These de Doctora111

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE ABDELHAMID IBN BADIS MOSTAGANEM
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Domaine : S.N.V
Thèse
Présentée pour l’obtention du diplôme de Doctorat en Sciences
Filière : Sciences Agronomiques
Spécialité: Microbiologie
Etude des propriétés technologiques et

inhibitrices de bactéries lactiques isolées à
partir de blé fermenté
Présentée par : Mme TAHLAITI HAFIDA
Soutenue publiquement le : 18/03/2019
Devant le jury composé de :
NEMMICHE Saïd Professeur Université de Mostaganem Président
BELAHCENE Miloud Professeur C .U. Ain Temmouchent Examinateur
BELHADI
Professeur Université de Saïda Examinateur
ABDELKADER
BEKADA Ahmed Professeur C .U. Tissemsilet Examinateur
AÏT SAADA Djamel MCA Université de Mostaganem Examinateur
DALACHE Fatiha Professeur Université de Mostaganem Directrice de thèse
Année universitaire 2018- 2019

A Sophia
Puisses-tu vivre dans un monde meilleur
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier en premier lieu ma responsable de thèse, le professeur Fatiha Dalache de m’avoir
proposé de travailler sur ce sujet de thèse et de m’avoir fait confiance pour débuter cette nouvelle
thématique, vos précieux conseils m’ont permis d’avancer.
Mes remerciements s’adressent au président du jury le professeur Nemmiche d’avoir bien voulu
examiner ce travail.
Je remercie également Mr Belahcéne, Professeur au centre Universitaire de Ain Temouchent, Mr

Belhadi, Professeur à l’université de Saïda, Mr Bekada Professeurà l’université de Tissemsilt et Mr
Aït Saada Maître de Conférences A à l’université de Mostaganem d’avoir accepté de juger ce travail.
Je remercie vivement Mme Rechidi-sidhoum pour les grandes discussions qu’on a eues ensemble et
qu’ils m’ont données du baume au cœur.
Je remercie Melle Meghoufel pour les agréables moments passés au laboratoire.
Je remercie mon amie Mme Ouahrani Nouria pour son soutien moral.
Mes remerciements s’adressent également aux doctorants du laboratoire des sciences et techniques
de la production animale.
Je remercie Mr Benharrat Noredine pour son aide et sa disponibilité.
Je remercie également MmeLazreg Hafida et Mr Benbouziane Djilali du laboratoire pédagogique du

département de biologie pour leur disponibilité.
Je remercie Mme Habchi-Zegrar Khelil Méryem pour tous les tracas qu’elle a endurés pendant la
préparation de cette thèse.
Résumé
Les grains de blé appelé « hamoum » est un blé qui a passé un long séjour dans un silo souterrain.
Notre étude s’est intéressée aux bactéries lactiques isolées à partir de ce substrat. Trente neuf isolats
ont été retenus et pré- identifiés par les méthodes phénotypiques classique en utilisant les différents
tests usuels (croissance à différentes concentrations, thermorésistance etc.).Les résultats montrent
qu’ils appartiennent essentiellement aux Lactobacillus (69 %), Pediococcus (15%),Leuconostoc
(8%) et Enterococcus (8%).Des activités antagonistes inter-bactéries ont permis de mettre en
évidence quatorze isolats performants. Les bactéries lactiques ayant un potentiel probiotique
doivent répondre à un certain nombre de propriétés probiotiques (activité antagoniste, tolérance à
l’acidité et aux sels biliaires).L’activité antagoniste vis-à-vis de 3 germes pathogènes
(Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853) ont montré des zones d’inhibitions avec des halos clairs et bien distincts. Les isolats
lactiques ont inhibés les bactéries pathogènes à 77,44%.Les lactobacilles ont montré un fort pouvoir
inhibiteur. L’emploi d’un milieu tamponné a permis des levées d’inhibitions dans 10,25% des cas et
une diminution des diamètres d’inhibitions dans 62,4% des cas. Après un screening basé sur la
méthode de Fleming et al., (1975), une quinzaine d’isolats ont subi une caractérisation protéomique
au MALDI-TOF MS dont quatre ont été identifiés avec un score d’identification satisfaisant :
Lactobacillus plantarum BHL23, Lactobacillus plantarum BHL27, Lactobacillus brevis BHL8 et
Pediococcus acidilactici BHC6.Les quatre souches identifiées présentent une activité
antibactérienne élevée et persiste après traitement avec la catalase mais disparaît en présence des
deux enzymes protéolytiques testées, ce qui indique que les agents actifs sont de nature protéique.
L’effet probiotique a été évalué par la survie à différents pH (2.5, 4.5 et 6.5) et à différentes
concentrations de sels biliaires à (0.3%,0.5% et 1%).Les résultats indiquent que toutes les souches
présentent une résistance aux pH acides et aux sels biliaires en particulier Lactobacillus plantarum
qui dépasse les 100% après 3h d’incubation. L’étude de la résistance aux antibiotiques a montré que
seule la souche BHL8 est sensible aux antibiotiques testés. Le hamoum est un substrat riche en
bactéries lactiques qui présente de bons potentiels probiotique.
Mots clés : blé fermenté, hamoum, bactéries lactiques, caractérisation phénotypique, MALDI-TOF
SM, effet probiotique, sels biliaires, acidité.
Abstract
Wheat grains called "hamoum" is a wheat that has spent a long time in an underground silo. Our
study was interested in lactic acid bacteria isolated from this substrate. Thirty-nine isolates were
selected and pre-identified by conventional phenotypic methods using the different usual tests
(growth at different concentrations, heat resistance, etc.). The results show that they belong mainly
to Lactobacillus (69%), Pediococcus (15%), Leuconostoc (8%) and Enterococcus (8%) Inter-
bacterial antagonist activities revealed fourteen successful isolates. Lactic acid bacteria with a
probiotic potential must respond to a number of probiotic properties (antagonistic activity, tolerance
to acidity and bile salts) Antagonistic activity against 3 pathogenic microorganisms (Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)
showed zones of inhibition with clear and distinct halos. Lactic isolates inhibited pathogenic
bacteria at 77.44%. Lactobacilli showed strong inhibitory activity. The use of a buffered medium
enabled inhibitory surges in 10.25% of cases and a decrease in inhibition diameters in 62.4% of
cases. After a screening based on the method of Fleming et al. (1975), about fifteen isolates were
proteomic characterized to MALDI-TOF MS, four of which were identified with a satisfactory
identification score: Lactobacillus plantarum BHL23, Lactobacillus plantarum BHL27,
Lactobacillus brevis BHL8 and Pediococcus acidilactici BHC6. The four identified strains show
high antibacterial activity and persist after treatment with catalase but disappear in the presence of
the two proteolytic enzymes tested, indicating that the active agents are of protein nature. The
probiotic effect was evaluated by survival at different pHs (2.5, 4.5 and 6.5) and at different bile salt
concentrations at (0.3%, 0.5% and 1%).The results indicate that all strains show resistance to pH
acid and bile salts especially Lactobacillus plantarum that exceeds 100% after 3 hours of
incubation. The study of antibiotic resistance showed that only strain BHL8 is sensitive to the
antibiotics tested. Hamoum is a substrate rich in lactic acid bacteria that has good probiotic
potential.
Key words: fermented wheat, hamoum, lactic acid bacteria, phenotypic characterization, MADI-
TOF SM, probiotic effect, bile salts, acidity.
‫ملخص‬
‫حبوب القمح هو القمح الذي قضى وقتا طويال في صومعة الدراسة‪ .‬لدينا تحت "‪ "Hamoum‬ودعا‬
‫األرض ركزت على بكتيريا حمض الالكتيك المعزولة من الركيزة‪ .‬وقد تم اختيار تسعة وثالثو عزلة‬
‫ومحددة مسبقا من قبل وسائل المظهرية التقليدية باستخدام مختلف االختبارات المعتادة (النمو بتركيزات‬
‫مختلفة‪ ،‬ومقاومة الحرارة وغيرها ‪ .)...‬وأظهرت النتائج أنهم ينتمو أساسا إلى الملبنة (‪ ،)٪96‬المملسة‬
‫(‪ ،)٪51‬النستقة (‪ )٪8‬والمكورات المعوية (‪ .)٪8‬وقد ساعدت بين البكتيريا أنشطة معادية لتسليط الضوء‬
‫على أربعة عشر األداء يعزل‪ .‬بكتيريا حمض الالكتيك وجود إمكانات بروبيوتيك يجب تلبية عدد من‬
‫الخصائص بروبيوتيك (النشاط خصم والتسامح ألمالح حمض الصفراء و النشاط العذائي) وجها لوجه ‪3‬‬
‫‪ E. coli ATCC‬اإلشريكية ‪ ATCC 25923 ،‬مسببات األمراض (المكورات العنقودية الذهبية‬
‫أظهرت مناطق تثبيط مع هاالت واضحة )‪ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853‬و ‪25922‬‬
‫ومتميزة‪ .‬العزالت الالكتيكية تثبط البكتيريا المسببة لألمراض عند ‪ ٪ 44.77‬وأظهرت اكتوباكيللي نشاط‬
‫مثبط قوي‪ .‬وقد سمح استخدام وسيلة مخزنة الموانع رفعت في ‪ ٪55.15‬من الحاالت وانخفض الموانع‬
‫بأقطار ‪ ٪71 ،91‬من الحاالت‪ .‬وبعد فحص يعتمد على طريقة فليمينغ وآخرو ‪ ،)5641( ،‬خمسة عشر‬
‫‪:‬التي تم تحديدها أربعة مع درجة تحديد مرضية ‪ MALDI-TOF MS‬يعزل خضع توصيف البروتين‬
‫‪ ،‬الملبنة خنصر اليد ومملسة الحمض ‪ ، BHL27 plantarum‬الملبنة حددت‪BHL23 plantarum‬‬
‫أربع سالالت معرض النشاط المضاد للبكتيريا عالية واستمرت بعد العالج ‪ BHL8 ,BHC6.Les‬اللبني‬
‫مع الكاتاالز لكن يختفي في وجود اثنين من االنزيمات المحللة للبروتين اختبار‪ ،‬مشيرا إلى أ عناصر‬
‫نشطة والبروتين في الطبيعة‪ .‬تم تقييم تأثير الكائنات الحية المجهرية التي كتبها بقاء في درجة الحموضة‬
‫المختلفة (‪ 7.1 ،1.1‬و ‪ )9.1‬وتركيزات مختلفة من األمالح الصفراوية (‪ ٪3.1 ،٪3.3‬و ‪ .)٪5‬وتشير‬
‫النتائج إلى أ جميع سالالت مقاومة لل أمالح حمض األس الهيدروجيني واألمالح الصفراوية وخاصة‬
‫العصية النباتية التي تتجاوز ‪ ٪533‬بعد ‪ 3‬ساعات من الحضانة‪ .‬وأظهرت دراسة مقاومة المضادات‬
‫فقط حساسة للمضادات الحيوية التي تم اختبارها‪ .‬حموم هو ركيزة غنية ‪ BHL8‬الحيوية أ الساللة‬
‫‪.‬ببكتيريا حمض الالكتيك التي لديها إمكانات بروبيوتيك جيدة‬
‫كلمات البحث‪:‬‬
‫القمح المخمرة " حموم " ‪ ،‬بكتريا الالكتيك‪ ،‬توصيف المظهري‪ ،‬أثر الكائنات الحية المجهرية‪MALDI-‬‬
‫‪ ،TOF MS‬الخصائص بروبيوتيك ‪،‬أمالح الصفراء‪ ،‬الحموضة‪.‬‬
LISTE DES ABREVIATIONS
ATCC : American Type Culture Collection
ATB : antibiotiques
A w : activité d’eau
BM : bleu de méthylène
BSH : hydrolase de sel biliaire
CRAPC : Centre de Recherche scientifique et technique en Analyses Physico-Chimiques
CHCA : Acide α-Cyano-4-Hydroxy-Cinnamique
DHB : Acide 2,5 Dihydroxy-Benzoïque
°D : degré Dornic
EPS : Exopolysaccharides
FAO : Food and Agriculture Organization- Organisation des nations unies pour l’alimentation
et l’agriculture
KDa: KiloDalton
MALDI-TOF MS:Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight mass

spectrometry
M 17 : gélose de Terzaghi
MRS : De Man, Rogosa et Sharpe
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
Rpm : rotation par minute
UFC : Unité Formant Colonie
V.P : Vogues Proskauer
WHO : World Health Organization (OMS)- Organisation Mondiale de la Santé

LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU 1: ALIMENTS ET BOISSONS TRADITIONNELS, A BASE DE CEREALES FERMENTEES,

CONSOMMEES DANS DIFFERENTES REGIONS DU MONDE (GUYOT,2010). 10
TABLEAU 2 : CLASSIFICATION DES BACTERIOCINES PRODUITES PAR LES BACTERIES A GRAM
POSITIF ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
TABLEAU 3: PRINCIPAUX CRITERES UTILISES POUR LA SELECTION DES SOUCHES
PROBIOTIQUES 40
TABLEAU 4: CRITERES DE SELECTIONS UTILISES AUX LABORATOIRES POUR LE SCREENING
DES PROBIOTIQUES 41
TABLEAU 5: MILIEUX SELECTIFS DES SOUCHES PATHOGENES 54
TABLEAU 6: SOUCHES PATHOGENES 54
TABLEAU 7: SCORE DE CONCORDANCE DES SPECTRES OBTENUS 60
TABLEAU 8: LES DIFFERENTS ANTIBIOTIQUES UTILISES 67
TABLEAU 9: RESULTATS DE LA PRE-IDENTIFICATION DES ISOLATS 71
TABLEAU 10: CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE DES BACTERIES LACTIQUES 73
TABLEAU 11: CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DES BACTERIES LACTIQUES. 75
TABLEAU 12: PROFILS FERMENTAIRE DES ISOLATS LACTIQUES 78
TABLEAU 13: LES DIFFERENTS GROUPES DU GENRE LACTOBACILLUS 80
TABLEAU 14: TABLEAU RECAPITULATIF DES RESULTATS DES TESTS DE PRE-IDENTIFICATION
DES BACTERIES LACTIQUES. 82
TABLEAU 15: IDENTIFICATION DES ISOLATS BACTERIENS PAR MALDI-TOF MS. 85
TABLEAU 16: SCORE DE CONCORDANCE DES SPECTRES OBTENUS A PARTIR D’UNE BACTERIE
D’INTERET AVEC CEUX DE LA BASE DE DONNEES BIOTYPER 86
TABLEAU 25: ANTIBIOGRAMME DES SOUCHES LACTIQUES 123
TABLEAU 17 : RESULTAT DE L’ACIDITE PRODUITE PAR LES SOUCHES LACTIQUES 173
TABLEAU 18 : INTERACTIONS ENTRE GENRE DES BACTERIES LACTIQUES EN MILIEU SOLIDE173
TABLEAU 18A 174
TABLEAU 18B. 174
TABLEAU 18C 175
TABLEAU 18D 175
TABLEAU 18E 175
TABLEAU 18F 176
TABLEAU 19: ACTIVITE ANTAGONISTE INTER-BACTERIENNE EN MILIEU TAMPONNE (T) ET
NON TAMPONNE (NT). 176
TABLEAU 20 : RESULTAT DES INTERACTIONS DES BACTERIES LACTIQUES VIS-A-VIS DES
BACTERIES PATHOGENES 177
TABLEAU 21 : ACTIVITE ANTAGONISTE DES SOUCHES LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE (T)
ET NON TAMPONNE (NT). 178
TABLEAU 22 : EFFET INHIBITEUR DES SOUCHES LACTIQUES EN PRESENCE D’ENZYMES 178
TABLEAU23 : RESULTAT DU STRESS ACIDE SUR LES SOUCHES LACTIQUES 178
TABLEAU 24 : RESULTATDE LA TOLERANCE DES SELS BILIAIRES SUR LES SOUCHES
LACTIQUES. 179
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1: FORME D’UNE MATMORA 5

FIGURE 2 : ASPECT DE BLE FERMENTE A, ET OUVERTURE D’UNE MATMORA B 6
FIGURE 3: ARBRE PHYLOGENETIQUE CONSENSUS, BASE SUR LA COMPARAISON DE SEQUENCE
D’ARNR 16S, MONTRANT LES PRINCIPAUX GROUPES DE BACTERIES LACTIQUES, AYANT UN
FAIBLE CONTENU MOL% DE G+C DE L’ADN AINSI QUE LES BACTERIES GRAM POSITIVES NON
RELIEES DES GENRES BIFIDOBACTERIUM ET PROPIONIBACTERIUM 15
FIGURE 4: LACTOBACILLUS CASEI AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE. 17
FIGURE 5 : LACTOCOCCUS LACTIS, AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE 17
FIGURE 6 : STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS, AU MICROCOPE ELECTRONIQUE 18
FIGURE 7 : ENTEROCOCCUS FAECALIS AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE 19
FIGURE 8: LEUCONOSTOC MESENTEROÏDES AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE. 20
FIGURE 9: PEDIOCOCCUS AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE. 21
FIGURE 10: BIFIDOBACTERIUM SP 22
FIGURE 11: DIFFERENTS TYPES DE FERMENTATION 23
FIGURE 12 : SCHEMA DE LA FERMENTATION DES ACIDES MIXTES 24
FIGURE 13 : FORMATION DE PORES MEMBRANAIRES PAR LE COMPLEXE NISINE-LIPIDE II 31
FIGURE 14 : MODE D’ACTION DES DIFFERENTES CLASSES DE BACTERIOCINES 33
FIGURE 15:LES PRINCIPAUX EFFETS BENEFIQUES ATTRIBUES AUX PROBIOTIQUES. 44
FIGURE 16 : SPECTROMETRE DE MASSE BRUCKER DALTONICS GERMANY ET SON UNITE
INFORMATIQUE 50
FIGURES 17& 18: ASPECT MACROSCOPIQUE DE BHL1 (A GAUCHE) ; ASPECT MACROSCOPIQUE
DE L’ISOLAT BHL10 69
FIGURE 19&20: ASPECT MICROSCOPIQUE DES CELLULES APRES COLORATION DE GRAM
(X1000), COCCI (A GAUCHE), BACILLE (A DROITE) 70
FIGURE 21: PROPORTION DES BACTERIES LACTIQUES 71
FIGURE 22: TESTS DE CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES BACTERIES LACTIQUES. T:
TEMOIN. 77
FIGURE 23 : REPARTITION DES GENRES A PARTIR DES DIFFERENTS ISOLATS DE BLE
FERMENTE. 77
FIGURE 24 : DISTRIBUTION QUANTITATIVE DES ESPECES PRESUMEES DE BACTERIES
LACTIQUES. 82
FIGURE25: SPECTRE DE LACTOBACILLUS PLANTARUM BHL23 88
FIGURE 26 : SPECTRE DE LACTOBACILLUS PLANTARUM BHL27 88
FIGURE 27 : SPECTRE DE LACTOBACILLUS BREVIS BHL8 89
FIGURE 28 : SPECTRE PEDIOCOCCUSACIDILACTICI BHC6 89
FIGURE 29: SPECTRE A PIC LACTOBACILLUS PLANTARUM BHL23 90
FIGURE 30: SPECTRE A PIC DELACTOBACILLUS PLANTARUM BHL 27 90
FIGURE 31 : SPECTRE A PIC LACTOBACILLUS BREVIS BHL8 91
FIGURE 32 : SPECTRE A PIC DE PEDIOCOCCUS ACIDILACTICI BHC 6
91
FIGURE 33 : EVALUATION DE LA QUANTITE D’ACIDE LACTIQUE PRODUITE AU COURS DU
TEMPS CHEZ LES SOUCHES TESTEES. 93
FIGURE 34: EVOLUTION DE LA CONCENTRATION D’ACIDE LACTIQUE ET DU PH DE LA SOUCHE
PEDIOCOCCUS ACIDILACTICI (BHC6). 95
FIGURE 35: EVOLUTION DE LA CONCENTRATION D’ACIDE LACTIQUE ET DU PH DE LA SOUCHE
LACTOBACILLUS PLANTARUM (BHL27). 95
FIGURE 36: EVOLUTION LA CONCENTRATION D’ACIDE LACTIQUE ET DU PH DE LA SOUCHE
LACTOBACILLUS PLANTARUM (BHL23). 96
FIGURE 37: EVOLUTION LA CONCENTRATION D’ACIDE LACTIQUE ET DU PH DE LA SOUCHE
LACTOBACILLUS BREVIS (BHL8). 96
FIGURE 38 : INHIBITIONS DES ISOLATS LACTIQUES PAR BHL6 97
FIGURE 39 : INHIBITIONS DES BACTERIES LACTIQUES EN MILIEU SOLIDE 98
FIGURE 40 : INTER-INHIBITION ET AUTO-INHIBITION DES BACTERIES LACTIQUES EN MILIEU
SOLIDE. 98
FIGURE 41 : TAUX DES INHIBITIONS INTER-GENERIQUES DES BACTERIES LACTIQUES. 99
FIGURE 42 : TAUX DES INHIBITIONS DES ISOLATS LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE (T) ET
NON TAMPONNE (NT). 101
FIGURE 43 : TAUX D’INHIBITION DE BHC5 PAR LES ISOLATS LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE
(T) ET NON TAMPONNE (NT). 101
FIGURE 44 : TAUX D’INHIBITION DE BHC4 PAR LES ISOLATS LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE
FIGURE 45: TAUX D’INHIBITION DE BHL12 PAR LES ISOLATS LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE
FIGURE 48:TAUX D’INHIBITION DE L’ISOLAT BHL9 PAR LES BACTERIES LACTIQUES EN MILIEU
TAMPONNE (T) ET NON TAMPONNE (NT). 104
FIGURE 50:ACTIVITE INHIBITRICE DE 4 SOUCHES LACTIQUES VIS-A-VIS DE PSEUDOMONAS
AERUGINOSA. 106
FIGURE 51: TAUX D’INHIBITIONS DES BACTERIES PATHOGENES PAR LES BACTERIES
LACTIQUES. 107
FIGURE 52 TAUX DES INHIBITIONS DES BACTERIES PATHOGENES PAR LES BACTERIES
LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE (T) ET NON TAMPONNE(NT). 108
FIGURE 53: INHIBITION DE LA SOUCHE E. COLI PAR LES BACTERIES LACTIQUES EN MILIEU
TAMPONNE (T) ET NON TAMPONNE (NT). 109
FIGURE 54 : INHIBITION DE LA SOUCHE PSEUDOMONAS AERUGINOSA PAR LES BACTERIES
LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE(T) ET NON TAMPONNE (NT). 109
FIGURE 55 : INHIBITION DE LA SOUCHE STAPHYLOCOCCUSAUREUS PAR LES BACTERIES
LACTIQUES EN MILIEU TAMPONNE (T) ET NON TAMPONNE (NT) 109
FIGURE 56: ZONES D’INHIBITION DES SOUCHES BHC6 ET BHL27 VIS-A-VIS DE LA SOUCHE
PSEUDOMONAS AERUGINOSA 110
FIGURE 57: ZONES D’INHIBITION DES SOUCHES BHL23 ET BHL27 VIS-A-VIS D’E.COLI. 110
FIGURE 58: EFFET INHIBITEUR DES SOUCHES LACTIQUES VIS-A-VIS DE LA SOUCHE
STAPHYLOCOCCUSAUREUS EN MILIEU TAMPONNE. 111
FIGURE 59 : ACTIVITES INHIBITRICES DES 4 SOUCHES LACTIQUES VIS-A-VIS DES SOUCHES
PATHOGENES TESTEES EN MILIEU TAMPONNE (T) ET NON TAMPONNE (NT). 112
FIGURE 60: EFFETS DES DIFFERENTES ENZYMES 113
FIGURE 61 : TOLERANCE A L’ACIDITE DE SOUCHES LACTIQUES 118
FIGURE 62: TOLERANCE DES SELS BILIAIRES DES SOUCHES LACTIQUES.119
FIGURES 63& 64 : ANTIBIOGRAMME DE LA SOUCHE BHL8. 125
FIGURE 65 : ANTIBIOGRAMME DE LA SOUCHE BHC6. 125
FIGURE 66 : ANTIBIOGRAMME DE LA SOUCHE BHL23. 125
FIGURE 67 : ANTIBIOGRAMME DE LA SOUCHE BHL27 125
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ 3
ABSTRACT 4
‫ملخص‬ 5
LISTE DES ABREVIATIONS 5
LISTE DES TABLEAUX 8
LISTE DES FIGURES 10
INTRODUCTION 1
I – SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 5
1.1. Blé dur et autres céréales 4

1.1.1. Le grain de blé 4
1.1.2. Taxonomie 4
1.1.4. Facteurs favorisant l’altération des grains 6
1.1.4.1. Influence de l’humidité 6
1.1.4.2. Influence de la température 6
1.1.5. Modifications du blé fermenté 7
1.1.5.1. Modifications visuelles et olfactives 7
1.1.5.2. Modifications biochimiques 8
1.1.2. Autres céréales 9
1.1.3. Aliments et boissons fermentés 9
1.1.4. Blé fermenté 11
1.2. Les bactéries lactiques 12

1.2.1. Définition et caractéristiques des bactéries lactiques 12
1.2.2. Classification des bactéries lactiques 13
1.2.3. Caractéristiques des principaux genres de bactéries lactiques 16
1.2.3.1. Genre Lactobacillus 16
1.2.3.2. Genre Lactococcus 17
1.2.3.3. Genre Streptococcus 18
1.2.3.4. Genre Enterococcus 19
1.2.3.5. Genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella 20
1.2.3.6. Genres Pediococcus et Tetragenococcus 20
1.2.3.7. Genre Bifidobacterium 21
1.2.4. Métabolisme des bactéries lactiques 22
1.2.4.1. Principales voies fermentaires des bactéries lactiques 22
1.2.4.2. Voie homofermentaire ou EM 23
1.2.4.3. Voie hétérofermentaire ou voie des pentoses phosphate 24
1.2.4.4. Voie bifide ou FPC (Fructose 6- phospho- cétolase) 25
1.2.5. Intérêts des bactéries lactiques 25
1.2.5.1. Dans la biopréservation 25
1.2.5.2. Dans l’industrie alimentaire 26
1.3. Les activités antimicrobiennes des bactéries lactiques 27

1.3.1. Les acides organiques 27
1.3.2. Le peroxyde d’hydrogène 27
1.3.3. Le dioxyde de carbone 28
1.3.4. Le diacétyl 28
1.3.5. La reutérine 28
1.3.6. Les bactériocines 28
1.3.6.1. Nomenclature et classification des bactériocines 29
 Classe I: Les lantibiotiques 30
 Classe II 32
 Classe III 33
 Classe IV 34
1.3.6.2. Propriétés des bactériocines 34
1.3.6.3. Production des bactériocines 35
1.3.6.4. Conditionnement des bactériocines 35
1.3.6.5. Bactériocines en agroalimentaire 35
1.3.6.6. Utilisation alimentaire des bactériocines 36
1.3.6.7. Applications médicales des bactériocines 37
1.4. Les probiotiques 38

1.4.1. Historique et développement du concept probiotique : 38
1.4.2. Définition 39
1.4.3. Principales espèces de bactéries lactiques à potentiel probiotique 39
1.4.4. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques 40
1.4.4.1. Résistance à l’acidité 41
1.4.4.2. Résistance aux sels biliaires 41
1.4.4.3. Adhésion aux cellules intestinales 41
1.4.4.4. Production de substances antimicrobiennes 42
1.4.4.5. Résistance aux antibiotiques 42
1.4.5. Mécanisme d’action 42
1.4.6. Critères technologiques 43
1.4.7. Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé 43
1.4.8. Applications des probiotiques 44
1.5. Les interactions 46

1.5.1. Définition 46
1.5.2. Différents types d’interactions 47
1.5.2.1. Interactions positives : Synergie 47
1.5.2.2. Les interactions négatives : Inhibition 47
1.6. Identification des bactéries par MALDI-TOF MS 49

1.6.1. Le spectromètre de masse MALDI-TOF MS 49
1.6.2. La spectrométrie de masse 49
2. MATERIEL ET METHODES 52
2.1. Origine et échantillonnage du blé fermenté : 52
2.2 .Milieux de culture et conditions de croissance 52
2.3. Isolement des bactéries lactiques 52
2.4. Purification et pré-identification des isolats et leur appartenance au groupe lactique 53

 Examen macroscopique et microscopique : 53
 Recherche de la catalase : 53
2.5. Conservations des bactéries lactiques 53
2.6. Souches pathogènes utilisées 54

2 .6.1. Vérification de la pureté et de l’identité des souches pathogènes 54
2.7. Dénombrement des bactéries lactiques 55
2.8. Pré-indentification phénotypique des bactéries lactiques 55

2.8.1. Caractérisation biochimique des isolats lactiques 55
2.8.1.1. Recherche de l’oxydase 55
2.8.1.2. Hydrolyse de l’esculine 56
2.8.1.3. Production des exopolysaccharides 56
2.8.1.4. Production d’acétoïne 56
2.8.1.5.Croissance sur lait bleu de Sherman 56
2.8.1.6. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH). 57
2.8.1.7. Type fermentaire 57
2.8.1.8. Profil fermentaire des sucres. 57
2.8.2. Caractérisation physiologique des isolats lactiques 58
2.8.2.1. Croissance à pH 9.6 58
2.8.2.2. Croissance à différentes concentrations de NaCl 58
2.8.2.3. Croissance à différentes températures 58
2.8.2.4. Test de la thermorésistance 58
2.9. Eude du pouvoir acidifiant 58
2.10. Identification protéomique des isolats par MALDI-TOF SM 59

2.10.1. Préparation des isolats pour l’analyse protéomique 59
2.10.2. Analyse des spectres obtenus 59
2.11. Mise en évidence des interactions négatives 60

2.1.1. Inhibitions en milieu solide 60
2.1.2. Inhibitions entre bactéries lactiques 61
2.11.2.1. Méthode de Fleming et al.(1975) 61
2.11.2.2. Méthode de Barefoot et Klaenhammer(1983) ou méthode des puits 61
2.1.3. Activité antimicrobienne des isolats lactiques contre des souches pathogènes 62
2.11.3.1. Méthode de Fleming et al.1975 62
2.11.3.2. Méthode de Barefoot et Klaenhammer,1983 62
2.1.4. Caractérisation de la nature des agents inhibiteurs 62
 Entre bactéries lactiques 62
 Avec les bactéries pathogènes 63
2.1.4.1. Recherche des inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène 63
2.11.4.2. Recherche des inhibitions dues aux phages lysogènes 63
2.1.4.2. Recherche des inhibitions dues aux bactériocines 64
 Effet de la trypsine 64
 Alpha-chymotrypsine 64
2.1.5. Caractérisation des bactériocines 65
2.2. Mise en évidence in vitro de quelques propriétés probiotiques 65

2.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales 65
2.2.1.1. Test de survie au stress acide 65
2.2.1.2. Test de survie au stress biliaire : 66
2.2.2. Test de sensibilité aux antibiotiques 66
3. RESULTATS ET DISCUSSION 68
3.1. Dénombrement des bactéries 68
3.2. Identification des bactéries lactiques isolées à partir de blé fermenté « Hamoum ». 68
3.2.1. Pré-identification des isolats 69
3.2.2. Etude des caractères biochimiques et physiologiques des bactéries lactiques. 71
3.3. Caractérisation des bactéries lactiques isolées à partir du blé fermenté par MALDI-TOF MS 85
3.4. Etude du pouvoir acidifiant des souches lactiques isolées à partir de blé fermenté. 92
3.5. Mise en évidence des inhibitions inter-bactériennes 97

3.5.1. Par la méthode de Fleming et al.,( 1975) 97
3.5.2. Inhibition par production d’acides organiques 100
3.5.3. Par la méthode des puits 105
3.6. Mise en évidence des inhibitions des bactéries pathogènes par les bactéries lactiques. 105
3.6.1. Mise en évidence des inhibitions par la méthode de Barefoot et Klaenhammer (1983). 106
3.6.2. Mise en évidence des inhibitions par la méthode de Fleming et al. (1975). 106
3.6.3. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur 111
3.6.3.1. Inhibitions en milieu tamponné 111
3.6.3.2. Inhibitions due au peroxyde d’hydrogène 112
3.6.3.3. Inhibition due aux phages lysogènes 112
3.6.3.4. Inhibition due aux bactériocines 113
3.7. Etude du potentiel probiotique des souches lactiques 117

3.7.1. Tolérance à l’acidité 117
3.7.2. Tolérance aux sels biliaires 118
3.7.3. Détermination des profils de résistance des antibiotiques des souches de bactéries lactiques. 123
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 127
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES: 130
ANNEXES 180
Annexe 1 173
Annexe 2 173
PUBLICATION 180
INTRODUCTION
INTRODUCTION
Introduction
Les céréales constituent la ressource alimentaire la plus importante au monde à la fois pour
l’alimentation humaine et animale. Elles occupent une place stratégique dans l’alimentation de la
population mondiale et en particulier dans les pays en développement. En effet, le blé (Triticum sp)
est la céréale la plus cultivée par le monde et ses produits sont très importants dans la nutrition
humaine, car ils fournissent un tiers des besoins en protéines et en énergie nécessaire pour un adulte
(environ 2400kcal) (Alfonso et al., 2013).
En Algérie, les céréales et leurs dérivés constituent la base alimentaire de la population

(pain, couscous et pâtes) et son stockage revêt une grande importance.
Les systèmes de stockage utilisés nécessitent un contrôle de plusieurs paramètres en

particulier la température et l’humidité (Niquet., 2006).
Le stockage souterrain est une méthode ancestrale utilisée pour constituer des réserves
domestiques, sociales et commerciales. Cette technique de stockage appelée « Matmora » (Bartali
et al., 1989) ,présente plusieurs avantages : le maintien du blé à une température constante
d’environ 20°C ; le produit est placé dans une atmosphère confinée sans oxygène d’où l’absence
d’activité biologique ; protection des conditions environnementales ; limitation des risques de
parasitisme du fait de la profondeur du silo et à moindre coût et enfin sa fabrication avec des
matériaux locaux et un savoir-faire local (Bartali et al.,1989) de même que sa disponibilité
immédiate par l’utilisateur.
En Algérie, ce mode de stockage est bien connu de la population rurale. Il est utilisé à petites
échelles au sein de certaines petites exploitations familiales en milieu rural et péri-rural de certaines
régions de l’Algérie (Tiaret, Relizane, Mascara et Ghardaïa).
Les grains de blé ne sont pas des substrats favorables à la prolifération des microorganismes,
mais l’augmentation de l’humidité et l’évolution de la température pendant leur conservation
traditionnelle en silos souterrains, permet la prolifération de nombreux microorganismes qui
entraînent la fermentation du blé en un produit du terroir Algérien nommé "Hamoum".
Il est essentiellement consommé dans les zones rurales sous forme de couscous et
transformé en farine pour la fabrication du pain.
1
INTRODUCTION
Les grains de hamoum sont de couleur gris-jaunâtre et présentent une forte odeur de
fermentation due au long séjour dans la matmora.
En effet, la fermentation est un procédé ancestral et l’une des méthodes économiques les
plus utilisés dans la consommation et la transformation des matières premières alimentaires. Elle
prolonge leurs durées de vie en éliminant les facteurs toxiques et antinutritionnels. Leurs propriétés
organoleptiques et multi- nutritionnelles sont également améliorées (Tamang, 2010d).
La Matmora est un milieu privilégié pour une grande diversité de microorganismes souvent
responsables du déclenchement du processus de la fermentation et des modifications des
caractéristiques du blé (Jeantet, 2007). La farine de blé est un produit agricole brut, soumis à des
menaces microbiologiques, source de contamination primaire (Doyle et Buchanan, 2012). En effet,
les grains de blé sont naturellement contaminés par des bactéries telles que Bacillus, Lactobacillus,
Macrococcus, Sarcine, et Serratia qui peuvent être présentes dans les farines (Alfonso et al., 2013).
De même, les bactéries lactiques peuvent être détectées dans les grains (Corsetti et al., 2007) et les
farines de blé (Corsetti et al., 2001 ; Russo et al.,2010). En outre, il a été rapporté que les bactéries
lactiques issues de la farine de blé peuvent également provenir de l’équipement de broyage et /ou de
production (Berghofer et al., 2003).
Parmi ces microorganismes associés au blé fermenté (Gourchala et al., 2014), les bactéries
lactiques jouent un rôle dans la fermentation des matières premières animales et végétales. Elles
sont omniprésentes dans la nature, et sont largement utilisées dans l’industrie alimentaire. Les
bactéries lactiques ont un rôle important dans la préparation, la conservation et la transformation de
nombreux aliments fermentés, ce qui leur confère le statut GRAS « GenerallyRecognized As Safe »
(Florou-Paneri et al., 2013). Elles jouent également un rôle important dans la fabrication de
fromage et de divers produits laitiers fermentés (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Ali, 2010). Elles
contribuent à la texture, à la saveur et à la production de composés aromatiques (Bourgeois et
Larpent, 1996 ; Gerrit et al., 2005 ; Cholet,2006). Elles produisent des substances antimicrobiennes
comme les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène (Dortu et Thonart, 2009) et des
bactériocines qui exercent une activité antagoniste vis-à-vis des microorganismes pathogènes et/ ou
d’altérations (Gàlvez et al., 2011). Les bactériocines ont suscité beaucoup d’intérêt dans la durée de
la conservation des aliments ainsi que dans le contrôle des maladies infectieuses (FAO/OMS,
2002).
Actuellement, les bactéries lactiques présentent un grand intérêt pour leurs valeurs
nutritionnelles et thérapeutiques dans les industries agroalimentaires et pharmaceutiques. La
2
INTRODUCTION
connaissance de ces bactéries lactiques pourrait nous permettre de les utiliser dans la
bioconservation, l’amélioration de la valeur nutritive des aliments et les préparations probiotiques.
En effet, les bactéries lactiques sont considérées parmi la flore intestinale normale et jouent un rôle
crucial dans le maintien et l’amélioration de la santé. Elles sont considérées comme des
microorganismes à potentiel probiotique. Selon la F.A.O./OMS, (2002) ; les probiotiques sont des
microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante exercent un effet positif
sur la santé au-delà des effets nutritionnels. Pour remplir cette fonction, les bactéries lactiques
doivent répondre à un certain nombre de critères dont la tolérance à l’acidité et aux sels biliaires
(Fuller, 1989 ; Saito, 2004).
Comparativement aux aliments fermentés des pays développés, relativement très peu de
recherches ont été menées sur les aliments fermentés des pays émergents et encore moins sur leurs
effets bénéfiques en santé que pourraient conférer les bactéries lactiques constitutives de leur
microbiote. Ceci nous conduit à formuler la question suivante « Les bactéries lactiques des aliments
fermentés comme le hamoum sont-elles susceptibles d’avoir certaines propriétés fonctionnelles
d’intérêt en santé tant probiotique que nutritionnelle ? ».
C’est dans ce contexte que nous avons entrepris notre étude afin de connaitre l’influence de
la fermentation due au stockage par la technique traditionnelle (Matmora). Nous avons mis en place
une collection de souches de bactéries lactiques isolées à partir du hamoum par les méthodes
phénotypiques classiques. Les bactéries ayant montré des propriétés probiotiques intéressantes
(stress acide et résistance aux sels biliaires) et un bon potentiel inhibiteur ont été retenus pour une
identification par la technique MALDI-TOF.
Le manuscrit de la thèse comprend trois chapitres avec une introduction, une conclusion
générale et quelques perspectives.
Le premier chapitre comprend une synthèse bibliographique sur le statut des céréales et du
blé fermenté en particulier, sur les bactéries lactiques avec les caractéristiques et les intérêts qui s’y
rapportent et les propriétés probiotiques de ces dernières.
Le second chapitre consacré au matériel et méthode présente l’origine du matériel

biologique et décrit avec précision tous les protocoles expérimentaux.
Le troisième chapitre regroupe les résultats et leur discussion. Enfin, le manuscrit s’achève
par la présentation de la conclusion et des perspectives et par les références bibliographiques et les
annexes.
3
INTRODUCTION
4
I – SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1.Blé dur et autres céréales

1.1.1. Le grain de blé
Le grain de blé constitue le fruit de la plante, c’est un fruit sec (caryopse) qui contient à
l’intérieur la graine proprement dite. Il est de forme ovale, arrondi à ses deux extrémités qui sont
inégales et de grosseur variable, son examen révèle : une face dorsale plus ou moins bombée et une
face ventrale, comportant un sillon profond. À sa partie supérieure, se trouvent des courts poils qui
forment la brosse. À sa partie inférieure, visible sur la face dorsale, se trouve une légère dépression
correspondante à l’embryon ou le germe (Calvel, 1984). La longueur du grain est comprise entre 5et
9 mm, et le poids est compris entre 35 et 50 mg (Šramková et al., 2009).
Les deux espèces qui dominent aujourd’hui la production du blé sont : le blé tendre et le blé dur.
Plusieurs autres espèces existent, toutefois elles ne sont cultivées qu’en faible quantités.
1.1.2. Taxonomie
Le blé est une monocotylédone qui appartient au genre Triticum de la famille des
Gramineae ou Poaceae (Branlard, 2010). Les deux espèces les plus cultivées sont le blé tendre
(Triticum aestivum) et le blé dur (Triticum durum) mais il existe de nombreuses autres espèces de
Triticum qui se différencient par leur degré de ploïdie et par leur nombre de chromosomes (14, 28
ou 42). Le blé dur contient deux génomes AA et BB et 28 chromosomes (Feillet, 2000).
1.1.3. Stockage du blé
Le stockage adéquat des denrées agricoles est une partie intégrante de leur processus de
production. Il est déployé pour assurer la sécurité alimentaire. Ainsi, il est considéré comme un
bouclier contre l’échec et la famine. Les modalités techniques de stockage ont évolué avec les
époques et les lieux. Les enjeux sont restés les mêmes mais l’évolution technique a surtout permis
une augmentation des capacités de stockage et une accélération des échanges. De nos jours, les silos
modernes permettent de stocker plusieurs types de céréales en même temps (Doumandji, 2003).
Il existe différents types de silos.
 Les silos aériens, en béton armé pouvant contenir de grande quantité de blé du fait de sa
hauteur atteignant parfois 100m (Reimbert, 1982). Ces silos se prêtent à l’utilisation comme
silos portuaires du fait de leur bonne consistance à la corrosion.
 Les silos métalliques de forme géométrique.
4
 Les greniers domestiques à base de terre, à armature de bambou ou en paille (Kodio,

1989).Les grains sont conservés en épis ou en vrac, d’une capacité de 3 à 7 tonnes. Ils sont
généralement surélevés pour éviter l’attaque des rongeurs.
 Silos souterrains appelé « Matmora » (Figure 2).Le stockage souterrain des céréales est une
technique largement utilisée en milieu rural dans plusieurs régions céréalières du monde en
général (Bartali et Debbarh, 1991). Cette technique de stockage des céréales est
appelée « Matmora ». Elle consiste à enfouir le produit dans le sol dans une cavité d’une
capacité moyenne de 5 tonnes environ. La ″Matmora″ présente une forme cylindrico-
conique, cylindrique, sphérique ou amphorique (FAO, 1994 ; Bartali et al., 1989) revêtue
d'un enchevêtrement de paille de blé et d'orge où bien par des feuilles de plastique. Celles-ci
jouent un rôle important dans la réduction des risques de détérioration du grain stocké par
les eaux souterraines. En général, les matmoras sont situées soit dans la maison soit à
l'extérieur, proches ou éloignées de l'habitation, parfois dans un milieu protégé ou fortifié
(Kanafani, 1994 ; Bartali et Debbarh, 1991). L’inconvénient majeur de cette méthode de
stockage est la trop forte humidité et les eaux d’infiltration qui favorisent le développement
des microorganismes et la fermentation bactérienne (Doumandji et al., 2003).
Figure 1: Forme d’une matmora (Bartali, 1987).
5
Figure2 : Aspect de blé fermenté A, et ouverture d’une matmora B (Bekhouche et al., 2013)
1.1.4. Facteurs favorisant l’altération des grains

1.1.4.1. Influence de l’humidité
La faible teneur en humidité est le facteur le plus important pour la conservation des grains
lors du stockage. Les grains, stockés avec le contenu d'humidité élevé, sont soumis à des pertes
élevées causées par l'attaque des insectes et les champignons (Vàsquez et al., 2008). Elle favorise la
respiration des grains et accentue en conséquence le dégagement de chaleur au sein des grains
stockés. Il est généralement admis que le dégagement de chaleur double pour chaque accroissement
de 1.5 % de l'humidité du grain et donc que la durée probable de conservation d'un stock est
diminuée de moitié. Les altérations sont accentuées par le fait que les grains humides favorisent le
développement des micro-organismes présents à la surface du grain (Cruz et al., 2002). En effet à
une humidité inférieure, les champignons ne poussent pas, mais à environ 14% ou légèrement au-
dessus, la croissance fongique a lieu (Hoseney, 1994).Les moisissures du genre Penicillium ne se
développent pas dans les lots de blé maintenus à 14% d’humidité et à un taux relatif interstitiel de
70% (Boudreau et Ménard, 1992). Des activités lipolytique et protéolytiques plus élevées sont liées
à la plus forte teneur en humidité, ce qui conduit encore à une perte en nutriments (protéines et
lipides) (Butt et al., 2004).
1.1.4.2. Influence de la température
La température joue un rôle important dans la conservation des grains (Cruz et al., 2002).
Elle est le facteur le plus important qui affecte la qualité du grain au cours du stockage (Kusiñska,
2001).
Elle intervient d’une part sur la valeur de l’Aw et d’autre part, sur les vitesses des réactions
chimiques et enzymatiques et donc la croissance des microorganismes (Richard-Molard, 1998). Une
6
augmentation de température se traduit par un dégagement de chaleur au sein de la masse des grains
qui double pratiquement pour chaque élévation de 5°C de la température, ceci jusqu'à environ 28°C
(au-delà l'effet diminue); la durée probable de conservation d'un stock est ainsi diminuée de moitié
(Cruz et al., 2002). Au cours de la conservation, plus la température est élevée et plus les réactions
biologiques des microorganismes sont rapides (Multon, 1982).
1.1.4.3.Influence de l’atmosphère confinée
La respiration des grains stockés dans une structure étanche appauvrit l'atmosphère
interstitielle en oxygène et l'enrichit en gaz carbonique. Cette modification de la composition des
gaz du milieu peut bloquer le développement des moisissures et détruire les insectes présents.Ce
principe est appliqué dans les méthodes de stockage souterrain (fosses) pratiquées de manière
traditionnelle. Cependant, si les grains sont emmagasinés avec une humidité excessive, des risques
de fermentation apparaissent et donnent lieu à des pertes importantes qui peuvent atteindre
l'ensemble du stock (Cruz et al., 2002).
1.1.4.4.Influence de la composition du grain
La structure anatomique des grains de blé, leur composition biochimique (Richard-Molard,

1998) et l’état physique, influent sur la croissance et l’activité des microorganismes (Cahagnier,
1998). La zone du germe, biochimiquement plus riche que l’enveloppe ou l’amande amylacée,
constitue le meilleur point de départ pour la croissance des moisissures. Des travaux ont pu montrer
que même à de très faible activité d’eau (0.75-0.85), les lipides neutres des grains dont le germe est
riche, ne présente pas une source de carbone accessible à la lipase fongique et constituent sans
doute des éléments essentiels pour l’initiation de la croissance des moisissures xérotolérantes
(Haard et al., 1999).
1.1.5. Modifications du blé fermenté

1.1.5.1. Modifications visuelles et olfactives
 Décoloration
La décoloration peut être causée par les champignons de champ et de stockage entraînant
ainsi un noircissement du germe de blé (Heredia et al., 2009). Les moisissures des champs peuvent
induire une décoloration des grains de blé, connue sous le nom (point noir ou tâche du noyau)
causant l’échaudage des grains et l’affaiblissement ou la mort des embryons (Hanson et
Christensen, 1953). Les moisissures de stockage provoquent une décoloration sévère des grains,
Aspergillus glaucus provoque la décoloration du germe ; Les moisissures du genre Penicillium qui
7
exigent des teneurs en eau relativement élevées peuvent causer la décoloration du grain (Brooker et
al., 1992).
 Odeur
La contamination fongique des grains de blé est responsable du rejet des odeurs indésirables.
Il a été constaté que les grains stockés à des conditions d’humidité élevées ont une odeur de moisi
(Mathew, 2010).
1.1.5.2. Modifications biochimiques
Au cours du stockage du blé, de nombreux changements biochimiques peuvent se produire

et provoquent une diminution de la valeur nutritive du produit stocké en attaquant les glucides, les
protéines, les lipides et les vitamines (Udayakumar, 2009).
 Dégradation des lipides
Les lipides des grains et notamment les triglycérides se révèlent particulièrement sensibles à
la dégradation par les microorganismes. Les triglycérides sont hydrolysés en glycérols et en acides
gras grâce à des enzymes appelé « lipases », que l’on rencontre chez les moisissures (Rhizopus,
Aspergillus, Geotrichum, Penicillium), les levures (candida, Pichia) et les bactéries (Bacillus). Les
acides gras sont dégradés chez les microorganismes aérobies et aéroanaérobies (Pseudomonas,
Entérobactéries, levures, moisissures…) par la β-oxydation (Guiraud, 2003). L’évolution de
l’acidité grasse est une des manifestations les plus sensibles des modifications biochimiques que
subissent le blé au cours du stockage (Feillet, 2000).
 Dégradation des glucides
Les grains de blé se composent d’environ de 60 à 80 % de glucides (Dunford, 2012) qui

comprennent à la fois des saccharides fonctionnelles et des saccharides de stockage, la plupart sous
forme de polysaccharides (amidon, cellulose) qui sont non directement assimilables par les
microorganismes et nécessitent l’intervention d’enzymes extracellulaires (amylases et cellulases).
 Dégradation des protéines
L’hydrolyse des protéines en polypeptides et en acides aminés assimilables par les

microorganismes ne se fait que très lentement dans les conditions de stockage (Multon, 1982).La
plupart des protéases microbiennes sont spécifiques. Elles agissent aussi bien sur les protéines que
sur les oligopeptides, il s’agit des enzymes généralement exocellulaires (Guiraud, 2003).
8
1.1.2. Autres céréales
Les variétés de céréales les plus consommées dans le monde sont le blé dur (Triticum
sativum), le maïs (Zeamays), le riz (Oryza satuva), l’avoine (Avena sativa), l’orge, (Hordeum
vulgara), le millet (Pennisetum glaucum), le teff (Eragrostistef), le sorgho (Sorghum bicolor), le
seigle (Secalecereale).
Leur importance varie selon les régions géographiques où elles sont naturellement cultivées.
Ces produits à base de céréales comme le blé, le seigle, le riz, le maïs, l’orge, l’avoine, le sorgho et
le millet, racines (manioc, taro), les légumes secs, pois chiche, graine de soja sont fermentés en
divers produits dans différentes régions du monde et selon les traditions ancestrales (tableau 1).
1.1.3. Aliments et boissons fermentés
Une large gamme de bouillies et de boissons non alcoolisées à base de sorgho, de millet et de
maïs est produite en Afrique : ogi (Benin, Nigeria), togwa (Tanzania), bushera (Ouganda), ben-
saalga/koko (Burkina Faso, Ghana), gowé (Benin), mawé (Benin), kenkey (Ghana), hussuwa
(Sudan) et poto poto (République populaire du Congo) (Muyanja et al.,2003; Tou et al., 2006 ;
Abriouel et al., 2006 ;Adebolu et al., 2007 ; Guyot, 2010).
De nombreux pays africains fabriquent les boissons alcoolisées à partir des céréales (après
maltage).
En Asie, la fermentation du riz avec des starters mixtes a donné naissance à une grande
variété de produits traditionnels (Hammes et al., 2005).
Dans les Himalayas, quelques céréales sont traditionnellement fermentées en aliments

comme selroti, nan, jalebi, siddu, bhatarua, et seerain. Elles sont aussi fermentées pour produire
des boissons alcoolisées (Tamang, 2010d). Au Mexique et au Guatemala, le maïs est utilisé pour la
production d’une boisson, non alcoolisée, dénommée pozol (Ben Omar and Ampe, 2000).
9
Tableau 1: Aliments et boissons traditionnels, à base de céréales fermentées, consommées dans différentes régions du monde (Guyot,2010).
Nom du produit Pays d'origine Céréales utilisées Nature du produit fermenté Utilisation
Ben-Saalga , Koko Burkina Faso, Ghana Millet de perle Liquide Bouillie
Behaati jaanr Inde, Népal Riz Riz glutineux saccharifié Boisson alcoolisée (douce-acide)
Boza Roumanie, Turkie, Albanie Blé, seigle, maïs, etc Liquide (avec cuisson) Boisson
Bushera Ouganda Shorgo, millet Suspension Boisson
Dosa Inde Riz et haricot urd Pâte à frire Crêpes
Boisson alcoolisée obtenue après
Gahum tojaanr Inde Blé, seigle, maïs, etc Graines cuites
filtration des graines
Gowé (Sifanu) Benin Shorgo Liquide (avec cuisson) Boisson
Hussuwa Soudan Shorgo Pâte Pâte comme aliment
Idli India Riz et haricot urd Pâte à frire Gâteaux cuits à la vapeur
Injera Ethiopie Teff; Shorgo, Eleusine, Maïs, orge Pâte à frire Pain plat
Kenkey Ghana Maïs Pâte Pâte cuite à la vapeur
Kisra Golfe arabe, Soudan Irak Shorgo, Millet de perle Pâte épaisse à frire Pain plat
Boisson alcoolisée épaisse,
Kodo ko jaan Y Inde, Népal Eleusine Graines cuites légèrement acide obtenue après
présage des graines
Mahewu Afrique du Sud, Zimbabwe Maïs Suspension Boisson
Mawé Bénin, Togo Maïs Pâte Aliments de base prêt-à-servir
Ogi Afrique de l'ouest Maïs, millet, shorgo Liquide Aliments de base prêt-à-servir
Poto poto Congo Maïs Liquide Bouillie
Pozol Mexique, Guatémala Maïs Pâte cuite avec le citron vert Boisson
Selroti Inde, Népal, Bhoutan Riz Pâte à frire Beignet
Togwa Afrique de l'est Maïs Bouillie Boisson
Ben-Saalga Burkina Faso, Ghana Blé, seigle Bouillie Aliments de base prêt-à-servir
Pain
San Fransisco Amérique Blé, seigle Pâte Pain
Pain au levain Europe, Australie, Amérique Millet de perle Pâte Pain- Baguette
1.1.4. Blé fermenté
Le blé récolté est conservé dans les silos souterrains « matmora » (Figure 2B). Suite à
l’infiltration accidentelle des eaux des précipitations dans la matmora, les grains de blé sont
inondées et subissent une fermentation spontanée. L’atmosphère confinée dans la matmora
engendre les phénomènes de fermentations d’origine microbienne dont la durée peut dépasser une
dizaine d’années. Le hamoum (Figure 2A), issu du blé fermenté est utilisé dans la préparation de
pain de blé fermenté et de couscous lemziet, elmachroub. Ces derniers sont caractérisés par une
variété de saveur, de texture et d’arômes particuliers pour les consommateurs des régions
spécifiques (Bekhouche et al., 2013).
Les fermentations des céréales sont dominées par les bactéries lactiques. La composition et
la diversité du microbiote des céréales fermentées dépendent principalement de l’environnement
(végétaux, animaux et ustensiles de fabrication, entres autres) et de l'adaptation des
microorganismes aux conditions de fermentation (substrats, températures, pH, activité de l’eau)
(Guyot, 2010; Tamang, 2013d).
11
1.2.Les bactéries lactiques

1.2.1. Définition et caractéristiques des bactéries lactiques
Le groupe de bactéries lactiques constitue un groupe hétérogène dont le caractère commun

est la production d’acide lactique suite à la fermentation des glucides (Labioui et al., 2005). Il existe
d’autres bactéries produisant de l’acide lactique mais qui ne sont pas considérées comme faisant
partie du groupe des bactéries lactiques. C’est le cas par exemple, de Bacillus et de
Sporolactobacillus qui sont des bactéries Gram (+) sporulées (Axelsson, 2004).
Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes en forme de coques ou de batônnets,
Gram-positif, incapables de produire la catalase (certaines souches possèdent une pseudo-catalase),
généralement immobiles et asporulées (Dellagio et al., 1994).En présence d’oxygène elles sont
incapables de phosphorylation oxydative. De nombreuses bactéries lactiques ont des exigences
nutritionnelles complexes en ce qui concerne les acides aminées, facteurs de croissance, peptides,
base purique et pyrimidique, des vitamines B et des acides gras. Elles ont également une activité
aromatique très importante d’où leur utilisation en agroalimentaire (Leveau et al., 1991). Sur la base
des caractéristiques de fermentation, les bactéries lactiques sont homofermentaires ou
hétérofermentaire (Dortu, 2008), et tolèrent des pH acides. Cette dernière propriété est utilisée en
agroalimentaire pour acidifier le milieu et empêcher le développement des bactéries pathogènes et
d'altérations (Nielsen et al., 2008).
Les bactéries lactiques sont ubiquistes, elles sont présentes dans de différentes niches
écologiques comme le lait, les produits laitiers, les végétaux, la viande, les muqueuses humaines et
animales (Drouault et Corthier, 2001). Elles ont également été retrouvées dans le sol, les engrais, et
les eaux d’égout (Holzapfel et al., 1996 cités par Givry et Duchiron, 2008).
Elles sont généralement mésophiles mais certaines sont psychrotolérantes ou

thermotolérantes. Elles se développent majoritairement à pH 4,0-4,5 et certaines sont encore actives
à des valeurs de pH extrêmes comme 9,6 ou 3,2. Elles possèdent des tolérances très variables vis-à-
vis du NaCl et possèdent de faibles activités protéolytiques et lipolytique (Caplice et Fitzgerald,
1999). Les bactéries lactiques utilisées dans l’alimentation sont considérées comme non pathogènes
et se font attribuer le qualificatif anglo-saxon d’organismes GRAS « GenerallyRecognized As
Safe ».Cependant, quelques espèces du genre Streptococcus et Enterococcus sont considérées
comme des pathogènes opportunistes (Collins et Aguirre, 1993).
Dans l’environnement, les bactéries lactiques sont souvent retrouvées dans le lait et ses
dérivés (lait fermentés, fromage).Les différentes espèces de Lactobacillus, Lactococcus lactis et/ou
12
Lactococcus garvieae, les plus rencontrés dans le lait et le fromage sont communément utilisés
comme ferments (« starter culture » ») par l’industrie agroalimentaire pour la production de produits
laitiers. Elles sont à l’origine de la fermentation pour la préparation de nombreuses boissons à partir
de plantes (boza, cidre), céréales (maïs, sorgho). Acidotolérantes, les bactéries lactiques sont
capables de survivre dans des milieux très acides en raison de leur production d’acide lactique. De
plus, l’acidification du milieu participe à l’inhibition de la croissance de certains microorganismes
pathogènes tels que Listeria monocytogenes (Ennahar et al., 1998).
1.2.2. Classification des bactéries lactiques
Depuis la description du genre Bacterium lactis (actuellement Lactococcus lactis), la

taxonomie des bactéries lactiques est en évolution permanente. Le nombre de nouvelles espèces a
augmenté énormément au cours de ces dix dernières années. Les réorganisations effectuées ont
contribué à fusionner des espèces en une seule, ou identifier une espèce comme un nouveau genre
(Pot, 2008).
La classification des bactéries, des levures, des virus et des protistes est basée sur la
taxonomie polyphasique. C’est Colwell (Colwell, 1970), qui a introduit ce terme en se référant à
une taxonomie basée sur un ensemble de critères regroupant les caractéristiques écologiques,
phénotypiques, biochimiques et génétiques (Pot, 2008).
La première classification des bactéries lactiques a été établie par Orla-Jensen (1919) basée
sur les méthodes phénotypiques classique (morphologique, biochimique et physiologique) demeure
pratique dans l’identification préliminaire des microorganismes (Lahtinen et al., 2011).Les bactéries
étaient donc classées en fonction de la morphologie pour décrire et classifier les genres des
bactéries lactiques. De ce fait, elles peuvent être divisées arbitrairement en bacilles (Lactobacillus et
Carnobacterium) et coques (Ho et al., 2007).Les données biochimiques et physiologiques incluant
la production de gaz à partir du glucose (Sperber et Swan, 1976),la croissance à différentes
températures, la tolérance au NaCl, aux acides, à la bile, l’hydrolyse de l’arginine à la détermination
du profil d’hydrolyse des sucres et à la configuration de l’aide lactique ont été utilisées pour
discriminer les microorganismes les plus proches (Ho et al., 2007).
Ces méthodes se sont ensuite étendues par l’étude des marqueurs chimio-taxonomiques
comme la composition de la paroi cellulaire bactérienne (De Ambrosini et al., 1996) incluant la
nature des acides gras, tels que l’acide lactobacillique et les acides gras insaturés qui la composent
(Gilarova et al., 1994).
13
Avec l’avènement de la biologie moléculaire, de nouvelles techniques se développèrent telle

que l’hybridation ADN/ADN, le séquençage de l’ARN 16S de gènes codant des protéines, de
protéines ribosomales ou d’études plus poussées du génome ont été incorporés à la description
d’une espèce. La combinaison des méthodes chimio-taxonomiques, moléculaires et physiologiques
ont permis d’approcher la taxonomie bactérienne sous un autre angle.
En effet, ces méthodes ont changé la taxonomie des bactéries lactiques de façon
significative. Selon les travaux de phylogénie (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Klein et al., 1998), les
bactéries lactiques appartiennent au phylum des Firmicutes, à la classe des Bacilli et à l’ordre des
Lactobacillales. L’ordre de Lactobacille regroupe six familles (Aerococcaceae, Carnobacteriaceae,
Enterococcaceae,Lactobacillaceae, Leucoccaceae et Streptococcaceae) formées de plusieurs
genres dont 15 seulement forment le groupe lactique
Lactococcus,Carnobacterium,Enterococcus,Lactobacillus,Weissella,Leuconostoc,Oenococcus,Pedi
ococcus, Streptococcus,Aerococcus,Vagococcus,Alloicoccus,Dolosigranulum, Globicatella et
Tetragenococcus. Parmi ces bactéries lactiques, neuf premiers genres sont utilisés dans l’industrie
agroalimentaire (Leisner et al., 2000).
Les relations phylogénétiques de ces principales bactéries lactiques, basées sur la

comparaison des séquences d’ARNr 16S, montrent que Carnobacterium, Enterococcus,
Vagococcus, Aerococcus, Tetragenococcus et Lactosphaera sont étroitement apparentés les uns aux
autres. Lactococcus et Streptococcus apparaissent comme relativement apparentés, alors que
Lactobacillus est phylogénétiquement distinct (Figure 3).
De nouveaux genres, par exemple Isobaclum,Ermococcus,Facklamia,Globicatella,

Helococcus,Ignavigranum,Apoqobacter,Abiotrophia,Alkalibacterium,Allofustis,TrichococcusMarin
ilactobacillus, Paralactobacillus,Oscillospira, ont également été décrit, et montrent des liens
physiologiques et phylogénétiques avec les groupe des bactéries lactiques (Ennahar et al., 2003,
Makarova et Koonin, 2007).
Récemment, deux nouvelles espèces Lactobacillus nasuensissp.nov et Lactococcus

fujiensissp.nov. ont été isolées respectivement d’ensilage de sorgho et de feuilles de choux chinois
et caractérisées phénotypiquement et taxonomiquement (Cai et al., 2011a ; Cai et al.,2011b). Les
bactéries lactiques représentent ainsi un groupe taxonomique, physiologique et phylogénique très
divers.
14
Figure 3: Arbre phylogénétique consensus, basé sur la comparaison de séquence d’ARNr 16S,
montrant les principaux groupes de bactéries lactiques, ayant un faible contenu mol% de
G+C de l’ADN ainsi que les bactéries Gram positives non reliées des genres Bifidobacterium et
Propionibacterium (Holzapfel et al., 2001).
15
1.2.3. Caractéristiques des principaux genres de bactéries lactiques

1.2.3.1. Genre Lactobacillus
Le genre Lactobacillus a été proposé par Beijerinck en 1901.Il compte à ce jour plus de cent
espèces, largement répandues dans les règnes animales et végétales. Elles sont caractérisées par leur
hétérogénéité : le pourcentage GC varie de 32 à 53%. De par leur variété, elles sont présentes dans
des milieux très différents laits fermentés comme le kéfir, végétaux fermentés comme la
choucroute, les viandes fraîches ou fermentées, l’ensilage ou le vin, le tube digestif de l’homme et
des animaux(Guiraud,2003 ; Galvez et al., 2008). Ces bactéries ont une forme de bacilles longs et
fins (parfois incurvés) souvent groupés en chaînes, généralement immobiles, asporulés, catalase
négative, se développent à un optimum de température situé entre 30 et 40°C. Les lactobacilles ont
des exigences nutritionnelles très complexes en acides aminés, en vitamines, en acides gras, en
nucléotides, en glucides et en minéraux (Khalid et Marth., 1990 ; Leclerc et al., 1994).
Le genre Lactobacillus a été subdivisé selon leur type fermentaire en trois groupes selon la
classification deOrla-Jensen en trois groupes remaniée par Kandler et Weiss ; et cette classification
est encore utilisée en milieu industriel (Tamime, 2002).
 Groupe I « Thermobacterium»
Il comprend les lactobacilles homofermentaires stricts, la plupart étant thermophiles qui se

développent à 45°C mais pas à 15°C. Ce groupe est constitué majoritairement d’espèces présentes
chez l’homme et les animaux et qui participent à l’équilibre de la microflore de l’organisme. Les
espèces les plus fréquentes dans l’alimentation (lait, yaourt, fromage) sont Lb. helveticus, Lb.
delbrueckii, Lb. acidophilus
 Groupe II «Streptobacterium » :
Il regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles et peuvent être occasionnellement

hétérofermentaires en fonction du substrat. Ils métabolisent le glucose en acide lactique grâce à la
voie homofermentaire d’Embden-Meyerhof-Parnas et dégradent les pentoses par la voie
hétérofermentaire des pentoses phosphate. Ils ne produisent pas de CO2 lors de la fermentation du
glucose mais ils en produisent lors de la fermentation du gluconate (Kandler et Weiss, 1986 ; Stiles
et Holzapfel., 1997).Les espèces les plus fréquentes dans l’alimentation sont Lb. casei, Lb. curvatus,
Lb. sake et Lb. Plantarum (Figure 4).
16
Figure 4 : Lactobacillus casei au microscope électronique (Corrieu& Luquet, 2008).
 Groupe III «Betabacterium » :
Ce sont des lactobacilles hétérofermentaires. Il comporte les espèces Lb. fermentum, Lb.
brevis et Lb. sanfrancisco.
1.2.3.2. Genre Lactococcus
La première espèce de Lactococcus décrite fut Bacterium lactis par Lister (1873). Elle fut
ensuite renommée Lactococcus lactis par Schleifer et al. (1985). Le genre Lactococcus comprend 7
espèces et 4 sous espèces (Euzeby, 2011).
Figure 5 : Lactococcus lactis, au microscope électronique (Corrieu et Luquet, 2008).
Les produits végétaux constituent leur réservoir principal, mais ils sont largement présents
dans le lait et les produits laitiers (Pilet et al., 2005).
17
Les lactocoques se présentent sous forme de coques en paire ou en chaînes de longueur

variable. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives homofermentaires ne produisant que de
l’acide lactique L(+), seul Lactococcus lactis ssp. Lactis biovar. Diacetylactis produit le diacétyl.
Leur température optimale de croissance est proche de 30°C, capable de se développer à 10°C mais
pas à 45°C. Quelques espèces produisent des exopolysaccharides et des bactériocines (Tamime,
2002).Cependant, l’espèce Lactococcus lactis (Figure 5) trois sous espèces ont été attribuées :
Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis
subsp.diacetylactis. Seules les deux premières Lactococcus lactis subsp. Lactis et Lactococcus
lactis subsp. Cremoris sont importantes dans l’industrie laitière (Axelsson , 1998).
1.2.3.3. Genre Streptococcus
Les espèces de Streptococcus ont été parmi les premières bactéries à être reconnus par les
microbiologistes en raison de leur implication dans un grand nombre de maladies humaines et
animales (Brown, 1919 ; Schottmüller, 1903).
Ce genre est généralement divisé en trois groupes : pyogène (la plupart des espèces
pathogènes et hémolytiques), oral (tel que St. salivarius, St. bovis) et les autres streptocoques
(Scheilfer, 1987).
Les cellules sont généralement, de formes sphériques ou ovoïdes disposées par paires, en
tétrades ou en chaînettes. Il est difficile de distinguer ce genre des Enterococcus, Leuconostoc et
Lactococcus sur une base morphologique (Wijtzeset al., 1997).
Figure 6 : Streptococcus thermophilus, au microscope électronique (Corrieu et Luquet, 2008).
L’espèce Streptococcus thermophilus (Figure 6), largement présente dans le lait et les
produits laitiers comme agent d’acidification, possède le statut GRAS (GenerallyRecognized As
18
Safe) Cette espèce se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et son caractère non
pathogène.
La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C et le nombre limité des hydrates

de carbones permettent de distinguer les st. thermophilus de la plupart des autres streptocoques
(Pilet et al., 2005). L’espèce Streptococcus thermophilus (Figure 6), largement présente dans le lait
et les produits laitiers comme agent d’acidification, possède le statut GRAS (GenerallyRecognized
As Safe) et est utilisée dans certains produits probiotiques.
1.2.3.4. Genre Enterococcus
Ce genre forme des coques, généralement groupés isolés, en paires, en chaînettes ou en amas
et leur morphologie peut varier selon les conditions de culture (Devriese et al., 1993).
Par ailleurs, il est caractérisé par ses capacités à croître à des valeurs de pH élevées, de
résister à l’acidité, et de se développer en présence de concentrations salines élevées (Ruiz-Moyano
et al., 2008).
Figure 7 : Enterococcus faecalis au microscope électronique (Wallace et al,2003).
Les espèces du genre Enterococcus se caractérisent par leur grande résistance aux facteurs
environnementaux. Elles sont présentes notamment dans l’intestin de l’Homme et des animaux, les
produits végétaux, le sol et les produits laitiers. Les espèces Enterococcus faecalis (Figure 7) et
Enterococcus faecium, anciennement désignées « streptocoques fécaux sont toutes les deux utilisées
comme probiotiques.
19
1.2.3.5. Genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella
Ils rassemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles (Figure 8) qui
possèdent un caractère hétérofermentaires marqué, avec production d’acide lactique (isomère D), de
CO2 et d’éthanol. Les caractéristiques telles que l’hydrolyse de l’esculine, la formation de dextrane,
les conditions de croissance, la capacité à croître à différents pH et température, l’assimilation de
citrate et/ou malate permettent la différenciation entre les genres Leuconostoc et Weissella (Ho et
al., 2007).
Actuellement, le genre Leuconostoc comprend quatorze espèces, ils sont également

anaérobies facultatifs et exigeants au point de vue nutritionnel et leur croissance est toujours lente.
Le développement des Leuconostoc entraîne souvent l’apparition d’une viscosité dans le milieu
grâce à la production des exopolysaccharides. Le genre Leuconostoc principalement Ln.
mesenteroïdes sp.cremoris et Ln. lactis sont utilisés en association avec les lactocoques dans
l’industrie laitière pour produire en plus de l’acide lactique et le CO2, des substances aromatiques
telles que le diacétyl et l’acétoïne à partir des citrates du lait (Guiraud, 2003 ; Ogier et al., 2008).
Figure 8 : Leuconostoc mesenteroïdes au microscope électronique. (Wallace et al., 2003)
Récemment, l’espèce Leuconostoc oenos isolée de vins a été classée dans un nouveau genre
Oenococcus oeni et certaines espèces de lactobacilles hétérofermentaires ont été groupées avec
Leuconostoc paramesenteroïdes dans le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997).
1.2.3.6. Genres Pediococcus et Tetragenococcus
Le genre Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le

regroupement en tétrade (Figure 9). Ils sont mésophiles, le plus souvent incapable d’utiliser le
lactose, et leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance (Simpson et
Taguchi, 1995). Les bactéries appartenant à ce genre productrices de bactériocines ne sont pas
20
adaptées à la fabrication des produits laitiers fermentés de par leur manque ou leur lenteur de
fermentation du lactose (Papagianni et Anastasiadou, 2009). En revanche, la souche Pediococcus
acidilactici productrice de pédiocine PA—1/AcH s’est révélée être responsable de la bonne
conservation de la viande en diminuant les populations de Listeria monocytogenes et de Clostridium
perfringens (Rodriguez et al., 2002).Certaines espèces se distinguent par leur capacité à se
développer à des teneurs en sels très élevées, comme Pediococcus halophilus, renommé
Tetragenococcus halophilus et Tetragenococcus muriaticus qui tolère jusqu’à 18% de NaCl (Pilet
et al., 2005).
Figure 9 : Pediococcus au microscope électronique. (Wallace et al., 2003)
Les espèces de Tetragenococcus ont un rôle crucial dans la fabrication des produits
alimentaires à concentration élevée en sel comme les sauces de soja, alors que les pediocoques sont
parfois utilisés comme levains lactiques pour les charcuteries (Tosukhowong et al., 2005).
1.2.3.7. Genre Bifidobacterium
Traditionnellement, le genre Bifidobacterium a été associé aux bactéries lactiques. Par la

suite, il a été séparé en raison du contenu G+C > mol 50% et affecté au phylum des Actinobacteria
(Gomez et Malcata,1999 ; Leahy et al., 2005).Néanmoins, les bifidobactéries sont également
considérées comme des bactéries lactiques, en raison de leurs propriétés physiologiques et
biochimiques semblables et du fait qu’elles partagent certaines niches écologiques communes aux
bactéries lactiques tel que le tractus gastro-intestinal (Klein et al.,1998). En effet, elles ont
généralement un pH optimal de croissance autour de 6.5 à 7 et une température de croissance
comprise entre 37°C et 41°C. Elles ont la forme irrégulière d’un V ou une morphologie bifide en
forme de Y (Figure 10). Elles sont hétérofermentaires et dégradent les hexoses en produisant de
l’acide lactique et acétique (Gomez et Malcata, 1999 ; Leahy et al., 2005).
21
Figure 10 : Bifidobacterium sp (Wallace et al., 2003)
Les espèces de Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve et bifidobacterium

longum se trouvent dans l’intestin des enfants et des adultes.
1.2.4. Métabolisme des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques regroupent des microorganismes appartenant à plusieurs genres ayant
la capacité de fermenter les sucres en acide lactique. Les sucres peuvent être des monosaccharides
tels que les hexoses (glucose, galactose), des pentoses (xylose, ribose, arabinose), des hexitols ou
des pentitols (mannitol, sorbitol, xylitol) ou des dissacharides (lactose, saccharose, cellobiose,
maltose, tréhalose). La capacité à métaboliser les sucres est fonction des souches considérées.
En règle générale, le produit final prédominant est l’acide lactique (50% de carbone de
sucre). Il est clair, cependant, que les bactéries lactiques s'adaptent à diverses conditions en
changeant leur métabolisme par conséquence. Cela peut conduire à former différents modèles de
produits finis (Axelsson, 2004).
1.2.4.1. Principales voies fermentaires des bactéries lactiques
La fermentation des sucres s’effectue essentiellement en trois étapes (Atlan et al., 2008) :
 Le transport du sucre à travers la membrane cellulaire ;

 Le catabolisme intracellulaire du sucre ;
 Formation et expulsion extracellulaire des métabolites terminaux.
Pour pénétrer dans la cellule, les sucres doivent d’abord franchir la membrane cellulaire qui
possède une perméabilité sélective : elle laisse passer les composés apolaires par diffusion mais se
22
révèle imperméable aux composés polaires hydratés. Deux systèmes de transport actifs des sucres
sont présents chez les bactéries lactiques : le système phosphotransférase phosphoénolpyruvate
dépendant (PTS), qui couple le transport et la phosphorylation du glucide (phosphorylation en
cascade), et le système perméase énergie-dépendant, qui fait pénétrer les glucides sous forme de
sucres libres (Thompson, 1987).
Selon les genres ou espèces, les bactéries lactiques utilisent principalement l’une des deux
voies majeures du métabolisme des sucres ( Figure 11). Il s’agit des voies homofermentaire
(Embden-Meyerhof-Parnas, EMP) et hétérofermentaire (voie des pentoses-phosphate) (Atlan et al.,
2008).
1.2.4.2. Voie homofermentaire ou EM
Figure 11 : Différents types de fermentation (Axelsson, 2004)
23
La voie homofermentaire emprunte la glycolyse dans sa totalité (du glc-6-P jusqu’au

pyruvate) et est généralement associée aux bactéries des genres Streptococcus, Lactococcus,
Pediococcus, et Lactobacillus. La glycolyse conduit, en conditions optimales de croissance, à la
production de 2 molécules de lactate et 2 molécules d’ATP par molécule de glucose. Ce
métabolisme est qualifié d’homolactique lorsqu’au moins 90% du glucose consommé est converti
en lactate. La fructose-1,6-biphosphta aldolase (FBA) est une enzyme clé indispensable au
fonctionnement de la voie EMP (Thompson et Gentry-Weeks, 1994). En conditions de croissance
non optimales (limitation de carbone ou certains sucres), le métabolisme des bactéries
homofermentaires peut se diversifier vers un métabolisme appelé mixte, avec production, en plus du
lactate, de formiate, ou/de CO2, d’acétate et d’éthanol (Cocaign-Bousquet et al.1996) (Figure 12).
Cette fermentation est essentiellement réalisée par les entérobactéries (Enterococcus sp.).
Figure 12 : Schéma de la fermentation des acides mixtes (Cocaign- Bousquet et al., 1996
Les principales enzymes sont indiquées en rouge : LDH : lactate déshydrogénase, PFL :
pyruvate formiate lyase, PDH : pyruvate déshydrogénase, PTA : phosphostransacétylase, ACK :
acétate kinase, ADHE : alcool déshydrogénase.
1.2.4.3. Voie hétérofermentaire ou voie des pentoses phosphate
Les principaux groupes de bactéries présentant ce type de métabolisme sont les Leuconostoc
telles que Leuconostoc mesenteroïdes (Ln. mesenteroïdes) et Leuconostoc pentosaceus et certains
24
Lactobacillus tels que Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti. Ce groupe de bactéries dégrade
les hexoses en empruntant la voie hétérofermentaire communément appelée voie des pentoses
phosphate (Figure11) qui conduit à la formation d’une molécule d’acide lactique, d’une molécule
d’éthanol et d’une molécule de CO2 (Kandler, 1983). Les sucres à cinq atomes de carbone ou
pentoses, comme le fructose, peuvent parfois être fermentés et donnent alors une molécule
d’éthanol et une molécule d’acide lactique. Outre ces produits, qui représentent plus de 80% des
métabolites obtenus, on obtient également de l’acide acétique et du glycérol.
Chez les bactéries hétérofermentaires et selon les conditions environnementales, le pyruvate

peut aussi former d’autres composés, comme l’acétate, l’éthanol ou encore des composés
responsables des arômes des produits laitiers (diacétyle, acétoïne, 2,3-butanediol, α-acétolactate)
(Loubiere&Cocaign-Bousquet, 2009).
1.2.4.4. Voie bifide ou FPC (Fructose 6- phospho- cétolase)
Cette voie est empruntée par les bactéries du genre Bifidobacterium, elle permet d’avoir 1.5
molécules d’acétate et 2.5 molécules d’ATP à partir d’une molécule d’hexose consommée. (Figure
11).
1.2.5. Intérêts des bactéries lactiques
Le principal atout que représentent les bactéries lactiques pour l’industrie alimentaire réside
dans l’amélioration de la qualité des produits fermentés en y développant certaines caractéristiques
organoleptiques et en augmentant leur durée de conservation (Stiles et Holzpafel, 1997).Elles
participent à l’inhibition de certains microorganismes pathogènes, en produisant des métabolites
ayant une activité antimicrobienne (Dortu et Thonard, 2009).
1.2.5.1. Dans la biopréservation
La technologie de biopréservation utilisant des bactéries lactiques inhibitrices constitue un

outil supplémentaire au service des industriels qui peut contribuer à l’amélioration de la qualité et
de la sécurité microbiologique. Elle constitue une alternative pour la conservation des produits
réfrigérés qui ont une durée de conservation de plusieurs jours à plusieurs semaines. Cependant,
leur application exige une sélection ciblée des souches permettant de répondre au mieux aux
caractéristiques des produits (Pilet et al., 2005).
25
1.2.5.2. Dans l’industrie alimentaire
L’implication des bactéries lactiques dans la fermentation et la bioconservation des aliments

est connue depuis très longtemps. Les souches de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus
thermophilus sont utilisés pour la production du yaourt, des fromages et des laits fermentés (Yateen
et al., 2008).Les bactéries lactiques sont aussi responsables de l’ouverture des fromages par
production de CO2, de la texture produits fermentés, par production des exopolysaccharides ainsi
que de la production de peroxyde d’hydrogène ou de bactériocines qui inhibent la croissance de
bactéries indésirables ( Doleyres,2003).
L’utilisation des bactéries lactiques a pour but l’amélioration des caractéristiques

organoleptiques des produits fermentés et par conséquence augmenter la durée de leur conservation
sans ajout de conservateurs chimiques.
26
1.3.Les activités antimicrobiennes des bactéries lactiques
Parmi les principaux atouts des bactéries lactiques est la préservation des qualités
nutritionnelles et organoleptiques des produits alimentaires et l’augmentation de la durée de
conservation (Abee, 1995 ; Hugenholtz et al., 1999). En effet, les bactéries lactiques produisent de
nombreux métabolites aux propriétés antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde
d’hydrogène, le dioxyde de carbone, le diacétyl, la reutérine et les bactériocines.
1.3.1. Les acides organiques
Les acides organiques comme l’acide lactique, l’acide acétique ou l’acide propionique sont
produits par les bactéries lactiques lors du processus de fermentation alimentaire et permettent
d’inhiber la croissance des bactéries qui ne peuvent se développer à pH acide. Sous la forme
indissociée, l’acide lactique et l’acide acétique traversent passivement la membrane cytoplasmique
et, pour de fortes concentrations d’acides, le milieu intracellulaire peut s’acidifier à un point tel, que
les fonctions cellulaires sont inhibées et le potentiel membranaire est annulé (Ammor et al., 2006).
Ainsi, l’accumulation d’acide organique est directement inhibitrice pour les microorganismes
nuisibles qui présentent un seuil bas de résistance aux changements de pH intracellulaire (Kashet,
1987).
En milieu tamponné, les acides lactique et acétique peuvent avoir des effets synergiques sur
certaines espèces comme E. coli (Adams et Hall, 1988).
La sensibilité à ces acides dépend des bactéries et de l’action simultanée d’autres facteurs
tels que : l’activité de l’eau et la température (Hsiao et Siebert, 1999).
La production des acides lactique et acétique et donc l’abaissement du pH ont un effet

essentiellement sur les microorganismes acido-sensibles tels que Pseudomonas, Salmonella, E.coli
et Clostridium. L’acide lactique est toxique pour beaucoup de bactéries mais aussi des champignons
et des moisissures (Geis, 1989 ; Piard et Desmazeaud, 1991).
L’acide lactique n’est pas le seul acide inhibiteur. En effet, quand l’aliment contient peu de
sucres, l’inhibition sera partiellement causée par d’autres produits tels que l’acide formique, l’acide
benzoïque et le diacétyl (Helander et al., 1997).
1.3.2. Le peroxyde d’hydrogène
Les bactéries lactiques ne possèdent généralement pas de catalase. L’accumulation du

peroxyde d’hydrogène sous l’action des oxydases est la cause majeure de la présence de l’activité
27
antimicrobienne, notamment chez les lactobacilles (Daeschel, 1989).L’action inhibitrice du

peroxyde d’hydrogène est principalement due à son fort effet oxydant sur les lipides membranaires
et les protéines cellulaires (Caplice et Fitzgerald, 1999).
1.3.3. Le dioxyde de carbone
Les bactéries lactiques hétérofermentaires synthétisent du dioxyde de carbone (CO2) comme

métabolite secondaire. Son accumulation dans le milieu extérieur crée une anaérobiose qui peut être
toxique pour les microorganismes aérobies présents dans l’aliment. Son accumulation dans la
bicouche lipidique peut causer un dysfonctionnement de la perméabilité membranaire (Ammor et
al., 2006).
1.3.4. Le diacétyle
Le diacétyle est un produit du métabolisme du citrate qui est responsable de l’arôme des
produits laitiers. Plusieurs genres des genres Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus et
Pediococcus peuvent synthétiser le diacétyle (Leveau et al., 1991). Les bactéries à Gram négatif, les
levures et les moisissures sont plus sensibles au diacétyle que les bactéries Gram positif (El-Ziney
et al., 1998).
1.3.5. La reutérine
La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldéhyde) est un métabolite intermédiaire qui possède un

effet antimicrobien. Il est produit lors de la fermentation anaérobique du glycérol par certaines
espèces de Lactobacillus, notamment Lactobacillus reuteui (Vollenweider, 2004).
La reutérine est également produite par des genres bactériens non lactiques tels que Bacillus,
Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter et Clostridium (Vollenweider, 2004).
La reutérine possède un large spectre d’activité et a des applications dans le domaine médical
et alimentaire.
1.3.6. Les bactériocines
Le terme bactériocine a été utilisé pour désigner les protéines et peptides antimicrobiens
synthétisés selon la voie ribosomique. Plus précisément, les bactériocines sont considérées comme
des substances protéiques présentant une activité antimicrobienne. Ainsi les bactériocines, peuvent
être isolées chez de nombreuses bactéries et archées (Klaenhammer, 1988).
28
Aujourd’hui, les bactériocines désignent le plus souvent des protéines ou complexes de

protéines produits par les bactéries Gram positif et plus particulièrement les bactéries lactiques
(Klaenhammer 1988). Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens le plus souvent
cationiques, modifiés ou non post-traductionnellement, de masses moléculaires comprises entre 2 et
6 kDa (Heng et al., 2007a).
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont généralement actives à faible
concentration contre des bactéries phylogénétiquement proches (Belguesmia et al., 2011, Cotter et
al., 2005b). Aucune bactériocine produite par des bactéries lactiques ayant une activité contre des
bactéries Gram négatif n’a été décrite, la membrane externe de ces dernières ne permettant pas aux
bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leur activité. Cependant, plusieurs genres de
bactéries à Gram négatif tels que Haemophilus, Helicobacter ou Neisseria se sont révélés être
sensibles à certaines de ces bactériocines (Morency et al., 2001).
L’activité antimicrobienne des bactériocines a un effet soit bactéricide, provoquant la mort

de la bactérie cible, soit bactériostatique inhibant la croissance bactérienne. Les bactériocines les
plus étudiées sont celles produites par les bactéries lactiques connues pour leur rôle dans la bonne
conservation des aliments (Cotter et al., 2005b).
1.3.6.1. Nomenclature et classification des bactériocines
Les bactériocines sont produites par plusieurs genres de bactéries lactiques : Lactococcus,
Lactobacillus, Pediococcus (Klaenhammer 1988 ; Piard et Desmazeaud, 1992), Carnobacterium,
Streptococcus, Enterococcus (Devuyst et Vandamme, 1994) et Bifidobacterium (Meghrous et al.,
1999).
La nomenclature des bactériocines est basée sur le générique du genre ou de l’espèce

productrice (Leclerc et al., 1995).Par exemple, l’espèce Escherichia coli produit une bactériocine
nommée colicine. L’espèce Pediococcus produit une bactériocine nommée pediocine.
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre classes selon
les caractéristiques communes telles que le poids moléculaire, les propriétés physicochimiques, leur
mode d’action (large ou restreint), leurs propriétés génétiques et leur stabilité thermique
(Klaenhammer, 1993; Drider et al., 2006).
29
Tableau 2 :Classification des bactériocines produites par les bactéries à Gram positif (Cotter
et al., 2005a).
 Classe I : Les lantibiotiques
Ce sont des peptides de taille inférieure à 5kD, synthétisés par voie ribosomique et subissant
des modifications post-traductionnelles importantes. Ces peptides sont caractérisés par la présence
de résidus modifiés de type lanthionine (Guder et al., 2002).
La structure de ces bactériocines diffère selon la localisation des ponts établis entre les
acides aminés inhabituels (Tossi et Sandri, 2002). Les lantibiotiques sont actifs contre de
nombreuses bactéries pathogènes, comme Listeria ou Salmonella, responsables d’infections. Cette
particularité permet aux lantibiotiques d’être utilisés comme conservateurs alimentaires (Cotter et
al., 2005b).
Il existe deux types de lantibiotiques selon leur structure et leur mode d’action. En, effet on
a la classe Ia qui est composées de polypeptides cationiques, linéaires, hydrophobes contenant
jusqu’à 34 acides aminés et dont la plus connue est la nisine et la classe Ib qui regroupe les
30
bactériocines globulaires non chargées ou nulle contenant jusqu’à 19 acides aminés (Twomey et al.,
2002), dont la plus connue est la mersacidine. Certains lantibiotiques sont par ailleurs constitués de
deux peptides agissant ensemble pour avoir une activité comme la lacticin 3147.
Les lantibiotiques ont principalement la membrane cytoplasmique pour cible. Pour les
lantibiotiques, l’effet antimicrobien est le résultat à la fois de la perméabilisation de la membrane
cytoplasmique et de l’inhibition de la biosynthèse de la paroi bactérienne ou de l’inactivation d’une
enzyme essentielle à la biosynthèse de la paroi bactérienne (Chatterjee et al., 2005a ;Twomey et al.,
2002).
Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions

électrostatiques ou par la liaison à des récepteurs spécifiques tels que le lipide II, précurseur du
peptidoglycane. Suite à cette liaison, les lantibiotiques vont provoquer la formation de pore dans la
membrane cytoplasmique entrainant l’efflux rapide de petits composés cytoplasmiques tels que les
ions, les acides aminés, l’ATP, etc. Cette augmentation de la perméabilité membranaire va entrainer
la mort cellulaire (Bauer et Dicks, 2005 ; Patton et al., 2005).
Les lantibiotiques composés de deux peptides tels que la lacticine 3147, agissent également par la
formation de pores dans la membrane des cellules cibles (Mc Auliffe et al., 2001).
Figure 13 : Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II, (Chatterjee et

al., 2005a).
31
 Classe II
Cette classe regroupe les peptides dont le poids moléculaire est inférieur à 10kDa, sont
stables à la chaleur et dépourvues de lantionine. Ces bactériocines ne contiennent pas d’acides
aminés modifiés. Cette classe est divisée en quatre sous-classes.
Sous-classe II-a : Les bactériocines de cette sous-classe contiennent entre 27 et 48 acides aminés et
ont toutes une partie N- terminale hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi
qu’un pont disulfure et une partie C- terminale moins conservée, hydrophobe ou amphiphile qui
détermine la spécificité d’action (Fimland et al. 2000 ; Richard et al., 2006). Elles ont toutes une
activité contre les souches de Listeria, certaines bactériocines de cette sous-classe contiennent
également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui semble être important
dans la stabilisation de la structure tertiaire. Par ailleurs, il semble qu’il leur conférerait une
meilleure activité antimicrobienne et une meilleure résistance à l’exposition à des hautes
températures et un spectre d’action plus large (Drider et al., 2006).
Sous-classe II-b : comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides pour avoir une activité.
Ces derniers doivent être présents en quantités approximativement équivalentes pour obtenir des
activités optimales ((Nissen- Meyer et al., 1992 ; Allison et al., 1994, Richard et al., 2006).
Les gènes structuraux qui codent pour de tels peptides sont habituellement situés un à la suite de
l’autre, dans un même opéron (Allison et al., 1994 ; Diep et al., 1996, Richard et al., 2006). Les
bactériocines appartenant à cette sous-classe sont la lactacine F, la lactococcine G, la plantaricine
E/F, J/K et S et la thermophiline 13.
Sous-classe II-c : regroupe les bactériocines activées par des thiols et n’appartenant ni à la classe
II-a, ni à la classe II-b (Klaenhammer, 1993).
Sous-classe II-d : les bactériocines qui ne peuvent être regroupées dans les trois premières sous-
classes.
Le mécanisme d’action supposé des bactériocines de classe IIa est l’interaction de la

bactériocine avec la membrane ou un récepteur, la mannose perméase, pour ensuite former un pore
dans la membrane de la cellule ce qui induit la perméabilisation de la membrane et la mort de la
cellule (Dalet et al., 2000, Bauer et Dick.,2005). Le mécanisme de formation des pores n’est pas
connu même si l’hypothèse la plus courante est l’assemblage de différentes molécules de la
bactériocine (Diep et al., 2007). Les pores formés par les bactériocines de la classe IIa causent la
perte d’ion potassium ainsi que d’acides aminés et d’autres molécules de faible poids moléculaire ce
32
qui dissipe les deux composantes de la force proton motrice (Bauer et al., 2005). Les bactériocines
de la classe IIb ont en général un spectre d’action inhibant un large éventail de bactéries Gram
positif. Elles forment des pores rendant la membrane perméable à différentes petites molécules
(Oppegard et al., 2007a).
 Classe III
Ce sont des protéines de taille supérieure à 30kDa et sensibles à la chaleur. La structure et le

mode d’action de ces bactériocines différentes complètement des autres bactériocines produites par
les bactéries lactiques. Cette classe ne contient que quatre bactériocines : l’helveticin produite par
Lactobacillus helveticus A, l’enterolysin A produite par Enterococcus faecium, la zoocin A produite
par Streptococcus zooepidermicus et la millericin B produite par Streptococcus milleri ( Nilsen et
al., 2003 ; Papagianni, 2003 ;Nigutova, 2007).
Le mode d’action de ces bactériocines différentes complètement des bactériocines des autres
classes. En effet, l’enterolysin A, la zoocin A et la millericin B agissent par hydrolyse des liens
peptidiques du peptidoglycane des cellules sensibles. La zoocin A a un spectre d’action étroit alors
que l’enterolysin A et la millericin B possèdent un spectre d’action large (Nilsen et al., 2003).
Figure 14 : Mode d’action des différentes classes de bactériocines (Cotter et al., 2005a).
33
 Classe IV
Cette classe comporte les bactériocines composées d’une partie non protéique nécessaire à
l’activité inhibitrice (sucre ou lipide). La classe IV a été ajoutée suite à l’observation de la perte
d’activité de certaines bactériocines après leur incubation en présence d’enzymes dégradant les
sucres et les lipides (Jiminez-Diaz et al., 1993).
1.3.6.2. Propriétés des bactériocines
Toutes les bactériocines possèdent une protéine responsable de leur activité biologique
(Tagg et al., 1976). Elles peuvent être soit de composition simple constituée uniquement de protéine
telle que la nisine et la lactine 481, soit de composition complexe par la présence de lipides de
carbohydrate additionnés à la protéine telle que la lactine 27 (Upreti et Hinsdill, 1975). La plupart
des bactériocines peuvent être lyophilisées sans perte de leur activité (Houlihan et Russell, 2006) La
température, le pH et la digestion enzymatique sont les principaux facteurs qui affectent la stabilité
des bactériocines Les bactériocines présentent une sensibilité aux enzymes protéolytiques telles que
la trypsine, l’α- chymotrypsine, la papaïne et la pepsine (Piard et Desmazeaud, 1992). Les
bactériocines se fixent spécifiquement aux récepteurs à la surface des cellules cibles et les tuent par
altérations des liaisons membranaires- enzymes entrainant la destruction du potentiel membranaire
par la formation de pore ou par digestion enzymatique du RNA et/ou DNA (Venugopal, 2011). Il
existe des bactériocines qui sont sensibles aux enzymes non protéolytiques (lipase et α-amylase).
Les bactériocines de très faible poids moléculaire sont très thermostables montrant une
grande stabilité à des traitements thermiques élevés tels que l’autoclavage (20mn) (Sarika et al.,
2010), à l’opposé de celle qui sont de poids moléculaire élevé qui sont très sensibles (Alves et al.,
2006 ; Albano et al., 2007).
Les variations de pH ont un effet marquant sur la stabilité des préparations

bactériocinogénique. Les bactériocines sont généralement stables dans les milieux acides et neutres.
En revanche, elles perdent leur stabilité en milieu basique. C’est le cas de la nisine qui perd sa
stabilité à 80% à pH 10 (Piard et Desmazeaud, 1992, Kostinek et al., 2007).
L’activité de la bactériocine issues des bactéries lactiques mésophiles n’est pas affectée par
la variation du pH allant de 2 à 11 (Makhloufi, 2006).
La composition du milieu, en particulier les sources et les concentrations de carbone

affectent fortement la production de bactériocines. Les bactéries lactiques productrices de
bactériocines requièrent de nombreux nutriments pour leur croissance et des milieux riches
contenant de l’extrait de viande, de levure et des hydrolysats de protéines sont nécessaires. Il a déjà
34
montré que l’augmentation des concentrations en extraits de levure, viande ou peptone peut
permettre une augmentation de la production de bactériocines (Todorov et Gomez., 2004 ;
Mataragas et al., 2004).
1.3.6.3. Production des bactériocines
Les bactériocines sont produites à la fin de la phase exponentielle et au début de la phase

stationnaire de croissance (Dortu et Thonart., 2009). Elles peuvent être dégradées par les protéases
produites par les bactéries lactiques productrices (Savijoki et al., 2006) ou être adsorbées à sa
surface, ce qui mène à la baisse de la concentration de bactériocines dans la culture. Différentes
protéines sont impliquées dans la production des bactériocines et sa régulation. Les bactériocines
sont produites sous forme d’un pré peptide non-biologiquement actif qui subira des modifications
post traductionnelles pour aboutir au peptide actif. Cette production est souvent régulée par un
système de Quorum Sensing, un mécanisme permettant à certains gènes d’être exprimés en fonction
de la densité de la population bactérienne, L'expression de gènes localisés soit sur le chromosome,
comme c'est le cas de la mersacidine(Altena et al., 2000), soit sur un plasmide, comme c'est le cas
de la sakacine A (Axelsson et Holck, 1995), ou sur un transposon, comme c'est le cas de la nisine
(Rauch et De Vos, 1992a).
Les facteurs influençant la production de bactériocines sont principalement la souche

productrice, la température, le pH, la composition du milieu et la technologie de fermentation
employée (Dortu, 2008).
1.3.6.4. Conditionnement des bactériocines
Il est très difficile de conditionner les bactériocines sous la forme purifiée. Les bactériocines
semi-purifiées peuvent être conditionnées sous forme sèche par atomisation ou lyophilisation
(Parente et Riccardi, 1999). La nisine, la seule bactériocine légalement approuvée comme additif est
commercialisée sous forme semi-purifiée (Dortu et Thonart, 2009).
1.3.6.5. Bactériocines en agroalimentaire
La bioconservation des aliments fait l’objet depuis 40 ans de nombreuses études. Elle
consiste en une augmentation de la durée de vie et une amélioration de la sécurité sanitaire des
produits alimentaires, en utilisant des microorganismes et/ ou leurs métabolites (Ross et al., 2002 ;
Stiles, 1996). Les bactéries lactiques et/ ou leurs métabolites utilisés depuis des millénaires d’une
façon empirique par de nombreuses populations, peuvent contribuer à la conservation des aliments
(Ross et al., 2002). C’est grâce aux propriétés antimicrobiennes de métabolites qu’ils synthétisent,
tels que l’éthanol, le peroxyde d’hydrogène, le diacétyl (Atrih et Foster, 2001a), les composés
35
antifongiques (Corsetti et al., 1998), les acides phényl-lactiques (Lavermicocca et al., 2000), les
antibiotiques comme la reutéricycline (Höltzelet al., 2000) et les bactériocines, que les bactéries
lactiques sont reconnues comme de bons agents de conservation des produits alimentaires (Abee et
al., 1995, Klaenhammer, 1988). Afin de diminuer l’utilisation des additifs chimiques dans
l’alimentation et d’obtenir des aliments prêts à la consommation et respectant les règles de la
sécurité sanitaire, l’industrie agroalimentaire s’intéresse à l’utilisation des bactériocines comme bio-
conservateurs (Robertson et al., 2004).
L’absence de toxicité pour les cellules eucaryotes et la perte d’activité en présence des
protéases présentes dans le tube digestif présentent des propriétés qui pourraient placer les
bactériocines parmi les substances sans danger pour l’Homme. Elles doivent cependant, pour le
moment, être considérées comme un moyen de conservation complémentaire à ceux déjà existants
(Deegan et al., 2006).
Des bactériocines sont commercialisées sous la forme d’un concentré obtenu après
fermentation par la souche productrice et atomisation d’un substrat alimentaire tel que le lait, par
exemple. Considéré comme un ingrédient fermenté, ce type de préparation contiendra d’autres
métabolites microbiens tels que l’acide lactique (Dortu et Thonart, 2009)
1.3.6.6. Utilisation alimentaire des bactériocines
Les bactériocines sont employées dans plusieurs domaines. Leur utilisation dans le domaine
alimentaire est devenue très intéressante grâce à leur potentiel d'assurer une sécurité microbienne et
une bonne qualité du produit alimentaire (Delves-Broughton, 1990 ; Benech, et al., 2002).
L'utilisation des bactériocines comme additifs naturels dans les aliments a suscité l'intérêt du
consommateur qui cherche à minimiser l'utilisation des additifs chimiques artificiels dans les
produits alimentaires. Plusieurs études ont montré l'efficacité de la nisine en tant qu'agent de
conservation dans les aliments comme la truite fumée (Nykanen et al, 1999), les produits à base
d'œufs liquides pasteurisés (Delves-Broughton et al. 1996), les fromages et d'autres produits laitiers
(Delves-Broughton, 1990). En effet, la nisine est la plus étudiée des bactériocines et la seule utilisée
commercialement dans les produits alimentaires.
Afin de s'assurer de l'efficacité des bactériocines utilisées pour des applications alimentaires
en tant que préservateurs, un conservateur alimentaire doit avoir les propriétés suivantes (Dortu
etThonart, 2009) :
Être actif sur les micro-organismes pathogènes aussi bien que sur ceux responsables des
altérations des aliments ;
36
Être inoffensif pour les humains ou les animaux ;
Être stable et non détruit au contact de l'aliment ou du micro-organisme ;
Être rapidement soluble et distribué uniformément dans l’aliment ;
Ne pas être inactivé par l'aliment, ni conférer de saveur ou d'arôme à l’aliment ;
Ne pas favoriser l'apparition de micro-organismes résistants
Ne pas diminuer la valeur nutritive de l'aliment.
D'une façon générale, les conservateurs alimentaires entre autres les bactériocines inhibent
les micro-organismes en interférant avec leur membrane cellulaire, leur activité enzymatique ou
leur métabolisme génétique. Ainsi, ils peuvent dénaturer leur protéine, altérer ou détruire leur ADN,
leur paroi cellulaire ou leur membrane cytoplasmique. Ainsi, par ces divers mécanismes d'action,
ces additifs naturels peuvent améliorer largement la sécurité alimentaire des produits.
1.3.6.7. Applications médicales des bactériocines
L’émergence de la résistance aux antibiotiques conventionnels ces dernières années a orienté

la recherche vers l’étude de nouveaux agents antimicrobiens. Le mode d’action des bactériocines
qui diffèrent de ceux des antibiotiques conventionnels et l’innocuité des bactériocines permettraient
leur utilisation comme alternative aux antibiotiques dans la prévention et/ ou le traitement des
infections dues à des bactéries devenues résistantes aux traitements conventionnels (Dicks et al.,
2011). Contrairement aux applications alimentaires des bactériocines, aucune de bactériocine n’est
à ce jour commercialisée comme médicament. Cependant, quelques-unes d’entre elles sont en cours
d’essais cliniques pour le traitement d’infections cutanées, respiratoires, systémiques et/ ou
urogénitales ainsi qu’en tant qu’agents contraceptifs parmi elles la rBPI21 en phase clinique III pour
le traitement de la méningite (Hancock, 2000).
37
1.4. Les probiotiques

1.4.1 .Historique et développement du concept probiotique :
La définition du terme probiotique a évolué dans le temps en fonction de la réflexion des

chercheurs, des connaissances scientifiques et des avancées technologiques.
Au XX siècle le lauréat du prix Nobel, Elie Metchnikoff a observé qu’un nombre surprenant
de personnes en Bulgarie vivait plus de 100 ans. Cette longévité ne pouvait pas s’expliquer par les
avancées de médecine moderne, car la Bulgarie, l’un des pays les plus pauvres d’Europe à l’époque,
ne bénéficiait pas de telles avancées. Le Dr. Metchnikoff a constaté que les Bulgares consommaient
de grandes quantités de yaourt, et il a associé l’augmentation de la longévité observée à la
consommation des microorganismes vivants provenant des produits laitiers fermentés. Même si
Metchnikoff voyait les microbes comme étant plutôt nuisible pour la santé humaine, il considérait
bénéfique la substitution des bactéries du tractus gastro-intestinal par celle du yaourt dont le bacille
bulgare. Il a alors expliqué l’effet bénéfique meilleur de ce dernier par l’absence de production
d’alcool (néfaste à la longévité), en comparaison aux bactéries présentes dans d’autres laits
fermentés tels que le kéfir ou le koumys. De plus il a supposé que l’acide lactique produit, ainsi que
d’autres facteurs non identifiés, agiraient de façon synergique pour inhiber la croissance de
bactéries de la putréfaction dans le colon (Guarner et al., 2008).
A la même époque, en 1906, le pédiatre français Henry Tissier a observé que les selles des
enfants souffrant de diarrhées contenaient un faible nombre de bifidobactéries par rapport aux selles
d’enfants en bonne santé. Il suggéra alors d’administrer ces bactéries aux patients diarrhéiques pour
les aider à restaurer un microbiote intestinal sain (FAO/WHO, 2001 ; Piquepaille, 2013).
Metchnikoff et Tissier sont donc les premiers à émettre l’idée d’administrer des
microorganismes exogènes afin de pallier à un éventuel dysfonctionnement de notre écosystème
intestinal. Le concept « probiotiques » est né.
Cependant, ce n’est qu’en 1954 que le terme de probiotiques a été introduit dans la
littérature par Ferdinand Vergin, ce terme dérivé du grec « pro bios », qui signifie littéralement « en
faveur de la vie » par opposition aux effets délétères des antibiotiques.
En 2002, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et la Food and Agriculture

Organisation des Nations Unies(FAO) officialisaient la définition de terme probiotique afin d’éviter
toute dérive. Les probiotiques sont donc définis comme « des organismes vivants qui, ingérés en
quantité suffisante, ont un effet bénéfique sur la santé de l'hôte » (FAO/WHO ,2002).
38
1.4.2. Définition
Le terme probiotique a bénéficié de plusieurs définitions qui ont évolué dans le temps en
fonction des connaissances scientifiques et des avancées technologiques (Ait-Belgnaoui et al.,
2006). Finalement, c’est en 2002 que la FAO (Food and Agriculture Organization) et l’OMS
(Organisation mondiale de la santé ; WHO) ont formulé la définition suivante : « microorganismes
vivants qui lorsqu’ils sont administrés en quantités adéquates, exercent une action bénéfique sur la
santé de l’hôte qui les ingère ».
1.4.3. Principales espèces de bactéries lactiques à potentiel probiotique
Les espèces les plus fréquentes et les plus rapportées dans la littérature sont du genre
Bifidobacterium et Lactobacillus, mais il faut aussi mentionner des souches du genre Enterococcus
et Streptococcus (Gbassi et al., 2011 ; Rokka et Rantamaki, 2010).
Tableau 2: Principaux critères utilisés pour la sélection des souches probiotiques (FAO/WHO,
2002)
Critères de sécurité Historique de non pathogénicité (GRAS)

Souche d’origine humaine ou alimentaire
Souche caractérisée par des méthodes phénotypiques et
génotypiques
Souche déposée dans une collection de culture internationale
Aucune possibilité de transmission de gènes de résistance aux
antibiotiques
Pas de deshydroxylation des sels biliaires
Critères fonctionnels Tolérance à l’acidité
Tolérance à la bile
Antagonisme vis-à-vis des pathogènes et production de
substances antimicrobiennes
Adhésion à diverses lignées de cellules intestinales et/ou au
mucus
Stimulation du système immunitaire
Critères technologiques Stabilité au cours des procédés de production et dans le produit
fini
Conservation des propriétés probiotiques après production
39
1.4.4. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques
Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la souche
microbienne. Il est nécessaire de connaître le genre et l’espèce de la souche utilisée car les effets
probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne. Il est nécessaire de caractériser de manière
précise les souches utilisées. La détermination taxonomique d’une souche potentiellement
probiotique est une étape indispensable.
Une série de principes généraux et de critères pratiques selon la FAO/WHO(2002) ont été
mis en place pour sélectionner les souches probiotiques les plus sécuritaires. Ces dernières doivent
être identifiées via des méthodes moléculaires fiables de détermination du phénotype et du
génotype. Toutes les souches probiotiques doivent être déposées dans une collection de cultures
reconnue à l’échelle internationale (à chaque souche est attribué un code alphanumérique
d’identification choisi par le laboratoire ou la collection. Une fois identifiées, les bactéries
probiotiques doivent être nommées selon les règles du Code International de Nomenclature des
Bactéries pour une compréhension universelle (Nom du genre / nom de l’espèce /identifiant de la
souche) (Vasiljevic et Shah, 2008 ; Butel, 2014).
La non-pathogénicité (innocuité) des souches est un critère très important, les souches ayant
le statut GRAS (Generally Regarded As Safe) sont d'ailleurs à favoriser. Ce critère de sécurité
semble évident, mais il est important de l’évaluer précisément pour chaque souche potentiellement
probiotique, en étudiant tout effet indésirable possible (résistance aux antibiotiques, activités
métaboliques nocives, production de toxines, potentiel infectieux, activité hémolytique)
(Fitzpatrick, 2005 ; Rothe et Blaut., 2013).
Toutefois, le critère de viabilité ou de survie demeure essentiel dans la sélection des

probiotiques qui doivent parvenir vivantes au site de leur action, à savoir l’intestin, et donc résister
aux différents mécanismes de défense de l’hôte étant donné que les bactéries sont administrées par
voie orale (Millette, 2008).
Ainsi, pour garantir leur survie pendant le passage du tractus digestif, les probiotiques sont
premièrement criblés pour leur tolérance au pH acide et à la bile. L’adhésion des bactéries
probiotiques aux tractus digestif leur permet de produire durablement des molécules bénéfiques
pour l’hôte, mais permet également l’exclusion des pathogènes et une immuno-stimulation (Servin,
2004). Les microorganismes potentiellement probiotiques doivent donc être sélectionner selon
différents critères qui sont décrits dans le tableau 4.
40
Tableau 3: Critères de sélections utilisés aux laboratoires pour le screening des probiotiques
(Nousiainen et al., 2004)
Critères But recherché

Survie pendant le passage par l’estomac et le
Résistance à l’acidité
duodénum
Survie pendant le passage par l’intestin
Résistance aux sels biliaires
grêle
Production d’acide (à partir du glucose et de Production « de barrière acide » efficace
lactose) dans l’intestin
Adhésion au mucus et/ou aux cellules épithéliales Colonisation efficace, réduction des sites
humaines d’adhésion des pathogènes à la surface
Inhibition du développement des germes
Production de substances antimicrobiennes
pathogènes
Résistance à la chaleur Survie pendant le processus de transformation
Stabilité, croissance sur une large échelle, survie
Bonnes propriétés technologiques
dans le produit, résistance aux bactériophages.
1.4.4.1. Résistance à l’acidité
Le comportement des bactéries dépend de la souche, par conséquent, il est nécessaire de

connaitre le genre et l’espèce des souches utilisées.
La survie des bactéries dans le suc gastrique dépend de leur capacité à tolérer les pH bas. Le
temps de passage peut-être d’une à trois heures selon l’individu et le régime. Par conséquent, des
auteurs proposent que les souches probiotiques doivent résister à un pH de 2,5 dans un milieu de
cultures pendant quatre heures (Ammor et Mayo. 2007)
1.4.4.2. Résistance aux sels biliaires
Dans l’intestin grêle, la tolérance aux sels biliaires est un facteur important qui contribue à la
survie des probiotiques. Les bactéries qui survivent aux conditions acides de l’estomac doivent alors
faire face à l’action détergente des sels biliaires libérés dans le duodénum après ingestion d’un repas
gras. Les bactéries peuvent réduire l’effet émulsifiant des sels biliaires en les hydrolysant avec des
hydrolases et de fait diminuent leur solubilité (Gu et al., 2008).
1.4.4.3. Adhésion aux cellules intestinales
La capacité d’adhésion à la couche est un critère incontournable de sélection recommandé

pour le choix des probiotiques. L’adhérence constitue le premier mécanisme de défense contre
l’invasion des bactéries pathogènes. Elle est basée sur la réalisation d’un ensemble de tests in vitro
41
puis in vivo en utilisant des cellules d’origine humaine et/ou animale (Palomares et al., 2007 ;
Reyes-Gavilan et al., 2011).
En plus du pouvoir d’adhésion aux cellules épithéliales de l’intestin, les probiotiques

peuvent se fixer au mucus qui recouvre les enthérocytes ou aux divers microorganismes que l’on
retrouve dans le tractus gastro-intestinal (Lamoureux, 2000).
1.4.4.4. Production de substances antimicrobiennes
Les bactéries lactiques synthétisent des molécules à action bactéricide/ bactériostatique

comme les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, le dioxyde de carbone, le diacétyle et les
bactériocines. Ces mécanismes antimicrobiens ont été exploités pour améliorer la préservation des
aliments (Titek et al., 1996 ; Labioui et al., 2005).
1.4.4.5. Résistance aux antibiotiques
Les bactéries lactiques sont naturellement résistantes à beaucoup d’antibiotiques grâce à leur
structure et physiologie. Les travaux de Temmerman et al. (2003) ont montré que 68.4% des
probiotiques isolés ont une résistance à un antibiotique ou plus. En effet, des souches de
Lactobacillus ont été trouvées résistantes à la kanamycine (81%), à la tétracycline (29.5%), à
l’érythromycine (12%) et au chloramphénicol (8.5%). 38% des isolats de Enterococcus faecium ont
été trouvés résistants à la vanomycine.
Dans la plupart des cas la résistance n’est pas transmissible, cependant, il est possible que le
plasmide codant pour la résistance aux antibiotiques soit transféré à d’autre espèces et genre. C'est
une raison significative pour choisir des souches manquantes du potentiel de transfert de résistance
(Denohue, 2004).
Les autorités européennes ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées pour la
production d’aliment pourraient poser un risque à la santé humaine et animale en raison d'héberger
des souches avec les gènes de résistance transmissibles. Par conséquent, avant de lancer une culture
probiotique, il est important de vérifier que les souches bactériennes impliquées ne comportent pas
de gènes transmissibles de résistance aux antibiotiques (Ammor et al., 2007.
1.4.5. Mécanisme d’action
Les probiotiques peuvent être considérés comme un moyen de véhiculer les principes actifs
qu'ils contiennent (enzymes, composants de paroi, substances antimicrobiennes) jusqu'à leurs cibles
d'actions dans le tractus digestif.
42
Les mécanismes d'action des probiotiques sur l'hôte sont complexes, souvent multiples et
dépendent de la souche bactérienne considérée ; ils agissent en particulier en inhibant les bactéries
indésirables, en neutralisant les produits toxiques, en améliorant la digestibilité alimentaire et en
stimulant l'immunité, ceci suggère qu'il faut un contact direct de ces probiotiques avec les différents
constituants de la barrière intestinale, tels que la microflore endogène, le mucus intestinal, les
cellules épithéliales. Ils sont également une source de vitamines (essentiellement du groupe B), et
de sels minéraux assimilables (Robin et Rouchy, 2001 ; Ait-Belgnaoui et al., 2005).
1.4.6. Critères technologiques
En plus de l’innocuité et des propriétés fonctionnelles, des critères technologiques sont

également pris en considération dans la sélection des souches probiotiques. Selon Saarela et al.
(2000), ces critères sont :
- Bonnes propriétés sensorielles
- Résistance aux phages
- Viabilité durant le traitement technologique
- Stabilité du produit durant le stockage
1.4.7. Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé
De nos jours, les probiotiques font l'objet de recherches intensives et on trouve de plus en
plus de preuves démontrant la variabilité des effets bénéfiques associés à la consommation de
probiotiques.
Ces effets peuvent être répartis en deux groupes : des effets bénéfiques sur l'équilibre de la
microflore intestinale et des effets thérapeutiques. La figure 15 illustre la diversité des effets
bénéfiques sur la santé.
43
Figure 15 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques ((Mercenier et al.,
2003).
1.4.8. Applications des probiotiques
Les différents produits commercialisés en tant que probiotiques humains ou animaux sont
constitués soit d’un seul microorganisme (produits dits monosouches) ou d’une association de
plusieurs espèces (produits dits pluri-souches). De nos jours, les produits probiotiques sont
commercialisés sous trois formes (Patterson, 2008) :
Un concentré de culture ajouté à des aliments et boissons à base de produits laitiers, de

fruits et de céréales ;
Un ingrédient ajouté à un aliment à base de lait ou de soja et auquel on permet d’atteindre
une concentration élevée par fermentation ;
Des cellules séchées, concentrées, en poudre, en capsule ou en comprimés.
Les probiotiques sont généralement associés aux produits laitiers de culture. La gamme de produits
probiotiques comprend maintenant des fromages, des crèmes glacées et des yogourts glacés de
même que des aliments et des boissons non laitiers (Patterson, 2008).
La survie des probiotiques dans les produits est affectée par plusieurs facteurs au cours des
processus de transformation et de stockage. Les nouvelles technologies, comme la micro-
44
encapsulation et la technologie des cellules immobilisées, offrent une protection additionnelle aux
organismes probiotiques et de nouvelles façons d’inclure des probiotiques dans les produits
alimentaires. Les fabricants commercialisent de nouveaux vecteurs d’administration de probiotiques
comme des pailles et des capsules de bouteille qui, lorsque percées ou brisées, délivrent des doses
thérapeutiques de probiotiques dans un produit alimentaire (Kailasapathy, 2002 ; Patterson, 2008).
45
1.5.Les interactions
1.5.1. Définition
L’évolution des conditions physico-chimiques et la disponibilité en nutriments sont des

éléments importants pour le développement des micro-organismes. Ils peuvent ainsi générer des
phénomènes d’interactions. Ces interactions sont classées selon une approche phénoménologiques
basées sur leurs effets positifs ou négatifs et ou une approche mécanistique c’est-à-dire directe
(contact physique entre les bactéries) ou indirecte (substance produite ou consommée par un des
microorganismes).
Ces interactions peuvent s’établir entre différentes populations (moisissures, bactéries), et au

sein même d’une population regroupant différentes espèces ainsi qu’entre différentes souches d’une
même espèce. Lorsqu’un phénomène d’interaction se déroule entre deux ou plusieurs
microorganismes, les cinétiques de croissance et de production, ainsi que les caractéristiques finales
des produits peuvent être modifiées. Ainsi, tout au long du processus de fabrication, on observe une
dynamique au sein des populations. Certains micro-organismes se multiplient activement, alors que
d’autres tendent à disparaître (Nissen et al, 2003).
Les bactéries lactiques sont très souvent associées, soit entre elles, soient avec d’autres
microorganismes (moisissures, levures, bactéries non lactiques) formant des cultures mixtes où
différents types d’interactions peuvent se produire. L’ensemble de ces interactions gouverne la
structure des communautés microbiennes et leurs activités (Nissen et al., 2003).
Ces interactions sont généralement classées en deux catégories : interactions directes et

indirectes. Les interactions directes impliquent un contact physique entre deux populations. Il s’agit
des interactions de prédation, parasitisme et inhibition par contact direct entre microorganismes
(cell-cell contact mechanism). Les interactions indirectes sont dues à des métabolites
extracellulaires et comprennent le mutualisme, le commensalisme, l’amensalisme et la compétition.
Ces interactions sont classées selon une approche phénoménologique basées sur leurs effets
positifs, se caractérisant par la stimulation d’un ou de plusieurs microorganismes ou négatifs
correspondant à l’inhibition de la croissance et de l’activité métabolique (Cholet, 2006 ; Monnet et
al., 2008) ; et une approche mécanistique c’est-à-dire directe (contact physique entre les bactéries)
ou indirecte (substance produite ou consommée par un des microorganismes).
46
1.5.2. Différents types d’interactions
1.5.2.1. Interactions positives : Synergie
Ces interactions sont aussi appelées interactions de coopération car elles surviennent
lorsqu’il y a stimulation d’une espèce bactérienne suite à la production ou à la libération de
métabolites particuliers dans le milieu (acide lactique, arômes, disponibilités de composés azotés,
etc.)(Bullard, 2011) .Ce type d’interaction peut être observé lorsque la croissance d’une première
espèce apporte des modifications au milieu (changement de pH, éliminations de facteurs inhibiteurs,
etc.), le rendant ainsi favorable à la croissance d’une deuxième espèce (Juillard et al., 1987). Un
bon exemple de ce type d’interaction est illustré chez les souches (S. thermophilus et Lb.
Bulgaricus) utilisées pour la production de yogourt.
Ces interactions de coopération regroupent les interactions de type commensalisme,

mutualisme et protocoopération.
 Commensalisme
Il s’agit d’interaction où l’un des microorganismes en jeu est stimulé par la production d’une
substance ou par la destruction d’un facteur inhibiteur.
 Mutualisme et protocoopération
Dans le mutualisme, la présence de chaque micro-organisme est indispensable pour la survie

de l’autre alors que dans la protocoopération l’interaction n’est pas nécessaire à la survie des
populations mais la présence des deux microorganismes ensemble entraîne une amélioration de leur
développement (Nehem, 2008).
1.5.2.2. Les interactions négatives : Inhibition
Les interactions négatives faisant intervenir la production de substances inhibitrices

notamment le cas des acides organiques issus des mécanismes homofermentaires et
hétérofermentaires des bactéries lactiques. L'inhibition peut aussi résulter de la production de
substance, de peroxyde d'hydrogène, les bactériocines produites par quelques souches de bactéries
lactiques sont également des agents inhibiteurs très puissants (Gilliland, 1985).Ce type
d’interactions inclue la compétition, l’amensalisme, la prédation et le parasitisme.
47
 La compétition
C’est une interaction inhérente à la conquête des niches écologiques. Il peut s’agir de
plusieurs espèces consommant le même substrat carbone, oxygène…) ou de la distribution spatiale
dans un écosystème (biofilm).Dans ce type d’interaction les mécanismes d’inhibition sont
réciproques. Cette compétition peut s’exercer vis-à-vis de l’espace disponible (inhibition de contact)
et /ou de la disponibilité en substrat (Cholet, 2006)
 L’amensalisme
L’amensalisme est une interaction inter-espèces où la présence d’un ou de plusieurs micro-

organismes a un effet inhibiteur sur le développement d’autres micro-organismes présents dans le
même environnement, sans que le micro-organisme inhibiteur en tire le moindre profit. Certains
métabolites tel que les acides carboxyliques, le lactate, le peroxyde d’hydrogène ou encore les
bactériocines participent à ce phénomène (Caplice et Fitzgerald, 1999 ; Van de Guchte et al, 2001 ;
Sieuwerts et al, 2008).Les effets inhibiteurs agissent sur la croissance des micro-organismes
pathogènes, indigènes ou inoculés (Sieuwerts et al, 2008).
 Prédation et parasitisme
Pour ces deux types d’interactions, une espèce vit au dépend d’une autre espèce pour son
propre bénéfice ou la détruit pour s’en nourrir.
48
1.6.Identification des bactéries par MALDI-TOF MS
L’identification des bactéries, isolées à partir de prélèvements biologiques, pendant des

années, a été basée uniquement sur des critères morphologiques et biochimiques. Le développement
des techniques de biologie moléculaire à partir des années 1990 a permis d’introduire ces approches
au sein des laboratoires d’analyse biologique. Leur intérêt dans l’identification des bactéries s’est
accru au fil des années. Elles permettent d’obtenir un résultat en quelques heures dans les situations
d’urgence (identification et typage du germe, et détection des résistances antibiotiques) ou
d’identifier un microorganisme si les systèmes utilisés en routine (approche biochimique) sont pris
en défaut. De plus, dans les prélèvements biologiques, elles rendent possible la caractérisation des
bactéries si la culture est restée négative, si les bactéries recherchées sont des bactéries
intercellulaires strictes (pour lesquelles la culture est réservée à des laboratoires spécialisés) ou des
bactéries encore incultivables à ce jour (Cariello, 2012).
1.6.1. Le spectromètre de masse MALDI-TOF MS
Les premières études de l’identification des microorganismes par la méthode d’analyse

MALDI-TOF (Matrix – Assisted Laser Desorption and Ionisation, Time- Of Flight Mass
Spectrometry) ont débuté dans les années 1990 (figure 16).
L’avènement de systèmes informatiques plus performants et la constitution de base de

données ont permis la commercialisation en 2008 des premiers systèmes d’identification de routine
aux laboratoires d’analyses médicales (Hemmersbach ,2008).
Si les techniques conventionnelles d’identification des différents germes se basent sur leurs
aspects phénotypiques, il est possible aujourd’hui d’identifier les microorganismes en analysant
directement leurs protéines par le MALDI-TOF MS (Cariello, 2012).
1.6.2. La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse consiste à séparer et identifier des molécules selon leur masse et
leur charge. Les applications de la spectrométrie de masse sont nombreuses et touchent divers
domaines : en biotechnologies pour l’analyse des peptides ou oligonucléotides, en pharmacologie
pour le dosage de médicaments, dans le domaine de l’environnement pour l’analyse de l’eau, en
clinique pour la recherche de drogues.
49
 MALDI-MS
L’analyte est d’abord co-crystallisé à des petits composés organiques (matrice) pour le
protéger d’un contact direct avec le faisceau ionisant et éviter sa dégradation. Ceux-ci vont absorber
la radiation du laser UV et transférer l’énergie aux protéines qui s’ionisent positivement. Les ions
générés vont se libérer des protéines. Les molécules chargées (+1) sont alors accélérées dans un
champ électrique.
 TOF
Après leur passage dans le champ électrique, les ions entrent dans un tube non soumis à un
champ électrique et sont séparés selon leur masse-charge. Les ions prennent des vitesses différentes
car les grosses molécules se déplacent plus lentement que les petites. Ensuite, un analyseur de
temps de vol va détecter le passage de chaque ion et créer les pics sur le spectre qui par après est
comparé à une base de données. Certains composants du spectre sont spécifiques à un genre,
d’autres à une espèce voire une sous-espèce. Selon la qualité et la pureté de l’échantillon et le
nombre de spectres de référence dans la base de données, l’identification de la bactérie se fait en
quelques secondes à quelques minutes.
 La matrice
La matrice est constituée de molécules cristallisées dont les plus utilisées sont l’acide 2,5
dihydroxybenzoïque (DHB), l’acide sinapinique et l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)
(Cariello, 2012). Ces molécules sont ajoutées à un solvant (acétonitrile, éthanol ou acide
trifluoroacétique). Le DHB convient pour l’analyse des échantillons organiques hydrophobes ou des
polymères aromatiques, tandis que l’acide sinapinique et l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique
sont destinés pour l’analyse des protéines.
Figure 16 : Spectromètre de masse BruckerDaltonics Germany et son unité informatique

(BruckerDaltonics, Germany).
50
II- MATERIEL & METHODES
MATERIEL & METHODES
2. MATERIEL ET METHODES
L’intégralité du travail a été réalisée au Laboratoire des Sciences et Technique de Production

Animale(LSTPA) de l’université Abdelhamid Ben Badis de Mostaganem. Les analyses des isolats
par MALDI-TOF MS ont été effectuées au Centre de Recherche scientifique et technique en
Analyse Physico-Chimiques (CRAPC).
2.1. Origine et échantillonnage du blé fermenté :
Les prélèvements, du blé fermenté nommé en Algérie «

hamoum », proviennent d’un silo
souterrain traditionnel de la localité de Mazouna wilaya de Relizane.
Les grains de blé prélevé pèsent chacun environ 35 à 45mg et datent d’une année. Ils sont
récupérés dans un bocal stérile et mit à 4°C jusqu’à utilisation. Ces grains sont de couleur gris-
jaunâtre ayant une forte odeur de fermentation à cause de leur long séjour dans le silo.
2.2 .Milieux de culture et conditions de croissance
Les milieux de cultures utilisés sont sous forme liquide ou solide après l’ajout de 15g/l
d’agar agar. Les milieux sont les suivants :
Le milieu MRS (De Man et al., 1960)

Le milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975)
Le milieu MSE (Mayeux et al., 1962)
Des milieux ont été utilisés pour l’identification phénotypique des isolats lactiques comme
le bouillon de Möeller à arginine, le bouillon hypersalé, lait de Sherman à 0.1% et 0.3% de
bleu de méthylène.
Tous les milieux de culture utilisés dans cette étude sont stérilisés à 120°C pendant 20mn.La
composition des différents milieux de cultures est présentée en annexe I.
2.3. Isolement des bactéries lactiques
Trois grains de blé fermenté « Hamoum » sont mis dans 9ml d’eau physiologique stérile et
incubés à 30°C pendant 24h.A partir de cette culture mère, une série de dilution décimale (jusqu’à
10-6) est réalisée, où 1ml de chaque culture mère est ajouté à 9ml de MRS ou M17. Chacun des 2
milieux est additionné de cyclohéximide à une concentration de 200mg/l de milieu pour éliminer la
flore fongique et les levures. Après homogénéisation, un volume de 0.1ml de chaque dilution est
étalé en surface dans des boîtes de Pétri contenant les milieux MRS ou M17solides.
52
MATERIEL & METHODES
Trois boîtes de Pétri par dilutions et par milieu de culture sont ensemencées et incubées à 30°C et
37°C durant 24 à 48h. Après croissance sur ces milieux, les boîtes dont les colonies sont bien
distinctes et dont les caractères culturaux comme l’aspect, la taille et la couleur, correspondent aux
caractéristiques des bactéries lactiques sont isolées en vue d’une purification.
2.4. Purification et pré-identification des isolats et leur appartenance au groupe lactique
La réalisation de la purification sur les bactéries sélectionnées est réalisée par un repiquage
(trois fois) successivement sur les milieux MRS et M17 selon la méthode d’épuisement de charge
(méthode de quadrants). Après 24 à 72h d’incubation à 30°C, les colonies, bien distinctes et bien
développées, sont retenues pour des examens macroscopiques, microscopiques et une recherche de
la catalase afin de confirmer leur appartenance au groupe lactique.
 Examen macroscopique et microscopique :
Sur boîtes de Pétri et à l’aide d’une loupe binoculaire, les colonies isolées sont soumises à
une observation macroscopique afin de déterminer les caractères culturaux (forme, aspect, taille,
couleur, opacité et contour).Ensuite, l’observation microscopique par coloration différentielle nous
permet de distinguer les isolats selon le type de Gram (positif ou négatif), leur morphologie (bacille
ou coque) et leurs modes d’associations (isolés, en chaînettes ou en tétrades).Les bactéries lactiques
sont à Gram+.
 Recherche de la catalase :
La catalase est une enzyme qui a la propriété de décomposer l’eau oxygénée(H2O2) avec
dégagement d’oxygène selon la réaction suivante :
2 H2O2 2H2O + O2
La mise en évidence de cette enzyme est réalisée sur une colonie bactérienne mise en
présence d’eau oxygénée à 10 V. L’apparition de l’effervescence traduit la présence d’une activité
catalasique. Les bactéries lactiques sont catalase négatives (Larpent, 1997).
Seules les bactéries Gram positives et catalase négatives sont retenues et conservées pour
une caractérisation phénotypique.
2.5. Conservations des bactéries lactiques
Après purification, les isolats sont conservés selon deux méthodes :
 Conservation de courte durée : les isolats purs sont ensemencés dans des tubes de MRS
incliné. Après incubation à 37°C, les tubes sont placés à +4°C durant plusieurs semaines.
53
MATERIEL & METHODES
 Conservation de longue durée : les isolats bactériens purs sont cultivés dans du lait
écrémé stérile à 70% (enrichi par 0.05% d’extrait de levure) supplémenté de 30% à 40% de glycérol
(Samelis et al., 1994).Les cultures sont incubées à 30°C et dès la coagulation du lait, elles sont
conservées à -20°C.
2.6. Souches pathogènes utilisées
Nous avons utilisé des souches pathogènes à Gram positif et négatif comme bactéries
indicatrices pour l’étude de l’activité inhibitrice des bactéries lactiques. Trois souches bactériennes
sont des souches de références ATCC provenant de l’institut Pasteur. Le tableau 6 indique le genre,
l’espèce et le code de ces bactéries.
2 .6.1. Vérification de la pureté et de l’identité des souches pathogènes
La purification des bactéries pathogènes a été effectuée par ensemencement en stries sur les
milieux sélectifs pour chacune des bactéries pathogènes. Les boîtes ont été incubées à 37°C pendant
24h.
Les milieux de culture sélectifs utilisés pour la purification des bactéries pathogènes sont
indiqués dans le tableau 5.
Tableau 4: Milieux sélectifs des souches pathogènes
Souches Milieux sélectifs
Staphylococcus aureus Chapman
Pseudomonas aeruginosa King B
Escherichia coli VRBL - Mac Conkey
Tableau 5: Souches pathogènes
Genre et espèces Code Origine
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Institut Pasteur

Pseudomonas
ATCC 27853 Institut Pasteur
1aeruginosa
Escherichia coli ATCC 25921 Institut Pasteur
54
MATERIEL & METHODES
2.7. Dénombrement des bactéries lactiques
Pour dénombrer la flore lactique présente dans notre échantillon, on utilise les milieux MRS
et M17 où 0.5ml de chaque dilution de la solution mère sont ensemencés en masse. Ensuite les
boîtes sont incubées à 30°C pendant 72h. Deux dilutions (10-5 et 10-6) ont été retenues pour le
comptage des colonies qui est exprimé en UFC (unités formant colonies) par gramme d’échantillons
selon la formule suivante Guiraud(1998).
∑c
𝑁=
VmL (n1 + 0,1n2)xd1
N : nombre de microorganismes présents dans l’unité de mesure de l’échantillon

c : nombre total de colonies comptées sur une boîte retenue des dilutions effectuées ;
Vml : volume de l’inoculum appliquée à chaque boîte en ml ;
n1 : nombre de boîtes comptées à la dilution retenue la plus faible ;
n2 : nombre de boîtes comptées à la seconde dilution retenue ;
d1 : facteur de la première dilution retenue.
2.8. Pré-indentification phénotypique des bactéries lactiques
L’identification des isolats lactiques a été établie par l’étude de différents tests clés
préconisés par les auteurs cités ci-dessus. Cette caractérisation a été réalisée sur des colonies jeunes
de (18-24h) et s’est effectuée en deux étapes. Tout d’abord, des tests physiologiques comme la
croissance à différentes températures, à différentes concentrations de NaCl, à un pH alcalin et la
thermorésistance et des tests biochimiques comme la croissance sur lait de Sherman, l’hydrolyse de
l’arginine, de l’esculine, la production de l’acétoïne, d’EPS, le test de l’oxydase, la recherche du
type fermentaire et la fermentation des carbohydrates. Ces tests ont nécessité l’utilisation de milieux
spécifiques.La lecture est appréciée par la présence d’un trouble, dû à la croissance, dans le milieu
liquide.
2.8.1. Caractérisation biochimique des isolats lactiques

2.8.1.1. Recherche de l’oxydase
Ce test est un critère d’identification des bactéries lactiques. A l’aide d’une pipette Pasteur,
une colonie bactérienne est déposée sur un disque pré-imprégné du réactif N-
diméthylparaphényléne diamine. Après une minute, les bactéries produisant l’oxydase deviennent
violettes (Guiraud, 1998). Les bactéries oxydases négatives sont retenues.
55
MATERIEL & METHODES
2.8.1.2. Hydrolyse de l’esculine
Ce test permet de caractériser les bactéries capables d’hydrolyser l’esculine. L’esculine est
un hétéroside qui peut-être dégradé par l’esculinase libérant ainsi du glucose et de l’esculétine.
L’activité enzymatique est recherchée sur milieu gélosé à la bile esculine fourni par l’institut
Pasteur (Algérie) (Devoyod et Poullain, 1988 ; Larpent-Gourgaud et al., 1997). Après incubation à
30°C pendant 2 à 4jours, l’hydrolyse de l’esculine se traduit par un noircissement du milieu dû à la
liaison des sels ferriques solubles à l’esculétine.
2.8.1.3. Production des exopolysaccharides
La production de dextrane à partir du saccharose est mise en évidence sur milieu MSE
(Mayeux, Sandine et Elliker, 1962). Les isolats ensemencés par stries et incubés à 30°C pendant
24h. Après incubation, les isolats producteurs de dextrane sont visualisés par la formation de
colonies larges, visqueuses et gluantes. Ce test permet de différencier les bactéries productrices de
dextrane et non productrices.
2.8.1.4. Production d’acétoïne
Elle est détectée par la réaction de VogesProskauer (VP) dont le principe est que l’acétoïne
se transforme en diacétyle sous l’action de la soude en présence d’oxygène (Harrigan et Mc Cane,
1976). Celui-ci s’associe avec l’α-naphtol en formant un complexe rose détectable. Pour réaliser ce
test, On ensemence 1% d’une culture overnight dans 10ml de lait à 0% de matière grasse stérile
reconstitué à 11% de matière sèche. On incube 24 à 48h à 30°C. Après coagulation et ajout de 3 à 4
gouttes de VPI-II, les tubes sont agités à la température ambiante pendant 15mn. La réaction
positive se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu.
2.8.1.5. Croissance sur lait bleu de Sherman
Ce test permet de mettre en évidence le développement des bactéries lactiques en présence

du bleu de méthylène et de différencier entre les genres Streptococcus et Lactococcus. Les espèces
de lactocoques utilisent l’oxygène présent dans le bleu de méthylène donnant ainsi une couleur
blanche au milieu (Devriese et Pot, 1995).
Ce test concerne les isolats de forme cocci et indique leur capacité à pousser en présence de
bleu de méthylène (BM) dont la coloration est bleue en conditions oxydantes et incolore en milieu
réduit. La décoloration du BM est d’autant plus rapide que le nombre de bactéries est élevé
(Delarras, 2007). Les isolats purifiés sont ensemencés dans 2 séries de tubes contenant chacun 9ml
de lait écrémé stérilisé et additionné d’1ml de BM à 0.1% et 0.3% (Guiraud, 1998).Après
56
MATERIEL & METHODES
incubation à 30°C pendant 48h, on note les observations relatives à la réduction du BM et à la

coagulation du lait.
2.8.1.6. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH).
Cette propriété est détectée en utilisant le bouillon de Möeller (Möeller, 1955), de bases
exemptes d’arginine et un autre additionné d’arginine à 1%.Une colonie fraîche est ensemencée
dans chacun des tubes. Les tubes sont recouverts d’huile de paraffine stérile. Après 24 à 48h
d’incubation à 30°C, les bactéries qui utilisent le lactose acidifient le milieu qui prend une
coloration jaunâtre alors que celles qui utilisent l’arginine ré-alcalinisent le milieu en libérant
l’ammoniaque ce qui va permettre un retour à la coloration violette initiale. (Larpent, 1997).
2.8.1.7. Type fermentaire
Les bactéries lactiques pendant leur croissance dégradent les sucres contenus dans le milieu
de culture en empruntant soit la voie homofermentaire dont le produit final est essentiellement
l’acide lactique ou hétérofermentaires qui produit en plus de l’acide lactique, de l’éthanol, de
l’acétate et du CO2 (De Roissart et Luquet, 1994).Les bactéries homofermentaires (Streptococcus,
Enterococcus et Lactococcus) ne produisent pas de gaz contrairement aux bactéries
hétérofermentaires (Leuconostoc et le groupe Betabacterium du genre Lactobacillus) qui produisent
du CO2 dans le milieu.
Des cultures jeunes sont cultivées dans des tubes contenant du MRS contenant des cloches
de Durham et incubées à 30°C pendant 24h à 48h. La production de gaz (CO2) se traduit par
l’apparition de bulles dans la cloche.
2.8.1.8. Profil fermentaire des sucres.
Les bactéries lactiques possèdent la capacité de dégrader différentes sources de carbone

constituant ainsi un critère indispensable pour leurs identifications.
L’étude de la fermentation des sucres est réalisée en bouillon MRS liquide préparé sans
glucose, contenant du pourpre de bromocrésol (BCP) (0.04g/l) comme indicateur de pH et
additionné de chaque sucre à tester. Après ensemencement des tubes, une fine couche de paraffine
stérile est ajoutée pour assurer les conditions d’anaérobiose (Samelis et al., 1994). L’utilisation du
sucre et la production d’acide se traduisent par le virage au jaune de l’indicateur de pH. Pour
l’identification des isolats, les sucres utilisés à une concentration de 1% sont les suivants : maltose,
glucose, raffinose, mannose, xylose, arabinose, fructose, galactose, lactose, glycérol, saccharose,
rhamnose, tréhalose, cellobiose.
57
MATERIEL & METHODES
Un tube sans ajout de sucre ensemencé par l’isolat à tester a été utilisé comme témoin.
2.8.2. Caractérisation physiologique des isolats lactiques

2.8.2.1. Croissance à pH 9.6
Ce test permet de différencier entre les genres Lactococcus et Enterococcus. En effet, les
espèces de lactocoques ne poussent pas à ce pH. Il est réalisé sur les cultures bactériennes dans du
bouillon MRS ajusté à pH 9.6 à l’aide d’une solution de NaOH (N/9) et incubé à 30°C pendant 24h
à 48h. La croissance bactérienne est appréciée par un trouble dans les tubes et par comparaison avec
une culture réalisée dans du MRS à pH6, 5. (Carr et al, 2002).
2.8.2.2. Croissance à différentes concentrations de NaCl
Ce test permet de savoir si les bactéries sont capables de croître dans un milieu hypersalé, ce
qui permet de distinguer les entérocoques des lactocoques. En effet, les espèces d’entérocoques
poussent dans ce milieu. Les cultures sont ensemencées dans un bouillon MRS à 2%, 4%,5%, 6,5%
et 7% de NaCl. Les tubes sont incubés à 30°C pendant 24 à 72 h. La capacité à croître dans ces
milieux hostiles est appréciée par une croissance dans les milieux de culture et par comparaison
avec un tube témoin réalisé avec une culture dans du MRS sans NaCl.
2.8.2.3. Croissance à différentes températures
Ce test permet de différencier les bactéries mésophiles des thermophiles (Leveau et al,
1991). Après inoculation des cultures isolées et purifiées dans du bouillon MRS, les tubes sont
incubés aux températures de 10°C ,15°C, 30°C, 37°C et 45°C pendant 24h à 72h. La croissance est
appréciée par l’apparition d’un trouble. Un tube témoin non ensemencé est incubé pour chacune des
températures (Guiraud, 1998).
2.8.2.4. Test de la thermorésistance
Ce test permet de connaître si les bactéries lactiques isolées ont la capacité de résister à un
traitement thermique (Teuber, 1994). Des cultures pures sont inoculées dans du bouillon MRS et
exposées à une température de 60°C pendant 30min puis incubées à 30°C pendant 24 à 48h. Les
bactéries présentant une croissance sont considérées comme thermorésistantes (Stiles et Holzapfel,
1997).
2.9. Eude du pouvoir acidifiant
La mesure de l’activité acidifiante consiste à suivre d’une part l’évolution du pH de

différentes cultures en fonction du temps et d’autre part à doser l’acidité titrable par la soude
58
MATERIEL & METHODES
(NaOH, N/9) en présence d’un indicateur coloré de pH la phénolphtaléine (Larpent, 1997).L’acidité

titrable mesurée est assimilée à des degrés Dornic (°Dornic) où 1°Dornic équivaut à 0.1g d’acide
lactique/l de lait.
Pour réaliser ce test, les souches ont été ensemencées à raison de 1% dans des tubes
contenant 10ml de lait écrémé stérile reconstitué à 12%. Après agitation, les mesures sont prises à
intervalles de temps 0h, 2h, 4h, 6h et 24h d’incubation à 30°C.L’acidité est déterminée par la
formule : Acidité (°D) = VNaOH x10
VNaOH : Volume de NaOH utilisé pour titrer l’acide lactique contenu dans 10ml de lait.
2.10. Identification protéomique des isolats par MALDI-TOF SM
L’identification des isolats lactiques a été réalisée par la spectrométrie de masse de type
Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation- Time- Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-
TOF/MS).
Le principe général est basé sur l’étude du déplacement d’entités ioniques dans des champs
électromagnétiques, ce qui permet l’identification des bactéries grâce à l’analyse de leur contenu
protéique (Claydon et al., 1996).L’ionisation est essentielle et est réalisée grâce à une matrice.
2.10.1. Préparation des isolats pour l’analyse protéomique
Les isolats sont soumis à une série de purification sur milieu PCA gélosé. A l’aide d’un
cure-dent stérile, on récupère 3 à 4 colonies à identifier que l’on dépose sur la plaque cible du
MALDI-TOF. Elles sont recouvertes de 10µl d’une solution saturée d’acide α-cyano-4-
hydroxyciannique (HCCA, Matrix, BrukerDaltonics) à laquelle on ajoute 1µl d’acide formique. La
plaque est mise à sécher à la température ambiante ensuite elle est introduite dans le
spectrophotomètre de masse et les spectres sont obtenus (Nacef et al., 2016).
2.10.2. Analyse des spectres obtenus
L’analyse protéomique est réalisée en utilisant une masse Microflex L20 spectromètre
(Brucker Daltonics, Germany) équipée d’un laser N2 et d’un intervalle de masse entre 2.000-
20.000Da. Sous l’effet de la pulvérisation du laser, les protéines de la cellule bactérienne vont se
disperser et vont être piégées par la matrice, cela va donner une empreinte protéomique. Les
spectres de masse MALDI-TOF enregistrés, sont analysés avec le logiciel MALDI-Bio Typer 4.0
(MALDI Biotyper4.0 Data base Brucker Daltonics, Germany). L’appareil est calibré avec la souche
d’E. coli DH5 alpha, utilisée comme souche standard. Les résultats s’affichent avec un code couleur
59
MATERIEL & METHODES
et sont exprimés par score de correspondance MALDI-Biotyper allant de 0.000 à 3.000 qui
indiquent le degré de confiance à accorder à l’identification (Lartigue et al., 2009 ; Cherkaoui et
al.,2010) tableau 14 . Enfin les spectres obtenus à partir de nos isolats bactériens sont comparés aux
spectres de référence présents dans la banque de données Biotyper).
Tableau 6: Score de concordance des spectres obtenus à partir d’une bactérie d’intérêt avec
ceux de la base de données Biotyper, reflétant le degré de confiance à accorder à
l’identification
Score Description Symbole Couleur
Forte probabilité
2,300 - 3,000 +++ Verte
d’identification à l’espèce
Identification du genre
2,000 –
sécurisée, identification à ++ Verte
2,299
l’espèce probable
1,700 – Identification au genre

1,999 + Jaune
probable
0,000 – Degrédeconfianceinsuffisan
- Rouge
1,699 antpour l’identification
2.11. Mise en évidence des interactions négatives
L’un des critères de sélection des probiotiques destinés à l’homme (FAO/OMS, 2002) est
leur capacité à produire des substances antimicrobiennes et d’inactiver les bactéries pathogènes
et/ou d’altération. Dans ce contexte, les interactions négatives qui correspondent à une inhibition de
la croissance bactérienne et de l’activité métabolique ont été étudiées en utilisant deux méthodes.
 La méthode de Fleming et al., 1975

 La méthode de Barefoot et Klaenhammer 1983
2.1.1. Inhibitions en milieu solide
La réalisation de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide a été effectuée en

testant dans un premier temps, l’effet des bactéries lactiques sur d’autres bactéries lactiques et sur
des bactéries pathogènes dans un second temps.
60
MATERIEL & METHODES
2.1.2. Inhibitions entre bactéries lactiques
Pour déterminer les souches inhibitrices (productrices de substances inhibitrices) et les

souches indicatrices (sensibles aux substances inhibitrices), nous avons testé les deux méthodes
précitées pour l’ensemble de nos isolats.
2.11.2.1. Méthode de Fleming et al.(1975)
Cette méthode permet de mettre en évidence les inhibitions par contact cellulaire, on
procède comme suit :
 Des cultures jeunes de 18h d’isolats lactiques à tester (supposés être inhibitrices) sont
ensemencées en touches sur milieu MRS solide puis incubés à 30°C pendant 24 h.
 Ensuite, les isolats indicateurs (supposés être sensibles) sont ensemencés en masse. Un
volume de 0.7ml de la culture indicatrice est rajouté à 8ml de gélose molle en surfusion
(45°C). Le mélange est ensuite versé à la surface des boîtes pré-incubées conformément à
la méthode de la double couche.
 Après solidification du milieu, les boîtes de Pétri sont mises à 30°C pendant 24h.
 L’inhibition se manifeste par l’apparition d’une zone transparente autour des isolats
ensemencés en touches.
 Après incubation, la lecture des résultats consiste à mesurer le diamètre des halos
d’inhibitions apparus autour des isolats ensemencés en touche.
2.11.2.2. Méthode de Barefoot et Klaenhammer(1983) ou méthode des puits
Cette méthode permet de mettre en contact le surnageant de la souche lactique productrice

de la substance antimicrobienne avec la souche indicatrice dans un milieu solide. On procède de la
manière suivante
 Des cultures lactiques sont incubées sur milieu liquide MRS à 30°C pendant18h.
 Après incubation, elles sont centrifugées à 4000rpm/10min.
 Des boîtes de Pétri sont ensemencées en masse par une culture sensible (supposée
être indicatrice) dans du milieu MRS solide.
 Après solidification, des puits de 5mm de diamètre sont creusés à l’aide d’une
cloche de Durham stérile.
 Les puits sont ensuite remplis par des surnageants de culture à tester, puis les boîtes
sont mises à incuber à 30°C pendant 24h.
 L’effet des surnageants se traduit par la formation des halos clairs autour des puits.
61
MATERIEL & METHODES
 La lecture des résultats est effectuée par la mesure des diamètres des halos
d’inhibitions.
2.1.3. Activité antimicrobienne des isolats lactiques contre des souches pathogènes
Cette partie de notre étude est consacrée à tester l’activité inhibitrice de tous nos isolats
lactiques isolés contre des bactéries pathogènes à Gram positif et à Gram négatif (Tableau6).
Les méthodes utilises ont été détaillées précédemment (méthode de Fleming et al., 1975 ;
méthode de Barefoot et Klaenhammer, 1983).
2.11.3.1. Méthode de Fleming et al.1975
Nous avons procédé de la même façon que dans le paragraphe (2.11.2.1.) excepté que nous
avons rajouté les bactéries pathogènes que nous avons ensemencées en masse dans la gélose molle à
la place des bactéries lactiques et incubées à 37°C pendant 24h.
La lecture des résultats est réalisée par la mesure du diamètre des halos d’inhibitions.
2.11.3.2. Méthode de Barefoot et Klaenhammer, 1983
Pour cette étude, les souches pathogènes sont ensemencées également en masse et des puits
sont remplis par les surnageants de culture des isolats lactiques. Après incubation à 37°C pendant
24h, les diamètres des halos d’inhibitions sont mesurés.
Ces séries de tests ont été tous répétées trois fois.
2.1.4. Caractérisation de la nature des agents inhibiteurs
Les bactéries lactiques ont la capacité d’inhiber d’autres bactéries lactiques appartenant au
même groupe ou à un groupe différent par la production d’agents inhibiteurs parmi lesquels on peut
citer : l’acide lactique, le peroxyde d’oxygène, la présence de phage ou les bactériocines. Cette
caractérisation est réalisée en premier lieu entre les bactéries lactiques et en second lieu contre les
bactéries pathogènes et/ou d’altération. Tous les tests ont été réalisés selon la méthode de Fleming
et al. 1975
 Entre bactéries lactiques
La production des acides organiques par les souches lactique est une cause majeure de
l’inhibition des bactéries lactiques. Pour mettre en évidence l’effet de l’abaissement du pH sur le
développement des souches indicatrices, l’emploi d’un milieu de culture MRS tamponné (tampon
62
MATERIEL & METHODES
phosphate 0.2M à pH 7 (annexe2) est utilisé. Nous avons procédé selon la méthode de Fleming et
al.,(1975).
L’utilisation du milieu tamponné a pour but de lever toutes les inhibitions dues à l’acide
lactique produites par les souches inhibitrices en comparaison avec celles obtenues avec le milieu
non tamponné (milieu témoin).La lecture des résultats est réalisée en mesurant les diamètres des
halos d’inhibitions.
 Avec les bactéries pathogènes
Selon la méthode de Fleming et al.,(1975), les bactéries lactiques ont été ensemencées en
touches sur milieu MRS solide tamponné à pH 7 et non tamponné utilisé comme témoin. Après
incubation à 30°C pendant 24h, nous avons coulé la gélose molle pré-ensemencée par les bactéries
pathogènes dans les boîtes pré-incubées. Après une deuxième incubation à 37°C pendant 24h, la
lecture des résultats est effectuée par la mesure du diamètre des halos d’inhibitions.
2.1.4.1. Recherche des inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène
Les bactéries lactiques sécrètent du peroxyde d’hydrogène qui est un agent inhibiteur dont
l’effet peut être levé par l’enzyme catalase (Julliard et al., 1987).
Les cultures bactériennes sont ensemencées en touches à la surface de deux milieux de

cultures. Le premier milieu MRS tamponné à pH 7 et considéré comme témoin et sur lequel on
coule 8ml de gélose molle en surfusion contenant 400µl de la souche pathogène (indicatrice). Le
second milieu MRS tamponné, sur lequel on coule 8ml de gélose molle en surfusion contenant
400µl de la souche pathogène additionné de 50µl de l’enzyme catalase (1mg/ml).
Après incubation à 37°C pendant 24h, la lecture des résultats est réalisée par la comparaison
de l’effet inhibiteur par la mesure du diamètre de la zone d’inhibition dans les milieux en présence
et en absence de catalase.
2.11.4.2. Recherche des inhibitions dues aux phages lysogènes
L’une des caractéristiques de l’effet antibactérien des phages est que chaque cellule
bactérienne infectée est lysée.
Dans le but de mettre en évidence les inhibitions dues à la production des phages, nous
avons procédé de la manière suivante :
63
MATERIEL & METHODES
On prélève des fragments de gélose dans la zone d’inhibition. Ces derniers sont suspendus
dans 1ml de milieu MRS liquide stérile contenant 50µl de chloroforme (afin d’éliminer
d’éventuelles bactéries vivantes).Après agitation, on laisse décanter 5mnpuis on prélève 300µl du
mélange que l’on ajoute à 7ml de gélose molle contenant 100µl de la souche indicatrice. La
préparation est coulée stérilement dans une boîte de Pétri et incubé à 30°C pendant 48h.
La lecture des résultats consiste à observer s’il y a présence ou pas de plages de lyse.
Les plages de lyse traduisent la présence de phages.
2.1.4.2. Recherche des inhibitions dues aux bactériocines
Les bactéries lactiques sécrètent des bactériocines qui sont des substances protéiques et qui
peuvent être dégradées par des enzymes protéolytiques. Afin de déterminer la nature de ces
substances responsables de l’activité antibactérienne, les cultures lactiques sont traitées par deux
enzymes protéolytiques, la trypsine (Sigma, T8803) et l’alpha-chymotrypsine (Sigma, C4129). Les
enzymes sont dissoutes dans du tampon phosphate de sodium (0.01M, pH7) à une concentration
finale de 1mg/ml.
 Effet de la trypsine
Les cultures bactériennes sont ensemencées en touches sur le milieu solide MRS tamponné,
considéré comme témoin. Après incubation à 30°C pendant 24h, on coule 8ml de gélose molle
contenant 400µl de la souche pathogène. Le second milieu MRS tamponné à pH 7 auquel on ajoute
8ml de gélose molle contenant 400µl de la souche pathogène additionné de 50µl de trypsine.
Après incubation à 37°C pendant 24h, l’activité de l’enzyme est évaluée en comparant
l’effet inhibiteur par la mesure du diamètre des halos d’inhibitions en présence et en absence de
l’enzyme protéolytique.
 Alpha-chymotrypsine
Pour cette étude, nous avons procédé de la même manière que précédemment sauf que l’on a ajouté
comme enzyme l’α-chymotrypsine. Après incubation à 37°C pendant 24h, la sensibilité de
l’enzyme est évaluée en comparant l’effet inhibiteur par la mesure du diamètre des halos
d’inhibitions dans les deux milieux.
64
MATERIEL & METHODES
2.1.5. Caractérisation des bactériocines
L’une des caractéristiques des bactériocines est la thermostabilité cependant elles peuvent
appartenir à la classe III si elles sont thermosensibles ou à la classe I ou II si elles sont
thermorésistantes (Dortu et Thonart, 2008).
Dans le but de tester cette propriété, nous avons choisi deux températures :
 Un chauffage à 80°C pendant 15 et 30mn

 Un chauffage à 100°C pendant 15 et 30mn
Nous avons procédés selon la méthode des puits (méthode de Barefoot et Klaenhammer, 1983).
 Des cultures lactiques de 18h sur MRS liquide sont centrifugées à 5000trs/min pendant 15mn.
 Les surnageants de ces cultures productrices de substances inhibitrices sont ensuite exposées
aux différentes températures.
 Les puits creusés dans la gélose solide ensemencés par les souches indicatrices sont remplis par
les surnageants traités.
 Après incubation à 37°C pendant 24h, la lecture des résultats est effectuée par la mesure des
diamètres des zones d’inhibitions.
2.2. Mise en évidence in vitro de quelques propriétés probiotiques

2.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales
Pour pouvoir exercer un rôle bénéfique sur la santé humaine, les bactéries probiotiques
doivent conserver une viabilité lors du passage dans le tractus gastro-intestinal (Senocket al., 2005).
Elles devraient en effet, survivre à l’acidité et au stress biliaire. L’évaluation de ces potentialités
probiotiques a été testée par l’exposition de nos 4 souches à ces stress selon la méthode
d’Hydrominus (Hydrominus et al., 2000).
2.2.1.1. Test de survie au stress acide
La capacité des bactéries lactiques à survivre dans les conditions mimant celles de l’estomac
de l’homme est réalisée de la manière suivante :
Des cultures overnight (18h) sont centrifugées à 13.000rpm/4min à 4°C. Les culots
bactériens sont suspendus dans 10ml de bouillon MRS ajustés à différentes valeurs de pH (2.5 ;
4.5 et 6.5). La première valeur correspond à la valeur moyenne quotidienne du pH gastrique, tandis
que le pH 4.5 correspond à la valeur moyenne du pH gastrique juste après le repas. Le pH 6.5 est
utilisé comme témoin. Une aliquote de chaque solution est prélevée immédiatement, au temps (t : 0
65
MATERIEL & METHODES
min) et après 3heures d’incubation à37°C. Après exposition à différents pH acide et à t=0 et t=3h,
des dilutions en cascades jusqu'à 10-7ont été réalisées. Ces dilutions sont ensuite ensemencées en
masse sur la gélose MRS et incubées à 37°C pendant 24 à 48h. La croissance a été déterminée par
le dénombrement des cellules bactériennes à T0H et T3h. Le taux de survie est calculé par l’équation
suivante :
Taux de survie (%)= log UFC àT3h /log UFC à T0h
Les tests ont été effectués en trois exemplaires.
2.2.1.2. Test de survie au stress biliaire :
La bile intestinale a une concentration moyenne de 0.3% (p/v) et le temps de séjour des
aliments dans l’intestin grêle est approximativement de 4h ((Prasad et al., 1998).
Les cultures de 18h ont été centrifugées à 13000rpm/10min à 4°C.Les culots sont transférés
dans du bouillon MRS à 0.3%,0.5% et1% de sels biliaires et ajustées à différents pH2.5 et 6.5. La
croissance des cellules bactériennes a été réalisée dans les mêmes conditions que pour le stress
acide à T0H et T3H. Le taux de survie est calculé par l’équation suivante :
Taux de survie (%)= log UFC àT3h /log UFC à T0h
Les tests ont été réalisés en trois exemplaires.
2.2.2. Test de sensibilité aux antibiotiques
Pour déterminer le comportement de nos souches vis-à-vis de certains antibiotiques, nous

avons testés les résistances de ces dernières par diffusion sur milieu solide Hinton-Mueller(MH) par
utilisation les disques d’antibiotiques commercialisés par l’institut Pasteur d’Alger (Tableau 8). A
partir de cultures overnight sur MRS liquide, on a effectué un ensemencement en stries, sur milieu
MRS solide. Après une incubation de 18h à 30°C, on a raclé quelques colonies (5 à 7) que l’on a
ajoutées à 10ml d’eau physiologique. Après homogénéisation, les préparations ainsi préparées sont
ensemencées par étalement à l’aide d’écouvillon imbibé de la culture bactérienne. Après séchage
des boîtes, on dépose stérilement les disques d’antibiotiques à la surface du milieu (5 à 7 par
boîtes). Les boîtes sont incubées à 30°C pendant 24h. La lecture des résultats consiste à mesurer les
diamètres des zones claires d’inhibitions. Nous considérons que pour un diamètre inférieur à 15mm,
la souche est résistante (R) à l’antibiotique considéré tandis que pour un diamètre supérieur ou égal
à 15mm elle est sensible (S) à l’antibiotique (Karam et Karam, 1994).
66
MATERIEL & METHODES
Tableau 8 : Les différents antibiotiques utilisés .
67
III-RESULTATS & DISCUSSION
RESULTATS & DISCUSSION
3. RESULTATS ET DISCUSSION
3.1. Dénombrement des bactéries
Après dilutions, étalement sur MRS additionné de cyclohéximide pour éliminer la flore
fongique et levure, l’incubation est réalisée à 30°C pendant 24h. Les colonies correspondant aux
caractéristiques des bactéries lactiques ont été isolées.
Cette étape nous a permis de mettre en évidence l’existence d’une flore lactique dans le blé
traditionnellement fermenté. Le comptage des colonies a montré que le nombre de bactéries
lactiques varie entre 1,6 et 5,2 x1010ufc/g. Sur ce point, certains travaux comme ceux de Corsetti et
al, en 2001 et 2007 ont montré que le nombre de bactéries lactiques isolées à partir de blé italien
varie respectivement de log 7,5 à 9,3 ufc/g et de 1 à 16x102ufc/g (Corsetti et al., 2001 ; Corsetti et
al., 2007). Dans le même ordre d’idée, les travaux effectués sur les farines de blé marocaines, le
dénombrement des bactéries lactiques varie entre 10 et 6x102 (Ennadir et al., 2004). Toutefois, on
remarque que la charge microbienne trouvée dans notre substrat est très importante par rapport à
celle citée précédemment. Par ailleurs, Il est fort probable, que la charge microbienne trouvée dans
le blé fermenté soit due au long séjour de ce dernier dans le silo souterrain « Matmora». En effet,
certains auteurs admettent par leurs travaux que comparativement avec les produits d’origine
animale, les végétaux renferment, en général un faible nombre de bactéries lactiques (Nguyen-The
et Carlin, 1994).
3.2. Identification des bactéries lactiques isolées à partir de blé fermenté « Hamoum ».
Cent vingt-deux isolats bactériens ont été isolés à partir de nos échantillons de blé fermenté
prélevé du silo dans la région de Mazouna. Ces isolements ont été réalisés sur milieux solides et
liquides MRS. Les colonies ont été d’abord purifiées et ont subi un premier screening basé sur la
coloration de Gram et le test de catalase. Les isolats bactériens sont désignés par la lettre H en
référence au substrat « Hamoum » et codés selon la forme des bactéries :
BHL : en référence à la forme bacille ; BHC : en référence à la forme coque.
L’identification des isolats lactiques au stade genre a été conduite en utilisant une batterie de
tests portant sur les caractéristiques culturales, morphologiques (macroscopique et microscopique),
physiologiques et biochimiques sur des cultures pures.
L’étude morphologique consiste à décrire l’aspect des colonies, la couleur et la taille sur
milieux solides. Elle est ensuite conduite par une coloration différentielle de Gram pour écarter les
bactéries Gram négatif, à observer leurs formes coques ou bâtonnets et leurs modes de
68
regroupements par une observation en immersion au microscope optique .Ensuite, une étude
physiologique est menée à l’aide de différents tests : l’aptitude de croissance à pH 9, puis à
différentes concentrations de NaCl, à différentes températures et le test de la thermorésistance.
L’identification phénotypique sur le plan biochimique est réalisée par l’hydrolyse de l’arginine,
l’hydrolyse de l’acétoïne, la croissance sur le lait bleu de Sherman, la mise en évidence de la
production d’EPS et la détermination du type fermentaire par production de gaz (CO2). Enfin,
l’identification est complétée par la production des acides à partir des hydrates de carbone.
3.2.1. Pré-identification des isolats
 Examen macroscopique
L’observation macroscopique des cultures en milieux liquide a permis de constater que tous les
isolats possèdent un trouble homogène indiquant une bonne croissance après 24 h d’incubation.
Sur milieux solides, l’observation a révélé plusieurs aspects morphologiques des colonies.
 Colonies circulaires, moyennes, bombées, lisses, de couleur blanchâtre ayant un contour

régulier.
 Grosses colonies, bombées de couleur blanchâtre, lisses, ayant un contour distinct
 Petites colonies lisses arrondies de couleur blanche à contour distinct.
Les figures 16et 17 montrent les aspects macroscopiques des colonies cultivées sur milieux solides.
Figures 17& 18 : Aspect macroscopique de BHL1 (à gauche) ; Aspect macroscopique de

l’isolat BHL10 (à droite).
69
 Examen microscopique
L’observation microscopique des caractères culturaux montre la forme des colonies la taille,
le mode de regroupement ainsi que la pureté des isolats.
Ces colonies se sont distinguées par deux formes :
 En bâtonnets courts et longs, isolés, en amas et même en palissade.

 En coques disposés en tétrade, en paire, groupés en amas et parfois en courtes chaînes.
Les figures 18 et 19 montrent les aspects des colonies après coloration Gram
Figure 19&20 : Aspect microscopique des cellules après coloration de Gram (x1000), Cocci (à
gauche), Bacille (à droite)
A l’issue des résultats macroscopiques et microscopiques et les tests de la catalase et de

l’oxydase, 39 isolats ont été retenus.Les résultats des tests morphologiques ont permis de rattacher
nos 39 isolats à 4 groupes de bactéries lactiques. Ce premier screening nous a permis de mettre en
évidence la présence de lactobacilles et de coques à des proportions différentes (figure 21).
70
30,76%
Bacille Coque
69,23%
Figure 21:Proportion des bactéries lactiques
Les observations microscopique et macroscopique, La coloration de Gram et le test de la

catalase nous permettent de définir les isolats en quatre groupes différents (Tableau 9).
Tableau 7: Résultats de la pré-identification des isolats
Micro Test de la Coloration Nombre

morphologie catalase Gram d’isolats
Colonies transparentes très Cocci, en

- + 3
petites et rondes chaînette
Cocci en
Colonieslisses, arrondies
diplocoque et en - 6
blanchâtre +
tétrades
Petites colonies
Bâtonnets longs,
blanchâtres, bombées et - + 27
isolés
rondes
Colonies blanches et Cocci en
- + 3
rondes chaînette
3.2.2. Etude des caractères biochimiques et physiologiques des bactéries lactiques.
Dans cette partie, l’approche utilisée pour l’identification de nos isolats est basée
essentiellement sur la caractérisation phénotypique. Cette dernière repose sur des critères
morphologiques, biochimiques et physiologiques.
71
Apartir des résultats de la caractérisation des bactéries lactiques par les méthodes
phénotypiques qui sont regroupés dans les tableaux 10 et 11 plusieurs remarques peuvent être
faites :
Croissance à différentes températures : ce test permet de distinguer entre la flore mésophile et

thermophile.
A 37°C, toutes les bactéries se développent à cette température.
A10, 15, 30, 37 et 45°C : la majorité des bactéries sont capables de se développer à15°C, 30°C,
37°C et 45°C indiquant qu’elles sont thermophiles à l’exception des isolats BHC10, BHC11
BHC12 qui sont mésophiles.
La thermorésistance : l’exposition des isolats à une température de 60°C pendant 30 min permet
de révéler que tous les isolats ont résisté à cette température à l’exception de BHC10, BHC11,
BHC12.
Au pH 9.6 : l’ensemble des bactéries ont une croissance en milieu alcalin, excepté les isolatsBHC8,
BHC9, BHC10, BHC11, BHC12.
NaCl : l’ensemble des isolats sont résistants aux concentrations de 2,4, 5 et 6,5% deNaCl à
l’exception des isolatsBHC10, BHC11, BHC12, BHC 23, BHC24, BHC25, BHC26, BHC27qui
sont sensibles à 6,5%.Les isolatsBHC8 et BHC9n’ont présentés aucune croissance aux
concentrations de NaCl testées.
Aucune croissance n’a été observée à 7% de NaCl.
Lait bleu de Sherman : Les résultats du test de lait bleu de Sherman révèlent que tous les isolats
ayant une forme cocci coagulent le lait et réduisent le milieu à une concentration de 0,1% de bleu de
méthylène.
En revanche, à la concentration de 0,3%, seuls les isolats BHC1, BHC2 et BHC3 se sont
révélés sensibles. Tous les isolats en forme de bacille ont coagulé le lait et ont réduit le milieu
excepté les isolats BHL1, BHL2 et BHL3.
Les résultats du test du type fermentaire : ce test a permis de différencier entre les isolats
hétérofermentaires et homofermentaires en utilisant un milieu liquide contenant du glucose muni
d’une cloche de Durham.
72
Tableau 8: Caractérisation physiologique des bactéries lactiques
Thermorésistance Concentrations de NaCl

Températures °C pH
Isolats (60°C, 30mm) (%)
10 15 30 37 45 6,5 9,6 2 4 5 6,5 7
BHC1 + + + + + + + + + + + + -
BHC2 + + + + + + + + + + + + -
BHC3 + + + + + + + + + + + + -
BHC4 - - + + + + + + + + + + -
BHC5 - - + + + + + + + + + + -
BHC6 - - + + + + + + + + + + -
BHC7 - - + + + + + + + + + + -
BHC8 - - - + + + + - - - - - -
BHC9 - - - + + + + - - - - - -
BHC10 + + + + - - + - + + + - -
BHC11 + + + + - - + - + + + - -
BHC12 + + + + - - + - + + + - -
BHL1 + + + + + + + + + + + + -
BHL2 + + + + + + + + + + + + -
BHL3 + + + + + + + + + + + + -
BHL4 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL5 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL6 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL7 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL8 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL9 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL10 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL11 -/+ + + + + + + + + + + + -
BHL12 + + + + + + + + + + + + -
BHL13 + + + + + + + + + + + + -
BHL14 + + + + + + + + + + + + -
BHL15 + + + + + + + + + + + + -
BHL16 + + + + + + + + + + + + -
BHL17 + + + + + + + + + + + + -
BHL18 + + + + + + + + + + + + -
BHL19 + + + + + + + + + + + + -
BHL20 + + + + + + + + + + + + -
BHL21 + + + + + + + + + + + + -
BHL22 + + + + + + + + + + + + -
BHL23 + + + + - + + + + + + - -
BHL24 + + + + - + + + + + + - -
BHL25 + + + + - + + + + + + - -
BHL26 + + + + - + + + + + + - -
BHL27 + + + + - + + + + + + - -
+ : réaction positive ; - : réaction négative ; +/- : faible croissance.
73
La présence de gaz (CO2) dans la cloche de Durham indique un métabolisme

hétérofermentaire. Ce test a permis de sélectionner 3 isolats en forme de coque hétérofermentaires.
Parmi les isolats homofermentaires décelés, on distingue 9 coques et 27 lactobacilles. On remarque
toutefois que le groupe homofermentaire est prépondérant dans les cultures de nos bactéries
lactiques.
Test de l’ADH : à travers les résultats, nous pouvons conclure que parmi la collection d’isolats,
certains n’ont pas la capacité d’hydrolyser l’arginine. En effet, le catabolisme de l’arginine se
manifeste par une coloration violette (ADH+).
Parmi les isolats ADH-, nous citons : BHC8, BHC9, BHC10, BHC11, BHC12, BHL8,
BHL9, BHL10, BHL12, BHL13, BHL14, BHL15, BHL16, BHL17, BHL18, BHL19, BHL20,
BHL21, BHL22, sont ADH-
Test Esc : L’hydrolyse de l’esculine se traduit par un noircissement sur milieu à esculine gélosé
(figure 16). Nous remarquons que tous les isolats se sont révélés positifs à ce test à l’exception de
BHL23, BHL24, BHL25, BHL26 et BHL27.
Test de l’ACT : La production d’acétoïne est caractérisée par l’apparition d’un anneau rouge à la
surface du milieu. Parmi les bactéries ayant la capacité de produire de l’acétoïne, nous citons les
isolats cocci, BHC4, BHC5, BHC6, BHC7 ainsi que les isolats bacillesBHL23, BHL24, BHL25,
BHL26 et BHL27.
Test de l’EPS : Les isolats cultivés sur milieu MSE sont apparus sous forme de grosses colonies
larges, de consistance visqueuse, à contour irrégulier et de couleur blanchâtre. Trois coques et cinq
bâtonnets se sont avérés producteurs d’EPS. Il s’agit de BHC10, BHC11 BHC12, BHL23, BHL24,
BHL25, BHL26 et BHL27.
74
Tableau 9: Caractérisation biochimique des bactéries lactiques.

Lait de Sherman
Isolats GAZ ADH ESC ACT DEXT
0,1% 0,3%
BHC1 - + + - - + -
BHC2 - + + - - + -
BHC3 - + + - - + -
BHC4 - + + + ND + -
BHC5 - + + + ND + -
BHC6 - + + + ND + -
BHC7 - + + + ND + -
BHC8 - - + - ND + -
BHC9 - - + - ND + -
BHC10 + - + - + + -
BHC11 + - + - + + -
BHC12 + - + - + + -
BHL1 + + + - - + -
BHL2 + + + - - + -
BHL3 + + + - - + -
BHL4 - + + - - + -
BHL5 - + + - - + -
BHL6 - + + - - + -
BHL7 - + + - - + -
BHL8 - + + - - + -
BHL9 - + + - - + -
BHL10 - + + - - + -
BHL11 - + + - - + -
BHL12 - - + - - + +
BHL13 - - + - - + +
BHL14 - - + - - + +
BHL15 - - + - - + +
BHL16 - - + - - + +
BHL17 - - + - - + +
BHL18 - - + - - + +
BHL19 - - + - - + +
BHL20 - - + - - + +
BHL21 - - + - - + +
BHL22 - - + - - + +
BHL23 + + - + + + +
BHL24 + + - + + + +
BHL25 + + - + + + +
BHL26 + + - + + + +
BHL27 + + - + + + +
+ : réaction positive ; - : réaction négative ; Gaz : production de gaz partir du glucose ; ADH : production de
l’arginine dihydrolase ; ESC : hydrolyse de l’esculine ; ACT : production d’acétoïne ; DEXT : production de dextrane
75
Type fermentaire V.P ADH
pH 9,6 Thermorésistance
Réduction de BM 0,3% Réduction de BM 0,1%
76
Hydrolyse de l’esculine
Figure 22 : Tests de caractérisation phénotypique des bactéries lactiques. T : témoin.
Globalement, les caractères phénotypiques (culturaux, physiologiques et biochimiques) ont

permis de rattacher nos 39 isolats à 4 genres par ordre de dominance, résultats représentés dans la
figure 23.
Lactobacillus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus
15%
8%
8%
69%
Figure 23 : Répartition des genres à partir des différents isolats de blé fermenté.
Lb : Lactobacillus ; En : Enterococcus ; L : Leuconostoc ; P : Pediococcus
77
L’étude de la fermentation des carbohydrates va compléter les caractérisations

physiologiques et biochimiques réalisées et permettre de nous diriger vers la détermination de
l’espèce bactérienne présumée.
Tableau 10: Profils fermentaire des isolats lactiques
Sucres G Mal Lac Raf Man Xyl Ara Fr Gal Sa Sor Rham Tré Cell
Isolats
BHC1 + + + - - - + - - + - - + +
BHC2 + + + - - - + - - + - - + +
BHC3 + + + - - - + - - + - - + +
BHC4 + - V - - - - + - + - + + +
BHC5 + - V - - - - + - + - + + +
BHC6 + - V - - - - + - + - - + +
BHC7 + - V - - - - + - + - + + +
BHC8 + + + - - - - + - + - + + +
BHC9 + + + - - - - + - + - + + +
BHC10 + + + - + + + + + + - - + -
BHL11 + + + - + + + + + + - - + -
BHL12 + + + - + + + + + + - - + -
BHL1 + + + - - - + + + - - - - -
BHL2 + + + - - - + + + - - - - -
BHL3 + + + - - - + + + - - - - -
BHL4 + + - - + - - + + - - + - -
BHL5 + + - - + - - + + - - + - -
BHL6 + + - - + - - + + - - + - -
BHL7 + + - - + - - + + - - + - -
BHL8 + + - - + - - + + - - + - -
BHL9 + + - - + - - + + - - + - -
BHL10 + + - - + - - + + - - + - -
BHL11 + + - - + - - + + - - + - -
BHL12 + + + - - - - + + + + - + +
BHL13 + + + - - - - + + + + - + +
BHL14 + + + - - - - + + + + - + +
BHL15 + + + - - - - + + + + - + +
BHL16 + + + - - - - + + + + - + +
BHL17 + + + - - - - + + + + - + +
BHL18 + + + - - - - + + + + - + +
BHL19 + + + - - - - + + + + - + +
BHL20 + + + - - - - + + + + - + +
BHL21 + + + - - - - + + + + - + +
BHL22 + + + - - - - + + + + - + +
BHL23 + + + - + - - + + + + - + +
BHL24 + + + - + - - + + + + - + +
BHL25 + + + - + - - + + + + - + +
BHL26 + + + - + - - + + + + - + +
BHL27 + + + - + - - + + + + - + +
78
+ : réaction positive ; - : réaction négative ; V : variable (plus de 10% et moins de 90% de réactions
positives;G :Glucose ; Mal : Maltose ; Lac : Lactose ; Raf : Raffinose ; Man : Mannose ; Xyl : Xylose ; Ara :
Arabinose ; Fr : Fructose ; Gal : Galactose ; Sac : Saccharose ; Sor : Sorbitol ; Rham : Rhamnose ; Tré : Tréalose ; Cell :
Cellobiose.
La pré-identification des isolats est réalisée par l’étude des profils de fermentation des
carbohydrates. En effet, la fermentation des carbohydrates entraine une acidification qui se traduit
par un virage de l’indicateur coloré du rouge pourpre au jaune attestant un résultat positif. Ceci est
attribué à la production d’acide lactique par les souches après catabolisme des sucres
fermentescibles. Les résultats des profils fermentaires sont représentés dans le tableau12.
En se référant aux différents tests réalisés, les 39 isolats sont répartis de la manière suivante :
Douze isolats ont une forme cocci en paire, en chaînette, groupés et/ou en amas. Parmi ces
derniers, trois isolats codés BHC1, BHC 2et BHC3 ont donné un résultat positif à ces différents
tests : thermorésistance, croissance à 15°C et 45°C, pH9.6 Ils se sont développés en présence de
6.5% de NaCl et ont également coagulés et réduit le lait contenant 0.1% de bleu de méthylène. La
différenciation entre les genres Enterococcus et Lactococcus repose sur la croissance en présence de
6.5% NaCl, à pH 9.6, à 45°C et réduisent le milieu lait contenant 0.1% de bleu de méthylène
(Devriese et Pot.1995 ; Badis et al., 2004). A la concentration de 0,3% de BM, parmi les isolats
cocci, seuls BHC1, BHC2 et BHC3 n’ont ni réduit, ni coagulé le lait. Ces caractéristiques répondent
aux critères que possèdent les entérocoques, ce qui nous conduit à classer ces trois isolats dans le
genre Enterococcus. Ils présentent également un caractère homofermentaire, hydrolysent l’esculine
et l’arginine et ne produisent pas l’acétoïne. La fermentation de l’arabinose nous permet de conclure
que ces trois isolats appartiennent à l’espèce Enterococcus faecium (Devriese et al., 1993). En
outre, ces isolats sont capables d’utiliser le lactose, le maltose, le glucose, le tréhalose mais
incapables d’utiliser le sorbitol, le xylose, le galactose, le raffinose et le mannose (Thapa et al.,
2006 ;Ennadir et al., 2014). Ces espèces ont également été identifiées dans les farines provenant du
Maroc, de la France et d’Italie.
Trois autres isolats codés BHC10, BHC11 et BHC12 présentent une forme lenticulaire, un
caractère hétérofermentaire, hydrolysent l’esculine et ne produisent pas d’acétoïne. Ils synthétisent
les EPS visualisés par des colonies visqueuses, ils sont incapablesd’hydrolyser l’arginine,
sedéveloppent à des températures de 15°C mais pas à 45°C et tolèrent une concentration élevée de
5% de NaCl mais pas de 6,5%. Ces bactéries sont incapables de survivre après leur exposition à une
température de 60°C pendant 30mn. Elles ne fermentent ni le galactose, ni le raffinose, ni le
rhamnose, ni le cellobiose et ni le sorbitol (Thapa et al., 2006 ; Kheddid et al., 2006). En revanche,
ils fermentent l’arabinose, le tréhalose et produisent du dextrane (Garvie, 1984 ; Björkroth et
79
Holzapfel, 2003). Ces isolats arabinose positifs, produisant du dextrane peuvent être identifiés aux
sous espèces Leuconostoc mesenteroïdes sp mesenteroïdes (Carr et al., 2002).
Concernant les six derniers isolats cocci, BHC4, BHC5, BHC6, BHC7, BHC8 et BHC9, ils
forment des colonies rondes qui au microscope optique révèlent une forme en tétrades
caractéristiques du genre Pediococcus. Ces isolats homofermentaires sont capables de se développer
à 45°C mais pas à 15°C et se développent à la concentration de 6,5% de NaCl. Les isolats BHC4,
BHC5, BHC6 et BHC7hydrolysent l’arginine, trait caractéristique de l’espèce Pediococcus
acidilactici (Carr et al., 2002). En outre, ils ont la capacité de fermenter le glucose, le fructose, le
cellobiose, le tréhalose et le saccharose. (Kheddid et al., 2006, Ennadir et al., 2014). Quantaux
autres isolats BHC8 et BHC9, ils sont incapables d’hydrolyser l’arginine (Carr et al., 2002), ne
tolèrent pas un pH de 9,6 et ne se développent pas aux différentes concentrations de NaCl. Le profil
de ces isolats se distingue par leur capacité à fermenter le maltose. Ces isolats peuvent être
identifiés à Pediococcuspentosaceus (Ennadir et al., 2014 ;Kheddid et al., 2006).
Les 27 bactéries, isolées à partir de blé fermenté, en forme de bacille sont représentées par le
genre Lactobacillus. Ce sont des cellules dont la morphologie varie de coccobacille à bacilles sous
forme de bâtonnets longs ou courts isolés ou associés en chaînettes ou en diplocoques et/ou en
amas.
Sur la base des différentes températures de croissance, de l’hydrolyse de l’arginine et du

type fermentaire, le genre Lactobacillus est subdivisé en 3 groupes (Tableau 13).
Tableau 11: les différents groupes du genre Lactobacillus selon Hammes et Hertel, 2003 ;
Axelsson, 2004.
Croissance à Production de gaz

15°C 45°C ADH Glucose Gluconate
Streptobacterium + V - - +
Thermobacterium - + - - -
Betabacterium + V + + +
Les bactéries homofermentaires mésophiles font partie du groupe II Streptobacterium tandis

que les bactéries homofermentaires thermophiles appartiennent au groupe I Thermobacterium. Le
groupe III Betabacterium renferme les bactéries hétérofermentaires mésophiles (Hammes et Hertel,
2003 ; Axelsson, 2004).
80
 Le groupe I Thermobacterium :
Les bactéries appartenant à ce groupe sont représentées dans notre étude parBHL4,
BHL5,BHL6, BHL7, BHL8, BHL9, BHL10etBHL11.Ces isolats sont homofermentaires,
thermophiles, incapables de décarboxyler l’arginine, hydrolysent l’esculine, se développent à une
concentration de 6.5% de NaCl et réduisent le milieu lait à 0.1 et 0.3% de BM. Ils sont incapables
d’utiliser le raffinose, l’arabinose, le xylose, le lactose, le cellobiose, le sorbitol, le tréhalose et le
saccharose. Ces isolats ont été pré-identifiés parmi l’espèce Lactobacillus amylophilus (Hammes et
Vogel. 1995 ; Hammes et Hertel. 2006).
 Le groupe II Streptobacterium :
Ce groupe renferme 16 isolats dont 11 isolats codés BHL12, BHL13, BHL14, BHL15,
BHL16, BHL17, BHL18, BHL19, BHL20, BHL21et BHL22 sont homofermentaires thermophiles.
Ils ne produisent pas de NH3 à partir de l’arginine (Collins et al., 1989) et hydrolysent l’esculine. Ils
tolèrent une concentration de 6.5% de NaCl. Ils sont capables d’utiliser le glucose, le maltose, le
lactose, le galactose, lecellobiose, le sorbitol, le tréhalose, le fructose et le saccharose. Ces isolats se
rapprochent de l’espèce Lactobacillus plantarum (Ennadir et al., 2014).Quant aux 5 isolats restants
codés BHL23, BHL24, BHL25, BHL26etBHL27, ils sont homofermentaires thermophiles. Ils
hydrolysent l’arginine et l’acétoïne mais pas l’esculine et ne se développent pas à 6,5% de NaCl.
Ces isolats sont capables d’utiliser l’ensemble des sucres testés sauf le raffinose, l’arabinose, le
rhamnose et le xylose. Ces isolats ont été pré-identifiés à l’espèce Lactobacillus casei (Hammes et
Hertel, 2006).
 Le groupe III Betabacterium :
Ces 3 isolats codés BHL1, BHL2, et BHL3sont hétérofermentaires, mésophiles, hydrolysent

l’arginine etl’esculine mais pas l’acétoïne. Ils sont capables d’utiliser l’ensemble des sucres testés à
l’exception du rhamnose, du sorbitol, du xylose, du cellobiose et du tréhalose. Toutes ces propriétés
nous laissent suggérer que ces isolats sont représentatifs de l’espèce Lactobacillus brevis (Hammes
et Hertel, 2006).
81
Tableau 12: Tableau récapitulatif des résultats des tests de pré-identification des bactéries
lactiques.
Genres Espéces Codes
Enterococcus faecium BHC1, BHC2, BHC3
Leuconostoc Mesenteroïdes ssp mesenteroïdes BHC10, BHC11, BHC12
acidilactici BHC4 , BHC5, BHC6, BHC7

Pediococcus
pentosaceus BHC8, BHC9
BHL4, BHL5, BHL6, BHL7,
amylophilus
BHL8, BHL9, BHL10, BHL11
brevis BHL1, BHL2, BHL3
BHL12, BHL13, BHL14,
Lactobacillus Plantarum BHL15, BHL16, BHL17,
BHL18, BHL19,BHL20,
BHL21,BHL22
BHL23,BHL24,BHL25,BHL26,
casei
BHL27.
Figure 24: Distribution quantitative des espèces présumées de bactéries lactiques.
Dans la présente étude, 4 genres et 8 espèces provenant du blé fermenté ont été pré-identifiées
dans le blé fermenté. Au cours de l’évolution de la fermentation, une communauté de bactéries
82
lactiques composée principalement de Lactobacillus s’est installée, en association avec d’autres

espèces minoritaires des genres Leuconostoc, Pediococcus et Enterococcus. On remarque toutefois
qu’à l’exception des 3 isolats lactiques (BHC10, BHC11 et BHC12) tous les autres se développent à
45°C et survivent à l’exposition à la température de 60°C pendant 30mn. Cette résistance à la
chaleur correspond probablement à une adaptation aux conditions de confinement pendant le
stockage souterrain.
La fermentation du blé est dominée par les espèces de lactobacilles homofermentaires, en

particulier L. plantarum. En effet, Humblot et Guyot, (2009) ont rapporté une évolution similaire
des bactéries lactiques dans les bouillies fermentées de millet, dans lesquelles seuls les représentants
des Lactobacillaceae (Lactobacillus), des Leuconostocaceaeet des Enterococcaceaes ont été
détectés.
Les espèces identifiées dans nos échantillons de blé fermenté sont en accord avec les
populations de bactéries lactiques décrites par les auteurs des travaux de recherche sur les aliments
fermentés à base de céréales. Lb. brevis, En. faecium, et P. pentosaceussont rapportés comme étant
présents en association, ou non, dans divers aliments fermentés à base de céréales tels que hussuwa
(Yousifet al., 2010), potopoto(Abriouel et al., 2006), ben-saalga (Touet al., 2007) et koko(Lei and
Jakobsen, 2004).
Des auteurs ont montré la présence de Lb. brevis dans les produits amylacés non alcoolisés à
base de céréales (Yao et al., 2009). Concernant la souche Lb casei identifié dans le blé fermenté, il a
été également détecté dans les levains traditionnels de blé mûr à un taux assez élevé (Reale et al.,
2011).Cette espèce a été isolée à partir d’un ferment produit à l’aide d’une farine fermenté et
représente 8,7%des souches isolées (Faid et al., 1994).Elle a été aussi décrite auparavant par
Spicher (1983) comme espèce naturelle de la fermentation du pain au seigle en Allemagne.
L’espèce Ln mesenteroïdes sp mesenteroïdes est présente dans différents levains de blé

albanais (Nionelli et al., 2014) , de blé traditionnel des pays européens (Robert et al., 2006 ; Robert
et al., 2009), de levain Iranien de Shangak (Azar et al., 1977) et des levains panaires traditionnels
marocains (Faid et al., 1994).Les leuconostocs sont naturellement présents sur les végétaux cultivés,
la betterave à sucre, dans le lait et produits laitiers fermentés et carnés. L’espèce Ln mesenteroïdes
sp mesenteroïdes est utilisée pour son rôle texturant antibactérien et aromatique dans plusieurs
produits alimentaires (Devoyod et Poullain, 1988 ; Benmechernene et al., 2013).
En ce qui concerne le genre Pediococcus, les isolats obtenus sont présumés être
P.acidilactici et P.pentocaseus. Parmi les bactéries lactiques isolées, à partir de farine de blé, ce
83
genre est représentatif de la flore lactique (Ennadiret al., 2014 ).Dans le même ordre d’idée, certains
auteurs ont avancé que Pediococcus pentosaceus était la seule espèce de ce genre qui a été détectée
dans tous les levains étudiés et peut être appliquée comme démarreur de la production de pain au
levain (Katina et al., 2002 ; Paramithiotis et al., 2005).Des auteurs ont trouvé que P. pentosaceus
est la seule espèce isolée dans tous les levains étudiés (DeVuystet Neysens ,2005 ; DeVuyst et
Vancanneyt, 2007).
Concernant les entérocoques, ils sont présents dans trois échantillons uniquement
représentés par l’espèce En .faecium. Ce sont des bactéries lactiques utilisées depuis des siècles
dans la transformation des aliments. Les entérocoques jouent un rôle essentiel dans la conservation
(prolongation du temps de stockage) et dans la qualité bactériologique des aliments, tout en
respectant leurs propriétés nutritionnelles et organoleptiques (Galvez et al., 2011). D’ailleurs,
Ennadir et al. (2014) ont constaté que cette espèce est moins fréquente dans la farine de blé
d’origine marocaine, contrairement aux travaux de Corsetti et al. (2007), qui indiquent que les
entérocoques représentés par les deux espèces Enterococcus faecium et Enterococcus mundtii sont
dominantes dans ce produit ((Ennadir et al., 2014 ; Corsetti et al.,2007).
Les entérocoques sont également présents sur les parties aériennes des végétaux (céréales et
plantes fourragères) (Devriese et al., 1993 ; Franz et al., 1999 ; Mundt et Hammer .1968) et
participent à la fermentation des aliments(Mundt et Hammer.1968 ; Franz et al.,1999 ). Signalons à
ce propos que dans la littérature, ce genre est le plus controversé des bactéries lactiques. Certains
auteurs le considèrent comme agent d’altération tandis que d’autres l’admettent comme un élément
contribuant positivement à la maturation et au développement de la flaveur des produits (Ammor et
al., 2005 ; Moreno et al., 2006 ; Gracia et al., 2007 ; Ruiz-Moyano et al., 2008).
En résumé, on remarque que les genres identifiés dans notre étude sont présents dans les
différentes investigations menées sur les farines de blé d’origine marocaine, italienne et française et
également sur les levains traditionnels de blé de différentes origines.
L’approche adoptée pour l’identification de nos isolats au niveau de l’espèce est basée
essentiellement sur les caractéristiques physiologiques et biochimiques.
Bien que cette caractérisation phénotypique constitue une étape fondamentale et

préliminaire, elle reste néanmoins sommaire et imprécise. En effet, une identification claire et
précise jusqu’à l’espèce et même à la sous espèce est difficile par les méthodes phénotypiques
classiques tel que le profil fermentaire à cause du nombre élevé des espèces de bactéries lactiques
qui différent par un nombre restreint de caractères biochimiques (Quere et al., 1997). Avec le
84
développement de nouvelles techniques, en particulier le MALDI-TOF MS, la caractérisation et

l’identification bactériennes se sont révélées plus efficaces car elles nécessitent une petite colonie et
une matrice. D’autant plus que cette technique est rapide, fiable et à moindre coût par rapport aux
autres techniques moléculaires utilisées pour l’identification microbienne. Donc, afin d’attribuer des
profils fiables à nos isolats, une caractérisation moléculaire s’avère indispensable.
3.3. Caractérisation des bactéries lactiques isolées à partir du blé fermenté par MALDI-TOF
MS
Une quinzaine d’isolats bactériens ont été soumis à une analyse de cellule entière de type
MALDI-TOF MS. Cette méthode discrimine les bactéries sur la base du criblage des pics observés
en tant que biomarqueurs protéiques pour l’identification des bactéries (Hollande et al., 1996). Cette
stratégie est améliorée par l’utilisation d’une ou plusieurs souches de références pour chacune des
espèces qui doivent être incluses dans la base de données (Williams et al., 2003 ; Chen et al., 2008).
Dans notre cas, le traitement des données a été réalisé par le logiciel MALDI BioTyper
TM4.0 (MALDI Biotyper4.0 Data base BruckerDaltonics, Germany).
L’identification des spectres des isolats bactériens a été réalisée à l’aide d’un algorithme de
reconnaissance qui considère les positions des pics dont l’intensité correspond à une échelle de 1 à
1000 (Bright et al., 2002 ;Freiwald et al., 2009). Le logiciel génère automatiquement les listes de
pics à partir de tous les spectres et extrait les pics typiques qui sont présents dans les spectres
répertoriés pour une espèce donnée.
Les figures24 à 30 illustrent les spectres de masse recueillis des 4 isolats bactériens réalises
par le logiciel MALDI-TOF MS BiotyperBrucker.
Tableau 13: Identification des isolats bactériens par MALDI-TOF MS.
Isolats Identification Score NCBI à identifier
BHL 27 Lactobacillus plantarum 2.023 1590
BHL 23 Lactobacillus plantarum 2.064 1590
BHL8 Lactobacillus brevis 2.201 1580
BHC6 Pediococcusacidilactici 1.77 1254
Un matching score ou score d’appariement et de fiabilité d’identification, basé sur les

masses identifiées et la corrélation de leurs intensités est généré et utilisé pour classer les résultats.
85
Un score supérieur à 2.000 ou compris entre 2.000 et 3.000 indique une bonne fiabilité et une forte
probabilité de l’identification de l’espèce. Le rang du genre, à ce score étant totalement sécurisé
(Gidenn, 2001 ; Blondiaux, 2013).
Tableau 14: Score de concordance des spectres obtenus à partir d’une bactérie d’intérêt avec
ceux de la base de données Biotyper, reflétant le degré de confiance à accorder à
l’identification.
Score Description Symbole
2,300 – 3,000 Forte probabilité d’identification à l’espèce +++
2,000 – 2,299 Identification du genre sécurisée, identification à ++

l’espèce probable
1,700 – 1,999 Identification au genre probable +
0,000 – 1,699 Degré de confiance insuffisant pour l’identification -
Selon les données présentées dans le tableau 15 et les figures 17 à 33, nous déduisons que :
 3 isolats ont été identifiés au rang de genre sécurisé (score >2.000) et l’espèce probable
 1 isolat a été identifié au rang de genre probable (score > 1.700).
Les isolats soumis à l’analyse protéomique sont identifiés comme suit :
BHL27 : Lactobacillus plantarum DSM 20246 DSM
BHL23 : Lactobacillus plantarum DSM 20246 DSM
BHL 8 : Lactobacillus brevis DSM 1268 DSM
BHC 6 : Pediococcusacidilactici146 RLT
En comparant les résultats de l’identification phénotypique avec ceux obtenus par MALDI-
TOF MS, on constate que seule l’espèce Pediococcus acidilactici (BHC6) a été identifiée par les
deux méthodes. En ce qui concerne Lactobacillus (BHL23, BHL27) identifiés par la méthode
phénotypique comme Lactobacillus casei, les résultats protéomique ont montré que ces isolats sont
Lactobacillus plantarum.
La caractérisation protéomique a permis l’identification de 4 bactéries lactiques avec de

bons scores.
L’analyse protéomique a montré que les bactéries lactiques les plus fréquemment détectées
sont les lactobacilles essentiellement représentés par l’espèce Lactobacillus plantarum. En effet,
86
cette dernière a été isolée à partir de nombreux substrats à base de céréales (blé, mil, sorgho, maïs et
seigle).Il est connu comme groupe majoritaire de la microflore lactique des produits traditionnels
(pâte ou purée et bouillies non alcoolisées) obtenus à partir du mil, sorgho et maïs en Afrique de
l’Ouest (Yao et al 2009 ; Louembé et al., 2003). Lactobacillus plantarum est l'espèce qui a été
isolée des levains de seigle russe et finlandais en tant que microorganisme prédominant (Rosenquist
et Hansen, 2000).Il a également été détecté à partir du levain traditionnel de blé iranien (Golshanet
al., 2014) et albanais (Nionelliet al., 2014).C’est un groupe qui fait partie des bactéries
commensales dont l’utilisation est courante comme probiotique chez les êtres humains et animaux
(Ouwehand et al., 2002).
87
Figure 25 : Spectre de Lactobacillus plantarum BHL23
Figure26 : Spectre de Lactobacillus plantarum BHL27
88
Figure27 : Spectre de Lactobacillus brevis BHL8
Figure 28 : Spectre de Pediococcus acidilactici BHC6
89
Figure 29 : Spectre à pic Lactobacillus plantarum BHL23
Figure 30 : Spectre à pic Lactobacillus plantarum BHL27
90
Figure 31 : Spectre à pic Lactobacillus brevis BHL8
Figure 32 : Spectre à pic de Pediococcus acidilactici BHC6
91
L’espèce Lactobacillus plantarum est décrite comme très active dans la fermentation panaire
(Lonner et Preve-Akesson, 1988).Des auteurs ont rapporté que parmi les bactéries lactiques isolées
des farines, les espèces Lactobacillus plantarum et Pediococcus pentosaceus sont les plus
fréquentes et représentent plus de 85% des isolats homofermentaires(DeVuyst et Neyssens, 2005 ;
DeVuyst et Vancanneyt, 2007 ; Corsetti et Settani, 2007).L’espèce Lactobacillus plantarumest une
espèce communément isolée à des fréquences variables de différents produits fermentés, des
levains, des produits laitiers et des produits végétaux (Tanasupawat et al., 1992 ; Tanasupawat et
al., 2002).Gobbetti et al.( 1995) et Corsetti et al. (2001) ont rapporté que l’espèce Lactobacillus
plantarum a été isolée des farines italiennes avec une faible fréquence. Contrairement aux travaux
effectués par Ricciardi et al. (2005) sur le levain utilisé dans la préparation du pain traditionnel du
blé dur italien, le microorganisme le plus dominant est Lactobacillus plantarum avec une fréquence
de 49%. Quant à l’espèce Lactobacillus brevis, elle est présente dans les produits amylacés non
alcoolisés.
Lactobacillus plantarum et Lactobacillus brevis sont deux espèces qui sont présentes dans la
fermentation d’un grand nombre de variété de produits alimentaires carnés (Rhee et al., 2011 ;
Kröckel et al., 2013) et également dans les fruits, légumes et plantes ( Karavoicova et Kohajdova,
2003 ;Rhee et al., 2011 ; Swain et al.,2014). Ces deux espèces sont aussi connues en tant qu’agents
altérants dans le jus et la bière (Arena et Manca de Nadra, 2001 ; Fguiri et al., 2012).
L’espèce Pediococcus acidilactici est une espèce majoritaire présente dans les farines de blé
marocaines (Ennadir et al., 2014) rejoignant les travaux de Hardy (1982), Bervas (1991) et Infantes
et Tourneur (1991) lors de leurs investigations sur la microflore lactique des farines de blé français.
Dans le blé fermenté, cette espèce a été détectée seulement dans 4 échantillons. Louembé et al.
(2003) ont signalé qu’en général, les pediocoques sont fréquemment isolés de plusieurs produits
végétaux. En outre, le genre Pediococcus a été détecté dans les produits végétaux (céréales,
choucroute, olives, concombre) et les produits fermentés (bière) (Louembé et al., 2003).
3.4. Etude du pouvoir acidifiant des souches lactiques isolées à partir de blé fermenté.
C’est principalement pour leur activité acidifiante que les industries agroalimentaires
utilisent les bactéries lactiques, car elle est considérée comme critère primordial de sélection des
souches lactiques à intérêt en technologie laitière.
L’activité acidifiante de nos quatre souches lactiques Lb. plantarum, Lb.brevis et

Pediococcus acidilactici sélectionnées et isolées de blé fermenté a été évaluée après 24h
d’incubation à 37°C. Le suivi de l’activité acidifiante des souches est réalisé sur milieu lacté exempt
92
de cellules viables. L’acidité dans les produits laitiers est exprimée en degré Dornic (1°Dornic=
0,1g/l d’acide lactique).
Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 17 (annexe 2) et illustrés à l’aide des
figures 32, 33, 34,35 et 36.
Les résultats montrent une évolution progressive en acide lactique au cours du temps,
accompagné d’un abaissement du pH du milieu.
Après 4h d’incubation, les valeurs du pH varient entre 6,67 et 6,47 parallèlement, la quantité
d’acide lactique produite se situe entre 1,25 et 2,30 g/L. Au bout de 24h d’incubation, les valeurs de
pH diminuent sensiblement jusqu’à atteindre un pH de 5,21 suivi d’une quantité d’acide lactique
produite de 2,9g/l
Les espèces Pediococcus acidilactici (BHC6) et Lactobacillus plantarum (BHL23)

provoquent une diminution du pH du lait de 6.67 à 5,21 au bout de 24h de fermentation. Par
ailleurs, on remarque que le comportement acidifiant de nos bactéries varie d’une souche à l’autre.
En effet, on constate que les valeurs d’acidification sont comprises entre 29 et 53°D.
Acide
lactique
BHL27
en g/L
BHL23
BHC6
BHL8
Temps (heures)
Figure 33: Evaluation de la quantité d’acide lactique produite au cours du temps chez les
souches testées.
93
La quantité d’acide lactique la plus élevée produite a été enregistrée chez Pediococcus
acidilactici 53°D (BHC 6) et la plus faible 29°D chez Lactobacillus plantarum (BHL23). En ce qui
concerne Lactobacillus plantarum (BHL27) et Lactobacillus brevis (BHL8), la quantité d’acide
lactique produite par ces souches est de 2,9 et 3,7g/l respectivement.
Nos souches lactiques ont montré une capacité faible d’acidification du lait, car le pH
enregistré pendant les 6 premières heures demeure presque inchangé. Après 24h d’incubation, il est
similaire pour Lb. plantarum (BHL23) et Lb. brevis (BHL8) et diminue pour P. acidilactici (BHC6)
et Lb.plantarum (BHL27). Aucune des 4 souches n’a montré un profil d’acidification performant
car après 6h d’incubation à 37°C aucune souche n’a été capable de baisser le pH au-delà de 6,45.
Ces résultats ont permis de classer les souches Lb plantarum (BHL23) et P. acidilactici
(BHC6) dans la catégorie des bactéries moyennement acidifiantes (79°D> acidité>40°D) et les
souches Lb. plantarum (BHL27) et Lb.brevis (BHL8) dans la catégorie des bactéries faiblement
acidifiantes. Une différence dans la réduction du pH et la production d’acide entre les genres, les
espèces et parfois entre les souches de la même espèce a été soulevée par de nombreux auteurs
(Alonso-Calleja et al., 2002 ; Luquet et Corrieu, 2005).
Selon ces résultats, on pourrait suggérer que les souches ayant une activité moyennement
acidifiante pourraient être proposées dans l'industrie laitière, où ils conduisent une diminution du
pH qui joue un rôle important et essentiel dans la coagulation du lait en déstabilisant la caséine
d’une part et d’autre part en donnant au produit une spécificité du goût, contribuant ainsi à la
saveur et la production d'arômes (Tamine et Robinson, 1999 ; Singh et al., 2006).
94
BHC6
BHC6
pH pH Acidité
BHC6 D° Dornic
8 60
7
50
Acidité Dornic (°D)

6
pH 5 40
4 30
3
20
2
10
1
0 0
0H 2H Temps4 (heure)
H 6H 24H
Figure 34 : Evolution de la concentration d’acide lactique et du pH de la souche Pediococcus

acidilactici (BHC6).
BHL27
BHL27
pH pH Acidité
BHL27 D° Dornic
6,8 35
6,7 30
6,6
6,5
25
6,4 20
pH
6,3 15
6,2
10
6,1
6 5
5,9 0
0H 2H 4H 6H 24H
Temps (heures)
Figure 35 : Evolution de la concentration d’acide lactique et du pH de la souche Lactobacillus

plantarum (BHL27).
95
BHL23
BHL23
pH pH BHL23 D°
Acidité Dornic
6,8 50
6,6

40
6,4
6,2 30
pH 6
5,8 20
5,6
10
5,4
5,2 0
0H 2H 4H 6H 24H
Temps (heures)
Figure36 : Evolution la concentration d’acide lactique et du pH de la souche Lactobacillus

plantarum (BHL23).
BHL8
BHL8
pH pH Acidité
BHL8 D° Dornic
6,8 40
6,7 35
6,6
6,5 30
6,4 25
6,3
20
pH 6,2
6,1 15
6 10
5,9
5,8 5
5,7 0
0H 2H 4H 6H 24H
Temps (heures)
Figure 37 : Evolution la concentration d’acide lactique et du pH de la souche Lactobacillus

brevis (BHL8).
96
3.5. Mise en évidence des inhibitions inter-bactériennes

3.5.1. Par la méthode de Fleming et al.,( 1975)
Afin de déterminer le spectre de l’activité antimicrobienne entre les bactéries lactiques, nous
avons réalisé une mise en évidence des inhibitions entre bactérie par contact direct par la méthode
de Fleming et al.,(1975).Cette méthode permet d’évaluer l’effet antagoniste par la mesure des
diamètres des zones d’inhibitions. Chacune des bactéries de nos échantillons a été testée comme
inhibitrice et indicatrice.
Nous avons effectué 789 combinaisons entre différents genres et différentes espèces. Les
zones d’inhibitions observées sont claires avec un contour régulier et bien distinct, les diamètres
varient entre 5 et 27mm. Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, et
18f (Annexe 2) et un exemple illustre les inhibitions inter-bactéries est représenté par la figure 38.
Figure 38 : Inhibitions des isolats lactiques par BHL6
A partir de ces résultats obtenus et les figures 37,38, 39 et 40 on peut noter les points suivants :
- On observe 88,9% de cas d’inhibitions et 11,10% d’absence d’inhibition
- On observe 98,60% de cas d’inter-inhibitions parmi l’ensemble des inhibitions et 1,40% d’auto-
inhibitions.
97
- 88, 9% des interactions sont des inhibitions présentant un diamètre d’inhibition compris entre 05
et 27mm.
- Le taux des inhibitions exercés par Lactobacillus contre le genre Lactobacillus est de 62,05%.
présence d'inhibition absence d'inhibition
11,10%
88,90%
Figure 39 : Inhibitions des bactéries lactiques en milieu solide
Auto-inhibitions inter-inhibitions
1,40%
98,60%
Figure 40 :Inter-inhibition et auto-inhibition des bactéries lactiques en milieu solide.
 Le taux des inhibitions exercés par les coques contre les isolats du genre
Lactobacillus représente 27,9% avec un diamètre des halos compris entre 06 et
15mm.
98
 Le taux des inhibitions exercés par les bactéries lactiques du genre

Lactobacilluscontre les coques est de 21,40%.
 Les inhibitions exercées par les bactéries du genre Pediococcus contre les
lactobacilles représentent un taux de 25,67% et dont le diamètre des halos
d’inhibitions varie entre 06 et 15mm.
 Les inhibitions exercées par le genre Lactobacillus contre les bactéries du genre
Pediococcus représentent un taux de 9,41% et dont le diamètre des halos
d’inhibitions varie entre 05 et 17mm.
 Le taux des inhibitions exercés par les bactéries du genre Lactobacillus contre les
isolats du genre Enterococcus etLeuconostocest de 4,70%.Les diamètres des halos
d’inhibitions varient entre 05 et 17mm pour Enterococcus et entre 06 et 09mm pour
Leuconostoc.
Taux des inter-inhibitionsdes bactéries
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
lactiqueses
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Figure 41: Taux des inhibitions inter-génériques des bactéries lactiques.

En : Enterococcus ; Lb : Lactobacillus ; Ln : Leuconostoc ; Pediococcus
 Parmi les coques inhibitrices des lactobacilles, 4 isolats se sont avérées
sensibles aux lactobacilles (BHC4, BHC6 ; BHC10, BHC12).
 Parmi les coques sensibles aux lactobacilles, l’isolat BHL17 s’est avéré le
plus sensible
 Les inhibitions exercées par les lactobacilles contre les lactobacilles sont plus
importantes que celles exercées contre les coques.
99
D’après nos résultats, on remarque que les lactobacilles ont un spectre d’action élevé. En
effet, ils sont connus pour leur pouvoir inhibiteur et acidifiant qui leur permet de résister à des pH
inférieurs à 4 (Cocconcelli et Fontana, 2008).
La méthode de Fleming et al., (1975) permet d’évaluer quantitativement le pouvoir

inhibiteur des souches ensemencées en touches sur les souches ensemencées en masse dans la
gélose. Elle met en évidence non seulement les inhibitions dues à la production d’agents inhibiteurs
mais aussi celles dues au contact cellulaire.
Après avoir réalisé le criblage des antagonistes par cette méthode, nous avons retenus 7
isolats lactiques en tant que bactéries indicatrices et 14 isolats en tant que bactéries inhibitrices.
Le screening des isolats lactiques testés par la méthode de Fleming et al., (1975) a montré
un bon pouvoir inhibiteur (tableau 19, annexe 2). Parmi les 98 combinaisons testées, 92 ont révélé
une inhibition, soit 94% de nos isolats ont un effet inhibiteur. Les zones d’inhibitions sont claires
avec un contour bien distinct. Les figures 42 à 48 illustrent les inhibitions entre bactéries.
L’isolat BHL24 montre un effet étroit et le plus faible puisque les diamètres des halos
d’inhibitions n’ont pas excédé 8mm. Toutefois, cet effet inhibiteur a été observé seulement contre
les lactobacilles.
L’effet inhibiteur de la souche BHL27 s’est avéré large et en même temps plus marquant
puisque dans plusieurs cas il a présenté les diamètres d’inhibitions les plus importants. D’une
manière générale, nous pouvons conclure que les lactobacilles ont montré un effet inhibiteur qui est
plus ou moins grand selon les indicatrices testées.Cet effet inhibiteur peut être causé par la
production de composés antimicrobiens tels que les acides organiques, le diacétyle, le peroxyde
d’hydrogène ou/et les bactériocines.
3.5.2. Inhibition par production d’acides organiques
Pour lever les inhibitions dues à la production d’acide lactique, nous avons utilisé un milieu
tamponné à pH7. La comparaison des résultats obtenus en milieu tamponné et non tamponné va
nous permettre de déterminer si la production d’acide lactique est le facteur déterminant des
inhibitions enregistrées production de substances (H2O2 et/ou bactériocine).
D’après le résultat obtenu (figure 41), on remarque que 9,57% des inhibitions sont dues à la
production d’acide lactique et 90,43% des inhibitions sont dues à la production de substances (H2O2
et/ou bactériocine).
100
Inhibitions dues à l'acidité Inhibitions dues à d'autres agents
9,57%
90,43%
Figure 42 : Taux des inhibitions des isolats lactiques en milieu tamponné (T) et non tamponné
(NT).
L’emploi du milieu tamponné a permis de constater des levées d’inhibitions. En effet, on

observe deux levées d’inhibitions chez les isolats BHC4, BHL11 et BHL25 alors que pour ceux de
BHL8, BHL13 et BHL18 un seul cas est observé. Nous pouvons conclure que l’agent inhibiteur est
l’acide lactique.
On a également observé une diminution des halos d’inhibitions indiquant la participation

d’agents inhibiteurs (H2O2, bactériocine) dans l’activité inhibitrice des bactéries testées. En effet,
dans le cas de la souche BHL27 les diamètres des halos d’inhibitions ont diminués en milieu
tamponné de manière significative.
NT T
25
Diamétre des zones d'inhibitions
20
15
( mm)
10
Figure 43 : Taux d’inhibition de BHC5 par les isolats lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
101
NT T
16
Diamétres des zzones d'inhibitions en mm
14
12
10
Figure 44: Taux d’inhibition de BHC4 par les isolats lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
NT T
16
14
Diamétre des zones d'inhibitions(mm)
12
10
Figure 45 : Taux d’inhibition de BHL12 par les isolats lactiques en milieu tamponné (T) et
non tamponné (NT).
102
NT T
20
Diamétre des zones d'inhibitions (mm)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Figure 46 : Taux d’inhibition de BHL6 par les isolats lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
NT T
25
20
15
10
Figure 47 : Taux d’inhibition de BHL7 par les isolats lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
103
NT T
14
Diaméétre des zones d'inhibitions (mm)
12
10
Figure 48 : Taux d’inhibition de l’isolat BHL9 par les bactéries lactiques en milieu tamponné
(T) et non tamponné (NT).
NT T
12
10
Figure 49: Taux d’inhibition de BHL21 par les isolats lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
104
Certaines interactions ont gardé le même effet inhibiteur en milieu tamponné et non
tamponné, par exemple BHL8, BHL13, les inhibitions engendrées par ces souches ne sont pas dues
aux acides organiques mais fort probablement au H2O2 ou à des bactériocines.
Les interactions dont les diamètres des halos d’inhibitions ont faiblement diminués par
exemple, cas de BHL3 dont le halo d’inhibition en milieu non tamponné est de 11mm alors qu’il est
de 9 mm en milieu tamponné. Dans ce cas, l’inhibition est due partiellement à l’acide lactique.
On remarque que selon l’indicatrice, la souche inhibitrice peut être inhibée par production
d’acide lactique comme le cas de BHC4 ou par production d’agents inhibiteurs comme le cas de
BHL18.
Dans certains cas, on constate que le diamètre de la zone d’inhibition en milieu tamponné
augmente au lieu de diminuer, cela peut s’expliquer par l’amplification du milieu acide.
Cette étape nous a permis de distinguer nos bactéries ayant un fort pouvoir inhibiteur
comme BHL27, BHL22, BHL23, BHL17, BHC10, BHL3 et BHL8 et celles qui ont été les moins
inhibitrices comme BHL24 et BHL25. Tous les isolats se comportent comme de bonnes
indicatrices.
3.5.3. Par la méthode des puits
Le test par la méthode de diffusion des puits a été réalisé pour vérifier si les inhibitions
observées précédemment par la méthode de Fleming et al., (1975) sont détectées par cette
méthode.Les résultats enregistrés ont permis de constater une absence totale des zones d’inhibition
malgré le nombre important de répétitions.Cette absence d’inhibition peut être accordée soit à une
faiblesse de croissance bactérienne ou que le surnageant n’est pas trop concentré pour permettre de
visualiser une inhibition (Dalache, 2006). Cette étude nous a permis de sélectionner un lot de
bactéries lactiques performantes qui vont être soumis à une analyse protéomique afin d’apprécier
les activités inhibitrices et probiotiques.
3.6. Mise en évidence des inhibitions des bactéries pathogènes par les bactéries lactiques.
L’une descaractéristiques des bactéries lactiques est leur capacité à ralentir et/ou d’inhiber
l’activité et la croissance des bactéries pathogènes et / ou d’altérations par la production d’agents
inhibiteurs.
105
3.6.1. Mise en évidence des inhibitions par la méthode de Barefoot et Klaenhammer (1983).
Les isolats pré-identifiés ont été testés par la méthode de Barefoot et Klaenhammer (1983),
pour la détection de souches lactiques productrices de substances protéiques antimicrobiennes.
Cette méthode permet de mettre en contact le surnageant des isolats avec les souches pathogènes
indicatrices. L’activité inhibitrice se traduit par l’apparition de zones d’inhibition autour des puits.
Les résultats enregistrés ont permis de constater une absence totale des zones d’inhibitions
autour des puits malgré de nombreuses répétitions. Cette absence d’inhibition peut-être causée
parune faible croissance bactérienne. Ces résultats rejoignent ceux d’Ammor et al (2005).
3.6.2. Mise en évidence des inhibitions par la méthode de Fleming et al. (1975).
Tous les isolats lactiques isolés à partir du hamoum ont été testés par la méthode de Fleming
et al. (1975) et ont permis de sélectionner les bactéries productrices de substances antimicrobiennes.
Ce criblage a été réalisé vis-à-vis des germes pathogènes à Gram positif Staphylococcus aureus
ATCC 25923 et à Gram négatif Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853. Cette activité inhibitrice se traduit par l’apparition d’un halo clair d’inhibition autour des
isolats ensemencés en touches. Un exemple de résultats obtenus est représenté dans la figure 50.
Figure 50 : Activité inhibitrice de 4 souches lactiques vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa.
La figures 51 montre les résultats des inhibitions des bactéries pathogènes par les bactéries
lactiques.
 On observe une activité inhibitrice chez 91,45% des isolats vis-à-vis des 3 souches
indicatricestestées avec un diamètre du halo clair compris entre 5 et 24mm.
 8,55% des isolats lactiques ne présentent pas d’inhibitions.
106
présence d'inhibition absence d'inhibition
8,55%
91,45%
Figure 51 : Taux d’inhibitions des bactéries pathogènes par les bactéries lactiques.
La répartition des isolats a été réalisée en fonction des diamètres des halos clairs. Selon Cardinal
et al.(1977) et Tahiri (2007),les inhibitions dont les diamètres sont ≥ 10mm sont considérées
comme ayant un effet inhibiteur élevé.
 9,34% des interactions présentent des inhibitions dont le diamètre est < à 10mm et 90,66%
des interactions dont le diamètre d’inhibition est ≥ à 10mm.
 Les lactobacilles ont un spectre d’activité très large. Ils ont inhibé aussi bien les bactéries
pathogènes à Gram positif qu’à Gram négatif avec des zones d’inhibitions qui atteignent 24
mm de diamètre traduisant ainsi un fort potentiel inhibiteur.
 Les bactéries à Gram positif ont été inhibées par toutes les bactéries lactiques testées.
 82,05% des isolats inhibent Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ; Staphylococcus

aureusATCC25923 est inhibés par 100% des isolats et E.coli ATCC 25922 est inhibé par
92,30% des isolats.
Ces inhibitions pourraient avoir plusieurs origines parmi lesquelles on peut citer : la production
des composés antimicrobiens comme les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, les phages
et/ou les bactériocines produits par les bactéries lactiques (Ammor et al., 2006).
107
 Cause des inhibitions
Parmi les causes principales des inhibitions des bactéries lactiques, on a la production des acides
organiques. Pour éliminer l’effet de ces acides sur les bactéries indicatrices, un milieu solide
tamponné à pH7 est utilisé.
L’effet inhibiteur est testé selon la méthode de Fleming et al., (1975),en utilisant du MRS solide
tamponné et non tamponné comme témoin. La lecture des résultats consiste à comparer les zones
d’inhibition obtenues dans les deux milieux.Les résultats obtenus sont illustrés dans les figures 52,
53,54 et 55 ainsi que dans le tableau 20 (Annexe 2)
L’évaluation des résultats obtenus en milieu tamponné et nontamponné nous permet de faire les
observations suivantes (Figure 52) :
 L’inhibition des bactéries lactiques a été levée dans 10,25% des cas.
 Les isolats lactiques dont les diamètres des zones d’inhibition ont diminués dans le milieu
tamponné représentent 62,4% des cas.
 Dans certains cas, en milieu tamponné, les diamètres des zones d’inhibitions des isolats
lactiques ont augmentés de 11,11%des cas.
 Le nombre des levées d’inhibitions est plus important chez les bactéries à Gram négatif.
Levée des inhibitions Augmentation des inhibitions

Diminution des inhibitions
10,25%
11,11%
62,40%
Figure 52 : Taux des inhibitions des bactéries pathogènes par les bactéries lactiques en milieu
tamponné (T) et non tamponné(NT).
108
MRS NT MRS T
20
Diametre zones d'inhibitions (mm)
15
10
BHL26
BHL10
BHL11
BHL12
BHL14
BHL15
BHL16
BHL17
BHL18
BHL20
BHL21
BHL22
BHL23
BHL24
BHL25
BHL27
BHC1
BHC2
BHC3
BHC5
BHC6
BHC8
BHC9
BHL1
BHL2
BHL3
BHL4
BHL6
BHL7
BHL8
BHL9
BHC11
BHC12
Figure 53 : Inhibition de la souche E. coli par les bactéries lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
MRS NT MRS T
25
Diamétre zones d'inhibitions(mm)
20
15
10
Figure 54 : Inhibition de la souche Pseudomonas aeruginosa par les bactéries lactiques en milieu
tamponné(T) et non tamponné (NT).
MRS NT MRS T
25
Diametre zones d'inhibitions(mm)
20
15
10
0
BHC 1
BHC 2
BHC 4
BHC 5
BHC 6
BHC 7
BHC 8
BHC 10
BHC 11
BHC 12
BHL 2
BHL 3
BHL 4
BHL 5
BHL 6
BHL 7
BHL 8
BHL 9
BHL 10
BHL 11
BHL 12
BHL 13
BHL 14
BHL 15
BHL 16
BHL 17
BHL 18
BHL 19
BHL 20
BHL 21
BHL 22
BHL 23
BHL 24
BHL 26
BHL 27
Figure 55 : Inhibition de la souche Staphylococcusaureus par les bactéries lactiques en milieu

tamponné (T) et non tamponné (NT)
109
Afin de sélectionner les bactéries bactériocinogènes parmi les 29 isolats soumis à l’activité
antagoniste précédemment, nous avons choisi 15 isolats ayant montré un bon pouvoir inhibiteur.Ces
isolats ont été traités par MALDI-TOF MS et 4 ont été identifiés. L’activité inhibitrice de ces 4
souches a été évaluée vis-à-vis des même souches indicatrices, Staphylococcus aureus ATCC
25923 et à Gram négatif indicatrices Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853).
Les résultats obtenus sont illustrés dans les figures 56 et 57 et dans le tableau 21en annexe 2.
Figure 56 : Zones d’inhibition des souches BHC6 et BHL27 vis-à-vis de la souche

Pseudomonas aeruginosa
Figure 57 : Zones d’inhibition des souches BHL23 et BHL27 vis-à-vis d’E.coli.
110
On constate que les souches Pediococcus acidilactici, Lactobacillus plantarum et

Lactobacillus brevis inhibent les bactéries pathogènes avec un diamètre qui varie de 10 à 23mm,
cela traduit un fort potentiel inhibiteur. Ces effets inhibiteurs peuvent avoir plusieurs origines.
La première est la production d’acide organique, en effet, les lactobacilles sont connus pour
leur grande résistance aux pH acides ((jusqu’à un pH voisin de 3,5) contrairement aux autres genres
de bactéries lactiques qui sont plus sensibles (Podolak et al., 1996 ; Wilson et al., 2005).
La deuxième est que les souches lactiques produisent une substance inhibitrice de nature
protéique (type bactériocine).
3.6.3. Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur

3.6.3.1. Inhibitions en milieu tamponné
L’emploi d’un milieu tamponné permet de mettre en évidence les inhibitions dues à la
production d’acide lactique (Figure 58 et 59).
 Une levée d’inhibition de la souche Pediococcus acidilactici (BHC6) vis-à-vis de

P.aeruginosa.
 Une levée d’inhibition de la souche Lactobacillus plantarum (BHL27) vis-à-vis d’E.coli.
Les diamètres des zones d’inhibition des souches deLb.plantarum, Lb.brevis et P.acidilacticiont
diminué en milieu tamponné par rapport au milieu non tamponné.
Figure 58 : Effet inhibiteur des souches lactiques vis-à-vis de la souche Staphylococcusaureus

en milieu tamponné.
111
BHC6 BHL8 BHL23 BHL27
25
Diaméétre zone d'inhibitions(mm)
20
15
10
0
NT T NT T NT T
Pseudomona aeruginosa
Staphylococcus aureus
Escherichia Coli
Figure 59 : Activités inhibitrices des 4 souches lactiques vis-à-vis des souches pathogènes
testées en milieu tamponné (T) et non tamponné (NT).
3.6.3.2. Inhibitions due au peroxyde d’hydrogène
Le peroxyde d'hydrogène secrété par les bactéries lactiques peut être dégradé par l'enzyme
catalase présente chez certaines espèces bactériennes.On constate que les souches BHL 27
(Lactobacillus plantarum), BHL 23 (Lactobacillus plantarum), BHL8 (Lactobacillus brevis) et
BHC6 (Pediococcus acidilactici) sont actives en présence de l’enzyme.Cette activité s’est traduite
par l’apparitionde zones indiquant un autre facteur d’inhibition autre que le peroxyde d’hydrogène.
A ce stade de notre étude, la combinaison entre l’inhibition due à la production d’acide

organique et le peroxyde d’hydrogène montre que pour les souches BHC6 et BHL27, l’inhibition
est due à l’acidité uniquement, quant aux autres souches l’inhibition peut être due à un agent
inhibiteur type bactériocine.
3.6.3.3. Inhibition due aux phages lysogènes
Le test des phages s’est révélé négatif pour l’ensemble des souches. Aucune plage de lyse
n’est apparue indiquant que l’inhibition antimicrobienne était due à la lysogénie.
112
3.6.3.4. Inhibition due aux bactériocines
La production des substances antimicrobiennes type bactériocine est un facteur de l’activité

inhibitrice des bactéries lactiques. Afin de déterminer la nature des agents inhibiteurs, les souches
retenues (BHC6, BHL8, BHL23 et BHL27) ont été traitées par la méthode de Fleming et al.(1975
par deux enzymes protéolytiques (trypsine et α-chymotrypsine) préparées dans du tampon
phosphate de sodium à pH7. Les résultats obtenus et représentés dans la figure 60 et le tableau 22
(Annexe 2) montrent une absence totale de la zone d’inhibition révélant ainsi que la substance
inhibitrice est de nature protéique.
Figure 60 : Effets des différentes enzymes
Le traitement de nos souches à différentes températures permet de définir la classe à laquelle

appartiennent les bactériocines.
Les surnageants soumis aux traitements thermiques 80°C et 100°C pendant 15 et 30mn
n’ont pas résistés à ces températures. Aucune inhibition n’a été détectée indiquant que la
bactériocine appartient à la classe III.
La mise en évidence de l’activité antibactérienne de nos isolats lactiques a été étudiée par la
méthode directe de Fleming et al., ( 1975) contre des germes pathogènes ou/et d’altérations d’une
part et d’autre part par la méthode indirecte afin d’évaluer l’effet des surnageants des cultures
lactiques
Cette méthode a permis de réaliser un screening des bactéries antagonistes. Tous nos isolats
testés contre les germes pathogènes Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC
25922 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ont montrés des zones d’inhibitions importantes
113
indiquant un fort pouvoir inhibiteur. Cette activité inhibitrice est aussi bien dirigée contre les
bactéries pathogènes à Gram positif qu’à Gram négatif.
D’après nos résultats, on constate que tous les isolats ont inhibés la croissance de
Staphylococcus aureus à 100%.En revanche, plusieurs isolats appartenant à Lactobacillus (8) et aux
coques(2) sont inactifs vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli.
Les inhibitions pourraient être dues à la production des composés antimicrobiens (acide
organiques, H2O2 et/ou bactériocines) produits par les bactéries lactiques (Ammoret al,.2006).
Afin d’éliminer la possibilité d’un antagonisme vis-à-vis des bactéries pathogènes parla
production d’acide organique, l’emploi d’un milieu de culture tamponné (tampon phosphate de
sodium 0,1M, pH7) est testé selon la méthode de Fleming et al., (1975).L’utilisation du milieu
tamponné aide à stabiliser le pH et à éliminer l’effet de l’acidité dû à la production d’acide lactique
(Labioui et al., 2005).La comparaison des résultats entre le milieu tamponné et non tamponné
indique des levées d’inhibitions dans 10,25% des cas.
Dans 62,4% des cas, les inhibitions persistent mais les diamètres des zones d’inhibitions
diminuent. On remarque que l’activité antagoniste des bactéries lactiques contre les souches
pathogènes est due essentiellement à la diminution du pH résultant de la production des acides
organiques. Par ailleurs, dans certains cas (11,11%), en milieu tamponné, le diamètre d’inhibition
augmente au lieu de diminuer. Par exemple, le cas d’E.coli inhibé par BHL24 dont le diamètre
d’inhibition est de15mm en milieu non tamponné augmenteen milieu tamponné (18mm).Cela nous
montre que l’acidité du milieu peut influer sur le potentiel inhibiteur (Rossland et al., 2005).
Pour la suite de notre travail, nous avons sélectionnés 15 isolats lactiques qui ont été soumis
à une identification par MALDI-TOF MS. Quatre souches ont été identifiés comme suit :
Lactobacillus plantarum codé BHL23 ; Lactobacillus plantarum codé BHL27 ; Lactobacillus
brevis codé BHL8 et Pediococcusacidilactici codé BHC6. Nous avons étudié l’activité antagoniste
de ces quatresouches lactiques par la méthode de Fleming et al, (1975) vis-à-vis des trois bactéries
pathogènes Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853.
Les résultats montrent que les cultures bactériennes de nos 4 souches lactiques possèdent un
pouvoir inhibiteur important dont les diamètres d’inhibition varient de 10 à 23mm suivant les
espèces pathogènes testées.La souche BHC6 possède le diamètre d’inhibition le plus important, car
elle a inhibé la croissance de Stapylococcusaureus avec un diamètre de 23mm. En revanche, la
souche BHL23 a montré une zone d‘inhibition de 10mm. Nos souchesprésentent un fort potentiel
114
antagonistecontre lesbactéries testées aussi bien à Gram positif qu’à Gram négatif. Ces bactéries
pathogènes sont parmi les germes principalement impliqués dans les toxi-infections alimentaires et
au cours de la fabrication des produits fermentés et de leur conservation. Les activités inhibitrices
entre les isolats lactiques et les bactéries pathogènes nous ont permis de remarquer que les
diamètres des zones d’inhibitions varient selon l’espèce (Prioult, 2003).Ces inhibitions peuvent être
dues au pH, au milieu de croissance, à la production de substances antimicrobiennes comme les
acides organiques, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines.
Les bactéries lactiques produisent de l’acide lactique pendant leur croissance. Ce métabolite
antibactérien modifie le pH du milieu et peut agir sur la croissance des bactéries cibles testées. Ces
dernières sont des bactéries pathogènes ou d’altérations que l’on rencontre fréquemment dans les
aliments tels que Staphylococcus aureus et E.coli.L’emploi d’un milieu tamponné révèle des levées
d’inhibitions dans le cas de la souche Lactobacillus plantarum(BHL27) vis-à-vis d’E.coli et de
Pediococcus acidilactici (BHC6) vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa.L’absence des inhibitions
des souches BHC6 et BHL27 en milieu tamponné suggère que ces dernières sont dues à la
production de l’acide lactique suite à l’abaissement du pH.
En effet, l’activité antibactérienne de l’acide lactique s’explique par la capacité à pénétrer

sous sa forme non dissociée à travers la membrane cytoplasmique perturbant ainsi le maintien du
potentiel de membrane et inhibant les systèmes membranaires de transport actifs (Alakomi et al.,
2007).De plus, Servin (2004) et Tejero-Sarinena et al (2012 ),ont souligné que l’acide lactique agit
comme un agent perméabilisant de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Pour les
autres souches, les halos d’inhibitions diminuent en milieu tamponné.Dans ce cas, on peut dire que
l’inhibition est partiellement attribuée à l’acide lactique.Cette diminution du pH peut donc affecter
la viabilité des pathogènes bactériens (Bruno et Shah, 2002 ; Servin, 2004). D’après DeVuyst et
al.(1994), les bactéries lactiques sont capables de produire et d’excréter des substances inhibitrices
autres que l’acide lactique ou l’acide acétique.
La multiplication de certaines cultures lactiques entraîne la production de peroxyde

d’hydrogène considéré comme inhibiteur de la croissance bactérienne. (Juillard et al., 1987). Le
peroxyde d'hydrogène secrété par les bactéries lactiques peut être toxique pour les bactéries
lactiques. L’emploi de la catalase (élimination de l’effet duH2O2) a été actifs vis-à-vis des
pathogènes testés. Ces résultats suggèrent la présence d’autres facteurs inhibiteurs. Ceci nous a
conduits à vérifier la nature de l’agent inhibiteur type bactériocine. D’après Song et Richard,
(1997), l’élimination de l’effet des acides organiques favorise plutôt l’activité antimicrobienne telle
que celle des bactériocines.
115
La perte de l’activité antimicrobienne après traitement par les enzymes protéolytiques

indique la sensibilité des composés actifs sécrétés par les souches à l’action des enzymes. Nos
résultats suggèrent que les substances inhibitrices produites par nos souches sont de nature
protéique. Le traitement thermique n’a révélé aucune activité résiduelle indiquant ainsi que les
substances sécrétées sont sensibles à la chaleur .L’activité antagoniste des souches est due à une
substance de nature protéique type bactériocine sensible à la chaleur.
Plusieurs facteurs peuvent avoir un effet sur l’activité antimicrobienne parmi lesquelles
l’interaction entre la bactérie et les constituants cellulaires ou du milieu de croissance, de la pureté
et de la croissance de l’enzyme et enfin de la technique employée pour détecter la sensibilité
enzymatique (Ness et al., 1996).
Selon Klaenhammer (1988), trois critères sont indispensables pour qu’une substance
antimicrobienne soit définie comme bactériocine : la présence d’une partie biologiquement active
de nature protéique, un spectre d’activité inhibiteur étroit limité aux espèces taxonomiquement
proches ou occupant la même niche écologique et un mode d’action bactéricide. Les substances
antimicrobiennesproduites par les souches bactériennes isolées du hamoum répondent aux critères
retenus par Klaenhammer (1988), à savoir que nos souches possèdent une activité antimicrobienne
qui est due à l’acidité et à un agent de nature protéique type bactériocine et sensibles à la chaleur.
Les substances produites par nos souches appartiennent à la classe III.
Globalement, l’activité antimicrobienne élevée présente dans notre travail confirme les
résultats de nombreux travaux indiquant les effets inhibiteurs de Lactobacillus plantarum et
Lactobacillus brevis contre des germes pathogènes résistants aux antibiotiques appartenant à E.coli,
S.aureuset P. aeruginosa (Benmechernene et al., 2013 ; Kermanshahiet al., 2014 et Chang et
al.,2016).La production de bactériocine a également été rapporté chez Lb.brevis (Mohankumar et
Murugalatha, 2011;Koo et al., 2015).
Messi et al. (2001), ont rapporté que la bactériocine produite par Lactobacillus plantarum,
plantaricine 35d a une forte action bactériocinogène contre S.aureus et L.monocytogenes. De même,
Lash (2005) a décrit une bactériocine produite par Lactobacillus plantarum ATCC 8014 qui inhibait
S.aureus, E. coli, L.innocua et P.aeruginosa). Millette et al. (2007), ont identifié une bactériocine
produite par P.acidilactici MM33.
Nos résultats sont en accord avec ceux trouvés par d’autres auteurs qui ont montré que les
bactéries à effet probiotique sont capables d’empêcher la croissance des bactéries pathogènes in
vivo et in vitro (Lin et al.,2007; Mahdhi et al., 2010b). La recherche de bactériocines s’avère
116
intéressante pour remplacer les conservateurs qui sont des produits chimiques de synthèse.
Cependant, ces derniers ne sont pas sans risques pour la santé. En effet, les aliments doivent être
surs, nutritionnellement équilibrés, pratiques à utiliser, avoir bon goût, etc. mais ils sont sujets à la
détérioration causée, entre autres, par des microorganismes (bactéries, moisissures, levures). Les
bactéries productrices de substances inhibitrices s’avèrent les candidats les mieux placés pour
préserver les aliments d’une part, et d’autre part pour la réduction des intoxications alimentaires
dues aux bactéries nuisibles. Ces propriétés peuvent se réaliser par l’exploitation des potentialités
des bactéries lactiques capables de produire diverses substances dotées de propriétés
antimicrobiennes.
3.7. Etude du potentiel probiotique des souches lactiques
La survie des bactéries lactiques aux conditions du tube digestif représente un critère de
sélection des souches probiotiques.C’est la raison pour laquelle nous avons testé ces deux
paramètres afin de vérifier si nos souches seraient de bons candidats probiotiques.
3.7.1. Tolérance à l’acidité
La résistance à l’acidité est l’une des caractéristiques recherchées lors de la sélection des
bactéries probiotiques. Elle est basée sur la survie des bactéries comptées principalement par
dénombrement sur milieux gélosés après exposition simulant les conditions gastriques. Les résultats
obtenus ont été calculés selon l’équation suivante :
Taux de survie (%) = log UFC à T (3h) /log UFC T (0h) * 100
L’ensemble des souches a donné une bonne résistance aux conditions acides (Figure 61).
A pH 2,5, seule la souche Lactobacillus brevis (BHL8) présente un taux de survie de 63,6% par
rapport aux souches Lactobacillus plantarum (BHL27, BHL23) dont les valeurs sont
respectivement de 99,41% et 98%. La souche Pediococcus acidilactici (BHC6) a atteint un
pourcentage de 92,33%.
A pH 4,5 qui représente le pH de l’estomac au moment ou juste après le repas, la souche L.

plantarum (BHL23) présente un taux de survie supérieur à 100%. A ce même pH, les taux de
croissance ont augmenté de 16,41% pour la souche BHL8, de 0,12% pour BHC6, 6,06% pour
BHL23 et 0,79% pour BHL27.
117
A pH 6,5, les souches BHL23et BHL27ont montré une grande proportion de cellules viables
malgré une légère diminution. Les souches BHL8et BHC6 présentent une augmentation non
négligeable de leur taux de survie.
pH=2,5 pH=4,5 pH=6,5

120
Taux de survie en %
100
80
60
40
20
0
BHL8
BHC6
BHL23
BHL27
Figure 61 : Tolérance à l’acidité des souches lactiques
3.7.2. Tolérance aux sels biliaires
La résistance aux sels biliaires a été évaluée in vitro avec des cultures en présence de
différentes concentrations en sels biliaires (0,3%, 0,5% et 1%) dans du milieu MRS. La technique
utilisée est la même que pour la résistance à l’acidité. Les résultats ont été calculés selon l’équation
ci-dessous :
Taux de survie (%) = log UFC à T (3h) /log UFC T (0h) * 100
D’après les résultats obtenus (Figure 62), on constate que toutes les souches montrent une
viabilité élevée en présence de toutes les concentrations testées en sels biliaires.
A pH 2.5 et 0.3% de sels biliaires, le taux de survie est sensiblement le même pour les
souches BHL8 et BHC6 par rapport au témoin, excepté la souche BHL27 qui montre une résistance
qui dépasse les 100%. La souche BHL23 montre une légère augmentation de la résistance aux sels
biliaires par rapport aux souches BHL8 et BHC6.
A pH 2,5 et 0,5%, le taux de survie des souches BHL8 et BHC6est pratiquement le même
par rapport à celui observé à 0.3% et aux témoins. En revanche, la souche BHL23 enregistre un taux
118
de résistance bas par rapport au témoin et aux autres souches. La souche BHL27 possède le taux de
résistance le plus important.
A pH 6,5 et 0,3% de sels biliaires, les souches BHL8 et BHL27 possèdent les mêmes taux
de résistance et s’alignent sur les taux témoins.Les souches BHL23 et BHL27enregistrent
également un taux important de croissance des cellules.
A pH 6,5 et 0,5% de sels biliaires, les souches BHL8 et BHL27 ont des taux de résistance
sensiblement identiquesaux témoins. Le taux de résistancede la souche BHC6 est très important par
rapport à l’ensemble des souches et au témoin. Par ailleurs, la souche BHL23 possède une bonne
croissance.
A pH 2,5 et 1% de sels biliaires, la viabilité des cellules bactériennes a sensiblement baissé

chez la souche BHL8. Néanmoins, on remarque une certaine stabilité des taux de survie des souches
BHL23 et BHC6.La croissance en présence de sels biliaires de la souche BHL27 est supérieure par
rapport au témoinsans sels biliaires.
0% pH=2,5 0% pH=6,5 0,3% pH=2,5 0,3% pH=6,5

0,5% pH=2,5 0,5% pH=6,5 1% pH=2,5 1% pH=6,5
140
Taux de survie des sels biliaires en %
120
100
80
60
40
20
0
BHL8 BHC6 BHL23 BHL27
Figure 62 : Tolérance des sels biliaires des souches lactiques.
A pH 6,5 et 1% en sels biliaires, toutes les souches présentent une croissance stable durant
les 3h d’incubation.
Les résultats montrent que les souches lactiques ont une capacité assez importante à croître
dans des concentrations élevées en sels biliaires.
119
L’étude de la survie des bactéries lactiques dans le tractus gastro-intestinal est important
pour une meilleure connaissance du devenir des bactéries lactiques ingérées avec l’aliment et une
meilleure compréhension de l’action des probiotiques chez l’homme et l’animal. Pour exercer un
effet probiotique significatif, les bactéries doivent arriver vivantes et en nombre suffisant dans
l’intestin (Drouault et Corthier., 2001). En effet, pour que la flore lactique puisse atteindre vivante
le gros intestin, il faut franchir certaines barrières telles que l’acidité gastrique, le pouvoir
bactéricide des sels biliaires etc.
Le critère essentiel dans la sélection d’un microorganisme potentiel probiotique est sa

capacité d’atteindre, de survivre dans le tractus digestif et notamment aux pH acides et aux sels
biliaires. C’est la raison pour laquelle nous avons testés ces deux paramètres afin de vérifier si nos
souches seraient de bons candidats probiotiques.
Globalement, toutes les souches bactériennes du hamoum présentent une bonne viabilité aux
pH acides pendant les 3h d’incubation, cette durée reflète la durée moyenne du temps passé par les
aliments dans l’estomac (Argyryet al., 2013). Ceci suggère qu’elles ont la capacité de traverser
l’acidité stomacale et peuvent atteindre facilement le milieu intestinal où elles pourraient s’y
multiplier.
D’après nos résultats, Il apparaît que larésistance à l’acidité des quatre espèces bactériennes
étudiées varie selon la souche et le pH. En effet, on remarque que Lactobacillusplantarum est la
souche la plus résistante aux conditions gastriques, ce qui est en adéquation avec les résultats
d’étude portant sur cette espèce (Hamon et al., 2011). Quant à Lactobacillus brevis, celle-ci
présente une bonne tolérance à l’acidité, mais elle reste néanmoins en dessous de celle de Lb.
plantarum qui dans l’ensemble dépasse les 100% après 3h d’incubation. Selon Hartke et al.(1996)
et Takahashi et al.(2004), la résistance à l’acidité n’est pas acquise suite à une diminution du pH
mais elle est souche dépendante.
De même, la plupart des bactéries lactiques comme les lactobacilles et les streptocoques sont
naturellement bien adaptés à un pH acide, elles sont capables non seulement de produire des acides
mais de fonctionner à pH acide. Nos résultats montrent également que les pediocoques et en
particulier l’espèce P. acidilactici possèdent un taux de survie élevé de 96.2%, ceux-ci sont en
accord avec ceux trouvés par Millette et al, (2007). La survie à pH3, après 2 à 4h d’incubation est
considérée comme le seuil optimal pour les souches probiotiques (Chou et Weimer, 1999).
Des études ont montrées que les lactobacilles d’origine animale ou alimentaire ont la
capacité de conserver leur viabilité à des pH compris entre 2,5 et 4,0 (Maragkoudakis et al., 2006 ;
120
Xanthopoulos et al., 2000). D’après nos résultats, on peut dire que nos souches lactiques isolées du
hamoum Lactobacillusplantarum, Lactobacillus brevis et Pediococcus acidilactici pourraient être
de bons candidats probiotiques.
Cependant, ce type de test est largement utilisé pour le criblage de souches à potentiel
probiotique mais il présente une certaine limite. Ainsi, le dénombrement par culture sur gélose ne
détermine que les cellules cultivables et sous-estime le nombre réel de cellules vivantes. Cependant,
malgré cette limite, les études comparatives comme réalisées ici nous donnent une idée préliminaire
de la résistance relative des souches aux conditions gastriques.
La tolérance à la bile est l’une des caractéristiques recherchées lors de la sélection des
bactéries probiotiques. Les bactéries doivent transiter via le duodénum en plus grand nombre de
cellules viables pour atteindre le site d’action et se multiplier. A ce niveau, certains composants de
la bile, notamment les acides biliaires comme l’acide cholique compromettent la viabilité des
bactéries ingérées.
La capacité de survie peutêtre modifiée par la présence de la bile qui peut provoquer un
stress chez les cellules sensibles. Contrairement, à l’acidité qui s’estompe après le passage
gastrique, l’action de la bile persiste plus longtemps (Singhal et al., 2010). Ainsi, après leur passage
dans l’estomac les bactéries sont confrontées, à l’action délétère des sels biliaires. Ils constituent
une barrière à franchir par les bactéries probiotiques pour gagner leur site d’action.
Les résultats obtenus pour le test de la tolérance aux sels biliaires, montrent que toutes les
souches sont capables, non seulement de survivre dans le milieu MRS solide additionné de la
solution de sels biliaires mais peuvent aussi y croître. Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés
par Bouzaine et al. (2004) qui ont montré une tolérance et une croissance de certaines souches de
Lactobacillus spsur le milieu MRS-agar additionné de la solution d’Oxgall à 0,3%. Nous avons noté
cependant, que le suc biliaire exercerait un effet variable sur la croissance des différentes souches
testées.
Globalement, les souches de L. plantarum se sont révélées légèrement plus tolérantes aux
sels biliaires par rapport à L.brevis. Cette tendance rappelle celle obtenue pour la résistance à
l’acidité, ce qui suggère des capacités relatives analogues pour les souches à lutter contre les deux
stress environnementaux.
Selon Gowri et Ghost, (2010), le taux normal de sels biliaires dans l’intestin est d’environ
0.3%. A cette concentration, toutes les souches testées se sont révélées tolérantes aux sels biliaires.
On remarque, néanmoins que l’augmentation de la concentration de la bile s’accompagne d’une
121
légère diminution du taux de croissance des cellules à pH 2,5. Cette résistance des lactobacilles aux
sels biliaires est due au fait quela bile joue un rôle majeur dans l’émulsification des lipides et
facilite ainsi leur digestion. Elle est également capable d’affecter l’intégrité cellulaire des bactéries
en agissant sur leur membrane plasmique (Begley et al., 2005).
Pour survivre aux effets délétères de la bile, les bactéries lactiques possèdent des hydrolases
de sels biliaires (BSH) qui aide à hydrolyser la bile conjuguée et lesquels ont par ailleurs été
suggérées comme étant des marqueurs spécifiques témoignant d’une adaptation à la niche
intestinale (O'Sullivan et al., 2009).
Ces enzymes sont indispensables à la tolérance à la bile chez Lb. plantarum et Lb. Salivarius
(Fang et al., 2009;Lambertet al., 2008). Par ailleurs, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus
plantarum sont capables de percevoir la présence de bile dans leur environnement et de répondre en
induisant la synthèse de protéines de surface (Bron et al., 2004; Bron et al., 2006; Pfeiler et
Klaenhammer., 2009).
Selon Usmann (1999), la survie des souches probiotiques à pH 3,0 et à une concentration de
0,1% de sels biliaires après 2h d’incubation est considérée comme une tolérance optimale. En
comparaison avec nos résultats, on constate que nos souches sont très performantes à la tolérance
des sels biliaires puisque toutes les souches ont résisté aux concentrations de 0,1% de sels biliaires
après 3h d’incubation.La résistance à l’acidité et la croissance en présence de la bile des
souchessuivent la même tendance,elles montrent une meilleure survie en milieu acide et de bonnes
croissances en présence de bile.
On remarque que les deux paramètres testés suivent la même corrélation. En effet, les
souches possèdent un comportement similaire face à l’acidité et la bile. Ceci est dû aux
caractéristiques des souches qui leur confèrent une bonne croissance en présence de la bile et une
bonne tolérance à l’acidité.
Cependant, une étude utilisant un criblage génétique pour estimer le potentiel probiotique a
été effectué au sein d’une collection de bactéries isolées de différents aliments fermentés. Celle-ci a
montré la présence d’un équipement génétique favorable à la survie du passage du tractus digestif
puisque plus de 90% d’entre-elles possèdent 7 des 12 gènes impliqués dans la résistance à pH acide
et possèdent 7 des 9 gènes impliqués dans la survie aux sels biliaires.Toutefois, cette distribution
des gènes impliqués dans la survie est très variable (Turpin ,2011).
122
3.7.3. Détermination des profils de résistance des antibiotiques des souches de bactéries
lactiques.
La résistance aux antibiotiques a été réalisée pour nos quatre souches lactiques vis-à-vis de
onze antibiotiques. Ces derniers appartiennent à différentes familles dont les β-lactamines
(l’amoxicilline AX, l’amoxicilline +l’acide clavulanique AMC ; la fosfomycine FOS, et la
céfalotineCF), les aminoasides (la gentamycine CN et la néomycine NE) ; les macrolides
(l’érythromycine E et la pristinamycine PT) ; les tétracyclines (TE) et les fluoroquinolones
(l’ofloxacineOFXet la ciprofloxacine CIP). La mesure du diamètre des zones d’inhibitions de
chaque souche pour chacun des antibiotiques testés permet de définir les souches comme étant
résistantes ou sensibles.Nous avons considérés que le diamètre de 15mm est la limite entre la
résistance et la sensibilité (Karam et Karam, 1994) donc toutes nos souches qui ont un diamètre
inférieur à 15mm sont considérées comme étant des souches résistantes et celles qui possèdent un
diamètre supérieur à 15mm sont considérées comme sensibles.
Les résultats obtenus de l’antibiogramme sont regroupés dans le tableau 25 et illustrés dans
les figures 63 à 67.
Tableau25 : Antibiogramme des souches lactiques
Souches lactiques testées
Familles
des antibiotiques Charge
ATB
Symbole (µg) BHL27 BHL23 BHL8 BHC6
Amoxicilline AX 25 R R S R
Amoxicilline+Acide
β-lactamines AMC 20+10 R R S R
clavulanique
Céphalotine CF 30 R R R R
Fosfomycine FOS 30 R R R R
Gentamycine CN 10 R R R R
Aminosides
Néomycine NE 30 R R S R
Erythromycine E 15 R R S R
Macrolides
Pristinamycine PT 15 R R S R
Tétracycline Tétracycline TE 30 R R S R
Ofloxacine OFX 5 R R S R
Fluoroquinolones
Ciprofloxacine CIP 5 R R S R
Les bactéries lactiques sont d’une utilisation sûre dans les aliments fermentés, car elles sont
présentes dans le tractus gastro-intestinal humain, et elles sont aussi intentionnellement ajoutées à
123
l’alimentation. Des préoccupations ont été soulevées quant à la résistance aux antibiotiques chez ces
bactéries bénéfiques. Les antibiotiques sont des substances antimicrobiennes d’origine biologique
ou synthétique, utilisées comme médicaments pour empêcher la multiplication ou la destruction des
bactéries. La résistance bactérienne aux antibiotiques est naturelle mais peut-être acquise chez
certaines souches devenant résistantes après modifications de leur équipement génétique
chromosomique ou plasmidique.
Le développement de l’industrie des probiotiques constitue une des voies les plus
importantes pour la propagation des gènes de résistance entrainant ainsi une augmentation des
résistances multiples aux antibiotiques (Ammor et al., 2008 ; Darsanaki et al., 2013).
L’examen de l’antibiogramme permet de constater que Lactobacillus brevis présente une

sensibilité aux familles des β – lactaminesreprésentées par l’amoxicilline, et l’amoxicilline + l’acide
clavulanique ; aux macrolides représentépar l’érythromycine, pristinamycine ; aux cyclines
représentées par la tétracycline et aux familles des fluoroquinolonesreprésentées par l’ofloxacine,
ciprofloxacine.
La soucheLactobacillus brevis est sensible à huit antibiotiques sur onze testés. Ce résultat
est en accord avec des études ayant rapportées que les lactobacilles sont généralement sensibles aux
antibiotiques inhibiteurs de la synthèse des protéines comme le chloramphénicol, l’érythromycine,
et les tétracyclines (Temmerman et al., 2003 ; Coppola et al., 2005 ; D’aimmo et al., 2007) et aux
antibiotiques inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne telle que les β-lactamines comme
l’ampicilline, la pénicilline et l’oxacilline (Charteris et al., 1998b ; Ammor et al., 2007 ; Khöll et
al., 2008).
En ce qui concerne les deux souches de Lactobacillus plantarum, elles ont présenté une
résistance vis-à-vis des 11antibiotiques.
124
Figures 63& 64: Antibiogramme de la souche BHL8.
Figure 65 : Antibiogramme de la souche BHC6. Figure 66 : Antibiogramme de la souche BHL23.
Figure 67 : Antibiogramme de la souche BHL27
125
Les Lactobacilles sont résistants à la famille des β-lactamines et en particulier aux

céphalosporines de la première génération. Cette résistance a été démontrée dans des études
publiées (Swenson et al., 1990 ;Charteris et al., 1998b ; Delgado et al., 2005 ; Florez et al., 2005) et
présente un caractère intrinsèque (Coppola et al., 2005, Ammor et al., 2008 ).
En effet, l’utilisation anarchique des antibiotiques depuis un certain temps en particulier les
β-lactaminesa conduit à l’émergence de souches résistantes. Les gènes de résistance vis-à-vis de ces
antibiotiques sont souvent localisés sur des éléments mobiles facilement transférables entre les
bactéries même d’espèces différentes (Diallo et al., 2013).
Toutes nos souches excepté BHL8 sont résistantes aux antibiotiquesappartenant à la famille
des aminosides (gentamycine et néomycine) et aux macrolides (érythromycine et pristinamycine) et
aux fluoroquinolones (ciprofloxacine, l’ofloxacine) et aux tétracyclines. Ceci est en accord avec les
résultats obtenus par Coppola et al (2005) et Herreros et al (2005) pour les aminosides ; par Klare et
al (2007) et Belleti et al (2009), Toomey et al (2010) pour les macrolides ; par Kastner et al (2006)
et Ouaba et al (2008) pour les fluoroquinolones.
Les lactobacilles ont également une résistance intrinsèque à des inhibiteurs de la synthèse
des acides nucléiques comme le triméthoprime et les sulfamides (Charteris et al., 1998 ; Katla et al.,
2001 ; Ammor et al., 2008).
Les lactobacilles sont connus pour leurrésistance aux aminosides (Charteris et al., 1998b ;
Coppola et al., 2005 ; Zhou et al., 2005), celle-ci est intrinsèque et est attribuée à l’absence de
transport d’électron du cytochrome-médiation permettant l’absorptiond’antibiotiques(Charteris et
al., 2001).La résistance à la tétracycline est souvent attribuée à des plasmides ou à des transposons
chez de nombreuses espèces bactériennes.
La résistance de Lactobacillus plantarum (Ammor et al., 2008 ; Casodo Munoz et al., 2014᷉)
et Lactobacillus brevis (Fukao et al., 2012) aux antibiotiques s’est révélée principalement
intrinsèque et portée par des gènes chromosomiques non transférables entre les bactéries.
L’espèce Pediococcus acidilactici résiste à tous les antibiotiques testés. De nombreux

auteurs ont obtenus des résultats de résistance semblables pour (i) les β-lactamines (Swenson et
al., 1990 ; O’Connor et al., 2007 ; Ammor et al., 2008) ;( ii) les macrolides ( O’Connor et al. ;
2007 ; Ammor et al., 2007) ; (iii) à la tétracycline (Swenson et al.,1990 ;Toomey et al., 2010).
126
L’hétérogénéité des profils de résistance des souches lactiques peut-être due au genre auquel
appartient la bactérie, à l’état physiologique et à la nature des antibiotiques. En effet, les phases et
les vitesses de croissance des cellules peuvent entrainer des variations de résistance aux
antibiotiques (Dhar et McKinney, 2007). Par exemple, les β-lactamines sont actives seulement sur
les bactéries en croissance (Walsh, 2003). Cette résistance peut également avoir lieu par
l’imperméabilité de la paroi cellulaire et aussi, il se peut que la bactérie testée possède le gène de
résistance (Devirgilii et al., 2008).Enfin, le milieu de culture joue également un rôle dans le
résistance aux antibiotiques ; en effet Ammor et al. (2007) ont rapporté que le milieu MRS peut
inactiver certains antibiotiques.
Les bactéries lactiques utilisées comme probiotiques ont le potentiel de servir d’hôte de
gènes de résistance aux antibiotiques, ce qui augmente le risque de transmettre ces gènes aux
bactéries pathogènes de l’homme (Ammor et Mayo, 2007). C’est pour cela que les souches ayant un
potentiel probiotiques devraient être sélectionnées de la flore commensale de l’homme ou de
l’animal et ne devraient pas transporter de manière intrinsèque des caractères de résistance aux
antibiotiques. Cette résistance aux antibiotiques des souches ayant les critères probiotiques devrait
être rigoureusement évaluée afin de minimiser le risque de transfert horizontal.
127
CONCLUSION & PERSPECTIVES
Conclusion et perspectives
Actuellement, il existe un intérêt majeur pour l’amélioration de la qualité et de la sécurité

alimentaire par conséquent la demande des consommateurs pour les produits les moins transformés
et sans agents chimiques de conservation est en constante recrudescence.
Le « Hamoum » est un blé fermenté par la technique traditionnelle due au stockage

souterrain « Matmora ».Ce produit constitue un produit terroir que nos aînés utilisaient pour leur
consommation.
Au cours de ce travail, nous avons commencé notre étude par une identification
phénotypique des bactéries lactiques isolées à partir du « Hamoum ».A partir de 122 isolats prélevés
à partir des échantillons de blé fermenté, nous avons sélectionné 39 bactéries lactiques. Cette
identification classique a été réalisée à l’aide d’une étude morphologique, biochimique et
physiologique et elle nous a permis d’orienter nos bactéries vers 4 principaux genres :
Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus et Leuconostoc.
La distribution quantitative a permis de caractériser 27 bacilles et 12 coques. Parmi les

lactobacilles, 11 appartiennent à l’espèce Lactobacillus plantarum, 8 représentent l’espèce
Lactobacillus amylophilus, 3 appartiennent à l’espèce Lactobacillus brevis et 5 sont représentatifs
de l’espèce Lactobacillus casei. Les coques sont représentés par 4 espèces Pediococcus acidilactici
et 2 Pediococcus pentosaceus, 3 Leuconostoc mesenteroïdes sp mesenteroïdes et 3 Enterococcus
faecium. Cette distribution montre une diversité de la flore lactique dont Lactobacillus plantarum
est l’espèce dominante.
L’étude des interactions entre bactéries lactiques, mise en évidence par la méthode de
Fleming et al., (1975) a montré 88,90% d’inhibitions et 11,10% d’absence d’inhibition. Les
inhibitions inter-géniques enregistrent un taux de 98,60%. Toutefois, nous remarquons que les
inhibitions exercées par les lactobacilles contre les lactobacilles sont plus importantes à celles
exercées contre les coques. Après ce screening, nous avons retenus 7 isolats lactiques en tant que
bactéries indicatrices et 14 isolats en tant que bactéries inhibitrices.Les résultats de ces interactions
ont montré que les lactobacilles possèdent un effet inhibiteur non négligeable selon les indicatrices
testées. L’emploi du milieu tamponné a permis de détecter les inhibitions dues à l’acidité dont le
taux est de 11,34% et celles dues à la production de substances (H2O2 et/ou bactériocine) est de
88,66%. Cette étape nous a permis de différencier nos bactéries ayant un fort pouvoir inhibiteur
127
comme BHL27, BHL22, BHL23, BHL17, BHC10, BHL3 et BHL8 et celles qui ont été les moins
inhibitrices comme BHL24 et BHL25.
L’activité inhibitrice des isolats lactiques vis-à-vis des 3 souches pathogènes Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 97853 par
la méthode de Fleming et al., (1975)) a montré que 91,45% des isolats du blé fermenté possèdent
une activité inhibitrice vis-à-vis de bactéries cibles à Gram+ et à Gram-.Parmi ces bactéries, nous
avons retenus 90,66% des isolats ayant un diamètre des halos > à 10mm. Un taux de 62,4 % des
inhibitions dues à la diminution des diamètres des halos a été déterminé par l’emploi d’un milieu
tamponné. En revanche, aucune activité inhibitrice n’a été constatée par la méthode indirecte
(Barefoot et Klaenhammer1983).
Quatre souches ont subi une identification protéomique par MALDI-TOF MS avec de bons
scores.Les spectres et les pics générés ont permis de les identifier au rang de genre et d’espèce. Il
s’agit de : 2 souches appartenant à l’espèce Lactobacillus plantarum (BHL23, BHL27), 1 souche à
Lactobacillus brevis (BHL8) et 1 souche à Pediococcus acidilactici (BHC6).
L’activité antimicrobienne des 4 souches lactiques identifiées par MALDI-TOF MS a été

étudiée vis-à-vis des3 souches pathogènes suivant la méthode de Fleming et al (1975). Les souches
lactiques ont montrés un large spectre d’inhibition vis-à-vis des germes pathogènes. L’utilisation
d’un milieu tamponné a permis de constater des levées d’inhibitions deLactobacillus plantarum
(BHL27) vis-à-vis d’E.coli et de Pediococcus acidilactici vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa.
En ce quiconcerne les autres souches, nous avons observé une diminution de l’activité
antibactérienne.Les inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène, mise en évidence par
traitement à la catalase sont présentes chez les 4 souches.La caractérisation de la nature de l’agent
inhibiteur a été réalisée par le traitement avec des enzymes protéolytiques (trypsine et α-
chymotrypsine). L’absence d’inhibition nous permet de conclure que les inhibitions produites par
nos 4 souches vis-à-vis des bactéries pathogènes sont dues à la production de substance type
bactériocine.
La tolérance à l’acidité pH (2,5 ; 4,5 et 6,5) et aux sels biliaires (0.3%,0.5% et 1%) des 4
souches a été mise en évidence selon la méthode d’Hydrominus et al (2000).Les résultats fournis
par l’étude in vitro des aptitudes probiotiques ont montré une résistance remarquable à l’égard des
conditions hostiles testées.
Les profils de résistance aux antibiotiques ont montré que les souches Lb.plantarum et P.
acidilactici possèdent une polyrésistance aux antibiotiques testés excepté Lb. brevis qui est sensible
128
aux ATB appartenant aux familles des macrolides, des aminosides sauf la gentamycine, des β-
lactamines sauf la céphalotine et la fosfomycine, des tétracyclines et des fluoroquinolones.
Les souches étudiées présentent in vitro des propriétés probiotiques intéressantes telle que le
pouvoir antibactérien, la production de substances type bactériocine et enfin la tolérance aux stress
acide et aux sels biliaires.
Toutefois, cette étude est un point de départ pour approfondir et caractériser les propriétés
biotechnologiques des bactéries lactiques du blé fermenté. De plus, ces informations pourraient être
utilisées dans l’élaboration d’un programme de recherche afin d’identifier et de sélectionner des
souches probiotiques à des fins thérapeutiques.
Ces résultats offrent des perspectives et peuvent être compléter par
 La purification des bactériocines ;
 l’étude des propriétés de ces bactériocines ;
 Elargir la gamme des souches pathogènes testées ;
 Compléter l’étude probiotique (hydrophobicité, adhésion aux cellules).
129
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169
ANNEXES
ANNEXES
Annexes
Annexe 1
Milieux de cultures:
Milieu M17( Terzaghi et Sandine)
Pour 1 litre de milieu :
Tryptone.........................................................................................2,50 g
Peptone pepsique de viande...........................................................2,50 g

Peptone papaïnique de soja ...........................................................5,00 g
Extrait autolytique de levure...........................................................2,50 g
Extrait de viande ............................................................................5,00 g
Lactose ...........................................................................................5,00 g
Glycérophosphate de sodium .......................................................19,00 g
Sulfate de magnésium ....................................................................0,25 g
Acide ascorbique ............................................................................0,50 g
Agar agar bactériologique.............................................................15,00 g
pH 7,2
Stérilisation à 120°C pendant 20mm
Gélose MRS(pH 6,5)
Pour 1 litre de milieu :
Peptone ...................................................................................................10g
Extrait de viande ....................................................................................10g
Extrait de levure .......................................................................................5g
Glucose ...................................................................................................20g
Tween80..................................................................................................1ml
Phosphatebipotassique ......................................................................... …2g
Acétate de sodium .................................................................................. .5g
Citrate d’ammonium ............................................................................... .2g
Sulfate de magnesium, 7 H2O ............................................................... 0.2g
Sulfate de manganèse, 4 H2O................................................................ 0.5g
Agar ........................................................................................................ 15g
Eau distillée qsp ................................................................................ 1000ml
Stérilisation par autoclavage à 120°C pendant 20 min.
170
ANNEXES
Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962).
Tryptone 10g
Extrait de levure 5g
Sccharose 100g
Glucose 5g
Citrate de sodium 1g
Gélatine 2,5g
Azide de sodium 0.0075g
Eau distillée qsp 1000ml
Agar 15g
pH7
Stérilisation par autoclavage à 120°C pendant 20minutes
Lait écrémé « Candia Silhouette »
Utilisé pour la préparation du milieu de Sherman
Lait écrémé …………………………………… 100g
Eau distillé….…………………………………….1000 ml
Autoclave120°C pendant 10 minutes
Lait bleu de Sherman :
Lait écrémé…… 100ml
Bleu de méthylène à 1% 1ml
Stérilisation par autoclavage à 120°C pendant 10minutes
171
ANNEXES
Solution tampon
La solution tampon est obtenue par le mélange de deux solutions A et B
Solution A
KH2 PO4 5,44g
Eau distillée 200ml
Solution B
Na2PO4 11 ,36g
Eau distillée 400ml.
172
ANNEXES
Annexe 2
Tableau 17 : Résultat de l’acidité produite par les souches lactiques durant 24h
d’incubation
0h 2h 4h 6h 24h
pH D° pH D° pH D° pH D° pH D°
BHC6 6.67 12,5 6.42 15,5 6.42 23 6.31 26,5 5.21 53
BHL8 6.67 12,5 6.54 16 6.45 17 6.33 18 6,05 37
BHL23 6.67 12,5 6.49 16,7 6.47 22 6.4 26 5.8 43
BHL27 6.67 12,5 6.48 15,3 6.44 17 6.4 20 6,2 29
Tableau 18 : Interactions entre genre des bactéries lactiques en milieu solide

Lb plantarum Lb brevis
Ind
BHL1 BHL BHL BHL1 BHL BHL1 BHL BHL BHL BHL BHL BHL BHL BHL
Inh
2 13 14 5 16 7 18 19 20 21 22 1 2 3
BHL1
10,0 12,0 5,0 10,0 0,0 9,0 9,0 10,0 9,0 8,0 8,0 9,0 15,0 0,0
2
Lb BHL1
plantarum 10,0 9,0 12,0 0,0 0,0 12,0 7,0 12,0 10,0 10,0 11,0 10,0 15,0 0,0
3
BHL1
10,0 10,0 10,0 5,0 15,0 10,0 5,0 11,0 10,0 10,0 11,0 5,0 5,0 12,0
4
BHL1
8,0 10,0 10,0 12,0 12,0 7,0 7,0 11,0 10,0 11,0 12,0 10,0 12,0 15,0
5
BHL1
7,0 16,0 5,0 0,0 5,0 6,0 9,0 10,0 11,0 13,0 14,0 10,0 12,0 16,0
6
BHL1
10,0 17,0 8,0 15,0 12,0 5,0 10,0 12,0 11,0 5,0 5,0 10,0 10,0 17,0
7
BHL1
10,0 16,0 9,0 0,0 7,0 12,0 10,0 10,0 9,0 10,0 10,0 10,0 15,0 0,0
8
BHL1
12,0 15,0 10,0 0,0 8,0 5,0 11,0 13,0 9,0 12,0 5,0 5,0 0,0 0,0
9
BHL2
8,0 16,0 7,0 11,0 9,0 0,0 11,0 12,0 11,0 12,0 10,0 6,0 10,0 10,0
0
BHL2
9,0 17,0 5,0 10,0 6,0 12,0 10,0 13,0 12,0 11,0 11,0 5,0 0,0 5,0
1
BHL2
12,0 16,0 6,0 6,0 7,0 0,0 12,0 10,0 12,0 12,0 12,0 6,0 10,0 0,0
2
BHL
Lb brevis 5,0 7,0 8,0 5,0 5,0 5,0 0,0 0,0 7,0 0,0 5,0 6,0 10,0 5,0
1
BHL
0,0 0,0 7,0 6,0 5,0 0,0 0,0 0,0 9,0 0,0 5,0 7,0 9,0 8,0
2
BHL
5,0 0,0 0,0 7,0 5,0 0,0 0,0 0,0 5,0 6,0 5,0 10,0 7,0 5,0
3
173
ANNEXES
Lb: Lactobacillus; Ind : indicatrice ; Inh: inhibitrice

Les diamètres des zones d’inhibitions sont exprimés en mm
Tableau 18a
Ind Lb amylophilus Lb casei

BHL BHL BHL BHL BHL BHL BHL BHL2 BHL2 BHL2 BHL2 BHL2
Inh BHL 4
5 6 7 8 9 10 11 3 4 5 6 7
BHL4 12,0 15,0 4,0 6,0 6,0 7,0 15,0 6,0 12,0 7,0 20,0 16,0 13,0
BHL5 15,0 4,0 5,0 7,0 10,0 10,0 16,0 9,0 12,0 15,0 16,0 15,0 5,0
Lb
amylophilus BHL6 6,0 17,0 5,0 12,0 6,0 7,0 11,0 12,0 10,0 7,0 15,0 9,0 7,0
BHL7 7,0 15,0 16,0 6,0 9,0 8,0 16,0 5,0 15,0 8,0 9,0 5,0 8,0
BHL8 15,0 15,0 17,0 9,0 7,0 9,0 10,0 9,0 10,0 12,0 5,0 6,0 9,0
BHL9 14,0 16,0 10,0 5,0 12,0 16,0 15,0 9,0 12,0 14,0 10,0 12,0 10,0
BHL1
9,0 12,0 10,0 10,0 12,0 7,0 12,0 6,0 14,0 14,0 11,0 11,0 11,0
0
BHL
10,0 10,0 24,0 10,0 5,0 14,0 15,0 15,0 10,0 12,0 15,0 16,0 17,0
11
BHL2
5,0 7,0 8,0 0,0 11,0 15,0 5,0 6,0 7,0 10,0 0,0 0,0 0,0
3
BHL2
Lb casei 8,0 6,0 9,0 5,0 12,0 10,0 12,0 15,0 8,0 5,0 0,0 0,0 0,0
4
BHL2
0,0 10,0 9,0 8,0 15,0 15,0 5,0 9,0 9,0 5,0 4,0 5,0 0,0
5
BHL2
6,0 0,0 0,0 9,0 10,0 12,0 9,0 10,0 10,0 0,0 5,0 5,0 10,0
6
BHL2
5,0 10,0 10,0 11,0 10,0 10,0 10,0 12,0 10,0 0,0 0,0 0,0 5,0
7
Tableau 18b.
Ind Pediococcus Enterococcus Leuconostoc
Inh BHC 4 BHC 5 BHC 6 BHC 7 BHC 8 BHC 9 BHC 1 BHC 2 BHC 3 BHC 10 BHC 11 BHC 12
BHL12 4,0 6,0 7,0 0,0 0,0 0,0 10,0 16,0 10,0 9,0 6,0 9,0
BHL13 5,0 0,0 8,0 0,0 0,0 0,0 5,0 4,0 4,0 6,0 8,0 6,0
BHL14 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 9,0 5,0 5,0 8,0 8,0 0,0
BHL15 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 8,0 4,0 0,0 4,0 6,0 6,0 6,0
Lb plantarum
BHL16 0,0 5,0 0,0 0,0 5,0 8,0 5,0 15,0 4,0 9,0 9,0 9,0
BHL17 0,0 5,0 0,0 0,0 0,0 7,0 9,0 5,0 7,0 7,0 8,0 8,0
BHL18 5,0 6,0 7,0 0,0 0,0 7,0 8,0 9,0 10,0 8,0 8,0 7,0
BHL19 5,0 7,0 5,0 0,0 5,0 6,0 0,0 16,0 9,0 10,0 7,0 5,0
BHL20 4,0 8,0 5,0 4,0 5,0 5,0 7,0 17,0 6,0 9,0 9,0 8,0
BHL21 5,0 8,0 4,0 5,0 5,0 6,0 5,0 12,0 7,0 8,0 8,0 8,0
BHL22 5,0 8,0 4,0 5,0 5,0 5,0 4,0 9,0 8,0 7,0 7,0 6,0
Lb: Lactobacillus ; Ind : indicatrice ; Inh: inhibitrice

174
ANNEXES
Tableau 18c
Ind Lb casei Leuconostoc

Inh BHL23 BHL24 BHL25 BHL26 BHL27 BHC 10 BHC 11 BHC 12
BHL 17 6,0 6,0 7,0 9,0 10,0
BHL 18 11,0 12,0 15,0 7,0 8,0
BHL 19 12,0 11,0 9,0 7,0 8,0
BHL 20 5,0 0,0 4,0 5,0 4,0
Lb plantarum
BHL 21 5,0 0,0 0,0 10,0 10,0

BHL 22 6,0 7,0 6,0 0,0 10,0
BHL 23 7,0 4,0 7,0 7,0 0,0
BHL 24 8,0 5,0 6,0 6,0 8,0
BHL 25 8,0 7,0 12,0 7,0 9,0
BHL 26 6,0 6,0 12,0 9,0 12,0
BHL 27 6,0 6,0 11,0 10,0 9,0
BHC 10 0,0 9,0 7,0 8,0 0,0 6,0 7,0 6,0
Leuconostoc
BHC 11 10,0 0,0 7,0 8,0 6,0 8,0 7,0 6,0

BHC 12 11,0 8,0 8,0 9,0 7,0 9,0 7,0 6,0
Lb: Lactobacillus ; Ind : indicatrice ; Inh: inhibitrice

Tableau 18d
Ind Lb casei Enterococcus Leuconostoc

Inh BHL23 BHL24 BHL25 BHL26 BHL27 BHC 1 BHC 2 BHC 3 BHC 10 BHC 11 BHC 12
BHL1 10 6,0 6,0 7,0 6,0 15,0 16,0 6,0 10,0 5,0 6,0
Lb brevis
BHL 2 15 10,0 6,0 6,0 0,0 15,0 16,0 10,0 10,0 5,0 8,0
BHL 3 6 6,0 6,0 13,0 15,0 16,0 16,0 7,0 7,0 7,0 7,0
Lb : Lactobacillus,; Ind : indicatrice ; Inh: inhibitrice .
Les diametres des zones d’inhibitions sont exprimés en mm
Tableau 18e
Lb plantarum
Ind
Inh BHL12 BHL13 BHL14 BHL15 BHL16 BHL17 BHL18 BHL19 BHL20 BHL21 BHL22
BHC 4 4,0 0,5 10,0 6,0 0,4 9,0 0,4 0,5 0,6 0,6 0,5
BHC 5 5,0 6,0 10,0 0,5 0,5 6,0 0,5 0,5 0,7 0,7 0,6
Pediococcus
BHC 6 9,0 10,0 9,0 0,4 0,6 7,0 0,5 0,5 0,7 0,5 0,7
BHC 7 5,0 0,5 9,0 0,5 0,5 6,0 0,6 8,0 8,0 0,6 0,6
BHC 8 8,0 0,6 16,0 0,6 0,6 5,0 0,7 7,0 6,0 0,5 0,5
BHC9 9,0 10,0 11,0 12,0 9,0 6,0 6,0 6,0 8,0 8,0 7,0
175
ANNEXES
Tableau 18f
Ind Lb, amylophilus Lb brevis Lb casei

BHL BHL BHL BHL BHL BHL
Inh BHL 4 BHL 5 BHL 6 BHL 7 BHL 8 BHL 9 BHL 10 BHL 11 BHL 1 BHL 2
3 12 13 14 15 16
BHC 4 4,0 0,0 0,0 5,0 0,0 0,0 5,0 5,0 4,0 7,0 6,0 7 4 0 4 6
BHC 5 5,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 4,0 5,0 5,0 6,0 5,0 7 4 0 6 7
Pediococcus
BHC 6 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,0 5,0 5,0 6 5 0 5 6
BHC 7 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 5,0 7,0 6,0 6,0 6 5 0 5 5
BHC 8 5,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 0,0 5,0 0,0 0,0 0,0 5 5 0 7 5
BHC 9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4 5 0 7 5
Lb : Lactobacillus,; Ind : indicatrice ; Inh: inhibitrice .

Les diametres des zones d’inhibitions sont exprimés en mm
Tableau 19 : Activité antagoniste inter-bactérienne en milieu tamponné (T) et non tamponné

(NT).
S.Ind BHC5 BHC4 BHC 12 BHL6 BHL 7 BHL9 BHL21
MILIEU MRST MRSN MRST MRSN MRST MRSN MRST MRSN MR MRSN MRST MRSN MRST MRS
T T T T ST T T NT
S.Inh
BHL 3 9 11 5 12 10 9 7 13 5 10 5 12 5 10
BHL 8 12 12 0 14 0 0 6 9 11 10 11 10 8 10
BHL11 0 10 0 7 7 6 7 10 10 5 5 10 0 0
BHL13 9 8 10 12 8 8 0 9 10 8 6 7 9 8
BHL 17 7 14 10 12 9 13 10 12 12 13 8 14 10 12
BHL 18 7 6 10 7 0 12 7 10 11 9 10 10 10 7
BHL 22 11 12 11 15 10 10 9 12 11 11 10 13 10 10
BHL 23 12 19 7 14 10 12 12 15 11 12 11 13 6 12
BHL 24 0 0 0 0 0 0 5 7 4 8 5 6 4 5
BHL25 0 12 0 6 4 10 6 10 0 0 5 8 4 6
BHL27 7 22 7 15 9 16 10 19 17 21 7 13 8 12
BHC 4 0 9 0 6 8 7 7 10 7 11 7 11 7 11
BHC6 9 11 9 6 8 6 7 11 7 10 6 10 7 7
BHC10 10 11 10 9 7 11 10 13 8 11 10 8 9 10
S. Ind : souche indicatrice ; S. Inh: souche inhibitrice
Les diamètres sont mesurés en m
176
ANNEXES
Tableau 20 : Résultat des interactions des bactéries lactiques vis-à-vis des bactéries
pathogénes
Pseudomonasaeruginosa Escherichia coli Staphylococcusaureus

S.Ind
MRS N T MRS T MRS NT MRS T MRS NT MRS T
S.Inh
BHC1 10 9 16 7 10 5
BHC2 12 10 12 8 10 0
BHC3 13 7 15 0 7 4
BHC4 12 10 5 12 11 0
BHC5 11 9 10 0 10 9
BHC6 20 0 20 15 23 16
BHC7 5 4 0 0 12 10
BHC8 8 5 12 9 12 0
BHC9 15 12 12 0 7 9
BHC10 12 11 0 0 10 0
BHC11 11 9 10 9 12 10
BHC12 9 10 14 0 13 10
BHL1 22 23 14 10 8 10
BHL2 21,5 22 10 0 15 17
BHL3 22 19 20 15 20 18
BHL4 18 ,5 17 15 11 16 12
BHL5 23,5 20 0 0 13 10
BHL6 20,5 10 16 10 14 15
BHL7 21 19 10 0 16 20
BHL8 20,5 12 16 10 22,5 16
BHL9 5 11 20 10 12 9
BHL10 21 18 12 9 15 10
BHL11 24 16 18 20 19 11
BHL12 0 0 10 6 11 0
BHL13 15 13 8 15 16 14
BHL14 12 10 15 10 15 12
BHL15 0 0 12 9 12 10
BHL16 0 0 14 10 13 9
BHL17 0 0 12 9 16 18
BHL18 0 0 15 5 12 16
BHL19 0 0 6 10 14 10
BHL20 0 0 11 9 15 18
BHL21 17 18 12 10 11 9
BHL22 16 15 12 9 20 15
BHL23 18 16 18 9 10 9
BHL24 15 18 12 10 11 10
BHL25 14 15 12 10 9 11
BHL26 20 18 16 14 10 14
BHL27 19 10 17 0 20 15
La mesure des halos d’inhibitions est exprimée en mm.
S.ind : souche indicatrice ; S.inh: souche inhibitrice
177
ANNEXES
Tableau 21 : Activité antagoniste des souches lactiques en milieu tamponné (T) et non
tamponné (NT).
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus E.coli

Milieu T NT T NT T NT
BHC6 0 20 16 23 15 20
BHL8 12 20,5 16 15 10 16
BHL23 16 18 9 10 9 18
BHL27 10 19 15 20 0 17
Tableau 22 : Effet inhibiteur des souches lactiques en présence d’enzymes (mm).
Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa

S.Ind Tr
α- α- α-
yp Catala Trypsi Catala Trypsi Catala
chymotryp chymotryp chimiotryp
S.Inh sin se ne se ne se
sine sine sine
e
BHC6 0 0 7 0 0 6 0 0 9
BHL8 0 0 6 0 0 7 0 0 6
BHL23 0 0 8 0 0 8 0 0 8
BHL27 0 0 8 0 0 8 0 0 8
Tableau23 : Resultat du stress acide sur les souches lactiques
pH
Souches bactériennes 2,5 4,5 6,5
BHL 8 63,6 80,01 92,21
BHL 23 98 104,06 100,7
BHLC 6 92,33 92,45 96,2
BHL 27 99,41 100,2 98,9
178
ANNEXES
Tableau 24 : Resultatde la tolérance des sels biliaires sur les souches lactiques.
Concentrations en sels biliaires (%)

0 0.3 0.5 1
pH 2,5 pH6,5 pH 2,5 pH 6,5 pH2,5 pH 6,5 pH2,5 pH6,5
Lb.plantarum 96,2 98 96,6 98,5 96,5 96,7 88,1 96,9
Lb.plantarum 97,3 95 112,45 99,8 99,18 91,16 97,51 98,8
Lb. brevis 98,7 92,6 97,05 98,6 95,4 123,3 96,34 96,8
P.
92,05 91,6 101,8 100,03 87,52 99,82 93,54 98,62
acidilactici
179

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Etude des propriétés technologiques et

Présentée par : Mme TAHLAITI HAFIDA

Soutenue publiquement le : 18/03/2019

Devant le jury composé de :

NEMMICHE Saïd Professeur Université de Mostaganem Président

BELAHCENE Miloud Professeur C .U. Ain Temmouchent Examinateur

BEKADA Ahmed Professeur C .U. Tissemsilet Examinateur

AÏT SAADA Djamel MCA Université de Mostaganem Examinateur

DALACHE Fatiha Professeur Université de Mostaganem Directrice de thèse

Année universitaire 2018- 2019

Je remercie également Mr Belahcéne, Professeur au centre Universitaire de Ain Temouchent, Mr

Je remercie Melle Meghoufel pour les agréables moments passés au laboratoire.

Je remercie Mr Benharrat Noredine pour son aide et sa disponibilité.

Je remercie également MmeLazreg Hafida et Mr Benbouziane Djilali du laboratoire pédagogique du

ATCC : American Type Culture Collection

BSH : hydrolase de sel biliaire

CRAPC : Centre de Recherche scientifique et technique en Analyses Physico-Chimiques

CHCA : Acide α-Cyano-4-Hydroxy-Cinnamique

DHB : Acide 2,5 Dihydroxy-Benzoïque

MALDI-TOF MS:Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight mass

MRS : De Man, Rogosa et Sharpe

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

Rpm : rotation par minute

UFC : Unité Formant Colonie

V.P : Vogues Proskauer

WHO : World Health Organization (OMS)- Organisation Mondiale de la Santé

TABLEAU 1: ALIMENTS ET BOISSONS TRADITIONNELS, A BASE DE CEREALES FERMENTEES,

FIGURE 1: FORME D’UNE MATMORA 5

1.1. Blé dur et autres céréales 4

1.2. Les bactéries lactiques 12

1.3. Les activités antimicrobiennes des bactéries lactiques 27

1.4. Les probiotiques 38

1.5. Les interactions 46

1.6. Identification des bactéries par MALDI-TOF MS 49

2.1. Origine et échantillonnage du blé fermenté : 52

2.2 .Milieux de culture et conditions de croissance 52

2.3. Isolement des bactéries lactiques 52

2.4. Purification et pré-identification des isolats et leur appartenance au groupe lactique 53

2.6. Souches pathogènes utilisées 54

2.7. Dénombrement des bactéries lactiques 55

2.8. Pré-indentification phénotypique des bactéries lactiques 55

2.9. Eude du pouvoir acidifiant 58

2.10. Identification protéomique des isolats par MALDI-TOF SM 59

2.11. Mise en évidence des interactions négatives 60

2.2. Mise en évidence in vitro de quelques propriétés probiotiques 65

3.1. Dénombrement des bactéries 68

3.5. Mise en évidence des inhibitions inter-bactériennes 97

3.7. Etude du potentiel probiotique des souches lactiques 117

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 127

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES: 130

En Algérie, les céréales et leurs dérivés constituent la base alimentaire de la population

Les systèmes de stockage utilisés nécessitent un contrôle de plusieurs paramètres en

Le second chapitre consacré au matériel et méthode présente l’origine du matériel

1.1.Blé dur et autres céréales

1.1.3. Stockage du blé

Il existe différents types de silos.

 Les silos métalliques de forme géométrique.

 Les greniers domestiques à base de terre, à armature de bambou ou en paille (Kodio,