REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE SAAD DAHLAB-BLIDA

FACULTE DE MEDECINE

Techniques immunologiques avec traceurs

Par : Dr BABASACI .R
Année universitaire 2017-2018
 Introduction :
Les immuno-analyses sont des techniques qui utilisent un réactif (antigène ou anticorps) associé à un
traceur détectable permettant de révéler la liaison antigène–anticorps spécifique. Les traceurs augmentent
la sensibilité d'une immunoanalyse et permettent de déceler des quantités plus faibles de cible que les
méthodes qui ne les utilisent pas. Trois grands types de traceurs sont utilisables, des enzymes, des
fluorochromes et des radio-isotopes. Initialement, ce sont ces derniers qui ont permis la mise en évidence
de réactions antigène–anticorps non décelables directement. Les contraintes liées à l'utilisation des radio-
isotopes ont conduit à développer des méthodes immuno-enzymatiques et d'immunofluorescence qui ont
progressivement supplanté les techniques radio-immunologiques.

Définition :

-Marqueur : une entité (atome, molécule, ion…) liée chimiquement à une molécule d’antigène ou
d’anticorps et délivrant un signal (direct ou indirect) quantitativement mesurable.
-Traceur : molécule sur laquelle est lié le marqueur pouvant être un antigène ou un anticorps.
-Analyte : molécule dont la concentration est mesurée par l’immunodosage, peut être un antigène ou un
anticorps.
-La sensibilité : désigne la probabilité d'obtenir un test positif sur un individu porteur de la maladie.
-La spécificité : désigne la probabilité d'obtenir un test négatif sur un individu non porteur de la maladie. La
sensibilité exclut la maladie tandis que la spécificité l'affirme.

Les radio-isotopes comme traceurs :

Les deux principaux radio-isotopes utilisés dans les techniques immunologiques sont l'iode-125 (125I) et le
tritium (3H). Ils sont employés pour le marquage d'une molécule qui sert alors de traceur radioactif. Ce
caractère radioactif restreint leur utilisation, soumise à une réglementation spécifique. L'iode-125 est un
radionucléide artificiel dont la période radioactive est de 59,7 jours. Il émet des rayonnements X (raie
principale 27 keV) et γ (raie principale 35 keV) dont la détection est assurée par un scintillateur solide
d'iodure de sodium associé à un photomultiplicateur.
Le marquage radioactif ne modifie pas la structure moléculaire, en particulier l'immunoréactivité.
Après couplage, le traceur doit être utilisé rapidement afin d'obtenir le signal optimal corrélé à son activité
spécifique. On distingue plusieurs types de dosage radio-immunologique :

Méthode par compétition (ou par défaut d'anticorps) :

Principe : repose sur la compétition entre des molécules d'antigène marquées (Ag*) et non marquées
(Ag) d'une même espèce vis-à-vis d'un nombre donné et limité de sites de liaison anticorps. L'anticorps
(Ac) est fixé sur une phase solide, paroi de tube ou billes de polystyrène. L'excès de traceur est éliminé
après incubation par une étape de lavage. La quantité des formes liées (Ag*-Ac) est inversement
proportionnelle à la quantité de l'analyte non marqué (Ag) présent dans l'échantillon. Les trousses de
dosage fournissent le support solide (tubes, billes), l'analyte marqué et une gamme étalon couvrant le
domaine de mesure.

Figure 1 : radio-dosage par compétition.

Méthode sandwich
Le principe du dosage s'appuie sur la reconnaissance de l'antigène dosé par deux anticorps spécifiques de
deux sites antigéniques distincts et accessibles. Un premier anticorps est adsorbé sur un support solide
(tube ou bille). Le second anticorps est marqué à l'iode-125 et utilisé comme traceur.
L'antigène de l'étalonnage ou de l'échantillon est pris en sandwich entre les deux anticorps. L'excès
de traceur est éliminé par une étape de lavage. La radioactivité mesurée est proportionnelle à la quantité
d'antigène présente dans l'échantillon.

Figure 2 : radio-dosage par méthode Sandwitch

Méthode par immunoprécipitation en phase liquide (test de Farr pour le dosage des
auto-anticorps anti-ADN double brin)
Cette méthode permet de rechercher des anticorps à l'aide d'antigènes purifiés marqués à l'iode-125. Les
complexes immuns (Ag*-Ac) formés dans le milieu réactionnel sont précipités par l'addition de
polyéthylène glycol (PEG) ou de particules recouvertes de protéine A (spécifiques des immunoglobulines
humaines et des anticorps de souris). Après centrifugation et élimination du surnageant, la quantité de
radioactivité dans le précipité est proportionnelle à la concentration en anticorps de l'échantillon. Cette
technique peut être appliquée au dosage de petits antigènes ne présentant qu'un épitope, comme les
haptènes, des peptides ou certains médicaments. On applique alors le principe de la compétition entre cet
antigène recherché et le même marqué à l'iode-125 ajouté au milieu réactionnel en même temps que des
anticorps spécifiques. La quantité de radioactivité mesurée dans les complexes immuns précipités est
inversement proportionnelle à la quantité de l'antigène recherché.
Avantages et inconvénients
Avantages
 Faible encombrement stérique du tritium
 Grande spécificité
 Grande sensibilité de la détection
 Grande stabilité du signal émis par le tritium

Inconvénients
 Utilisation réglementée des radio-isotopes (précaution d'utilisation, habilitation des personnels et
des locaux, gestion des déchets)
 Demi-vie courte de l'iode-125
 Variation des contrôles de qualité internes des trousses de RIA
 Interférence de la bilirubine, de l'hémoglobine, voire des lipoprotéines
Applications
Les techniques RIA ont été supplantées par les techniques ELISA. Il subsiste quelques domaines
d'application en hormonologie, cancérologie (marqueurs tumoraux), auto-immunité (anticorps
anti-ADN natif) ou pharmacologie (dosage de médicaments et de toxiques).

Dosages immuno-enzymatiques :
L'utilisation d'enzymes comme traceurs a été introduite dans la seconde moitié du xxe siècle pour offrir
une alternative aux radio-isotopes. Pour être efficaces, les enzymes candidates doivent :
 privilégier des contraintes Michaeliennes avec un faible Km pour leur substrat,
 catalyser des réactions irréversibles,
 être stables, résistantes aux interférences et faciles à conjuguer sans perte d'activité.
L'activité enzymatique en présence d'un substrat adapté et d'un chromogène1 génère un produit coloré
proportionnellement à la quantité d'enzymes et donc de la molécule à laquelle elle est conjuguée. La
mesure est réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre et le résultat est exprimé en unités arbitraires de densité
optique (DO). En métabolisant plusieurs molécules de substrat, les enzymes amplifient le signal,
permettant la détection de très faibles quantités de cibles. Le substrat et le chromogène non dégradés ne
doivent pas perturber la lecture et le produit coloré doit être facilement détectable. De plus, il est préférable
que l'enzyme, le substrat et le produit soient absents des préparations à analyser. En raison de leur très
grande spécificité, les anticorps sont souvent utilisés dans des réactions immuno-enzymatiques qualitatives
ou quantitatives visant à détecter des antigènes. Le couplage du traceur sur les anticorps ne doit pas altérer
leur immunoréactivité ni la capacité du traceur à générer un signal. Dans les techniques immuno-
enzymatiques en phase liquide, le produit coloré doit demeurer soluble et rester détectable par
spectrophotométrie ou chimiluminescence. Dans les techniques en phase solide (membranes synthétiques,
cellules, tissus), le produit coloré précipite au site précis de la réaction antigène–anticorps et est détecté
macroscopiquement ou microscopiquement.
L'anticorps (ou l'antigène) est couplé à une enzyme soit de façon covalente, soit par des liaisons
non covalentes biospécifiques.
Le couplage covalent :
Les méthodes les plus courantes utilisent le glutaraldéhyde.
Le système biospécifique : conjugaison non covalente basé sur l'interaction entre la biotine
(vitamine soluble, appelée selon les pays vitamine B8, B7 ou H) et la streptavidine (purifiée à partir
de Streptomyces avidinii) ou l'avidine (isolée des blancs d'œufs). Cette interaction à une affinité
extrêmement forte de l'ordre de 10-14 M. Deux systèmes peuvent être utilisés :
 Dans le plus simple, la biotine est conjuguée à l'anticorps et la streptavidine à l'enzyme, toutes deux
de façon covalente.
 Une alternative permet de développer un système d'amplification de la réaction antigène–anticorps.
En effet, jusqu'à quatre molécules de biotine peuvent se lier à une molécule de streptavidine.
L'addition à la réaction finale de molécules de biotine bivalentes (liées à l'aide d'un agent réticulant
ou linker) couplées à l'enzyme et de streptavidine permet la formation de volumineux complexes
dans lesquels les sites restés libres de la streptavidine reconnaissent la biotine de l'anticorps
conjugué. C'est le système streptavidine–biotine ou avidine–biotine (Avidin–Biotin Complex ou
ABC)

Les enzymes : les plus utilisées sont la peroxydase et la phosphatase alcaline en raison de leur
simplicité d'utilisation et de leur sensibilité (tableau 1). La peroxydase de raifort (horseradish
peroxidase ou HRP), présente dans des racines de végétaux telles que les radis noirs, est une petite
glycoprotéine de 40 kDa, ce qui lui permet de diffuser facilement dans les tissus ou les cellules lors
 des marquages, tout en limitant les interférences avec la protéine conjuguée. Elle catalyse la
réaction d'oxydoréduction suivante qui aboutit à former un chromogène oxydé et de l'eau :

Elle peut aussi catalyser l'oxydation du luminol en 3-aminophthalate pour les techniques basées
sur la chimioluminescence. La phosphatase alcaline (PAL), absente des végétaux, est dérivée d'intestins de
veau ou d'Escherichia coli. Elle catalyse l'hydrolyse d'une liaison ester monophosphate pour libérer un ion
phosphate et un groupement hydroxyle libre en présence d'eau. Par exemple, le paranitrophényl phosphate
incolore est ainsi transformé en paranitrophényle (pNP) jaune :

Les autres enzymes utilisées incluent l'acétylcholinestérase de l'organe électrique de l'anguille électrique
(Electrophorus electricus) et, de façon moins courante, la β-galactosidase d'Escherichia coli.
En général, les réactions enzymatiques sont arrêtées par l'addition de solutions d'acide ou de base diluées
qui changent le pH du milieu et inactivent l'enzyme.
L'ELISA peut être réalisé à visée qualitative ou quantitative selon que l'on utilise ou non une
courbe d'étalonnage (ou gamme étalon). Cette dernière doit être réalisée avec une solution de concentration
connue de la molécule que l'on cherche à doser. Le seuil de détection des ELISA quantitatifsest de l'ordre
du pmol/L ou du ng/mL. Des dosages semi-quantitatifs peuvent être réalisés en comparant la densité
optique obtenue avec l'échantillon à celle d'une série de calibrateurs ou Etalon (E1. E2, E3,…etc).
 On distingue plusieurs types d'ELISA en fonction de la nature de la molécule à doser et de la technique de
révélation : ELISA direct, indirect, sandwich ou compétitif :

Tableau : Différents types d'ELISA utilisables selon l'analyte recherché : antigène ou anticorps

Type de
Analyte Premier réactif Deuxième réactif Réactif soluble de
Analyte recherché technique
adsorbé soluble soluble révélation
ELISA
Anticorps de
Substrat/
Antigène Direct Antigène détection /
chromogène
marqué
Antigène Substrat/
Anticorps Anticorps /
marqué chromogène
Anticorps
Anticorps Substrat/
Anticorps Indirect Antigène secondaire
primaire chromogène
marqué
 Anticorps de Anticorps de Substrat/
Antigène Sandwich Antigène
capture détection marqué chromogène
Substrat/
Anticorps Compétitif Antigène Anticorps Anticorps marqué
chromogène
Antigène Substrat/
Antigène Anticorps Antigène
marqué chromogène

Méthodologie :
Les techniques ELISA comportent différentes étapes
Adsorption des molécules
 Immobilisation de la molécule à adsorber
 Support solide: microplaques en polystyrène (de 96 ou 384 puits) à haute capacité d'adsorption
 Passive directe réalisée grâce à des liaisons non covalentes
 Type hydrophobe et ionique entre le plastique et les résidus non polaires ou ioniques des protéines
en milieu alcalin
Saturation du support adsorbant :
 Nécessaire pour neutraliser les zones du support restées libres.
 Etape de saturation pour éviter toute adsorption ultérieure de matériel présent dans l'échantillon
 Elle s'effectue par ajout de tampon riche en protéines (type PBS + albumine bovine sérique) suivi
d'une étape de lavage
Première réaction antigène–anticorps
 Le premier réactif soluble (sérums, LCR ou urines) est déposé après dilution dans les puits
 la plaque est incubée.
 Les antigènes ou les anticorps en solution vont se lier à la molécule adsorbée.
 Dans les ELISA directs, ce premier réactif est couplé à l'enzyme.
Deuxième réaction antigène–anticorps
 Ajout du deuxième réactif (AC) couplé à l'enzyme après lavage rigoureux
 Deuxième incubation
 ELISA indirects le réactif est un anticorps coupler avec une enzyme ou la biotine
 L‘ELISA sandwich, l'anticorps de capture est un anticorps polyclonal, alors que l'anticorps de
détection est un monoclonal

Révélation
 Après lavages, la révélation par l'ajout du substrat et du chromogène spécifiques de l'enzyme.
 Étape réalisée dans un tampon adapté à l'activité enzymatique
  Arrêt de la réaction par ajout d'un tampon acide ou basique détruisant l'activité enzymatique
 Mesure de la densité optique peut être réalisée en cinétique ou en point fixe après.
 La quantité de signal émis est proportionnelle à la quantité de la molécule à doser.
Expression des résultats
 Selon le type d'ELISA utilisé, différentes courbes de titration peuvent être obtenues.

Avantages :

 Facile et rapide

 Durée plus courte

 Pas de problème de réactivité croisée liée à l'utilisation d'un anticorps secondaire couplé

 Amplification du signal donc de la sensibilité de l'ELISA (technique très sensible)

 Réactifs de révélation indépendants de la spécificité recherchée et donc utilisables pour différents

tests

Inconvénients:
  Dénaturation de l'antigène ou de l'anticorps et perte de sensibilité
 Risque de fixation de protéines non spécifiques et d'augmentation du bruit de fond
 Perte de réactivité liée au couplage
 Nécessité de disposer de deux anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes distincts de
l'antigène pour les ELISA sandwich n'utilisant pas d'anticorps polyclonal de capture
 Risque de réactivité croisée et d'augmentation du bruit de fond
 Interférences avec les facteurs rhumatoïdes et agglutinines froides lors de dosages sanguins :
risque de faux positifs ( ELISA indirect)

Applications:
 Sérodiagnostic des maladies infectieuses
 Le diagnostic et le suivi de maladies auto-immunes.
 Typage HLA et recherche d’allo-anticorps

Immuno-empreinte (western-blot)
 Décrite en 1973.
 Consiste en une électrophorèse dénaturante pour la séparation des protéines d'une solution
 Suivie de leur transfert fidèle sur une membrane
 la détection est ensuite réalisée sur la membrane, de manière :
 Directe grâce à des anticorps spécifiques couplés à un traceur
 Indirecte en utilisant alors un anticorps spécifique et un anticorps secondaire couplé
à un traceur enzymatique
 -Cette technique est qualitative,
 -Semi-quantitative car l'intensité du signal émis est corrélée à la quantité d'antigène adsorbé sur la
membrane.
L'immunodot (dot-blot) ou immunoslot (slotblot) : est une technique dérivée du western-blot
dans laquelle les antigènes, sont directement déposés sur une membrane souple, sans séparation des
protéines sur gel. Les étapes de révélation sont comparables pour les deux méthodes.

Méthodologie
Séparation protéique
  Séparation électrophorétique des polypeptides sur gel de polyacrylamide (PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis ou PAGE).
 A l'addition d'agents dénaturants t.q le laurylsulfate de sodium (SDS) la séparation est en fonction
de la taille.
 Cette technique appelée SDS–PAGE est très largement employée pour déterminer la masse
moléculaire des polypeptides
 Il existe également des gels réalisant un gradient de pH qui permettent de séparer les protéines en
fonction de leur point isoélectrique.

Transfer
 Sur une membrane de nitrocellulose ou de polyvinylidene difluorure (PVDF)
 Réalisé par :
 l'application d'un champ électrique permettant la migration électrophorétique des protéines
 par transfert passif (plus long et rendement plus faible).
Saturation et lavages
 La saturation est réalisé avec:
 Du lait (riche en caséine)
 Du sérum (riche en albumine).
 Un lavage élimine tout matériel non fixé les liquides de lavage sont de type Phosphate-Buffered
Saline (PBS) ou Tris-Buffered Saline (TBS) supplémenté d'un détergent doux comme le Tween-20
ou le NP-40 à faible concentration (0,05 %).
Résultats
 La révélation des protéines d'intérêt fixées est effectuée par incubation dans un bain d'anticorps
 soit directement en utilisant un anticorps spécifique couplé à un traceur
 soit indirectement en utilisant un anticorps secondaire reconnaissant le domaine Fc de l'anticorps
primaire.
 Plusieurs lavages sont nécessaires entre chaque incubation de la membrane avec les anticorps.
  Le traceur couplé à l'anticorps est une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline)
 Les réactions chromogéniques sont révélées directement par observation immédiate de la
membrane.

Figure : Étapes méthodologiques du western-blot

Avantages
 Analyse de complexes protéiques, de plusieurs protéines simultanément, des modifications post
traductionnelles des protéines (t.q phosphorylation)
 Détermination de la masse moléculaire, de l'état de glycosylation des protéines
 Large application analytique dépendant du vaste choix d'anticorps spécifiques
 Mesure quantitative possible

Inconvénients
 Risque de perte de réactivité vis-à-vis des anticorps de révélation.
Lors de séparations électrophorétiques en conditions dénaturantes, seuls les épitopes
linéaires séquentiels persistent
 Conditions optimales de migration et de transfert à déterminer pour chaque type de
protéines à analyser
 Risque de réactivité non spécifique des anticorps secondaires en technique de révélation indirecte
  Durée technique beaucoup plus longue qu'un ELISA et moins standardisable

Applications
 la confirmation d'un diagnostic sérologique positif d'infection par le VIH nécessite un western-blot.
 La détection d'auto-anticorps est fréquemment effectuée en immunodot (autoantigènes fixés sur les
membranes).

Immunodosages utilisant un marqueur luminescent

Depuis environ trente ans, comme alternative à l’utilisation des marqueurs radioactifs, le couplage de
luminophores à des anticorps ou à des antigènes a été appliqué avec succès à de nombreuses techniques
d’immunodosage. Le terme de luminophore est utilisé pour désigner toute molécule ou tout groupement
susceptible d’émettre de la lumière sous l’effet d’une excitation appropriée. Le marqueur luminescent émet
un signal direct mais non spontané, provoqué par un apport d’énergie extérieure.

Généralités sur les phénomènes de luminescence moléculaire

Origine de la luminescence moléculaire

Une molécule qui absorbe suffisamment d’énergie pour passer à un niveau d’énergie supérieur (niveau
excité) revient spontanément à son niveau d’énergie fondamental. Ce retour peut se faire avec émission de
photons du domaine optique : ceci constitue le phénomène de luminescence (figure 9).

Figure 1: Origine de la luminescence moléculaire

- Phénomène d’absorption :
Le quantum d’énergie séparant deux niveaux électroniques étant de quelques électron-volts, une énergie au
moins équivalente doit être apportée à la molécule pour qu’elle puisse passer dans un état électronique
excité. L’énergie fournie à la molécule peut être de nature lumineuse (photons UV, visible), électrique,
chimique, mécanique...
 - Mécanisme d’émission :
Divers processus permettent le retour de l’état excité à l’état fondamental. Certains sont non radiatifs
comme la relaxation vibrationnelle à l’intérieur d’un même état électronique, ainsi que la conversion
interne entre les différents états électroniques. D’autres sont radiatifs et constituent la luminescence
moléculaire.

Différents types de luminescence utilisés en immunodosages

La distinction repose sur la nature de l’énergie d’excitation d’une part et sur le mode de désexcitation
d’autre part

- La photoluminescence, qui englobe la fluorescence et la phosphorescence, est un phénomène

d’émission consécutif à une excitation lumineuse (photons UV, visible). La fluorescence est un
phénomène rapide, la durée de vie moyenne τ des états excités étant de l’ordre de 10 –9 à 10–8 s. La
phosphorescence est un phénomène lent, la durée de vie des états excités étant de l’ordre de τ > 10 –6
s.
- La chimiluminescence est un phénomène radiatif consécutif à une réaction chimique produisant une
molécule dans un état excité.
- La bioluminescence est un cas particulier de la chimiluminescence. Ce phénomène est retrouvé chez
certains êtres vivants et nécessite l’intervention de réactions enzymatiques (exemple du système
luciférine-luciférase retrouvé dans divers organismes).
- L’électrochimiluminescence est un phénomène radiatif consécutif à l’application d’une différence
de potentiel qui provoque l’émission lumineuse (λ = 620 nm) à partir d’un chélate de ruthénium
- La thermochimiluminescence est un processus radiatif consécutif à l’excitation de molécules par
une énergie thermique

Marqueurs fluorescents

Une molécule fluorescente exposée à un faisceau de lumière absorbe l’énergie des photons incidents. La
molécule excitée réémet un photon de λ supérieur à la λ du photon excitateur. La différence entre ces deux
valeurs λ est appelée « déplacement de Stokes » et constitue un critère de qualité du traceur fluorescent
(plus il est important et plus il est facile d’éliminer lors de la mesure, la lumière parasite).
Figure: Spectres d’absorption (1) et d’émission (2) de la fluorescéine

Les principaux marqueurs fluorescents utilisés dans les immunodosages

Les fluorophores conventionnels (fluorescéine, rhodamine B, ANS, ombelliférone) présentent les

inconvénients de posséder un déplacement de Stokes faible (< 100 nm), une longueur d’onde d’émission
inférieure à 600 nm et un temps de déclin de fluorescence court (< 20 ns). Les phycobiliprotéines sont plus
intéressantes en raison de leur émission dans le rouge avec un rendement quantique élevé. Les chélates de
lanthanides (europium, terbium, samarium) ont, en plus, une constante de temps de déclin de fluorescence
élevée (10 à 1 000 μs) permettant une sélection du temps de mesure. Enfin l’érythrosine est un marqueur
phosphorescent. L’exemple d’application des techniques est :
immunohistologie ou immunohistochimie:
 Ces techniques sont utilisées pour détecter, localiser, voire estimer le niveau d'expression de
protéines d'intérêt sur un matériel cytologique ou des coupes tissulaires
 Les tissus sont analysés après fixation chimique, inclusion et coupe en paraffine, ou après
congélation et coupe au cryostat
 Pour révéler la fixation de l'anticorps au tissu, une méthode directe ou indirecte peut être
employée.
La méthode directe: utilise directement des anticorps marqués (ou conjugués), appelés anticorps de
révélation. Cette technique est simple et rapide, de localisation précise mais de sensibilité médiocre
La méthode indirecte (IFI) : utilise un anticorps primaire non marqué spécifique de l'antigène, dont
sa fixation est révélée par un anticorps secondaire marqué. Cette méthode est privilégiée lorsque le niveau
d'expression de l'antigène à analyser est faible.
  Les traceurs fluorescents utilisés sont surtout l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la
phycoérythrine (PE)

Avantages et inconvénients du marqueur fluorescent

Avantage :

 Stabilité des produits marqués

 Facilité de marquage
 Signal intense et spécifique (chélates de lanthanides)
 Mise au point d’immunodosages sans séparation de phases possible
 Mise au point possible du dosage simultané de plusieurs analytes

Inconvénients :

 Nécessité d’appareillage complexe

 Signal peu spécifique (fluorophores conventionnels) : mauvaises détectabilité et reproductibilité
 Risque de faible spécificité (contamination par la fluorescence parasite)
 Risque de contamination par l’Europium exogène

Applications

 la recherche d'auto-anticorps spécifiques de maladies auto-immunes

 Etude des infiltrats immunitaires dans les tumeurs, font généralement appel à la technique
d'immunohistochimie.

Immunodosages multiplex sur billes

 Utilise des microbilles de polystyrène de 5 à 8 μm
 Recouvertes de molécules (Peptides, anticorps, acides nucléiques)
 Fixées de manière covalente (groupement amine de l’Ag et les fonctions carboxyliques des
microbilles)
 Détection simultanée de plusieurs analytes (jusqu'à 100)

Principe: capture de l'analyte avec les billes et de révéler cette capture avec un traceur fluorescent selon
une technique de type sandwich
Méthodologie
 Les microbilles sont incorporées par des fluorochromes (rouge et orange)
 Chaque type de bille est recouvert d’ag particulier
 Incubation avec les échantillons dans des plaques de 96 puits.
 Le lavage est facultatif
 Une seconde incubation est réalisée en présence d'un traceur couplé à un fluorochrome
(phycoérythrine)
 Le traceur peut être un anticorps pour la détection de protéines ou d'autoanticorps.
 La suspension de billes est entraînée dans une veine liquide à travers un fluorimètre ou un
cytomètre en flux.
 Après excitation par un laser, chaque bille émet sa fluorescence intrinsèque l’identifiant
 L'excitation du traceur, par un second laser, témoigne de la positivité de la réaction
 Un minimum de 100 billes de chaque type est analysé
En parallèle, l'analyse de la lumière diffractée latéralement permet de détecter les doublets de billes, exclus
de l'analyse

Avantages et inconvénients
Recouvrent celles des techniques immuno-enzymatiques et de cytométrie en flux.
Avantages
 Nombreux paramètres dosés simultanément
 Faible volume d'échantillon (quelques dizaines de μL)
 Grande étendue du domaine de mesure
 Rapidité et très bonne sensibilité, au moins équivalente à la technique ELISA
 Large spectre d'applications

Inconvénients
 Risque de perte/diminution de la réactivité liée au couplage covalent sur les microbilles.
 Mise au point parfois difficile.
 Risque de réactivité croisée surtout dans la recherche d'auto-anticorps.
 Pas de standardisation et variabilité interlots (surtout pour la recherche d'auto-anticorps)
 Sensibilité des lasers aux variations de température
 Sensibilité des microbilles et du traceur à la lumière
 Nécessité de calibration fréquente de l'appareil
 Comme pour l'ELISA, la présence de lipides, de bilirubine ou de facteurs rhumatoïdes interfère
avec la technique
 Non adapté aux broyats cellulaires

Applications
Les domaines d'application sont très étendus.

En recherche : le dosage des cytokines dans des fluides biologiques ou dans des surnageants ou

lysats cellulaires utilise cette méthodologie. Il est par ailleurs désormais possible d'effectuer des analyses
transcriptomiques (mRNA, miRNA) grâce aux plates-formes de multiplexage sur billes.

En clinique : le multiplexage est utilisé pour la détection et la quantification d'auto-anticorps

(diagnostic et suivi de maladies auto-immunes), d'allo-anticorps (anti-HLA en transplantation)

Tchnique de Cytométrie en flux

 Permet une mesure des caractéristiques:
 Physiques et/ou biologiques de particules
 Des cellules, en suspension dans un flux liquide
 Passant devant une ou plusieurs laser mesurant
 Diffraction de lumière
 fluorescence émise
Permettent une évaluation des caractéristiques de chaque cellule Le cytomètre en flux est composé d'un
système fluidique, d'un banc optique associé à des circuits électroniques de recueil des signaux et d'une
informatique d'acquisition et d'analyse des données

Figure : Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses sous populations sanguines
(FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands angles).
Avantages
 Analyses multiparamétriques
 Analyses qualitatives et quantitatives
 Rapidité d'acquisition
 Analyse d'un grand nombre de cellules
 Identification de populations rares
 Traçabilité et rémanence des données
 Isolement des cellules
 Grande variété d'applications

Inconvénients
 Coût d'achat et de maintenance des cytomètres
 Complexité des analyses multiparamétriques
 Mauvaise stabilité de certains fluorochromes
 Non-visualisation des cellules (sauf imageurs en flux)

Applications :

En immunologie et en hématologie pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes

affections. Ces applications peuvent concerner :
 l'identification (immunophénotypage) des populations et sous-populations cellulaires
en fonction de leurs marqueurs de différenciation (e.g. évaluation des sous-populations lymphocytaires
sanguines, diagnostic des hémopathies),
 des études fonctionnelles évaluant notamment la prolifération, la cytotoxicité, la
production de cytokines, l'apoptose, la dégranulation des basophiles, la phagocytose.

ELISpot :
La technique ELISpot (enzyme-linked immunospot) permet:

 Détecter les cellules produisant une protéine sécrétée spécifiquement (e.g. cytokine, granzyme,
immunoglobuline).

 La protéine est captée par un anticorps fixé préalablement sur une membrane de Nylon ou de
nitrocellulose dans le fond de puits de culture où sont placées les cellules, additionnées
éventuellement de stimuli adéquats (mitogènes, antigènes).
 La présence de la protéine sécrétée est révélée, après élimination des cellules, par un deuxième
anticorps couplé à une enzyme et la formation d'un produit chromogène

 Chaque point (ou spot) représente l'empreinte d'une cellule productrice de la protéine d'intérêt.

 Le nombre de cellules ayant produit un spot coloré est déterminé à l'aide d'une loupe ou d'un
microscope, éventuellement relié àun système informatique
.