Université Ibn Zohr A.

Universitaire : 2017/2018
Campus Universitaire AÏT MELLOUL
Centre des Sciences et Techniques

TD : TECHNIQUES CHIMIQUES POUR LA BIOLOGIE (SV3)

Série 2 : Techniques d’isolement et de purification des Protéines (1/2)

Exercice 1 :
Un groupe de chercheur s’intéresse à l’isolement et la purification des cellulases produites
par des bactéries appartenant à l’espèce Bacillus subtilis. Un ensemble de 20 isolats ont été
prélevés à partir d’une rizière.
1- Donner un protocole permettant le prélèvement des bactéries à partir du sol ?
Pour l’isolement des microorganismes il existe principalement deux techniques :

L’Isolement par contact: où l’échantillon prélevé est déposé directement sur un

milieu nutritif liquide. Après incubation, une série de dilutions successives sont
effectuées (10-1 à 10-4 avec du diluant : pepton-sel ou trypton-sel) et
l’ensemencement est réalisé cette fois en milieu gélosé à partir des différentes
dilutions réalisées en bouillon nutritif. Après incubation à température convenable,
l’apparition des colonies microbiennes est visible en milieu gélosé et on peut alors
réaliser un autre isolement par la méthode des stries (Technique de Microbiologie).
L’Isolement par suspensions-dilutions : on réalise une suspension de l’échantillon
(sol) dans de l’eau physiologique stérile (on peut ajouter du diluant), puis il faut
incorporer les différentes dilutions de cette suspension dans le milieu d’isolement
solide (gélose). Cette technique comprend plusieurs étapes, allant de la préparation
des dilutions jusqu’à l’interprétation des résultats.

Incubation

Milieu liquide Milieu trouble après 18 H d’incubation

A température adéquate avec le type de microorganisme
25-30 C pour les champignons / 37 °C pour les Bactéries

Cependant, le protocole le plus adapté à l’isolement des bactéries du sol est

l’isolement par suspension-dilution.

2- Pour la production de l’enzyme, proposer une démarche expérimentale permettant de

sélectionner une souche productrice de cellulases ?
Pour la sélection de souches de Bacillus productrices de cellulases, il faut réaliser une
première étape d’isolement de la bactérie (étape d’isolement par suspension-dilution),
ensuite à partir du milieu d’isolement en gélose (boite de pétrie), il faut réaliser des
repiquages dans des milieux gélosés neufs contenant un révélateur coloré de l’activité
enzymatique. On peut par exemple utiliser la gélose + le Rouge congo (en phase finale après
incubation) comme révélateur de l’activité cellulase (Auréoles jaunâtres autour des colonies
qui manifestent une activité cellulase). On peut par exemple proposer le protocole suivant :

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Elaboré par Pr. A EL ASBAHANI
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Cette activité est visualisée par l’utilisation d'un milieu gélosé à base du carboxy-méthyl-
cellulose (CMC) comme seule source de carbone (cellulose). Le milieu cellulase est un mélange d'un
milieu minimum M et d'un milieu CMC.
Le milieu M (rôle de tampon : pH=7) se compose de Na2HPO4 (6g), KH2PO4 (3g), NH4Cl (1g),
NaCl (0,5g) et eau distillée (1litre). Le milieu est autoclavé pendant 15min à 120°C. Ensuite, sont
ajoutés 1ml d’une solution de CaCl2 à 0,1molaire et 1ml d’une solution de MgSO4 à 1molaire.
Le milieu CMC se compose de carboxy-méthylcellulose (10g), extrait de levure (5g), glycérol
(50%) (2ml), agar (20g) et le tampon M (quantité pour 1litre). Ce milieu final est autoclavé pendant
15min à 120°C puis coulé dans des boites de Pétri. L'incubation des microorganismes sur ce milieu
CMC est effectuée pendant 24 heures à 48 heures et à des températures de 37°C et 30°C
respectivement pour les bactéries et (éventuellement les levures si elles existent). L’activité cellulase
est ensuite révélée par l’ajout d’une solution de rouge Congo à une concentration de 1mg/ml
pendant 15 minutes (par inondation des boites) suivie de trois rinçages avec une solution molaire de
NaCl. Les micro-organismes cellulase positifs manifestent alors des auréoles jaunâtres autour de
leurs colonies.
Exemple de résultats positifs (isolats à activité cellulase positive) révélées au Rouge Congo :

On peut ensuite confirmer au niveau des souches positives, les souches bactériennes de type
bacillus : ces dernières se caractérisent par leur pouvoir de production des spores (baciles) et ce sont
aussi des baciles à gram positifs ce qui va faciliter leur isolement en utilisant un milieu sélectif.

3- Faut –il prévoir une extraction de l’enzyme par la lyse cellulaire ? Si oui quelle
technique ?
La cellulase est une enzyme extracellulaire synthétisée à l’intérieur de la cellule
microbienne mais secrétée pour fonctionner en dehors de la cellule. C’est une enzyme
impliquée dans la dégradation de macromolécules à l’extérieur de la cellule. Donc
l’extraction par la lyse cellulaire n’est pas nécessaire.

4- Commenter le graphique suivant et lui donner un titre ?

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Elaboré par Pr. A EL ASBAHANI
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Titre : Chromatogramme d’une enzyme de cellulase purifiée par la chromatographie

échangeuse d’ion.

Ce graphique représente l’élution réalisée par chromatographie échangeuse d’ion pour

purifier l’enzyme de cellulase produite par une bactérie de Bacillus ainsi que le profil
chromatographique obtenu en suivant les fractions éluées par absorption à la longueur
d’onde λ=280 nm qui correspond au maximum d’absorbance des acides aminés
aromatiques donc au maximum d’absorbance des Protéines et donc le suivi à 280 nm est
une méthode rapide qui nous permet un suivi rapide et directe des différentes fractions
protéiques obtenues par chromatographie d’échange d’ions . Ce suivi a été également
soutenu (ou bien confirmé) par la mesure de l’activité cellulase des fractions obtenues et ça
pour mieux repérer et caractériser les fractions qui correspondent à l’activité cellulase
recherchée. Troisième point, l’élution des fractions protéiques a été réalisée en appliquant un
gradient en NaCl c'est-à-dire en appliquant une augmentation progressive de force ionique µ
par création d’un gradient de NaCl (concentration augmentant progressivement en NaCl).

5- Déterminer à quelle concentration de NaCl l’enzyme est éluée ?

Le pic qui correspond à la cellulase est celui qui présente une activité enzymatique
maximale. Dans ce graphique, le premier pic correspondant à cette enzyme a été élué (en
premières fractions) à une concentration de NaCl avoisinant 0,2 M.

6- Connaissez-vous une autre méthode d’élution ? Quelles sont les précautions à

prendre ?

La deuxième méthode d’élution qu’on peut employer est celle basée sur la variation du pH
pour amener l’enzyme fixée à la résine à un pH égal à son pI (pour neutraliser sa charge
nette et récupérer ainsi l’enzyme par élution). Tout de même, il y’a des précautions à
prendre : Il faut éviter les valeurs extrêmes du pH, pour ne pas dénaturer l’enzyme de façon
irréversible après son élution.

Exercice 2 :
Un groupe de chercheurs s’intéresse à l’isolement et la purification d’une enzyme de lipase
thermostable pour une application industrielle en agroalimentaire. Dix isolats de
champignons filamenteux (moisissures) appartenant au genre Talaromyces ont été isolés à
partir du sol d’une station thermique. La récupération de l’enzyme a été faite par
centrifugation à 4000 rpm pendant 15 minutes. L’extraction a été réalisée en présence d’un
tampon.
La lipase est une enzyme extracellulaire spécialisée dans la transformation de triglycéride en
glycérol et en acides gras (figure 1). La libération des acides gras est accompagnée d’une
diminution du pH de milieu de culture. Cette diminution peut être mise en évidence par la
présence du rouge de phénol (coloration rouge pour la forme basique et jaune pour la forme
acide).
1- Proposer une technique d’isolement d’un champignon filamenteux à partir du sol ?
Il existe deux techniques permettant l’isolement des champignons filamenteux à partir
du sol : la technique d’isolement par contact direct, et la technique par suspension-dilution.
Proposer un protocole expérimental permettant de mettre en évidence la capacité
lipolytique des isolats ? Le pH du milieu gélosé est de 7 et la température optimale
d’incubation est de 30°C ?

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Figure 1 : activité lipolytique de la Lipase

La mise en évidence de l’activité de lipase est basée sur la libération des acides gras qui
diminue le pH de milieu de culture.
• Dans un milieu de culture gélosé (faible concentration en glucose), incorporer les
triglycérides TGR (substrat pour induire la production des lipases) et un indicateur coloré
(rouge de phénol).
• Ajuster le pH à 7 par l’ajout d’une base ou d’un acide. Stériliser le milieu de culture + TGR +
rouge de phénol à 121°C pendant 20 minutes.
• Ensemencer chaque souche au centre d’une boite de Pétri contenant le milieu de culture
stérilisé, et incuber les boites de culture à 30°C pendant 7 jours.
• Mesurer l’halo de changement de couleur (du rouge au jaune) qui correspond à la
dégradation des TGR et la libération des acides gras par l’activité des lipases.

Exercice 3 :
Exprimer la vitesse de centrifugation en nombre de g, sachant que le rayon de la
centrifugeuse est de 10 cm ?
Selon la formule RCF = 1,118 x 10-5 x r x n2, la force centrifuge est 1789 g.
Exercice 4 :
A quel pH une électrophorèse sera-t-elle la plus efficace pour séparer les mélanges
protéiques suivants : a)- Sérum-albumine et hémoglobine ; b)- Myoglobine et
chymotrypsine ; c)- Ovalbumine, sérum-albumine et uréase ?
Données : ovalbumine : pHi=4,6 ; sérum-albumine : pHi=4,9 ; uréase : pHi = 5,0 ; et
hémoglobine : pHi = 6,8 ; myoglobine : pHi = 7,0 ; Chymotrypsine : pHi = 9,5.

a)- Pour séparer Sérum-albumine (pHi= 4,9) et hémoglobine (pHi=6,8), il faut

appliquer un pH d’électrophorèse pHe intermédiaire entre les deux pHi :
donc pHe pour ce premier cas (a)= ½ (4,9 + 6,8) = 5,85.
b)- Pour séparer Myoglobine (pHi=7,0) et chymotrypsine (pHi=9,5), il faut appliquer
un pH intermédiaire donc pHe = 8,25.
c)- Ovalbumine (pHi=4,6), sérum-albumine (pHi=4,9) et uréase (pHi=5,0) : les pHi
sont très proches donc l’application d’un pH intermédiaire ne permettra pas d’obtenir une
bonne séparation par électrophorèse: il faut appliquer un pH extrême dans ce cas soit très
acide (pHe <1) ou très basique (pHe>11) pour avoir une bonne séparation. Les trois
protéines migreront dans le même sens mais à des vitesses différentes d’où leur séparation.
Exercice 5 :
Les protéines traitées par le SDS deviennent des polyanions. Soumises à une
électrophorèse sur gel de polyacrylamide à pH = 7,0 , elles migrent toutes vers l’anode
(=électrode +) quelque soit leur charge initiale de départ.
1- On mesure la distance de migration, d, de 4 protéines dont on connaît le poids
moléculaire. Quel est l’intérêt de la mesure de migration d de ces protéines de PM connu.
Que faut-t-il alors reporter en courbe en fonction de d ?
L’intérêt de la mesure de la distance de migration d des Protéines de PM connus est
qu’on peut utiliser ces Protéines comme marqueurs de Poids Moléculaire (PM) (= échelle de

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taille). Il existe une relation de linéarité entre le Log du PM et le déplacement d de ces

Protéines.
On exprime le Log PM des ces Protéines en fonction de leur migration d.
On trace la courbe Log PM = f(d) qui est une droite et connaissant le déplacement d
électrophorétique d’une Protéine de PM inconnu, on peut par extrapolation à cette courbe
déterminer le PM inconnu de cette Protéine.
En courbe : il faut donc représenter Log PM en fonction de (d).

2- Représenter donc ces résultats sous forme du tableau suivant sachant que les
Protéines de PM connu et utilisées sont : L’Ovalbumine ; Trypsine; Myoglobine; Cytochrome
C et leurs migrations d sont données dans le tableau suivant :
Protéine PM Log PM d (mm)
Ovalbumine 43.000 4,63 37,6
Trypsine 23.300 4,36 59,5
Myoglobine 17.200 4,23 70,0
Cytochrome C 13.500 4,13 79,0
3- Pour les 4 protéines suivantes, on a trouvé dans les mêmes conditions
d’électrophorèse :
Protéines Migration d Protéines Migration d
Lysozyme 77,5 Anhydrase 52,0
carbonique
Sérumalbumine 21,5 Pepsine 45,0
A l’aide des données précédentes, déterminer alors le PM de ces 4 Protéines.

Il faut tracer la courbe Log PM = f(d) :

C’est une droite de la forme : d = -a x Log PM + b = Me (Mobilité électrophorétique).

Par extrapolation, on trouve que les Protéines ont les PM suivants :
Lysozyme=
PM =14 100 ; Sérumalbumine =
PM = 69 200 ; Anhydrase carbonique =

PM = 28 200 et Pepsine =
PM = 34 600.

4- Le PM de l’hémoglobine est de 64000. On a trouvé après électrophorèse, une

seule bande dont la distance de migration est de 73 mm (PM = 10 4,2 = 15.800).
Expliquer ce résultat ?

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L’hémoglobine est formée de 4 sous-unités identiques : 2 α et 2 β de PM

d’environ 15 800 chacune : (15 800 x 4 ==
63 200 ) . Ces 4 sous-unités sont
reliées entre-elles au niveau de l’hémoglobine. Dans les conditions de SDS –Page :
conditions dénaturantes, ces 4 sous-unités se trouvent détachées mais étant de PM
proches ou identiques elles migrent toutes vers la même zone sur le gel d’où
l’apparition d’une seule bande.

Exercice 6 :
On a déterminé le volume d’élution Ve au cours d’une chromatographie d’exclusion
moléculaire sur séphadex, des Protéines suivantes dont-on connait le PM :
Protéine PM Log PM Ve (mL)
Aldolase 145.000 5,1613 52
Lactate DH 135.000 5,130 57
Phosphatase alcaline 80.000 4,903 92
Ovalbumine 45.000 4,653 131
Β-Lactoglobuline 37.100 4,569 143

1- Que faut-il reporter en 3ème colonne de ce tableau ? Porter alors en courbe Ve (mL)
en fonction des données de cette 3ème colonne ? Qu’est ce que vous remarquer ?
En 3ème colonne, il faut reporter les Log PM : on représente ensuite en courbe les
variations du Ve en fonction de Log PM :

Courbe de Variation du Volume d’élution Ve en fonction du PM des Protéines

2- Calculer alors le PM de la Glucosinase sachant que son Ve = 105 mL

Pour la Glucosinase : Ve = 105 =
Log PM = 4,73 =
PM = 53 700.
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