CHM 302: CHIMIE ANALYTIQUE II : METHODES DE SEPARATION

OBJECTIFS DU COURS :

Chimie appliquée à l’analyse des médicaments

− De comprendre les bases théoriques de différentes techniques de séparation
et de purification.
− De séparer, purifier et vérifier la pureté et identifier la nature d’un composé.

PLAN DE COURS

Introduction

CHAP 1: Généralités sur les méthodes de séparation

CHAP 2: Méthodes chromatographiques
I. Principe, classification
II. Chromatographie d’adsorption
III. Chromatographie de partage
IV. Chromatographie d’échange d’ions
V. chromatographie d’exclusion diffusion ou chromatographie sur gel

CHAP 3: Applications
I. Chromatographie en phase liquide sur colonne
II. Chromatographie en phase liquide couche mince
III. Chromatographie Liquide Haute Pression (CLHP) ou HPLC.
IV. Chromatographie en phase gazeuse
V. Electrophorèses
VI. Chromatographie en phase supercritique

BIBLIOGRAPHIE
1- Chimie analytique Tome 2 Méthodes de séparation écrit par G. MAHUZIER, M.
HAMON, D.FERRIER, P.PROGNON, éditeur ELSEVIER / MASSON
2- Procédés de séparation. Techniques, sélection, dimensionnement Par George-E Keller,
Jimmy-L Humphrey, éditeur Dunod
3- Internet

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 INTRODUCTION

La chimie est l’étude de la matière, ses propriétés chimiques et physiques, les

modifications chimiques et physiques qu’elle subisse et les changements énergétiques qui
accompagnent ces processus. Parmi les branches de la chimie, la chimie minérale étudie les
substances que l’on trouve dans le règne minéral (sol, sous-sol et atmosphère) et la chimie
organique a pour objectif l’étude de substances constituants les organismes vivants (végétaux et
animaux). Les synthèses organiques constituent une seconde voie d’accès aux composés
organiques. L’étude des produits de réaction et des constituants des organismes vivants nécessite
une parfaite maîtrise des méthodes de séparation et d’analyse. Ainsi le progrès constant de la
Chimie est dû au développement et au perfectionnement de ces techniques.
➢ Méthodes de séparation
Méthodes chromatographiques, plusieurs techniques sont utilisées ici : CC, CCM,
CPG, CLHP ou HPLC, électrophorèse
➢ Méthodes d’analyse
Les substances pures obtenues après les purifications doivent être analysées dans le but
d’obtenir leurs structures. Pour cela les méthodes d’analyse nous permettent d’avoir des
informations qui pourraient conduire à la détermination de la structure de la molécule.

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CHAP 1: GENERALITES SUR LES METHODES DE SEPARATION
Les méthodes de séparation autre fois appelées analyse immédiate sont basées sur un certain
nombre d’opérations qui différent selon le produit de départ. Ce dernier peut être une solution
homogène issue de l’extraction d’un mélange naturel ou d’une réaction de synthèse ou bien un
mélange hétérogène.
I. Séparation des constituants d’un mélange hétérogène
Les mélanges hétérogènes sont des mélanges présentant deux phases :
1- Ils peuvent être des mélanges présentant une phase solide et une phase liquide : les deux
moyens les plus classiques de leur séparation sont la filtration et la centrifugation
La technique de filtration permet une filtration sous pression normale, en s’aidant d’une
surpression ou d’une dépression. Dans ce dernier cas on utilise une fiole conique pour recueillir
le liquide. Cette fiole est munie d’un ajustage latéral permettant de relier à une pompe ou à une
trompe à vide : c’est la fiole à vide ou fiole de Kitasato. Le système filtrant proprement dit est un
creuset en verre fritté ou un disque en matériau poreux, placé sur un support en porcelaine percé
d’orifices c’est l’entonnoir de Büchner.
La centrifugation est une opération de séparation mécanique, par action de la force centrifuge, de
deux à trois phases entraînées dans un mouvement de rotation. On peut séparer deux phases
liquides, une phase solide en suspension dans une phase liquide, voire deux phases liquides
contenant une phase solide.
Par exemple, des boues humides ainsi traitées donneront une phase liquide et des boues sèches
2- Ils peuvent être des mélanges de deux liquides non miscibles ainsi la centrifugation, le
chauffage permettent de rompre les émulsions pour ainsi conduire à une séparation par
décantation.

II. Séparation des constituants d’un mélange homogène

Trois cas peuvent se présenter : mélange de liquide homogène, de solide homogène, de gaz
1) Dans le cas d’un liquide ou d’un solide homogène,
Dans le cas d’un liquide, on peut provoquer la formation d’un solide, la démixtion en deux
phases.
Dans le cas d’un solide, réaliser le tri des différents constituants. Dans les deux cas on parle de
rupture de phase.

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2) On peut de manière préférentielle dissoudre certains constituants du mélange homogène dans
un solvant approprié. On parle ici de transfert de phase : osmose, extractions, chromatographies
3) On peut faire passer l’un des constituants du mélange à l’état vapeur : Il s’agit de la distillation
si le mélange est un liquide et de la sublimation s’il est solide. Ici on parle de changement d’état.
Pour le mélange de composés gazeux on peut utiliser la chromatographie en phase gazeuse

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CHAP 2 : METHODES CHROMATOGRAPHIES

Introduction et historique
Parmi les méthodes de séparation et de purification connues (séchage, décantation,
distillation, filtration, recristallisation,…) la chromatographie tient une place de choix car
permettant de séparer un produit contenant des impuretés difficiles à enlever par distillation ou
cristallisation. Cette technique sert également à séparer des produits organiques d’un mélange.
Ajout du solvant d'élution
Mikhail Semenovich Tsvet (ou Michael Tswett) en 1903 fut le premier à
réaliser par cette technique la séparation de pigments végétaux sur une
colonne, un réservoir cylindrique, remplie de particules de carbonate de Echantillon

calcium (figure I.1). Il fallut attendre par la suite plusieurs années pour
Matériel solide
un développement substantiel de la chromatographie, développement
Laine en verre

initié principalement par les travaux de Martin et Synge, en 1941. Ces

chercheurs ont découvert que le passage d'un mélange d'acides aminés
acétylés au niveau d'une colonne remplie de gel de silice provoquait leur
Eluant collecté

séparation. Ensuite sont nées les techniques de chromatographie en phase

gazeuse, sur papier et en couche mince et finalement, la chromatographie
Fig. I.1. Colonne chromatographique
HPLC (de l'anglais «High Performance Liquid Chromatography»)
vers la fin des années 1960. Cette dernière a produit un effet pour le moins explosif dans le monde
scientifique, si bien qu'elle connaît aujourd'hui des applications dans tous les secteurs où les sciences
comme la chimie et la biologie sont présentes, notamment au niveau de l'industrie pharmaceutique,
clinique et alimentaire, l'industrie des polymères et le secteur de la protection de
l'environnement.
● 1931 (KUHN et LEDERER) : chromatographie sur colonne (chromatographie liquide solide
CLS)
● 1938 (IZMAILOV et SCRAIBER) : chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC),
TAYLOR et UREY : chromatographie par échange d’ions
● 1941 (MARTIN et SYNGE, Nobel en 1952) : concept de chromatographie gaz-liquide,
chromatographie de partage liquide-liquide
● 1952 : développement pratique de la chromatographie gaz-liquide
● 1955 : 1er chromatographe gaz-liquide sur le marché (chromatographie en phase gazeuse : GC)
● 1965 (HALASZ, HORVATH) : Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP ou
HPLC).

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I. DÉFINITIONS
La chromatographie est une méthode physique de séparation des constituants d'un mélange
basée sur les différences d'affinités des substances à séparer à l'égard de deux phases, l'une
stationnaire (ou fixe) et l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la
séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur
désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque
phase. La phase stationnaire (phase fixe) peut être soit sur la surface intérieure d'une colonne soit
sur une surface plane et la phase mobile est la phase qui se déplace à travers la phase stationnaire,
en entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais
uniquement avec les analytes.

II. BUTS DE LA CHROMATOGRAPHIE

Le but de la chromatographie est de séparer un mélange complexe en ses différents
constituants. Afin d’identifier ou de doser certains constituants d’un mélange à séparer, on peut
distinguer deux objectifs principaux.

I.2.1. Objectif analytique

Il s’agit d’identifier des solutés qualitativement et/ou quantitativement, l’opération se
faisant par le seul processus chromatographique, auquel peuvent être associés, en passage direct
d’autres techniques chimiques ou physico-chimiques destinées à faciliter l’analyse qualitative (on
qualifie cela de couplage).

I.2.2. Objectif préparatif

Les concentrations des solutés ici sont importantes. Les quantités produites demeurent
cependant faibles (de l’ordre du kg/jour) et le procédé ne sera utilisé que pour les substances
rares, sensibles à la chaleur (protéines, etc…).
III- Principe et classification des méthodes chromatographies
La chromatographie est la méthode de séparation la plus utilisée aujourd’hui en chimie
organique. C’est une méthode basée sur la différence d’affinité des constituants du mélange entre
deux phases : une phase stationnaire et une phase mobile.
Le choix d’un type de chromatographie dépend des règles logiques liées à la nature des
mélanges de composés à séparer

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Sous le nom de méthodes chromatographiques, on regroupe un très grand nombre de techniques
différentes, qui en plus du terme chromatographie, portent une appellation propre, selon que l’on
veut rappeler :
o la nature physique des phases
o Le principe du phénomène mis en œuvre
o Le procédé opératoire
III.1- Classification selon la nature physique des phases
La phase mobile est un fluide liquide ou gaz. La phase stationnaire peut être un solide finement
divisé ou un liquide immobilisé sur une phase fixe par exemple un support poreux qui ne
participe pas à la chromatographie.
La combinaison de ces différentes possibilités permet de distinguer les quatre types de
chromatographie suivants :
Chromatographie liquide-liquide
Chromatographie liquide-solide
Chromatographie gaz-liquide
Chromatographie gaz-solide chromatographie en phase gaseuse (CPG)

III.2. Classification selon le phénomène chromatographique

Cette classification dépend de la nature de la phase stationnaire.
Il existe :
1. La chromatographie d’adsorption où la phase stationnaire est un solide ayant des
propriétés adsorbantes
2. La chromatographie de partage lorsque la phase stationnaire est un liquide non miscible à
la phase mobile
3. La chromatographie par échanges d’ions où la phase stationnaire est formée de macro-
molécules (résines) portant des groupements fonctionnels acides ou basiques qui permettent
l’échange de certains de leurs ions avec des ions de même signe du mélange à
chromatographier.
4. La chromatographie d’exclusion diffusion ou chromatographie sur gel : la phase
stationnaire est constitué par un gel qui se comporte comme un tamis vis-à-vis des
molécules ayant des poids et des structures différentes.
III.3. Classification selon le procédé utilisé
Selon le procédé utilisé pour immobiliser la phase stationnaire, on distingue :
• La chromatographie sur colonne. - La phase stationnaire est contenue dans une colonne
cylindrique en verre ou en en métal comme souvent en CPG.
• La chromatographie sur papier. – Une surface plane de cellulose considérée comme
support maintient par imbibition une phase stationnaire liquide.
• La chromatographie sur couche mince (CCM). – La phase stationnaire est dans ce cas
retenue sur une surface plane, verre, matière plastique, ou feuille d’aluminium qui est

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 recouverte d’une mince couche (0,2 à 0,5 mm d’épaisseur) de gel de silice, cellulose, alumine
ou de grains de résine échangeuses d’ions.
Selon les modalités de migration de la phase mobile on envisage :
• La chromatographie par développement. – L’élution des différentes substances est
menée de telle sorte que celles-ci restent toujours sur la phase stationnaire où elles sont ensuite
localisées. Suivant la direction de la migration on parle de chromatographie ascendante,
descendante, circulaire.
• La chromatographie d’élution. – l’élution ici est poursuivie jusqu’à ce que chaque
substance soit entraînée hors de la phase stationnaire ; l’identification se réalise alors sur
l’éluat.
II- Principes généraux de la Chromatographie
La séparation d’un mélange en ses différents constituants est l’objectif à atteindre pour toute
chromatographie. Le phénomène ou les procédés utilisés varient selon les types de méthodes
choisies, mais toutes celles-ci ont en commun un certain nombre de principes.
1) Les composés se répartissent dans deux phases non ou très peu miscibles jusqu’à
l’établissement d’un équilibre. Cette partition dépend des propriétés de chaque composé vis-à-
vis des phases considérées.
2) Le renouvellement continu de la phase mobile, remet en cause cet équilibre et entraîne par
une succession d’autres équilibres, la migration des substances tout au long de la phase
stationnaire.
3) La séparation des différents composés tient au fait que chaque constituant migre avec une
vitesse qui lui est propre.

Avant d’aborder l’étude des principales méthodes et d’en montrer l’originalité, il est
nécessaire d’avoir à l’esprit certaines notions très générales que l’on supposera connues lors des
études ultérieures.
Pour en faciliter la compréhension, nous présentons en premiers de manière schématique le
déroulement d’une chromatographie, puis nous développons les notions théoriques qui pourront
ensuite être aisément transposées aux différentes méthodes.

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IV- Représentation schématique d’une Chromatographie
Cas de la chromatographie d’adsorption
a) Définition et Principe
Chromatographie d’adsorption est l’une des plus anciennes type de chromatographie. Elle utilise
une phase mobile (liquide ou gazeuse) et une phase stationnaire solide. Ce mode de
chromatographie met en jeu un mécanisme d'adsorption du soluté sur la phase stationnaire
solide et un mécanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse (éluant).
Au cours de la séparation, les solutés du mélange sont adsorbés par la phase stationnaire
(c.-à-d. fixés sur la surface solide grâce à une faible énergie (liaisons hydrogène, interactions
électrostatiques...).
L'élution ou désorption consiste à extraire le soluté adsorbé à l'aide d'un solvant appelé éluant.
- Les différents solutés sont plus ou moins adsorbés sur la phase stationnaire, et plus ou moins
solubles dans la phase mobile; il en résulte une migration différentielle des solutés en fonction de
la résultante entre les deux forces (de rétention et d'entraînement) et donc une séparation de ces
solutés.

b) Solution ne contenant qu’une seule substance

Afin de simplifier cette représentation, on suppose dans un premier temps que la solution à
chromatographier n’est constituée que d’un seul composé dans un solvant que nous prendrons
dans cet exemple comme étant de même nature que la phase mobile.
Un petit volume de cette solution est déposé sur une colonne chromatographique remplie d’une
phase stationnaire très finement divisée et entourée par la phase mobile.
La chromatographie est un phénomène continu; mais pour la commodité du raisonnement, elle
peut être représentée comme une succession de phénomènes discontinus en imaginant que la
colonne est constituée par l’empilement successif de petits volumes cylindriques de même
hauteur dx numérotés de 0 à N.
Dans la conduite de cette chromatographie: trois moments sont envisagés:
le dépôt de la solution à chromatographier sur la colonne.
le développement du chromatogramme
l’élution
Dépôt de la solution. – La solution dans laquelle la substance se trouve à la concentration
Co est déposée au sommet de la colonne par petites fractions que nous supposerons égales à vm.
Toute adjonction provoque par gravitation un déplacement de chacun des volumes
élémentaires vm de la phase mobile le long de la colonne: c’est ainsi que le volume de l’étage 0
prend la place de l’étage 1 qui à son tour chasse le 2e et ainsi de suite jusqu’à l’extrémité de la
colonne où un volume vm de phase mobile est recueilli.
A l’étage 0, la substance se trouve donc en contact avec la phase stationnaire. Cette phase
a été choisie en raison de sa grande affinité pour la ou les substances à séparer. Un équilibre
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 s’établit alors. Lorsqu’il est réalisé, la substance se trouve ainsi partagée entre les deux phases
dans des proportions dépendant de la constante d’équilibre.
La concentration en substance dans chaque phase est bien entendu inférieure à la
concentration initiale Co, mais celle de la phase stationnaire, étant donné, son affinité est
supérieure à celle de la phase mobile.
L’introduction d’un nouveau volume de soluté vm provoque le même déplacement de la
phase liquide tout au long de la colonne. Mais à ce moment deux équilibres doivent se réaliser.
A l’étage 0, la solution très concentrée rencontre une phase stationnaire non saturée.
A l’étage 1 la solution appauvrie en substance, se trouve en contact avec une phase
stationnaire vierge et de nouveaux partages se réalisent alors afin que les constantes
d’équilibres soient satisfaites.
L’adjonction d’un 3e volume de solution vm remet en cause les équilibres établis et
comme précédemment une nouvelle répartition apparaît.
Ce même phénomène se répétera jusqu’à ce que toute la solution à chromatographier soit
déposée sur la colonne. On constate alors que toute la substance est localisée à la partie
supérieure sur un certain nombre d’étages dans lesquels la concentration diminue
progressivement lorsque l’on s’éloigne du sommet.
Développement. – La même représentation graphique peut être poursuivie, mais cette
fois c’est le solvant pur qui est introduit par fractions successives vm au sommet de la colonne.
A chaque étage les équilibres précédents sont rompus et de nouveaux s’établissent: la
phase mobile s’enrichit lorsqu’elle est au contact d’une phase stationnaire chargée en substance
ou au contraire s’appauvrit dans le cas inverse de telle sorte que les constantes d’équilibres
soient toujours respectées.
Si on considère que le comportement de la substance reste identique tout au long de la
colonne, on constate que la substance se déplace progressivement d’étages en étages au fur et à
mesure de l’introduction de la phase mobile. Il se produit un étalement progressif de la zone
contenant la substance. Les concentrations se trouvent réparties de part et d’autre d’une valeur
maximale, il s’établit donc un véritable gradient de concentration qui progresse vers l’extrémité
de la colonne.
Elution. – En continuant l’addition du solvant, on arrive à faire migrer la substance de
plus en plus loin à l’intérieur de la colonne jusqu’au moment où elle est entraînée dans le
solvant qui sort à l’extrémité: c’est l’élution.
Lorsque plusieurs composés sont en présence: chacun se déplace indépendamment
d’étage en étage selon le système exposé ci-dessus avec une vitesse qui lui est propre et qui
dépend de son comportement vis-à-vis des deux phases.
La migration et la séparation chromatographique résultent donc d’une suite continue de
fixations et d’élutions.

c) Coefficient de partage ou de distribution

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 Le coefficient de partage qui est la base de toute sorte de chromatographie décrit la façon
dont un composé à purifier est partagée ou distribué entre les phases. Pour deux phases non
miscibles A et B, la valeur de cette constante (Kp) est donnée par l’expression :
concentration dans la phase A
Kp =
concentration dans la phase B
Le terme Coef. de distribution effective est définit par le rapport de la quantité totale (différente
de la concentration) de la substance présente dans une phase et de la quantité totale présente dans
l’autre phase.
Par exemple Si Kp d’un composé entre deux phases A et B est égal à 1 et si ce composé est
distribué entre 10 cm3 de A et 1 cm3 de B, les concentrations dans les deux phases seront égales,
mais la quantité totale de composé dans la phase A sera 10 fois celle dans la phase B (mA = 10 x
mB).

d) Chromatographie sur colonne (CC)

C’est une chromatographie au cours de laquelle la phase stationnaire est placée dans un
tube cylindrique en verre ou en plastique fermé d’un bout par un robinet. Il est appelé colonne. La
colonne peut être chargée par voie sèche (adsorbant sec) ou par voie
humide (en faisant une bouillie d’adsorbant). Si la colonne est chargée par
voie sèche, elle doit être mouillée à la fin avec le solvant à utiliser pour
élution. Le mélange de composés à séparer est placé au dessus de ce gel.
Ce procédé de séparation par colonne est la méthode la plus utilisées pour
la séparation des composés. Contrairement à la CCM, on la fait traverser
par une variété de solvants de polarité croissante. Les composés du
mélange se distribuent entre la phase stationnaire et la phase mobile par
un processus d’adsorption et de désorption. Le composé le moins
fortement adsorbé et le plus facilement désorbé sous les conditions de
l’opération traverse la colonne très rapidement et est le premier à être élué
suivi du composé le plus fortement adsorbé.

Rq. Le mélange de solutés à séparer est généralement fixé sur une matière
inerte appelée célite. Ceci permet le transfert (de récupérer la totalité) de
mélange de solutés du récipient qu’il en contient à la colonne.

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Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
Cuve d'élution

trace de la mine
localisant les spots
spots des échantillons
melange d'éluants

Appareil pour CCM

La CCM est une chromatographie d’adsorption qui utilise une couche légère d’adsorbant
solide (0,1−2 mm) déposée sur une plaque en verre ou en plastique ou en aluminium. Puis une
petite quantité du mélange à séparer ou à analyser est dissout dans un solvant convenable et
déposée à 1 cm des bords latéraux et 1,4 cm du bord inferieur de la plaque. La tache doit être
environ 3−5 mm de diamètre. Le dépôt de la tache se fait avec le capillaire ou une seringue. Le
solvant doit être évaporé en laissant la plaque à l’air libre. La plaque est ensuite placée
verticalement dans un récipient ou chambre de développement pour CCM avec le bord inferieur
immergé dans un solvant ou mélange de solvants bien approprié qui en contient au préalable. La
profondeur du solvant doit être environ 1 cm de manière à être en contact avec l’adsorbant. Le
solvant ou mélange de solvant (éluant) se déplace du bas vers le haut à travers l’échantillon à
analyser jusqu’à atteindre 10 à 15 cm du point de dépôt de l’échantillon. Si le solvant est bien
choisi, les solutés de l’échantillon se déplacent vers le haut suivant leurs coefficients de
distribution. Après un intervalle de temps bien approprié, la plaque est retirée de la cuve et les
traces du solvant marquées immédiatement. Elle est ensuite séchée à l’air libre. Si le soluté n’est
pas coloré, la visualisation des spots sur la plaque pourra être accomplie en aspergeant un réactif
chimique ou autres méthodes. Par exemple exposition de la plaque sous une lampe Ultraviolette
ou sous les vapeurs d’iode (I2). Ou bien en aspergeant une solution d’acide sulfurique dilué à 50
% suivi de la calcination.

e 1. Facteur de rétention (Rf)

En CCM ou chromatographie sur papier, la position d’une tache (représentant un composé)
est repérée par une constante appelée facteur de rétention. C’est le rapport entre la distance
parcourue par le soluté et celle parcourue par le front de solvant ; les deux mesurées à partir de la
ligne de dépôt des spots.

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 Exemple : Considérons un mélange de constituants A+B à

Front de solvent analyser. Ce mélange après avoir été déposé sur une plaque
x position de B et placé dans une cuve contenant un solvant approprié, se
S x position de A déplace de manière a séparer les produits qui le constitue.
B A
Après un intervalle de temps bien approprié, le front de
mélange de A + B
solvant peut être observé. La plaque après être retirée de la
cuve et les spots révélés, les Rf de A et de B sont calculés. Nous pouvons utiliser cette méthode
pour une analyse qualitative et quantitative d’un échantillon, pour comparer la pureté d’un
produit. Les Rf trouvés peuvent être comparés avec ceux des échantillons authentiques de A et de
B.
e2. Applications
i. Microchromatographie : Les applications qualitatives :
- révèle la présence ou l’absence d’une substance spécifique dans l’échantillon. Ceci est
généralement possible lorsqu’on compare une substance pure avec un mélange de
composés en CCM
- Informe sur la complexité d’un mélange.
- Informe relativement sur la proportion d’une substance dans le mélange
- Indique le nombre minimal de composés par le nombre de spots en CCM ou le nombre de
pics en CGL.
Remarques : Certaines taches révélées sur la plaque CCM peuvent contenir plusieurs
substances. On dit que le mélange est complexe.
Cette méthode est très utilisée pour tester rapidement les différents systèmes de solvants ou faire
des contrôles rapides de fractions provenant de la chromatographie sur colonne ou encore pour
vérifier très rapidement la pureté relative d’un produit.

ii. Chromatographie préparative

Cette méthode permet de séparer des quantités de substances inférieures à 1 g. On se
sert des plaques recouvertes d’une couche de phase stationnaire de 1 à 2,5 mm. Cette épaisseur de
phase stationnaire dépend de la quantité de substance à déposer sur la plaque.
L’échantillon à séparer est déposé non plus sous forme d’une tache, mais en un trait
épais continu que l’on charge plusieurs fois.
Le développement de la chromatographie fractionne cet échantillon en bandes
parallèles qui sont révélées soit par U.V., soit par pulvérisation d’un réactif sur une petite partie

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de la plaque tout en recouvrant soigneusement l’autre partie. La localisation des substances est
ensuite extrapolée à toute la plaque.
Le recueil séparé de ces bandes et leur élution par un solvant permet de d’obtenir
quelques milligrammes du composé, quantité suffisante pour permettre de l’identifier.

IV. ETUDE THEORIQUE DE LA CHROMATOGRAPHIE

I.V.1. Théorie des plateaux
L’étude théorique de la chromatographie à tout d’abord été effectuée en assimilant la
colonne chromatographique à une colonne à distiller où la progression des substances est
considérée comme une succession d’équilibres se réalisant entièrement dans des étages ou
plateaux fictifs appelés "plateaux théoriques". On peut ainsi définir les plateaux théoriques
comme une juxtaposition de volumes identiques contenant tous les mêmes proportions de phase
stationnaire et de phase mobile. Cette notion de plateaux théoriques appliquée à la colonne
chromatographique permet ainsi d’exprimer par des lois les phénomènes de l’élution et de la
séparation. Cette théorie des plateaux présente des imperfections car elle assimile la
chromatographie à une suite discontinue d’opérations et elle suppose que chaque
équilibre se réalise entièrement sans tenir compte des phénomènes de diffusion et
de l’écoulement continu de la phase mobile qui en réalité diminuent les échanges.
Pour la compléter, plusieurs autres théories ont été élaborées dont la théorie dite
théorie cinétique dans laquelle l’aspect dynamique de la phase mobile est pris en
considération ainsi que l’influence de facteurs tels que la température et la pression.

IV.2. Hauteur équivalente d’un plateau théorique H.E.P.T.

Considérons une colonne de longueur L ayant N plateaux théoriques identiquement formés.
h = L/N où h est appelée Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique
h et N caractérisent le fonctionnement de la colonne car ils dépendent :
- de la nature des phases
- de la géométrie de la colonne
- de tous les facteurs qui influencent les équilibres
IV.3. Répartition de la substance au cours de la migration

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Considérons une solution ne renfermant qu’une seule substance de quantité Q déposée en une
seule fois sous un volume vm (volume occupée par la phase mobile dans un plateau théorique) sur
le plateau supérieur d’une colonne chromatographique de N plateaux numéroté de 0 à n. A
l’équilibre la relation Cs = KCm est respectée.
La substance se répartit donc entre les deux phases et la loi de la conservation de la matière
permet d’écrire :
Q = Qm + Qs (*)
Qm = quantité de substance dans la phase mobile
Qs = quantité de substance dans la phase stationnaire
Dans chaque phase nous avons donc une fraction de la quantité initiale
Soit X = la fraction de la quantité de substance fixée par la phase stationnaire
c-à-d Qs = XQ
Y = fraction de la quantité de substance se trouvant dans la phase mobile
c-à-d Qm = YQ
alors l’équation (*) s’écrit Q = XQ + YQ où 1 = X + Y
Si on introduit dans la colonne un volume vm de phase mobile pure directement l’équilibre
cherche à s’établir de nouveau.
- Dans le plateau supérieur, de rang 0, la phase stationnaire renfermant une quantité XQ de la
substance va en céder à la phase mobile jusqu’à ce que l’équilibre soit de nouveau réalisé.
- dans le plateau suivant de rang 1, c’est le phénomène inverse qui se produit : la quantité YQ (de
la phase mobile) se répartit dans la phase stationnaire jusqu’à ce qu’un nouveau équilibre soit
établit.
Si nous introduisons n volumes de phase mobile la substance se trouve dans n + 1 plateaux. En
suivant ainsi une distribution binomiale exprimée par la formule Q(X + Y)n.
Exemple : La quantité de substance Qp présente dans un plateau de rang p lorsque l’on fait passer
n volumes de phases mobiles sur une colonne, est une fraction de la quantité initiale Q, qui a pour
valeur le produit du p+1 ième terme T du développement du binôme, par Q

Qp = ( Xn-p Yp)Q

La quantité de substance présente dans un plateau dépend donc de 4 facteurs:

1) de la quantité de substance initiale déposée : Q
2) du rang du plateau considéré : p

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 3) du nombre de volumes vm de phase mobile que l’on fait passer sur la colonne
4) du coefficient de partage qui impose les fractions X et Y de substance se trouvant
dans les deux phases.
Expression de n en fonction de vm (volume occupé par la phase mobile dans un plateau
théorique)
V = n vm V = est le volume de la phase mobile passé sur une colonne chromatographique
pendant un temps donné.
vm = volume occupé par la phase mobile dans un plateau
Expression de X et de Y en fonction de vm
X = Qs/Q Y = Qm/Q
Qs = Cs. vs Qm = Cm . vm
Qm cm vm
Q = Qs + Qm = Cs. vs + Cm . vm Y= = or cs = K cm
Q cm vm + cs vs

cm vm vm
d’où Y= =
cm vm + vs Kcm vm + vs K

vm
En posant veff = vm + Kvs Y= par ailleurs, X + Y = 1
veff
vm
donc X = 1 -
v
veff = volume efficace d'un plateau théorique eff

IV.4. Elution de la substance et représentation graphique

Certaines techniques chromatographiques ne se limitent pas au seul développement mais
ont pour but de recueillir la substance après l’avoir fait migrer à travers toute la phase
stationnaire. Lorsqu’on continue à ajouter la phase mobile de manière continue, la substance est
entraînée par le solvant qui sort à l’extrémité de la colonne.
Ce phénomène d’élution dépend non seulement de l’affinité de la phase stationnaire pour la
substance et des caractéristiques de la colonne mais aussi du volume V de phase mobile écoulé.
Si la colonne ne retient pas la substance, il suffit de faire passer n volumes vm de phase mobile à
travers la colonne pour recueillir la substance. (Avec n égal au nombre de plateaux N). La
substance traverserait ainsi la colonne avec le front du solvant sans qu’il y ait mise en jeu du
phénomène chromatographique. On dit que le solvant est trop polaire. De la même façon, si après
avoir fait passer n volumes vm de phase mobile à travers la colonne on ne recueille aucune
substance ; on dit que le solvant est moins polaire.

16
En réalité, la substance doit présenter, comme nous l’avons vu, une certaine affinité pour la phase
stationnaire. Il est alors évident que lorsque le front du solvant arrive à l’extrémité de la colonne,
la substance s’est d’autant moins déplacée que cette affinité est plus grande. Il va donc falloir,
pour qu’elle progresse, faire passer un très grand volume de phase mobile c’est-à-dire utiliser un
nombre n de volumes élémentaires vm d’autant plus important que la substance est plus retenue
par la phase stationnaire.
Ainsi n  N.
Etudier l’élution d’une substance revient à envisager en fonction du volume de phase mobile
écoulé, la concentration de cette substance à la sortie du dernier plateau.
Si on considère qu’à l’extrémité de la colonne se trouve un plateau hypothétique (N+1). Un
système de détection placé juste à l’extrémité de la colonne transmet de manière continue à
l’enregistreur les variations de concentrations dans ce plateau hypothétique.
L’intensité du signal envoyé à l’enregistreur est proportionnelle à la quantité de substance
présente dans ce plateau Q(N+1) et le tracé obtenu est analogue à la courbe d’allure type gaussien
et porte le nom de pic chromatographique. (Une courbe de Gauss est une courbe géométrique
présentant un maximum placé sur un axe de symétrie, et deux points d’inflexions situés sur une
même horizontale.
Lorsque seule la phase mobile traverse le plateau hypothétique (N +1) l’enregistrement présente
une ligne continue parallèle à l’axe des abscisses appelée « ligne de base »
- L’axe des abscisses est représenté par le déroulement à vitesse constante du papier et
les longueurs mesurées sur cet axe sont donc directement proportionnelles à des temps.
- D’autre part, l’écoulement de la phase M. s’effectuant à débit constant, ces longueurs sont
également proportionnelles au volume V, et donc à n, ou au rapport V/veff
Ainsi les ordonnées proportionnelles aux intensités transmises par le détecteur, correspondent
à la fraction de substance Q(N+1)/Q traversant le plateau.
Le tracé de la courbe appelé chromatogramme est une courbe représentative de la fraction

Q(N+1) V
= f( v )
Q eff

d = distance entre le début de la

chromatographie et le maximum d’un pic.

17
Tr=temps écoulé entre l’introduction de l’échantillon dans la colonne et le moment où la substance sort à
sa concentration maximale.
V= volume de la phase mobile nécessaire pour amener la substance à sa concentration maximale dans le
plateau N+1

Fig. Enregistrement d’un pic chromatographique

V. QUELQUES MATERIELS CHROMATOGRAPHIQUES

L’évolution d’une substance dans une colonne chromatographique ou l’élution d’une substance,
dépend nettement de son affinité avec l’adsorbant ou l’éluant.

V.1. ADSORPTION

En chromatographie, l’adsorption correspond à la fixation plus ou moins énergétique d’un

soluté sur la phase stationnaire appelé adsorbant. Ce phénomène fait intervenir des forces
complexes entre les solutés et l’adsorbant : forces électrostatiques, forces inductives, forces des
liaisons hydrogène, etc. Pour qu’il y ait séparation, il faut nécessairement que la fixation du
soluté sur l’adsorbant soit réversible. L’élution ou désorption consiste à extraire, à partir de la
phase solide, la substance adsorbée à l’aide d’un solvant (éluant).
Pratiquement, il existe plusieurs substances chimiques pouvant être utilisés comme
adsorbants à condition qu’ils présentent certaines propriétés.
Il faut qu’il soit :
L’INSOLUBILITE totale dans les solvants et éluants utilisés ; inertie vis-à-vis d’eux et des
substances à chromatographier.
LA SURFACE SPECIFIQUE IMPORTANTE. La surface spécifique des adsorbants est
leur surface par unité de poids. Elle est liée à leur granulométrie et à leur porosité. Une grande
surface spécifique est en générale souhaitable car elle permet d’obtenir de meilleures séparations
et de diminuer la longueur des colonnes.
ACTIVITE. L’activité des adsorbants est très variable. Elle dépend de leur nature, de leur
préparation mais surtout de leur teneur en eau. La majorité d’entre eux possèdent en effet des
groupements polaires et on tendance à fixer sur quelques-uns de leurs sites les molécules d’eau de
l’atmosphère ou celles contenues dans les solvants rarement parfaitement anhydres. L’activation
est souvent obtenue en portant l’adsorbant à l’étuve à des températures élevées (100-300 °C) afin
d’éliminer des molécules d’eau fixées à la surface. La durée et la température varient selon
chaque adsorbant car il est nécessaire d’éviter le départ des molécules d’eau liées qui font partie
de sa structure même.
a). Nature de l’adsorbant

18
 L’origine des adsorbants est très diverse. Les poudres des charbons végétal ou animal ont
parfois été utilisées. Mais le sont moins de nos jours à cause de leur plus grand pouvoir
adsorbant. En chromatographie sur colonne, on a préféré l’utilisation d’adsorbants, moins actifs
et incolores qui permettent d’autre part de mieux suivre visuellement la progression des
substances.
Les oxydes, les hydroxydes et les sels minéraux insolubles, sont parmi la plus grande majorité
d’adsorbants utilisés. Il existe aussi des adsorbants organiques dont l’emploie n’est pas trop
fréquent.
b). Adsorbants minéraux
La silice SiO2 ou gel de silice est souvent plus ou moins hydratée. On l’obtient par
précipitation acide des silicates métalliques. Elle se présente sous forme d’une poudre blanche et
de très fines granulométries. Etant donné que la silice est très avide d’eau, elle doit être activée
par séchage à l’étuve à 150 ou 200 °C avant d’être utilisé. Ses sites acides pourront être masqués
partiellement en les traitant par une base, soude ou potasse, ou en mélangeant le solvant d’élution
avec de petites proportions d’amines ou d’ammoniaque.
L’alumine Al2O3, nH2O. Cet adsorbant est aussi très utilisé car il présente de très bonnes
propriétés d’adsorption. Selon sa préparation, il renferme un certain nombre de molécules d’eau
liée, mais s’hydrate très facilement au contact de l’air. Avant son utilisation, il est nécessaire de
ménager son activation. La meilleure température se situe vers 200 °C. L’alumine est obtenue par
précipitation des sels d’aluminium par les bases fortes. Elle renferme toujours des impuretés
basiques et doit être traitées préalablement avant son utilisation pour la séparation des substances
acides.
On distingue :
- L’alumine basique qui adsorbe pratiquement, à l’exception des carbures saturés aliphatiques,
toutes les molécules.
- Les alumines neutres et acides dont les activités sont diminuées par lavage avec des solutions
acides telles que l’acide acétique, l’acide chlorhydrique ou nitrite. Elles permettent la séparation
des substances à caractère acide.
Autres Adsorbants :
Les sels de calcium, phosphates et carbonates, les oxydes de magnésium qui présentent une
activité spécifique pour une molécule plane insaturée et les silicates de magnésium encore
appelés Florisil.
c). Adsorbants organiques
Ils sont aussi nombreux, mais d’activité plus faible. La cellulose et ses dérivés, l’urée, les
polyamides et les saccharoses qui sont des adsorbants polaires.
Les adsorbants non polaires sont obtenus par polymérisation de styrène (vinylbenzène) et de
divinylbenzène
Nous pouvons en fin citer le séphadex qui permet de séparer les substances suivant leur poids
moléculaire.
les argiles et les zéolites sont de bons adsorbants naturels. Le charbon actif est un excellent
adsorbant
19
 V.2. ELUANT
La phase mobile en chromatographie est encore appelée éluant. L’élution est le processus
de faire passer l’éluant à travers l’adsorbant contenu dans une colonne chromatographique (CC)
ou fixé sur une plaque de verre ou d’aluminium (CCM). Les équilibres résultant de la distribution
des substances entre l’adsorbant et la phase mobile, sont déterminés par leurs actions
intermoléculaires. Les molécules de l’éluant se substituent à celles des solutés sur les sites de
l’adsorbant et donnent naissance à des liaisons adsorbant-éluant. La création d’interactions
moléculaires éluant-solutés, impliquent que ces derniers soient solubles dans l’éluant. Les mêmes
forces complexes que celles vues précédemment lors de l’étude du phénomène d’adsorption
(forces électrostatiques, forces inductives, forces des liaisons hydrogène, etc) expliquent les
liaisons adsorbant-éluant. L’ensemble de ces interactions définit la force d’élution d’un solvant.
Cette force est généralement assimilée à l’énergie d’adsorption des molécules du solvant sur
l’adsorbant et elle est liée à la polarité.
Il existe plusieurs possibilités de classer les solvants pour comparer entre eux leur
force d’élution 0.
L’habitude a été prise d’envisager leur énergie spécifique d’adsorption vis-à vis de l’alumine pris
comme adsorbant de référence (c'est-à-dire leur énergie de fixation par gramme d’alumine) et
d’établir des séries éluotropes traduisant ainsi leur polarité.
Les solvants à force éluotrope élevée sont les plus polaire : eau, alcool et les solvants
pratiquement apolaires comme les carbures saturés ont des valeurs de 0 extrêmement basses.

20
Tableau : Série éluotrope sur l’alumine de quelques solvants classés par ordre de polarité
croissant

Solvant 0
Hexane 0.00
Ether de pétrole 0.01
heptane 0.01
Cyclohexane 0.04
Tetrachlorure de carbone 0.18
Ether isopropylique 0.28
Toluène 0.29
Benzène 0.32
Ether éthylique 0.38
Chloroforme 0.40
Chlorure de méthylène 0.42
Dichloro éthane 0.49
Acétone 0.56
Dioxanne 0.56
Butanol 0.56
Acétate d’éthyle 0.58
Acétonitrile 0.65
Pyridine 0.71
Diméthylsulfoxyde 0.75
Alcool isopropylique 0.82
Alcool éthylique 0.88
Alcool méthylique 0.95

Le choix des éluants est souvent guidé par un certain nombre de contraintes pratiques
liées à leur comportement vis-à-vis des échantillons à chromatographier, des phases stationnaires
et de l’appareillage à utiliser. Exemple le méthanol qui est un solvant très polaire dissout
partiellement la silice.
Le développement du chromatogramme s’effectue en utilisant parfois le solvant ou le
mélange de solvant qui a permis de fixer l’échantillon sur la colonne ou mieux un solvant
légèrement moins polaire que ce dernier. Lorsque les substances sont très retenues par
l’adsorbant, les opérations peuvent être très longues.
On préfère généralement, quand cela est possible, augmenter graduellement la force
d’élution en mélangeant deux solvants de polarités différentes. Le choix de ces solvants dépend
de l’expérience de l’utilisateur, mais il est également possible de le déterminer en faisant des
essais préliminaires en CCM, dont les résultats sont ensuite transposables en CC.

21
 Les solutions obtenues après élution d’un échantillon à travers une phase stationnaire
est appelées éluats et les substances présentent dans chaque éluat obtenu peuvent être décelées
par une CCM analytique.

I.2.5. Révélation
Lorsque les substances sont colorées, elles sont aisément localisées ; mais très souvent
elles sont incolores et doivent être décelées par des procédés appropriés à leur nature. Il existe
ainsi plusieurs méthodes permettant de visualiser les produits sur une plaque de CCM parmi
lesquelles :
- L’examen sous lumière ultratviolette permettant de visualiser la plupart des
substances organiques porteuses d’électrons 
- Exposition aux vapeurs d’iode De nombreux composés organiques peuvent être
localisés par ce procédé. Les composés insaturés et les composés aromatiques sont les plus
sensibles
- Formation des réactions colorées Ici il y a pulvérisation de solutions suivie d’un
éventuel chauffage à 100 °C. De nombreux réactifs utilisés, nous pouvons citer :
Des réactifs très généraux tel que l’acide sulfurique dilué à 50 %, l’acide phosphorique ou de
solutions très oxydantes tel que : bicarbonate de potassium ou permanganate de potassium en
solution acide sulfurique.
Des réactifs spécifiques de certains composés : réactifs des alcaloïdes (test de draggendorft),
des triterpènoïdes (test de libermann Burchard), des flavonoïdes (test de shinoda), des
anthraquinones (test de Bornträger), des phénols (test au chlorure ferrique), des sucres, etc.

CHROMATOGRAPHIE SUR GEL OU CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION

DIFFUSION

La chromatographie d'exclusion est aussi appelée filtration sur gel ou tamisage

moléculaire. On peut encore l’appelé Chromatographie par perméation de gel. Cette technique est
apparue en 1959. La chromatographie sur gel se fonde sur la possibilité des molécules de taille
différentes de pénétrer ou de ne pas pénétrer à l’intérieur des phases stationnaires. C’est une
méthode d’analyse générale permettant d’effectuer non seulement la séparation, mais également
la purification et l’analyse de mélange complexe, notamment lorsque les constituants du mélange
ont des masses molaires ou des tailles différentes. Cette méthode repose sur le comportement
dissemblable de molécules de volumes différents, vis-à-vis des grains poreux d’une phase
stationnaire constituée par un gel : Les molécules diffusent à l’intérieur des grains du gel où elles

22
en sont exclues. Contrairement à d’autres méthodes chromatographiques, elle est entièrement
indépendante de la nature des solvants.

Les raisons qui font de ce type de chromatographie, une technique de choix dans ces domaines
d'applications, sont les suivantes:
- la rétention des différentes molécules est relativement indépendante du milieu extérieur
(nature du tampon, force ionique, pH, température...). Ainsi la séparation peut se faire dans
les meilleures conditions pour le composé.
- il n'y a pratiquement pas de phénomènes d'adsorption
- passage facile de l'analytique au préparatif
- méthode de choix pour dessaler les solutions biologiques.

1. Principe et caractères
Le matériel servant de base à cette séparation est un gel, c'est-à-dire un milieu d’aspect
homogène formé par deux phases :
- une phase dispersée qui est la substance solide constituant le substrat du gel
- une phase dispersante qui est le solvant
Le substrat du gel est composé de petites particules très régulières, grains, billes ou perles
parfaitement calibrées. Chaque grain résulte de la liaison de macromolécules assemblées les unes
aux autres de façon à former un ensemble régulièrement réticulé.
En présence du solvant, chaque particule du gel gonfle parce que celui-ci pénètre à l’intérieur.

Les gels utilisés en chromatographie ont des origines très différentes et pour certains des
applications spécifiques. Ils doivent tous présentés un certain nombre de caractère dont la
connaissance est indispensable au moment de leur choix :
Par exemple : Le diamètre des pores (le gel commercialisé sous le nom de séphadex G10 est très
réticulé et a des mailles très étroites, il n’absorbe que 1 ml d’eau /gramme de sel sec, alors que le
séphadex G200 dont les mailles sont très lâches en absorbe 20 ml), la taille et la forme des
particules, l’inertie et la consistance.
Le gel le plus utilisé de nos jours est le gel de dextrane commercialisé sous le nom de séphadex.
Ce gel est obtenu à partir du dextran, polyholoside polymérisé obtenu après culture de
Leuconostoc mesenteroides dans des solutions de saccharose.

23
 En chromatographie classique sur colonne, les diamètres peuvent aller de 40 à 120µ, pour
les gels séphadex ; mais en Chromato haute performance ou en CCM, les tailles sont plus réduites
(20 à 80µ). Ce gel permet d’obtenir la séparation des molécules dont les P.M. vont de 700 à
800 000.

Gel d’agarose (Sépharose) : ce gel possède une porosité beaucoup plus élévée que le séphadex et
permet de séparer des molécules dont le poids moléculaire peut aller de 10 000 à 150 millions.
Gels de polyacrylamide commercialisés sous le nom de Biogels : Ils sont obtenus par
polymérisation de l’amide acrylique en présence d’un amide acrylique bifonctionnel le N-N’
méthylène bis acrylamide (CH2=CHCONH)2CH2. Ils permettent la séparation des molécules dont
les P.M. vont de 200 à 400 000.
Gels de polystyrène commercialisés sous le nom de Styragel : Ils sont obtenus par la
polymérisation de dérivés du vinyl benzène en présence du divinyl benzène

24
CHROMATOGRAPHIE PAR ECHANGE D'IONS

La chromatographie par échange d'ions est une chromatographie en phase liquide où la

phase stationnaire est constituée par une trame solide insoluble dans l’eau, sur laquelle sont
greffés, par liaison covalente, des groupements fonctionnels ionisables. Chaque groupement est
donc susceptible de donner un ion chargé positivement et un ion chargé négativement : l’un reste
fixé sur la matrice, l’autre ion mobile de charge opposée assurent l'électroneutralité et peut
s’échanger avec les ions de même signe de la solution. Ainsi, des molécules chargées peuvent
s'adsorber réversiblement sur l'échangeur d'ions, et être ensuite relarguées de la résine, en
modifiant la composition ionique du solvant.
L'expérience est, classiquement, conduite en 3 temps:
1- dépôt des substances sur la colonne choisie en fonction des charges des molécules et de la
résine.
2- élution des molécules généralement en augmentant de façon graduelle la force ionique du
solvant d'élution.
3- régénération de l'échangeur d'ions (par lavage extensif avec une solution de pH permettant de
remettre les charges dans leur valeur initiale
Nature :
La phase stationnaire est constituée d'un support insoluble dans l'eau, sur lequel sont
greffés des groupements fonctionnels ionisables.

-Les supports sont les mêmes que ceux que l'on utilise dans les autres types de chromatographies
c-à-d:
• minéraux : silice
• organiques : résine polystyrénique, polyacrylamide, cellulose, dextrane
-Les groupements fonctionnels sont fixés par des liaisons covalentes sur la matrice; ils sont de
deux types:
• les échangeurs de cations portent des groupements chargés (-)

25
• les échangeurs d'anions portent des groupements chargés (+)
Sur ces supports sont greffés:
- soit des groupements acides susceptibles de se charger négativement à pH du tampon qui
baigne la résine supérieur au pK des groupements greffés: il s'agit alors d'échangeurs de
cations
- groupements sulfopropyl, carboxy méthyl, phosphorique, sulfonique.
- Les molécules retenues sont celles qui sont chargées positivement. Les protéines
acquièrent une charge globale positive si le pH du tampon est inférieur à leur pH
isoélectrique.
- soit des groupements basiques susceptibles de se charger positivement à pH du tampon
qui baigne la résine inférieur au pK des groupements greffés: il s'agit d'échangeurs
d'anions groupements diéthyl (hydroxyl 2 propyl), aminoéthyl, diéthyl amino éthyl, p
amino benzoyl, triméthyl ammonium.
Les molécules retenues sont celles qui sont chargées négativement. Les protéines acquièrent
une charge globale négative si le pH du tampon est supérieur à leur pH isoélectrique.
Les colonnes échangeuses d'ion peuvent également servir pour désaler les solutions de
protéines ou d'acide nucléiques, utilisées par exemple en centrifugation. Si la colonne contient
des résines échangeuses à la fois d'anions et de cations, la solution est complètement " lavée "
de ses ions autres que les protons et les hydroxyles.
La séparation est basée sur cette propriété d'échange d'ions et ne peut donc s'appliquer qu'à des
solutés ionisables.
Exemples :
ECHANGEURS DE CATIONS ECHANGEURS D'ANIONS

FORTS

FAIBLES

26
CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER
Proposée en 1944 par Consden, Gordon et Martin, C’est une chromatographie de partage
liquide-liquide au cours de laquelle les constituants du mélange sont séparés à partir de leur
différence de coefficient de partage. Ces chercheurs montrèrent qu’il était possible de séparer
sans les acétyler des aminoacides en se fondant sur leur différence de solubilité entre une phase
mobile organique, une phase stationnaire aqueuse immobilisée sur une grande feuille de
cellulose.
Exemple : Le fonctionnement est similaire à celui présenté pour la CCM, à l’exception que le
papier ici remplace la plaque en verre ou en aluminium. Dans plusieurs applications l’eau est le
solvant et la cellulose du papier constitue la phase stationnaire.

ÉLECTROPHORÈSE

Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un

champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine « phorèse » vient
du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ».

L’électrophorèse est la séparation des (macro)molécules chargées par migration dans un champ
électrique (qui entraîne le déplacement des molécules chargées, à un pH donné) en fonction de
leur taille, de leur charge électrique et d’autres propriétés physiques sur un support imprégné de
solvant.

Contrairement à la chromatographie où la distance de migration des molécules dépend de la

solubilité des molécules dans le solvant et de leur affinité pour le support, en électrophorèse, la
distance de migration dépend de la charge (nette), de la masse de la molécule et de sa forme
tridimensionnelle.

L’électrophorèse est généralement utilisée par les biologistes et biochimistes pour séparer les
acides aminés, les acides nucléiques, les protéines, les peptides et les nucléotides.
On peut utiliser l’électrophorèse pour séparer les différentes protéines d’un extrait, grâce à leur
charge électrique nette. Cette charge électrique (nette) reflète la composition de ces protéines en

27
acides aminés. Par exemple, le blanc de l'œuf (ou le sérum) contiennent plusieurs protéines qui
peuvent être séparées en fonction de leur charge électrique.
L’électrophorèse des protéines peut être réalisée sur des supports variés :
- selon un montage horizontal : support papier, acétate de cellulose ou gel d’agarose
- selon un montage vertical : gel de polyacrylamide.

1. Électrophorèse sur gel

L’électrophorèse sur gel est une méthode de séparation des macromolécules en fonction de leur
taille, de leur charge électrique et d’autres propriétés physiques. Elle fait référence à une
technique où les molécules sont obligées de traverser une couche de gel sous l’impulsion d’un
courant électrique.
L’énergie motrice de l’électrophorèse est la tension qui est appliquée à des électrodes placées de
part et d’autre de la couche de gel. Les propriétés d’une molécule déterminent la rapidité avec
laquelle un champ électrique peut traverser un milieu gélatineux.
Diverses macromolécules biologiques importantes (ex.: acides aminés, peptides, protéines,
nucléotides et acides nucléiques) possèdent des groupes ionisables qui, à un pH donné, se
transforment en espèces chargées électriquement sous forme tantôt de cations (+), tantôt d’anions
( ̶ ).En fonction de la nature de la charge du réseau, les particules chargées migreront soit vers la
cathode, soit vers l’anode. À titre d’exemple, lorsqu’un champ électrique traverse un gel de pH
neutre, les groupes de phosphates chargés négativement de l’ADN provoquent la migration de
celui-ci vers l’anode (Westermeier, 1997).

1.1. Électrophorèse sur gel d’agarose

L’électrophorèse à travers l’agarose est une méthode utilisée de façon standard pour séparer,
identifier et purifier des fragments d’ADN. La technique est simple et facile à réaliser et peut
dissoudre des fragments d’ADN que d’autres procédures ne permettent pas de séparer
correctement.

1.1.a) Principe de l’électrophorèse sur gel d’agarose

28
La technique de l’électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer les acides nucléiques et les
protéines. La séparation de macromolécules dépend de deux variables : la charge et la masse.
Lorsqu’un échantillon biologique tel qu’un ADN est mélangé à une solution tampon et appliqué
sur un gel, il se produit une interaction des deux variables. Les molécules repoussées d’un côté
par le courant électrique produit par une électrode sont attirées simultanément par le courant
produit par l’autre électrode. La force de friction du matériau composant le gel joue le rôle de «
tamis moléculaire » et sépare les molécules en fonction de leur taille. Durant l’électrophorèse, les
macromolécules sont poussées à travers les pores. Leur vitesse de migration à travers le champ
électrique dépend des facteurs suivants :
• la résistance du champ,
• la taille et la forme des molécules,
• l’hydrophobicité relative des échantillons,
• la force ionique et la température du tampon dans lequel les molécules se déplacent.

1.1.b) Quelques composants de l’électrophorèse sur gel d’agarose

→ Agarose
L’agarose, un colloïde naturel extrait d’une algue, est un polysaccharide linéaire (masse
moléculaire moyenne : ~12 000 Da) composé de l’unité de répétition fondamentale agarobiose,
elle-même composée d’unités alternantes de galactose et de 3,6-anhydrogalactose. L’agarose est
très fragile et se détruit facilement sous l’effet de manipulations. Les gels d’agarose ont de grands
« pores » et sont utilisés essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse
moléculaire supérieure à 200 kDa.
Les gels d’agarose sont obtenus en mettant la poudre d’agarose déshydraté en suspension dans un
tampon aqueux, puis en faisant bouillir le mélange jusqu’à ce que l’agarose se transforme en une
solution claire.

→ Tampon d’électrophorèse
La mobilité électrophorétique de l’ADN est affectée par la composition et la résistance ionique
du tampon d’électrophorèse. En l’absence d’ions, la conductance électrique est minimale et

29
l’ADN migre lentement, voire pas du tout. Dans un tampon à résistance ionique élevée, la
conductance électrique est très efficace et une quantité importante de chaleur est générée. Dans le
pire des cas, le gel se met à fondre et l’ADN se dénature. Les tampons d’électrophorèse sont
généralement préparés sous forme de solutions concentrées et conservés à température ambiante.

→ Concentration d’agarose
Un fragment d’ADN d’une taille donnée migre à travers des gels à différents taux en fonction de
la concentration d’agarose. En fonction de la concentration spécifique de l’agarose ou du tampon,
des segments d’ADN contenant entre 20 et 50 000 bp peuvent être séparés. Dans les gels
horizontaux, l’agarose est généralement utilisé à des concentrations comprises entre 0,7% et 3%
(cf. Tableau 2).

Tableau Concentration de gel d’agarose recommandée pour différencier des molécules d’ADN
linéaires

% d’agarose Éventail de tailles d’ADN (bp)

0,75 10 000 – 15 000
1,0 500 – 10 000
1,25 300 – 5 000
1,5 200 – 4 000
2,0 100 – 2 500
2,5 50 – 1 000

→ ADN marqueur
La distance de migration, pour une tension, un gel d’agarose et des concentrations de tampon
donnés, dépend du poids moléculaire du matériau de départ. Les puits situés à gauche et à droite
du gel devraient, dès lors, être remplis avec un ADN marqueur d’une taille connue. Un marqueur
contient généralement un nombre défini de fragments d’ADN connus, ce qui permet de
déterminer plus facilement la taille des ADN inconnus si une distorsion systématique du gel
devait se produire en cours d’électrophorèse.

30
1.2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide : Principe

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide est une électrophorèse verticale. Les molécules sont
séparées par migration dans un champ électrique sur un gel de polyacrylamide imprégné de
solvant. Les protéines, chargées négativement, migrent vers l’anode, borne chargée
positivement. La distance de migration dépend de la charge (nette) et de la masse de la molécule
(ainsi que de sa forme tridimensionnelle).
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide s’effectue par montage vertical. Le gel est situé entre
deux plaques de verre. Chaque extrémité du gel est mise en contact avec un tampon contenant des
électrolytes qui, soumis à un champ électrique, permet la propagation d'un courant électrique
dans le gel. Les mélanges à tester et les témoins (marqueurs
de poids moléculaire) sont déposés dans les micro-puits. Les
protéines sont révélées au bleu de Coomassie (bandes).
En parallèle, on fait migrer un mélange de protéines
marqueurs de poids moléculaire dont la longueur est
connue (kit acheté dans le commerce). Ceci permet de
déterminer le poids moléculaire d’une protéine inconnue et
ainsi l’identifier.
Le gel est constitué d’acrylamide (formant des chaînes
linéaires) et de bis-acrylamide (formant des ponts entre les chaînes). Selon la
proportion des deux composés, on obtient un gel avec des mailles plus ou
moins grandes : il joue le rôle de tamis moléculaire. La taille des mailles doit
être du même ordre de grandeur que la taille des protéines.

L’électrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide peut être réalisée sous

plusieurs conditions :
- en conditions non dénaturantes : migration selon la charge nette, la masse moléculaire et la
forme (structure tridimensionnelle) de la protéine
- en conditions dénaturantes (SDS : dodécyl sulfate de sodium) : séparation selon la masse
uniquement

31
- électrophorèse bidimensionnelle : séparation selon la charge nette, puis selon la masse
moléculaire.

1.2.a) Électrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes

L’électrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes ou

électrophorèse en présence du dodécyl sulfate de sodium ou électrophorèse SDS (ou SDS-PAGE :
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) sépare les protéines selon leur
masse moléculaire (uniquement). Les protéines sont dénaturées et recouvertes de SDS chargé
négativement.
Le SDS (dodécyl sulfate de sodium) encore appelé laurylsulfate de sodium (LSS) [n-CH3 (CH2)11-
SO4Na] est un détergent ionisé qui se fixe aux protéines. Les protéines sont alors recouvertes par
les charges négatives du SDS, leur propre charge nette est masquée.

Dénaturées et uniformément chargées négativement par le SDS, les protéines migrent vers
l’anode (borne +) uniquement en fonction de leur masse, donc de la longueur de leur chaîne
polypeptidique. On ne sépare pas les protéines en fonction de leur charge.

1.2.b) Électrophorèse de protéines bidimensionnelle

L’électrophorèse de protéines bidimensionnelle sépare les protéines selon leur charge puis selon
leur masse moléculaire.
1ère dimension : séparation des protéines en fonction de leur charge par focalisation
isoélectrique
Pour toute protéine, il existe un pH isoélectrique (pHi), pH pour lequel la protéine est
électriquement neutre et ne se déplace pas dans un champ électrique (la conductivité de la
protéine est nulle : γ= 0).
Dans la focalisation isoélectrique, les protéines (à l’état natif, non dénaturées) migrent dans un
tube étroit de gel de polyacrylamide dans lequel il est établi un gradient de pH grâce à un
mélange de tampons spéciaux. Chaque protéine migre dans le gradient de pH jusqu’à un point
qui correspond à son pH isoélectrique et elle se stabilise à ce niveau.

32
2ème dimension : séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en SDS (conditions dénaturantes).

1.2.c) Le western blot: électrophorèse de protéines suivie de la recherche d’une protéine X par
un anticorps anti-protéine X

Le Western blot est une technique complémentaire de l'électrophorèse des protéines. Après
migration dans un gel de polyacrylamide, les protéines sont transférées sur une membrane, qui
est alors l'exacte réplique du gel de polyacrylamide
après migration.
La présence d’une protéine particulière est ensuite
révélée par réaction avec un anticorps se liant
spécifiquement à la protéine recherchée. L'anticorps
est marqué par un fluorochrome, par un isotope
radioactif, ou lié à une enzyme dont la réaction avec
son substrat produit une substance colorée.

5.2. Électrophorèse sur bande d’acétate de cellulose : principe

Les protéines ont une charge électrique nette qui reflète leur composition en acides aminés.
L’électrophorèse de protéines sur bande d’acétate de cellulose est une électrophorèse horizontale.
Les molécules sont séparées par migration dans un champ électrique sur une bande d’acétate de
cellulose (dérivé acétate d'une forme purifiée de cellulose) imprégnée de solvant.

Une cuve d’électrophorèse pour montage horizontal est formée de deux réservoirs de tampon
séparés munis chacun d'une électrode de platine.
Chaque support de bande est placé à cheval au-dessus de la cloison qui sépare les deux réservoirs.
Les deux bouts de la bande plongent dans le tampon (solution d'électrolytes).

33
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE

La chromatographie en phase supercritique (CPS) est une méthode de chromatographie

utilisant un fluide supercritique comme phase mobile. La CPS a été mise en œuvre pour la
première fois en 1962 par Klesper, Corwin et Turner

À la différence des principales techniques chromatographiques (GC et LC), cette méthode

requiert que la sortie de la colonne soit pressurisée. C'est une condition nécessaire pour créer
cette phase mobile intermédiaire, d'énergie interne élevée, qui transfère les solutés comme le
ferait un gaz et les dissout comme le ferait un liquide. Ainsi s'ouvre un vaste domaine de
conditions opératoires tridimensionnelles où l'on peut faire varier la pression, en plus de la
température (dimension de la GC) et de la composition de la phase mobile (dimension de la LC).

Phase mobile

Doté d'un faisceau remarquable de propriétés physiques, économiques et écologiques (car il est
produit par recyclage et non par combustion), le dioxyde de carbone (CO2) est le composant
majeur des phases mobiles de la SFC. Il possède aussi l'avantage d'avoir un point critique
facilement accessible (31,1 °C à 74 bars) contrairement à l'eau, par exemple (374,15 °C à 221,2
bars). Dans ce rôle, le CO2 est éventuellement mélangé sous pression avec un modificateur
polaire, souvent un solvant usuel (du méthanol par exemple) contenant les additifs secondaires
couramment utilisés en Chromato liquide.

Avantages

La SFC répond le mieux à des besoins industriels par ses méthodes rapides, très efficaces et
rentables qui contribuent aux efforts de rationalisation dans le domaine des séparations
moléculaires. L'industrie pharmaceutique en est la principale utilisatrice, notamment pour séparer
les énantiomères des molécules chirales.

Colonnes remplies
On utilise en CPS les mêmes géométries et la même variété de phases stationnaires qu’en CPL, y
compris la grande majorité des phases stationnaires chirales (à l’exclusion des phases
stationnaires incompatibles avec la CPS comme les échangeurs d’ions par exemple). Toutefois,

34
on choisira de préférence une phase stationnaire de forme sphérique et des conditions de travail
(P, T et débit de phase mobile) permettant de minimiser la perte de charge qui peut occasionner
un gradient de masse volumique dans la colonne et, partant, un étalement thermodynamique de la
bande de soluté, surtout lorsque des colonnes de grande longueur sont mises en œuvre

Détection
En CPS, la détection peut être effectuée de deux manières différentes : soit directement dans le
fluide à l’état supercritique ou subcritique, soit, après décompression du fluide, à l’état gazeux.
La CPS utilise donc à la fois les détecteurs de la CPL et ceux de la CPG, mettant ainsi à son
profit les progrès technologiques effectués dans ces deux techniques.

35
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)
I) Principe de la chromatographie

La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange

même très complexe.

Il existe trois principaux types de chromatographie:

• la chromatographie en phase gazeuse (CPG)

• la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)

• la chromatographie en couche mince (CCM).

Les deux premières méthodes peuvent être assez largement décrites par des

théories communes. Dans les deux cas, un fluide appelé phase mobile parcourt un

tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne

remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans

les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange

à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui

l'entraîne à travers la colonne.

Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés

généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la

colonne.

De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté

se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de

déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les

autres et donc séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet

d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur

un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au

36
passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un

pic.

Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au

bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise
qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par
ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration
de chaque soluté dans le mélange injecté.

II) La chromatographie liquide haute performance

Les organes

a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité

suffisante. Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes) sont
disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs
solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse.

b) La pompe : elle est muni d'un système de gradient permettant d'effectuer une
programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler:

- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de
l'analyse.

37
- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des
constituants du mélange d'éluants.

Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques l à plusieurs ml/min.

c) Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des

boucles de différents volumes, nous utiliserons une boucle de 20l. Le choix du
volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la
concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection
permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse
quantitative.

d) La colonne

Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux
produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de
diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30
crn. Au delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide
beaucoup trop élevées.

e) La phase stationnaire

- La phase normale:

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il
faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les
produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire
qui sortent en tête.

38
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps
du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.

- La phase inverse :

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des chaînes
linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et
nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les
composés polaires qui seront élués en premier.

Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire

au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante.

- La phase mobile :

L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire

normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés.
La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de
principe :

- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;

- si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (
le plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on
agit sur les facteurs de rétention k des composés.

Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec
une phase greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec
les phase normales. Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite
qu'un composé apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement
retenus. On réalise des gradients d'élution en diminuant au cours de la séparation la
polarité de l'éluant (ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration en
acétonitrile va en croissant au cours de l'élution).

On peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase

mobile.

39
f) Détecteurs

Deux types de détecteurs sont classiquement utilisés

* détecteur UV-visible (celui que nous utilisons) : il mesure l'absorption de la

lumière par le produit à la sortie de la colonne. E opère à longueur d'onde constante,
celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deuterium est utilisé pour des
longueurs d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe à vapeur de mercure est
utilisé à la longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur
soit utilisable, il faut que :

- le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à

l'appareil, et que son coefficient d'absorption  soit suffisamment grand ;

- la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par

l'opérateur.

40
Figure 5: Principe du détecteur UV

* réfractomètre : il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la

sortie de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la
température du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure : il
y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut
les variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de
travailler qu'en mode isocratique avec ce détecteur.

Les données sont collectées par l'intermédiaire soit d'un intégrateur ou d'une -
station d'acquisition.

41
III) Application de la chromatographie à l'analyse

1) Analyse des chromatogrammes

Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics
correspondant à chacun des produits.

Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible.

La composition de la phase mobile est un paramètre particulier à la HPLC. Il faut
donc préciser pour chaque analyse :
- le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…
- la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa composition, débit,
mode de détection  en nm.
- la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilité
du détecteur, etc…

2) Analyse qualitative

Le temps de rétention (tR en min) est une

caractéristique de chaque soluté dans les
conditions opératoires fixées.

On peut comparer le tR de deux solutés en

définissant :

- le facteur de sélectivité  entre les deux

solutés :

- l’efficacité d'une colonne qui est mesure en nombre de plateau théorique :

Nombre de molécule sortant

de la colonne en fonction du temps

42
  : écart type : distance entre le point
d'inflexion (point où la dérivée seconde
s'annule) et la moitié de la courbe.

 : largeur du pic à mi-hauteur

 : largeur à la base (unité de temps)

n = nombre de plateaux théoriques :

HEPT (hauteur équivalente de plateaux

théoriques)

HEPT = L/n (L = hauteur de colonne, n nombre de plateaux théoriques)

Résolution de la colonne pour la séparation de deux solutés bien déterminés.

R>1 bonne séparation

R<1 mauvaise séparation  donc les paramètres appliqués à la colonne ne sont pas
les bons.

3) Analyse quantitative

Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est
proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.

Méthode de l'étalonnage externe :

Il est nécessaire de disposer d'une

quantité suffisante du produit afin de
faire une courbe d'étalonnage Aire =
f(masse ou concentration du produit), pour
un volume injecté constant V. L'injection
ultérieure du même volume V de
l'échantillon à doser permet, à l'aide de la

43
mesure de l'aire du pic reportée sur la courbe d'étalonnage, de connaître la masse
ou la concentration recherchée. Cette méthode est plus précise que celle qui
consiste à ne faire qu'une mesure avec l'étalon et à utiliser une règle de trois :

Ae/Me = Aet/met

A: Aire des pics

e : échantillon

et : étalon

m : masse du produit remplaçable par la concentration

Méthode des ajouts :

Comme la précédente, cette méthode nécessite de posséder le produit à analyser

pur; après avoir analysé l'échantillon, on ajoute à celui-ci des quantité connues m
du produit avant de le chromatographier à nouveau ( faire au minimum deux ajouts),
ce qui entraîne une variation de l'aire du pic A.

Si m est la masse contenue dans l'échantillon à analyser,

(A/m) = a/m soit m= A*(m/A)

Si le produit ajouté est en solution, il faut tenir compte des effets de dilution.

Méthode de l'étalon interne (utilisée essentiellement en CPG) :

On compare la réponse du ou des produits à analyser à celle d'un étalon interne,

donc introduit dans le mélange à doser et convenablement choisi.

44
Une solution étalon est préparée avec le ou les produits que l'on veut doser. Les
masses sont connues m’1, m’2, et … me pur l'étalon ; à ces masses correspondent les
aires A’1, A’2, …, A'e, sur le chromatogramme.

Dans l'échantillon contenant les masses m1, m2, … de solutés on ajoute me de

l'étalon, ce qui donne les aires A1, A2, Ae.

On obtient :

m'1 = 1 A’1

m'2 = 2 A’2

me = e A'e

avec  coefficient de proportionnalité

et k1 = (1/e) = (m'1 A’e /me A’1)

d'où la valeur k1 puisque toutes les données sont connues.

Dans l'échantillon inconnu on aura :

m1 = 1 A1

me = ae Ae

(m1/me) = (1 A1/e Ae) = k1(A1/Ae)

me, k1, A1, Ae sont connus.

45