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    Coloration de Gram

    Transféré par

    Sobour Kelani
    Ce document décrit la procédure de coloration de Gram, une technique bactériologique utilisée pour distinguer les bactéries gram positives des bactéries gram négatives. Il explique le principe, le matériel nécessaire, les étapes de la procédure ainsi que la préparation des réactifs.

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    Techniques et procédures de laboratoires

    Techniques Bactériologiques
    Coloration de gram
    Antoine Pierson (BiolTrop)

    Principe
    Les bactéries gram+ sont colorées en violet, les bactéries gram- sont colorées en rose, ceci étant du
    à une différence de composition de la paroi.
    Effectué à partir d'un frottis ou un étalement.

    Matériel
     Lames
     Colorants

    Mode opératoire
    1. Réaliser un frottis ou un étalement.
    2. Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser refroidir la lame.
    3. Immerger les lames dans la solution de Cristal Violet pendant 1 mm.
    4. Lavage à l'eau en transvasant les lames.
    5. Immerger les lames dans du Lugol pendant 1 mn en les agitant.
    6. Laver à nouveau à l'ea.
    7. Décolorer jusqu'à disparition de la couleur violette dans l'alcool en faisant couler goutte à
    goutte sur la lame inclinée ou en immergeant les lames pendant une dizaine de secondes
    dans le décolorant.
    8. Laver à l'eau.
    9. Contre colorer avec la solution de safranine diluée pendant 20 à 30 secondes.
    10. Laver à l'eau et sécher à l'air.
    11. Observer à l’objectif x 100, en immersion avec de l'huile.

    Lorsque l'on colore peu de lames, plutôt que d'immerger les préparations, on peu les recouvrir de
    colorants. Le décolorant doit être changé chaque jour.

    Risques d'erreurs
    Faux Gram (+) :
     Étalement trop épais.
     Dépôt de colorant dans le flacon de violet de gentiane : filtrer le colorant pour y remédier.
     Solution iodée de Gram mal égouttée.
     Décolorant laissé trop peu de temps (globalement, mieux vaut trop que pas assez.
     Solution de safranine laissée très longtemps (plus d'une minute).
    Faux Gram (-) :
     Solution iodée de Gram laissée trop peu de temps.
     Décolorant laissé trop longtemps et mal rincé

    Version 1.0 : 1 novembre 2008 1/2


    Préparation des réactifs
    Violet de gentiane – adaptation de Hucker
    Solution A :
     Violet de gentiane 2 g
     Alcool à 95° 20 ml

    Solution B :
     Oxalate d'ammonium : 0,8 g
     Eau distillée 80 ml
    Mélanger les solutions A et B, Laisser reposer 24 heures avant l'emploi, Verser à travers un papier filtre
    dans un flacon.

    Solution iodée de gram


     Iode 1 g
     Iodure de potassium 2 g
     Eau distillée 300 ml
     Dissoudre d'abord l'iodure de potassium dans environ 30 ml d'eau distillée, ajouter l'iode et
    mélanger jusqu'à dissolution.
     Ajouter le reste d'eau distillée, mélanger.
     Conserver dans un flacon en verre brun ou en plastique opaque (à l'abri de la lumière).

    Solution de safranine
    Solution A :
     Safranine O 2,5 g
     Alcool à 95° qsp 100 ml
    Solution A bis :
     Solution A 10 ml
     Eau distillée 90 ml

    Décolorant
    1. Mélanger à parties égale alcool à 95 ° et acétone.
    2. Le mélange est à faire extemporanément.

    Contrôle de qualité
    Il est fortement conseillé de pratiquer régulièrement un contrôle de qualité de la coloration car sa
    qualité est très dépendante de la qualité et de la composition des réactifs ainsi que de l’expérience
    de l'opérateur, notamment à cause de l’étape de décoloration qui doit être appréciée « à l’œil ».
    On peut ainsi préparer une série de lames de témoin Gram (-) riches en entérobactéries (gram
    d'une CBU riche en Escherichia coli) et une autre série de lames de témoin Gram (+) riches en
    Staphylococcus aureus (à partir d’une plaie ou autre).

    Version 1.0 : 1 novembre 2008 2/2

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