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    Ce document décrit la procédure de coloration de Gram pour classer les bactéries en Gram positif ou Gram négatif. Il explique les étapes de la méthode incluant la réalisation d'un frottis bactérien, la coloration au violet de gentiane, et la contre-coloration à la fushine. Le document fournit également la liste du matériel nécessaire.

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    Université des Sciences et de la Technologie Oran Mohamed-Boudiaf

    Faculté de SNV (Sciences de la Nature et de la Vie )

    La date : 14/12/2022

    TPn =02:

    Coloration de gram

    Module systématique

    Nom : BENMESSAOUD
    Prénom : FERIEL
    Group : 02

    2022-2023

    Page | 1
    o Introduction :
    Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de
    coloration de Gram. Cette technique a été mise au point en 1884 par Hans Christian
    Gram, un bactériologiste danois. Après coloration, les bactéries Gram+ deviennent
    violettes alors que les bactéries Gram- apparaissent en rose. La répartition des
    bactéries en Gram+ ou Gram- est un critère systématique important pour la
    classification des bactéries. En outre, la coloration de Gram reste une étape
    essentielle dans l’analyse médicale pour la détermination des pathogènes. Elle
    permet de visualiser facilement les bactéries et de donner des indications sur leurs
    formes et leurs tailles.

    o Méthode et Matériel :

    Matériels :
    Bec bunsen.
    Tube essai.
     Les lames de verre.
     Pince.
     Souches bactériennes (S1, S2).
     Colorants (violet de gentiane, lugol, fushine).
     Décolorant (l’alcool).
     pissette d'eau.
     Bécher.

    Les matériels utilisés

    Page | 2
    Méthode :
    I. Réalisation du frottis : elle nécessite d’avoir un frottis fixé :
     A l’aide de pipette pasteure déposer une goutte d’eau distillée stérile Sur une
    lame.
     Ajouter à la goutte une colonie isolée (de la souche bactérienne), délicatement
    en va réaliser par étalement circulaire en partant de centre vers l’ éxtrimité ( la
    partie gauche qui reste dans une lame pour faire le détectage le group, numéro
    de souche ..)

    Séchage :

     A l’aide de bec bunsen, on a obtenir la lame de 15 à 20 cm au-dessus


    de flamme jaune du bec jusqu’à séchage la lame.

    Page | 3
     Pour avoir la flamme jaune du bec on a fermé les trous de l’oxygène.

    Fixation :
     Consiste à un passage rapide de la lame 2 à 3 fois dans la flamme
    jaune du bec.
    II. Coloration de gram :

    - Voici succinctement les différentes étapes de cette coloration :


     Déposer quelques gouttes de solution de violet de gentiane sur le
    frottis fixé.

    Page | 4
     Laisser agir 2min (le violet de gentiane colore le cytoplasme des
    bactéries.
     Jeter l’excès de colorant dans un bécher.
     Rincer très brièvement en faisant couleur de l’eau sur les lames.
     Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis (est un mordant qui
    permet de fixer le violet de gentiane dans les bactéries).

     Laisser agir 45s.


     Jeter la solution du lugol dans bécher.
     Rincer brièvement à l’eau distillée.
     Décolorer en faisant couler la solution de décoloration sur la lame
    jusqu’à ce que le violet ne s’écoule plus du frottis (30s), la solution
    de décoloration contient l’alcool.
    Page | 5
     Rincer à l’eau distillée.

     Contre-colorer en déposant la solution de fushine pendant 2 min, ce


    colorant permet de visualiser les bactéries gram négative décolorées
    à l’étape précédent.

    Page | 6
     Rincer à l’eau distillée.

     Laisser sécher a l’aide du bec bunsen.

    Page | 7
     Les bonnes gestes de manipulation :
     Nettoyer de la paillasse par l’eau de javel avant le commencé.
     Désinfecter les mains.
     Les cheveux longs attachés.

    o Conclusion :
    La coloration de Gram est un procédé utilisé en microbiologie, en
    bactériologie médicale elle permet de classer les bactéries en deux
    grandes catégories : les bactéries Gram positif qui gardent leur coloration
    violette après décoloration par l'alcool, les bactéries Gram négatif qui,
    décolorées par l'alcool, sont teintées par la fuchsine et apparaissent roses
    ou rouges.

    Page | 8

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