
    pelúcida con espermatozoides

    Criofractura de epitelio gástrico vista por


    microscopia de barrido
    Microscopio Electrónico
    de Barrido
    SS-550

    Imagen de electrones
    secundarios en una muestra de
    cerámica:
    Ampliación: 10.000x
    Aceleración: 15.0 kV
    Permite ver el
    DE
    interior de las
    TRANSMISION
    estructuras

    MICROSCOPIA
    ELECTRONICA

    Permite ver la
    DE BARRIDO superficie de las
    estructuras

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