Niveau 2eme Année Licence.: Travaux Pratiques de Microbiologie
Niveau 2eme Année Licence.: Travaux Pratiques de Microbiologie
Niveau 2eme Année Licence.: Travaux Pratiques de Microbiologie
2019-2020
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TPN °6 : coloration de Gram Niveau :L 2 Biologie Module : Analyse microbiologique
Préparé par M. .Hansal N.
EXAMEN MICROSCOPIQUE : PAR COLORATION DE GRAM
BUT :
Il permet l’étude microscopique des bactéries mortes après fixation et coloration. La coloration de GRAM
permet de différencier des bactéries dites Gram + de bactéries dites Gram -.
Cette méthode permet d'observer :
- la MORPHOLOGIE des bactéries
- le MODE de GROUPEMENT
- la COULEUR : gram + ou -
- la DENSITE ou PROPORTION de chaque microorganisme en cas de mélange
MATERIEL NECESSAIRE :
- une lame
- du Violet de Gentiane (ou Violet Cristal sous forme sèche)
- du lugol
- de l'alcool (éthanol à 95°) très peu dilué
- de la Fuschine fraîchement préparée
- de l'eau déminéralisée
- du papier filtre
- microscope photonique : objectif x 40 et x100
TECHNIQUE :
1. Prélèvement :
A partir d’une culture liquide : prélever un aliquote de suspension à l’anse (ou à la pipette stérile)
après avoir homogénéisée le milieu
A partir d’un milieu solide : réaliser une suspension en eau physiologique à partir d’une culture jeune
et prélever un aliquote de suspension à l’anse de platine (ou à la pipette stérile)
A partir de produits alimentaires ou biologiques : prélever un aliquote du produit (dilué ou non) à
l’anse (ou à la pipette stérile) après avoir homogénéisée le milieu
2. Réalisation du frottis:
Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire en partant du centre de la lame
Le frottis réalisé doit être :
- MINCE et HOMOGENE, étendu sur la lame sans toucher les bords
- Réalisé sur une lame PROPRE et DEGRAISSEE, une goutte d'eau déposée en
surface doit s'y étaler complètement.
3. Séchage :
- à la température du laboratoire, si possible
- ou bien à chaleur douce : platine chauffante à 37° ou au-dessus de la veilleuse du bec bunsen, à hauteur
suffisante. NE JAMAIS CHAUFFER BRUTALEMENT
4. Fixation :
But : tuer les bactéries, fixer leur structure cytologique, et les faire adhérer à la lame.
Fixation par la chaleur :
- à utiliser seulement pour les frottis effectués à partir de cultures bactériennes
- passer la lame -frottis situé sur le dessus- dans la flamme chauffante, LENTEMENT et 3 à 4
fois de suite (attention de bien tenir la lame avec une pince) et laisser refroidir.
Fixation par l'alcool : employé quel que soit le produit traité.
- recouvrir la lame pendant 5 min avec de l’alcool puis rincer à l’eau déminéralisé et égoutter le
frottis avant coloration.
5. Coloration :
Principe : Cette coloration est une coloration complexe qui permet de différencier les bactéries d'après
leur forme et leur affinité pour les colorants.
La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM – grâce à leurs différences de
nature de paroi. Les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus fine et riche en lipides, alors que les
bactéries Gram positifs ont une paroi épaisse et pauvre en lipide.
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TPN °6 : coloration de Gram Niveau :L 2 Biologie Module : Analyse microbiologique
Préparé par M. .Hansal N.
6. Mise au point :
Repérer les bactéries à l’objectif x40.
Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis
Faire la mise au point en forte luminosité ( condensateur levé et diaphragme ouvert) objectif x100.
Se placer dans un endroit où la répartition des bactéries est homogène et la coloration nette
Eliminer les lames dans le bocal déchets non infectieux
7. Observations :
On peut noter la morphologie des bactéries et la coloration de celles-ci : les bactéries violettes sont dites
Gram positives, celles qui sont roses sont dites Gram négatives. On peut également noter
l'homogénéité de coloration de la bactérie.
Présentation des résultats d’observation :
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