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    Université de Yaoundé I Faculté des Sciences

    University of Yaoundé I Faculty of Sciences

    DEPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE
    Department of Microbiology

    Travaux pratiques de Parasitologie Médicale


    MIB 352

    Dr Kengazong Lucia
    Dr Meyin A Ebong Solange

    Année académique : 2023/2024


    RECOMMANDATIONS PARTICULIÈRES AU LABORATOIRE DE
    MICROBIOLOGIE

    En salle de travaux pratiques (TP), tout étudiant doit :

     Être muni obligatoirement d'une blouse de coton.

     Travailler dans l'ordre et avec précaution, en évitant tout déplacement inutile.

     Respecter rigoureusement les principes de manipulation aseptique enseignés, afin


    d'éviter tout geste dangereux.

     Prévenir aussitôt, en cas d'accident, le responsable de la salle, pour que toute mesure de
    désinfection soit prise immédiatement.

     Vérifier le bon fonctionnement du bec de bunsen, faire attention pendant la


    manipulation aseptique de ne pas enflammer les manches de la blouse ou les cheveux.

     Fermer le robinet de gaz dès que la flamme n'est plus nécessaire.

     S'assurer en fin de séance, avant de quitter sa place que tout le matériel septique
    manipulé n'est pas susceptible de contaminer les personnes chargées de l'entretien.

     Placer les pipettes, étaloirs de verre contaminés, lame sitôt après usage dans les bacs
    renfermant du liquide décontaminant.

     Placer les tubes à essai, tubes à hémolyse contenant ou ayant contenu des produits
    microbiens, convenablement bouchés, dans les paniers métalliques pour y subir une
    destruction à l'autoclave.

     Nettoyer la paillasse avec un décontaminant.

    1
    Objectif des travaux pratiques

    - Faire acquérir aux apprenants les bases du diagnostic d’une infection parasitaire. Il s’agit de la
    mise en évidence des éléments parasitaires responsables des parasitoses digestives d’une part et des
    parasitoses sanguines d’autre part.
    Profil: Etudiants ayant suivi les CM de l’UE MIB 352

    Contenu: Les TP sont consacrés à la recherche de (s) élément (s) parasitaire (s) présent (s) dans les
    produits pathologiques afin d’établir un diagnostic des parasitoses digestives par examen direct et
    les parasitoses sanguines après coloration de May-Grünwald Giemsa (cas du paludisme).

    Mots clés : éléments parasitaires, parasitoses, examens directs, coloration au Giemsa.

    2
    Diagnostic des parasitoses digestives et sanguines

    Introduction :
    Les maladies parasitaires présentent un enjeu majeur en santé publique. C’est le cas par
    exemple du paludisme qui selon l’OMS cause environ 1,5 à 2,7 millions de décès par an dont 1
    décès toutes les 30 secondes. Les parasitoses sont causées par 4 grands groupes de parasites: les
    Protozoaires, les métazoaires dont les Helminthes (Nemathelminthes ou Nématodes (vers
    ronds) et les Plathelminthes (vers plats) dont les Trématodes et Cestodes) et les Arthropodes
    ectoparasites. Les principaux échantillons analysés en parasitologie sont les selles et le sang
    mais aussi d’autres échantillons tels que l’urine, la biopsie de la peau, ponctions (rate,
    ganglions, moelle osseuse…). Le diagnostic des parasitoses est essentiellement basé sur
    l’observation microscopique des différentes préparations.

    I- Diagnostic des parasitoses digestives: Examens de selles (coprologie)


    La coprologie est la recherche des éléments parasitaires dans un échantillon de selles. Cette
    recherche peut se faire en utilisant des techniques directes ou des techniques après
    concentration de l’échantillon de selle dans un petit volume. Il est possible de faire des
    colorations spécifiques en fonctions de la nature de l’élément parasitaire recherché dans la
    selle. Dans le cadre de ce TP nous allons utiliser uniquement les techniques de diagnostic direct
    de la selle.
    NB: L’examen de selles commence par une observation macroscopique de la selle
    (consistance, couleur, sanguinolente, glaireuse…) qui peut renseigner sur la nature de
    l’élément parasitaire susceptible d’être présent dans l’échantillon.
    Matériel
    Produit pathologique (échantillons de selles)
    Lames et lamelles
    Lugol
    Eau physiologique
    Alcool
    Microscope

    1- Examen de selles à l’état frais simple


    L’eau physiologique ayant les mêmes caractéristiques que les liquide corporels, les
    parasites du produit pathologique conservent leur morphologie et leurs mouvements pour une
    meilleure observation. Nous pouvons donc voir les formes végétatives des protozoaires encore
    mobiles.

    3
    Mode opératoire: Déposer une goutte d’eau physiologique
    sur la lame préalablement dégraissée, prélever une petite noisette
    de selle ajouter à la goutte d’eau, homogénéiser et recouvrir
    avec la lamelle puis observer à l’objectif 10 puis 40x.

    2- Etat frais avec lugol


    Le lugol colore les kystes de protozoaires et les rend identifiables à partir des
    constituants intracellulaires (vacuoles, noyau, inclusions : l’amidon mal digéré se colore en
    bleu, la flore iodophile du colon apparait brun) mais il tue les formes végétatives.
    Mode opératoire: Même processus que l’état frais à l’eau physiologique.

    II- Diagnostic des parasitoses sanguines: cas du paludisme


    Le diagnostic du paludisme repose sur la recherche du plasmodium à différents stades du
    cycle de vie: (trophozoites, schizontes ou gametocytes) dans un prélèvement sanguin.
    L’échantillonnage doit se faire soit par prélèvement capillaire au bout du doigt avec confection
    immédiate du frottis et de la goutte épaisse, soit par ponction veineuse avec prélèvement dans
    un tube contenant un anticoagulant (Ex EDTA) et réalisation secondaire des lames d'examen.
    NB: Le sang contenant les anticoagulants risque de se décoller de la lame durant le lavage: il
    faut bien sécher la goutte épaisse avant la coloration.
    Matériel
    Produit pathologique (goutte de sang à prélever)
    Vaccinostyles
    Giemsa (solution à 10 % ou 3%) ;
    un petit récipient ou bécher pour le colorant de Giemsa ;
    du méthanol absolu et sans acétone ;
    une pipette Pasteur munie d’une poire ;
    un petit récipient ou bécher pour le méthanol ;
    un support de coloration ;
    un chronomètre (minuterie) ;
    des gants de soin en latex jetables ;

    Mode opératoire:
    Frottis sanguin: Déposer une petite goutte de sang sur la lame en verre, placer une
    deuxième lame de verre inclinée à 30° en avant de la goutte ramener en arrière, au contact de la
    goutte, tirer la lame en avant de manière à étaler une mince couche de sang et laisser sécher. Il
    doit être effectué avec soin de manière à ne comporter qu'une couche cellulaire.

    4
    Goutte épaisse: Déposer sur une lame de verre dégraissée, une grosse goutte de sang (2
    fois le volume que celle du frottis), en cas de prélèvement capillaire, pour empêcher la
    coagulation, avec le coin d'une autre lame ou la pointe d'un vaccinostyle, étaler régulièrement
    le sang sur une surface de 1cm de diamètre, en tournant régulièrement pendant 2 minutes.
    Retourner la lame et laisser sécher en position horizontale, à température ambiante, à l’abri des
    mouches et des poussières.

    Technique de la coloration au Giemsa


    Pour le frottis, recouvrir la lame d'alcool méthylique pendant 3 minutes, puis de Giemsa
    pendant 20 minutes pour le Giemsa lent (solution de travail à 3 %) ou 10 minutes pour le
    Giemsa rapide (solution de travail à 10 %); rincer à l'eau neutre; Sécher; lire la lame à
    l'immersion (objectif X100).
    Pour la goutte épaisse, laisser sécher la goutte puis recouvrir la lame de Giemsa pendant
    20 minutes pour le Giemsa lent (solution de travail à 3 %) ou 10 minutes pour le Giemsa rapide
    (solution de travail à 10 %); rincer à l'eau neutre; Sécher; lire la lame à l'immersion (objectif
    X100).

    NB: Le frottis permet d’identifier l’espèce mais ne concentre pas les formes parasitaires
    - La goutte épaisse est une technique de concentration utilisable également pour les recherches
    de trypanosomes et microfilaires.
    - La solution de travail (Giemsa) doit être préparée chaque jour à partir de la solution mère
    (annexe 2) le volume requis par lame = 3 ml qu’on multiplie par le nombre de lames à colorer.

    5
    Annexes
    Annexe 1 : Illustrations de quelques œufs de parasites

    Œufs d’oxyures (Enterobius vermicularis) Œuf de trichocéphale (Trichuris trichiura)

    Œufs d’Ascaris lumbricoïdes vus à l’examen Embryophore de Taenia spp. Vu à l’examen


    parasitologique des selles (objectif x40) parasitologique des selles

    6
    Annexe 2: Solution mère de Giemsa

    Annexe 3: Procédure de coloration au Giemsa rapide

    7
    Annexe 4: Procédure de coloration au Giemsa rapide

    Source: Diagnostic Microscopique du Paludisme–Modes Opératoires Normalisés –07A: Coloration au Giemsa


    des étalements de sang à la recherche de Plasmodium

    8
    Annexe 5 : Différents stades de développement du Plasmodium à la microscopie

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