Mémoire de Fin D'études

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
Université Abdelhamid Ibn

UPER
‫جامعة عبد الحميد بن باديس‬
Badis-Mostaganem
‫مستغانم‬
Faculté des Sciences de la
‫كلية علوم الطبيعة و الحياة‬
Nature et de la Vie
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ET BIOLOGIE VEGETALE

N° ……………………………………………………..…….…… /SNV/2015
Mémoire de fin d’études

Présenté par
Djelti nadjet et Lassal samira

Pour l’obtention du diplôme de
Master en biologie
Spécialité:
Génétique Moléculaire et Génomique des microorganismes
Thème
Identifications biomoléculaires et Caractérisation
biotechnologique des levures issues du cépage Cinsault
cultivé dans la commune Ben Abdelmalek
Ramdane(Mostaganem)
Soutenue publiquement le 28/06/2017
Devant le Jury
Président Mr. BENAKRICHE. B Maitre de conférences, U. Mostaganem

Encadreur Mr. BEKADA .A Maitre de conférences, U. Mostaganem
Co.Encadreur Mlle.. . BERBER.N Maitre-assistant, u. Mostaganem
Examinateurs Mr .CHADLI. R Maitre de conférences, U. Mostaganem
2016-2017
Remerciements
Avant toute chose, nous remercions « ‫ » هللا‬qui nous a donné la patience, le courage et la
volonté pour réaliser ce mémoire
Nous tenons aussi à présenter nos sincères remerciements
à notre encadreur le Pr .Bekada. pour la confiance qu’il nous a accordée en
acceptant cet encadrement
Pour sa disponibilité tout au long de l’élaboration de ce mémoire, pour son aide,
Ses critiques et ses suggestions, et surtout pour sa patience dans la correction de ce mémoire.
Nous remercions Pr. Benakrich d’avoir accepté la présidence du jury de la soutenance.
Nous remercions Pr .Chadli qui a accepté d’examiner ce modeste travail.
Nous voudrons remercier aussi les techniciens du laboratoire de microbiologie Djillali,

Mohamed, et particulièrement Hafida pour sa patience, son aide précieuse et ses valeureux
conseils.
Finalement, nous remercions tous ceux ou celles qui ont contribué de près ou de loin à
l’accoplissement de ce mémoire.
Avous tous, un grand Merci
D. Nadjet
L. Samira
Table des matières
Table des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Introduction générale...............................................................................................1
Partie: Etude bibliographique
Chapitre I : Raisins et levures
I.1. Raisin et vignoble...............................................................................................3

1.1. Histoire...............................................................................................................3
1.2. Définition...........................................................................................................3
3. Les maladies de la vigne............................................................................4
3.1. Les maladies virales..........................................................................................5
3.2. Les maladies à phytoplasmes...........................................................................5
3.3. Les maladies bactériennes................................................................................5
3.4. Les maladies à nématodes ...............................................................................6
3.5. Les maladies fongiques....................................................................................6
4. La Physiologie de la vigne..................................................................................6
5. Les organes de la vigne.......................................................................................6
5.1. Les racines........................................................................................................7
5.2. Les troncs et les bras.........................................................................................7
5.3. Les rameaux et les sarments.............................................................................7
5.4. Les feuilles........................................................................................................7
5.5. Les bourgeons...................................................................................................8
5.6. La flour.............................................................................................................8
6. Les Principales maladies et ravageurs de la vigne.............................................9
7. Les maladies cryptogamiques de la vigne...........................................................9
7.1. Le Mildiou........................................................................................................9
7.2. Symptômes.......................................................................................................9
7.2.1. Feuilles..........................................................................................................9
7.2.2. Tiges............................................................................................................10
7.2.3. Baies............................................................................................................10
8. L’oidium............................................................................................................10
8.1. Symptômes .....................................................................................................11
8.1.1 feuilles...........................................................................................................11
8.1.2 Tiges..............................................................................................................11
8.1.3 Inflorescences................................................................................................11
8.1.4 Baies..............................................................................................................11
9. Les maladies à virus...........................................................................................12
9.1 Court noue.......................................................................................................12
10. les ravageurs....................................................................................................12
10.1Phylloxéria.....................................................................................................12
10.2 La Pyrale.......................................................................................................12
10.3 Cochylis........................................................................................................13
10.4 L’atise...........................................................................................................13
11. Etude de la physioogie....................................................................................13
11.1.1. Étude de la rafle.........................................................................................13
12. Baie de raisin....................................................................................................14
12.1.1 .Etude de la pellecule de raisin....................................................................14
12.1.2. Étude de la pulpe.........................................................................................14
12.1.3. Étude des pépins..........................................................................................15
12.2. Étude des constituants chimique...................................................................15
12.2.1. L’alcool.........................................................................................................15
12.2.2. Les acides organiques....................................................................................15
12.2.3. Les polyphénols.............................................................................................16
12.2.3.1 Les métiers colorants...................................................................................16
12.2.3.2 Les anthocyanes..........................................................................................17
12.2.3.3 Les polyphénols incolores..........................................................................17
13. Substances aromatique.......................................................................................18
13.1. Les aromes primaires......................................................................................18
13.2. Les aromes secondaires..................................................................................18
13.3. Les aromes tertiaires........................................................................................18
14. Substances azotées..........................................................................................19
15. 1 .Enzyme.........................................................................................................19
15.2. Vitamines.......................................................................................................20
15.3. Substances minérales.....................................................................................20
15. Influence des facteurs externe...........................................................................20
15.1. Sol de plantation..............................................................................................20
15.2. Climat.............................................................................................................20
15.2.1 Léensoleillement ou la lumiére................................................................... 20
15.2.3 La pluvométrie..............................................................................................21
15.2.4. Les vents......................................................................................................21
16. La flore microbienne du raisin et son origine...................................................21
17. Notion de cépage...............................................................................................22
16.1. Le cepage........................................................................................................22
16.2.1 la diversification entre les cépages...............................................................22
16.2.1 La couleur de la peau....................................................................................22
16.2.2 L’observation des caractères morphologiques.............................................22
17. La viticulture dans le monde.............................................................................23
18. La viticulture en Algérie...................................................................................23
Partie : Etude bibliographique
CHAPITRE II : Etude fondamental des levures
II.1 .Générale......................................................................................................25
1.1 .Définition de la levure................................................................................25
1.2 .Caractéristiques des levures........................................................................25
3. Historique de levure.....................................................................................26
4. Morphologie de la levure.............................................................................26
4.1 .Cytologie et organisation...........................................................................28
4.2 .la paroi.......................................................................................................28
4.3 .membrane cytoplasmique...........................................................................29
5. caractéristiques et cycle de reproduction......................................................30
5.2. Caractéristiques et cycle de reproduction.................................................30
5.3. Caractéristiques variables..........................................................................31
5.4. Caractère génétiques..................................................................................31
6. La reproduction de la levure........................................................................32
6.1. Par bourgeonnement..................................................................................32
6.2. Par fusion des spores.................................................................................32
7. La reproduction............................................................................................32
8. Bourgeonnement danc la levure..................................................................34
8.1. Reproduction d’une levure........................................................................35
8.2. La reproduction sexuée............................................................................36
8.3. La reproduction asexuée..........................................................................37
9. différenciation des levures..........................................................................38
9.1. La levure fraiche......................................................................................38
9.20 La levure biologique déshydratée..........................................................38
9.3 La levure biologique lyophilisée..............................................................38
10. les conditions physicochimiques de croissance.......................................39
11. Sensibilité aux agents chimiques.............................................................39
11.1. Acides organiques................................................................................39
11.2. Éthanol.................................................................................................40
11.3. Sulfite...................................................................................................40
11.4. Antifongique........................................................................................40
12. Métabolisme et conditions de croissance................................................40
CHAPITRE III : Technique d’étude des levures
III.I .Isolement des levures...........................................................................42

2. Classification et identification des levures..............................................42
2.1. Classification........................................................................................42
2.2 Technique d’identification....................................................................42
2.2.1. Etude des caractères culturaux...........................................................42
2.2.2. Étude des caractèresmorphologiques cellulaires................................43
2.3.1. Aptitude à la Filamentisation.............................................................43
2.3.2. Morphologie particuliéres..................................................................44
2.3.3 .Caractéristiques sexuelles...................................................................44
4. Caractéristiques biochimiques et physiologiques.....................................45
4.1. Fermentation des sucres........................................................................45
4.2 Assimilation des composés carbonés......................................................45
4.3 Assimilation des sources azotées.............................................................45
5. Méthodes moléculaires d’identification des levures..................................45
6. Les techniques de biologie moléculaires....................................................45
6.1 .La structure d’ADN..................................................................................46
6.2. Matériel génétique des levures................................................................47
6.2.1. Le génome levurien................................................................................47
6.2.2. Les chromosomes...................................................................................47
6.2.3. ADN mitochondrie.................................................................................48
6.2.4. Plasmide.................................................................................................49
6.2.5. ADN ribosomiques.................................................................................50
6.2.6. La région ITS..........................................................................................51
6.3. L’extraction d'ADN...................................................................................52
6.4. Extraction d’ADN génomique de levure....................................................52
6.5. Détermination de la concentration d’ADN................................................53
6.6 .Électrophorèse sur gel d’agarose classique.................................................53
7. L’amplification d’ADN..................................................................................55
7.1. Définition de PCR.........................................................................................56
8. Les différentes méthodes d’identification des levures.....................................57
8.1 PCR quantitative............................................................................................57
8.2. Principe de la quantitative.............................................................................58
8.3. PCR delta........................................................................................................59
8.4. La reverse transcriptase (RT-PCR).................................................................59
8.5. Identification des levures entre espèces..........................................................60
9. Identification des levures au niveau de souche.................................................60
10. biotechnologie des levures...............................................................................64
10.1. L’utilisation de la levure en industrie...........................................................65
Partie II : Etude Expérimental

Chapitre IV : Matériels et méthodes
1. Objectif de l’étude..............................................................................................67
2. Présentation de la région de la récolte...............................................................67
3. Sources de prélèvement des levures..................................................................67
4. Milieu de pré-culture.........................................................................................68
5. Présentation de milieu de culture......................................................................68
6. Isolement, purification et conservation des isolats...........................................69
7. Purification des levures.....................................................................................70
8. Conservation des levures..................................................................................71
9. Identification microscopique des levures.........................................................72
10. Méthode de la coloration avec le bleu de méthylène.......................................72
10.1 Test de filamentisation.................................................................................73
10.2 Test de sporulation......................................................................................73
11. Test des caractéristique biochimiques et physiologiques.................................73
11.1. Fermentation des sucres..............................................................................73
11.2. Milieu de culture.........................................................................................74
12. Caractérisation biotechnologique..................................................................74
12.1. Etude de l’activité enzymatique de la biomasse.........................................75
13. caractérisation biotechnologique...................................................................77
13.1. Fermentation alcoolique chez la levure.....................................................77
14. Identification moléculaire.............................................................................80
Partie II : Résultats et discussion
I. 1. Etudes des Caractéristiques culturaux des souches isolées du cépage cinsault............86

2. Etude des caractéristique morphologique et physiologique des souches..........................88
3. Etude des caractères biochimiques des souches................................................................93
4. Etude des caractères biotechnologique.............................................................................96
5. Etude moléculaire..............................................................................................................98
Conclusion générale...............................................................................................................99
Références bibliographiques ................................................................................................100
Annexes.................................................................................................................................101
Dédicace
A ma mère, la lumière qui éclaire ma vie, qui m’a toujours
encouragé, aidé, qui m’a guidé Dans le droit chemin, qui m’a appris
que rien est impossible, que dieu te garde près de nous, merci
Maman.
A celui qui m’a toujours encouragé et soutenu durant toutes mes

années d’études. Merci pour ton amour et ta confiance total. A toi
très cher papa.
A ma chère et présieuse sœur (Djelti Rommaissa) et frère (Réda).
A mes camarades, Samira, Derar Fatima, Bousoir Imad

particulièrement pour tous les bons moments que nous avons
prtagés.
Et à mon encadreur Pr.Bekada merci pour votre disponibilité et vos

précieux conseils.
Ainsi qu’à toute la promotion de GMGM 2016/2017.
D.Nadjet
Liste des figures
Figure Pages
Figure n°1 : Un cep de vigne et ses différents éléments 04
Figure n°2- 3: Symptômes de Mildiou sur feuille et grappe de vigne. 10
Figure n°4- 5: Symptômes de L’oïdium surfeuil. 12

Figure n° 6: Larve et dégâts sur inflorescence 13
Figure n° 7: Papillon au repos. 13
Figure n°08 : Schéma dʼune baie de raisin 14
Figure n°09 : Production mondiale de raisins 23
Figure n°10 : Représentation idéalisée d’une cellule de levure 27
Figure n°11 : Structure membranaire des levures 28
Figure n°12: Structure de la chitine 29
Figure n°13 : Structure de cellule de levure 30
Figure n°14 : la coloration de levure 30
Figure n°15 : Cycle de la production de la levure 33
Figure n° 16 : Cycle de reproduction de la levure 36
Figure n°18 : Schéma de la reproduction asexuée par bourgeonnement
d’une levure 37
Figure n° 19 : Schéma de la reproduction asexuée par scission d’une levure 38
Figure n° 20 : Filamentisation des levures 43

Figure n°21 : Les trois principales étapes d’étude de l’écologie microbienne 45
par méthode moléculaire.
47
Figure n°22 : Description de la structure d'un chromosome.
48
Figure n°23 : Schéma représentant une bactérie contenant des plasmides.
49
Figure n°24 : Schéma pour la structure l’ADNr
50
Figure n°25 : Schéma explicatif de la situation de la région ITS
52
Figure n°26 : Visualisation de bandes d’ADN sur gel d’agarose.
53
Figure n°27 : principe d’électrophorèse
56
Figure n°28 : Schéma représentant les cycles PCR.
59
Figure n°29 : Le principe de la RT- PCR
61
Figure n°30: Principe de méthode de RAPD
62
Figure n°31: Principe de méthode d’AFLP
66
Figure n° 32 : le cépage Cinsault cultivé de la région Abdelmalek Remdane
dans la Wilaya de Mostaganem.
68
Figure n°34 : Schéma récapitulatif de l’étude microscopique des souches
isolées.
77
Figure n°35 : Dispositif de mesure du CO2 produit permettant la collecte du
gaz
80
Figure n°36 : Schéma récapitulatif de notre étude moléculaire à partir des
souches isolées.
82
Figure n°37 : organisation des gènes codant les ARN ribosomiques
87
Figure n °38 : photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la
souche19’ AMR
88
souche11’ AMR.
Figure n °40: photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la 89

souche 25 AMR.
90
souche 31 AMR
91
souche C AMR
Figure n°43 : Observation des milieux ensemencés par les souches après 92
l’incubation à 30°C pendant 72 heures
Figure n°44 : Observation des milieux ensemencés par les souches après 92
l’incubation à 30 °C Pendant 72 heures.
Figure n° 45: Observation des milieux ensemencés par les souches après 93
l’incubation à 30°C pendant 72 heures.
93
Figure n°46 : Observation des milieux ensemencés par les souches
après l’incubation à 30°C pendant 72 heures.
Figure n°47 : Observation de milieu d’assimilation de l’urée 93

ensemencé par les souches après l’incubation à 30°C pendant 48
heures.
Figure n°48 : Observation de milieux d’assimilation de nitrate 94

ensemencé par les souches après l’incubation à 37°C pendant 48
heures
Figure n°49: Visualisation de la région (ITS-I-ADNr5, 8S-ITSII) 98

amplifiée chez les 05 isolats de Cinsault.
Figure n°50 : Visualisation de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) 98

digérée par la Hinf  chez les 05 isolats de Cinsault.
Figure n°51 : Visualisation de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) 99

digérée par la HaeII chez les 05 isolats de Cinsault.
Liste des tableaux
Tableau pages
Tableau n° 01 : Quelques levures isolées des raisins et des moûts en 22
fermentation
Tableau n°2 : Enzymes de restriction utilisées et conditions d’utilisation 60
Tableau n°3 : Production et utilisation de certaines enzymes levuriennes 63
Tableau (04) : programme PCR pour l’identification des levures 82
Tableau n°05 : observation macroscopique des souches isolées de Cinsault 86
Tableau n°06 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la 87

souche19’AMR
Tableau n°07: caractéristiques morphologiques et physiologiques de la 88

souche11’AMR
Tableau n°08 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche 89

25 AMR
Tableau n°09 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche 90

31 AMR
Tableau n° 10 : Résultats d’études des caractères biochimiques des souches 91

isolées du Cinsault
Tableau n°11: Les résultats du test de la fermentation alcoolique des 94

souches isolées du Cinsault.
Tableau n°12 : Les résultats de l’activité enzymatique de l’invertase des 95

souches isolées du Cinsault.
Tableau n °13 : Fréquences des espèces de levures isolées à partir du 96

cépage Cinsault.
Tableau n °14: Taille en paires de bases des produits de PCR et des fragments 97
de restriction obtenus avec deux endonucléases différentes (Hinf I et HaeII).
Liste des abréviations
A : Adénine
ADN: Acide Désoxyribonucléique
ADNc : Acide Désoxyribonucléique complémentaire
ADNr : Acide Désoxyribonucléique ribosomiaux
AFLP: Amplified Fragment Lenght Polymorphism
ARN: Acide ribonucléique
ARNr : Acide ribonucléique ribosomiques
ARNt : Acide ribonucléique transporteur
ATP : Adénosine Triphosphate
C : Cytosine
Cm : Centimètre
CO2: Dioxyde de carbone / Carbone dioxyde
°C: Degrés Celsius
DAF : DNA Amlified Fingerprinting
dNTP : Désoxyribonucléotides – tri- phosphates
g : Gramme
G : Guanine
G+C : Guanine + Cytosine
Ha: Hectere
H: Heure
H2O : Monoxyde de dihydrogène
HCl : Chlorure d’hydrogène
ITS: Internal Transcribed Spacer
IFV: Institut Français de vigne et du vin
Kb : Kilo paires de base
L : Litre
M b : Million de base
Mg /L : Milligramme par litre
Min : Minute
Ml : Millilitre
mM : Millimole
M-tube: Molecular tube
NAD+ : Nicotinamide Adénine Dinucléotide
NTS : Non Transcribed Spacer
NaCl: Chlorure de sodium
OGA : Gélose glucosée à l’oxytétracycline
O2: Dioxygène
Pb : Paire de base
PCR: Polymerase Chain Reaction
PCR-Q : PCR en tems réel quantitatif
PDA : Potato dextrose agar
PCA: Principal Component Analysis
PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis
PH : Potentiel Hydrogène
RAPD: Random Amplified Polymorphic
Rpm: rotation par minute
RE: Réticulum endoplasmique
REF: Repetitive Extragenique palindromic
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms
RT: La reverse transcriptase
Sec: Seconde
T : Taaymine
T° : Tempirature
Taq : DE Thermus aquaticus
UFC : Unité formant colonie
YPG: Yeast extract peptone glucose
µl: Mictrolitre
Introduction
La vigne est une plante très anciennement cultivée par l’homme, si bien que
l’histoire de la viticulture et du vin se confond avec l’histoire de l’homme. De nos
jours, les vignes couvrent près de 8 millions d’hectares dans le monde et produisent plus
de 67 millions de tonnes de raisins (FAOstat, 2012). En Algérie, la viticulture a connu
un important développement, notamment au cours de la dernière décennie. En effet la
superficie du vignoble algérien est passée de 50000 hectares en 2000 à plus de 70000 en
2012.
De même que toutes les autres plantes cultivées la vigne est sujette à de nombreux
problèmes sanitaires. Les parasites, les pathogènes ainsi que les conditions climatiques
provoquent d’importantes pertes de récoltes au cours des années. Les champignons sont
les agents qui causent les plus importants dégâts sur les vignes. Les maladies qu’ils
provoquent sont très redoutées car ils peuvent s’attaquer à toutes les parties de la plante
en occasionnant la diminution sensible du volume des récoltes ainsi que l’altération
considérable de la qualité des produits (Robert, 2007).
De ce fait et dans le cadre de notre projet de recherche, nous nous sommes penchés sur les
problèmes causés par les bio-agresseurs de la vigne. Notre modèle d’étude.
La deuxième partie expérimentale est basée sur l’isolement, purification, identification

classique et moléculaire des levures ainsi que une caractérisation biotechnologique de ces
dernières.
Dans notre étude expérimentale, la méthode basée sur l’analyse de différentes région du
génome, est utilisée pour évaluée la diversité levuriennes c’est :
LA PCR-RFLP qui est une méthode fiable et rapide d’identification, elle est basée sur
l’amplification des régions ITS des ADN ribosomiques, puis on soumet ces régions à une série
d’enzymes de restriction, essentiellement des endonucléases tel que la HinfI, la TaqI
L’objectif final tracé a court et long terme, s’installe dans la mise en valeur des levures
1
Introduction
identifier puis sélectionnées afin de servir surtout les domaines agro alimentaires (boulangerie,
vinaigrerie, fromagerie....) et les nouvelles biotechnologies.
2
Chapitre I RAISIN ET LEVURES
I. RAISIN ET VIGNOBLE
1. Histoire
La vigne, c’est l’une des plantes les plus diversifies qui soient, et certainement
celle qui a fait le plus rêver les hommes depuis l’antiquité (Dussert – Gerber, 2013).
En provenance d’Asie Mineure, le raisin était présent à l’état naturel puis diffusé
ensuite vers l’Ouest. Lorsque la récolte était amplement suffisante, le raisin était broyé
en jus, puis réservé dans de terre alors que 4000 ans avant notre ère débutèrent la
maitrise du processus vinification et de la viticulture.
Dans l’antiquité, les Grecs et les Romains, répandirent la culture de la vigne dans
tout l’Empire. A partir de Là, la culture de vigne fut domestiquée et de très nombreuses
variétés de raisins le jour uniquement pour la viticulture et peu l’homme a commencé à
maitriser la culture de la vigne (Oswald, 2006 ; Arnaud et Deluc, 2007 ; Baudouin,
2009).
L’Algérie est le plus vaste pays du Maghreb qui a partagé le sort des phéniciens à
l’empire Ottoman , en passant par les Romains , la conquête arabe , les temps des
barbaresques , l’occupation espagnole , la conquête française (1830) ne trouve
qu’environ 2000 hectares de vigne ; ils deviendront 30'000 en 1888 , pour atteindre le
maximum de 407'000 hectares en 1951 – 1954 en produisant jusqu’à 19 millions
d’hectolitres .
Au moment de l’indépendance de l’Algérie, la vigne couvrais encore 350'000
hectares, avec une production variant de 14 a 18 millions d’hectolitres. Elle
représentait, sur le plan économique, 10 % des terres cultivées y faisait vivre
directement 32'140 familles d’exploitants.
Par le temps, la plus grande partie de ce vignoble a été arrachée, le vignoble « pied noir
» en très bon état général s’est désagrégé par pertes de compétences et volontés
politiques. Aujourd’hui, ce vignoble relance souvent freinées par les incertitudes
politiques. (Isnard, 1947 ; Isnard, 1949 ; Boudjellal Aouf, 1972 ; Isnard, 1975 ;
Berger, 1986 ; Blouin, 2007).
2. Définition
2.1. La Vigne : est un arbrisseau rampant, la famille botanique des vitacées
essentiellement de l’espèce Vitis (Hédalgo et al ., 2005) .
Schématiquement comme toutes les autres plantes comparables, un plant de vigne est
formé d’une partie souterraines, les racines et radicelles, et d’une partie aérienne
3
formant le tronc qui supporte les sarments, les rameaux, les fleurs devenant fruits –
raisin (Carbonneau et al., 2007).
2.2. Le raisin : est le fruit de la vigne du genre Vitis vinifera. C’est le deuxième fruit
le plus cultivé au monde (classement de l’année 2000).
C’est une baie charnue qui a plusieurs formes possibles en fonction des variétés. Il
est constitué d’un péricarpe et de graines appelées pépins qui sont au nombre maximum
de 4 par baie pour la majorité.
Il sert surtout à la fabrication du vin à partir de son jus fermenté, mais il se
consomme également comme un fruit, soit frais, le raisin de table, soit sec, le raisin sec.
On extrait aussi l’huile de pépins de raisin (Cadet, 2005).
Figure n°1 : Un cep de vigne et ses différents éléments (Cadet, 2005).

3. Les maladies de la vigne
Les maladies de la vigne. En Europe, un large spectre de ravageurs attaquent la
Vigne ; leur importance varie avec les zones climatiques. De nombreux insectes
(pucerons, acariens,…) ont induit autrefois la perte de vignobles européens, mais
l'utilisation de porte-greffes résistants ainsi que de pièges sexuels par les services
d'avertissements agricoles ont considérablement réduit ces types de nuisances.
Les nématodes cécidogènes (Meloidogyne spp.) engendrent des nodosités sur les
racines et transmettent des virus. De nombreux parasites fongiques s'attaquent également
aux vignes dont les plus importants sont : le mildiou de la vigne ou rot-brun, l’oïdium, la
pourriture grise, l’esca, l’eutypiose, l’anthracnose, l’excoriose et le black-rot. Le mildiou
4
est d’une grande importance économique. Grâce aux programmes de prévision, les
traitements actuels sont mieux maitrisés. La lutte contre le mildiou de la vigne est aussi
entreprise par les sélectionneurs qui préparent l’avenir en créant des cultivars résistants.
Cette démarche fastidueuse, peut être facilitée par des critères biochimiques et
analytiques de résistance aux maladies.
3.1. Les maladies virales
Ces maladies sont très graves car les vignes infectées ne peuvent être
traitées et constituent une source de contamination. Plus d’une soixantaine de
virus différents peuvent attaquer la vigne (Du Preez et al., 2011), ils provoquent
des troubles entrainant la diminution du rendement, l’affaiblissement et le
vieillissement prématuré des ceps, ainsi qu’une reprise difficile au greffage et au
bouturage (Reynier, 2000). En Algérie, plusieurs virus ont été mis en évidence dont les
types viraux du GLRaV agent de l’enroulement foliaire (Lehad et al, 2013).
3.2. Les maladies à phytoplasmes (jaunisses)
Les jaunisses de la vigne sont dues à la présence de l’agent vecteur et du

matériel végétal porteur de la maladie (Reynier, 2000). Ce sont des maladies
graves qui peuvent entrainer la diminution de la croissance, de la productivité des
ceps et de la qualité des produits de la vigne. Chez celle-ci deux maladies importantes
sont reportées : la flavescence dorée, une maladie de quarantaine transmise par la
cicadelle Scaphoïde ustitanus, et le « bois noir », transmis par Hyalesthes
obsoletus (Reynier, 2000).
3.3. Les maladies bactériennes

Bien qu’ayant un développement sporadique et limité, les bactérioses de la vigne
ne sont pas négligeables. Six genres bactériens sont signalés sur la vigne :
Agrobacterium, Xyllophilus, Xylella, Pseudomonas, Xanthomonas et Enterobacter
(Boudon-Padieu et al., 2000) ; toutefois, seulement deux bactéries causent des
maladies assez graves : Xylella fastidiosa : agent de la maladie de Pierce (Varela et
al., 2001) et Xanthomonas ampelina : qui cause le « Bacterial blight »
(Panagopoulos, 1998).
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3.4. Les maladies à nématodes
Elles sont particulièrement insidieuses et difficiles à diagnostiquer par

l’observation car les symptômes induits sont souvent confondus avec des stress
hydriques ou minéraux. Elles ne sont connues que depuis un siècle, et ce n’est que vers
la moitié des années 1950 que les recherches ont montré qu’un large éventail de nématodes
est inféodé la vigne (Raski, 1998). Cinq genres de nématodes peuvent s’attaquer à la
vigne :Meloïdogyne (« Root-Knot Nematodes »), Xyphinema (« Dagger Nematodes »),
Longidorus (« Needle Nematodes »), Pratylenchus (« Lesion Nematodes ») et Tylenchulus («
Slow Decline Nematodes »).
3.5. Les maladies fongiques
La vigne est sensible à de nombreux champignons phytopathogènes qui causent

des dégâts aux conséquences économiques graves. Certains de ces champignons s’attaquent
aux racines et au bois causant des maladies de dépérissement telles que l’Esca et
l’eutypiose; d’autres s’attaquent au feuillage et aux grappes comme le mildiou, l’oïdium
et la pourriture grise. Le tableau 2 regroupe les principales maladies fongiques, leurs
agents causaux ainsi que les symptômes provoqués.
4. La physiologie de la vigne
Les plantes de vigne cultivées sont constituées d’unes structure permanente, formée par
le tronc et les racines pérennes, qui durent toute la vie de la plante et qui s’accroît chaque
année. La partie aérienne, repousse annuellement, elle est récupérée à la récolte sous forme de
grappe ou enlevée lors des interventions de conduite pour se recycler dans le sol (Attia, 2007).
Concernant la partie souterraine formée par des racines plus ou moins grosse et plus ou moins
vieilles, les extrémités plus fines et plus jeune, constituent le chevlu (Hédalgo et al., 2005 ;
Carbonneau et al. ,2007).
5. Les organes de la vigne
Comme toute plante supérieure, la vigne comprend des racines, une tige et des feuilles
(organes végétales), les bourgeons sont situés à l’aisselle des feuilles tandis que les vrilles et le
inflorescences paraissent être opposées à ces organes. Les fleurs (organes reproducteurs),
groupées sur les inflorescences, donneront, après fécondation, les graines de raisin.
5.1. Les racines
Les racines d’une souche de vigne sont des racines adventives nées en majeure partie sur
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le nœud inférieur de 1a bouture ou greffe bouture dont elle est issue. Dans des conditions
chaudes et humides on peut observer le développement des racines adventives aériennes
(Huglin, 1986).
En examinant l’extrémité d’une radicelle au microscope, on observe tous au bout une sorte
de capuchon ou de dé à coudre de tissus dures appelé coiffe qui lui permet de s’allonger et de
pénétrer dans le sol sans abimer la zone méristématique molle et délicate située a l’intérieur et
qui génère cette croissance. (Hidalgo, 2005).
5.2. Les troncs et les bras

Au niveau du couvert ou parties aériennes de la vigne on distingue le tronc, les bras plus ou
moins long (qui peuvent être absent sur les vignes taillées) les coursons ou long bois qui
constituent les rameaux formés l’année précédente et pampres ou rameaux herbacés de l’année
qui, au cours de leurs aoûtement en automne, se transforment en sarments dotés de feuilles, de
vrilles et de grappes (de fleurs et plus tard de fruits).
Le tronc et les bras de la vigne font partie du couvert; on les appelle organes vivaces car ils
subsistent quasiment toute la durée de vie de la plante.
Leurs fonctions outre la respiration, consistent a soutenir les sarments, les rameaux et leurs
bourgeons, les feuilles, les grappes et les vrilles ainsi qu’a acheminer la sève brute vers les organes
a travers un système de vaisseaux (ligneux et criblés) et, lorsque celle ci est transformée en sève
élaborée, a nourrir toute la plante. (Hidalgo, 2005).
5.3. Les rameaux et les sarments

Chez la vigne, comme chez d’autre plantes les pousses ici les rameaux, grossissent
précisément à l’endroit ou s’insèrent les feuilles, les bourgeons, les vrilles et les petites grappes de
fleures qui se transformeront ultérieurement en grappes de fruits (raisins) .ce point de grossissent
s’appel le un nœud ; les parties comprises entre deux de ces nœuds s’appellent les entre nœuds.
(Hidalgo, 2005).
5.4. Les feuilles
Les feuilles sont composées d’une queue ou pétiole et d’une partie élargie et étalée, appelée
limbe, sillonnée par des nervures de différents ordres.
Le pétiole et les nervures du limbe qui le prolongent forment des sortes de cordons ; on retrouve
dans cette anatomie les deux systèmes deux vaisseaux conducteurs de la sève brute et de la sève
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élaborée: le premier sert à transformer la sève brute en sève élaborée, le second permet à la sève
élaborée d’alimenter les tissus de la feuille et du reste de la plante. (Hidalgo, 2005).
5.5. Les bourgeons

Tous les bourgeons de la vigne sont constitués d’écailles externes brunes plus ou moins foncées
et dune bourre blanchâtre abondante (duvet) à l’intérieur. Ces écailles protègent les cônes
végétatifs. Véritable pousses miniatures grâce à un méristème terminal qui assure la croissance du
rameau et de tous ses organes également minuscules: ébauches de feuilles, de vrilles, d’inloescenc
es et de bourgeons. (Huglin, 1986).
A l’aisselle du pétiole des feuilles on distingue deux types de bourgeons ; prompt bourgeon et
l’œil latent Le prompt bourgeon ainsi que son nom l’indique a la propriété de pou voir s
développé l’année même de sa formation. Normalement il ne donne que des pousses réduites
désignées sous le nom d’entre cœur.
Le bourgeon latent n’évolue par contre presque jamais en pousse l’année de sa formation. Au
cours du cycle végétatif il change uniquement de volume; d’abord plus réduit que les prompt
bourgeons, il devient par la suite volumineux que ce dernier.
Alors que le prompt bourgeon est formé d’un seul bourgeon, la structure de l’œil latent est plus
complexe. (Huglin, 1986).
5.6. La fleur
Dés l’apparition de bourgeons fertiles sur le rameau et dans les cônes végétatifs des bourgeons,
des groupes spécifiques de cellules se multiplient rapidement. Le bourgeon et le rameau qui le
porte poussent et donnent naissance aux fleurs il n’est pas inutile de rappeler que les
inflorescences (ébauches de grappes) sont définitivement formées, en miniature, dans le bourgeon,
c’est à dire que leur arborescence est le nombre de fleurs qui verront le jour a la fin de la phase de
croissance de la vigne sont déjà établis.
Une fleur complète hermaphrodite (cas le plus courant sur nos vignes) est principalement
formée: d’un petit pédoncule ou pétiole, conduit pourvu de systèmes vasculaires par lequel la sève
brute circule et, principalement, la sève élaborée, nécessaire au développement et a la maturité des
parties persistantes de la fleur qui, après fécondation, donnent naissance a un grain de raisin (fruit)
; d’un calice ; dune corolle , qui après ouverture revêt habituellement la forme illustrée sur le dessi
n avant de tomber ; d’étamines au nombre de cinq, composées d’un filet et d’anthères doubles, qui
contient les grains de pollen et tombent après fécondation ; et d un pistil, en forme de bouteille,
dont la cavité ovarienne est cloisonnée et contient quatre ovules. Le col de la bouteille, ou style se
8
termine par une sorte d’élargissement, appelé stigmate.
6. Les Principales maladies et ravageurs de la vigne

La vigne est une culture sensible aux maladies. Toutefois, cette sensibilité varie en fonction des
cépages. Généralement, lorsqu’aucun moyen de lutte n’est employé, les dégâts peuvent être
considérables. Le mildiou, l’oïdium la pourriture grise sont les principales maladies de la vigne
7. Les maladies cryptogamiques de la vigne
7.1. Le Mildiou
Le champignon Plasmopara viticola est un parasite obligatoire qui ne peut se développer que
sur les tissus vivants. Il est à reproduction sexuée et hiverne sous forme d’oospores (spore sexuée)
dans les feuilles mortes. La proportion d’oospores qui sera mature au printemps dépend des
conditions de l’automne. Plus l’automne est pluvieux, plus il y aura d’oospores matures le
printemps suivant.
Au printemps, la température minimale pour le développement du champignon est de 11 °C. À
maturité, les oospores produiront de nouvelles spores (sporange). À ce stade, la pluie (présence
d’eau libre) constitue le principal facteur de développement de la maladie. Lors de fortes pluies,
les éclaboussures de terre et d’eau transporteront les spores sur les feuilles. Plasmopara. Viticola
produit alors un autre type de spores (zoopores) qui infectent les tissus en croissance. Le jeune
tissu est généralement plus sensible.
Lorsque les feuilles sont complètement étalées, elles sont moins sensibles aux infections. Les
baies sont sensibles seulement de la floraison à environ 4 semaines après la lors ai son. Par contre,
puis qu’il y a continuellement du nouveau feuillage, il est important de bien protéger la vigne
durant toute.
7.2. Symptômes
7.2.1. Feuilles
Décolorations jaunâtres plus ou moins circulaires, on appelle ces symptômes des taches
d’huile. Duvet blanc (fructification du champignon) surtout à la face inférieure des feuilles. Les
taches brunissent avec le temps et les feuilles fortement atteintes peuvent tomber.
7.2.2. Tiges
Apex en crochet avec duvet blanc sur la tige (fructification du champignon).
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7.2.3. Inflorescences
Les inflorescences sont particulièrement sensibles. Lors de forte infestation, elles peuvent
jaunir, brunir, puis sécher complètement.
7.2.4. Baies
Duvet blanc (fructification du champignon). Les baies atteintes tôt en saison deviennent bleues
puis brunes et se dessèchent. Les baies des variétés de raisin rouge se colorent prématurément et
celles de raisin blanc deviennent tachetées. Les baies infectées restent souvent dures alors que
celles non infectées ramollissent durant la véraison.
Les premiers traitements sont effectués lorsque les premières tâches de mildiou sont observées
dans le vignoble.
Le dernier traitement se fera avec des produits de contact et appliqué sur le haut du feuillage
afin de protéger celui ci contre le mildiou tardif (dit :mosaïque) .
Figure n°2- 3: Symptômes de Mildiou sur feuille et grappe devigne.
( http://www.vignes.be/ravagreurs et maladies.htm)
8. L’oïdium
Erysiphe necator est un parasite obligatoire de la vigne; il ne peut se développer que sur les
tissus vivants de la vigne. Sous nos conditions climatiques, Erysiphe necator hiverne sous forme
de cléistothèces, organes contenant les ascospores (spores sexuées). Au printemps, les ascospores
mûrissent puis infectent les feuilles situées à proximité de l’écorce. Suite à ces infections, des
taches recouvertes de spores asexuées, les conidies, se développent sur les feuilles. Les conidies de
Erysiphe necator n’ont pas besoin d’eau libre sur la feuille pour l’infecter. Par contre, une
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humidité relative élevée favorise la germination des conidies et donc, les infections. Le blancde la
vigne est favorisé par un temps chaud (température optimale 25°C) et sans pluie, l’eau inhibant la
germination des conidies.
8.1. Symptômes
8.1.1. Feuilles
Apparition d’un feutre blanc poudreux et peu épais généralement sur la face inférieure de la
feuille. Lorsque la maladie progresse, le nombre de taches augmente; elles sont visibles sur les
deux faces. Sur les feuilles sévèrement atteintes, il y a crispation du bord du limbe. En fin de
saison, on peut observer la présence de petites pustules de couleur orangée à noire (cléistothèces)
sur la partie supérieure du limbe.
8.1.2. Tiges
Taches étoilées qui peuvent mesurer jusqu’à quelques centimètres et qui prennent une
coloration brune à noire, suite à la dégénère essence progressive du champignon au cours de la
saison. Les taches, au pourtourfibreux, demeurent visibles même suite à l’aoûtement des rameaux.
8.1.3. Inflorescences
Le blanc prend habituellement l’aspect d’une poussière grise à blanchâtre. Lors d’infections
sévères, les grappes peuvent tomber, particulièrement lors de la récolte mécanique.
8.1.4. Baies
Les baies peuvent être atteintes, de la nouaison à la véraison (environ 4 semaines après la lor ai
son). El les prendre ont un col or at ion gris cendré pour rapidement se recouvrir de spores, leur
donnant une apparence farineuse. En fin de saison, des cléistothèces apparaissent aussi sur les
baies. Les baies attaquées se dessèchent, peuvent craquer et tombent au sol. Les baies infectées
vers la fin de la période de sensibilité sont généralement plus sujettes au craquement, ce qui les
rend plus sensibles à la pourriture grise .
11
Figure n°4- 5: Symptômes de L’oïdium surfeuil.

( http://www.vignes.be/ravagreurs et maladies.htm)
9. Les maladies à virus
9.1. Court noue

Une vigne atteinte de court noué présente des symptômes caractéristiques : aspect buissonnant
de la végétation (les rameaux sont plus petits que la normale), jaunissement, chute des feuilles, les
rameaux présentent des entres nœuds courts et parfois des doubles nœuds, les grappes présentent
des troubles de la fécondation (millerandage, coulure).
10. Les ravageurs
10.1. Phylloxéra
Les ravages du phylloxéra ont été considérables, car aucun moyen de destruction ne s’est
avéré totalement efficace, malgré une étude minutieuse de l’insecte; les insectes mâles et femelles
s’accouplent à la fin de l’été. La femelle pond sur les souches œuf unique, appelé œuf d’hiver. Celui
ci éclot au printemps et donne naissance au phylloxéra aptère, ou sans ailes, qui descend sur les
racines aux dépens desquelles il vit, d’où son autre nom phylloxéra radicicole.
10.2. La Pyrale ( Sparganothis pilleriana)

Est un papillon dont chenille peut causer de graves dégâts. Le papillon mesure 20à 25 mm
ailes déployées. Ses ailes antérieures, de couleur jaunes paille, présentent trois bandes
transversales brun rougeâtre. La chenille qui peut atteindre 30 mm est de couleur grise, vert sal Ou
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rougeâtre, avec une tête noire et brillante.

10.3. Cochylis ( Eupoecilia ambiguella)
L’adulte est un papillon de 7 à 8mm d’envergure, ses ailes antérieures, sont de couleur jaune
ocre, et sont traversées par une large bande transversale brunâtre. La chenille (10 mm de long), de
couleur lie de vin avec une tête noire brillante, a des mouvements lents.
10.4. L’altise
Elle se reconnaît facilement par sa façon de sauter qui lui vaut le surnom de puce de la vigne.
Ses cuises sont fortes lui permettant le saut. Son corps ovale, long de 4 à 5mm est bleu vert
métallisé.
Figure n° 7: Papillon au repos.

Figure n° 6: Larve et dégâts sur inflorescence
( http://www.vignes.be/ravagreurs et maladies.htm).
11.1. Etude de la physiologie
11.1.1. Etude de la rafle
Elle sert de support et permet le transport de la sève élaborée jusquʼà la baie. La partie non
ramifiée de la rafle qui part du rameau sʼappelle le pédoncule, les parties ramifiées qui tiennent les
baies portent le nom de pédicelles.
La rafle représente 1 à 7% du poids de la grappe saine, plus si la grappe a souffert dʼune
mauvaise formation des baies (millerandage) ou dʼune surmaturité (vin moelleux et liquoreux).
La rafle contient :
•des tanins : constituent 3% du poids de rafle.
13
•de lʼeau : représente 78 à 80% du poids de la rafle.

•des matières minérales : représentent de 2 à 3 % du poids de la rafle . Elles sont surtout sous
forme de sels de potassium. (Navarre, 1998).
Les rafles facilitent le pressurage, mais communiquent des tanins durs aux vins si elles
manquent de maturité.
Figure n°08 : Schéma dʼune baie de raisin (Dessin Guy Pujols). (Navarre, 1998).
12. Baie de raisin

La baie ou grain est constituée de :
• la pellicule
• la pulpe
• les pépins.
La taille des baies est comprise entre 8 et 24 mm. sa forme est variable selon les espèces.
12.1.1. Etude de la pellicule du raisin
Elle est très importante, car elle contient les arômes, les tanins et la couleur. Elle est composée
de plusieurs couches de cellules différenciées. Vers lʼextérieur on trouve la cuticule recouverte par
la pruine qui est la zone de localisation des levures naturelles.
Les levures transportées par le vent sont piégées par la pruine. En dessous se trouvent
lʼépiderme (épi = superficielle, dessus) et lʼhypoderme (hypo = dessous, plus profond). Les
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polyphénols (tanins et anthocyanes) et les arômes sont contenus dans lʼhypoderme.

Le foulage et la macération facilitent le passage de ces composés dans le jus.la cellulose
contenue dans la pellicule forme la majeure partie du dépôt de débourbage des vins blancs et de
pressurage des vins rouges. La cellulose gêne la filtration et le collage. (Guillaume, 2001).
12.1.2. Etude de La pulpe : elle représente 85 à 90% du poids de la baie. Elle est composée
essentiellement dʼeau, de sucres et dʼacides organiques. Ce sont les sucres contenus dans la pulpe
qui sont transformés en alcool par les levures. Les raisins de cuve contiennent beaucoup moins de
pulpe que les raisins de table, ils ont un diamètre plus petit. dessin raisin de cuve cabernet
sauvignon (7 à 10 mm) et dessin raisin de table plus gros Italia : (20 à 28 mm) Arnaud et al, 2007).
12.1.3. Etude des pépins : Ils devraient être au nombre de 4, mais on en trouve à 3 ou 2 grains
très fréquemment. Ils sont situés au centre de la baie, baignée par la pulpe et alimentés par le
pinceau, sortent de faisceaux conducteurs.
Les pépins contiennent de lʼeau, des tanins, de lʼhuile et de la cellulose (Huglin, 1986).
12.2. Etude des constituants chimiques
12.2.1. Lʼalcool (sucres)
Ne le nions pas, Cʼest lʼ un des composés qui nous intéresse le plus dans le vin. Pour avoir
beaucoup dʼalcool, il faut beaucoup de sucres. La quantité de sucre est très fortement influencée
par :
• Le cépage (variété, âge, adaptation au terroir et au climat).
• les méthodes culturales (taille, rendement).
• le terroir (sol plus ou moins riche en matière organique, plus ou moins drainant).
• lʼexposition au rayonnement solaire.
• le climat annuel ayant régné sur la parcelle.
• la date de récolte.
Vous avez du remarquer quʼen 10 ans le titre alcoolique volumique (TAV) indiqué sur les
bouteilles des vins AOC est passé de 12/12,5 à 13,5. Les vins de garde sont de plus en plus
alcoolisés, car de nombreux travaux ont été entrepris pour concentrer le raisin en sucre et quʼen plus
le climat se réchauffe Les sucres des raisins sont essentiellement composés dʼhexoses (molécule
contenant 6 atomes de carbone : C6H12O6) : le glucose et le fructose.
12.2.2. Les acides organiques

Les principaux acides du raisin sont :
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• lʼacide tartrique
• lʼacide malique
• lʼacide citrique
Ils jouent un rôle important dans la fraicheur (acidité) du vin, lʼéquilibre général, mais
également sur sa conservation. Plus le vin est acide, plus il saura se protéger des attaques
bactériennes, mais trop dʼacidité déséquilibre le vin. Les acides sont stockés principalement dans la
pulpe des baies. On assiste à une baisse importante de lʼacidité des vins depuis les années 1975.
 Lʼacide tartrique : COOH-CHOH-COOH.
Cʼest le principal acide du raisin. On ne le trouve que dans le raisin. Il est synthétisé dans le
raisin vert et dans les jeunes feuilles. Il nʼest pas utilisé par les besoins énergétiques de la plante,
sauf lorsque la température dépasse 35°C. Il donne un goût particulier, que l’on retrouve facilement
en mangeant des raisins pas mûrs ou des grappillons. Il précipite dans les cuves et dans les
bouteilles avec les variations de température (cristaux blancs dans les vins blancs, cristaux tintés de
rouge dans les vins rouges).
 Lʼacide malique : COOH-CH2-CHOH-COOH.
Il existe dans tous les fruits. (Malus = pomme). Il est peu stable, accumulé pendant la
croissance herbacée, il sera brûlé pendant la maturation, cela permet lʼaccumulation des sucres.
Durant la maturité, si la température est trop froide, cʼest à dire inférieure à 30°C, ce sont les sucres
qui seront consommés et la maturation se fera mal. La consommation de lʼacide malique, qui varie
selon les cépages est utilisé dans la répartition géographique des cépages. Les cépages qui
consomment beaucoup dʼacide malique sont plantés en région froide (chardonnay, pinot noir), ceux
qui consomment peu dʼacide malique sont plantés sous climats méditerranéens (grenache noir,
mourvèdre). Lʼacide malique donne un goût acide prononcé, rappelant celui de la pomme verte pas
mûre.
 Lʼacide citrique : COOH-CH2-COH-CH2-COOH
COOH
On ne le trouve quʼà lʼétat de traces dans le raisin. Cʼest lʼacide principal des agrumes. Il est
trèsacide, vous le connaissez, cʼest celui du citron vert.
12.2.3. Les polyphénols
Les plantes synthétisent des polyphénols à partir de phénols, allant jusquʼà donner de très
grosses molécules comme la lignine et les tanins, constituants essentiels des parties solides des
plantes.
Les polyphénols se divisent en deux groupes :
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• les matières colorantes

• les polyphénols incolores
12.2.3.1. Les matières colorantes
On trouve dans le raisin deux types de matières colorantes : les anthocyanes (rouges) et le
flavones (jaunes). Ils sont localisés dans lʼhypoderme de la pellicule des raisins. Les raisins jaunes
sont dépourvus dʼanthocyanes. Tous les raisins possèdent des flavones. Certains cépages, trèsrares,
dits teinturiers possèdent des anthocyanes dans leur pulpe. Cʼest le cas de lʼalicante Bousquet, qui a
servi à rehausser la couleur des vins de nombreuses régions.
12.2.3.2. Les anthocyanes
On en trouve dans de très nombreuses plantes. Elles sont solubles dans le moût, dans lʼeau, et
en milieu alcoolique. Elles sont plus solubles à chaud quʼà froid. Les anthocyanes sont libérés dans le
moût dés le foulage. La fermentation alcoolique et la macération favorisent leur diffusion.
Évolution des anthocyanes : Elles apparaissent dans le raisin au moment de la véraison sous une
forme simple, puis elles se polymérisent. Lors de lʼélevage des vins, les phénomènes de
polymérisation vont continuer, donnant avec le temps des couleurs de plus en plus orangées. Plusle
milieu est réducteur (manque dʼoxygène), plus le vin tend vers les teintes orangées.
Si le vin subit une trop forte oxydation, la couleur devient brune (casse brune des vins). Les
anthocyanes peuvent se combiner aux tanins, ce qui permet la stabilisation de la couleur. Dans les
vins on trouve des anthocyanes :
• libres (de couleur rouge violacée) qui disparaissent au cours du temps.
• plus ou moins condensées (donnent la couleur tuilée).
• combinées (certaines précipitent au cours du temps au fond des bouteilles).
12.2.3.3. Les polyphénols incolores
Ils correspondent aux :
• phénols volatils (arômes)
• acides phénols
• polyphénols condensés
• tanins
Les phénols volatils : sont très aromatiques, ils sont peu perceptibles dans le raisin et le moût et
apparaissent avec le temps dans le vin.
Les polyphénols condensés : sont des corps intermédiaires, constitués par polymérisations
successives, ils conduisent à la formation des tanins. Par décomposition, ils redonnent des acides
phénols dont ils sont issus.
Les Tanins : Ils résultent de la polymérisation dʼacides phénols. Dans le raisin il nʼy a que de
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tanins condensés. On les trouve dans la pellicule, les rafles et les pépins. Dans la pellicule les tanins
sont soit sous forme libre, soit sous forme liée à la structure membranaire des cellules. Dans les
pépins, seuls ceux situés le plus vers lʼextérieur sont extractibles. Les tanins provenant des pépins et
des pellicules sont différents de ceux trouvés dans les fûts de chêne.
Les tanins sont solubles dans lʼéthanol, plus le milieu est chaud, plus la solubilité augmente. Ils
Sont très friands dʼoxygène. Les tanins se polymérisent entre eux, et peuvent également se
combiner avec des protéines, des sucres, des acides et des anthocyanes (pour résumer, il nʼaiment
pas la solitude, et apprécient de se mélanger à des étrangers...).
Dans la pellicule, les tanins sʼaccumulent jusquʼà la maturité, puis diminuent par dégradation.
dans les pépins, il y a beaucoup plus de tanins, ils sont présents avant la véraison. Plus la maturité
est avancée plus les tanins se polymérisent et deviennent mois astringents. Dans les rafles, leur
teneur est très élevée au moment de la véraison et ils ne polymérisent pas beaucoup durant la
véraison. Les tanins sont durs, proches de ceux des pépins.
Les tanins jouent de nombreux rôles dans le vin sur :
• le goût : central pour lʼéquilibre des vins rouges : astringence, amertume, corps.
• la couleur : condensation avec les anthocyanes, stabilisation de la couleur.
• les micro-organismes : action antiseptique.
• la stabilisation du vin : en sʼassociant avec les protéines, ils protègent les vins de la casse
protéique (genre de long coton flottant dans la bouteille).
La recherche de tanins de qualité est essentielle. Si les tanins sont trop présents, trop absents, de
mauvaise qualité, le vin sera déséquilibré. Obtenir des tanins ayant la bonne maturité est compliqué.
cela demande aux viticulteurs de bien les connaître et dʼêtre très vigilant sur le contrôles de
maturité et les macérations. Aujourdʼhui, on n’observe que la recherche de tanins mûrs entraine une
augmentation du taux dʼalcool dans les vins.
Prenez le temps de bien comprendre les tanins, recherchez-les dans les fruits frais et secs et
légumes de votre quotidien (noix, amandes, noisettes, thé, artichaut, banane, coing, nèfles).
13. Substances aromatiques
Les substances aromatiques sont localisées dans les cellules hypodermiques de la pellicule des
baies. Leur quantité est très faible, mais leur pouvoir aromatique peut-être fort. On peut les répartir
En 3 catégories :
• les arômes primaires
• les arômes secondaires
• les arômes tertiaires
Les arômes primaires sont présents dans le raisin, les secondaires sont formés pendant la
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fermentation alcoolique et les tertiaires apparaissent durant le vieillissement du vin.

13.1. Les arômes primaires : leur concentration augmente jusquʼà la maturité, ensuite ils
deviennent plus lourds, moins fins.
13.2. Les arômes secondaires : ils sont constitués dʼalcools supérieurs, dʼaldéhydes, de cétone
divers et surtout dʼesters éthyliques ou amyliques des acides organiques présents dans la
fermentation (acétate dʼisoamyle à lʼodeur de «bonbons anglais»).
13.3. Les arômes tertiaires : Ils proviennent dʼestérifications lentes entre les acides organiques du
vin et lʼalcool, de condensations et synthèses spontanées entre des fonctions alcooliques,
aldéhydiques, cétoniques et phénoliques produisant des arômes complexes. Comme les tanins,
les arômes jouent un rôle central dans les vins. Les derniers progrès en oenologie ont permis de
conserver plus de fruits dans les vins, mais permettent aussi de mieux les identifier. Lorsquʼils
sont sous forme liée, ils sont appelés précurseurs dʼarômes, ils ne sont pasodorants. Ce sont des
enzymes spécifiques qui permettent la libération des arômes. Certaines souches de levures
permettent la libération dʼarômes spécifiques (beaujolais nouveau...).
Les substances aromatiques sont composées par des terpènes, des caroténoïdes, des
composés cystéinylés et des pyrazines. Ils peuvent être sous une forme liée ou libre.
14. Substances pectiques
Ces substances entrent dans la constitution des matières de réserve et dans les matériaux
structuraux et protecteurs des végétaux. On les appelle les polysaccharides. Ils ne donnent pas de
caractères particuliers au vin. Leur excès dans les vins traduit un triturage de la vendange et peut
entrainer des difficultés de sédimentation.
15. Substances azotées
Lʼazote est lʼun des 4 composés constitutifs des êtres vivants. Il existe sous 4 formes
différentes
Dans les vins :
 Azote minéral
 Acides aminés
 Peptides
 Protéines
Lʼazote minéral introduit dans le circuit de sève de la vigne y prend la forme ammoniacale
(NH4+).
À partir de cet état, il est introduit dans le cycle organique sous la forme dʼacide aminé. Bien
connu par les lycéens scientifiques sous la forme :
19
15.1. Enzyme
Elles sont essentielles à la synthèse et à la dégradation de nombreuses réactions chimiques.
Elles ont des noms qui se terminent par «ase» et qui précisent la transformation qu’elles réalisent :
Les oxydases favorisent les oxydations, les Hydrolases et les Lyases coupent les molécules, les
pectinases dégradent les pectines.
La fermentation alcoolique est effectuée par des enzymes, il en faut une douzaine pour dégrader
le sucre en alcool. Les enzymes nécessitent des conditions de température, de pH, dʼoxygène
particulières qu’il faut connaître pour mieux réaliser naturellement les vinifications.
15.2. Vitamines
Les vitamines sont indispensables au bon fonctionnement des réactions chimiques.
• La vitamine C (ou acide ascorbique) est un protecteur contre lʼoxydation des moûts et des vins
• La vitamine B agit sur le bon fonctionnement de la fermentation alcoolique.
15.3. Substances minérales
Les végétaux puisent les substances minérales dans le sol par lʼintermédiaire des radicelles.
Plus le sol sera aéré, riche en êtres vivants et en micorhyzes plus la plante pourra prélever
facilement Les minéraux du sol. Un excès dʼapport dʼengrais minéraux, fréquemment réalisé en
agriculture Traditionnelle tend à diminuer la qualité des vins, car les vignes sont plus productrices.
Les éléments prélevés sont du potassium (K), du magnésium (Mg), du calcium (Ca) et du sodium
(Na), Qui se retrouvent dans le raisin sous forme phosphates, sulfates et sels organiques. Lʼapport
en Substances minérales le plus important est stocké dans les pellicules des baies.
15. Influence des facteurs externes
15.1. Sol de plantation
Le sol est un facteur naturel du terroir prépondérant pour la qualité. Les choix viticoles les plus
lourds en termes d’impact sur la qualité des raisins doivent être raisonnés en fonction des propriétés
de chaque Sol (Arnaud et Deluc, 2007).
La vigne est peu exigeante. Elle aime les sols caillouteux, car les cailloux facilitent l’écoulement
des eaux, accumulent la chaleur de la journée pour la restituer la nuit et permettent la réverbération
du soleil sur la raison (Crespy, 1997 ; Comprade ; 2000 ; Mouillet,2001 ; Boudouin et
Petronio,2009).
15.2. Climat
La culture de la vigne, compte tenu de ses exigences climatiques ; ne peut se pratiquer que dans
des zones tempérées et intertropicales. Le climat du pourtour méditerranéen est idéal à son
20
développement (Carbonneau et al, 2007 ; Baudouin, 2009).

La pluviométrie, l’ensoleillement, les températures et les vents conditionnement le
développement de la vigne, et la maturation du raisin. Les cépages réagissent différemment aux
conditions climatiques subies : certains sont plus résistants au gel, d’autres plus sensibles à
l’humidité (Feilhes et Mandroux, 2002).
15.2.1. L’ensoleillement ou la lumière

La nécessité d’un bon ensoleillement favorisant la photosynthèse, donc l’accumulation des
sucres dans le raisin. Les besoins de la vigne, exprimés en heures d’insolation pendant la période
végétative, vont de 1200 heures pour les tardifs, ce qui représente une durée d’environ 30 jours de
beau temps en fin d’été. (Moonen et al., 2002 ; jones et al.,2005).
15.2.2. La température
La vigne nécessite pour son développement une température qui ne descend pas en dessous de
9°C sinon sa croissance sera difficile. Les années de grande chaleur donnent des raisins sucrés, peu
acides, mais un excès de chaleur nuit à la qualité des produits en donnant des raisins insuffisamment
acides ( Crespy, 1997).
15.2.3. La pluviométrie
La vigne nécessite une pluviométrie minimale naturelle ou provoquée (irrigation) d’environ
200 - 500 mm d’eau par an. Il faut à la vigne une forte proportion de pluies d’automne et d’hiver,
qui, seules, lui assurent les réserves souterraines nécessaires à son entretien pendant l’été (Larnaude,
1948). Les pluies de printemps conditionnent la vitesse de croissance et l’élongation finale des
rameaux, par contre la pluie d’automne peut provoquer un développement de la pourriture grise et
un éclatement de la baie. Un excès d’eau surtout en été rend le climat impropre à la viticulture
(Isnard, 1947 ; Blouin, 2007).
15.2.4. Les vents
La vigne redoute les vents au début de la végétation, lorsque les jeunes pousses sont encore trop
faibles et risquent d’être cassées (Chancrin, 1966 ; Arnaud et Deluc, 2007).
16. La flore microbienne du raisin et son origine
La surface externe du grain de raisin retient toujours des germes vivants apportés par les
poussières de l’air ou les insectes hibernantes (abeilles, drosophiles).
La microflore des raisins est composée d’une grande variété de microorganismes : levures,
bactéries et moisissures. Leur présence et leur pourcentage à la surface des raisins sont influencés
par plusieurs facteurs : le cépage, les conditions climatique de la maturation, le sol, les pratique
21
culturales, la localisation géographique du vignoble, l’age de la vigne (Filoftea, 2010).

Au moment des vendanges, les populations dénombrées sont comprises entre 103- 105 UFC/
baie pour les levures et 102- 103 UFC/baie pour les bactéries (Renouf, 2006).
Les levures sont irrégulièrement réparties à la vigne ; peu nombreuses sur les feuilles, les
rafles et les raisins verts, elles colonisent sur la pellicule des baies en maturation, elles se multiplient
préférentiellement sur les exsudats libérés des microlésions dans les zones situés autour des
stomates. Le secret de la réparation des populations levuriennes à la surface de raisin, c’est la
situation chaude de vignoble et la concentration élevée de sucre de raisin.
Les espèces de levures significativement présentes sur le raisin sont de nombre limité. On
rencontre essentiellement des levures à métabolisme strictement oxydatif, appartenant au genre
(Rhodotorula, et quelques espèces fermentaires tel que les espèces apiculées ( Kloekera apiculata
Tableau n° 01 : Quelques levures isolées des raisins et des moûts en fermentation (d’après
Cuinier et Poulard, 2003).
17. Notion de cépage

16.1. Le cépage
Désigne le type et le qualitatif « variétal », alors une variété cultivée d’un ensemble d’individus
ayant les caractères morphologiques et technologique assez proches pour les designers sous le
même nom (Reynier, 2007).
16.2. La diversification entre les cépages
22
Elle est basée sur :

16.2.1. La couleur de la peau du raisin
 Cépages rouges (noir) : Carignon, grenache noir, cinsault, aramon, mourvèdre, merlot....
(Reynier., 2007).
 Cépages blanes : grenache blanc clairette, muscat blanc à petits grains.
16.2.2. L’observation des caractères morphologiques
Comme la couleur des bourgeons ou des baies, la forme des feuilles ou des rameaux, la
dimension des grappes, et le goût.
17. La viticulture dans le monde
Production mondiale de raisins

La production mondiale de raisins de l’année 2008 s’inscrirait, avec près de 677,9 millions de
quintaux, en légère hausse par rapport à celle de 2007(+11,6 millions de quintaux /2007).
Figure n°09 : Production mondiale de raisins (OIV, 2009)
 production mondiale est près de 677,9 millions de quintaux de raisins, la production

Européenne est très important avec 43%, l’Afrique se trouve en quatrième place avec
production de 6%.
23
18. La viticulture en Algérie
La viticulture en Algérie est le plus souvent associée à l’agriculture coloniale et aux tentatives de
reconversion menées depuis 1962.
La viticulture est cependant plus ancienne car plusieurs vestiges témoignent de la présence de la
vigne et de ses produits avant l’antiquité.
De nombreuses influences (phéniciennes, romaines et autres) ont contribué à l’introduction des
cépages et à l’évolution de la culture.
L’évolution de la viticulture est le résultat des politiques agricoles successives menées. La
viticulture occupait durant la période coloniale l’ensemble des terroirs au niveau national mais
localisé surtout dans la zone ouest où les sols sont pauvres et la pluviométrie n’excède pas 450 mm
par an.
Au lendemain de l’indépendance, les vignobles algériens qui étaient essentiellement composés
de cépages de cuves se sont trouvés confrontés à des problèmes liés à une intégration dans
l’économie nationale et mondiale, ainsi qu’aux nouvelles orientations politiques viticoles
provoquant ainsi un désintéressement chez les viticulteurs.
Devant cette situation, il était nécessaire de reconvertir l’importante assiette viticole héritée de la
colonisation.
La politique d’arrachage adoptée dans les années 1970 avait comme objectif d’arracher 100.000
ha de vignes de cuves et de conserver un niveau de production de 10 millions d’hectolitres de vins.
L’arrachage de la vigne de cuve devait se faire au bénéfice de la vigne de table, mais les besoins
en céréales ont conduit à la rapide extension de cette culture à la place de la vigne, notamment dans
les zones marginales comme celles des plaines sèches de l’ouest et sur les coteaux du centre et de
l’ouest.
L’arrachage a indifféremment concerné les cépages ordinaires de consommation courant et les
cépages de qualité installés par les vignerons français. (ABDEL GUERFI, 2003).
24
Chapitre II Etude fondamentale des levures
II.1 Générale
La levure est un élément prépondérant dans les itinéraires techniques d’élaboration
des vins. Le changement de comportement des consommateurs à l’égard du vin conduit
aujourd’hui la profession à intégrer leur part d’exigences dans les schémas d’élaboration
des vins. Le choix des levures, puis leur maîtrise au cours de la fermentation alcoolique
sont des étapes cruciales dans l’articulation des process mis en œuvre. Une grande
majorité des opérateurs utilisent désormais les levures sélectionnées pour sécuriser les
fermentations et marquer le vin sur des critères spécifiques, recherchés par le
consommateur (arômes agréables, acidité moindre…). Cependant, une frange
grandissante de professionnels - pour des raisons culturelles ou médiatiques - fait le
choix de fermentations spontanées.
A l’heure actuelle, les levures constituent un matériel expérimental de choix en
raison de leur double état de micro-organismes et d’eucaryotes (Pol, 1996).
1.1. Définition de la levure

Une levure est un champignon unicellulaire apte à provoquer la fermentation des
matières organiques animales ou végétales. Les levures sont employées pour la
fabrication du vin, de la bière, des alcools industriels, des pâtes levées et d'antibiotiques.
La levure désigne originellement des champignons unicellulaires capables de
provoquer la fermentation des matières animales ou végétales. Ce nom provient de
l'aptitude de la levure de boulanger Saccharomyces cerevisae à faire lever la pâte à
pain. Elle n'a rien à voir avec la levure chimique, ou levain, qui ne correspond qu'à une
poudre chimique, principalement composée de bicarbonate de sodium et d'acide
tartrique, elle aussi utilisée en boulangerie dans le même but.
2. Caractéristiques des levures

Les levures possèdent toutes une membrane plasmique protégée des agressions
extérieures par une paroi cellulaire. En tant qu'eucaryotes, elles possèdent un noyau
clairement délimité et différents chromosomes. On y trouve aussi des mitochondries,
organites cellulaires capables de fournir de l'énergie à partir du dioxygène. Les levures
réalisent la reproduction sexuée ou asexuée en fonction du contexte.
La fermentation consiste en une réaction chimique d'oxydoréduction sur une
structure carbonée dans un milieu dépourvu de dioxygène. Ainsi, les levures comme
certaines bactéries peuvent survivre dans un environnement anaérobie à partir de
25
molécules carbonées comme des sucres. Dans ce contexte, les levures parviennent à
survivre en décomposant cette molécule en une autre plus petite, avec émission de
dioxyde de carbone.
C'est ce dioxyde de carbone qui va permettre à la levure de boulanger de faire lever
la pâte à pain. Le gaz cherche à s'échapper, ce qui gonfle l'ensemble de la structure
(Guiraud,2003).
3. Historique de levure
La levure est un micro-organisme qui se trouve dans le sol, sur les plantes, et dans
l'air. La levure a été cultivée depuis des millénaires. Elle sert de catalyseur dans le
processus de la fermentation, qui est nécessaire pour faire du pain.
Il existe plusieurs variétés de levure qui servent à la fermentation de pâtes, de bières,
de vins, et autres. La variété utilisée par Fleischmann pour la fermentation du pain est le
saccharomyce cerevisiae.
La boulangerie a commencé en Égypte il y a plus de 4,000 ans. On ajoutait parfois
des épices, du miel, et des oeufs au pain pour changer leur saveur. Les archéologues
constatent que les Égyptiens fabriquaient leurs pains en forme d'oiseaux, de poissons, et
de vaches. Certains pains étaient utilisés pour des cérémonies.
L'art de la boulangerie existe depuis longtemps, mais la science de la fermentation
n'a vu le jour qu'en 1676, lorsqu’Anton Leeuwenhoek a inventé le microscope. Les
chercheurs pouvaient désormais observer les micro-organismes comme la levure. En
1859, Louis Pasteur a réussi à expliquer comment fonctionne la fermentation :
La levure absorbe les féculents dans la farine, et produit du dioxyde de carbone.
. Le dioxyde de carbone fait gonfler le gluten dans la farine, et ceci fait gonfler la pâte.
En 1868, l'arrivée de la compagnie Fleischmann a donné naissance à l'ère moderne de
la boulangerie.
4. Morphologie de la levure
Les Levures, bien qu'utilisées inconsciemment par l'homme depuis plus de 5 000 ans
pour la préparation de boissons alcoolisées, ne sont en fait considérées comme les êtres
vivants unicellulaires responsables de la fermentation que depuis le XIXe siècle.
F. J. F. Meyen, en 1837, propose le nom de Saccharomyces pour la levure de bière,
organisme incolore de petite taille, qui se reproduit par bourgeonnement : une petite
26
hernie apparaît en un point de la surface d'une cellule mère, grossit et s'étrangle ; le

bourgeon ou cellule fille peut alors se détacher, grossir encore, bourgeonner à son tour.
L'état unicellulaire est facile à réaliser en milieu liquide agité, mais en milieu solide le
bourgeonnement donne naissance à des thalles buissonnants, formés de cellules levures
bout à bout qui, par accumulation, forment des colonies visibles à l'œil. Chez d'autres
Levures (Kloeckera, Hanseniaspora...), le bourgeonnement n'a lieu qu'aux deux pôles de
la cellule, qui prend fréquemment un aspect biapiculé ou en citron. Cependant, certaines
Levures de distillerie ne bourgeonnent pas et se multiplient par fission (+98)
D'autre part, d'authentiques Levures bourgeonnantes sont pourvues d'un thalle plus
organisé autour d'axes filamenteux à cloisons transversales, comme dans un vrai
mycélium de champignon supérieur ; plus souvent, les cellules axiales ne sont que des
cellules levures très allongées, sans cloisons vraies les séparant (pseudomycélium).
Tous les intermédiaires existent entre des thalles cohérents à structures mycéliennes
et l'état unicellulaire : la définition des Levures ne peut être basée ni sur la vie
unicellulaire, ni sur le bourgeonnement, ni sur le pouvoir fermentaire, bien que les
représentants les plus typiques cumulent ces trois caractères.
À côté de la multiplication végétative, des spores internes ont été observées, pour la
première fois, par T (Larpent, 1991).
Figure n°10 : Représentation idéalisée d’une cellule de levure (Thuriaux, 2004).
27
4.1. Cytologie et organisation

La cytologie (du grec cytos + logos : étude des cellules) est l'étude des cellules
isolées. Elle se différencie de l'histologie, qui est l'étude morphologique des tissus.
Il s'agit de l'étude des cellules normales ou pathologiques (cytopathologie), ainsi que
de leurs aspects morphologiques ou biochimiques.
Après culture, frottis ou biopsie, étalement ou apposition sur une lame, puis
coloration, l'observation se fait au microscope optique plus rarement au microscope
électronique en transmission ou au microscope électronique à balayage.
Le cytologiste est le biologiste clinique ou l'anatomo-pathologiste spécialisé dans
l'étude morphologique des cellules (Bouix et Leveau ; 1991).
4.2. La paroi
Une paroi cellulaire est une paroi assez rigide entourant certaines cellules, située à
l'extérieur de la membrane cellulaire, qui apporte à la cellule un soutien structurel, une
protection, et agit comme un mécanisme de filtrage. La paroi cellulaire fait aussi
obstacle à l'expansion lorsque l'eau pénètre dans la cellule. Tous les organismes vivant
en possèdent sauf les animaux et les protozoaires (Larpent, 1991).
Figure n°11 : Structure membranaire des levures (Veron, 2008).
 La couche interne, de β (1-3) – glucane, insoluble en milieu alcalin, de structure

fibrillaire, assure le maintien et la rigidité de la paroi ;
La couche moyenne, de β (1-3) – glucane soluble ramifié qui confère une certaine
élasticité à la paroi, est aussi le lieu d’ancrage des mannoprotéines ;
 La coche externe, de mannanes phosphorylés ;
Du β (1-6) – glucane assure le lien entre les différentes couches.
28
 La chitine est localisée au niveau de la zone de cicatrisation lors du bourgeonnement

(Bulawa et al., 1986). Elle est séparée de la membrane cytoplasmique par un espace
périplasmique où sont localisées des enzymes : invertase, phosphatase acide, β –
glucosidase, β – glucanases de type β (1-3) et (1-6) ( ce dernier étant impliqué dans le
renouvellement de la paroi au cours de la croissance et du bourgeonnement), de
protéases, β(1-3) et 1-6) ( ce dernier étant imliqué dans le renouvellement de la paroi au
cours de la croissance et du bourgeonnement), de protéases, etc. ( 5Kollar et al., 1997).
 La chitine est un long polymère fibreux de β 1,4 – N- acétylglucosamie (Figure4)
(Voet, eristalline, et Voet, 2005). Sous forme cristalline, ce polysaccharide est
extrêmement robuste et possède une résistance à la tension supérieure à plusieurs
matériaux artificiels. Cette résistance est le résultat des nombreuses liaisons hydrogènes
formées entre les chaînes linéaires de chitine (Roncero, 2002). Elle compte seulement
pour un faible pourcentage (1-2%) du poid sec de la paroi cellulaire mais est
indispensable pour son intégrité (Osmond et al., 1999 ; Meyer et al., 2004).
Figure n°12 : Structure de la chitine ( Karp et Masson, 2010).
4.3. Membrane cytoplasmique : composée principalement de phospholipides

double couche (partie hydrophile à l'extérieur et partie lipophile à l'intérieur). Elle
contient aussi de nombreux complexes protéiques intrinsèques et extrinsèques dont les
rôles sont variés, par exemple des enzymes appelées protéases mènent les transports de
29
substances du milieu extérieur vers le milieu intracellulaire et/ou inversement avec ou

non transformation du substrat durant le passage (Larpent, 1991).
5. Caractéristiques et cycle de reproduction

5.1. Caractéristiques structurelles
Les levures sont des micro-organismes eucaryotes, ainsi possèdent-elles
caractéristiques structurelles propres à ce type cellulaire et d'autres plus spécifiques aux
levures elles-mêmes :
5.2. Caractéristiques constantes
Figure n°13 : Structure de cellule de levure (James Watson (1928).
Figure n°14 : la coloration de levure ( Maurice Wilkins (1916-2004)
Aspect de levures à la coloration de Gram, on peut visualiser les parois

(translucides) qui entourent les cellules.
30
Une paroi cellulaire entourant la membrane plasmique et protégeant la levure des

agressions physico-chimiques du milieu extérieur. Elle est constituée d'une couche
externe de mannoprotéines, associés à des glucanes et une couche interne de glucanes
associés à une petite quantité de chitine.
Un noyau : contenant l'information génétique du génome chromosomique de la

levure. (voir le chapitre sur les caractéristiques génétiques pour en savoir plus).
De mitochondries qui jouent un rôle important dans la respiration aérobie de la
levure et la production d'ATP(www.web).
5.3. Caractéristiques variables
Une ou plusieurs vacuoles, organites à l'aspect homogène, qui servent d'espaces de
stockage pour diverses substances.
5.4. Caractéristiques génétiques
5.4.1. Chromosomes : les levures sont des organismes eucaryotes et possèdent un noyau
avec des chromosomes linéaires. Chez les Saccharomyces, les chromosomes sont au
nombre de 16 simples ou 16 paires selon la forme haploïde ou diploïde de la cellule.
Il existe des gènes de structure à information continue comme chez les bactéries, et
des gènes à information discontinue (introns et exons) comme chez les organismes
supérieurs. Par ailleurs, les gènes de régulation sont spécifiques des levures.
5.4.2. Plasmides : à côté des chromosomes, il existe dans le noyau des petites molécules
d'ADN circulaire d'environ 6 000 paires de bases, les plasmides, présents entre 50 et
100 exemplaires par cellule. Ces plasmides sont autoréplicables et autotransférables
sans affecter la viabilité de la cellule. Ils portent l'information génétique de quelques
caractères non essentiels à la viabilité de la levure. Ils ont un rôle considérable dans
toutes les opérations de génie génétique.
5.4.3. ADN mitochondrial : chaque mitochondrie renferme plusieurs molécules circulaires
d'ADN qui portent l'information de certaines enzymes de la chaîne respiratoire.
Levures « tueuses » : certaines souches de Saccharomyces renferment dans leur
cytoplasme deux virus à ARN. Le matériel génétique du « petit virus » code une toxine
exocellulaire capable de tuer d'autres levures et une protéine de résistance à cette même
toxine pour empêcher les levures « tueuses » de se tuer entre elles. Le « grand virus »
est nécessaire à la multiplication et au maintien du « petit virus » dans le cytoplasme.
31
Les gènes codant pour d'autres toxines produites par des "levures tueuses" sont
directement inclus dans l'ADN chromosomique (Larpent, 1991).
6. La reproduction de la levure
6.1. Par bourgeonnement
Dans les cuves de fermentation, la multiplication de la levure se fait par
bourgeonnement (reproduction asexuée). Une maîtrise totale de la production de cellules
à l’échelon microscopique et une pratique de l’hygiène absolue sont indispensables.
Les constituants de la cellule se dédoublent pour former un bourgeon qui augmente
progressivement de volume. Le noyau se divise et le noyau fils migre dans
l’excroissance (bourgeon). Le bourgeon arrivé à maturité se détache.
6.2. Par fusion des spores
Dans d’autres conditions, la cellule de levure forme des spores qui peuvent être
utilisées pour la multiplication dans certains cas particuliers. Les spores sont très
résistantes et peuvent être considérées comme des formes de survie de la levure (on a
découvert des spores intactes, dans la banquise polaire, dont l’origine pourrait remonter
au-delà de 100.000 années). Lorsque les conditions du milieu redeviennent favorables,
les spores fusionnent et reconstituent la cellule. Les levuriers mettent à profit ces deux
modes de reproduction pour la fabrication de la levure et la création de nouvelles
souches plus élaborées.
7. La reproduction
Tous les êtres vivants produisent leur propre genre à travers le processus appelé la
reproduction. La reproduction a lieu sexuellement et asexuellement.
32
Figure n°15 : Cycle de la production de la levure (Leclerc et al.,1995).

7.1. La reproduction sexuée
La reproduction sexuée est la principale méthode de reproduction pour la grande
majorité des organismes macroscopiques, y compris presque tous les animaux et les
plantes. Voici deux processus principaux au cours de la reproduction sexuée chez les
eucaryotes: méiose, impliquant la réduction de moitié du nombre de chromosomes et la
fécondation, impliquant la fusion de deux gamètes et la restauration du nombre initial de
chromosomes. Au cours de la méiose, les chromosomes de chaque paire se croisent
généralement plus pour atteindre la recombinaison homologue qui permet de produire la
diversité génétique lorsque les cellules se divisent dans la méiose.
7.2. Fission binaire dans l’amibe
Amibe est un organisme unicellulaire minuscule et amorphe qui a une membrane
cellulaire poreuse qui entoure les organites cellulaires et le cytoplasme. L’amibe se
reproduit par la méthode de reproduction asexuée ordinaire appelée fission binaire.
Après la réplication de son matériel génétique par la division mitotique, la cellule se
divise en deux cellules filles de taille égale. Le matériel génétique est tout aussi divisé,
par conséquent les cellules filles sont génétiquement identiques les unes aux autres et à
la cellule mère. Dans ce procédé, le noyau de la première amibe se divise pour former
deux noyaux fils par le procédé de caryocinèse. Après que le noyau a été divisé en deux,
le processus de cytokinèse dans laquelle a lieu dans le cytoplasme de la cellule mère se
divise en deux cellules filles. Cela conduit à la formation de deux cellules filles d’amibe
ayant un noyau et leurs propres organites cellulaires.
33
La caryocinèse est le processus de la division du noyau. Elle correspond à la

séparation des chromosomes filles en deux noyaux fils. La caryocinèse est généralement
suivie par la cytocinèse.
La cytocinèse est le processus de la division du cytoplasme. Elle correspond à la
séparation des noyaux fils en deux cellules filles. La cytocinèse se produit
immédiatement après la mitose.
8. Bourgeonnement dans la levure
Les levures sont unicellulaires (certaines sont multicellulaires) comme les micro-
organismes eucaryotes appartenant aux champignons royaume. La taille d’une levure
peut varier considérablement selon les espèces, mesurant généralement 3-4 μm de
diamètre. La plupart des levures se reproduisent de façon asexuée par un processus de
division asymétrique appelé bourgeonnement. D'abord, il produit une petite
protubérance sur la cellule parente qui grossit d’une très grande taille et forme un
bourgeon. Le noyau de la cellule-mère se divise en un noyau fils et migre dans la cellule
fille. Le bourgeon se détache du corps de la mère en formant un étranglement à la base.
Le bourgeonnement se répète pour former une chaîne de cellules de bourgeon. La
cellule fille produite pendant le processus de bourgeonnement est généralement plus
petite que la cellule mère.
Les levures appartiennent à l'ensemble des thallophytes qui regroupe les
champignons et les végétaux qui ne possèdent ni racines, ni tiges, ni feuilles (algues,
lichens).
Les levures ont un appareil végétatif réduit à une seule cellule. Dans certaines
conditions de culture, ces cellules s'arrangent en files, mimant le mycélium des
champignons.
Les levures sont des organismes non chlorophylliens. Elles n'utilisent donc pas la
lumière comme source d'énergie et le gaz carbonique comme source de carbone. Elles
tirent leur énergie de la décomposition des matières organiques mortes. La plupart des
levures sont saprophytes. Quelques-unes sont parasites.
On rencontre des levures sur tous les milieux riches en sucres qu'elles transforment
en éthanol ou en glycérol. Cette transformation s'accompagne d'une forte production de
gaz carbonique. Cette fermentation se fait à l'abri de l'oxygène de l'air.Les levures
aiment plutôt les milieux acides. Beaucoup d'entre elles utilisent les acides organiques
comme source de carbone et d'énergie.
34
Les levures se multiplient par bourgeonnement (reproduction asexuée). La

reproduction sexuée n'existe que lorsque les levures se retrouvent dans des conditions
très défavorables de milieu. Selon le mode de reproduction sexuée, on distingue les
levures ascomycètes ou levures vraies (Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia,
Hansenula), les levures basidiomycètes (Sporobolomyces) et les levures imparfaites ou
fungi imperfectif (Candida, Kloekera, Rhodotorula, Cryptococcus).
Saccharomyces cerivisiae, agent de transformation des sucres en alcool, est à
l'origine des vins, des bières, cidres et autres boissons fermentées. C'est aussi cette
levure qui, en dégageant du gaz carbonique, assure la levée de la pâte à pain. Cette
levure possède un plasmide, petit filament d'ADN circulaire (nommé "plasmide deux
microns") dans lequel il est assez facile d'introduire des gènes étrangers à la levure,
l'obligeant à synthétiser le programme du gène introduit. C'est ainsi, par exemple, que
l'on a introduit le gène producteur de la capside du virus de l'hépatite B et que cette
levure peut être utilisée pour la production du vaccin contre cette maladie.
Candida albicans est une levure normale des muqueuses (bouche, vagin). Dans
certaines conditions, particulièrement quand l'hôte connaît une dépression passagère de
ses défenses immunitaires ou est atteint de certaines maladies (diabète), cette levure
devient pathogène et provoque des candidoses (muguet ou candidose blanche des
muqueuses). Candida est ce que l'on appelle un pathogène opportuniste.
De très nombreuses espèces de levures sont responsables de mycoses humaines ou

animales, souvent bénignes, quelquefois très graves, voire mortelles
(coccidioïdomycoses).
8.1. Reproduction d'une levure
Les levures sont des champignons unicellulaires, qui peuvent se reproduire de
manière sexuée ou asexuée. Leur mode de reproduction asexuée peut se faire soit par
fission binaire, soit par bourgeonnement. Il leur permet de se multiplier très rapidement
dans des conditions favorables. Par exemple, une seule cellule de levure de boulanger
peut produire par bourgeonnement jusqu'à 40 cellules filles en moins de deux heures.
© Larousse 2006.
35
Figure n° 16 : Cycle de reproduction de la levure (Leclerc et al., 1995).

8.2. La reproduction sexuée
La reproduction sexuée est la principale méthode de reproduction pour la grande
majorité des organismes macroscopiques, y compris presque tous les animaux et les
plantes. Voici deux processus principaux au cours de la reproduction sexuée chez les
eucaryotes: méiose, impliquant la réduction de moitié du nombre de chromosomes et la
fécondation, impliquant la fusion de deux gamètes et la restauration du nombre initial
de chromosomes. Au cours de la méiose, les chromosomes de chaque paire se croisent
généralement plus pour atteindre la recombinaison homologue qui permet de produire la
diversité génétique lorsque les cellules se divisent dans la méiose.
Figure n°17 : Schéma de la reproduction sexuée d’une levure (Thuriaux, 2004).
36
8.3. La reproduction asexuée

La reproduction asexuée est la principale forme de reproduction des organismes
unicellulaires comme les archées, les bactéries et les protistes. Beaucoup de plantes et
champignons se reproduisent ainsi de façon asexuée. La reproduction asexuée est un
mode de reproduction par lequel la descendance se pose à partir d'un seul parent, et
héritent des gènes de ce parent seulement. La descendance sera les copies génétiques
exactes de ce parent.
Les nouveaux organismes sont produits dans une multiplication rapide par le
processus de divisions amitotique ou mitose. L’amitose est le processus par lequel une
cellule se sépare directement, comme le noyau et le cytoplasme sont directement coupés
en deux. La mitose est le processus par lequel une cellule, qui a déjà répliqué chacun de
ses chromosomes, sépare les chromosomes dans son noyau de cellule en deux
ensembles identiques de chromosomes, chaque jeu aura son propre nouveau noyau.
C'est une forme de division nucléaire.
La fission binaire et le bourgeonnement sont deux méthodes ordinaires de
reproduction asexuée. La fission binaire se trouve dans les organismes unicellulaires
comme l'amibe, Paramaecium et Euglena, pour n'en nommer que quelques-uns, et le
bourgeonnement se trouve dans la levure et l’Hydre.
Figure n°18 : Schéma de la reproduction asexuée par bourgeonnement d’une levure

(Thuriaux, 2004).
37
*Reproduction asexuée, par scission - Scissiparité

Le noyau s’étire et se casse en deux. Pendant ce temps, une séparation au niveau de la
paroi, ce qui conduit à la formation de deux cellules. Les levures du genre
Schizosaccharomyces se reproduisent ainsi.
Figure n° 19 : Schéma de la reproduction asexuée par scission d’une levure

(Thuriaux, 2004).
9. Différenciation des levures
La levure biologique et la levure chimique : bien les connaître pour bien les utiliser.
Pour répondre à la question la plus couramment posée : qu'elle soit fraîche, déshydratée
ou lyophilisée, j'utilise toujours la même quantité de levure. Ma préférée étant la
lyophilisée pour sa facilité d'usage.
9.1. La levure fraîche : se présente généralement sous forme pressée. Très friable,
elle s'incorpore facilement dans le pétrin après avoir été délayée dans un liquide tiède
(25° C pas plus). Elle conserve ses propriétés stockée au froid entre 0 et 10°C. La
température optimale étant située aux alentours de 4°C. On ne met jamais en contact
la levure fraîche avec le sel (le sel "tue" la levure).
9.2.La levure biologique déshydratée : se présente sous forme de petites billes et
doit absolument être délayée dans un liquide à 25 °C maxi comme pour la levure
fraîche avant utilisation. Elle est aussi appelée levure sèche active.
9.3.La levure biologique lyophilisée : est aussi appelée levure sèche instantanée.
Elle se présente sous forme de petites paillettes et à l'avantage de pouvoir être
utilisée telle qu'elle, à sec, comme pour les croissants. Elle a un pouvoir
38
fermentaire de 30 à 40 % supérieur à la précédente (levure sèche active). Elle

permet une répartition rapide et homogène dans la pâte. L'incorporation au pétrin
s'effectue directement en la mélangeant à sec dans la farine ou en la saupoudrant
au-dessus de la pâte au début du pétrissage.
10. Les Conditions physicochimiques de croissance

10.1. Température : la température optimale de culture des levures se situe en
général entre 25 °C et 30 °C, mais comme les autres micro-organismes, les
levures peuvent être classées en levures psychrophiles, mésophiles et
thermophiles. D'une façon générale, les levures ne sont pas thermorésistantes. La
destruction cellulaire commence dès 52 °C (contre 120 °C pour les bactéries
thermophiles hors archées). Les levures sont aussi sensibles à la congélation et
à la lyophilisation avec une grande variabilité selon les genres et espèces, et selon
la phase de croissance (les cellules en phase exponentielle résistent moins que les
cellules en phase stationnaire).
10.2. Activité de l'eau : la plupart des souches ne peuvent se développer pour une
activité de l'eau inférieure à 0,90 ; mais certaines tolèrent des pressions
osmotiques plus élevées, correspondant à une activité de l'ordre de 0.60, en
ralentissant leur métabolisme ; ces levures sont dites xérotolérantes.
10.3. Oxygène : toutes les levures sont capables de se développer en présence
d'oxygène : il n'y a pas de levure anaérobie stricte. Certaines levures sont aérobie
strictes (comme les Rhodotorula). Les autres sont aéro-anaérobie facultatives
avec parmi elles : des levures préférant un métabolisme soit fermentaire soit
respiratoire même en présence d'oxygène.
10.4. pH : les enveloppes cellulaires sont imperméables aux ions H3O+ et OH−. Les
levures tolèrent donc des gammes de pH très larges, théoriquement de 2,4 à 8,6.
11. Sensibilité aux agents chimiques

11.1. Acides organiques : ils ont un effet inhibiteur sous leur forme non dissociée car
ils peuvent pénétrer dans la cellule et la sensibilité de la levure dépend de sa capacité à
les métaboliser. C'est pour cette raison que les acides sorbiques et propioniques sont
plus inhibiteurs que les acides acétique, citrique et lactique.
39
11.2. Éthanol : les plus résistantes sont les Saccharomyces bayanus que l'on utilise dans
les procédés de fermentation alcoolique pour l'élaboration des boissons ou d'éthanol
industriel.
11.3. Sulfite : le SO2 a un effet inhibiteur plus prononcé sur les bactéries que sur les
levures, même si parmi les levures des sensibilités existent.
11.4. Antifongiques : la sensibilité à la cycloheximide (actidione) est variable et on peut
distinguer 3 groupes de levures :
- Levures inhibées dès 1 µg/mL (ex : Saccharomyces)
- Levures inhibées à 25 µg/mL (ex: Schizosaccharomyces)
- Levures tolérantes à 1 mg/mL (ex: Zygosaccharomyces)
Le chloramphénicol inhibe la synthèse de protéines mitochondriales mais pas celle
des protéines cytoplasmiques. Seules les levures capables de fermenter peuvent alors être
cultivées en présence de chloramphénicol.
12. Métabolisme et conditions de croissance
12.1. Processus énergétiques
Les deux principaux processus énergétiques connus chez les hétérotrophes sont la
respiration et les fermentations. Pour leur développement ces levures ont besoin :
 De composés carbonés source de carbone et d'énergie.
 De composés azotés réduits sous forme d'ammonium ; quelques levures peuvent
cependant utiliser des composés oxydés (comme les nitrates) ou organiques pour
la biosynthèse des protéines et d'acides nucléiques.
 D'éléments minéraux variés, vitamines et facteurs de croissance qui varient selon
les levures.
Toutes les levures sont capables de dégrader le glucose, le fructose et le mannose en
présence d'oxygène, par un métabolisme oxydatif, conduisant à la formation de CO2 et
H2O.
12.2. Respiration aérobie : C6H12O6 (glucose) + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + ATP
(Adénosine Tri-Phosphate)
Cette voie métabolique est très énergétique et permet aux cellules de subir une
multiplication avec un rendement cellulaire élevé (le rendement étant défini par le
quotient de la quantité de cellules fabriquées par le substrat sucré consommé). En plus
des sucres simples, certaines levures peuvent utiliser d'autres glucides (mono, di ou
trisaccharides, voire des polysaccharides comme l'amidon) mais aussi des alcools, des
40
acides ou des alcanes. D'une manière plus générale, elles ont une capacité hydrolytique
bien moindre que les moisissures.
En plus du métabolisme oxydatif, certaines levures peuvent privilégier une
dégradation des glucides par un métabolisme fermentatif qui conduit à la formation
d'éthanol et de CO2 suivant la réaction :
12.3. Fermentation alcoolique : C6H12O6 (glucose) → 2CO2 + 2 (éthanol) +

C10H16N5O13P3 (Adénosine Tri-Phosphate, ATP).
En plus de ces composés majoritaires, des alcools supérieurs, des aldéhydes, des
esters, des acides… sont formés en plus petites quantités et participent qualitativement de
façon importante et complexe à la formation des flaveurs des boissons fermentées. Ce
métabolisme est moins énergétique que le métabolisme oxydatif, et le rendement de la m-
ultiplication cellulaire en est affecté bien que la vitesse de croissance puisse être
nettement plus rapide que dans le processus oxydatif. Ce processus fermentaire peut
fonctionner en présence ou en absence partielle ou totale d'oxygène c'est-à-dire en
anaérobiose. On évoquera, dans le paragraphe suivant, l'apparition d'un processus
fermentaire en présence d'oxygène en excès, décrit comme l'effet Crabtree et très
important dans l'industrie de production des levures de boulangerie.
41
Chapitre III Technique d’étude des levures
III.1. Isolement des levures Les levures
Sont sujets à la concurrence sur les milieux d'isolement par une reproduction rapide des
populations bactériennes, et à l'inhibition par des produits du métabolisme bactérien (Allen et
al., 1987). Leur étude demande l’emploi de milieux sélectifs dotés de propriétés
antibactériennes et si possible antimoisissures (Guiraud, 1998). Pour l'isolement des levures,
la plupart des investigateurs ont employé des milieux organiques complexes, contenant des
ingrédients comme l'extrait de malt, l'extrait de levure et le peptone, en combinaison avec le
glucose (Hagler et Mendonca, 1981).
2. Classification et identification des levures
2.1. Classification
La classification de référence est actuellement celle de Kreger-Van, (1984) qui présente

des changements sensibles par rapport à la précédente classification de Lodder, (1971). En
particulier, de nouveaux critères taxonomiques sont pris en considération pour permettre des
études plus rigoureuses. Il s’agit d’un groupe hétérogène, qui d’un point de vue taxonomique,
comprend une soixantaine de genres et prés de 500 espèces (Kreger-Van, 1984). Les levures
se divisent en 3 grandes classes : Les ascomycètes : genres sexués, où les produits de la
méiose ou ascospores sont endogènes et enfermés dans une structure issue du zygote : l’asque.
Les basidiomycètes : genres sexués, où les produits de la méiose ou basidiospores (chez les
levures sont souvent appelés ballistospores) sont exogènes et émis à l’extérieur du zygote. ·
Les deutéromycètes ou levures imparfaites : genres asexués ne se multipliant que par
reproduction végétative. Classification des levures (Kreger-Van., 1984).
2.2. Techniques d’identification
Les levures se distinguent des autres champignons par une taxonomie basée à la fois sur
des caractères culturaux, morphologiques, sexuels et physiologiques. En effet, les critères
d’identification n’ont pas tous la même importance, ils doivent être utilisés dans un ordre bien
déterminé (Bouix et Leveau, 1991).
2.2.1. Etude des caractères culturaux
Cette étude est effectuée à partir d’ensemencement sur milieux liquides et solides. Le but
est d’examiner l’aspect, la forme, la couleur et la consistance des cultures (Guiraud, 1998).
Les caractères culturaux ainsi étudiés sont :
41
- La forme des colonies.
- La coupe des colonies.
- L’aspect de la culture sur gélose inclinée.
- L’aspect de la culture sur milieu liquide.
- La couleur,….
2.2.2. Etude des caractères morphologiques cellulaires
Les critères utilisés dans la description des levures sont ceux décrits par; Wickerham,
(1951), Van der Walt, (1970), Van der Walt et Yarrow, (1984).
2.2.3. Morphologie cellulaire normale et mode de reproduction végétative
Ces caractères sont étudiés par des examens microscopiques, permettant de définir la
forme, l’arrangement et le mode de division des cellules, ainsi que de mesurer leur taille en
utilisant un oculaire micrométrique.
Les cellules de levures ont des formes variées, caractéristiques du genre mais la forme peut
se modifier assez largement selon les étapes du cycle biologique et en fonction des conditions
de milieu ( Larpent, 1991 ; Bouix et leveau, 1993 ; pol, 1997).
Elle se fait, soit par une du thalle, soit par la production de spores asexuées.
Chez les levures elle se fait la plupart du temps par bourgeonnement (saccharomyces) ou
éventuellement par scissiparité (Schizosaccharomyces) (Richer et Branger 2007).
2.3.1. Aptitude à la Filamentisation
Certaines espèces peuvent former des filaments de type mycélien. Ces filaments sont
parfois mis en évidence par l’examen microscopique précédant. La recherche systématique de
l’aptitude à la filamentisation d’une souche, doit cependant s’effectuer après une culture sur
un milieu spécifique.
42
A B C D
Figure n° 20 : Filamentisation des levures (A : mycelium à artrospore ; B : pseudomycelium

à blastospore et à chlamydospore ; C : pseudomycelium à blastospore) ( Guirad, 2003).
2.3.2. Morphologies particulières
Dans des milieux pauvres et sous tension d’oxygène réduite, la formation de

chlamydospores et de ballistospores est observée. Leur recherche s’effectue à partir de
milieux spécifiques.
Levures bourgeonnantes + pseudomycélium + blastospores + chlamydospores (spores de 6

à 12 µm, rondes ou ovales, à double contour, très réfringentes) : Candida albicans/ Candida
dubliniensis.
Levures bourgeonnantes + pseudomycélium + blastospores : levures du genre Candida,

orientation vers une espèce autre que Candida albicans / Candida dubliniensis (Larpent.,
1991).
Candida albicans et Candida dubliniensis sont les seules espèces qui produisent des tubes
germinatifs en 3 heures à 37°C, dans un milieu pour blastèse ou dans du sérum. Au-delà de 4
heures, la germination n’est plus spécifique de Candida albicans / Candida dubliniensis.
F 2% des souches de Candida.albicans / Candida dubliniensis ne produisent pas de tubes
germinatifs.
2.3.3. Caractéristiques sexuelles
La formation d’ascospores est un critère taxonomique très important. Différents milieux de

sporulation sont utilisés, pour mettre en évidence les asques, leur forme, la couleur et le
nombre de spores par asque, par sa reproduction sexuée ( Bourgeois et leveau, 1991).
43
4. Caractéristiques biochimiques et physiologiques
Les principaux critères physiologiques utilisés dans la classification des levures, sont la
fermentation et l’assimilation de différent substrats (Kreger-van Rij,1984 et Lodder,1970).
4.1. Fermentation des sucres
La description standard des levures se base sur la capacité à fermenter certains sucres,
examinés dans des tubes de Durham pendant une période fixe. La caractérisation de la
fermentation qu’elle soit vigoureuse, bonne, lente ou faible, dépend de la quantité de gaz
dégagé dans le tube d'insertion (Kreger-van Rij,1984).
4.2. Assimilation des composés carbonés
L’importance de l'assimilation des substrats carbonés comme critère pour la distinction des
levures est soulignée par Wickerham et Burton,(1948) et Wickerham,(1951).
Ces composés sont choisis pour leur intérêt distinctif, bien que la connaissance détaillée de
leur utilisation, du point de vue biochimique, fait souvent défaut (Ostergaard et al., 2000).
4.3 Assimilation des sources azotées
Les levures assimilent généralement l’ammonium, les peptones, les acides aminés et
parfois l’urée. Certains substrats azotés comme les nitrates, les nitrites, l’éthylamine, la
cadavérine, l’urée, etc… ne sont utilisés que par certaines espèces ; propriété spécifique pour
leur identification (Guiraud, 1998).
5. Méthodes Moléculaires d’identification des levures

L’apparition de la biologie moléculaire à permis de comprendre que les méthodes
d’identification des micro-organismes fondées sur les phénotypes des différents individus
n’étaient pas toujours faibles, car les résultats pouvaient varier dans le temps.
Plusieurs techniques ont donc été développées pour discriminer et /ou identifier les micro-
organismes par l’analyse de l’ADN ou d’une partie de celui- ci (Turner., 2000).
6. Les techniques de biologie moléculaires
Les méthodes d’étude de l’écologie microbienne suivent un schéma commun qui peut-
être divisé en trois étapes. Chacune doit être la plus performante possible pour assurer le
44
meilleur seuil de détection de la méthode prise dans sa globalité. Toutes ces méthodes
débutent par une extraction de l’ADN. Cette étape est essentielle car la quantité et la qualité
de l’ADN microbien récupéré conditionne les deux étapes qui constituent la suite de
l’analyse.
Figure n°21 : Les trois principales étapes d’étude de l’écologie microbienne par méthode
moléculaire.
6.1. La structure de l’ADN
L'ADN est une molécule très longue, composée d'une succession de nucléotides accrochés
les uns aux autres par des liaisons phosphodiester. Il existe quatre nucléotides différents :
l'adénosine, la cytidine, la guanosine et la thymidine, dont l'ordre d'enchaînement est très
précis et correspond à l'information génétique (Divol, 2004).
L'ADN est formé de deux brins complémentaires enroulés en hélice (double hélice). S'il
peut prendre plusieurs formes (type Z et type A), l'ADN prend le plus souvent la forme B, où
la double hélice possède les caractéristiques suivantes :
 10,5 paires de bases par tour ;

 un pas de l'hélice (hauteur entre deux tours) de 0,34 nanomètres.
45
La règle d’appartement est stricte : l’adénine ne peut s’associer qu’à la thymine ( dans
l’ADN) tandis que la cytosine s’associe nécessairement à la guanine. On dit des bases qui
s’apparient qu’elles sont complémentaires (Raven, 2011).
6.2. Matériel génétique des levures
Les levures depuis longtemps ont été un système modèle pour les recherches en
génétique.
Ce sont les premiers eucaryotes à avoir été manipulés à grande échelle par les techniques
du génie génétique et elles jouent encore un rôle primordial comme modèle dans les
recherches sur les cellules eucaryotes. En 1996, on a terminé le séquençage du génome de
saccharomyces.cerevisisiae premier eucaryote à être complètement séquencé. (Raven, 2011).
6.2.1. Le génome levurien
Le génome levurien est le plus petit de tous les génomes eucaryotes connus,
saccharomyces. cerevisiae possède 6000 gènes, 12 millions pb, et 16 chromosomes dont le
nombre est très variable entre les espèces. Ce matériel génétique est distribué sur les
chromosomes, l’ADN mitochondrien et un petit nombre d’éléments extra chromosomiques
(Goffeau et al.,1996).
La quasi- totalité (70%) du génome chromosomique levurien correspond à une information

génétique directe, contrairement à l’ADN des animaux ou des plantes dont une fraction
importante est formée de pseudogènes ou de séquences répétitives non transcrites (Thuriaux
et Mosrin, 1991 ;Goffeau et al., 1996).
6.2.2. Les chromosomes
Un chromosome est une structure constituée d'ADN. Chacun des chromosomes a une
forme différente. Nous en avons 23 paires dans le noyau de chacune de nos cellules, 22 sont
communes aux deux sexes. Les deux chromosomes restants sont les chromosomes sexuels.
Chez la femme, ils forment une paire. On les appelle les chromosomes X. Chez l'homme, ils
sont différents, l'un est un chromosome X et l'autre, beaucoup plus court est appelé
chromosome Y. Ces chromosomes contiennent le répertoire complet des histones
eucaryotiques, parmi les quelles l’histone H1long temps supposée absente (Goffeau et al.,
1996).
46
Les chromosomes sont particulièrement visibles au moment de la division cellulaire et ils

sont en nombre différent selon les espèces. Le nombre de chromosomes varie dans certains
types de cellules malades, en particulier dans les cellules cancéreuses, où en général, il
augmente.
De nombreuses homologies de séquences géniques et de leurs fonction avec des gènes

humains ont été mises en évidence (Goffeau et al., 1996 ; paret et al., 1999 ; Auclair et al.,
2003 ; Gomes et al., 2005).
Figure n°22 : Description de la structure d'un chromosome.
(https://fr.wikipedia.org/wiki/Chromosome).
6.2.3. L'ADN mitochondrial
Une mitochondrie contient plusieurs copies d'ADN circulaire. L'ADN mitochondrial

représente moins de 1% de l'ADN total de la cellule.
L'ADN mitochondrial est compacté en agrégats appelés nucléoïdes ou mito-

chromosomes. Le composant le plus abondant des nucléoïdes est le facteur de transcription
A qui contribue de manière significative à la compaction de l'ADN, de manière similaire à
47
l'action des histones.
Le génome mitochondrial chez les animaux (hérité de la mère) est une molécule d'ADN
double brin de de 16,569 paires de base (beaucoup plus petit que celui des plantes) avec 435
ilots CpG et 4747 cytosines dans des sites non-CpG.
C’est le cas de l’ADN plastidial et mitochondrial, qui du fait de similitudes de région avec
l’ADN bactérien, permet l’hybridation de certaines amorces universelles et par conséquence
un résultat positif à l’amplification. Pour éviter ce problème, il est nécessaire de choisir des
régions spécifiques à la communauté en question ou dans le cas ou sa présence est inévitable,
il faut donc repérer les pics ou bandes liés à cette amplification aspécifique et les supprimer
des profils obtenus (Jawich,2006).
6.2.4. Plasmide
Figure n°23 : Schéma représentant une bactérie contenant des plasmides.

https://fr.wikipedia.org/wiki/Plasmide
En microbiologie et en biologie moléculaire, un plasmide désigne une molécule d'ADN

distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la
survie de la cellule. Le terme plasmide fut introduit par le biologiste moléculaire américain
Joshua Lederberg en 1952. Les plasmides portent un ensemble de gènes permettant sa propre
réplication et fréquemment des gènes de résistance à des antibiotiques qui apportent un
avantage aux bactéries qui les contiennent.
Les plasmides sont bicaténaires (constitués de deux brins complémentaires) et

généralement circulaires. On les trouve presque exclusivement dans les bactéries et parfois
dans d'autres micro-organismes comme par exemple le plasmide 2Mu que l'on trouve dans la
levure Saccharomyces cerevisiae (levure de boulangerie), un eucaryote unicellulaire.
48
Les plasmides peuvent être présents en nombre de copies variable. Les grands plasmides
naturels (>50 kb) sont souvent présent à une ou deux copies par cellule, comme le
chromosome. Les plasmides construits par génie génétique pour des utilisations
biotechnologiques (expression de protéine recombinante, clonage de gène, séquençage de
l'ADN) ont souvent été modifiés pour être présents à un nombre de copies beaucoup plus
élevé, de l'ordre quelques dizaines à quelques centaines, ce qui permet une amplification de la
production d'ADN et/ou de protéines.
Plusieurs plasmides différents peuvent coexister dans une même cellule sous condition de
leur compatibilité mutuelle. Certains plasmides sont capables de s'intégrer aux chromosomes ;
on appelle ces plasmides des épisomes.
Les plasmides participent aux transferts horizontaux de gènes entre les populations
bactériennes, et donc à la dissémination des gènes conférant des avantages sélectifs (par
exemple des résistances aux antibiotiques ou des facteurs de virulence). La mobilité des
plasmides (par conjugaison) au sein des populations bactériennes accroît le spectre d'hôte des
gènes impliqués dans la virulence. Ces gènes offrent en contrepartie un avantage sélectif pour
le plasmide et les bactéries hôtes. On conçoit donc la nature quasi ubiquitaire et persistante
des plasmides chez les bactéries pathogènes ( Thuriaux et Mosrin, 1991).
6.2.5. ADN ribosomique
Figure n°24 : Schéma pour la structure l’ADNr (Higgins, 2012).
(en) Structure générique d'un opéron d'ADN ribosomique d'eucaryote indiquant la répétition
en tandem des domaines NTS, ETS, 18S, ITS1 (en), 5,8S, ITS2 (en) et 28S.
49
L'ADN ribosomique (ADNr) est l'ensemble des séquences d'ADN transcrites en ARN
ribosomiques (ARNr). Les ribosomes sont des complexes de protéines et d'ARNr au sein
desquels se déroule la traduction des ARN messagers au cours de la biosynthèse des
protéines.
L'ADN ribosomique des eucaryotes est un opéron formé d'une répétition en tandem de
domaines NTS, ETS, ARNr 18S, ITS1 (en), ARNr 5,8S, ITS2 (en) et ARNr 28S. Il possède
également un autre gène transcrit en ARNr 5S dans le génome de la plupart des eucaryotes.
L'ARNr 5S est également présent dans les tandems répétés par exemple chez la drosophile.
Dans le noyau, la région du chromosome portant l'ADN ribosomique apparaît sous la forme
d'un nucléole, qui forme de grandes boucles d'ADNr. Ces régions d'ADNr sont également
appelées organisateur nucléolaire dans la mesure où elles forment la base structurelle du
nucléole. Le génome humain compte cinq chromosomes portant de telles régions : les
chromosomes acrocentriques 13, 14, 15, 21 et 22.(Hoshino, 2012).
6.2.6. La région ITS
Figure n°25 : Shéma explicatif de la situation de la région ITS (Higgins, 2012).
L'ITS (pour Internal Transcribed Spacer) est une région de l'ADN ribosomique. C'est une
région non codante et hautement polymorphe. Pour cette raison, elle est très fréquemment
utilisée en biologie cellulaire pour mettre en évidence une différence génétique entre deux
espèces, par exemple, particulièrement chez les champignons.
Une telle variation intra génomique peut être détectée par les deux séquençages direct et le
séquençage après clonage amplifié par PCR de sa région ; évidemment, cette dernière
méthode va révéler plus de variation, en fonction du nombre de clones produits PCR
50
séquencés (Guillamon et al., 1998 ; Esteve – Zarzoso et al., 1999 ; Nisiotou et Gibson,
2005).
6.3. L’extraction de l’ADN
Plusieurs techniques d’extraction d’ADN sont possibles. Certaines permettent une

extraction rapide et directe de l’ADN à partir des cellules. D’autres indirectes nécessitent de
recourir à un protocole en plusieurs étapes. Le choix de ces méthodes dépend de la nature de
l’ADN ciblé (ADN chromosomique des bactéries, ADN génomique des levures), de l’origine
1ère étape Extraction de l’ADN 2ème étape Amplification de l’ADN 3ème étape
Différenciation des produits PCR (Moulessehoul, 2006).
6.4. Extraction d’ADN génomique de levure
L’ADN obtenu à l’aide de cette méthode n’est pas d’une pureté élevée, mais elle est
néanmoins suffisante pour les analyses par hybridation ADN/ADN ainsi que pour les
amplifications PCR. Les cellules sont mises en culture dans 10 ml de milieu complet (YPG)
liquide, à 30 °C sous agitation, jusqu’en début de phase stationnaire. Elles sont ensuite
récoltées par centrifugation (5min à 3000rpm). Le culot est alors remis en suspension dans 1
ml d’eau distillée puis transféré dans un tube Eppendorf et centrifugé pendant 2 min à 12000
rpm. Les cellules sont ensuite reprises dans 250 µl de tampon de broyage (TrisHCl pH 8 10
mM, EDTA 1 mM, NaCl 100mM, Triton 2%, SDS 1%) et on ajoute des billes de verre (de
diamètre 0,5 mm) de manière à laisser environ 1 mm de milieu audessus des billes. On ajoute
alors 250µl de phénol-chloroforme et le milieu est vortexé pendant 3 min, puis centrifugé
pendant 5 min à 12000 rpm. La phase aqueuse supérieure, transférée dans un nouveau tube
Eppendorf, est additionnée d’un volume de p h énol-chloroforme. Ce mélange est vortexé
pendant 30 sec puis centrifugé à 12000 rpm pendant 2 min. La phase aqueuse supérieure est à
nouveau transférée dans un nouveau tube Eppendorf et additionnée de 600 µl d’éthanol
absolu froid et de 20 µl d’acétate d’ammonium 3 M. Cette solution est maintenue dans la
glace pendant 15 min environ puis centrifugée pendant 5 min à 12000 rpm. Après séchage, le
culot est repris dans 400 µl de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM). On ajoute 30 µg de
RNase A au milieu qu’on incube pendant 15 min à 37 °C. 1 ml d’éthanol absolu froid est
alors mélangé à la solution qui est ensuite placée 15 min dans la glace, puis centrifugée
pendant 10 min à 12000 rpm. Le surnageant est éliminé et le culot rincé avec 1 m l d’éthanol
70%. Après une nouvelle centrifugation, le culot est repris dans 50 µl de TE. (Hoffman and
Winston, 1987).
51
6.5. Détermination de la concentration d’ADN
La concentration d’une solution d’ADN peut être estimée par la mesure de l’absorbance
à 260 nm, une unité d’absorbance correspondant à 50 µg/ml d’ADN bicaténaire. Le calcul du
rapport des absorbances à 260 nm et 280 nm permet d’estimer la pureté de la solution
(absence de protéines), ce rapport devant être compris entre 1,8 et 2 (Sambrook et al., 1989).
6.6. Électrophorèse sur gel d’agarose classique
Les fragments d’ADN de taille inférieure à 50 kb sont séparés selon leur taille par
migration sur gel d’agarose 1%. Ces fragments sont visibles aux UV à 300 nm grâce au BET
contenu dans le gel qui s’insère entre les plateaux de base de l’ADN. On peut en estimer la
taille et la concentration en comparaison avec la comigration d’un marqueur de taille tel que
de l’ADN de phage l digéré par EcoRI et HindIII. La migration s’effectue sous une tension
pouvant varier de 20 à 100Vdans un tampon d’électrophorèse, le TAE (Tris-Base 4,84 g ;
acétate de sodium 0,68 g ; EDTA 0,336 g ; acide acétique 1,35 ml; eau qsp 1l).
Le BET est un agent d’intercalation utilisé comme marqueur des acides nucléiques ; il
dovient fluorescent quand il est exposé aux rayonnements ultraviolets ; c’est un produit
dangereux, qui possède un effet mutagène et peut être cancérigène, il doit donc être manipulé
avec des gants sous une hotte aspirante ( Bâ et al., 2011).
Figure n°26 : Visualisation de bandes d’ADN sur gel d’agarose.
(https://wiki.aurea.eu/index.php/La_technique_PCR).
52
6.7. Gel polyacrylamide
Sur gel polyacrylamide : Les gels de polyacrylamide [Pol- Acrylamide Gel Electrophoresis
ou PAGE] sont utilisés pour des fragments plus petits que les gels d’agarose, en général
inférieurs à 1 kb. A nouveau, les échantillons déposés sur le gel sont séparés en fonction de
leur taille. Tous comme pour les gels d’agarose, une concentration plus élevée permet une
séparation plus nette des fragments de très petites tailles. Ils sont utilisés pour sépares les PCR
d’ITS, les fragments de RFLP (Huybens et al., 2009 ; Nolan et al., 2003).
Figure n°27 : principe d’électrophorèse (Lionnet et Croquette, 2005).
6.8. Purification de l’ADN par chromatographie
Cette méthode de purification, très rapide, a été utilisée pour séparer l’ADN double brin
amplifié par PCR des autres substances présentes dans le milieu réactionnel après
amplification (amorces en excès, dNTP, sels). L’ADN purifié peut ensuite être utilisé pour
d’autres réactions : PCR, digestion par un enzyme de restriction, ligation, séquençage... Cette
méthode de chromatographie d’exclusion (gel-filtration) est basée sur la séparation des
molécules selon leur taille dans une résine de Séphacryl sous l’action d’une force centrifuge.
Les impuretés (dNTP, sels) et les petits fragments d’ADN (amorces de taille inférieure à 25-
mer) sont retenus par la résine, alors que les grands fragments d’ADN (500-mer et davantage)
passent rapidement à travers. Les colonnes utilisées (MicroSpin™ S-400 HR), préalablement
équilibrées dans du tampon TE, sont commercialisées par Pharmacia. La colonne est d’abord
remise en suspension, placée dans un microtube Eppendorf et centrifugée à 2300 rpm pendant
1 minute pour éliminer l’excès de tampon. Après avoir placé la colonne dans un nouveau
microtube Eppendorf, 25 à 50 µl d’échantillon sont déposés délicatement à la surface de la
53
résine, puis centrifugés à 2300 rpm pendant 2 minutes. La solution d’ADN purifiée est
récupérée dans le microtube.
7. L’amplification de l’ADN
Afin de comparer ou d’étudier l’ADN extrait, celui-ci doit donc être amplifié par la
réaction de polymérisation en chaîne PCR.
La révolution suivante en biologie moléculaire à été la mise au point de la réaction en chaîne

de la polymérase (PCR, pour Polymerase Chain Reaction). Karu Mullis a mis au point la PCR
en 1983, Alors qu’il était chimique à la Cetus Corporation ; en 1993, sa découverte lui a valu
le prix Nobel de chimie (Huybens et al., 2009 ; Raven et al., 2011 ; Hoshino, 2012).
7.1. Définition de la PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR est une technique dont le but est de copier « in vitro » de façon exponentielle un
fragment d’ADN (ou parfois d’ARN) cible de longueur définie. Son principal objectif est
alors de faire un grand nombre de copies d’un fragment ou d’un gène cible pour avoir assez
d’ADN matrice pour d’autres études (Thiao,2005 dans Moussa Sassi ,2011).
Face à la méthode microbiologique traditionnelle, et aux méthodes non spécifique, la

biologie moléculaire (PCR) apporte des solutions de détection de hauts niveaux de rapidité
(réponse entre 24 à 48 heures), de sensibilité ( 1 à 5 germes.ml -1), et de spécificité .Mais elle
reste relativement chère et nécessite un personnel qualifié pour les opérations d’extraction, et
de fragmentation (Gerland, 2010) Aussi, comme inconvénients, cette technique ne fournit
aucune information sur le niveau de contamination (Delaherche et al., 2004) et peut souvent
générer des faux positifs car la réaction amplifie indifféremment l’ADN des cellules vivantes
et /ou mortes.
La technique PCR est utilisée pour amplifier différentes parties du génome en ayant pour
cibles l’ADN total, l’ADNr nucléaire ou l’ADNr mitochondrial. L’ADN total est analysé par
des techniques comme la RFLP (pour Random Fragments Length Polymorphism ou
Polymorphisme de longueur des fragments de restriction), l’AFLP ( pour Amplified
Fragment- Length Polymorphism ), la RAPD (pour Random Amplified Polymorphic DNA
ou Amplification aléatoire d’ADN Polymorphe) et les microsatellites pour accéder au
polymorphisme de larges portions d’ADN (Bà et al .,2011 ; Chikere, 2013).
54
7.2. Principe
La PCR est une technique permettant l’amplification exponentielle et spécifique d’un

fragment d’ADN in vitro par l’utilisation d’une polymérase thermostable, d’oligonuc l é
otides amorces et des quatre dNTP, que l’on soumet à une série de cycles de température.
Plusieurs cycles alternant une dénaturation de l’ADN, l’hybridation des oligonucléotides et la
polymérisation de l’ADN sont ainsi effectués. La durée et la température des différentes
étapes sont des paramètres essentiels qui sont définis pour chaque expérience.
Quand on répète ce mécanisme, on obtient une grande quantité de séquences correspondant

à l’ADN situé entre les deux amorces (Raven et al., 2011 ; Bâ et al., 2011).
La PCR est basée sur le mécanisme de réplication de l'ADN (1) in vivo : l'ADN bicaténaire
est déroulé en ADN monocaténaire, puis dupliqué et ré-enroulé, selon des cycles répétitifs
comprenant les trois étapes suivantes :
 7.2.1. Dénaturation : de l'ADN par fusion à haute température pour convertir l'ADN
bicaténaire en ADN monocaténaire. Cette étape est réalisée à une température comprise
entre 93 et 96°C.
 7.2.2. Hybridation : à l'ADN cible de deux oligonucléotides utilisés comme amorces.
Cette hybridation a lieu à une température comprise entre 55 et 65°C.
 7.2.3. Extension : de la chaine d'ADN par addition de nucléotides à partir des amorces en
utilisant l'ADN polymérase (2) comme catalyseur en présence d'ions Mg2+. La
55
température optimale de travail de l'ADN polymérase est de 72°C.
Figure n°28 : Schéma représentant les cycles PCR.
(https://wiki.aurea.eu/index.php/La_technique_PCR).
8. Les différentes méthodes d’identification des levures
La PCR fournit, une estimation qualitative (nature des espèces) et quantitative nombre
d’espèces) de la diversité microbienne. Pour cela, l’amplification est basés sur l’utilisation de
courtes séquences consensus présentes chez toutes les espèces qui assurent l’amplification
d’une séquence divergente selon l’espèce. Cette divergence peut d’exprimer en termes de
taille, de séquence nucléotidique, ou bien une combinaison de ces deux paramètres (Ness.,
1993).
8.1. PCR quantitative
La PCR quantitative (ou QPCR), ou PCR en temps réel, est une méthode particulière de
réaction en chaîne par polymérase permettant de mesurer la quantité initiale d'ADN. En
56
réalité, la PCR quantitative mesure le nombre d'amplicon (portion d'ADN définie par un
couple d'amorces).
Il existe diverses techniques permettant de quantifier l'ADN en biologie moléculaire. On

peut utiliser la spectromètrie à 260 nm qui permet de connaître avec précision la concentration
d'ADN total dans un échantillon par dosage optique. Cette méthode ne peut cependant pas
permettre de connaître avec précision la quantité d'un ADN particulier (défini par une
séquence précise de nucléotides). Il existe heureusement plusieurs techniques fiables
permettant la quantification de l'expression d'un gène particulier comme le Southern blot, le
Northern blot et bien sûr la PCR quantitative.( https://fr.wikipedia.org/wiki/PCR_quantitative)
8.2. Principe de la quantitative
L’amplification au cours de la se fait selon la formule :
X = X0 (1+ Eff)n
X : Nombre de molécules.
X0 : Quantité initiale à amplifier.
n : Le nombre de cycles.
Eff : Efficacité de l’amplification, c’est-à-dire la proportion moyenne de

molécules se dupliquant au cours d’un cycle. En général, l’efficacité est entre 80
et 90%, au cours des premiers de la PCR.
Cependant l’amplification n’est pas exponentielle sur toute la durée da la

PCR. En effet, la PCR peut être décomposée en deux phase exponentielle et la
phase de plateau, ou les produits nécessaires à l’amplification (notamment les
d’NTPs et les amorces) deviennent limitant ( Berrih-Aknin ; 2002).
Cette technique est très puissante, relativement simple à mettre en œuvre et

applicable à n’importe quel gène à partir du moment où la séquence est connue.
57
C’est une technique fiable et reproductible mais elle nécessite des mises au point
préalables. Son utilisation dans des situations physiologiques (au cours du
développement ou activation) et physiopathologiques est très informative,
surtout quand les outils spécifiques des protéines correspondants ne sont pas
disponibles (Berrih- Aknin ; 2000).
8.3. PCR delta
Il s’agit d’une technique basée sur l’amplification par PCR (polymerase chain reaction)
des régions du génome situées entre les éléments delta, portions d’ADN dispersées en nombre
variable selon la souche de levure. Seul Saccharomyces cerevisiae possède ces éléments delta,
aussi cette technique n’est elle appliquée qu’à cette espèce. On estime que 20 % des souches
différentes par ECP ont le même profil PCR. Plus rapide et moins coûteuse que l’ECP – les
résultats peuvent être obtenus en 24 / 48 heures – cette méthode est utilisée notamment pour
les contrôles de production et d’implantation, la sélection de souches et les études
écologiques. Legras et Karst (2003) ont optimisé cette technique en concevant deux nouvelles
amorces : 12 et 21 situées près de  1 et  . L’utilisation de  12 et  21 ou de 1 avec 2
met en lumière un plus grand polymorphisme se traduisant par un grand nombre de bandes sur
le gel d’électrophorèse (Castellucci, 2011, Outil de la biologie moléculaire pour
l’identification de la levure de la vinification Saccharomyces cerevisiae et d’autre espèce liées
à la vinification).
8.4. La reverse transcriptase (RT- PCR)

L’ADN est très stable dans la milieu contrairement à l’ARN. L’étude de ce dernier est
donc plus intéressante si la viabilité d’une population microbienne est l’objet de recherche.
La reverse transcriptase RT) permet la création à partir de l’ARN d’un brin d’ADN
complémentaire (ADNc) qui peut ensuite être amplifie par une PCR classique.
La RT- PCR permet donc la comparaison de la composition, de la viabilité ou de
l’activité de populations microbiennes (Sharkey et al., 2004 dans Huybens et al., 2009).
58
Figure n°29 : Le principe de la RT- PCR (Beldjord, 2009).
8.5.Identification des levures entre espèces
8.5.1. PCR ITS (Internal Transcribed Spacer)
Cette technique permet d’amplifier une partie de l’ADN ribosomique, la région ITS
(Internal Transcribed Spacer) des levures, moisissures ou bactéries. Cette région étant
théoriquement identique pour tous les individus d’une espèce donnée, mais différente d’une
espèce à l’autre, elle est la base de nombreuses études taxonomiques. Dans le cas des
bactéries, on lui préfère parfois la PCR 16S qui vise une autre région de l’ADN ribosomique.
L’amplification de la région ITS par la PCR se réalise dans un thermocycleur suivant un

région cycline, chaque cycle est caractérisé par une succession de trois étape principales de la
PCR.(White et al.,1990 ; Guillamon et al., 1998 ; Egli et Henick-kling, 2001).
9. Identification des levures au niveau de souche
9.1. PCR- RFLP(Restriction Fragment Length polymorphism)
Pour certaines identifications de levures, la technique de PCR-RFLP a été utilisée comme

signalé plus haut. Les conditions de réalisation de la PCR ont déjà été mentionnées. Les
amplicons sont révélés par électrophorèse dans un gel d’agarose 1,5 % (p/v). La RFLP
59
consiste en une digestion enzymatique des amplicons obtenus lors de la PCR. Les enzymes
utilisées sont les suivantes : HhaI, HaeIII et HinfI. Les mélanges réactionnels sont explicités
dans le tableau. Après 2 heures à 37°C, les fragments de restriction sont séparés selon leur
taille par électrophorèse dans un gel d’agarose 3% (p/v).
(file:///C:/Users/safa/Downloads/divol.pdf)
Le RFLP est un véritable marqueur génétique. En effet, il correspond à un emplacement

strictement défini sur le génome et se caractérise par sa viabilité d’une espèce à l’autre (Ludes
et Mangin, 1992).
Tableau n°2 : Enzymes de restriction utilisées et conditions d’utilisation (données en µL).
9.2. La technique Random Amlifide Polymorphic DNA (RAPD)
L’amplification aléatoire d’ADN polymorphe est une technique qui a été développée par
Williams (1990) afin de construire des cartes génétiques.
Le principe consiste à utiliser des amorces d’environ 10 paires de bases avec des
températures d’appariement basses, 36°C à 45°C. Des appariements plus ou moins
spécifiques ou des mésappariements permettent l’amplification d’une série de fragments de
tailles différentes.
Les fragments obtenus dépendent de l’appariement des amorces et de la distance entre ces
appariements en utilisant peu de matériel (Huybens et al., 2009).
60
Afin de contrôler les résultats obtenus, il convient de multiplier les essais en variant la
quantité d’ADN de départ (Huybens et al., 2009). En utilisant une concentration d’ADN
suffisante sans être trop élevée entre 10 et 100 ng) et en standardisant au maximum le matériel
comme la méthode (même polymérase, même cycleur, même manipulateur......), la
reproductibilité de la manipulation peut être fortement améliorée.
Figure n°30: Principe de méthode de RAPD (Filofteia, 2010).
9.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
L’analyse AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) a été utilisée pour la

caractérisation des souches de levures isolées des établissements viticoles
australiens (Curtin et al., 2007). Ainsi, la technique a permis l’identification de
8 génotypes provenant d’un total de 244 isolats originaires de 31 régions
viticoles. Cette technique, décrite pour la première fois par vos et al. (1995), est
fondée sur la mise en évidence conjointe de polymorphisme de sites de
restriction et d’hybridation d’amorces arbitraires. Cette technique utilise à la fois
les enzymes de restriction et l’amplification par PCR (Filofteia, 2010 ;
Abdulmalk, 2013).
61
En 2009, de nouveaux protocoles sont apparus avec différentes compositions

pour le mélange utilise pour l’analyse par PCR (Tessonniere et al., 2009).
C’est une combinaison de deux techniques PCR et RFLP après digestion

par deux endonucléases. L’ADN génomique subit une légation d’adaptateurs
spécifiques compatibles avec les extrémités générée par les digestions
enzymatiques. Ces adaptateurs permettent ensuite l’hybridation d’amorce
spécifique. On obtient ainsi des profils constitués de plusieurs dizaines de
bandes distinctes. Analysé par exemple sur gel de polyacrylamide (Filofteia,
2010).
Figure n°31: Principe de méthode d’AFLP (Huybens et al., 2009).
62
10. Biotechnologie des levures

Par un métabolisme diversifié, les levures occupent une place essentielle
dans l’industrie alimentaire. Elles participent à l’élaboration de nombreux
produits alimentaires (panification, fromagerie, brasserie) et dans la
production des métabolites mais aussi à la revalorisation de déchets agricoles
et industriels, et la production protéines (Scriban, 1984 et Lecterc et al.,
1995).
Les biotechnologies et la recherche biomédicale exploitent ainsi
largement ces microorganismes, pour la production de molécules d’intérêt
médical. (Ex : production de protéines hétérologues, comme le vaccin de
l’hépatite B) (Mercier, 1997 et Blin, 2002).
Types Levures utilisées Utilisations
d’enzymes
Amylases Lipomyces starkey Saccharification de l’amidon,
Sachwanniomyces castellit Boulangerie, Textile, Papeterie
Invertases Saccharomyces carlbergensie Confiserie
Saccharomyces cerevisiae
Lipases Condida lipolytica Fromagerie, laiterie
Lactases Candida pseudotropicalis Crèmes glacées
Kluyveromyces fragilis
Kluyveromyces lactis
Tableau n°3 : Production et utilisation de certaines enzymes levuriennes (Simon et

Meunier, 1970 et Sicard, 1982)
63
10.1. L’utilisation des levures en industrie
10.1.1. Panification
Une autre utilisation, connue depuis l’antiquité, est la fabrication du pain : Le dégagement
de gaz carbonique, qui accompagne la fermentation, permet de faire lever la pâte en lui
conférant une texture légère. On utilise également Saccharomyces cerevisiae ( levure de
boulangerie) (Simon et Meunier, 1970 et Cofalec, 2006).
10.1.2. Production de protéines
Les levures constituent une source précieuse de protéines car elles sont le siège d’une
biosynthèse protéique très active. Elles sont utilisées à la production de protéines
d’organismes unicellulaires (POU) ou « Single Cell Proteins » (SCP) , qui sont souvent
incorporées à l’alimentation animale et humaine. Cette production peut s’effectuer sur des
substrats considérés comme des déchets tels que le lactosérum et les résidus de pâte à papier.
(Pol, 1996).
10.2. La levure probiotique Saccharomyce cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae est un champignon levuriforme (unicellulaire) appartenant au

genre des ascomycètes (Moller et al., 2001 ; et visser et al., 1990).
La croissance optimale de cette levure se situe à des valeurs de pH comprises entre 4,5
et 5,0 mais elle tolère parfaitement des valeurs de pH comprises entre 2,5 et 8,0.
Saccharomyces cerevisiae est une espèce mésophile avec un optimum de température entre 25
et 30°C (Rose and Harrisson, 1971) qui peut s’adapter et coître dans un large spectre de
température, Toute fois elle est généralement incapable développer de se à des températires
supérieures à 40°C.
Les différentes souches sont ubiquistes, c’est- à- dire capable de se développer en milieu
aérobie et en milieu anaérobie (Rose, 1987). Sous certaines conditions, notamment
l’adjonction d’ergostérol au milieu de culture (Moller et al., 2001 ; visser et al., 1990). Cette
propriété lui permet d’accroître sa biomasse en présence ou en absence d’oxygène mais à des
rythmes différents ; la production en aérobiose autorise un accroissement de sa biomasse
presque 20 fois supérieur à celui de la fermentation.
64
Cette levure est, depuis des temps très anciens, à la base de la panification et de la
fabrication des boissons alcoolisées et aujourd’hui, elle continue à être indispensable à ces
activités industrielles (Harrison and (Rose, 1970) auxquelles on peut ajouter la production des
biocarburants (éthanol). Depuis un demi-siècle, la levure s’installe et progresse en qualité
d’additif alimentaire, puis de pro biotique en élevage intensif de ruminant ou les éleveurs ont
commencé à l’apprécier lors de tentative de valorisation des résidus de fermentation (Carter
and Phillips, 1944).
65
Chapitre IV Matériels et Méthodes
1. Objectif de l’étude
Les levures se trouvent naturellement sur le raisin (habitat principal) de table ou de cuve par
exemple les gènes : Kluyveromyces, Pichia...etc, participant à de nombreuses fermentations qui
contribuent à la production des différents produits.
Cette étude consiste à isoler, purifier, caractériser microscopiquement et identifier

génétiquement les levures souvent trouvées dans le cépage dénommé le cépage Cinsault cultivé
de la région Abdelmalek Ramdane dans la Wilaya de Mostaganem, en cherchant à valoriser et
exprimer la diversité du patrimoine phylogénétique en se basant sur l’étude moléculaire (PCR –
ITS – RFLP).
2. Présentation de la région de la récolte
Les vignobles sont situés dans le cépage Cinsault cultivé de la région Abdelmalek Ramdane
dans la Wilaya de Mostaganem, Selon le recensement général de la population et de l'habitat de
2008, la population de la commune de Abdelmalek Ramdane est évaluée à 13 607 habitants
contre 12 577 en 1998.
Figure n° 32 : le cépage Cinsault cultivé de la région Abdelmalek Ramdane

dans la Wilaya de Mostaganem.
3. Sources de prélèvement des levures
Les échantillons sont prélevés au mois de Septembre 2012dan les vignobles sélectionnés à.
Cinsault cultivé de la région Abdelmalek Ramdane dans la Mostaganem. Le cépage soumis à
l’étude est :
66
Le cinsault est un vieux cépage noir à jus blanc, probablement originaire de la Provence.
C’est en Languedoc et en Vallée du Rhône qu’il s’est définitivement installé.
Ses grappes sont grandes, composées de grosses baies à la chair très juteuse. C’est un cépage
tardif qui a besoin de soleil et qui résiste bien à la sècheresse, assez productif mais fragile face
aux maladies. Il préfère les sols pauvres pour une production de qualité.
Figure n° 33 : le Cinsault
4. Milieux de culture
4.1. Milieu de pré culture YPG
Les bais, recueillies des vignobles, sont mises en culture dans un milieu riche YPG ( Yeast
Peptone Glucose) additionné de Gentamicine et /ou Chloramphénicol dont la composition est la
suivante
Remarque : Chloramphénicol est un antibiotique de la famille des phénicolés, il est utilisé en

association avec la gentamicine dans des milieux de culture en mycologie pour empêcher la
croissance des bactéries et favoriser ainsi celle des champignons. (Organisme québécois
responsable de la Sécurité et de la Santé au Travail, 2013).
4.2. Milieu de pré culture OGA
La gélose glucosée à l’oxytétracycline est utilisée pour la recherche et le dénombrement des

levures et des moisissures. Ce pendant, en 1965, Buttiaux et Catsaras ont recommandé l’emploi
de ce milieu pour la recherche des levures et moisissures dans les bières.
5. Préparation du milieu de culture

 Mettre en suspension les éléments constituants le milieu dans 1 litre d’eau distillée.
 Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le
temps nécessaire à sa dissolution.
 Répartir en flacons, à raison de 200 ml par flacon à peu près.
 Stériliser à l’autoclave à 120°C pendant 20 minutes.
67
6. Isolement, purification et conservation des isolats
1ère étape
Prélèvement 1 seul cépage
(Septembre
(vignoble de Abdelmabdelmalek Ramdane) Cinsault
2012)
2ème étape Isolement des souches - Baies de raisin

de levures - Stade d’enrichissement(1jf)
(Septembre
- « boites de pétri coulées
2012)
par la YPG+ gentamycine
3ème étape Purification Repiquage par stries
(Septembre
2012)
4ème étape Conservation - Repiquage par stries en

(Septembre tubes inclinés
2012) - Stocker à 4°C/2 à 3 mois
(Revivification au mois
pe Décembre et Mars)
5ème étape Identification

microscopique des
(Mai 2017) levures Etude des caractères culturaux
Morphologie cellulaire et mode

de la multiplication végétative
Aptitude à la filamentisation
Caractéristiques sexuelles
Figure n°34 : Schéma récapitulatif de l’étude microscopique des souches isolées.
68
6.1. Technique de prélèvement des levures

Nous avons prélevé avec ciseaux stérile environ 500 g de grappes de raisins sains, et nous les
avons recueillis dans des sachets stériles.
6.2. Préparation de l’extrait de raisin
Des grappes de raisins sont éraflées et écrasées a fin d’obtenir un mout qu’on laisse
fermenter pendant une journée a 25° C dans le but d’augmenter la viabilité et la quantité des
levures.
6.3. Isolement des levures
Cette étape consiste à isolats les levures présentent dans le jus ou le mout de raisin sur un
milieu spécifique (YPG+ Gentamycine).
A l’aide d’une pipette pasteur flambée, on ensemence des boites contenant des milieux de
cultures par la méthode de strie avec le jus obtenu ou le mout recueilli à partir de cépage de la
1ere journée.
6.4. Méthode
- Tracer sur le fond extérieur de la boite de pétri de diamètre perpendiculaires, la boite et
ainsi séparée en quatre secteurs équivalents.
- Prélever à l’anse le jus de raisin ou le mout de premier jour de la fermentation en
respectant les règle des stérilités.
- Etaler l’inoculum en une zone périphérique sur une surface de 1 cm2.
- Flamber l’anse, laisser refroidir, disséminer l’inoculum précédemment déposé en l’étalent
en stériles très serrées sur une moitié de la boite.
- Faire pivoter la boite d’un quart de tour. Flamber à nouveau l’anse, laisser refroidir.
Tracer à nouveau des stries dans la moitié de la boite ressemblant les autres quadrants.
- Répéter l’opération afin de disséminer la semence du troisième quadrant dans le
quatrième.
- Placer dans la position renversée les boites stériles dans l’étuve.
- Et avant d’être mise à l’incubation (25°C/1 j-5j), les boites doivent être soigneusement
codées arrangées.
7. Purification des levures
Générer, la purification a pour objectif d’éliminer les contaminants qui accompagnent le
prélèvement initial et de contrôler la pureté de l’échantillon (Bent Mohamed et Sidi Baba,
2008).
69
7.1. Technique
 Effectuer une série d’ensemencements par la méthode des stries sur des boites contenant le
milieu YPG + Gentamicine.
 Renouveler l’opération en prenant à chaque fois au hasard une colonie isolée
 Etiqueter les boites de pétrie
 Incuber à 25 ou 27° C pendant 24 à 48h
Noter : cette technique conduits à obtenir une culture dont la pureté est estimée par
observation microscopique.
8. Conservation des levures
La méthode de conservation des souches la plus utilisée et la plus simple consiste à repiquer
les souches en tube sur gélose inclinée, les cultures sont incubées pendant 3 à 5 jours, pour
permettre une croissance maximale, puis elles sont stockées à 4° C afin de favoriser leur viabilité
et limiter les possibilités de variations, les levures se conservent très bien au réfrigérateur
pendant 3 à 6 mois. L’opération est reconduite deus fois depuis le mois de septembre 2012 (UI-
Haq et al., 2002 Guiraud, 2003)
8.1. Technique
 Dans des tubes à vis stériles, verser le milieu YPG préalablement fondu additionné de
gentamicine à raison de 0.15 ml
 Laisser solidifier le milieu incliné sur surface froide
 Etiqueter les tubes
 repiqués les souches en tubes par des stries
 incuber à 25 ou à 27° C pendant une durée allant jusqu’à 3 à 5 jours
 conserver les tubes ensemencés au frais à 4° C pendant un mois ou plus
Remarque : la conservation des souches de levure nécessite un repiquage sur milieu neuf
chaque deux à trois mois pour une meilleure revivification, pour cela le 1er repiquage a était
réaliser le 19-12-16 ; le 2éme repiquage a était effectué le 04-03-17 ; voir jusqu’ à plusieurs
repiquages.
*Les repiquages étaient dans des boites coulées avec le milieu YPG + gentamycine.
70
9. Identification microscopique des levures
9.1. Tests morphologiques
9.1.1. Etude des caractères culturaux
Après l’incubation des cultures pendant 3 jours à 25 – 28°C sur milieu gélosé (YPG +
gentamycine), une observation macroscopique permet de décrire l’aspect des colonies (taille,
pigmentation, contour, viscosité...).
9.1.2. Les caractéristiques cellulaires
9.1.2.1. Morphologie cellulaire et mode de multiplication végétative
L’observation microscopique permet de définir la forme, l’arrangement et le mode de

division des cellules.
 Observation vitale sans coloration
Ces caractéristiques sons observées sur des préparations microscopiques à l’état frais
(objectifs ×40) par un prélèvement d’une colonie à partir d’un milieu solide par une anse et la
déposer dans un tube contenant 10 ml d’eau distillée et on la jusqu’à ce que la colonie soit
dissociée, on prélève une goutte de cette suspension et on la dépose entre une lame et une
lamelle puis on passe à l’examen microscopique (Pol, 1996).
 Observation vitale avec coloration
L’observation au microscope des lames colorées au bleu de méthylène nous à permis de

définir les formes : sphériques, ovidés, allongées, cylindriques... (Larpent, 1991).
10. Méthode de la coloration avec le bleu de méthylène

- Déposer une goutte de bleu de méthylène sur la lame identifiée.
- Prendre une colonie à l’aide de la spatule.
- Mélanger l’échantillon à la goutte de bleu de méthylène.
- Recouvrir d’une lamelle en évitant la formation de bulles d’air.
- Observer rapidement la préparation au microscope, à l’objectif ×40.
10.1. Test de filamentisation
La recherche systémique de l’aptitude à la filamentisation, est observée à partir d’une
culture sur lame microscopique (Objectifs ×40 puis × 100). Pour cela, le milieu YPG fondu
est déposé à la pipette sur une lame microscopique préalablement stérile dans une boite de
71
pétri, Quand le milieu est solidifié, la levure à examiner est ensemencée en une strie
longitudinale.
La lame est incubée dans la boite de pétri contenant un peu d’eau distillé stérile pour
éviter la dessiccation du milieu. L’observation se fait après 3 à 5 jours d’incubation. La
Bordure de la culture est examinée, si la levure filament, la nature de mycélium (pseudo ou
vrai mycélium), son abondance, sa ramification sont notées.
La différenciation entre mycélium et pseudo mycélium se fait sur la base de deux
constatations :
- La cellule terminale d’un filament de mycélium vrai est plus grande que l’avant
dernière.
- Les filaments de pseudo mycélium présentent des constrictions au niveau de deux
cellules consécutives. On peut notes dans certains cas, la présence de blastopores et de
chlamydospores (Guiraud, 2003).
10.2. Test de sporulation (caractéristique sexuelles)
Le milieu utilisé pour étudier la propriété de nos souches à former des ascospores est le
milieu « Fowell + gentamycine ». C’est un milieu recommandé pour mettre en évidence les
ascospores.
Le milieu est autoclave à 120°C pendant 20 minutes, puis réparti aseptiquement dans des
tubes inclinés, ensuite ensemencés et incubés à 25°C pendant une semaine à un mois.
Les observations se font sur des préparations microscopiques pour examiner la forme de
l’asque et des ascospores, ainsi que le nombre et la position des ascospores dans l’asque.
 Coloration des spores sur frottis
Protocole
1- Réaliser un frottis épais et le laisser sécher à l’air.
2- Recouvrir de solution de vert-malachite.
3- Chauffer légèrement sur la veilleuse d’un bec bensen jusqu’à évaporation sans faire
bouillir.
4- Rincer pendant 1 minute sous un filet d’eau.
5- Recouvrir de solution de safranine et laisser agir 20 secondes.
6- Rincer sous un filet d’eau et laisser sécher.
7- Observer au microscope directement (sans lamelle).
72
*Résultat
Les levures et la paroi des asques sont colorées en rose tandis que les ascospores sont colorées
en vert.
11. Tests des caractéristiques biochimiques et physiologiques
11.1. Fermentation des sucres
Bien que les tests biochimiques (la capacité à fermenter différents glucides) constituent une
approche classique pour l’identification des levures, il n’en demeure pas moins qu’ils sont
particulièrement utiles pour la détermination de certaines espèces et sous-espèces de levures.
Grâce à ces tests, il est possible de connaître certaines caractéristiques du métabolisme des
levures isolées.
Les tests d’information sont effectués avec des sucres très purs à des concentrations de 6%.
Les souches ont été testées pour leur capacité à fermentation le glucose, fructose, lactose,
saccharose selon la méthode de Durham avec un virement de la couleur du rouge au jaune du fait
de l’oxydation du milieu.
Le milieu utilisé est celui proposé par Wickerham (1951) qui contient un indicateur coloré, le
milieu est réparti en tubes à essai, à raison de 9 ml par tube, et chaque tube reçoit une cloche de
Durham.
Les sucres à tester sont mis séparément dans chaque tube, l’ensemble est ensuite autoclaver à
120°C, 20 min.
Après refroidissement, les milieux sont ensemencés et portés à l’incubation à 30°C pendant
72h. Les tubes examinés chaque jour pour voir le pourcentage de gaz dégagé dans la cloche et le
virage du couleur de l’indicateur coloré (Aissam, 2003).
11.2. Milieu de culture
Le milieu choisi pour ces tests est le milieu YPG liquide additionné d’un indicateur coloré
avec une cloche de Durham, sa composition varie selon le sucre à tester.
 Extrait de levure..........................................................10,0 g
 Peptone pancréatique..................................................10,0 g
 Gentamicine ( à la place du Chloramphénicol).........0,15 ml
 Sucre...........................................................................20,0 g
 Rouge de phénol........................................................24,0 ml
 Eau distillée...............................................................1000 ml
 PH = 5,8
73
11.3. Préparation du milieu

 Penser la masse nécessaire de chaque constituant pour 1L d’eau distillée.
 Ajouter la source de carbone (glucide à tester).
 Dissoudre les composants du milieu dans le diluant à l’aide de l’agitateur
 Porter à ébullition sur une plaque chauffante.
 Laisser refroidir légèrement sur la palliasse.
 Répartir en flacons, à raison de 200 ml par flacon à peu près.
 Stériliser à l’autoclave à 120°C pendant 20 minutes.
Remarque : La préparation du milieu est répétée pour chaque sucre à testé.
11.4. Technique d’identification
 Répartir le milieu dans des tubes à essai, à raison de 9 ml par tube.
 Conditionner les tubes avec une cloche de Durham.
 Ensemencer le milieu avec une culture levurienne.
 Etiqueter chaque tube selon la souche correspondante.
 Porter les tubes à l’incubation à 30°C pendant 3 à 5 jours.
 Examiner les tubes chaque jour pour voir le pourcentage de gaz dégagé dans la cloche
(Audigie et al, 1983).
12. Caractérisation biotechnologique
12.1. Etude de l’activité enzymatique de la biomasse
La cinétique enzymatique de l’invertase est établie en utilisant des bandelettes de détection
de glucose avec un lecteur approprié.
12.2. Préparation de l’enzyme
 Mettre en suspension 10 g de chaque souche dans 30 ml d’une solution
d’hydrogénocarbonate de sodium à 0,1 mol/1.
 Incuber 24 h à 40°C.
 Centrifuger, récupérer le surnageant et le diluer au 1/10 avec du tampon.
* Mesures
 Prépare une solution de saccharose 0,75 g/ 100 ml.
 Mettre 5 ml de tampon acétate pH = 4.6 dans les tubes à essai.
 Ajouter 1 ml de la solution de saccharose dans le premier tube. Dans les autres tubes
placer 0.8, 0.4, 0.2, 0.1,0 ml de la solution de saccharose complété 1 ml avec le tampon.
 Faire de même pour les dilutions des autres substrats.
 Construire la courbe Vi = (Saccharose). La vitesse étant estimée ici comme la quantité de
glucose.
74
 Pérée au cours de la phase stationnaire (Didier ; 1997).

12.3. Etude de la croissance des microorganismes par turbidimétrie
12.3.1. Protocole
- Passer l’ose à la flamme et ouvrir les boites contenant la colonie à prélever à proximité de la
flamme.
- Laisser refroidir, l’ensemencer ou l’appliquer à l’intérieur de couvercle pour le refroidir plus
vite puis prélever la colonie désirée. Refermer la boite, puis prendre le flacon contenant le
milieu de culture liquide préalablement stérilisée.
- Enlever le bouchon, passer le goulot à la flamme. Déposer la colonie dans le liquide en
imprimant un mouvement de rotation à l’anse entre les doigts.
- Repasser le goulot à la flamme et mettre un bouchon stérile.
- Agiter le flacon sur un vortex pour dissocier la colonie et mettre à incuber.
12.3.2. Application suivi de la croissance par turbidimétrie
Lorsqu’une population des microorganismes se développe en milieu liquide, le trouble du
milieu est proportionnel à la concentration en cellules, un spectrophotomètre permet de mesurer
l’absorption de lumière par suspension de cellules. Après avoir construit une courbe
d’étalonnage donnant l’absorbance en fonction de la concentration en cellules. Avec une
longueur d’onde de 640 nm (Didier ; 1997).
12.3.3. Etalonnage
- Faire une suspension de levures (1 g dans 100 ml du milieu qui sera utilisé pour la
croissance des levures) et réaliser une numération sur lame pour connaitre la concentration
exacte.
- Faire une série de dilutions (1/2, 1/4,1/8, 1/10, 1/20) avec le milieu de culture dans des cuves
standard.
- Mesure de l’absorbance de chacune de dilutions avec spectrophotomètre sans oublier
d’agiter la cuve avant chaque mesure.
12.3.4. Suivi de la croissance
A intervalles réguliers, toutes les deux ou les trois heures, faire un prélèvement de 3 ml après
avoir soigneusement agité le flacon de mesure de culture. Mesurer l’absorbance de chaque
échantillon et déterminer la concentration en cellules graphiquement à partir de droite
d’étalonnage pour chaque prélèvement. Construire la courbe exprimant la concentration en
cellules en fonction du tems.
75
13. Caractérisation biotechnologique

13.1. Fermentation alcoolique chez la levure (méthode de mesure et caractérisation des
produits formés (CO2 et l’éthanol)).
La fermentation alcoolique se caractérise par l’assimilation du glucose et par le rejet les
produits de fermentation (dioxyde de carbone et d’éthanol). Cette réaction se déroule en milieu
anaérobie (sans O2) :
C6H12O6 2CO2 + 2C5H5OH + (énergie)
On parle d’oxydation incomplète de la matière organique (glucose).

*Remarque
La durée de la fermentation est estimée à une température de 25°C. Elle pourra être plus
longue ou plus court si la température de fermentation est plus basse ou plus élevée.
13.2. Matériel biologique
 Peser 1 g de chaque souche levurienne sélectionnée après formation du tapis cellulaire sur la
gélose dans les boites pétries.
 Dissoudre les levures dans un volume de 20 ml d’eau distillée.
13.3. Préparation d’une solution glucosée à 20%
 Peser précisément 20 g de glucose anhydre.
 Ajouter le glucose à 80 ml d’eau distillée dans un ballon jaugé de 100 ml.
 Chauffer la solution sur la plaque chauffante jusqu’à dissolution complète du glucose.
 Laisser refroidir à la température ambiante.
 Compléter le volume à 100 ml avec de l’eau distillée.
 Transférer la solution dans un récipient de plus grand volume.
 Chauffer sur plaque chauffante jusqu’à ébullition.
 Laisser bouillir quelques minutes puis refroidir à la température ambiante.
76
13.4. Méthode
13.4.1. Préparation du montage
Le montage à été effectué selon le schéma suivant :
Figure n°35 : Dispositif de mesure du CO2 produit permettant la collecte du gaz (Pol,
1996).
Etape 1 : Remplir le cristallisoir avec de l’eau à environ la moitie de sa capacité.
Etape 2 : Remplir complètement l’éprouvette de 250 ml avec de l’eau et le boucher

hermétiquement avec la paume de la main.
Etape 3 : Renverser l’éprouvette en immergeant son ouverture dans le cristallisoir, puis retirer
votre main et fixer l’éprouvette à la pince.
L’éprouvette devrait être entièrement remplie d’eau. Si de l’air est introduit, recommencer les
étapes 2 et 3. Vous pouvez négliger une petite bulle d’air occupant un volume de moins de 1 ml.
Etape 4 : Raccorder le tube flexible au connecteur inséré dans le bouchon troué en bois.
Etape 5 : Introduire l’autre extrémité du tube flexible dans l’éprouvette remplie d’eau.
*Remarque
L’extrémité du tube devrait être bien entrée dans l’éprouvette pour éviter qu’elle n’en ressorte
pendant l’expérience, mais sans être trop haute, de façon à pouvoir bine observer les bulles de
gaz qui s’en échapperont.
77
 Addition de glucose et de l’inoculum

Etape 6 : Mettre en suspension 1 g de levures dans 20 ml d’eau distillée dans le ballon en
verre.
Etape 7 : Mettre le ballon sur un agitateur réglé à 30°C.
Etape 8 : Verser 0,8 g de glucose dans le ballon et agiter jusqu’à dissolution complète de
sucre.
Etape 9 : Boucher hermétiquement le ballon avec le bouchon troué en bois, pour que le gaz
produit par fermentation puisse s’échapper à travers le tube flexible et être recueilli dans
l’éprouvette.
Etape 10 : Placer l’ampoule à décanter dans le 2ème trou du bouchon et laisser le robinet
ouvert pendant 15 min.
Etape 11 : Dés que les 15 min sont achevées, fermer le robinet de l’ampoule à décanter.
Etape 12 : Durant toute la fermentation, agiter périodiquement la culture en imprimant un
mouvement rotatif à l’ampoule à décanter et observer comment le gaz produit s’accumule
Lorsque le volume de gaz dans l’éprouvette restera inchangé pendant au moins 5 minutes,
malgré les agitations périodiques, vous saurez que la fermentation est terminée.
 Démontage, mesure et observations
Etape 13 : Lorsque la production de gaz cesse, retirer le tube de l’éprouvette et noter le
volume total de gaz qui s’y accumulé tout au long de la fermentation en faisant notamment
attention à la lecture des graduations sur l’éprouvette, car elle est inversée.
Etape 14 : Calculs
 Détermination de la masse d’éthanol produite
Dans les conditions normales de température et de pression qui régnaient lors de l’expérience,
1 mole de gaz occupe un volume de 22,4 litres, soit 22 400 ml. Connaissant le volume de gaz
produit par la fermentation, calculez le nombre de mole de gaz qui ont été produites.
Selon l’équation suivante : C6H12O6 2CH3CH2OH+ 2CO2, la fermentation

alcoolique génère autant de moles de gaz que de moles d’éthanol. On en déduit donc que la
fermentation produit : mole d’éthanol.
78
Le même nombre de mole.

Sachant qu’une mole d’éthanol à une masse de 42 g, la masse d’éthanol produite serait égale
à:
’Éthanol
14. Identification moléculaire
Toutes les méthodes moléculaires débutent par l’extraction de l’ADN, cette étape est
essentielle car la quantité de l’ADN microbien récupéré conditionne les deux étapes qui
constituent la suite de l’analyse
1ère
Extraction d’ADN
Étape
2ème Vérification qualitative

et quantitative de
Étape l’ADN extrait
Electrophorèse
3ème
Amplification de
Étape l’ADN cible
79
4ème
Digestion de l’ADN
Étape cible
5ème
Différentiation des
Étape produits PCR- RFLP
Figure n°36 : Schéma récapitulatif de notre étude moléculaire à partir des souches isolées.
14.1. Extraction d’ADN
L’extraction des acides nucléique est la première étape dans la plupart des études de biologie
moléculaire. L’objectif des méthode d’extraction des acides nucléiques dans le cas présent est
d’obtenir des acides nucléique non fragmentées tirés des souches levurienne dans le cas des
cultures liquides afin de pouvoir mener une analyse précise en utilisant la réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) (Lipp, et al ; 2001).. La quantité des acides nucléique compte
parmi les facteurs les plus critiques pour l’analyse PCR.
14.2. Méthode (protocole d’extraction de l’ADN Génomique des levures (selon l’IFV de
Nantes)
 Inoculer une quantité des souches colonies isolées des boites à partir de la biomasse présente à
la surface de la gélose YPG gélosé dans un volume de 1,5 ml de bouillon (YPG +
chloramphénicol).
 Incuber à 25°C pendant 24 h.
 Centrifuger 10 minutes à 13 000 rpm.
 Récupérer le culot et éliminer le surnageant.
 Mélanger le culot obtenu avec 660 µl de mélange 50 TE/SDS/1 (tampon de lyse).
 Vortexer.
 Incuber à 65°C/5 min.
 Ajouter 340 µl d’acétate de potassium pour chaque microtube, (bien mélanger en inversant le
microtube).
80
 Mettre au réfrigérateur (arrêté la réaction : acétate de potassium- tampon de lyse) jusqu’à ce

que la suspension devienne semi- solide (30 minutes).
 Centrifugation 10 minutes à 13 000 rpm.
 Prendre 750 µl de surnageant et mélanger avec 750µl d’isopropanol.
 Centrifuger à 13 000 rpm / 10 minutes.
 Eliminer le surnageant et rincer délicatement le culot d’ADN avec 120 µl de l’éthanol 95%.
 Suspendre le culot dans 300 µl de TE 1 X et placer 5 minutes à 65°C.
 Conserver au réfrigérateur (4°C).
14.3. Vérification qualitative et quantitative de l’ADN extrait

Le contrôle qualitatif et quantitatif des ADN extraits est réalisé avant chaque utilisation par
plusieurs méthodes tel que :
La qualité et la quantité des ADN extraits est contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose à
2% (migration 30 minutes à 130 Volts). (Filofteia, 2010).
13.3. Amplification de l’ADN par la PCR
Le principe de la PCR repose sur la variation des températures afin d’amplifier l’ADN durant
les cycles, après chaque cycle le nombre de copies de départ est doublé.
L’ADN extrait est mis en suspension dans un mélange réactionnel et transférer vers
l’amplification (les étapes sont détaillées dans le tableau 03 :
81
Tableau (04) : programme PCR pour l’identification des levures
Amorces Etape 1 Etape 5 Etape 6

utilisées Dénaturation initial Cycle d’amplification Elongation refroidissement
finale
Nombre
De cycle Temps T°C Temps T°C Temps T°C
Temps T°C
Etape2
Dénaturation 90°C
ITSI 30 Sec
5
Et Etape 3
minutes 95°C 35 10 min 72°C 20H 4°C
ITS2 Hybridation 50°C
30 Sec
Etape 4
Elongation 72°C
1 min
14.4.1. PCR-ITS-RFLP
ITS
ITS 1 ITS 3
18 S 26 S 5,8 S
Figure n°37 : organisation des gènes codant les ARN ribosomiques.
14.4.2. Amplification de la région ITS
Préparation du mix ITS pour 30 échantillons :
H2o destillé.............................................................................................................1120µl
Tampon 10 X..............................................................................................................180µl
DNTP…………………………………………………………………………………70µl
IST 1………………………………………………………………………………..12, 8µl
82
ITS 4…………………………………………………………………….………......12, 8µl
mgCl2 …......................................................................................................................100µl
DMSO……………………………………………………………………….………....3%
Taq AND polymerase….................................................................................................24µl
AND amplifié……………........................…………………………………………….3µ
D’après les constituent cites ci-dessus, la PCR-ITS nécessite deux amorces dont les séquences
sont les suivantes selon Polomska et al. 2007 :
-ITS 1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)
-ITR 4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’).
 Digestion enzymatique
Dans le but d’identifier les différentes espèces de levures. Les produits PCR-ITS sont traités
par les enzymes de restriction qui reconnaissent des séquences d’ADN spécifiques ou des motifs
(le site de restriction). (Renouf et al., 2006). Deux enzymes ont été utilisées dans cette étude
Hinf1 et Taq1.
La digestion enzymatique consiste à couper un double brin d’ADN en un point précis.
On parle d’endonucléases car elle coupe à l’intérieur au lieu de dégrader l’ADN à partir des
extrémités libre (Chantal ; 1996). L’emploi de 3 enzymes de restriction (HaeIII, Taq 1 et Hinf
I) sur les produits d’amplification de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) a permis d’obtenir les
profils RFLP selon le schéma.
14.4.3. Préparation du gel d’agarose 1,5%
L’électrophorèse a été effectuée sur gel d’agarose à 1,5%, qui est préparé de 3g de resorphor
plus agar sous une agitation sur une plaque chauffante jusqu’à ce que sa couleur devient
transparente. L’agarose est dissout dans du TBE 1X (TBE 10X DILU2 AU 1/10 ; Tris 107,8g /L,
acide borique 55g /l et 7,44g/l d’EDTA) (Perron, 2004).
Dés le déclenchement de l’ébullition, l’agitation est arrêtée. 10µl du bromure d’éthidium est
ajouté à l’agarose juste avant sa solidification afin de visualiser l’ADN sur un rayonnement ultra-
violet (256nm).
83
14.4.4. Migration de l’ADN

14.4.4.1. Principe de la migration
L’ADN est déposé sur un gel d’agarose en présence d’un marqueur qui devient fluorescent
lorsqu’il s’intercale dans l’ADN. L’ADN chargé négativement est attiré vers l’électrode +les
mailles du gel d’agarose permettent de séparer les molécules en fonction de leurs tailles
(Lionnet et al, 2005). Plus le réseau est moins dense, mieux les molécules de petites tailles
seront séparées (Ausubel.et al., 1989).
14.4.4.2. Déroulement de la migration
La migration se déroule comme suit :
Après l’amplification de l’ADN extrait, il est additionné du bleu de bromophénol. Ensuit les
échantillons ont été mis dans les puits du gel solide (précédemment préparé). A cette étape, le gel
est placé dans la cuve à électrophorèse contenant la solution de TBE.
En outre, l’utilisation d’un standard interne (marqueur 100pb) dans chaque échantillon permet
la comparaison d’échantillon issue de migrations différentes (Janvier, 2007).
Un voltage de 100volt est appliqué durant 55min jusqu’à ce que les bandes soient bien
séparées les unes des autres. Les résultats sont observés sous l’UV.
*Remarque
1. pour la manipulation de l’électrophorèse avec du BET :
Une haute d’aspiration est obligatoire.
Pendant la manipulation le port des gants spéciaux est obligatoire avec accès interdit à toute
personne étrangère non protégée.
2. pour la préparation du gel de migration et lors de l’électrophorèse, la manipulation sous hôte,

aspirante est très recommandée.
84
Partie II Résultats et Discussions
Les levures isoles en septembre 2016 a partir de cépage de raisin de la variété Cinsault
implanté dans les plaines de Abdelmalek Ramdane Ont été purifié par repiquages
successifs. Cela a permis d’obtenir une collection de 5 souches de levures désignées comme
suit :
- Ct (1j) Cinsault 19’
- Ct (2j) Cinsault11’
- Ct (3j) Cinsault 25
- Ct (4j) Cinsault 31
- Ct (5j) Cinsault C
1. Etude effectuées sur les souches isolées du cépage Cinsault
1.1. étude macroscopique
L’étude macroscopique effectuée sur les colonies de souches préalablement isolées nous a
permis de faire une présélection basée essentiellement sur leur caractéristiques
morphologiques telles que l’aspect, la forme et la couleur, et aux quelles nous avons rajouté
l’odeur, un paramètre aussi important dans la pré-identification des levures (tableau N°04).
1.2.Etude microscopique
L’observation au microscopique des lames effectuée sur les colonies des souches nous à
permis de définir les formes : Sphérique, Ovoïdes, Allongées, Cylindriques, et le mode de
reproduction : Monopolaire, Bipolaires par bourgeonnement.
85
Tableau n°05 : observation macroscopique des souches isolées de Cinsault
Souche Forme Aspect Couleur Odeur Photos
Ct (1j)
Cinsault arrondie convexe beige Levure
19’
Ct (2j) arrondie Convexe rougeâtre Levure de

Cinsault boulangerie
11’
Ct (3j) Levure de
Cinsault ovoïde lisse rougeâtre boulangerie
25 intense
Ct (4j) Levure de
Cinsault ovoïde convexe blanchâtre boulangerie
31 intense
Ct (5j)
Cinsault ovoïde convexe blanchâtre Alcool
C
86
2. Etude des caractéristiques morphologiques et physiologiques des souches

isolées de cépage de cinsault
2.1. La souche 19’ AMR
Les testes effectués sue cette souche peuvent être résumés dans le tableau suivant :
Tableau n°06 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche19’AMR
Forme végétative Apicule
Mode de reproduction Bipolaire

Caractères morphologiques
Filamentisation -
Sporulation -
Glucose +
Fructose +
Test biochimique Saccharose -
Lactose -
La souche 19’ à un aspect apiculé, ne forme pas de spores après le test de sporulation mais
elle est apte à bourgeonner.
Elle a la capacité de fermenter le glucose et le fructose, par contre, elle ne fermente ni le

saccharose ni le lactose.
(Sans coloration) (Avec coloration)
Figure n °38 : photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la souche19’

AMR
87
2.2. La souche11’ AMR
Tableau n°07: caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche11’AMR
Cylindrique
Forme végétative
Monopolaire
Mode de reproduction
Pseudomycélium
Caractères morphologiques Filamentisation
_
Sporulation
+
Glucose
+
Fructose
_
Test biochimique Saccharose
_
Lactose
La souche 11’ AMR est se forme cylindrique, apte à bourgeonner et possède un pseudo
mycélium.
Elle est capable de fermenter le glucose et le fructose, contrairement au saccharose et au

lactose.
Figure n °39 : photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la souche11’

AMR.
88
2.3. La souche 25 AMR
Tableau n°08 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche 25 AMR
Cylindrique
Forme végétative
Monopolaire
Caractères Mode de reproduction
morphologiques Pseudo mycélium
Filamentisation
_
Sporulation
Glucose +
Test biochimique Fructose +

_
Saccharose
_
Lactose
La souche 25 AMR a une forme cylindrique, possède un mode de bourgeonnement

monopolaire, elle est également dotée d’un pseudo mycélium.
Elle a la capacité de fermenter le glucose et le fructose mais pas le saccharose ni le lactose.
Sans coloration avec coloration
Figure n °40: photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la souche 25

AMR.
89
2.4. La souche 31 AMR
Tableau n°09 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche 31 AMR
Ovoïde
Forme végétative
bipolaire
_
Caractères morphologiques Filamentisation
_
Sporulation
+
Glucose
+
Fructose
_
Test biochimique Saccharose
_
Lactose
La souche 31 AMR est caractérisée par une forme Ovoïde. Les résultats des tests de
filamentisation et de sporulation ce sont avérés négatifs.
Cette souche peut fermenter le glucose et le fructose, alors qu’elle ne fermente ni le

saccharose ni le lactose.
Figure n °41 : photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la souche 31

AMR
90
2.5. La souche C AMR
Tableau n°10: caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche C AMR
Sphérique
Forme végétative
_
Caractères morphologiques _
Filamentisation
_
Sporulation
+
Glucose
+
Test biochimique Fructose
_
Saccharose
_
Lactose
La souche C AMR est caractérisée par une forme sphérique. les tests de filamentisation et
de sporulation on donné des résultats négatifs.
Contrairement au saccharose et au lactose, cette souche n’a fermenté que le glucose et le

fructose.
Figure n °42 : photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la souche C

AMR
91
3.Etude des caractères biochimiques des souches
3.1. Test de la fermentation des sucres
3.1.1. Glucose
Figure n°43 : Observation des milieux ensemencés par les souches après l’incubation à 30°C
pendant 72 heures
3.1.2. Saccharose
Figure n°44 : Observation des milieux ensemencés par les souches après l’incubation à 30 °C
Pendant 72 heures.
92
3.1.3. Fructose
Figure n° 45: Observation des milieux ensemencés par les souches après l’incubation à 30°C
pendant 72 heures.
3.1.4. Sucrose
Figure n°46 : Observation des milieux ensemencés par les souches après l’incubation à
30°C pendant 72 heures.
3.2. Test d’assimilation des composées azotées
3.2.1. Assimilation de l’urée
Figure n°47 : Observation de milieu d’assimilation de l’urée ensemencé par les souches après
l’incubation à 30°C pendant 48 heures.
93
3.2.2. Assimilation de nitrate
Figure n°48 : Observation de milieux d’assimilation de nitrate ensemencé par les souches
après l’incubation à 37°C pendant 48 heures
Tableau n° 11: Résultats d’études des caractères biochimiques des souches isolées du
Cinsault
La souche 19’ 11’ 25 31 C

Le sucre
Glucose + + + + +
Fructose + + + + +
Lactose + + + + +
Saccharose + + + + +
Sucrose + + + + +
L’urée + + + + +
Nitrate + + + + +
En observant les résultats de fermentation des sucres obtenus, on remarque que les 5
souches isolées à partir de cépage Cinsault sont capables de fermenter tous les sucres testés
(Glucose, Fructose, Saccharose, Sucrose et Lactose). Cette fermentation est observée par un
dégagement de gaz après incubation des souches levuriennes.
Concernant le test d’assimilation des composées azotées, les 5 souches levuriennes

assimilent les deux composés (nitrate et urée). Et cela veut dir qu’elle n’appartient pas a la
catégorie se Saccharomycetaceae.
94
4. Etude des Caractères biotechnologique

4.1. Les résultats du test de la fermentation alcoolique
Les résultats de testes biotechnologique sur les cépages cinsault sont résumés dans le
tableau suivant :
Tableau n°12: Les résultats du test de la fermentation alcoolique des souches isolées
du Cinsault.
Le test de fermentation alcoolique va nous permettre d’observer un pouvoir de

fermentation remarquable chez la souche C en le comparant avec les autres souches.
95
Tableau n°13 : Les résultats de l’activité enzymatique de l’invertase des souches

isolées du Cinsault.
En se basant de la courbe d’étalonnage nous avons pu déterminer la concentration de sucre

inverti (glucoses et fructose) libérer lors de la réaction enzymatique par les 5 souches de
levures (Tableau n°13).
Chez la souche C on observe que le nombre de micromoles de saccharose hydrolysé par

minute est très important, par rapport aux autres souches. Il est de l’ordre de 1536 µmol/l/min.
donc on peut conclure qu’il existe une seule enzyme qui peut provoquer la dégradation de
saccharose en glucose et fructose (invertase).
L’invertase est produite par une large variété des microorganismes parmi lesquels, on peut
citer les levures appartenant aux genres (candida, Saccaromyces....), pour la dégradation de
saccharose en glucose et fructose (Carlson. M et Botstein, 1982, Trumbly, 1986 ;
Costagloli et al., 1985).
96
5.Etude moléculaire
5.1. Résultats de PCR-ITS-RFLP des isolats de levures isolés à partir de cépage
Cinsault
Les espèces de levures isolées à partir du raisin Cinsault
05 isolats de levures ont été identifiés comme appartenant à 2 genres et 2 espèces) différents :
Pichia fermetans (04 isolats) et Torulaspora delbrueckii (01 isolat) (Tableau n°14).
Tableau n °14 : Fréquences des espèces de levures isolées à partir du cépage Cinsault.
L’examen des résultats obtenus indique que 4 isolats de levures sélectionnées (Cn1,
Cn2, Cn3, Cn4) appartiennent à l’espèce Pichia fermentans (tableau 14), selon le guide de
détermination de l’IFV (2012). Le profil moléculaire de l’isolat (Cn5), indique qu’il ressemble
à l’espèce Torulaspora delbrueckii, selon le guide de détermination de l’IFV (2012).
Tableau n°15 : Taille en paires de bases des produits de PCR et des fragments de restriction
obtenus avec deux endonucléases différentes (Hinf I et HaeII).
Cn5
97
L’étude macroscopique de cet isolat renferme des colonies rougeâtres, de petite

taille, lisse. Et parallèlement, l’examen microscopique indique que cette levure est de forme
ovale, (simple pseudomycélium peut être formé).
L’amplification de la région cible (ITS1 – ADNr 5,8 S – ITS2) est bien menée,
malheureusement la restriction enzymatique est insuffisante avec une seule enzyme (Hinf).
Le catalogue officiel de comparaison de l’IFV exige au minimum deux enzymes, c’est

pour cela que la confirmation d’appartenance de cet isolat a telle ou telle espèce reste
ambigüe.
Par ailleurs, la combinaison des deux résultats (études morphologiques et moléculaires)

indique que l’isolat (Cn1, Cn2, Cn3, Cn4) Appartiendrait approximativement l’espèce suivante
Pichia fermentas et l’isolat (Cn5) appartien a l’espece Torulaspora delbrueckii.
Figure n°49: Visualisation de la région (ITS-I-ADNr5, 8S-ITSII) amplifiée chez les 05

isolats de Cinsault.
Cn5
Figure n°50 : Visualisation de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) digérée par la Hinf  chez
les 05 isolats de Cinsault.
98
Cn5
Figure n°51 : Visualisation de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) digérée par la HaeII chez
les 05 isolats de Cinsault.
La discussion
Selon les caractères macroscopique et microscopique les levures sont caractériser par des
forme « Cylindrique, sphérique, ovoïde ».
L’isolement des levures est effectué a partir du jus de raisin fermenté, une goutte du jus a
été étalée sur les boites de pétrie contenants YPG.
Apres 24 heures d’incubation a 25° C, des colonies de levures ont été purifiées puis
identifiées.
Apres l’incubation, la couleur blanche est observer chez toutes les souches, la forme des
colonies ce varie d’une forme cylindrique sphérique et ovoïde un mode de reproduction
monopolaire et bipolaire est observé chez les levures.
La présence de mycélium pseudomycélium est détectée chez les souches isolées.
99
Conclusion
Les levures sont unicellulaires (certaines sont multicellulaires) comme les micro-organismes
eucaryotes appartenant aux champignons royaume. La taille d’une levure peut varier
considérablement selon les espèces, mesurant généralement 3-4 μm de diamètre. La plupart des
levures se reproduisent de façon asexuée par un processus de division asymétrique appelé
bourgeonnement. D'abord, il produit une petite protubérance sur la cellule parente qui grossit d’une
très grande taille et forme un bourgeon. Le noyau de la cellule-mère se divise en un noyau fils et
migre dans la cellule fille. Le bourgeon se détache du corps de la mère en formant un étranglement
à la base.
Le bourgeonnement se répète pour former une chaîne de cellules de bourgeon. La cellule fille
produite pendant le processus de bourgeonnement est généralement plus petite que la cellule mère..
Grâce à ces travaux personnels encadrés, une approche génétique a été développée pour un
essai d’identification des souches isolées a partir des baies de raisin des cépages de la région
d’abdelmalek remdane dans la wilaya de Mostaganem.
Une étude macroscopique et microscopique des souches de levures isolées nous a facilité a les
sélectionnées suivant leurs critères morphologiques.
L’identification des levures ce fait avec la technique (PCR-RFLP) avec l’utilisation des enzymes
de restrictions (Hae III, Hha I ou Cfo, Alu I, etc.) est indispensable avec un séquençage approprié
pour diversifier l’intra spécifique.
Au début de notre travail, on a menée avec réussite une méthode d’isolement et de conservation
des levures extrait du raisin.
A fin de détecter les microorganismes pour étudier leur évolution des méthodes de biologie
moléculaires plus rapides et efficace ce fait et qui cible directement les molécules d’ADN.
Suite a ces méthodes, d’autres méthodes a été faite telque les méthodes biochimiques ;
fermentation des sucres, et biotechnologiques ; la fermentation des glucides et la production du gaz
carbonique et l’alcool qui nous ont facilité la sélection des souches désirées, les plus productrice et
qui ont le plus grand rendement parmi les souches étudier.
Plusieurs technique d’analyse très développé microbiologiques peuvent être faite pour
l’identification des levures de raisin.
Conclusion
C’est dernière technique peuvent être automatisé a fin de traiter un grand nombre d’échantillons.
Cependant, la mycologie des levures reste un domaine ou’ de grandes inconnues subsistent, à cause
de la diversité de la population levurienne, tant au niveau des processus biologiques que des
microorganismes impliqués. Aujourd’hui, le couplage systématique des méthodes de microbiologie
moléculaire à celles du génie des procédés procédés permet toute fois de milieux comprendre et
optimiser les procédés de traitement des levures.
Annexes
Les produits utilisée durant le travail
Les milieux de cultures utilisés
 Préparation de la gélose YPG ( Yeast Peptone Glucose)

 Eau distillée 1000ml
 Glucose 20g
 Agar 20g
 Peptone 10g
 Extrait de levure 10g
PH= 6.8 à 25C° pendant 20min
 Composition de milieu Fowell
 Eau distillée 1000ml
 Agar 20g
 Acétate de sodium trihydraté 5g
 Composition de milieu WICKERHAM
 Eau distillée 300 ml
 Peptone pancréatique 3g
 Extrait de levure 3g
 Rouge de phénol 0,015g
 Gentamicine 80 mg (Antibiotique) 0,06 g
Remarque : On ajoute les différents sucres à une concentration de 6% dans chaque

milieu. On les met dans tubes + la cloche de durham.
 Les réactifs utilisés pour l’identification moléculaire
Gel d’agarose
 Agarose + résorphor 1,5 g

 TBE 100 ml
 BET 10µl
Annexes
 Réactifs utilisés pour l’extraction d’ADN
 Préparation du 50 TE (tampon pour le ECP et la préparation du mélange 50
TE/SDS 10% à PH= 7,5
 EDTA 3,73 g
 Tris 3,03 g
 Eau bi-distillée 1000 ml
 Préparation du SDS
 SDS à 10% 2g
 Préparation du mélange 50 TE/SDS 10% (tampon pour l’ extraction d’ADN)
 Tampon 50 TE
 10% solution SDS
 Préparation de l’acétate de potassium 5 moi par litre (tampon pour l’extraction
d’ADN)
 Acétate 98,14 g
 Réactifs utilisés pour l’électrophorèse
 Préparation du TBE 10 × à pH 8 (tampon pour préparer la TBE 1 ×)
TBE 1× = TBE 10× dilué au 1/102
- Tris 107,80 g
- Borate 55 g
- EDTA 7,44 g
- Eau bi-distillée 1000 ml
 Composition du marqueur 100 pb
Dans le micro tube contenant 100 pb DNA Ladder, ajouter
- 100 µl du colorant bleu de bromophénole
- 900 µl de TE/ 1X
Annexes
 Les équipements et matériels pour l’expérimentation biotechnologique
*Pour le dosage de CO2 et de l’éthanol
 Equipements
- Agitateur
- Balance de précision
- Statif
- Pince à burette
 Matériels
- Cristallisoir en verre
- Ballon en verre
- Ampoule à décanter
- Bouchon troué en bois
- Tube flexible
- Contenant pour peser
*Pour l’étude de l’activité enzymatique
- Eprouvette de 50 ml
- Pipette graduées
-Support de tubes essai
-Spectromètre
-Solution de Glucose 2,5 mM (Mllimole)
- Solution de fructose 2,5 m M
- Solution de DNS (Acide 3,5 – Dinitrosalicylique ).
- Préparation de réactif à l’acide 3,5 Dinitrosalicylique ( DNS).
- Dissoudre 1 g de DNS dans 20 ml de soude (NAOH) 2 N
- Ajouter doucement une solution de 30 g de tartrate double de NaK dissout dans 50 ml
d’eau distillée
- Compléter à 100 ml avec de l’eau distillée et agiter jusqu’à obtention d’une solution
homogène de couleur orange – rouge ( Si nécessaire chauffer légèrement le mélange) .
Le réactif DNS doit être conservé dans un flacon bien fermé et à l’arbi de la lumière.
 Réactifs pour l’identification des levures ( Test de Sporulation).
 Préparation de vert de malachite
- Dissoudre 1g de phénol dans 100 ml D’eau distillée
Annexes
- Dissoudre de 1g de vert de malachite dans la solution de phénol.
 Préparation de safranine
- Dissoudre 500 mg de safranine dans 100 ml d’eau distillée.
Résumé
Le raisin défini comme le fruit de la vigne, le plus cultivé dans le monde. Il est considéré
comme un habitat principal d’un grand nombre des espèces levuriennes. Donc notre étude
visait à isoler, purifier et caractérise des espèces de levures issues du cépage Cinsault récolté
de la Ben Abdelmalek Ramdane wilaya de Mostaganem.
Nous avons effectué des tests microscopiques et macroscopiques, ainsi que d’autres tests de
sporulation, aptitude à la filamentisation, tests biochimiques et biotechnologiques, qui ont
montré la présence de 5 souches levuriennes. Ces 5 souches levuriennes sont caractérisées par
des performances importantes de production de CO2 et d’éthanol, ainsi que la présence de
l’enzyme l’invertase.
Un protocole d’extraction d’ADN de même qu’une PCR-ITS-RFLP a été mise au poit pour la
région ITS 1-ADNr 5,8S- ITS2. Elle est assez sensible pour détecter la biodiversité des
différentes espèces de levures isolées.
Mots clés : Levures indigènes, Raisin, Cinsault, Régions de Abdelmalek Ramdane

(Mostaganem), ITS- PCR- RFLP.
Abstract
Defined as the fruit of the vine, the most widely grown grapes in the world. It is considered to
be a core of a large number of levuriennes species habitats. So our study aimed to isolate,
purify and characterize species of yeasts from the grape Cinsault harvested of the commune
Ben Abdelmalak Ramdane wilaya of Mostaganem.
We performed microscopic and macroscopic, tests and other tests of sporulation , ability to
the filamentisation, biochemical and biotechnological testing, which showed the presence of
5steains levuriennes. These 5 strains of levuriennes are characterized by significant
perforance of CO2 and ethanol production, as well as the enzyme invertase.
A DNA restriction en protocol as well as PCR- ITS-RFLP was developed for the rDNA ITS
1- 5,8S- ITS 2 region. It is sensitive enough to detect the biodiversity of different species of
yeasts isolated.
Keywords: indigenous yeasts, grape, Cinsault, Regions and Abdelmalek Ramdane

(Mostaganem) , ITS- PCR- RFLP.

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Université Abdelhamid Ibn

LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE ET BIOLOGIE VEGETALE

Mémoire de fin d’études

Djelti nadjet et Lassal samira

Président Mr. BENAKRICHE. B Maitre de conférences, U. Mostaganem

Examinateurs Mr .CHADLI. R Maitre de conférences, U. Mostaganem

Nous tenons aussi à présenter nos sincères remerciements

à notre encadreur le Pr .Bekada. pour la confiance qu’il nous a accordée en

acceptant cet encadrement

Pour sa disponibilité tout au long de l’élaboration de ce mémoire, pour son aide,

Nous remercions Pr. Benakrich d’avoir accepté la présidence du jury de la soutenance.

Nous remercions Pr .Chadli qui a accepté d’examiner ce modeste travail.

Nous voudrons remercier aussi les techniciens du laboratoire de microbiologie Djillali,

Avous tous, un grand Merci

Table des matières

Liste des figures

Liste des tableaux

Liste des abréviations

Partie: Etude bibliographique

Chapitre I : Raisins et levures

I.1. Raisin et vignoble...............................................................................................3

Partie : Etude bibliographique

CHAPITRE II : Etude fondamental des levures

CHAPITRE III : Technique d’étude des levures

III.I .Isolement des levures...........................................................................42

Partie II : Etude Expérimental

Partie II : Résultats et discussion

I. 1. Etudes des Caractéristiques culturaux des souches isolées du cépage cinsault............86

A celui qui m’a toujours encouragé et soutenu durant toutes mes

A ma chère et présieuse sœur (Djelti Rommaissa) et frère (Réda).

A mes camarades, Samira, Derar Fatima, Bousoir Imad

Et à mon encadreur Pr.Bekada merci pour votre disponibilité et vos

Ainsi qu’à toute la promotion de GMGM 2016/2017.

Figure n°4- 5: Symptômes de L’oïdium surfeuil. 12

Figure n° 19 : Schéma de la reproduction asexuée par scission d’une levure 38

Figure n° 20 : Filamentisation des levures 43

Figure n °40: photo montrant l’aspect microscopique, bourgeonnement de la 89

Figure n°47 : Observation de milieu d’assimilation de l’urée 93

Figure n°48 : Observation de milieux d’assimilation de nitrate 94

Figure n°49: Visualisation de la région (ITS-I-ADNr5, 8S-ITSII) 98

Figure n°50 : Visualisation de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) 98

Figure n°51 : Visualisation de la région (ITSI-ADNr5, 8S-ITSII) 99

Tableau n°05 : observation macroscopique des souches isolées de Cinsault 86

Tableau n°06 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la 87

Tableau n°07: caractéristiques morphologiques et physiologiques de la 88

Tableau n°08 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche 89

Tableau n°09 : caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche 90

Tableau n° 10 : Résultats d’études des caractères biochimiques des souches 91

Tableau n°11: Les résultats du test de la fermentation alcoolique des 94

Tableau n°12 : Les résultats de l’activité enzymatique de l’invertase des 95

Tableau n °13 : Fréquences des espèces de levures isolées à partir du 96

La deuxième partie expérimentale est basée sur l’isolement, purification, identification

génome, est utilisée pour évaluée la diversité levuriennes c’est :

d’enzymes de restriction, essentiellement des endonucléases tel que la HinfI, la TaqI

vinaigrerie, fromagerie....) et les nouvelles biotechnologies.

Figure n°1 : Un cep de vigne et ses différents éléments (Cadet, 2005).

3.1. Les maladies virales

3.2. Les maladies à phytoplasmes (jaunisses)