These Nguyen Thien-An 2007 CEA-iBiTec-S

Relations structure - Fonction dans la superfamille des
Cytochromes P450
Thien-An Nguyen
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Thien-An Nguyen. Relations structure - Fonction dans la superfamille des Cytochromes P450. Infor-
matique [cs]. Université Paris-Diderot - Paris VII, 2007. Français. �NNT : �. �tel-00447215�
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Résumé
Les cytochromes P450 (CYP) sont des enzymes responsables de la biotransformation de composés exogènes,
aussi bien dans les phénomènes de détoxication que d’intoxication par formation d’entités réactives. La forme
hépatique humaine la plus abondante (CYP3A4) est responsable du métabolisme de plus de 60 % des
médicaments utilisés actuellement, entraînant de nombreuses interactions médicamenteuses indésirables. La
connaissance des mécanismes moléculaires de fonctionnement de ces CYPs au moyen de modèles prédictifs est
d’un intérêt primordial pour les industriels. L’obtention de ces modèles par modélisation comparative est
toutefois pénalisée par la dispersion en séquences dans cette superfamille.
Une méthode originale de reconstruction des CYPs basée sur l’identification au sein de cette famille des
blocs structuralement conservés (CSB) est proposée ici. Ces CSBs définissent un repliement commun aux CYPs
et sont considérés comme la signature structurale de la superfamille. Les CSBs sont codés en termes
d’informations statistiques (profile) puis alignés sur les séquences de CYP de structure inconnue, par un outil
d’alignement multiple (Caliseq) créé pour produire l’alignement multiple optimal pour les reconstructions par
modélisation comparative. Caliseq sert aussi à détecter des séquences originales de CYP dans une banque ou un
génome.
Le modèle structural obtenu permet de suggérer des mutations pour observer les modifications du
comportement de la protéine vis-à-vis de ses substrats spécifiques. Le cas du CYB2B6 est un exemple concret où
le modèle a suggéré des mutations permettant d’augmenter l’affinité de l’enzyme pour un substrat spécifique
utilisé en chimiothérapie.
Mots clef : Cytochrome P450, Modélisation comparative à bas taux d’identité, Génomique exploratoire à
partir de signature structurale, CYP2B6.
Abstract
Cytochromes P450 (CYP) are monoxygenase enzymes involved in biotransformations of exogenous

compounds in detoxification processes, but also in intoxication by generation of reactive species. CYP3A4, the
most abundant isoform present in human liver, is responsible for the metabolisation of more than 60% of drugs
used in therapy, leading to unwanted drug-drug interactions. The knowledge and understanding of mechanisms
underlying substrate recognition and transformation is of outstanding interest for setting up reliable predictive
tools in pharmaceutical companies. Achievement of CYP models by homology modeling is however limited by
the high diversity of sequences in this superfamily.
An original method based on the identification of Common Structural Blocks (CSB) within the family, is
proposed here to rebuild structural models despite their low sequence identity. CSBs define a common fold of
the CYPs and are used as a structural signature of the superfamily. A multiple alignment tool able to align
successive profiles (calculated in each CSB) on the CYP sequences of unknown structure, has been developed to
make use of the structural information beneath the CSBs, in one hand to give reliable multiple alignments used
in homology modeling, and in the other hand, to search for new CYP sequences in databanks or genomes.
When the structural model is obtained, in silico mutation experiments can be performed to monitor changes
in the behavior of the protein towards its specifics substrates. A successful example is shown through CYP2B6
case, in which mutations suggested by the model led to significant increase of its affinity towards a specific
substrate used in chemotherapy.
Keywords: Cytochrome P450, low identity Homology Modeling, Genomic exploration using structural
signature, CYP2B6.
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE 1
ÉTAT DES CONNAISSANCES 9
1 CYTOCHROMES P450 : POURQUOI UN TEL INTERET ? 11

1.1 A LA DECOUVERTE D’UNE SUPERFAMILLE D’ENZYME… 12
1.2 NOMENCLATURE, CLASSIFICATION ET PHYLOGENIE 23
1.3 OCCURRENCE, DISTRIBUTION ET LOCALISATION 31
1.4 UN REPLIEMENT TRES CONSERVE 36
1.5 PROPRIETES CHIMIQUES DES P450S 52
1.6 AU CENTRE D’UN SYSTEME DE DETOXICATION 58
1.7 CONCLUSION 64
2 LES OUTILS BIOINFORMATIQUES : VERS DE NOUVELLES SOLUTIONS 67
2.1 BREVE PRESENTATION DE LA DISCIPLINE ET OBJECTIFS 68
2.2 LES PROTEINES : DESCRIPTION GEOMETRIQUE DU SQUELETTE PEPTIDIQUE 69
2.3 BANQUES DE SEQUENCES ET DE STRUCTURES : LES DONNEES SOURCES 72
2.4 TRAITEMENT DES DONNEES SOURCES 82
2.5 CONSTRUCTION D’UN MODELE 112
2.6 EXPLOITATION DU MODELE 120
2.7 CONCLUSION 127
NOUVELLES METHODES 129
3 MODELISATION COMPARATIVE ADAPTEE POUR LES SUPERFAMILLES 131

3.1 INTRODUCTION A LA METHODE 132
3.2 RECHERCHE DES ELEMENTS STRUCTURAUX CONSERVES 133
3.3 POSITIONNEMENT DES CSBS SUR LA SEQUENCE CIBLE 140
3.4 CONSTRUCTION DES MODELES DE CYTOCHROME P450 148
3.5 ÉVALUATION, SELECTION ET RAFFINEMENT DES MODELES 152
3.6 CONCLUSION 156
i
4 VOYAGE AU CENTRE DE CALISEQ 159
4.1 PRESENTATION DE L’OUTIL 160
4.2 FONCTIONNEMENT DE CALISEQ 160
4.3 LES DIFFERENTES EVOLUTIONS DE CALISEQ 163
4.4 CONCLUSION 172
RESULTATS 175
5 COMPARAISON DES METHODES 177

5.1 INTRODUCTION 178
5.2 LES CSBS, UNE UTILISATION INNOVANTE ? 179
5.3 CALISEQ ET LES AUTRES METHODES D’ALIGNEMENT 205
5.4 CONSTRUCTION DE MODELES DE P450S, QUELLE METHODE ADOPTER ? 217
5.5 VERS L’OBTENTION D’UNE BANQUE DE P450S 223
5.6 CONCLUSION ET PERSPECTIVES 234
6 DU VIRTUEL AU CONCRET : APPLICATIONS SUR LE CYP2B6 237
6.1 INTRODUCTION 238
6.2 DIFFERENTES APPROCHES EXPLOITEES POUR UN SEUL MODELE FINAL 239
6.3 DOCKING MANUEL ET MUTATIONS IN SILICO 243
6.4 SIMULATION DE MD 247
6.5 CONCLUSION 260
6.6 ARTICLE 261
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 263
7 BILAN ET NOUVELLES IDEES 265
BIBLIOGRAPHIES 271
ANNEXES 289
ANNEXE 1 LE MONDE MERVEILLEUX DES PROTEINES 291

ANNEXE 2 FICHIER, FORMAT ET EXEMPLES 301
ANNEXE 3 CALISEQ : DISSECTION D’UN PROGRAMME 315
ANNEXE 4 MODELLER : STRATEGIE ADAPTEE AUX BLOCS 343
ANNEXE 5 DES ALIGNEMENTS EN VRAC… 349
ii
Abréviations et acronymes
ADN = Acide Désoxyribonucléique

CASP = Critcal Assessment of protein Structure Prediction
CATH = Class Architecture Topology Homology
CPA = Chlorophosphamide
CPI = 4-(4-chlorophenyl)imidazole
CSB = Common Structural Block (fr. block structuralement commun ou conserve)
CYP = Cytochrome P450
Da = Dalton
EMBL = European Molecular Biology Laboratory
EMX = Enzymes du Métabolisme des Xénobiotiques
GDEPT = Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy
HMM = Hidden Markov Model (fr. modèle de Markov caché)
indel = Insertion Délétion
Kd = Constante de Dissociation
Km = Constante de Michaelis
M = Molaire
MD = Molecular Dynamics (fr. Simulation de Dynamique Moléculaire)
P450 = Cytochrome P450
PDB = Protein Data Bank
PSSM = Position Specific Scoring Matrix ou Profil
RMN = Résonance Magnétique Nucléaire
RMSD = Root Mean Square Deviation (fr. écart quadratique moyen)
SCOP = Structural Classification Of Proteins
SRS = Substrate Recognition Site (fr. Site de reconnaissance du substrat)
SSE = Structural Secondary Element (fr. élément de structure secondaire)
iii
Introduction générale
1
3
En l’espace d’un demi-siècle, le Cytochrome P450, est devenu un véritable emblème dans la
communauté scientifique des biologistes tant l’engouement que cette protéine suscite est intense.
Depuis sa découverte dans les années 50, elle ne cesse de poser de nouvelles questions aux chercheurs.
En réalité, il n’existe pas un Cytochrome P450, mais toute une variété : ces cytochromes P450s
correspondent en effet à une large superfamille d’hémoprotéines mono-oxygénases, présente à la fois
chez les procaryotes et les eucaryotes. Ces enzymes jouent un rôle important dans le métabolisme
oxydatif d’une grande diversité de substrats pour la plupart hydrophobe, aussi bien d’origine endogène
qu’exogène. Ainsi, chez les cellules de mammifère, ils sont notamment responsables de la
métabolisation et de la détoxication des composés exogènes, également appelés xénobiotiques. On les
trouve aussi impliqués dans les phénomènes d’intoxication par formation d’entités réactives :
époxydes, radicaux, etc. Ces enzymes de phase I du métabolisme, assurent une modification du
potentiel redox de ces xénobiotiques par mono-oxygénation ou réduction, modifiant leur liposolubilité
et rendant possible leur excrétion après conjugaison ou non par des enzymes de phase II. Les P450s,
de 400 à 500 acides aminés environ, contiennent une proto-porphyrine IX de fer (l'hème) qui joue le
rôle de catalyseur d'oxydo-réduction, et peuvent être solubles ou membranaires. Les réactions
d'oxydo-réduction entraînent l’activation de l’oxygène qui est transférée sur le substrat positionné
entre 3 et 6 Å du fer (Johnson, 2003).
En raison de leurs propriétés physico-chimiques et de leur implication dans les réactions de

détoxication, les cytochromes P450 constituent donc un enjeu à la fois économique et pharmaceutique
majeur : les industriels pharmaceutiques doivent en effet faire face à ces enzymes qui reconnaissent et
dégradent la majeure partie de leurs médicaments actuellement mis sur le marché. De plus, cette
dégradation peut entraîner des interactions médicamenteuses non désirées capable de provoquer des
effets toxiques. Les laboratoires de recherche doivent pourtant composer avec ces protéines qui
constituent une des premières barrières naturelles aux agressions extérieures. C’est pourquoi il est
impératif d’étudier et de comprendre les mécanismes impliqués dans la reconnaissance du substrat par
ces CYPs, pour pouvoir espérer soit contourner cette barrière par diminution les doses de médicaments
prescrits, soit agir directement sur ces enzymes et les modifier à notre avantage, par des expériences de
mutation.
La thématique des P450s depuis, tout particulièrement les P450s impliqués dans la cascade de
détoxication chez l’homme est une des activités majeures de l’équipe dirigée par M. Delaforge et F.
André au sein de laquelle j’ai effectué mon travail de thèse. Elle concerne aussi bien l’activité
catalytique de ces enzymes (multi-spécificité et coopérativité) que leurs relations structure-activité vis-
4 Introduction générale
à-vis de composés hydrophobes (médicaments, pesticides, mycotoxines, ….). Fort de leurs

connaissances et de leurs savoir-faire expérimentaux, les membres de cette équipe ont décidé
d’aborder la problématique de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par des
approches nouvelles : celles de la bioinformatique. En effet, la bioinformatique est devenue
aujourd’hui un outil puissant et complémentaire des autres outils qu’on utilisait jusqu’alors en biologie
pour étudier le fonctionnement des protéines (études spectroscopies, études enzymologiques
d’activités et mutagénèse, etc.). Le développement d’algorithmes de plus en plus nombreux et la
montée en flèche de la puissance de calcul des ordinateurs, ont fait de l’informatique un outil
parfaitement adapté à la biologie dont on attend beaucoup, en particulier dans le domaine de
l’ingénierie et la conception de médicaments. C’est dans ce contexte que j’ai pris mes fonctions dans
cette équipe en Octobre 2004, pour explorer in silico les mécanismes généraux de reconnaissance par
les CYPs, pour expliquer à la fois la sélectivité à l’intérieur d’une famille de substrats, la multi-
spécificité et les effets coopératifs entre substrats de famille chimique différente (interaction
médicamenteuse).
En bioinformatique structurale, le point de départ avant toute investigation est la disposition d’un
support de travail qui est soit la structure de la protéine, soit un modèle. Même si aujourd’hui un
nombre important de structure de CYPs est disponible, il demeure insignifiant comparé au nombre de
gènes connus dans cette superfamille. À noter que la plupart des structures de P450s connus
correspondent à celles qui ont un intérêt clinique ou pharmaceutique. Bref, pour étudier des P450s de
structure inconnue, il est nécessaire de produire des modèles. Toutefois, la diversité en séquence
(principalement en partie N-terminale, et à un degré moindre en C-terminale) qui existe au sein de
cette superfamille est un vrai frein à l’obtention d’un modèle 3D par modélisation comparative.
Le premier point sur lequel j’ai travaillé durant mes trois années de thèse, a consisté à développer
une méthodologie fiable de reconstruction de P450s à bas taux d’identité. Pour cela, j’ai conduit
mes expériences sur un cas particulier des P450s : celui du CYP 3A4. En effet, chez l'homme, la
famille de P450 la plus abondante est celle du CYP3A, qui comprend notamment l'isoforme P450 3A4
(CYP3A4, 503 acides aminés). Celui-ci est majoritaire dans le foie, responsable à lui seul du
métabolisme de près de 60% des médicaments utilisés actuellement (Lewis, 2003), mais aussi de
nombreux produits présents dans notre environnement : pesticides, mycotoxines, additifs alimentaires,
etc. Des composés endogènes tels que la testostérone ou des petits dérivés peptidiques (Delaforge et
al., 1997) sont aussi reconnus et oxydés par ce cytochrome. Les substrats pris en charge sont
5
généralement hydrophobes, mais de taille, de nature chimique, et de poids moléculaire très variables :
de 150 à 1400 Da (Rendic, 2002, Ekins et al., 2003).
Un premier modèle moléculaire du CYP3A4 a été développé au laboratoire au cours du travail de

thèse de N. Loiseau (Loiseau, 2002). Il a été obtenu par modélisation comparative basée sur les six
structures de cytochromes P450 disponibles à l’époque dans la PDB (Protein Data Bank), dont cinq
d'espèces bactériennes solubles, avec une moyenne de 20 % d'identité. Ces isozymes partagent une
homologie fonctionnelle (activité mono-oxygénase), mais reconnaissent et métabolisent des substrats
très différents, parfois spécifiques (camphre par exemple, pour le P450cam ou Camphor
5-monoxygenase, le plus étudié). Un autre modèle de la famille 3A, l’isoforme CYP3A7 qui présente
88% d’identité avec le CYP3A4, et est exprimée principalement dans le foie durant la période fœtale
et néonatale (Lacroix et al., 1997, de Wildt et al ., 1999), a été construit en 2003 par M. Cottevieille
avec un jeu réduit à quatre structures PDB de cytochrome P450, dont trois bactériennes. Le modèle de
CYP3A7 devait permettre de comparer les mécanistiques 3A4/3A7 chez l’homme, et d’utiliser leurs
propriétés opposées dans le métabolisme des stéroïdes, afin de réaliser des validations croisées des
modèles. Toutefois, les modèles obtenus avec pourtant la même stratégie de modélisation, ne sont pas
en accord. Ce désaccord provient de l’étape d’alignement des séquences de référence sur la séquence
cible, étape cruciale en modélisation comparative. Dans les deux cas pourtant, l’information
structurale spécifique des CYPs était utilisée pour améliorer l’alignement multiple. En effet, en dépit
de la diversité en séquence, on observe une bonne conservation du repliement global dans la
superfamille des P450, au travers des différentes structures déposées dans la PDB qui sont d’origines
diverses (bactérienne, fongique ou de mammifère). Cette information structurale servait d’ancrage à
l’alignement multiple.
J’ai donc été amené à étudier cette information de conservation structurale au sein de la
superfamille des CYPs, puis vérifier et valider l’intérêt de son utilisation pour améliorer l’alignement
multiple. Pour cela, il a fallu mettre en place et développer un outil fiable d’alignement multiple
(Caliseq) permettant de positionner correctement les séquences des P450s de structures connus, sur la
famille des 3A. Les alignements produits par cette méthode servent de points de départ aux
reconstructions de modèles 3D de CYP 3A et par extension à d’autres P450s ne disposant pas d’autres
homologues à plus de 30% d’identité (limite acceptable pour la reconstruction de modèles par des
méthodes classiques).
6 Introduction générale
Par ailleurs, le programme développé m’a également permis d’aborder la bioinformatique

génomique : en effet, ce logiciel initialement mis au point pour produire les alignements multiples était
également en mesure d’exploiter l’information structurale comme signature spécifique des P450s pour
des expériences de génomique exploratoire. Caliseq permet en effet de détecter des séquences de
P450s (dans la mesure où l’information de conservation structurale est tirée de la superfamille des
P450s) dans des banques de séquences. Cet aspect de génomique exploratoire présente un intérêt dans
la construction d’une banque de séquences spécifique au P450s. L’utilisation de cette banque,
combinée à celle de la reconstruction de modèles pourrait théoriquement aboutir à une constitution
d’une base de modèle de site actif, sur laquelle les chimiothèques pourraient être confrontées. Les
résultats des criblages obtenus, apporteront probablement des éléments de réponses, ou du moins une
idée sur les mécanismes de reconnaissance du substrat par ces enzymes.
Outre l’aspect prédictif de la bioinformatique, j’ai été également conduit au cours de ma thèse à
travailler sur une application concrète de la bioinformatique structurale dans un traitement par
thérapie génique, impliquant une autre P450, la CYP 2B6. Ce travail a été initié par l’équipe de
Toxicologie Moléculaire à la Faculté de Médecine de Paris V qui a développé les techniques de
thérapie génique autour d’une prodrogue, dont le produit de dégradation par le CYP présente un effet
chimiothérapique. Pour améliorer l’affinité et l’activité enzymatique du CYP 2B6 pour ce substrat, des
expériences de mutations dirigées ont été réalisées. En raison du nombre important de mutants opérés,
cette équipe a sollicité notre aide pour lui fournir un support bioinformatique en vue de tester in silico
les résultats. Ce fut donc pour moi l’occasion d’aborder un autre aspect de la bioinformatique
apportant une véritable finalisation au travail in silico, à savoir utiliser les ressources et les
informations disponibles pour fournir une base destinée et une description moléculaire à des
expériences biochimiques.
Ce travail de collaboration m’a ainsi permis de confronter des résultats obtenus (mutations in
silico, docking de la prodrogue dans le site actif, simulations de dynamique moléculaire…) sur des
modèles de CYP 2B6 par des résultats expérimentaux et au plan plus général, d’apporter (ou de
confirmer) des éléments de réponse aux mécanismes de reconnaissances de substrat par les P450s.
L’ensemble de tous mes travaux est présenté au travers de ce manuscrit, agencé de la manière
suivante : dans un premier chapitre, j’exposerai l’état des connaissances actuelles disponibles, aussi
bien sur les P450s que sur les méthodes bioinformatiques classiques d’étude de protéine. Je décrirai
dans un second chapitre les méthodes que j’ai développées pour compléter les méthodes
7
bioinformatiques existantes, et en dernier chapitre, je présenterai les résultats obtenus par cette
méthode et ceux issus de la collaboration avec l’équipe de Paris V.
Première Partie
État des connaissances
9
CHAPITRE 1
1 Cytochromes P450 : pourquoi un tel intérêt ?
« Nous ne connaissons pas le vrai si nous ignorons les causes »

Aristote (384-322 av JC)
11
12 Chapitre 1. Cytochromes P450 : pourquoi un tel intérêt ?
1.1 A la découverte d’une superfamille d’enzyme…

1.1.1 Présentation d’une protéine hors norme
Le cytochrome P450 constitue un des sujets de recherche les plus en vogue au cours de ce dernier
demi-siècle, aussi bien en biochimie qu’en biologie moléculaire. Il doit également son principal essor
au développement de ressources de l’industrie pharmaceutique mondiale. Sous le terme général de
cytochrome P450, se regroupe une superfamille multigénique de protéines enzymatiques dites
«hemo-thiolate» à propriétés redox. Aussi connu sous le terme de mono-oxygénases, il a la capacité
d’activer les molécules de dioxygène en des entités hautement réactives (ROS) et d’insérer ensuite
l’oxygène moléculaire dans un nombre important et varié de substrats tant au niveau d’un atome de
carbone, que d’azote ou de soufre. Cette activation du dioxygène est rendue possible par la présence
d’un atome de fer inclus dans l’hème qu’il porte. Ces cytochromes P450 (CYPs ou P450s) sont des
enzymes ubiquitaires qu’on retrouve dans tous les organismes vivants à l’exception près de certains
micro-organismes primitifs qui auraient évolué il y a plus de 3,5 milliards d’années. De même,
substrats et réactions générés par ces enzymes sont multiples et ubiquitaires : les CYPs sont
responsables du métabolisme oxydatif de molécules très diverses, comprenant aussi bien des
substances endogènes (hormones stéroïdiennes, acides gras, vitamines D, prostanoïdes, alkanoïdes,
terpènes et autres pytoalexines…) que les xénobiotiques (médicaments, pesticides polluants, toxiques,
cancérigènes, carcinogènes…). Les réactions de biotransformation des xénobiotiques catalysées par
les CYPs s’inscrivent en effet dans un processus de détoxication évitant l’accumulation de substances
potentiellement toxiques dans l’organisme. Ce sont d’ailleurs ces mêmes substrats qui auto induisent
leurs propres réactions de détoxication. Paradoxalement, les CYPs peuvent parfois catalyser
l’activation chimique de certains composés (procarcinogènes…) et produire des métabolites toxiques,
mutagènes voir cancérogènes (génération de ROS qui endommagent l’ADN). Cette ambivalence et les
conséquences majeures qui en découlent ont conduit à s’intéresser aux cytochromes P450, tant du
point de vue structural que fonctionnel.
1.1.2 Identification et caractérisation des CYPs
Cela fait à présent cinquante ans que Garfinkel et Kligenberg (1958) ont reporté pour la première
fois l’apparition d’un pigment jaune orangé dans des fractions microsomales hépatiques de rat et de
cochon en présence de monoxyde de carbone. Ce pigment fut alors dans un premier temps caractérisé
comme une hémoprotéine, identifiée à un cytochrome de type b peu commun, puis deviendra plus tard
A la découverte d’une superfamille d’enzyme… 13
ce qu’on connaît sous la désignation « P450 ». Cette désignation de « P450 » a été attribué en raison
de sa propriété d’absorption maximal à 450 nm dans le spectre UV (cf. Figure 1-1) lorsque le fer de
l’hème, à l’état réduit, est complexé au monoxyde de carbone (Omura et Sato, 1962). Le ‘P’ de P450
fait référence quant à lui au « pigment » d’où le terme P450 pour Pigment à 450 nm. La fonction
biochimique des cytochromes P450 fut alors établie vers le début des années 60 aussi bien dans la
biotransformation des stéroïdes (Estrabook et al., 1963) que dans l’oxydation des composés exogènes
(Cooper et al., 1965).
Figure 1-1 Spectre d’absorption du P450 complexé à du monoxyde de carbone montrant le pic caractéristique
aux alentours de 450 nm
C’est donc, d’une part l’observation d’une pigmentation cellulaire jaune-orangé apparue à la suite
d’une complexion de préparation microsomale avec un monoxyde de carbone et d’autre part, la
présence d’un pic distinct à 450 nm en spectre UV visible d’absorption (Garfinkel, 1958 ; Klingenberg,
1958) qui ont permis la découverte de l’enzyme. Les origines phylogéniques des P450s quant à elles,
demeurent discutables et restent encore à démontrer. On pense toutefois que le système des P450s
aurait évolué de façon constante il y a plus de 3,5 milliards d’années, avant même l’arrivée de
l’oxygène atmosphérique (Wickramasinghe et Villee, 1975). Au départ, il semble que les organismes
présents se servaient du potentiel chimique des molécules d’oxygène pour traiter les composés
organiques, grâce à la formation contrôlée d’entités réactives (i.e. superoxydes, peroxydes, etc.). Ces
mécanismes de transformation de l’oxygène seraient rendus possibles par la médiation d’un complexe
fer-porphyrine dont la structure est similaire de la protoporphyrine IX (ou hème cf. Figure 1-1). La
porphyrine est en effet une entité appropriée pour la régulation de l’équilibre de l’état de spin du fer
(Frausto da Sliva et Williams, 1991), occupant donc un rôle important dans les échanges électroniques
du fer (et donc par la même occasion, dans la catalyse par les hémoprotéines). Ce type de réaction peut
être de plus favorisé par l’influence d’une cystéine proximale (thiolate) présente dans l’apoprotéine du
P450 qui se charge, d’acheminer les molécules d’eau, les éléments réducteurs (i.e. proton/électrons)
nécessaires à la réaction (Lewis et Pratt, 1998) et les substrats organiques à lier. De toute évidence,
l’apoprotéine P450 semblerait avoir évolué de façon à incorporer la partie héminique et à « orienter »
les substrats potentiels vers un métabolisme oxydatif d’une position particulière. L’apport en électron
peut être obtenu quant à lui par transfert à partir de partenaires redox pouvant appartenir à un système
immergé dans une bicouche phospholipidique (comme celle de la membrane du réticulum
endoplasmique dans le cas des P450s hépatiques microsomaux).
Figure 1-2 Protoporphyrine IX de fer constituant l'hème des cytochromes P450
Au final, tous les P450s identifiés à ce jour désignent des hémoprotéines constituées d’un hème
relié à l’apoprotéine par un groupement cystéinate complexant le fer de groupe prosthétique (cf.
Figure 1-3). Schématiquement, on a coutume de représenter les CYPs comme une grosse
hémoprotéine constitué d’une chaîne polypeptidique unique, l’apoprotéine (d’un poids moléculaire
compris entre 45 et 60 kDa) et d’un groupement prosthétique central, l’hème (catalyseur de la réaction
enzymatique). Ce dernier est lié de façon « non covalente » à l’apoprotéine par l’intermédiaire d’une
cystéine. Le site catalytique de l’enzyme est hydrophobe, permettant l’accueil de substrats.
- La diversité des P450s est naturellement liée à la séquence primaire en acides aminés de
l’apoprotéine.
- L’hème des CYPs est constitué d’une protoporphyrine XI de Fer. Au sein des P450s, ce métal
est lié aux quatre azotes pyrroliques de la porphyrine et au soufre de la cystéine axiale. Cette
cinquième liaison de coordination du fer est réalisée avec le groupement thiolate de la cystéine
présente dans la région C-terminale. Le fer peut être hexacoordonné, le sixième ligand étant
par exemple, O2, H2O, CO ou une autre molécule. Dans le P450, le plan de l’hème définit
deux régions : (a) la face proximale située du côté du ligand cystéinate et (b) la face distale
contenant le site actif de l’enzyme.
Cystéine
Apoprotéine
S Face proximale
N N
FeIII
Hème
(protoporphyrine)
N N
Site catalytique
(zone hydrophobe
Face distale pour le substrat)
Figure 1-3 Représentation schématique d'un CYP
1.1.3 Diversité des cytochromes P450
Depuis sa découverte, l’intérêt que cette superfamille suscite n’a cessé d’augmenter de façon
considérable : aujourd’hui encore, le CYP reste un challenge scientifique majeur. Les trois décennies
qui séparent la première purification d’un P450 en 1970 (Yu et Gunsalus, 1970) de la première
résolution d’une structure d’un P450 de mammifère en 2000 (Williams et al., 2000b), ont ainsi permis
d’appréhender efficacement la complexité et la diversité de cette superfamille.
1.1.3.1 Multiplicité en gènes

On remarque tout d’abord chez cette superfamille une multiplicité en gènes : Lewis reportait déjà
en 2000 plus de 1200 gènes individuels de P450. Selon lui, beaucoup d’autres nouveaux gènes
viendront grossir les rangs dans les années à venir, tant l’état de connaissance dans ce domaine est
vaste, profond ne demandant qu’à être exploré. Ses intuitions se sont révélées exactes, puisque
aujourd’hui (2007), nous atteignons déjà 7700 gènes répartis entre les bactéries, végétaux,
champignons, insectes et animaux. De plus, d’une espèce à l’autre, le nombre de gènes codant pour les
P450s est très variable.
À partir d’informations basées sur des alignements de séquences et d’arbres phylogéniques

d’évolution Nelson a émis l’hypothèse d’un gène ancestral des P450s qui serait apparu il y a environ
3.5 milliard d’années chez la bactérie (Nelson, 1999; Nelson et al., 1993, 1996). Ce dernier serait très
proche du seul P450 présent dans tous les organismes : le CYP51. Ce P450 catalyse la 14-α-
déméthylation du lanostérol, un intermédiaire qui intervient dans les premières phases de la chaîne de
synthèse des stérols. La diversification des CYPs pourrait donc être expliquée par une
complexification de la biosynthèse des stérols au cours de l’évolution. Par ailleurs, l’apparition d’une
« menace oxygène » dans le monde végétal ou animal expliquerait également la différentiation des
CYPs, spécialisés dans la détoxication des xénobiotiques. Malgré l’importante diversité génique des
cytochromes, cette superfamille est caractérisée par deux séquences protéiques consensus :
- Une séquence consensus située du côté proximal de l’hème FxxGx(R/H)CxG (il s’agit là du
motif décrit de façon historique). Appelé « Cys-Pocket », elle contient la cystéine ligand du
fer et est considérée comme la signature peptidique de la superfamille des P450s. D’ailleurs,
ce motif est également désigné « signature cytochrome P450 – hème » et est utilisé pour
identifier les P450s dans la base PROSITE (voir le paragraphe sur Prosite page 79) pour la
recherche des P450s. Le motif de la base PROSITE s’écrit sous cette forme : [FW]-[SGNH]-
x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]. Cette séquence participe au maintien de
l’hème au sein de l’apoprotéine.
350 353 357 359 249 252

CYP101 F G H G S H L C L G … … G G L D T V
CYP102 F G N G Q R A C I G … … A G H E T T
CYP1A1 F G L G K R K C I G … … A G F D T I
CYP3A4 F G S G P R N C I G … … A G Y E T T
CYPY2J2 F S I G K R A C L G … … A G T E T T
441 444 448 450 312 315
Séquence
F x x G x R/H x C x G … … G/A G x E/D T x
consensu
s
Figure 1-4 Séquences consensus « Cys-Pocket » caractéristiques des cytochromes P450 (source : thèse de P.
Lafite)
- Une séquence consensus distale (G/A)Gx(E/D)T moins bien conservée au sein des P450s, elle
joue un rôle dans l’activation de l’oxygène moléculaire lors de la catalyse.
En raison du nombre important de P450s exprimés dans le monde vivant, une nomenclature en
famille et sous famille basée sur l’identité en séquence a été élaborée. Cette nomenclature sera
détaillée la section 1.2.1.
1.1.3.2 Localisation hétérogène

Les CYPs sont représentés dans tous les organismes vivants, à différents niveaux de localisation
cellulaire : dans le cas des procaryotes, les CYPs sont des protéines cytosoliques, tandis que chez les
eucaryotes, ils sont membranaires, localisés dans différents compartiments cellulaires. Ainsi, on
distingue les P450s mitochondriaux, les P450s microsomaux, fixés aux membranes du réticulum
endoplasmique (RE), et les cytochromes plastidiaux chez les végétaux.
1.1.3.3 Variabilité en forme

On pensait initialement que le P450 n’était qu’un simple et unique cytochrome. Très vite, on se
rendit compte que cette enzyme pouvait exister sous de multiples formes, chacune possédant des
propriétés différentes qui dépendent à la fois de leur sélectivité au substrat et de certaines
caractéristiques physicochimiques (Omura et al., 1993). A titre d’exemple, des variations distinctes
sont relevées autour du pic d’absorption des 450 nm pour des enzymes isolées de sources différentes,
ou issues de préparations microsomales provenant d’animaux traités par des composés chimiques
différents (Ruckpaul et Rein, 1984). Cette multiplicité en formes de cytochromes P450 n’est en fait
qu’une conséquence d’une multiplicité en gènes (Gonzalez, 1988). Elle a ainsi conduit l’enzyme dans
un premier temps, à l’appellation d’oxydase à « fonction mixte » puis, plus récemment, à celle de
« mono-oxygénase » pour décrire sa capacité à insérer un atome d’oxygène dans une large variété de
substrats et classes structurales de composés (Porter et Coon, 1991 ; Okita et Masters, 1992 ; Ortiz de
Montellano, 1986, 1995). Encore largement utilisée, l’appellation de « cytochrome » n’est pourtant
plus considérée comme la plus appropriée pour décrire ces hémoprotéines : non seulement les P450s
diffèrent significativement des autres cytochromes en de nombreux points, ils sont également plus
reconnus comme des enzymes dites « hemo-thiolates » que des protéines redox (cas des cytochromes a,
b ou c par exemple) en dépit du fait qu’ils possèdent, un potentiel redox, bien plus bas que leurs
homologues (de -420 mV).
1.1.3.4 Diversité des réactions catalysées

Une des particularités des CYPs est leur capacité à catalyser une multitude de réaction de
monooxgénation, dont l’hydroxylation est la plus répandue. Ils réalisent également des réactions
d’époxydation, de déshydratation, d’isomérisation ou de réductions (Mansuy et Battioni, 2000 ;
Guengerich, 2001 ; Ortiz de Montellano, 2005) sur des motifs carbonés aliphatiques ou aromatiques en
transformant un atome d’oxygène à partir de dioxygène et nécessitant quelques protons et un donneur
d’électrons.
Figure 1-5 Réactions d’oxydation généralement catalysées par les P450s. D’après (Mansuy et Battioni, 2000)
1.1.3.5 Rôles multiples

Cette variété de réactions catalysées confère aux P450s un rôle important aussi bien dans la
transformation de molécules endogènes qu’exogènes. Selon les organismes dans lesquels ils sont
exprimés, les CYPs ne jouent pas le même rôle. Comme il a été déjà évoqué, les P450s sont les
principales enzymes impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques. Ils participent entre autre à
l’élimination des composés exogènes comme les médicaments, les toxines ou les polluants en
complétant l’action défensive du système immunitaire destiné à prendre en charge les macromolécules.
Dans certains cas, pourtant, la dégradation de certains xénobiotiques peut former des métabolites
réactifs électrophiles et devenir source de toxicité pour le P450 ou d’autres protéines cellulaires (cf.
paragraphe 1.6.2). Par ailleurs, les CYPs occupent une place importante dans la biosynthèse et la
biodégradation des composés endogènes. Chez les procaryotes, certains CYPs participent à la
biosynthèse de composés endogènes tels que les stérols ou des antibiotiques assurant la défense du
microorganisme. Chez les eucaryotes, c’est également les P450s qui assurent la synthèse des stérols
nécessaires aux membranes plasmiques comme le cholestérol ou l’ergostérol, ainsi que la biosynthèse
des hormones stéroïdiennes, des eïcosanoïdes, des rétinoïdes et de certaines vitamines (Guenguerich,
2005).
1.1.3.6 Un large spectre de substrats

Les CYPs sont en mesure de catalyser un nombre très important et varié de substrats : les CYPs
participant à des chaînes de biosynthèse endogènes sont généralement spécifiques à un seul substrat,
tandis que ceux impliqués dans le métabolisme de xénobiotiques montrent une très faible spécificité de
substrat. Ces derniers sont capables de métaboliser des substrats de polarité ou taille très variable.
L’exemple qu’on a coutume de citer pour illustrer ce phénomène est celui du CYP3A4, cytochrome
humain qui à lui seul est en mesure de métaboliser jusqu’à 50% des médicaments prescrits chez
l’homme (Rendic, 2002). Il reconnaît des substrats allant du paracétamol (151 Da) pour le plus petit, à
la cyclosporine (1,2 kDa) pour la plus volumineuse. À noter qu’un substrat peut être oxydé de
plusieurs façons différentes au sein d’un même P450 et que la même activité d’oxydation d’un substrat
peut être catalysée par plusieurs P450s.
1.1.3.7 Un corpus de connaissance croissant

Enfin, outre la diversité en gènes, en formes, en réaction et en rôle, le corpus de connaissance
dans ce domaine est lui même profond et étendu : le nombre de publications sur les P450s (ou relatives
aux P450s) ne cesse d’augmenter depuis cette dernière décennie, de façon régulière (voir exponentielle)
et avoisinant la barre des 1000 publications scientifiques par an (Estabrook, 1996 ; Koymans et al.,
1993). La Figure 1-6 montre justement les différents domaines de recherche et autres champs
d’application des P450s.
Métabolisme Polymorphisme
endogènique et génétique
biosynthèse de
stéroïdes, d’acides Activation
gras, prostanoïdes, métabolique de
Biotransformation de procarcinogènes
eicosanoïdes
médicaments/métabolisme
vitamines D et
acides biliaires
Détoxication de
Physiologie Pharmacologie Toxicologie xénobiotiques
Dégradation
métabolique de Cytochromes P450 Biochimie Biosenseurs
terpènes, Microbiologie Biotechnologie Biosynthèses
alkanes et ciblées
d’acides gras
Chimie Sciences des Sciences de

Bioremédiation
plantes environnement
Biomonitoring
Métabolisme de
Stéréo- et Régio- phytoalexins, Conversion
sélectivité alkanoïdes, terpènes des herbicides
d’oxygénation et couleur des fleurs et insecticides
Figure 1-6 Domaines de recherches du P450 et champs d'application (Adapté de Bernhardt, 1996 ; récupéré de
Lewis, 2001)
En résumé, il est facile de comprendre toute cette agitation « cérébrale » autour des CYPs, tant
leurs fonctions, leurs implications, leurs mécanismes sont importants et variés. Ils présentent non
seulement une véritable multiplicité en gènes, une grande diversité en réactions catalytiques mais
montrent également des rôles variés, pouvant aller du métabolisme de xénobiotiques à la biosynthèse
et biodégradation des composés endogènes. Dans cette diversité pourtant, le mécanisme sous-jacent
semble imposer une contrainte à cette superfamille : sa structure très conservée.
1.1.4 Conséquences structurales
Étonnamment et en dépit de leur diversité, les CYPs semblent partager en commun un repliement
très conservé. En effet, compte tenu de l’évolution fonctionnelle des CYPs, la structure tertiaire des
P450s telle que nous la connaissons1 au travers des différents cristaux publiés dans la Protein Data
Bank (PDB) (http://www.rcsb.org) résulterait de contraintes apportées par divers éléments nécessaires
à sa fonction catalytique (cf. Tableau 1.1) : liaison au substrat, hème, oxygène et partenaire(s) redox.
Tableau 1.1 Rôles structuraux de l'apoprotéine P450 (source Lewis, 2001)

Fonction du P450 Dispositifs structuraux impliqués
1. Liaison à l’hème Hélice I et L, cystéine invariante et usuellement deux résidus

basiques pour la liaison ionique avec les propionates de l’hème
2. Liaison et activation de l’oxygène La région de l’hélice I distale à la partie héminique
3. Liaison des partenaires redox Résidus basiques pour les liaisons ioniques
4. Transfert du proton à l’oxygène Liaisons ioniques internes établies par les résidus avoisinant l’hème
5. Liaison des différents substrats Les hélices B’, F et I et les brins β1 et β4 (Région SRS)
6. Régulation de ces activités à Peptide N-terminal de 30-40 résidus de long

l’intérieur de la membrane
SRS = Substrate recognition site (Gotoh, 1992)
Ces contraintes liées à la fonction sembleraient exercer une certaine pression conduisant à la
conservation structurale des P450s : en effet, d’un P450 à un autre, la structure des P450s est
inchangée, et ce en dépit de leurs localisations environnementales, que ce soit chez la bactérie (où le
P450s est cytoplasmique), les mitochondries ou encore dans les systèmes microsomaux (où les P450s
sont ancrés à la membrane) (Degtyarenko et Archakov, 1993). Il existe bien entendu quelques
exceptions connues à cette conservation structurale. C’est le cas des P450s dont la fonction est quelque
peu inhabituelle, comme par exemple l’allène oxyde synhtase (AOS), la prostacyclin synthase (PGIS)
ou encore la thromboxane synthase (TXAS). En fait, les différentes fonctionnalités montrées par ces
enzymes peuvent être associées à de petits changements dans la séquence (par exemple sur l’hélice I),
mais suffisamment cruciaux (cf. Tableau 1.2) à l’intérieur du centre catalytique du P450 pour entraîner
une légère modification de la structure de la protéine.
1
De 16 à 18 hélices α numérotées de A à L avec quelques variations et 4 à 6 feuillets β numérotés de 1 à 6. La
structure des CYPs sera vue plus loin.
Tableau 1.2 Comparaison de l'hélice I entre plusieurs P450s.

Type de réaction
Espèces CYP Abréviation Séquence
enzymatique
↓ ↓ ↓ ↓
Humain 3A4 Nif F I F A G Y E T T S Nifedipine N-Oxidase
Humain 5A1 TXS F L I A G Y E I I T Thromboxane synthase
Rat 5A1 TXS F L I A G H E I T T Thromboxane synthase
Souris 5A1 TXS F L I A G H E V I T Thromboxane synthase
Cochon 5A1 TXS F L I A G Y E I I T Thromboxane synthase
Lin 74 AOS N S W G G F K I L L Allène oxyde synthase
Guayule 74 AOS N T F G G V K I L F Allène oxyde synthase
Humain 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase
Vache 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase
Rat 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase
Souris 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase
Poulet 19 Arom M L I A A P D T L S Estrogène synthase
Truite 19 Arom M V I A A P D T L S Estrogène synthase
Levure 51 14DM V L M G G Q Q T S A Lanosterol 14α-démétylase
Rat 51 14DM L L L A G Q Q T S S Lanosterol 14α-démétylase
Humain 51 14DM L L L A G Q Q T S S Lanosterol 14α-démétylase
Candida 51 14DM V L M G G Q Q T S A Lanosterol 14α-démétylase
Note :
1. La séquence habituelle de l’hélice distale est montrée par la séquence AGxET du CYP3A4 (ou x est
n’importe quel résidu
2. CYP5A1 ne possède pas la thréonine distale conservée
3. CYP74 ne possède ni la thréonine distale conservée ni le résidu acide précédent
4. CYP19 possède une proline avant l’aspartate
5. CYP51 ne possède pas de résidu acide avant la thréonine distale
6. ↓. Pointe les résidus normalement conservés
Références : Nelson et al., 1996 ; Mansuy et Renaud, 1995, Tableau tiré de Lewis, 2001
En conclusion, ce qui a été un jour vu en tant qu’un simple enzyme est désormais connu pour sa
multiplicité de formes, disposant de fonctionnalités variées et d’un vaste nombre de substrats
potentiels (Porter et Coon, 1991 ; Guengerich, 1991a et b ; Stegeman et Livingstone, 1998 ; Mansuy,
1998; Nelson, 1999).
Nomenclature, Classification et Phylogénie 23
1.2 Nomenclature, Classification et Phylogénie
Vu l’importance en nombre et l’extrême diversité des P450s exprimés dans le monde vivant, sans
méthodologie stricte, on risquerait de se perdre dans un brouillard d’informations. Ainsi, il a été
convenu de répertorier chaque P450 selon une nomenclature particulière. Cette dernière a été
arbitrairement choisie, en fonction du degré d’identité entre chaque P450. Un autre regroupement a pu
également être décrit, reposant cette fois-ci sur la fonctionnalité des P450s, et plus précisément, la
manière dont ces derniers reçoivent les électrons nécessaires à leurs activités. On parlera alors de
classification. Bien évidemment, ces deux éléments permettent d’apporter suffisamment
d’informations pertinentes à la réalisation d’un modèle d’évolution, qui peut être décrit par la
phylogénie.
1.2.1 Nomenclature
Depuis 1989, une appellation systématique des P450s a été mise en place, périodiquement mise à
jour depuis (Nebert et al., 1989a et b, 1991a ; Nelson et al., 1993, 1996). Cette nomenclature utilise le
symbole CYP (ou Cyp chez la souris et la drosophile) comme abréviation pour le terme cytochrome
P450 (aussi bien ADNc, ARNm que protéine), symbole qu’on retrouve en italique (CYP) lorsqu’il fait
référence au gène. La lettre P qui est parfois trouvé après un gène informe quant à lui qu’on a affaire à
un pseudogène. Il a donc été convenu que les CYPs soient classés en fonction de leur degré de
similitude dans leur séquence primaire2 (séquence en acides aminés) (voir aussi le site internet de
David Nelson à l’adresse http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html) comme suit :
- Appartiennent à la même famille (désigné par un chiffre arabe, CYP1, CYP2, …), les CYPs
ayant un degré de similitude supérieur à 40% ;
- A la même sous-famille (représentée par une lettre majuscule, CYP2B, CYP2C, …), les
CYPs ayant un degré de similitude supérieur à 55%
- Enfin, les isoformes appartenant à une même sous famille sont différenciés par un chiffre
arabe (CYP2C8, CYP2C9,…).
2
Il existe des cas particuliers pour les CYP responsable du métabolisme des stéroïdes où l’ancienne
nomenclature subsiste : le nombre juste après CYP correspond alors au numéro de l’atome du substrat où s’opère
la réaction de monoxygénation. C’est le cas pour le CYP 19 par exemple.
Alors que ce système fut initialement mis en place de façon arbitraire, ce choix de classification
par degré de similitude s’est révélé être assez judicieux et approprié, compte tenu qu’il permet de
séparer les différentes familles et sous-familles de façon satisfaisante dans la majorité des cas. Bien
évidemment, certains regroupements demeurent inexacts.
En se basant sur cette similitude entre les séquences et dans certains cas en tenant compte des
activités catalytiques, il a donc été possible de déterminer si deux gènes étaient issus ou non d’une
duplication de gènes phylogénétiques. En raison du nombre de familles devenu très important, un
niveau supplémentaire de regroupement est requis. Les clans font alors leur apparition et rassemblent
les familles qui appartiennent à un même groupe (issu d’un même gène ancestral) d’après de
nombreux arbres phylogénétiques établis auparavant (Nelson, 1999). Ces clans sont désignés par le
chiffre le plus petit des familles qu’ils regroupent ou par le chiffre de la famille majoritaire. Ainsi, le
clan 2 regroupe la famille de CYP2 de même que les familles CYP1, 17, 18 et 21.
Outre cette classification standard, les divers CYP se distinguent aussi par deux autres critères :
leur spécificité de substrat et la classe de molécules entraînant l’augmentation de l’expression.
Néanmoins, bien que les CYPs puissent se distinguer par leur spécificité au substrat, cette dernière
caractéristique peut être chevauchante comme il a été déjà mentionné précédemment : un CYP peut
ainsi métaboliser plusieurs substrats et un substrat peut être métabolisé par plusieurs CYPs. On peut
donner à titre d’exemple le cas de la morphine qui peut être soit métabolisée par les CYP3A4 et 2C8
(Projean et al., 2003). Un aperçu des CYPs et de leurs substrats est disponible sur le site Internet
http://www.edhayes.com/startp450.html.
1.2.2 Classification
Les CYPs catalysant principalement des réactions de mono-oxygénation, un apport d’électron au

substrat est donc nécessaire. Ces électrons sont fournis par le NADPH ou le NADH. Ainsi, les CYPs
ont été divisés en plusieurs grandes classes selon différents critères, tels que la façon dont les électrons
sont transportés du NAD(P)H au site catalytique. A ce jour, deux nomenclatures sont utilisées pour
différencier ces CYPs : (a) une ancienne nomenclature comprenant seulement 4 classes, adoptée de
tous, et (b) une plus récente décrit par Hannemann en 2006 qui distingue 10 classes. L’intérêt de cette
dernière nomenclature est discutable, mais semble être plus rigoureuse pour départager certains
regroupements qui hébergent des cas particuliers. Néanmoins, dans ce manuscrit, c’est la classification
en 4 classes qui sera utilisée.
1.2.2.1 Classification à 4 classes
Figure 1-7 Partenaires de transfert d'électrons des CYPs (d’après Paine et al., 2005). La classe I comprend les
P450s mitochondriaux (A), la majorité des P450s solubles (B) et certains systèmes fusionnés, dont le CYP RhF est
un représentant (C). La classe II comprend les P450s du RE (D) et les P450s qui incluent la ferredoxine à deux
flavines comme P450BM3 (E) Fx : ferredoxine, FxR : ferredoxine réductase, CPR : CYP réductase
Dans la classification originale, on distingue deux classes majoritaires de transfert d’électrons

(Paine et al., 2005) (cf. Figure 1-7). Deux autres classes sont également rencontrées, mais beaucoup
plus rarement.
- La classe I fait intervenir dans la chaîne de transfert d’électrons des enzymes à centre fer-
soufre. Les électrons du NAD(P)H sont prélevés par une ferrodoxine réductase à flavine (FAD)
puis transmis à une ferrodoxine à centre fer-soufre Fe2S2. Cette ferrodoxine transfère ensuite
les électrons au P450 pour permettre la catalyse. Cette classe contient la très grande majorité
des P450s bactériens et les P450s mitochondriaux. Il conviendrait d’ajouter à cette classe des
nouveaux systèmes identifiés récemment comme le P450RhF (Roberts et al., 2002), qui est
une protéine de fusion contenant une réductase à flavine et FMN, une protéine type
ferredoxine à centre fer-soufre et le cytochrome P450.
- La classe II des P450s est la plus commune chez les eucaryotes, à l’origine de réactions
catalytiques extrêmement diverses et variés. Les CYPs de cette classe sont trouvés au niveau
du RE et requièrent une NADPH-Cytochrome P450 réductase (CPR) qui contient les
groupements prosthétiques FAD et FMN. Cette dernière est issue d’une fusion de deux
protéines ancestrales : elle montre une partie N-terminale homologue avec une flavodoxine
bactérienne à FMN et une partie C-terminale homologue avec une ferrodoxine NADP+
réductase à FAD et avec une NADPH-cytochrome b5 réductase. Dans le système microsomal

de P450s, en plus de la CPR précédemment décrite, on retrouve aussi un autre système qui
n’est pas spécifique des P450s, faisant intervenir un cytochrome b5. Ce dernier est en mesure
de transférer lui aussi des électrons au P450, après avoir reçu ces électrons soit par la CPR soit
par la NADH-cytochrome b5 réductase. Dans la nomenclature à 4 classes, le P450BM3 issu de
Bascillus megaterium et la NO-synthase apparaissent toutes deux dans cette classe, ce qui
n’est pas le cas dans la nomenclature à 10 classes.
- Le P450nor catalyse la réduction du monoxyde d’azote NO et reçoit ses électrons directement
du NADH, sans protéine intermédiaire (Takaya et al., 1999). Ce P450 est le seul représentant
de la classe IV.
- D’autres P450 catalysent des isomérisations ou des déshydratations, et ne nécessitent pas
d’apport d’électrons extérieurs ou d’oxygène moléculaire. Les substrats transformés sont
généralement riches en électrons, comme des hydroperoxydes ou des endoperoxydes. Bien
qu’aucun système de transfert d’électrons ne soit présent, la classe III est tout de même défini
et comprend ces systèmes. La récente P450PCIS humaine (qui est une isomérase) fait partie de
cette classe (Strushkevich et al., en attente de publication).
1.2.2.2 Classification à 10 classes

La classification précédemment décrite est la plus connue, et admise de toute la communauté
scientifique. Néanmoins, il existe des cas pour lesquels le regroupement tel qu’il a été décrit ne semble
pas des plus appropriés, notamment pour des CYPs bactériens. Ceux-ci ont amené Hannemann à
proposer une autre classification (Hannemann et al., 2006), toujours basée sur le transfert d’électrons,
mais plus adaptée pour ces cas particuliers. Les principaux changements observés, outre le nombre de
classes, est principalement la sortie de certains de ces P450s de procaryotes d’une certaine classe (des
classes I et II) pour former une nouvelle classe à eux seuls.
Le Tableau 1.3 et la Figure 1-8 qui suivent, résument et illustrent les principales caractéristiques
permettant de regrouper les P450s selon cette nouvelle classification.
Tableau 1.3 Classes des systèmes P450s, classées selon la topologie des partenaires redox impliqués dans le transfert d’électrons au CYP
(d’après Hannermann, 2006).
Classe / Source Chaîne de transport d’électron Localisation / Remarques
Classe I
Bactérienne NAD(P)H > [FdR] > [Fdx]a> [P450] Cytosolique, soluble
NADPH > [FdR] > [Fdx] > [P450]
Mitochondriale P450 : membrane interne des mitochondries
FdR : membrane associée
Fdx : matrice mitochondriale, soluble
Classe II
Bactérienne NADH > [CPR] > [P450] Cytosolique, soluble ; Streptomyces
NADPH > [CPR] > [P450]
Microsomale A carbophilus
NADH > [CPR] > [cytb5] > [P450]
Microsomale B NADH > [cytb5Red] > [cytb5] > [P450]
Ancrée à la membrane, ER
Microsomale C Ancrée à la membrane, ER
Ancrée à la membrane, ER
Classe III
Bactérienne NAD(P)H > [FdR] > [Fldx] > [P450] Cytosolique, soluble ; Citrobacter braakii
Similaire à la classe II, mais sans l’entité
CPR
Classe IV
Bactérienne Pyruvate, CoA > [OFOR] > [Fdx] > [P450] Cytosolique, soluble ; Sulfolobus tokadaii
Classe des P450s thermophiles (ex CYP 119)
Classe V
Bactérienne NADPH > [FdR] > [Fdx–P450] Cytosolique, soluble ; Methylococcus
capsulatarus
Classe VI
Bactérienne NAD(P)H > [FdR] > [Fldx–P450] Cytosolique, soluble ; Rhodococcus
rhodochrous strain 11Y
Classe VII
Bactérienne NADH > [PFOR–P450] Cytosolique, soluble ; Rhodococcus sp. strain
NCIMB 9784, Burkholderia sp., Ralstonia
metallidurans
Cas du P450RhF
Classe VIII
Bactérienne, fungique NADPH > [CPR–P450] Cytosolique, soluble ; Bacillus megaterium,
Fusarium oxysporum
Cas du P450BM3
Classe IX
Seule NADH NADH > [P450] Cytosolique, soluble ; Fusarium oxysporum
dépendant, fungique Seul représentant : P450nor
Classe X
Indépendant chez la [P450] Liée à la membrane, ER
plante/mammifère Anciennement la classe III
Abréviation pour les partenaires contenant les centres redox suivants : Fdx (complexe fer-sulfure) ; FdR, Ferrodoxine réductase (FAD);
CPR, cytochrome P450 réductase (FAD, FMN) ; Fldx, Flavodoxine (FMN) ; OFOR, 2-oxyacid:ferrodoxine oxydoréductase (complexe
thiamine phosphate, [4Fe-4S]) ; PFOR, phthalate-family oxygénase réductase (FMN, complexe [2Fe-2S]).
a
Fdx contenant un complexe fer-sulfure de type [2Fe-2S], [3Fe-4S], [4Fe-4S], [3Fe-4S]/ [4Fe-4S]
Figure 1-8 Organisation schématique des différents systèmes de P450s. (A) Classe I, système bactérien ; (B)
Classe I, système mitochondrial ; (C) Classe II, système microsomal ; (D) Classe III, système bactérien, ex. du
P450cin ; (E) Classe IV, système bactérien thermophile ; (F) Classe V, système bactérien à [Fdx]–[P450] fusionné ;
(G) Classe VI, système bactérien à [Fldx]–[P450] fusionné ; (H) Classe VII, système bactérien à [PFOR]–[P450]
fusionné ; (I) Classe VIII, système bactérien à [CPR]–[P450] fusionné ; (J) Classe IX, système eucaryote P450nor ;
(K) Classe X, système eucaryote indépendant, cas du P450TxA (source Hannemann et al., 2006)
1.2.3 Phylogénie
Pour remonter aux origines des P450s, les chercheurs ont essayé de retracer leur évolution au
moyen de techniques phylogéniques. Cependant, la construction d’arbres phylogénétiques n’est pas
aisée pour cet enzyme car elle se base sur des matrices de distances calculées à partir d’un alignement
multiple en séquences primaires (MSA). Cet alignement dépend fortement du degré de similarité entre
séquences utilisées. En raison des divergences en séquence primaire, il est facile de comprendre qu’un
alignement multiple qui prendrait en compte tous les P450s serait difficilement réalisable. La
classification des P450s en famille et sous famille, basée sur la similitude en séquence, a rendu plus
abordable dans un premier temps, la construction d’arbres phylogénétiques ainsi que d’autres formes
d’analyses qui étudient l’évolution des relations entre gènes de P450s.
Un nombre très varié de méthodes a été utilisé pour comparer les séquences de P450s conduisant
la plupart du temps à des arbres assez proches pour un gène ancestral commun à 2 milliards d’années.
La méthode largement utilisée pour investir l’évolution et les relations entre P450s est celle de
l’UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Analysis) (Nelson et Strobel, 1987 ; Gotoh et Fujii-
Kuriyama, 1989 ; Nebert et al., 1991 ; Nebert et Gonzalez, 1987 ). Nebert et Nelson ont également
exploré les variations au sein des arbres phylogénétiques produits par le Neighbor Joining (NJ) et
l’UPGMA pour 39 séquences, où ils trouvèrent une légère différence entre les deux méthodes
principalement en raison des familles de CYP1 et CYP2. Toutes les méthodes d’analyse de séquences
ont montré que la forme bactérienne CYP102 (P450BM3) du Bascillus megaterium se regroupe avec les
P450s d’eucaryotes, tandis que les autres formes de procaryotes ségrégent clairement dans des classes
différentes. Une des raisons évoquées serait liée à la similitude des partenaires redox partagés par
CYP102 et les P450s microsomaux d’eucaryotes comme il a été vu précédemment lors des
classifications à 4 formes.
Au final, un arbre simplifié (cf. Figure 1-9) a été proposé où partant d’un gène ancestral commun
(il y a 2 milliards d’années) qui se serait dupliqué. Les gènes ainsi créés auraient alors divergé, faisant
apparaître progressivement une multitude de familles, sous-familles et d’isoformes de CYP. Au cours
de l’évolution, ces gènes qui se sont considérablement diversifiés, ont vraisemblablement participé à
l’adaptation des organismes aux changements de biotope. Cette diversification est corrélée au passage
d’une atmosphère originellement réductrice à une atmosphère plus oxydante sous l’effet de la
production de dioxygène par les organismes photosynthétiques. La pression actuelle en oxygène a
ainsi crû rapidement de façon exponentielle avec le temps. Ceci serait une cause probable de la non
linéarité de l’évolution des CYPs.
Figure 1-9 Arbre phylogénique simplifié des cytochromes P450 (d'après Lewis, 2001). Les CYPs (CYP1 à 4)
qui interviennent dans le métabolisme des xénobiotiques sont annotés en rouge (où EMX signifie Enzyme du
métabolisme des Xénobiotiques). Il est admis que ces familles CYPs ont évolué puis divergé vers le monde animal
pour permettre une adaptation et/ou une protection vis-à-vis de composés nouveaux et/ou toxiques synthétisés par
les végétaux. Les CYP11A, 11B, 17,19 et 21 interviennent dans la synthèse d’hormones stéroïdiennes en
catalysant des réactions d’hydroxylations.
Occurrence, Distribution et Localisation 31
1.3 Occurrence, Distribution et Localisation

1.3.1 Occurrence et Distribution
Comme mentionné précédemment, les CYPs sont des enzymes ubiquitaires, largement
représentées dans tous les organismes vivants, de la bactérie aux mammifères, en passant par la plante
et les champignons (Nerbert et al., 1989a et b), bien qu’il semble que certaines espèces primitives de
bactéries en soient dépourvues. La répartition de ces CYPs au sein des différents organismes est
consultable sur le site (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html) de David Nelson, site
complet qui est tenu régulièrement à jour par l’auteur de façon bénévole depuis plus de 10 ans. On y
retrouve donc non seulement la répartition entre organismes et les statistiques sur les P450s, mais
également tout un ensemble d’informations relatives aux P450s. Il permet ainsi à n’importe quel
utilisateur d’avoir accès aux connaissances actuellement disponibles sur les P450s telles que les bases
de données ou encore les séquences de P450s. Concernant la répartition, à la date du 7 septembre 2007,
Nelson a répertorié pas moins de 7703 séquences de CYPs provenant de 866 familles différentes qui
se répartissent entre les animaux, les plantes, les champignons, les bactéries, les protistes et les archées.
Ces données sont issues d’un comptage et d’une vérification manuelle par l’auteur du site (cf. Tableau
1.4 et Figure 1-10). Elles mettent d’ailleurs en évidence une proportion très élevée de CYPs chez la
plante, phénomène qui s’explique en partie par le fait que de nombreux génomes ont été séquencés
chez la plante.
Tableau 1.4 Répartitions des CYPs dans les différents organismes vivants (source de Nelson)
Organismes Nombre de CYPs compté Nombre de familles de CYPs
Animaux 2740 109

Plantes 2675 94
Champignons 1231 309
Bactéries 813 290
Protistes 226 54
Archées 18 10
Total 7703 866
Les statistiques données ici ont été enregistrées le 7 septembre 2007.

Figure 1-10 Répartition des séquences (a) et des familles (b) de CYPs dans les différents organismes vivants.
On remarque que les CYPs sont largement représentés dans chez la plante et l’animal. Cela est lié à l’effort des
investigations dans chaque organisme.
Même si les P450s ont été caractérisés dans de nombreuses espèces telles que les oiseaux, les
poissons, les reptiles, les insectes, les mollusques, les arthropodes, les crustacés, les champignons, les
plantes et les bactéries (Schenkman et Griem, 1993 ; Pinot et al., 1999 ; Gorman et al., 1998 ; Chapple,
1998 ; Scott et al., 1998 ; Walker, 1998 ; Hallahan et al., 1993 ; Hallahan et West, 1995 ; Nelson, 1998)
(Une revue spéciale de « Comparative Biochemestry and Physiology » (Volume 121C, Nos. 1–3, 1998)
traite justement de ces P450s non mammifères), c’est pourtant chez les mammifères que le P450
suscitent le plus d’intérêt, en particulier les formes humaines de l’enzyme (Guenguerich, 1989a et b,
1992a–d, 1994, 1995a ; Guenguerich et al., 1998, 1992 ; Rendic et DiCarlo, 1997). En conséquence,
les P450s humains ont été intensément investis et étudiés, et les systèmes d’expression hétérologues
sont devenus à présent un moyen fiable d’analyse pour les interactions enzyme–substrat de P450s
isolés (Estabrook et al. 1991 ; Gonzalez et Korzerkwa, 1995).
1.3.2 Localisation
Chez les mammifères, les P450s sont présents dans la plupart des tissus, mais ils sont
particulièrement abondants en quantité et en diversité au niveau du foie (cf. Figure 1-11). Pour l’être
humain, le foie est un organe très important tant au niveau de sa corpulence physique que son rôle
fonctionnel. C’est le premier organe, après l’intestin grêle, à être en contact avec les xénobiotiques via
le système porte hépatique. Il représente en effet à lui seul 1/50e du poids total du corps humain. Il se
compose pour 70% de cellules parenchymateuse ou hépatocytes et pour 30% de cellules diverses dont
les cellules de Ito, les cellules composant les canicules biliaires et les cellules de Küpffer. Ses
fonctions sont nombreuses et variées : fondamentalement, le foie est impliqué dans la sécrétion et
l’évacuation de la bile par les canalicules biliaires, mais du fait qu’il soit extrêmement vascularisé et
qu’il soit situé à l’interface de l’appareil digestif et l’appareil circulatoire, il joue également un rôle
dans la distribution de nombreux métabolites issus de la nutrition. En outre, le foie est capable
d’assurer un grand nombre de fonctions métaboliques comme la synthèse des protéines plasmatiques,
des lipides (dont le cholestérol), de l’urée et le stockage et la libération du glucose dans le sang, la
production de substrats à haut potentiel énergétique, mais aussi le stockage de nombreuses vitamines.
Enfin, il joue un rôle central au cours du processus de détoxication.
Figure 1-11 Répartition des CYPs dans le foie Humain (d'après Guenguerich, 2005)
Ces deux dernières (fonctions de synthèse et de détoxication par le foie) ne sont en fait que le
reflet macroscopique des acteurs principaux de l’échelle microscopique : les CYPs. Les CYPs sont
donc en nombre abondant dans le foie, et plus précisément localisés dans les membranes du réticulum
endoplasmique (RE) des hépatocytes (Ruckpaul et Rein, 1984 ; Stier, 1976). Le RE est en effet une
structure lipidique particulière, très favorable aux échanges, et disposant d’une surface étonnamment
large (comprenant 7 à 11 m²/g du poids du foie) comparé à son volume, ce qui fait de lui la structure
idéale pour héberger les enzymes de Phase I comme les P450s (Lewis et Pratt, 1998 ; Gibson et Skett,
1994). Sachant que 12 à 15% du RE est composé de cytochromes P450, on peut estimer
approximativement que les P450s comptent pour un peu moins d’1% du poids total d’un hépatocyte
(Ruckpaul et Rein, 1984).
Figure 1-12 Localisation dans le réticulum endoplasmique lisse (source Nebert, 1987). Six à huit P450s se
regroupe autour d’une réductase qui leur apporte les électrons nécessaires au métabolisme des substrats.
Au sein de la membrane du RE, des études stœchiométrique (Finch et Stier, 1991 ; Schwarz, 1991)
ont suggéré que les P450s se regrouperaient par 6 ou par huit autour d’une réductase, un partenaire
fournisseur en électrons. Ces unités hexamèriques (ou octamèriques) subissent alors une diffusion
transversale à l’intérieur de cette membrane phospholipidique du RE, elle-même sujette à une
diffusion latérale au moyen du « flip-flop ». Par conséquent, les substrats relativement lipophiles se
retrouvent alors facilement acheminés vers le centre réactionnel des P450s afin d’y être métabolisés.
Bien que majoritairement concentrés au niveau du foie, les P450s sont également exprimés dans
d’autres organes et tissus (cf. Tableau 1.5) tels que le rein, les seins, la prostate (Williams et al., 2000a)
la peau, l’épithélium nasal, le placenta, le cerveau, le poumon, la rate, le pancréas et la région
gastro-intestinale (Waterman, 1992 ; Schenkmann et Griem, 1993 ; Hellmold et al., 1998 ; Hakkola et
al., 1998, 1996). Toutefois, même si les P450s sont identifiés dans ces autres organes, ils demeurent en
concentration faible et leur participation dans les biotransformations des xénobiotiques n’est pas bien
définie. Certains CYP (CYP11A et CYP11B) sont également présents du côté du feuillet externe de la
membrane nucléaire et dans la membrane interne des mitochondries (Montoliu et al., 1995). Ces
isoformes sont relativement peu impliquées dans la biotransformation des xénobiotiques mais elles
jouent un rôle important dans le métabolisme des composés endogènes comme les stéroïdes, le
cholestérol, la vitamine D3, et les acides biliaires.
Tableau 1.5 Expression tissulaire et cellulaire des CYPs

Tissus Types cellulaires
Foie Hépatocytes (surtout centrobulaires)

Cellules de Kupffer
Intestin Entérocytes
Poumon Cellules de Clara
Pneumocytes II
Cellules endothéliales
Rein Cellules tubulaires proximales
Cerveau Cellules endothéliales cérébrales
Cellules du plexus choroïdes
Peau Kératocytes
Autres :
Muqueuse Buccale Cellules épithéliales
Cœur Myocytes
Pancréas Cellules pancréatiques
Sang Leucocytes
Ovaire Cellules Lutéiniques
Testicule Cellules de Leydig
En raison de leur diversité, tant au niveau de leur localisation, de leur sélectivité et réactivités vis-
à-vis des substrats dans des espèces différentes (Guengerich, 1997), on comprend mieux pourquoi il
est relativement difficile d’étudier cette superfamille. Parfois, au sein même des mammifères, des
différences de comportements, d’inductibilités et de sélectivités sont observées (Lewis et al., 1998a ;
Soucek et Gut, 1992 ; Nedelcheva et Gut, 1994 ; Smith, 1991 ; Guenguerich, 1997). En conséquence,
il peut être parfois très difficile d’extrapoler des résultats obtenus à partir d’expériences menées sur
des rongeurs de laboratoire, par exemple, sur les résultats attendus de métabolisme de composé chez
l’Homme (Lewis et al., 1998a). On sait par ailleurs qu’il existe chez les mammifères une différence
sexuelle de P450s (Schenkman et al., 1967) et que les niveaux de P450s chez les individus varient en
fonction de leur régime alimentaire (Ioannides, 1999 ; Parke et Ioannides, 1994). Il existe enfin une
variation de facteurs cellulaires contrôlant l’expression de ces P450s dans les tissus, qui conduit à une
altération du niveau de ces enzymes dans les différents tissus (Wolff et Strecker, 1992). Chez l’homme,
cette variation se retrouve au niveau hépatique, en raison des différences génétiques liées aux groupes
ethnographiques et des changements phénotypiques (Price-Evans, 1993 ; Bachmann, 1996), dont
certains ont été associés à la susceptibilité au cancer (Crespi et al., 1991 ; Nebert et al., 1996 ; Crofts
et al., 1993 ; Puga et al., 1997).
1.4 Un repliement très conservé

1.4.1 De la bactérie aux mammifères : les premières structures X
La grande diversité des CYPs, tant au point de vue de sa composition en acides aminés, de ses
formes dans les différents organismes, que des différents substrats qu’ils sont en mesure de prendre en
charge, a été largement soulignée tout au long des précédents paragraphes. En dépit de cette diversité
importante et contre toute attente, tous les CYPs partagent une structure tertiaire, un repliement,
extrêmement conservé, de la bactérie, aux mammifères. Ce phénomène est d’autant plus remarquable
que les CYPs bactériennes et les CYPs des eucaryotes présentent une différence majeure liée à leur
localisation : à l’opposé de son homologue bactérien qui est cytoplasmique, les CYPs des eucaryotes
sont membranaires, ancrés à la membrane au moyen d’une courte séquence hydrophobe
transmembranaire de 20 à 30 acides aminés en N-terminale de la protéine.
C’est d’ailleurs en raison de leur solubilité que les premières structures de CYP à avoir été
publiées furent celles de bactéries. Celles d’eucaryotes sont en effet nettement plus difficiles à purifier
et à stabiliser au cours de leur extraction, les rendant moins favorable à une expérience de
cristallographie. Or, jusqu’à présent, les expériences de cristallographie par rayon X (RX)
produisent les modèles les plus fiables pour décrire la conformation tridimensionnelle de protéine – en
raison de leur taille trop importante, il n’est pas possible d’appliquer la méthode de résonance
magnétique nucléaire (ou RMN) sur les CYPs – dans un état solide (ces deux techniques seront
décrites en annexes). Ce qu’il faut retenir concernant la cristallographie, c’est que le cristal X d’une
structure n’est qu’un « instantané » (en anglais on utilisera le terme de « snapshot ») moléculaire de la
protéine. Elle correspond à un « cliché photographique » d’une situation dynamique du
fonctionnement de la protéine (où par exemple un ligand se lie à l’enzyme, ou au cours de processus
de métabolisation…). Même si un cristal donne beaucoup d’informations sur le repliement d’une
protéine, il ne tient pas en compte la protéine dans son vrai milieu et dans son fonctionnement habituel.
De plus, les contraintes de préparations pour une cristallographie sont nombreuses et il n’est pas
possible à ce jour de cristalliser une membrane lipidique ou un élément ancré dans une membrane
lipidique.
Ainsi, il y a encore moins d’une dizaine d’années, aucune structure de mammifère n’était publiée :
toutes les études et les hypothèses sur la structure et sur la fonction des P450s de mammifère
reposaient alors sur des structures connues de P450s bactériennes (ou micro-organismes). Jusqu’au
Un repliement très conservé 37
début des années 90, le seul cristal de P450 disponible est celui du P450cam (CYP101) provenant de
Pseudomonas putida (Poulos et al., 1985). Cette structure haute résolution est restée longtemps un
paradigme pour l’étude de la relation structure-fonction de P450 pendant plusieurs années, jusqu’à
l’obtention d’autres structures de P450s solubles, dont les principales sont répertoriées dans le Tableau
1.6. Parmi elles, les quatre premières structures qui ont vu le jour après P450cam, sont le P450BM3
(CYP102), le P450terp (CYP108), le P450eryF (CYP107) et le P450nor (CYP55). Ce n’est qu’au cours de
ces 7 dernières années qu’on assiste à un progrès considérable dans la résolution de structure de CYPs
de mammifères avec en 2000 le premier cristal de CYP2C5 un P450 de lapin (Williams et al., 2000c).
Celle-ci a été rendue possible au moyen de procédés particuliers qui ont consisté en la protection de la
partie C-terminale du P450 par un tag d’histidine et le remplacement de l’ancre hydrophobe
N-terminale par une chaîne hydrophile (une séquence MAKKTSSKGR dans le cas du CYP2C9
(Williams, 2003)) pour rendre les enzymes plus solubles. Il est généralement accepté que ces
changements opérés sur les CYPs de mammifères n’affectent en rien, ni leur repliement, ni leurs
fonctions dans la mesure où ils ne changent pas les paramètres d’activité ou de cinétique de l’enzyme
(Cosme et Johnson, 2000 ; von Wachenfeldt et al., 1997 ; Pernecky et al., 1993). A partir du moment
où l’on a compris comment cristalliser des structures de mammifère, d’autres P450s de mammifère ont
été résolus, tous en majorité de la famille 2, excepté les CYP3A4, CYP 8A1 et CYP1A2.
Entre la première structure de P450 soluble publiée en 1985 (Poulos et al., 1985) et la structure du
CYP2D6 humain résolue fin 2005 (Rowland et al., 2005) environs 140 structures tridimensionnelles
résolues par cristallographie ont été déposées à la PDB. À ce jour, on peut en répertorier environs 160,
bien d’autres sont déposées sur la PDB et attendent d’être publiées. Les progrès technologiques et les
moyens mis en œuvre pour l’étude de cette superfamille sont tels qu’on s’attend en moyenne à avoir
une à deux structures X par mois. La Figure 1-13 et la Figure 1-14 qui correspondent aux statistiques
de dépôt des structures de P450s sur la PDB illustrent justement ce phénomène. A noter que sur les
150 structures qu’on répertorie à ce jour, on peut identifier 29 formes différentes comprenant 19 P450s
solubles (dont 1 fongique) et 10 P450s microsomaux de mammifères (dont 8 humaines).
Tableau 1.6 Principales structures tridimensionnelles des P450s déposées à la PDB
CYP Organisme Entrées PDB Res (Å) Références (de la 1ere entrée)
Microorganismes
CYP 101 56 structures
Pseudomonas putida 1,63 (Poulos et al., 1987)
(P450cam) dont 2CPP
CYP 102 21 structures
Bacillus megaterium 2,00 (Ravicahndran et al., 1993)
(P450BM3) dont 2HPD
P450Terp Pseudomas sp. 1CPT 2,30 (Hasemann et al., 1994)
CYP 107 9 structures dont
Saccharopolyspora erythrea 2,35 (Cupp-Vickery et Poulos., 1995)
(P450eryF) 1OXA
CYP 55A1 Fusarium oxysporum 12 structures
2,00 (Park et al., 1997)
(P450nor) (fungique) dont 1ROM
5 structures dont
CYP 119 Sulfobus solfactaricus 1,93 (Yano et al., 2000)
1F4T
5 structures dont
CYP 51 Myobacterium tuberculosis 2,10 (Podust et al., 2001)
1E9X
3 structures dont
P450OxyB Amycolatopsis orientalis 1,70 (Zerb et al., 2002)
1LFK
5 structures dont
P450Epok Polyangium cellulosum 2,65 (Nagano et al., 2003)
1Q5E
4 structures dont
CYP 121 Myobacterium tuberculosis 1,06 (Leys et al., 2003)
1N40
P450OxyC Amycolatopsis orientalis 1UED 1,90 (Pylypenko et al., 2003)
CYP 152A1 Bacillus subtilis 1IZO 2,10 (Lee et al., 2003)

2 structures dont
CYP 175A1 Thermus thermophilus 1,80 (Yano et al., 2003)
1N97
CYP 154C1 Streptomyces coelicolor 1GWI 1,92 (Podust et al., 2003)
CYP 154A1 Streptomyces coelicolor 1ODO 1,85 (Podust et al., 2004)
P450st Sulfobus tokodaii IUE8 3,00 (Oku et al., 2004)

Streptomyces coelicolor 5 structures dont
CYP 158A2 1,50 (Zhao et al., 2005)
A3(2) 1S1F
3 structures dont
P450PKIC Srteptomyces venezuelae 1,75 (Sherman et al., 2006)
2C7X
Rhodopseudomonas
CYP 199A2 2FR7 2,01 (Xu et al., en attente)
palustris
Mammifères
3 structures dont
CYP 2C5 Oryctolagus cuniculus 3,00 (Williams et al., 2000)
1DT6
3 structures dont
CYP 2C9 Homo sapiens 2,55 (Williams et al., 2003)
1OG5
CYP 2C8 Homo sapiens 1PQ2 2,70 (Schoch et al., 2004)
3 structures dont
CYP 2B4 Oyctolagus cuniculus 1,90 (Scott et al., 2004)
1SUO
6 structures dont
CYP 3A4 Homo sapiens 2,05 (Yano et al., 2004)
1TQN
6 structures dont
CYP 2A6 Homo sapiens 1,90 (Yano et al., 2005)
1Z10
CYP 2D6 Homo sapiens 2F9Q 3,00 (Rowland et al., 2006)
CYP 8A1 Homo sapiens 2IAG 2,15 (Chiang et al., 2006)

CYP 2R1 Homo sapiens 2OJD 2,70 (Strushkevich et al., en attente)
CYP 1A2 Homo sapiens 2HI4 1.95 (Sansen et al., en attente)
Figure 1-13 Statistiques sur le nombre de structures de P450s publiées dans la PDB. La partie de
l’histogramme en jaune représente le nombre de structures bactériennes de P450s publiées dans la PDB, en rouge
le nombre de structures de mammifères. La première structure de 1985 du P450cam par l’équipe de Poulos n’est
plus disponible (PDB 1CPP). Les structures de mammifères commencent à apparaître en nombre depuis 2000,
bien que généralement, ce sont les structures solubles qui soient les plus publiées.
Figure 1-14 Effectif cumulé des structures de P450s publiées depuis 1987. Le nombre de templates est
également montré, en jaune pour les bactériens et en rouge pour les microsomaux.
1.4.2 Un repliement général pour tous
En dépit des disparités évoquées précédemment, un nombre suffisant de structures a été résolu
pour confirmer que le repliement général et la topographie des P450s sont globalement identiques pour
tous les P450s, solubles ou membranaires, quelle que soit leur classe d’appartenance (cf. Figure 1-15).
Nombreux sont les articles où cette conservation structurale soulignée par comparaison des structures
entre elles avec le dernier en date, celui de M. Otyepka (Oteypka et al., 2006) qui fait un inventaire
des différences et conservations entre les structures des P450s de mammifères. Ce repliement est de
façon surprenante spécifique au P450s : à ce jour, il n’existe aucune autre protéine non-P450 publiée
qui partage cette structure. Les structures ont une forme de prisme triangulaire dont la hauteur mesure
environ 65 Å et la base 35 Å. Les éléments de structures secondaires suivent une nomenclature établie
sur le P450cam et donnée par Poulos en 1985 (Poulos et al., 1985). Cette nomenclature s’est vue bien
entendu modifiée légèrement au fur et à mesure de la découverte de nouvelles structures secondaires
d’autres P450s. Un schéma topographique du P450BM3 est représenté en Figure 1-16. Les hélices α
sont identifiées par des lettres majuscules (auxquels des « ‘ » ou « ‘’ » viennent s’ajouter) tandis que
les feuillets β sont désignés par des chiffres de 1 à 5. Sur cette figure, deux régions dans les structures
se distinguent : une région riche en hélices α, bien structurée à droite et une seconde région constituée
principalement de feuillets β et de boucles, donc plus flexible, à gauche et en haut. L’hème situé au
centre de la molécule et de cette vue, semble assez accessible de la surface. Dans la région riche en
hélices α, la longue hélice I de 32 résidus environ traverse la molécule de part et d’autres de la
molécule. Au centre de cette hélice I, près du fer de l’hème, se trouve une thréonine (en position 252
dans la numérotation du P450cam) impliquée dans l’activation de l’oxygène moléculaire. Le rôle de la
thréonine sera décrit dans les paragraphes à venir. Enfin, cette longue hélice I se retrouve dans toutes
les P450s et sert souvent d’ancrage lors d’alignement structural.
Les régions structurales les plus conservées dans toutes les structures sont celles qui participent à
la chimie d’activation de l’oxygène par le complexe hème-thiolate (Figure 1-16). La première d’entre
elles, contient une partie de l’hélice L et la cystéine proximale. Afin d’assurer une stabilisation du
ligand cystéinate, une structuration particulière de la boucle contenant la cystéine (Cys-pocket) est
observée dans toutes les structures. La seconde région relativement bien conservée est située du côté
distal de l’hème et fait partie de l’hélice I.
Figure 1-15 Exemples représentatifs de structures tridimensionnelles illustrant le repliement similaire des
P450s (images générées avec Pymol avec les structures PDB : 1PHA, 2HPD, 1NR6 et 1TQN). Les hélices sont
représentées en rubans rouges, les feuillets en flèches jaunes et l’hème en représentation sphérique bleue. Les
petites flèches noires délimitent l’hélice I qui a servi pour aligner les structures dans la présente image. Cette
hélice I est présente sur toutes les structures de P450. Elle parcourt la molécule de part et d’autres, ici de haut en
bas et de droite vers la gauche. Les 4 structures adoptent une forme relativement conservée, en dépit de quelques
différences. La structure du CYP3A4 (1TQN) présente une délétion de quelques résidus dans sa séquence,
correspondant à une région qui ne diffracte pas aux RX.
Les parties les plus variables dans les structures quant elles, correspondent à celles qui forment la
cavité distale au dessus de l’hème, comprenant le site actif et les canaux potentiels d’accès des
substrats comme les hélices B’, F, G, et la boucle F-G (ou les hélices F’ et G ‘ chez les P450s
membranaires).
Figure 1-16 (A) Topologie et éléments de structures secondaires du cytochrome P450BM3 reproduit de la p.
157 de Cytochrome P450 (P.R. Ortiz de Montellano, ed.) d’après Graham et Peterson, 1995). Les hélices sont
représentées par des barres noires dont la longueur est approximativement proportionnelle à la longueur de l’hélice.
Les brins β des feuillets sont représentés par des flèches. L’hème est représenté par un carré en N-terminal de
l’hélice L. Avec quelques changements mineurs, cette topographie peut être généralisée à tous les CYPs ; (B)
structure 3D du P450BM3 (PDB 2HPD). En raison de l’angle de vue, certaines hélices et certains feuillets n’ont
pas pu être annotés. Les hélices α sont annotées en lettre majuscule de A à L et les feuillets β désignés par les
chiffres 1 à 5. Sur les deux figures, on observe la présence de deux régions: une riche en feuillets β, annotée β-
domain et l’autre riche en hélices α, annotée α-domain.
1.4.2.1 Le site actif de fixation des substrats

Le site actif est constitué dans la majeur partie du temps d’une cavité hydrophobe, généralement
bordée par les hélices B’, F, G et I, la boucle C-terminale et la boucle située après l’hélice K. Les
CYPs membranaires se différencient de leurs homologues bactériens par la structuration en une ou
deux hélices de la boucle F-G. Ces hélices, notées F’ et G’, forment le toit du site actif, comme pour la
boucle F-G chez les CYPs cytosolubles. De manière générale, les éléments structuraux bordant le site
actif des P450s solubles et membranaires sont les mêmes. Néanmoins, l’arrangement spatial de ces
hélices ou boucles est différent, mis à part le positionnement de l’hélice I comme le montre la Figure
1-17.
Figure 1-17 Comparaison de structures secondaires bordant les cavités du P450cam (vert) et CYP 2C8 (bleu),
en vue de dessus (A) et en vu de profil (B) par rapport à l’hème. Les hélices sont représentées en ruban tandis que
l’hème, en rouge est représenté en bâtonnet. Alors que les hélices I coïncident à peu près, on observe un
positionnement diffèrent pour les hélices F’, F, G, G’ et B’
En se basant sur la structure tridimensionnelle du P450cam, ainsi que sur les alignements de
séquences des CYPs membranaires de la famille 2 sur celle du CYP 101A (P450cam) et des
informations prédictives de structures secondaires sur les CYP2, O. Gotoh a prédit la position de six
régions d’interaction possibles entre le substrat et l’apoprotéine (Gotoh, 1992) (cf. Figure 1-18).
Désignés sous le terme de SRS (pour « Substrate Recognition Site »), ces zones sont réparties tout au
long de la séquence des P450s, recouvrant environ 16% des résidus totaux de la protéine. Ces SRSs
correspondent à des zones fortement variables en termes de séquence et ont été repérées grâce à
l’observation de substitutions non « synonymes » par l’auteur. Toutes les mutations reportées ou les
fragments chimériques ayant significativement affecté les spécificités de reconnaissance du substrat
aux enzymes CYP2 parentaux tombent ou chevauchent l’une de ces six régions.
La reconnaissance d’une grande variété de substrats par les P450s pourrait donc être expliquée par
le positionnement différent des éléments structuraux bordant le site actif, mais également par la
variabilité des séquences au sein des zones en interaction avec les substrats.
A
1 Rat 2A1 MLD---TGLLLVVILASLSVMLLVSLWQQ-KIRGRLPPGPTPLPFIGNYLQLNTKDVYSSITQLSERYG
1 Souris 2A5 MLT---SGLLLVAAVAFLSVLVLMSVWKQRKLSGKLPPGPTPLPFIGNFLQLNTEQMYNSLMKISQRYG
1 Rat 2B2 MEP---S---ILLLLALLVGFLLLLVRGHPKSRGNFPPGPRPLPLLGNLLQLDRGGLLNSFMQLREKYG
1 Humain 2F1 MDS---I---STAILLLLLALVCLLLTLSSRDKGKLPPGPRPLSILGNLLLLCSQDMLTSLTKLSKEYG
1 Rat 2G1 MT-------------LCLSCLLILIAWKRTSRGGKLPPGPTPIPFLGNLLQVRIDATFQSFLKLQKKYG
1 Lapin 2C3 MDL---L----IILGICLSCVVLLSLWKKTHGKGKLPPGPTPLPVVGNLLQLETKDINKSLSMLAKEYG
1 Lapin 2C4 MDP---V----AGLVLGLCCLLLLSLWKQNSGRGKLPPGPTPFPIIGNILQIDVKDISKSLTKFSERYG
1 Chien 2C21 MXX---X----XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXKLPPGPTPLPIIGNILQINTKNVSKSLSKLAENYG
1 Rat 2D1 MAV---LGIT-IALLVWVATLLVISIWKKIYNSWNLPPGPFPLPILGNIFQLDLKDIPKSFTKLAKRFG
1 Rat 2E1 MELLNGTGLWSMAIFTVIFILLVDLMHRRHRWTSRYPPGPVPWPVLGNLLQVDLSNMPYSLYKLQHRYG
1 P.putida 101A1 MTT-------ETIQSNANLAPLPPHVPEHLVFDFDMYNPSNLSAGVQEAWAV--------LQESNV--P
1 B B’ SRS-1 C D
72 PVFTIHLGPRRVVVLYGYDAVKEALVDQAEEFSGRGEQATYNT---LFKGYGVAFSS-GERAKQLRRLSIATLRDFGVGKRGVEERILEE
76 PVFTIYLGPRRIVVLCGQEAVKEALVDQAEEFSGRGEQATFDW---LFKGYGVAFSS-GERAKQLRRFSIATLRDFGVGKRGIEERIQEE
70 DVFTVHLGPRPVVMLCGTDTIKEALVGQAEDFSGRGTIAVIEP---IFKEYGVIFAN-GERWKALRRFSLATMRDFGMGKRSVEERIQEE
73 SMYTVHLGPRRVVVLSGYQAVKEALVDQGEEFSGRGDYPAFFN---FTKGNGIAFSS-GDRWKVLRQFSIQILRNFGMGKRSIEERILEE
63 SVFTVYFGPRPVVILCGHEAVKEALVDQADDFSGRGEMPTLEK---NFQGYGLALSN-GERWKILRRFSLTVLRNFGMGKRSIEERIQEE
71 SIFTLYFGMKPAVVLYGYEGVIEALIDRGEEFSGRGIFPVFDR---VTKGLGIVFSS-GEKWKETRRFSLTVLRNLGMGKKTIEERIQEE
71 PVFTVYLGMKPTVVLHGYKAVKEALVDLGEEFAGRGHFPIAEK---VNKGLGIVFTN-ANTWKEMRRFSLMTLRNFGMGKRSIEDRVQEE
72 PVFTVYFGMKPTVVLYGYEAVKEALIDRSEEFSGRGHFPLLDW---TIQGLGIVFSN-GEKWKQTRRFSLTVLRNMGMGKKTVEDRIQEE
72 PVFTLHLGSRRIVVLHGYKAVKEVLLNHKNEFSGRGDIPVFQ----EYKNKGIIFNN-GPTWKDVRRFSLSILRDWGMGKQGNEARIQRE
76 DVFSLQKGWKPMVIVNRLKAVQEVLVTHGEDTADRPPVPIFKCLGVKPRSQGVILASYGPEWREQRRFSVSTLRTFGMGKKSLEEWVTKE
65 DLVWTRCNGGHWIATRG-Q-LIREAYEDYRHFSSECPFIPREA---GEAYDFIPTSMDPPEQRQFRALANQVV-GMPVVDK-LENRIQEL
5 E F SRS-2 SRS-3
158 AGYLIKMLQGTCGAPIDPTIYLSKTVSNVISSIVFGERFDYEDTEFLSLLQMMGQMNRFAASPTGQLYDMFHSVMKYLPGPQQQIIKVTQ
162 AGFLIDSFRKTNGAFIDPTFYLSRTVSNVISSIVFGDRFDYEDKEFLSLLRMMLGSFQFTATSMGQLYEMFSSVMKHLPGPQQQAFKELQ
156 AQCLVEELRKSQGAPLDPTFLFQCITANIICSIVFGERFDYTDRQFLRLLELFYRTFSLLSSFSSQVFEFFSGFLKYFPGAHRQISKNLQ
159 GSFLLAELRKTEGEPFDPTFVLSRSVSNIICSVLFGSRFDYDDERLLTIIRLINDNFQIMSSPWGELYDIFPSLLDWVPGPHQRIFQNFK
149 AGYLLEELHKVKGAPIDPTFYLSRTVSNVICSVVFGKRFDYEDQRFRSLMKMINESFVEMSMPWAQLYDMYWGVIQYFPGRHNRLYNLIE
157 ALCLIQALRKTNASPCDPTFLLFCVPCNVICSVIFQNRFDYDDEKFKTLIKYFHENFELLGTPWIQLYNIFP-ILHYLPGSHRQLFKNID
157 ARCLVEELRKTNALPCDPTFILGCAPCNVICSVILHNRFDYKDEEFLKLMERLNENIRILSSPWLQVYNNFPALLDYFPGIHKTLLKNAD
158 ALYLVEALKKTNASPCDPTFLLGCAPCNVICSIIFQNRFEYDDKDFLTLLEYFHENLLISSTSWIQLYNAFPLLIHYLPGSHHVLFKNIA
157 AQFLVEELKKTKGQPFDPTFLIGCAPCNVIADILFNKRFDYNDKKCLRLMSLFNENFYLLSTPWIQLYNNFADYLRYLPGSHRKIMKNVS
166 AGHLCDAFTAQAGQSINPKAMLNKALCNVIASLIFARRFEYEDPYLIRMVKLVEESLTEVSGFIPEVLNTFPALLR-IPGLADKVFQGQK
148 ACSLIESLRPQ--GQCNFTEDYAEPFPIRIFMLLAGL-PEEDIPHLKYLTDQMTR-PDGS----------------------MTFAEAKE
G H 2 SRS-4 I J
248 KLEDFMIEKVRQNHSTLDP-NSPRNFIDSFLIRMQEEK-NGNSEFHMKNLVMTTLSLFFAGSETVSSTLRYGFLLLMKHPDVEAKVHEEI
252 GLEDFITKKVEHNQRTLDP-NSPRDFIDSFLIRMLEEKKNPNTEFYMKNLVLTTLNLFFAGTETVSTTLRYGFLLLMKHPDIEAKVHEEI
246 EILDYIGHIVEKHRATLDP-SAPRDFIDTYLLRMEKEKSNHHTEFHHENLMISLLSLFFAGTETGSTTLRYGFLLMLKYPHVTEKVQKEI
249 CLRDLIAHSVHDHQASLDP-RSPRDFIQCFLTKMAEEKEDPLSHFHMDTLLMTTHNLLFGGTKTVSTTLHHAFLALMKYPKVQARVQEEI
239 ELKDFIASRVKINEASFDP-SNPRDFIDCFLIKMYQDKSDPHSEFNLKNLVLTTLNLFFAGTETVSSTLRYGFLLLMKYPEVEAKIHEEI
246 GQIKFILEKVQEHQESLDS-NNPRDFVDHFLIKMEKEKHKKQSEFTMDNLITTIWDVFSAGTDTTSNTLKFALLLLLKHPEITAKVQEEI
247 YTKNFIMEKVKEHQKLLDV-NNPRDFIDCFLIKMEKEN---NLEFTLGSLVIAVFDLFGAGTETTSTTLRYSLLLLLKHPEVAARVQEEI
248 NQFKFISEKIKEHEESLNF-SNPRDFIDYFLIKIEKEKHNKQSEFTMDNLIITIWDVFSAGTETTSTTLRYGLLVLLKHPDVTAKVQEEI
247 EIKQYTLEKAKEHLQSLDI-NCARDVTDCLLIEMEKEKHSQEPMYTMENVSVTLADLFFAGTETTSTTLRYGLLILMKYPEIEEKLHEEI
255 TFMALLDNLLAENRTTWDPAQPPRNLTDAFLAEVEKAKGNPESSFNDENLRMVVVDLFTAGMVTTATTLTWALLLMILYPDVQRRVQQEI
212 ALYDYLIPIIEQRRQ-----KPGTDAISIVANG-Q----VNGRPITSDEAKRMCGLLLVGGLDTVVNFLSFSMEFLAKSPEHRQELIERP
K SRS-5 3 4 3
336 EQVIGRNRQPQYEDHMKMPYTQAVINEIQRFSNLAPLGIPRRIIKNTTFRGFFLPKATDVFPILGSLMTDPKFFPSPKDFDPQNFLDDKG
341 DRVIGRNRQPKYEDRMKMPYTEAVIHEIQRFADMIPMGLARRVTKDTKFRDFLLPKGTEVFPMLGSVLKDPKFFSNPKDFNPKHFLDDKG
335 DQVIGSHRPPSLDDRTKMPYTDAVIHEIQRFADLAPIGLPHRVTKDTMFRGYLLPKNTEVYPILSSALHDPQYFDHPDTFNPEHFLDADG
338 DLVVGRARLPALKDRAAMPYTDAVIHEVQRFADIIPMNLPHRVTRDTAFRGFLIPKGTDVITLLNTVHYDPSQFLTPQEFNPEHFLDANQ
328 NQVIGTHRTPRVDDRAKMPYTDAVIHEIQRLTDIVPLGVPHNVIRDTHFRGYFLPKGTDVYPLIGSVLKDPKYFRYPEAFYPQHFLDEQG
335 EHVIGRHRSPCMQDRTRMPYTDAVMHEIQRYVDLVPTSLPHAVTQDIEFNGYLIPKGTDIIPSLTSVLYDDKEFPNPEKFDPGHFLDESG
333 ERVIGRHRSPCMQDRSHMPYTDAVIHEIQRFIDLLPTNLPHAVTRDVKFRNYFIPKGTDIITSLTSVLHDEKAFPNPKVFDPGHFLDESG
337 HRVVGRHRSPCMQDRSCMPYTDAVVHEIQRYIDLVPNNLPHSVTQDIKFREYLIPKGTTILTSLTSVLHDEKGFPNPDQFDPGHFLDENG
336 DRVIGPSRVPAVRDRLDMPYMDAVVHEIQRFINLVPSNLPHEATRDTVFQGYVIPKGTVVIPTLDSLLYDSHEFPDPEKFKPEHFLNENG
345 DEVIGQVRCPEMTDQAHMPYTNAVIHEVQRFGDIAPLNLPRITSCDIEVQDFVIPKGTTLIINLSSVLKDETVWEKPHRFHPEHFLDAQG
292 E------------------RIPAACEELLRRFSLV--ADGRILTSDYEFHGVQLKKGDQILLPQM-----LSGL-DERENACPMHVDFSR
6 L 5 SRS-6
426 QLKKNAAFLPFSTGKRFCLGDGLAKMELFLLLTTILQNFRFKFPMKLEDINESPKPLGFTRIIPKY--TMSFMPI---- 492
431 QFKKNDAFVPFSIGKRYCFGEGLARMELFLFLTNIMQNFHFKSTQAPQDIDVSPRLVGFATIPPTY--TMSFLSR---- 494
425 TLKKSEAFMPFSTGKRICLGEGIARNELFLFFTTILQNFSVSSHLAPKDIDLTPKESGIAKIPPTY--QICFSAR---- 491
428 SFKKSPAFMPFSAGRRLCLGESLARMELFLYLTAILQSFSLQPLGAPEDIDLTPLSSGLGNLPRPF--QLCLRPR---- 491
418 RFKKNDAFVAFSSGKRICVGEALARMELFLYFTSILQRFSLRSLVPPADIDIAHKISGFGNIPPTY--ELCFMAR---- 484
425 NFKKSDYFMPFSAGKRACVGEGLARMELFLLLTTILQHFTLKPLVDPKDIDPTPVENGFVSVPPSY--ELCFVPV---- 489
423 NFKKSDYFMPFSAGKRMCVGEGLARMELFLFLTSILQNFKLQSLVEPKDLDITAVVNGFVSVPPSY--QLCFIPI---- 487
427 SFKKSDYFMAFSAGKRVCVGEGLARMELFLLLTNILQHFTLKPLVDPKDIDTTPIANGLGATPPSY--KLCFVPV---- 484
426 KFKYSDYFKAFSAGKRVCVGEGLARMELFLLLSAILQHFNLKSLVDPKDIDLSPVTVGFGSIPPQF--KLCVIPRS--- 493
435 NFVKHEAFMPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTCLLQRFSFSVPVG-QPRPSTHGFFAFPVAPLPY--QLCAVVREQGL 504
356 Q-K-VS-HTTFGHGSHLCLGQHLARREIIVTLKEWLTRIPDFSIAPGAQIQHKSGIVSGVQALPLVWDPATTKAV---- 415
Figure 1-18 Alignement de séquences multiples entre les CYP2 membranaires et le P450cam (source Gotoh,
1992). Les régions correspondant aux hélices et aux feuillets du P450cam sont encapsulés dans un cadre à trait
plein. Les zones surlignées en gris correspondent aux résidus de liaison au substrat dans le P450cam (Laughton et
al., 1990). Les SRSs sont représentés dans un cadre rouge à trait en pointillé. L’alignement diffère légèrement de
la publication de Gotoh en raison des séquences sélectionnées. Il existe une différence de nomenclature entre cet
alignement donné par Gotoh et le schéma (A) (celui d’un BM3) de la Figure 1-16. Ainsi, le premier feuillet 5 sur
l’alignement, correspond en fait au feuillet 3 de la figure, le premier feuillet 2 à 5, les feuillets entre K et L (3-4-3)
correspondent aux feuillets 1-2-1 (avec aussi un feuillet 6 avant le feuillet 1) et le dernier feuillet (5) correspond
aux feuillets 3-4-3.
1.4.2.2 Interaction avec la CPR

Avec les structures résolues soit par RX, soit par RMN, de la putidarédoxine de Pseudomonas
putida (protéine qui se couple au P450cam pour lui fournir des électrons), de nombreux résidus chargés
négativement ont été observés en surface de la protéine, suggérant qu’ils pourraient être dirigés vers le
CYP. Il en a donc été déduit à l’époque que le P450cam interagissait avec sa protéine de transfert
d’électrons par interaction électrostatique, au moyen de ses résidus chargés positivement. Cette
hypothèse s’est ensuite vue confirmée lorsque le cristal de P450BM3 a pu être étudié. Ce CYP a la
particularité d’être lié covalemment à sa CPR, montrant ainsi une surface de contact avec la CPR en
position proximale du P450, chargée positivement dans l’ensemble et définie par les hélices B, C et K.
La résolution tridimensionnelle de la totalité de la CPR de rat (Wang et al., 1997), puis la

résolution partielle de la CPR humaine (Zhao et al., 1999) ont permis de mieux comprendre les
interactions entre ces P450s de classe II et la CPR. De façon analogue aux P450s membranaires, la
cristallisation d’une CPR n’est possible qu’après suppression de la partie N-terminale hydrophobe et
transmembranaire. En revanche, des études enzymatiques ont montré que chez les mammifères, la
CPR dépourvue de sa partie transmembranaire n’est plus en mesure de se coupler avec les P450
membranaires, ce qui démontre l’importance de la membrane dans l’orientation spatiale optimale des
deux enzymes entre elles (Paine et al., 2005). Par ailleurs, la surface d’interaction supposée entre le
P450 microsomal et la réductase semble être la même que celle décrite pour les P450s solubles. Ce
constat ne tient pas compte de la stœchiométrie mesurée, d’un ratio 1/8 pour les P450/réductase décrit
précédemment. Certaines hypothèses stipuleraient que les réductases tournent autour d’un P450 à
l’image d’un barillet de pistolet. Aucune information ne permet à ce jour de vérifier cette hypothèse.
1.4.3 Structures de complexes P450-substrats. (Exemple du CYP 2C5)
Parmi les structures de CYPs déposées sur la PDB, nombreuses sont celles co-cristallisées de leur
substrat. Parmi celles de mammifères, les premières à avoir été réalisées sont celles du
CYP2C5/3LVdH, par les équipes d’E.F. Johnson et D. Mansuy. Historiquement, le CYP2C5 (code
PDB 1DT6) fut la première structure de mammifère à avoir été réalisée et publiée. Cette dernière a
subi quelques mutations et délétions afin d’être cristallisée dans les meilleures conditions. Par la suite,
deux autres structures de ce CYP 2C5 ont été réalisées à de meilleurs résolutions, toutes deux
co-cristallisées à un substrat dont la taille et la polarité diffèrent : le diclofénac (DIF) et le 4-méthyl-N-
méthyl-N(2-phényl-2H-pyrazol-3-yl)benznesulfonamide (DMZ) (Marquest-Soares et al., 2003). Ce fut
d’ailleurs les premières structures de complexes P450s de mammifère : celui avec le DMZ est trouvé
sous le code PDB 1N6B et celui avec le DIF, 1R6B. Par superposition différentielle de ces trois
structures, il est possible d’observer quelques comportements de la protéine en présence ou absence de
son substrat.
Tableau 1.7 Résidus du site actif du CYP2C5 en contact avec le DMZ (Wester et al., 2003a) et le DIF (Wester et al., 2003b)
Résidus en contact
SRS
Communs aux 2 substrats Spécifique du DMZ Spécifique du DIF
SRS-1 L103, A113, A114 V106 V100

SRS-2 N204, V205 L201, (L208, L213) –
SRS-3 – A237, I240 –
SRS-4 D290, G293, A294, T298 S289 –
SRS-5 L359, L363 – –
SRS-6 F473, V474 – –
Les résidus du 2C5 en contact avec le DMZ ou le diclofénac sont quasiment les mêmes (cf.
Tableau 1.7), et ne présentent pas de différence majeure de polarité. Lorsqu’un substrat se fixe au sein
de son site actif, le CYP 2C5 montre une adaptabilité importante des éléments structuraux bordant la
cavité du site actif en fonction de la taille et de la polarité du composé (cf. Figure 1-19) :
- Ainsi la présence dans le site actif d’un composé faiblement polaire comme le DMZ
correspond à une conformation fermée du P450. La protéine se contracte ainsi autour du
substrat, ce qui a pour conséquence de chasser l’eau présente dans la cavité du site actif
renforçant alors les interactions favorables avec le substrat. Le déplacement observé d’hélices
permettrait donc de boucher les canaux par lesquels pourraient rentrer les molécules d’eau.
Conjointement, les deux hélices F et G se rapprochent alors de l’hème par translation
perpendiculaire à l’axe de l’hélice I. D’autre part, la boucle B-C se structure pour former une
petite hélice B’ qui permet d’optimiser les contacts de type hydrophobe avec le substrat. Cette
région fait d’ailleurs partie du SRS-1.
- Globalement, les modifications du site actif du CYP 2C5 induites par la fixation du DIF sont
analogues à celles observées avec le DMZ (compaction autour du substrat, structuration de la
boucle B’, fermeture des différents canaux). Cependant, le diclofénac est plus petit que le
DMZ et porte une fonction chargée (COOH) qui pointe vers l’extrémité d’un canal. Le reste
du canal est comblé alors par un réseau de molécules d’eau, stabilisé par les différents résidus
du canal (Figure 1-19 B).
Figure 1-19 Adaptations conformationnelles du site actif du CYP 2C5/3LVdh lors de la fixation du DMZ (A)
ou du DIF (B). (d’après Wester et al., 2003a, b). Dans les deux figures, la structure du CYP 2C5/3LVdH sans
substrat est représentée en orange. Les portions d’hélices sont représentées en ruban. On observe ici pour les deux
cas un structuration de l’hélice B’. Pour le DFI, un réseau de molécules d’eau apparaît pour combler le canal.
1.4.4 Canaux potentiels d’accès au site actif
1.4.4.1 Premiers constats sur les CYPs solubles

Le premier cristal du P450cam complexé avec le camphre a révélé de façon inattendue un site actif
profondément enfoui au sein de la protéine, entraînant par la même occasion une série de questions
portant sur l’accessibilité des substrats au site actif. En effet, entre les structures du P450cam complexé
ou non avec un camphre, aucun canal parfaitement défini n’est constaté. En revanche, les facteurs
thermiques (B-factor) des structures X annotés dans le fichier au format PDB (un fichier formaté
utilisé pour décrire les protéines publiées dans la PDB), montrent une flexibilité possible des hélices
B’, F et G. Dans l’article de Poulos (Poulos et al., 1987), les auteurs ont suggéré que l’hélice B’, très
flexible, permettrait l’entrée du substrat vers le site actif. Plusieurs études menées par d’autres groupes,
ont contribué à valider cette hypothèse dont le travail de Dunn et al (Dunn et al., 2002) qui offre une
vue d’une structure RX du P450cam co-cristallisé avec un analogue du camphre (cf. Figure 1-20). Dans
ce cristal, on peut observer que l’analogue occupe tout un canal d’accès qui se forme par déplacement
de l’hélice B’ et de la boucle B-C. De nombreux travaux sur les P450s solubles ont par la suite
confirmé ce résultat, en apportant des preuves de la présence d’autres canaux possibles dans certains
P450s, en fonction du substrat utilisé (Poulos et Johnson, 2005 ; Cojocaru et al., 2007).
Figure 1-20 P450cam co-cristallisé avec un analogue du camphre (PDB 1LWL) (d'après Dunn et al., 2002).
L’analogue du camphre est représenté en sphère orangé au centre du site. Du fait de sa longueur important, il
occupe tout un canal d’accès avec la partie fluorescente à l’extérieur de l’enveloppe protéique.
1.4.4.2 Identification des canaux sur les CYPs de mammifères

Contrairement aux CYPs solubles, les CYPs microsomaux ont une boucle F-G beaucoup plus
longue qui se structure généralement en deux petites hélices F’ et G’. Cette région interagit beaucoup
avec la région en feuillets β de la partie N-terminale et probablement avec la membrane, limitant les
possibilités d’ouverture évoquées précédemment chez les P450 solubles. Cependant, l’hélice B’ reste
encore très flexible et peut donc jouer un rôle dans l’ouverture d’un canal d’accès aux substrats. Ainsi,
à partir des structures du CYP 2C5/3LVdH précédemment décrites, E.F. Johnson a proposé un canal
d’accès aux substrats dont l’entrée serait délimitée par les hélices B’, I et G et par la boucle B’-C
(Wester et al., 2003a). A l’instar de leur homologue soluble, l’arrivée de nouvelles structures avec et
sans ligand ont permis de découvrir d’autres canaux visibles. La structure la plus riche en informations
reste celle du CYP 2B4 de lapin sans substrat (Scott et al., 2003). Cette structure présente une large
ouverture entre les hélices F et G d’une part et l’hélice B’ d’autre part. L’ouverture de ce canal est telle,
qu’une histidine d’un autre monomère de CYP 2B4 vient complexer le fer. Deux autres structures du
CYP 2B4 ont été ensuite publiées toutes deux complexées avec un substrat de taille différente. L’une
d’elle (PDB 1SUO) présente un substrat 4-(4-chlorophenyl)imidazole – CPI – qui met en évidence la
très grande flexibilité de la protéine dans la région décrite (Scott et al., 2004 ; Zhao et al., 2006). (cf.
Figure 1-21)
Figure 1-21 Comparaison des structures du CYP 2B4 (A) sans substrat (PDB 1PO5); (B) avec le CPI (PDB
1SUO). Pour les deux structures, l’hème figure en rouge en style bâtonnet, les hélices α sont représentées en ruban
rouge, les brins β en flèches jaunes. Le CPI sur la figure (B) est représenté en bâtonnet orange, au dessus de
l’hème. Dans la structure sans ligand (A), les hélices F et G sont éloignées du plan de l’hème et la boucle B-C est
structurée de façon différente à celle de la seconde structure. D’après Scott et al., 2004 ; Zhao et al., 2006.
Des analyses par dynamique moléculaire (MD) (la technique sera décrite dans le prochain
chapitre) d’expulsion de substrat menées par l’équipe de R.C Wade ont permis de compléter ces
hypothèses sur l’accès au site actif, en démontrant la présence possible d’autres canaux en fonction des
substrats utilisés et montrent que les canaux d’entrée peuvent varier selon le substrat à métaboliser.
(Ludemann et al., 2000 ; Winn et al., 2002 ; Wade et al., 2004 ; Schleinkofer et al., 2005). Ces
techniques de MD ont permis notamment de faire apparaître des canaux lors d’observation de la
protéine en mouvement, canaux qui n’étaient pas percevables sous observation figée de la structure
RX.
1.4.4.3 Bilan des canaux d’entrée et de sortie, selon Cojocaru et al.(Cojocaru et al., 2007)
V. Cojocaru a récemment publié un article faisant le bilan de toutes les entrées et sorties possibles,
répertoriés sur l’ensemble des P450s disponibles en Mars 2006, soulignant par la même occasion
quelques différences entre les mécanismes d’entrées/sorties pour les P450s bactériennes et ceux de
mammifères. La recherche des canaux a été opérée à l’aide du logiciel CAVER (Petrek et al., 2006)
(http://loschmidt.chemi.muni.cz/caver/). L’ensemble des canaux repérés est décrit dans la Figure 1-22
et le Tableau 1.8.
Figure 1-22 Canaux d'accès potentiels des CYPs. (source Cujucaro) Tous les canaux calculés ont été annotés
sur la structure du P450cam (PDB 1ATKD). La protéine, en grise, est en représentation cartoon (hélice en ruban et
brin en flèches) Les ouvertures de canaux sont montrées à l’aide de cercles numérotés à la position correspondante
en surface de la protéine. Les canaux partageant une même couleur sont liés par (i) leur mode d’ouverture (2c, 2ac,
2a, 2f, 2b – en rouge ; 2c, 2d, 4 – en vert ; 1,3 – en marron), (ii) leur fonction [solvant (S), water (W) – en bleu], ou
(iii) récemment identifié (5 – violet). Chaque canal est montré avec une nuance de couleur différente. La boucle B-
C est coloriée en rose tandis que la boucle F-G est en vert. Deux vues distinctes sont proposées pour pouvoir
observer l’ensemble des canaux : (A) une vue de profil en regardant droit ver l’hélice I et (B) une vue de dessus de
l’hème, à partir de sa face distale.
Tableau 1.8 Localisation et occurrence des canaux d'accès au site actif des CYPs disponible en Mars 2006 (d’après Cojocaru et al., 2007)
Canal Localisation Commentaires Observé dans les P450s
1 Apparaît entre les hélice C/C’ et H ou L, Canal rare, observé en MD. P450cam
près de la boucle G-H et le feuillet 2 Possibilité de route pour les
espèces gazeuses
2 Toute les sous-classes exceptées 2d et 2f - –

sont bordées par le boucle B-C/hélice B’.
Cette région de la protéine est hautement
variable à la fois en séquence et en
structure entre les différents P450s. Elle
est décrite comme importante pour la
spécificité du substrat à travers les
contacts qu’elle établit avec lui comme il a
été vu précédemment.
2a Apparaît entre la boucle F-G, l’hélice Canal commun CYP119, P450st, P450nor, CYP2B4,
B’/boucle B-B’/Boucle B-C et le feuillet 1. CYP2C9, P450cam, P450BM3, P450Terp,
Toute cette région est extrêmement CYP121, CYP152A2, CYP154C1,
variable en séquence et en structure chez CYP158A2, P450OxyB, P450OxyC,
les P450s. La région C-terminale de l’hélice P450epoK, CYP175A1
F forme le SRS-2 et la région N-terminale
de l’hélice G forme le SRS-3
2b Apparaît entre la boucle B-B’, les feuillets 1 CYP2B4, CYP2C8, CYP3A4, P450BM3,
et 3 (SRS-5 présent dans le feuillet 3) CYP152A2
2c Apparaît entre l’hélice Get I et l’hélice Canal commun CYP119, P450Nor, CYP2B4, CYP2C5,
B’/boucle B-C. L’hélice I contient le SRS-4 CYP2C8, CYP2C9, CYP154C1,
CYP158A2
2ac Apparaît entre le sommet de la boucle B-C Canal commun CYP119, P450Nor, CYP2B4, CYP2C5,
(ou hélice B’) et l’hélice G entre les canaux CYP2C9, CYP154A1, CYP154C1,
2A et 2c CYP158A2 P450OxyB, CYP175A1
2e Apparaît à travers le boucle B-C Canal assez commun, Il a été CYP2B4, CYP2C5, CYP2C8, CYP2C9,
montré comme une seconde CYP3A4, CYP51, P450EryF, CYP121,
sortie possible dans la MD du CYP152A2, CYP154C1, P450OxyB,
P450eryF P450epoK
2d Est spatialement proche du 2a d’où Anciennement observé CYP2B4, P450BM3, CYP154C1

l’appartenance à une sous-classe 2. exclusivement chez P450BM3
Apparaît entre la région N-terminal de la avec un acide palmitoleïque
protéine et les hélices a/A’ et A. non chargé.
2f Idem que 2d pour la définition. Apparaît Canal commun CYP119, P450Nor, CYP2B4, CYP2C5,
entre l’hélice F’/boucle F-G et le feuillet 5 CYP2C9, P450cam, P450BM3,
P450Terp, CYP158A2, P450OxyB,
P450OxyC, CYP175A1
3 Apparaît entre les hélice F et G ou au Canal rare, identifié comme P450cam

niveau de la boucle E-F un substrat (ou produit)
secondaire potentiel en MD
4 Apparaît au travers de la boucle F-G Canal rare CYP119, CYP2B4, CYP2C8
5 Apparaît entre les hélices K et K’ Canal rare CYP2B4, CYP158A2, CYP175A1
S Apparaît entre les hélice E,F et I et le Présent dans la moitié des CYP119, P450Nor, CYP2B4, CYP2C5,
feuillet 5 P450s, possibilité de sortie CYP2C8, CYP2C9, CYP3A4, P450cam,
pour les substrats, mais non P450BM3, P450Terp, CYP158A2,
confirmé jusqu’à présent P450OxyB, P450OxyC
W Apparaît à la base de la boucle B-C près du Entrée de l’eau pour l’apport P450BM3
C-terminal de l’hélice B en oxygène moléculaire.
1.5 Propriétés chimiques des P450s
A partir de ces éléments structuraux, il est possible de s’intéresser aux mécanismes mis en jeu lors
des biotransformations. Comme il a été déjà souligné, l’élément essentiel qui permet ces réactions est
l’hème des P450s, plus particulièrement le fer qu’il porte. Ces réactions ont également besoin d’un
apport d’électrons et d’oxygène moléculaire lors de la réaction enzymatique.
1.5.1 Implication du fer de l’hème dans les interactions
L’atome de fer est en mesure de former 6 liaisons de coordination. Dans le cas des CYPs, le fer
est pentacoordiné par les 4 azotes pyrroliques de l’hème et par le thiolate de la cystéine. Le sixième
ligand peut être soit une molécule d’eau, soit un atome coordinant d’un composé fixé dans le site actif.
Ces variations dans l’état de coordination du fer se traduisent par des signatures spectrales
caractéristiques dans le domaine de l’UV visible (cf. Figure 1-23).
1.5.1.1 État natif

A l’état natif, le FeIII de l’hème existe en équilibre sous deux états de spin, dépendant de son état
de coordination :
- Un état de bas spin S=1/2, dans lequel le fer est hexacoordiné et dans le plan de l’hème. Le
sixième ligand est presque toujours une molécule d’eau. Le maximum d’absorption de cette
espèce FeIII est situé aux environs de 420 nm.
- Un état de haut spin S=5/2 correspond à un FeIII pentacoordiné situé en dehors du plan de
l’hème. Cette espèce a un maximum d’absorption à 390 nm
1.5.1.2 En présence d’un composé

En présence d’un composé exogène qui se fixe dans le site actif, trois cas de figure se présentent :
- Lorsque le composé hydrophobe rentre dans le site actif, il chasse la molécule d’eau
coordinant le fer dans l’état de bas spin. Le FeIII se retrouve donc à l’état de haut spin, avec un
maximum d’absorption à 390 nm. On appelle cette interaction, une interaction de type I dont
le spectre différentiel est constituée d’un pic à 390 nm et d’une vallée à 420 nm.
- Si ce composé porte un atome d’oxygène accessible au fer (comme une fonction alcool ou
ester) cet oxygène peut complexer le fer pentacoordiné et donner une interaction de type I
inversé. On retrouve ainsi le FeIII sous forme de bas spin avec un pic d’absorption en UV
visible à 420 nm. Le spectre différentiel résultant comporte alors un pic à 420 nm et une vallée
Propriétés chimiques des P450s 53
à 390 nm. A noter que dans certains cas, l’arrivée d’un substrat dans le site actif peut favoriser
la fixation d’une molécule d’eau comme sixième ligand du fer et donner également un telle
interaction.
- Une interaction de type II est observée lorsque le composé exogène comporte un atome
d’azote ou de soufre pouvant complexer le FeIII et se fixe au sein du site actif. Le FeIII absorbe
alors entre 425 et 435 nm. Le spectre différentiel montre ainsi un minimum vers 390-410 nm
et un maximum vers 425-435 nm
Figure 1-23 Interactions spectrales observées lors de fixation d'un composé dans le site actif (d'après Mansuy
et al., 1989) (Source : Thèse de P. Lafite). HS : Haut Spin ; BS : Bas Spin.
1.5.2 Cycle catalytique de la mono-oxygénation des substrats par les CYPs
Le cycle catalytique des CYPs est communément décrit en 7 étapes principales.
Figure 1-24 Cycle catalytique des CYPs (Makris et al., 2005; Mansuy et Battioni, 2000) (Source : Thèse de P.
Lafite) Le cycle court obtenu par addition d’un composé donneur d’atome d’oxygène est indiqué en bleu (aucun
exemple n’est donné) ; les voies non-productives ou abortives en rouge et la voie réductase en marron.
1. Le cycle catalytique des CYPs est initié par la fixation du substrat au sein du site actif. Ceci
entraîne dans le cas de l’état natif à bas spin le déplacement de la molécule d’eau distale et
favorise la position pentacoodinée haut spin du complexe ferrique FeIII.
2. Cette fixation du ligand induit une augmentation du potentiel du couple FeIII/FeII, permettant
ainsi le transfert d’un électron qui peut réduire le fer en complexe ferreux FeII. Dans certains
cas, tels les P450s d’eucaryotes, il semblerait que le transfert d’électron puisse se produire
sans fixation d’un composé dans le site actif (Guengerich et Johnson, 1997).
3. La réduction du fer est suivie par la fixation de l’oxygène moléculaire sur le fer, donnant le
complexe ferreux FeII←O2.
4. Le transfert d’un second électron vers ce complexe réduit l’oxygène moléculaire en formant
l’entité peroxy-ferrique FeIII–OO– qui par protonation donne ensuite un complexe hydroperoxo
FeIII–OOH.
5. Une seconde protonation provoque ensuite la rupture hétérolytique de la liaison O–O, libérant
une molécule d’eau et le composé fer-oxo formellement écrit FeV=O.
6. Ce composé est hautement oxydant. Il peut transférer son atome d’oxygène au substrat.
7. Le métabolite sort du site actif.
Dans certains cas, l’oxydation du substrat peut être réalisée par l’espèce FeIII–OOH. Les travaux
de A. Vaz ont ainsi montré que certaines époxydations d’oléfines sont réalisées par cette entité et non
par le fer-oxo FeV=O (Vaz et al., 1998). Par ailleurs, l’utilisation d’agents oxydant donneurs d’atome
d’oxygène, tels que l’iodosobenzène, les peracides, les hydroperoxydes, les anions ClO2– ou IO4–,
permettent d’obtenir directement l’espèce réactive fer-oxo à partir de l’état natif. On parle alors de
cycle court des CYPs.
1.5.2.1 Voies abortives

Dans le cas idéal, la consommation d’une molécule de NAD(P)H doit s’accompagner de
l’oxygénation d’une molécule de substrat, comme dans le cas du P450cam ou de P450s spécifiques des
voies de biosynthèses endogènes. Toutefois, dans le cas des P450s impliqués dans la métabolisation
des xénobiotiques, ce couplage n’est pas aussi efficace : des voies secondaires de transfert d’électrons
dites « abortives » peuvent se produire. Ceci se traduit par retour à l’état de complexe FeIII sans
oxydation du substrat. Ce découplage entre le transfert d’électrons et transfert d’atome d’oxygène peut
apparaître au niveau de plusieurs étapes du cycle catalytique :
- Le complexe ferreux FeII←O2 peut se décomposer en formant l’ion superoxyde O2●– et le

complexe ferrique FeIII. Cet ion superoxyde peut alors se dismuter pour donner du peroxyde
d’hydrogène et de l’oxygène moléculaire :
2O2•− + 2 H + 
→ H 2O2 + O2
- L’addition du proton sur l’atome d’oxygène ligand du fer des complexes peroxyferrique FeIII–
OO– ou hydroperoxo FeIII–OOH se traduit par la formation du FeIII et d’une molécule de
peroxyde d’hydrogène :
+
Fe III − OO − + H + 
→ Fe III − O O − →
H
H 2 O 2 + Fe III
H
Fe III − OOH + H + → Fe III − O OH 

→ H 2 O2 + Fe III
H
- L’entité fer-oxo FeV=O peut redonner également l’état natif FeIII après consommation de deux
protons et de deux électrons :
FeV = O + 2 H + + 2e − 
→ H 2 O2 + Fe III
L’ion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène libérés, constituent tous deux une source potentielle
de stress oxydant. Cette activité oxydase des P450s est généralement plus importante que l’activité
catalytique oxygénase présentée précédemment dans le cas des P450s microsomaux, mais ce
découplage dépend de paramètres qui influent sur la vitesse de transfert des électrons ou des protons,
comme l’accessibilité de l’eau au site actif, un positionnement du substrat trop éloigné du fer,
l’absence de sites suffisamment réactifs sur le substrat (Mueller et al., 1995)…
1.5.2.2 Quelques remarques sur l’existence des intermédiaires du cycle catalytique

Le cycle catalytique des cytochromes P450 a été étudié en détail dans le cas de P450cam et de
certains de ses mutants, catalysant tous l’hydroxylation régio- et stéréo- sélective du camphre.
- Les premiers intermédiaires du cycle catalytique des P450s (les deux états natifs,
FeIII/Camphre et FeII/Camphre) ainsi que le dernier complexe (FeIII/hydroxycamphre) ont été
caractérisés par de nombreuses études cristallographiques et spectroscopiques (Markis et al.,
2005). Très peu de différences structurales sont observées entre les deux composés
FeIII/Camphre et FeII/Camphre (Schlichting et al., 2000).
- La structure du complexe FeII–O2 a été résolue par cryo-cristallographie à 100K (Schlichting
et al., 2000). Celle-ci révèle un déplacement du camphre, une apparition de molécules d’eau et
la stabilisation de l’oxygène par des liaisons hydrogène auxquelles participent certains acides
aminés du site actif tels que l’Asp251 et la Thr252.
- En dépit du fait que l’existence des complexes peroxo-, hydroxo- et oxo du fer n’a pas pu être
prouvée par des expériences de cristallographies, l’équipe de B. Hoffman a pu quand même
mettre en évidence par spectroscopie ENDOR et RPE les complexes peroxo- et hydroxperoxy-.
Ainsi, ils ont irradié par des rayons γ des échantillons à très basse température (77K et 6K),
figeant les structures à chaque étape du cycle, permettant ainsi la visualisation des complexes
(Davydov et al., 2001). En revanche, l’espère FeV=O n’a pas pu être observée : la
transformation du complexe FeIII–OOH produit directement l’espèce FeIII/hydroxycamphre
sans passer par le fer-oxo.
1.5.2.3 Importance de l’Asp251 et la Thr252 dans le mécanisme d’activation de l’oxygène

La structure tridimensionnelle de l’intermédiaire FeII←O2 révèle l’importance de la poche distale
dans le transfert des protons et dans l’activation de l’oxygène (Schlichting et al., 2000). Des
changements conformationnels du squelette peptidique et des chaînes latérales autour du site actif se
produisent lors de la fixation du dioxygène entraînant l’apparition d’un réseau de liaisons hydrogène.
Dans ce mécanisme d’activation de l’oxygène, les résidus Asp251 et Thr252 semblent jouer un rôle
important :
- Des études isotopiques sur des mutants D251N (Aspartate en position 251 mutée en
Asparagine) ont souligné l’importance du rôle structural d’Asp251 dans le réseau de
molécules d’eau évoqué précédemment, mais également dans la coupure hétérolytique de la
liaison O–O (Deprez et al., 1994 ; Gerber et Sligar, 1994).
- Les études de RPE et ENDOR cryogénique sur le mutant T252A (Thréonine à la position 252
en Alanine) ont montré quant à eux l’existence de l’espèce FeIII–OOH sans observer
l’hydroxylation du substrat (Davydov et al., 2001). D’après ce résultat obtenu chez le P450cam,
on est en mesure d’affirmer que la thréonine 252 est impliquée dans le transfert du second
proton du cycle catalytique. Pourtant, il semblerait que le transfert de ce second proton,
menant à la coupure hétérolytique de la liaison O–O, soit fortement modulée par la structure
du substrat fixé dans le site actif.
Chez les autres P450s, tels que ceux de la famille 2, D.F Lewis a montré qu’une mutation opérée
sur la thréonine correspondante à celle du 252 chez P450cam a pour conséquence une réduction
important de l’activité. A l’opposé, certains P450s qui ne possèdent pas cette thréonine ont pourtant
une activité catalytique (Hiroya et al., 1994 ; Cupp-Vickery et Poulos, 1995).
1.6 Au centre d’un système de détoxication

1.6.1 Place du CYP dans le système de détoxication
Outre son implication dans les voies endogènes, la fonction de biotransformation confère aux
CYPs une place privilégiée dans les systèmes de détoxication. En effet, l’une des sources premières
d’agression quotidienne que subissent les organismes vivants provient de l’environnement. Ces
agressions sont liées de façon directe ou indirecte à des substances d’origine diverse, communément
désignées sous le terme de xénobiotique. On retrouve parmi ces substances des produits naturels,
médicaments ou encore polluants de l’environnement : toxines végétales et animales, dérivés des
combustibles domestiques et industriels, solvants, colorants, additifs alimentaires, pesticides,
herbicides, etc.… Ces composés ont pour principales caractéristiques d’être de faible poids
moléculaire d’une part et hydrophobes d’autre part. En raison de ces caractéristiques, ils ont une
tendance naturelle à s’accumuler dans les phases lipidiques des membranes cellulaires, rendant ainsi
leur élimination par voies classiques (urine et bile) très difficile. Ce phénomène résulterait en une mort
inéluctable des organismes par effet toxique, si ceux-ci ne s’étaient pas dotés, au cours de l’évolution
de systèmes enzymatiques permettant leur élimination.
Ce processus de détoxication se déroule en trois phases (cf. Figure 1-25) qui mettent en jeu
différents enzymes de biotransformation (Phase I et II) présentés dans le Tableau 1.9 et des
transporteurs (Phase III). L’ensemble forme un système connu sous l’appellation d’Enzymes du
Métabolisme des Xénobiotiques (EMX). Ces trois phases sont désignées comme il suit :
• Phase I ou phase de fonctionnalisation

• Phase II ou phase de conjugaison
• Phase III à transporteurs ATP-dépendant
Il peut être toutefois signalé que le métabolisme des xénobiotiques ne conduit pas toujours à la
détoxication de ces composés. En effet, dans certains cas, le produit oxydé ou réduit peut manifester
un très forte réactivité par attaque électrophile ou nucléophile des macromolécules environnantes
(protéines, acides nucléiques).
Au centre d’un système de détoxication 59
Pénétration
intracellulaire Fixation sur les macromolécules :
Organites - ADN → Mutation (cancérogenèse)
par voie passive
- Protéines → allergies / inactivation
- Péroxydation lipidique
MRPs,
MDRs
Phase III
ELIMINATION
transporteurs
Composé RH Phase I ATP
OXYDATION
monooxygénases Phase II Conjugués ROR’
P450 CONJUGAISON
NADPH, O2 transférases
GSH
EFFLUX UDPGA
Métabolites ROH PAPS
+ MT
P-gp R.O.S.
Figure 1-25 Schéma simplifié du métabolisme des composés hydrophobes (Source : Cours de M. Delaforge)
La couleur froide représente la voie « normale » du métabolisme, en couleur chaude, lorsqu’il y a des phénomènes
de toxicités. Le devenir d’un composé hydrophobe dans la cellule dépend de toutes ces voies de métabolisme.
MDR : MultiDrug Resistance ; MRP :Multidrug Resistant Protein ; P-gp : P-glycoprotein
Dans ce processus de détoxication, les CYPs occupent une place prédominante : ils sont les
enzymes majoritaire de la phase I (ils oxydent jusqu’à 90% des substrats), jouant ainsi un rôle
pharmaco-toxicologique très important. La vitesse d’élimination des xénobiotiques de l’organisme est
donc contrôlée par leur vitesse de transformation par les cytochromes P450. Ce métabolisme peut
varier en fonction de facteurs génétiques liés au polymorphisme des CYPs par exemple, ou
environnementaux tels que l’induction, l’inhibition. Ces variations constituent donc une cause possible
d’inefficacité thérapeutique ou même de toxicité (Ingelman-Sundberg, 2002).
Tableau 1.9 Principales réactions de biotransfomation

Réactions Enzymes Localisation Substrats
Réaction de Phase I
Oxydations Alcool déshydrogénases Cytosol Alcools
Aldéhyde déshydrogénases Cytosol Aldéhydes
Monoamine oxidases Mitochondrie Amines
Flavine mono-oxygénases Microsomes Amines tertiaires
Cytochrome P450 Microsomes Variés
Réductions Cytochrome P450 Microsomes Variés
Carbonyle réductases Microsomes Aldéhydes, Cétones
Alcool déshydrogénases Cytosol Aldéhydes, Cétones
Hydrolyses Estérases Cytosol, Esters
Microsomes,
Mitochondrie
Peptidases Variés Microsomes Peptides
Réaction de Phase II
Hydrolyses Epoxyde hydrolases Cytosol, Microsomes Epoxydes
Glucuronidation UDP Glucuronyl-transférases Microsomes Phénols, Thiols, Amines,
Acides Carboxyliques
Conjugaison au gluthation Glutathion-S-transférases Microsomes Electrophiles
Sulfatation Sulfotransférases Phénols, Thiols, Amines
Méthylation O-,N-,S-méthyl-transférases Cytosol, Microsomes Phénols, Amines
Acétylation N-acétyl-transférases Cytosol Amines
Conjugaison aux acides Aminoacyl-transférases Microsomes Acides Carboxyliques
aminés
Comme il a été vu précédemment, l’ « organe principal » où s’opèrent les réactions de

détoxication est le foie, là où les CYPs sont présents de façon majoritaire. Au sein de cet organe, la
contribution relative des différents CYPs au métabolisme des médicaments est à peu près
proportionnelle à leur abondance relative, excepté pour les CYPs de la famille 1A et le CYP2D6.
Approximativement 75% des médicaments actuellement sur le marché ne sont en fait métabolisés que
par ces trois CYPs hépatiques : (a) le CYP 3A4, (b) le CYP 2D6 et (c) le CYP 2C9 (Rendic, 2002).
D’autres organes sont également le siège d’un métabolisme secondaire, moins important, car les P450s
exprimés dans ces tissus contribuent non seulement à l’élimination, mais influencent également les
concentrations tissulaires des agents thérapeutiques. L’intestin est un exemple de ces « organes
annexes ». Il serait d’ailleurs le lieu principal du métabolisme extra-hépatique. Certains CYPs sont
relativement plus présents dans l’intestin qu’ils ne le sont dans foie : c’est le cas du CYP 2J2 par
exemple. D’autres en revanche sont présents dans le foie, mais pas détectés de l’intestin, tels que les
CYP 1A2, 2A6, 2B6, 2C8 et 2E1 (Paine et al., 2006). Des études ont montré qu’en dépit d’une
concentration en P450s moins faible dans l’intestin, le métabolisme intestinal pouvait contribuer de
façon significative et parfois égale au métabolisme hépatique comme dans le cas de la cyclosporine,
du midazolam ou du verpamil (Kolars et al., 1991 ; Paine et al., 1996 ; von Richter et al., 2001). Les
tissus du système respiratoire, à la fois exposés aux xénobiotiques inhalés et aux pathogènes transmis
par le sang, sont une cible importante en toxicologie environnementale. De nombreux CYPs sont
exprimés dans le poumon, dont certains spécifiques du tissu : CYP 2A13, 2S1 ou 4B1 (Ding et
Kaminsky, 2003). Le poumon semble de plus être le lieu d’entrée dans l’organisme pour de nombreux
procarcinogènes, comme les hydrocarbures aromatiques présents dans la fumée de cigarette,
métabolisés par les CYP 1A ou 2A.
1.6.2 Variation inter-individuelle et manifestations pathologiques
L’activité des P450s dans le tissu hépatique est fortement dépendante de deux paramètres, l’un
génétique (polymorphisme) et l’autre exogène (induction et inhibition). Cette variabilité peut être la
cause d’une accumulation trop importante ou d’une élimination trop rapide du médicament, et par voie
de conséquence entraîner les effets indésirables et/ou toxiques.
1.6.2.1 Polymorphisme
Les gènes codant pour les P450s impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques peuvent avoir
des mutations allèliques qui sont appelées polymorphismes si leur fréquence est supérieure à 1% de la
population. Ces variations de gènes peuvent conduire à des variations d’expression du CYP
correspondant, ainsi qu’à des variations de leur activité catalytique. Ainsi de nombreux
polymorphismes de P450s définissent deux phénotypes appelés « métaboliseur lent » et « métaboliseur
rapide » pour un médicament donné. Les métaboliseurs rapides éliminent plus vite le médicament et
diminuent son efficacité thérapeutique, tandis que les métaboliseurs lents accumulent le médicament
qui peut devenir toxique par effet de surdosage. La communauté scientifique et médicale est
maintenant bien consciente qu’une thérapie rationnelle peut émerger en prenant en considération ces
variations de métabolisme inter-individuelles (Evans et Relling, 1999).
1.6.2.2 Cancérogenèse
La part des cancers imputables aux xénobiotiques (polluants ou constituants « normaux » de
l’alimentation) n’est pas bien définie, mais reste non négligeable. Chez l’homme, des corrélations
entre les polymorphismes génétiques de certaines isoformes et les risques de cancer suggèrent que les
CYPs joueraient un rôle dans les processus de cancérogenèse. Les isoformes les plus étudiées et
impliquées dans ce mécanisme sont les CYP 1A1, 1A2, 4B1 et 2E1. Chez l’homme, une forte activité
du CYP 1A1 semble être associée à la survenue de cancers du poumon. L’activité du CYP 2E1 serait
impliquée dans le développement de stéatohépatites via la production d’un stress oxydant (Weltman et
al., 1996). Une étude montre d’ailleurs que l’induction du CYP 2E1 par la N-nitrosodiméthylamine
serait associée à l’apparition d’hépatocarcinomes (Tsutsumi et al., 1993). Le CYP 2A6 est responsable
de l’activation métabolique de la N–nitrytosamine (contenue dans la fumée de tabac), en métabolite
cancérigène pouvant provoquer un cancer du poumon (Kamataki et al., 1999).
1.6.2.3 Malformations congénitales

Le thalidomide et la phénytoïne sont des molécules thérapeutiques tératogènes chez l’homme et
sont métabolisés respectivement par les CYP 2D6 et CYP 2C19. La toxicité découlant de l’activité des
CYPs peut être un problème lors de l’organogénèse. En effet, la capacité de métabolisation du fœtus
est non négligeable. Le CYP 1A1 est exprimé dès le stade de l’organogénèse, avant huit semaines et le
CYP 1A2 après quatre mois (Oesterheld, 1998). L’activité in utero de ces enzymes pourraient être
associée à des malformations et des fausses couches (Hakkola et al., 1998).
1.6.2.4 Réactions immunoallergiques

Parallèlement aux mécanismes de toxicité directe, certains métabolites activés par les CYPs
peuvent se révéler toxiques par des mécanismes immunoallergiques (Pessayre, 1995). L’hapténisation
des macromolécules du soi par les métabolites réactifs peut stimuler le système immunitaire chez
certains individus conduisant à une réponse inadaptée de type auto-immune. Les protéines du soi
modifiées (CYPs en particulier) sont considérées comme étrangères au système immunitaire et
deviennent alors les cibles d’auto-anticorps. Pour que ceux-ci puissent participer à la destruction
immunologique des hépatocytes, les haptènes seront transportés par voie vésiculaire jusqu’à la
membrane plasmique. Il en résulte une cytolyse (Pessayre, 1995). Il a été démontré que le foie était
principalement touché par ces phénomènes. Au cours de formes sévères d’hépatites
immunoallergiques, consécutives à l’absorption de médicaments tels que l’acide tiélinique, l’halothane
ou la dihydrlazine, des anticorps dirigés contre les CYPs ont été retrouvés. Il est intéressant de noter
que pour ces trois médicaments, les CYPs impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques
(CYP 2C9 pour l’acide tiénilique, CYP 1A2 pour la dihydralazine et CYP 2E1 pour l’halothane) sont
les cibles de ces auto-anticorps.
Acide tiénilique Dihydralazine
CYP 2C9 CYP 1A2
Métabolite réactif Métabolite réactif
Fixation covalente Fixation covalente

au CYP 2C9 au CYP 1A2
A2
Auto-anticorps Auto-anticorps
anti-CYP 2C9 anti-CYP 1A2
Figure 1-26 Mécanismes de mise en place de maladie auto-imunes après administration de l'acide tiénilique, de
la dihydralazine.
1.6.2.5 Interactions médicamenteuses

L’administration concomitante de deux ou plusieurs médicaments peut avoir des conséquences
néfastes sur leur pharmacocinétique. Ces variations mettent en jeu les mécanismes d’induction, de
répression et d’inhibition. Pour les mécanismes d’inhibition, on distingue les inhibitions de types
réversibles – où l’inhibiteur vient se fixer au niveau du site actif en compétition avec le substrat – et
les inhibitions de types irréversibles – où ces inhibiteurs oxydés par les P450 restent fixés de façon
covalente dans le site actif. On parle alors d’inhibiteur suicide –. Un grand nombre d’interactions
médicamenteuses ont été mises en évidence. Elles peuvent survenir au cours de chaque étape
pharmacocinétique (absorption, distribution, métabolisation, élimination) et plus particulièrement lors
de la métabolisation. Au cours de cette phase, tous les CYPs sont impliqués, mais surtout le CYP 3A4
à qui on doit par exemple le retrait de la terfénadine, anti-histamique qui en présence de kétoconazole
(antiparasitaire) ou d’érythromycine (antibiotique) entraînait des complications cardiaques importantes.
Des études ont montré que la présence de kétoconazole, inhibiteur direct du CYP3A4, diminuait
fortement le métabolisme de la terfénadine, ce qui avait pour effet d’augmenter sa concentration
plasmatique et de provoquer des toxicités cardiaques et vasculaires (Wang et al., 2002). Cet exemple
illustre bien les conséquences parfois dramatiques des interactions médicamenteuses. On voit donc
que l’efficacité ou la toxicité d’un médicament métabolisé par un CYP est affectée par la prise d’un
autre médicament. Néanmoins, dans certains cas, les interactions médicamenteuses peuvent être mises
à profit en thérapeutique. Le saquinavir est une antiprotéase dont l’efficacité est limitée, in vivo, par sa
faible biodisponibilité. La prise concomitante de jus de pamplemousse ou de ritonavir augmente
nettement sa biodisponibilité et son efficacité (Kupferschmidt et al., 1998). Au contraire, la prise de
certains médicaments est déconseillée avec du jus de pamplemousse. C’est le cas du cisapride
(prokinétique) qui après absorption de jus de pamplemousse provoque des torsades de pointe
(Morawiecka, 2000). La cyclosporine A est un immunodépresseur très utilisé en thérapeutique, mais
aussi très coûteux. Il a été démontré que l’administration simultanée de kétoconazole et de
cyclosporine A doublerait la biodisponibilité de la cyclosporine A et ainsi réduisant les doses de 60%
à 80 % pour obtenir l’immunosuppression (Gomez et al., 1995).
Le Tableau 1.10 montre plusieurs types d’interactions médicamenteuses faisant intervenir les
mécanismes d’induction, de répression et d’inhibition. En pratique clinique, les interactions
médicamenteuses mettant en jeu des mécanismes d’inhibition sont plus fréquentes pour celles
impliquant des mécanismes d’induction et de répression. Les effets de nombreux médicaments sur
l’expression des CYPs restent inconnus. Il est important de les identifier afin de pouvoir prédire les
éventuelles interactions médicamenteuses.
1.7 Conclusion
Tout au long de ce chapitre, la nature, la diversité et la complexité des CYPs ont été soulignées.
Leurs implications dans le système de détoxication et les conséquences aussi bien bénéfiques que
pathologiques ont été également évoquées. Ces informations justifient bien l’intérêt que représente
cette superfamille auprès des industries pharmacologiques depuis sa découverte. Jusqu’à présent, la
plupart des études portées sur cette superfamille a été réalisée expérimentalement. Parmi elles,
l’obtention de cristaux de P450s fut une avancé importante dans la connaissance de ces enzymes : la
structure des protéines donnent en effet beaucoup d’information sur leurs fonctionnements. Pourtant,
comprendre les mécanismes de reconnaissance des CYPs, en se basant uniquement sur la structure,
n’est certainement pas une tâche aisée. C’est pourquoi on sollicite aujourd’hui l’utilisation d’outils
informatiques pour traiter et faire une synthèse des informations disponibles sur ces protéines.
Ces outils sont en effet très pratiques, pouvant être utilisés dans la prédiction (modélisation de
CYPs de structure inconnue lorsque cela est réalisable), pour proposer des réponses à de nombreuses
hypothèses formulées sur le fonctionnement (expérience de docking) ou encore, pour suggérer de
nouvelles expériences à réaliser (mutation dirigée). En pharmacologie, les industriels utilisent
classiquement ces structures (et/ou modèles) de P450 pour tester leurs molécules chimiques, afin d’en
déterminer des pharmacophore (support pour le design de nouveaux médicaments).
Conclusion 65
Tableau 1.10 Quelques exemples d'interactions médicamenteuses résultant d’une perturbation du métabolisme
Médicament Médicament Conséquences Références

Interaction Effet CYP
responsable affecté cliniques bibliographiques
Sécobarbital Warfarine – Pas d’effet CYP 2C9 Lin et al., 1998

anticoagulant :
risque de maladie
thrombo-
embolique
Ethanol paracétamol – Risque CYP 2E1 Slattery et al., 1996
(prise d’hépatotoxicité
chronique)
Induction Rifampicine Contraceptifs – Risque de CYP 3A4 Barditch–Crovo et al.,
Griséofulvine oraux grossesse 1999 ;
Weaver et Glasier,
1999
Rifampicine Cyclosporine – Risque de rejet de CYP 3A4 Offermann et al.,
A greffe 1985
Phénytoïne Paracétamol – Hépatotoxicité CYP 3A4 Brackett et Bloch ,
2000
Tachycardie, ISrael et al., 1993 ;

Répression IFNα, IFNβ Théophyline – CYP 1A2 Wills, 1990
convulsion
Fluconazole AINS + Hémorragies, CYP 2C9 Bertz et Granneman ,

(Ibuprofène, perforations 1997
piroxicam, gastro-intestinales
diclofénac)
Oméprazole, Diazépam + Somnolence, CYP 2C19 Gerson et
Lansoprasole coma, dépression Triadafilopoulos,
respiratoire 2001
Cimétidine Imipramine + Effet atropiniques, CYP 2D6 Bertz et Granneman,
toxicité 1997
cartio-vasculaire
Kétoconazole, Triazolam + Somnolence, CYP 3A4 Vahre et al., 1994
Itraconazole coma, dépression
respiratoire
Erythromycine, Cisapride, + Torsade de pointe CYP 3A4 Dresser et al., 2000
Inhibition Kéthoconazole Térfénadine
Vérapamil, Simvastatine, + Rhabdomyolyse CYP 3A4 Dresser et al., 2000 ;
Diltiazem, Lovastatine Mopusser et al., 2000
Erythromycine
Itraconazole Félodipine + Hypotension, CYP 3A4 Dresser et al., 2000
bradycardie
Ritonavir Ergotamine + Ergotisme CYP 3A4 Dresser et al., 2000
Kétoconazole, Cycolsporine + Néphrotoxicité CYP 3A4 Dresser et al., 2000

Erythromycine A
Quinine Codéine + Diminution de CYP 2D6 Sindrup et al., 1996
l’effet antalgique
AINS : Anti-inflammatoires Non Stéroïdens

– : Diminution ou perte de l’efficacité
+ : augmentation de la toxicité et/ou de la sévérité des effets secondaires
Ainsi, l’ère du numérique ouvre réellement de nouvelles perspectives dans d’études de ces CYPs.
Dans le prochain chapitre, nous verrons comme exploiter les structures de P450s existantes pour la
construction de modèles (lorsque cela est possible), et également comment observer et comprendre les
mécanismes mis en jeu dans la reconnaissance substrat–protéine au travers de simulation. Bref, le
prochain chapitre sera dédié à la présentation des différents outils bioinformatiques déjà disponibles à
l’étude d’une protéine.
CHAPITRE 2
2 Les outils bioinformatiques : vers de nouvelles solutions
« Donnez moi un point fixe et un levier et je soulèverai la Terre »

Archimède (287-212 av JC)
67
68 Chapitre 2. Les outils bioinformatiques : vers de nouvelles solutions
2.1 Brève présentation de la discipline et objectifs
La bioinformatique est un domaine de recherche qui a émergé depuis peu. L’augmentation

vertigineuse du nombre de données générées en biologie associée au développement de l’informatique
a peu à peu mis en lumière cette nouvelle discipline. La bioinformatique comprend un ensemble de
concepts et de techniques nécessaires à l’interprétation de l’information génétique (séquences et
expressions) et structurale (repliement 3D et interactions). C’est en quelque sorte le décryptage de la
« bio-information ». La bioinformatique est donc une branche théorique de la biologie. Son but est
d’effectuer la synthèse de données disponibles (à l’aide de modèles et de théories), d’énoncer des
hypothèses généralisatrices (par exemple, comment les protéines se replient ou comment les gènes
interagissent) et de formuler des prédictions (par exemple dans notre cas, prédire un mécanisme
d’interaction).
Nous allons montrer dans cette thèse comment les outils de la bioinformatique peuvent permettre
l’étude des mécanismes sous-jacents des P450s. Les méthodes développées en bioinformatique sont
nombreuses et variées : il n’est donc pas question de faire un inventaire de toutes les méthodes
existantes, mais plutôt de présenter les différents méthodes ou données qui sont en rapport avec
l’objectif qu’on s’est fixé ici. Un plan d’expérience à suivre est ici proposé pour servir de fil
conducteur à ce chapitre (cf. Figure 2-1). Ce plan d’expérience consiste en des procédures, des étapes
à réaliser pas à pas, analysant des données simples (par exemple les séquences) pour aboutir à un
modèle (tel le mécanisme d’action de la protéine). Le modèle peut être le support pour des simulations
afin de « mimer » la réalité (par exemple, simulations de dynamique moléculaire en présence ou non
d’un substrat). En multipliant les expériences et en modifiant légèrement le support, on espère à terme
avoir des idées sur le fonctionnement de la protéine. C’est le principe de la modélisation moléculaire.
Dans ce chapitre, nous verrons où et comment chercher l’information nécessaire à notre étude,
comment obtenir un modèle (et les principes/méthodes impliqués pour le fabriquer), comment
modifier ce modèle et le rendre plus « proche » de la réalité, et comment procéder à des simulations
pour observer son comportement dans le temps. Chaque paragraphe de ce chapitre correspond à une
des différentes étapes illustrées sur la Figure 2-1.
Les protéines : description géométrique du squelette peptidique 69
Banque de
données
Récupération de données issues de banques

de séquences ou de structures
Pour les P450 : environs 7000 gènes disponibles
Données brutes à traiter

Comparaisons de séquences
Alignement de séquences/structures
Modélisation comparative …
Pour les P450 : 29 templates structuraux
disponibles dans la PDB
Obtention du modèle
Évaluations …
Docking (arrimage)
Simulations de dynamiques moléculaires
Mutation in silico …
Études du modèle
Analyse, comparaison avec des données
biochimiques …
Figure 2-1 Plan d’expérience pour la modélisation moléculaire en générale (correspondant au plan du chapitre).
2.2 Les protéines : description géométrique du squelette

peptidique
Dans un premier temps, nous souhaitons aborder ce chapitre par des rappels de notions
géométriques et structurales des protéines, sur lesquelles reposent les concepts des logiciels
bioinformatiques qui ont été utilisés au cours de la thèse ou qui ont été développés.
2.2.1 Les coordonnées cartésiennes
La description la plus simple du squelette protéique est évidemment la liste des coordonnées
cartésiennes de ses atomes ou de ses Cα (carbone central des acides aminés, eux-mêmes composants
des protéines, cf. Annexes). Cette description est celle sur laquelle s’appuie la mesure de similarité
structural appelée RMSD (Root Mean Square Deviation) entre les structures superposées (voir section
2.4.3.2).
2.2.2 Les distances internes
La liste des distances internes entre atomes ou Cα du squelette peptidique est un moyen de décrire
une conformation de manière indépendante de l’origine des coordonnées. Les distances internes d’une
sous-structure donnent donc une information « locale » de la conformation. Celle-ci permet
évidemment les comparaisons sans avoir à superposer les coordonnées cartésiennes des structures
concernées.
2.2.3 Les angles Phi, psi et Omega
Comme la liaison peptidique –CO–NH– est considérée comme plane, le squelette peptidique peut
être décrit par les angles φ,ψ et ω qui sont les angles dièdres de la chaîne respectivement autour des
liaisons N–Cα, Cα–C et C–N (cf. Figure 2-2). L’angle ω est en général trans (180°), mais dans les
prolines il peut être cis dans 6 à 10% des cas. De ce fait, la description du repliement ne prend en
compte généralement que le couple (φ,ψ) (MacArthur et Thornton, 1996). De plus, le couple φ et ψ ne
peut pas prendre n’importe quelle combinaison de valeurs (Ramachandran et al., 1963). En outre, les
angles ψ et ω sont très corrélés (Esposito et al., 2005).
Figure 2-2 Angles φ,ψ (A) et angles α,τ (B)

Les protéines : description géométrique du squelette peptidique 71
2.2.4 Les angles Alpha et Tau
L’angle α est l’angle dièdre défini par quatre Cα successifs et l’angle τ est l’angle entre les plans
définis par trois Cα successifs (cf. Figure 2-3). L’angle αi est associé au deuxième des quatre Cα (le
Cαi) et l’angle τi est celui formé par les trois premiers Cα.
Figure 2-3 Angles Alpha et Tau décrit par Levitt. L’angle α est l’angle dièdre défini par les quatre Cα
successifs. L’angle τ est l’angle entre les plans définis par trois Cα successifs. La figure (A) correspond à une
simplification de la structure protéique où les groupes d’atomes C, N et H ont été combinés en un atome N’
(centres d’interaction) et les atomes O en O’ (figure tirées de Levitt, 1976).
Les angles α et τ ont été décrits par Levitt et al. (Levitt et Warshel, 1975 ; Levitt, 1976). Toutefois,
ils ont été utilisés précédemment par Flory lors de son étude de la conformation de polypeptides en
pelotes statiques (random-coil) (Flory, 1969). Les liaisons N– Cα et Cα+1–C sont parallèles à ± 10° et
le groupe peptidique (–CαHNH2–COOH) est plan, il est donc possible de remplacer les angles φ et ψ
par une seule valeur, l’angle α dont la relation avec φ et ψ est la suivante (Levitt, 1976) :
α i = 180° + φi +1 + ψ i + 20°(sin φi + sin φi +1 )

Comme les axes de liaisons N– Cα et Cα+1–C sont parallèles mais non colinéaires, l’angle τ, formé
par 3 Cα successifs, varie avec l’angle α selon la relation suivante :
τ i = 106° + 13° cos(α i − 45°)
L’angle τ varie donc peu autour de 106°. Comme celle des angles (φ,ψ), la distribution des angles
α n’est pas uniforme (Oldfield et Hubbard, 1994). Les éléments de structures secondaires sont décrits
par une suite répétitive d’angles α : une hélice α est une suite d’angles α proches de 50° tandis qu’un
brin β est une série d’angles α fluctuant autour de 200° (entre 180° et 240°, Figure 2-4).
(A) (B)
Figure 2-4 Distribution des angles α dans la PDB (A) et τ dans la PDB non redondante (B)
(source thèse de M. Carpentier, 2005)
2.3 Banques de séquences et de structures : les données sources
Nous décrirons dans ce paragraphe deux catégories de banques de données qui ont été utilisées
dans notre « plan d’expérience » (adapté aux P450s) : les banques de séquences et les banques de
structures de protéines.
2.3.1 Banque de séquences biologiques
Les premières banques de séquences sont apparues au début des années 80, sur l’initiative de
plusieurs équipes. Très rapidement, avec l’augmentation de l’efficacité du séquençage, la collecte et la
gestion des données ont nécessité une organisation plus conséquente. C’est ainsi que se sont apparues
les premières banques de séquences nucléiques telles que l’EMBL pour l’Europe – base financée par
l’EMBO (European Molecular Biology Organisation) et maintenue par une équipe située actuellement
à Cambridge au sein de l’EBI (Europeean Bioinformatics Institue) – ou encore GenBank pour les
États-Unis – financée par le NIH (National Institue of Health) diffusé par le NCBI (National Center of
Biotechnology Information) –. Une collaboration entre ces deux banques a été initiée relativement tôt,
s’est étendue en 1987 avec la participation de la DDBJ (DNA Data Bank) du Japon, pour donner
naissance en 1990 à un format unique de description des séquences dans les banques de données
nucléiques (Le format de ce fichier peut être consulté sur le serveur de l’EMBL à l’adresse suivante :
http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FT_definitions/feature_table.html)
Banques de séquences et de structures : les données sources 73
Parallèlement, deux banques principales de séquences protéiques ont été créées. La première se
nomme la Protein Identification Ressource (PIR-NBRF) (George et al., 1986), fruit de l’association
de données issues du MIPS (Martinsried Institute for Protein Sequences), de la base japonaise JIPID
(Japan International Protein Information Database) et des données de la NBRF (National Biomedical
Research Fondation). La deuxième, gérée par l’EBI et le SIR (Swiss Institute of Bioinformatics), se
nomme la spTrEMBL et a été constituée à Genève à partir de 1986. Elle comprend une banque de
données soigneusement annotée, la Swiss-Prot (Bairoch et Boeckmann, 1991), et une banque plus
large annotée automatiquement, la TrEMBL (Translated EMBL nucleotide sequence library)
(Apweiler et al., 1997). Aujourd’hui, l’EBI, le SIR et le PIR ont uni leurs forces pour créer la base de
données UNIPROT (Apweiler et al., 2004). La version non redondante de cette base de données,
UniRef100, contient environ 5 millions et demi de séquences. Si on analyse un extrait soigneusement
annoté de cette banque, UniProtKB Swiss-Prot, on constate qu’environ la moitié des séquences sont
d’origine bactérienne (cf. Figure 2-5)
À noter enfin que cette richesse en information est due à la présence de génomes entièrement
séquencés. Au début, il s’agissait de petits organismes comme le bactériophage Lambda, de 40 kb
(Sanger et al., 1982) ou encore la bactérie Haemophilus influenzae de 1,83 Mb (Fleischmann et al.,
1995), premier organisme vivant dont le génome a été entièrement séquencé. Progressivement les
séquences complètes de génomes de plus en plus grands sont arrivées avec en point d’orgue en 2001,
la séquence du génome humain 3400 Mb (Lander et al., 2001 ; Venter et al., 2001).
Tableau 2.1 Statistiues de la base de données UniProt (release 12.0 du 24-Jui-2007)
Database Entries
UniProtKB 4 949 164

UniProtKB/Swiss-Prot section 276 256
UniProtKB/TrEMBL section 4 672 908
UniRef100 4 910 948
UniRef90 3 145 989
UniRef50 1 555 946
UniParc 15 345 639
UniprotKB comprend l’ensemble de séquences annotées, les UniRef sont des bases de données non redondantes et UniParc correspond aux
archives. Dans les banques UniRef90 et UniRef50, aucune paire de séquence dans les bases respectives n’a une identité mutuelle en
séquence de > 90% ou > 50%. La base UniRef100 les séquences identiques et les fragments de ces séquences comme une même entrée, avec
des liens vers l’ID de la protéine, la séquence, la bibliographie associée, etc.
Figure 2-5 Distribution taxonomique des 283 454 séquences (A) et des 122 974 séquences eucaryotes (B) de la
version 54.2 du 11-sept-07 d’UniProtKb/Swiss-Prot
Pour ce travail de thèse, les séquences de P450s utilisées proviennent essentiellement des bases de
données Swiss-Prot et TrEMBL. Dans ces dernières, les cytochromes P450s représentent environ plus
de 6481 entrées dans l’UniProtKB release 12.2 (Swiss-Prot(909) et TrEmbl(5572)).
2.3.2 Banque de structures tridimensionnelle de protéines
Les structures de protéines sont généralement toutes répertoriées dans la Protein Data Bank (PDB)
(http://www.rcsb.org/pdb). Ce qui a été précédemment dit (dans le Chapitre 1) pour l’évolution
d’apparition des structures de P450 reflète l’évolution de la PDB en général. Cette banque connaît une
croissance impressionnante depuis sa création. Toutefois, cette banque est extrêmement redondante,
beaucoup de structures provenant de protéines très proches (grand nombre de mutants, de co-cristaux
avec des substrats variés). À titre d’exemple, plus de 600 structures de lysozyme sont présentes dans la
PDB. Les statistiques de la banque montre néanmoins que le nombre de structures 3D déterminées est
encore bien faible comparé au nombre de séquences disponibles.
Tableau 2.2 Dénombrement des structures déposées dans la PDB au 15 septembre 2007
Exp. method Molecule type

Proteins Nucleic Acids Proteins/NA other Total
complexes
X-Ray 36223 983 1684 24 38914

NMR 5665 781 134 7 6587
Electon Microscopy 105 10 38 0 153
Other 80 4 4 2 90
Total 42073 1778 1860 33 45744
Figure 2-6 Croissance annuelle du nombre de structures déposées dans la PDB. En bleu, est représentée le
nombre de structures annuelles et en rouge le nombre cumulé des structures. (Source : http://www.rcsb.org/)
Un site dérivé de la PDB, PDBsum (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum) a été

mis en ligne pour une navigation plus agréable dans les structures protéiques et l’information associée
aux structures.
Dans la PDB, l’ensemble des structures de P450s a été déterminé par cristallographie RX, (voir
Figure 1-13 et Figure 1-14 page 39). On peut remarquer que le nombre de structures résolues de P450
suit la tendance fortement croissante de la PDB elle-même.
2.3.3 Banque de classification de structures protéiques
Il existe des banques pour identifier et classer – soit de façon hiérarchique soit de façon non
hiérarchique – les familles de repliements déjà connus. Ces banques utilisent plusieurs approches soit
basées sur des calculs de « distance » entre repliements, soit essentiellement construites sur un examen
visuel des structures 3D disponibles.
2.3.3.1 FSSP
La base de données FSSP de L. Holm et C. Sander (Holm et al., 1992) a été construite à partir
d’un algorithme de mesure quantitative de la compacité des structures. Ce critère permet de diviser
une structure en domaines de plus en plus petits. La récurrence des domaines obtenus est ensuite
analysée afin de connaître la taille des domaines pouvant être retrouvés en grand nombre dans des
protéines différentes. C’est le serveur DALI (Holm et Sander, 1997) qui permet d’interroger la base
FSSP. Ce serveur permet non seulement de consulter la classification la plus récente de la PDB90 qui
contient les structures présentant entre elles moins de 90 % d’identité en séquence, mais aussi de
rechercher les structures les plus proches d’une structure que l’on soumet.
Lorsqu’une structure de P450 est soumise à ce serveur par exemple, un alignement structural de
structures proches de celle de la requête est alors affiché, comprenant des références et des liens vers
l’accession PDB de chaque structure.
2.3.3.2 SCOP
SCOP (Structural Classification of Protein) (Murzin et al., 1995) découpe les protéines en
domaines (régions ayant un cœur hydrophobe et peu d’interaction avec les autres protéines) pour les
classer. La classification de SCOP s’effectue sur quatre niveaux, du plus général au plus fin :
1. class : la composition en structures secondaires est similaire (tout α ; tout β ; α et β
mêlés ; α et β organisés en deux régions séparées) ;
2. fold : la composition en structures secondaires (hélices α et feuillets β), leur arrangement
spatial et leurs connexions topologiques sont similaires ;
3. superfamily : l’identité de séquence peut être faible mais les structures et les fonctions
suggèrent une origine évolutive commune ;
4. family : les structures protéiques ont au moins 30% d’identité de séquence ou bien
possèdent des fonctions et des structures très similaires
Ainsi, la banque SCOP classifie « manuellement » selon les organisations hiérarchiques les 26000
structures de la version Oct2004 de la PDB en 945 repliements, 1539 super familles et 2845 familles.
Dans cette banque, les CYPs sont retrouvés dans la classe des « tout α » et le repliement des
« Cytochrome P450 ». Ce dernier ne contient qu’une seule superfamille, celle des Cytochrome P450s,
elle-même ne contentant qu’une seule famille, celles des Cytochromes P450s. En résumé, la
superfamille des P450s représente une seule et unique branche dans la hiérarchie.
2.3.3.3 CATH
CATH (Class, Architecture, Topology (fold family) and Homologous superfamily) (Orengo et al.,
1997) est aussi base de données construite automatiquement et vérifiée manuellement à partir de la
PDB. Seuls les cristaux résolus à plus de 4 Å dans la PDB sont considérés dans CATH. La
classification hiérarchique des structures proposées dans cette base de données est illustrée sur la
Figure 2-7.
Figure 2-7 Classification des rempliements dans la base de données CATH (source :
http://cathwww.biochem.ucl.ac.uk/cgi-bin/cath/GotoCath.pl?link=cath_info.html)
Cette base comporte également quatre niveaux principaux par familles structurales, et cinq autres
niveaux supplémentaires établis sur les similarités des séquences protéiques. Ces niveaux de
classification sont les suivants :
1. Class : les structures sont regroupées selon leur composition en structures secondaires et
les contacts entre celles-ci (4 classes : principalement α, principalement β, mixte,
quelques structures secondaires).
2. Architecture : l’organisation générale des structures secondaires est la même pour les
structures d’un même groupe.
3. Topology : les structures ayant un même repliement en termes de nombre, ordre et
connexions de structures secondaires sont regroupées.
4. Homologous superfamily : les structures d’un même groupe ont des structures et des
fonctions très similaires, suggérant un ancêtre commun.
5. Niveaux supplémentaires : S, O, L, I selon l’identité de séquences respectivement > 35%,
> 60%, >95% et de 100% (ce dernier regroupe en fait les protéines qui ont été résolues
plusieurs fois, par exemple complexées ou non avec un ligand). Le dernier niveau D sert
vérifier l’unicité de chaque entrée.
Dans cette banque, et à l’image de SCOP, les P450s figurent dans la classe des « principalement
α » (Class 1), dans l’architecture des « paquets orthogonaux » (Architecture 1.10), dans la topologie
des « Cytochromes P450s » (Topology 1.10.630) et enfin dans les superfamilles homologues des
« Cytochromes P450s » (Homologous superfamily 1.10.630.10). Les CYPs dans la nomenclature
CATH peuvent descendre jusqu’aux sous-niveaux S, O, L I puis D. À noter qu’il existe une autre
entrée au niveau topologique (niveau 3), relative aux P450s : Cytochrome P450-Terp, domain 2
(Topology 1.10.230). La différence topologique observée est présentée à la Figure 2-8. Le recherche
de la structure 1cpt du P450Terp est pourtant retrouvée au niveau des « Cytochromes P450s »
(Homologous superfamily 1.10.630.10) : on peut donc se demander d’où peut provenir cette autre
entrée relative aux P450s…
(A) (B)
Figure 2-8 Différence topologique observée dans CATH pour « Cytochrome P450s » et
« Cytochrome P450-Terp, domain 2 »
2.3.4 Autres banques secondaires
Les banques de données de séquences telles que GenBank/EMBL/DDBJ pour les acides
nucléiques, Swiss-Prot, TrEMBL, UNIPROT pour les protéines et la PDB pour les structures, sont des
banques de données généralistes : elles contiennent toutes les données sources suffisantes pour les
travaux d’analyses et de traitements en bioinformatique. Devant la croissance quasi exponentielle des
données et l'hétérogénéité des séquences contenues dans les principales bases de séquences
généralistes, d'autres bases spécialisées sont apparues. Elles se sont constituées autour de thématiques
biologiques ou tout simplement en vue de réunir les séquences d'une même espèce et d'en enrichir les
annotations pour diminuer, ou lever les ambiguïtés laissées par les grandes banques publiques. A titre
d’exemple, on peut citer la banque d’alignement de structures HOMSTRAD, les banques de domaines
de protéine PFAM, ProDom, ou SMART, les banques de régions ou de motifs conservés Blocks,
PRINTS mais également des banques de motifs/signatures spécifiques comme Prosite.
2.3.4.1 Prosite
Prosite (Hulo et al., 2006) est une banque originale et peut être considérée comme un dictionnaire
qui recense des motifs (ou signatures) protéiques ayant une signification biologique. Elle est établie en
regroupant, quand cela est possible, les protéines contenues dans Swiss-Prot par famille comme par
exemple les kinases ou les protéases. On recherche ensuite, au sein de ces groupes, des motifs
consensus susceptibles de les caractériser spécifiquement. La construction de cette base repose sur
quatre critères essentiels : i) collecter le plus possible de motifs significatifs, ii) avoir des motifs
hautement spécifiques pour caractériser au mieux une famille de protéines, iii) donner une
documentation complète sur chacun des motifs répertoriés, et iv) faire une révision périodique des
motifs pour s'assurer de leur validité par rapport aux dernières expérimentations. L'essentiel de
l'expertise est basé sur un réseau de correspondants spécialistes des sujets traités. La base est organisée
en deux parties. La première contient l'identification et la description de chaque motif. La deuxième
contient l'information qui documente chaque motif (Bairoch, 1993 ; Bairoch et Bucher, 1994).
Dans le cas des P450s, la fiche documentaire a pour le numéro d’accession PDOC00081, et pour
titre « Cytochrome P450 cysteine heme–iron signature ». Cette fiche répertorie les informations
générales des P450s telles que leur description, quelques références ainsi que l’entrée du motif
PROSITE des P450s proprement dite. Celle-ci dispose également d’un nom et d’un numéro
d’accession (PS00086) ainsi que la règle associée pour détecter les P450s sur UniProtKB/Swiss-Prot
et la PDB (grâce aux références croisées). Ce motif, correspond à peu près à la signature
caractéristique des P450s vu dans le premier chapitre (Figure 1-4, page 16) :
[FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD].
Dans ce motif de 10 résidus, les crochets « [ ] » correspondent aux résidus possibles à la position
donnée, le caractère x, à n’importe quel résidu, et les accolades «{ } », à un résidu facultatif à une
position donnée. Cette signature (Cys-Pocket) est retrouvée sur 782 séquences des 283 454 séquences
d’UniProtKB/Swiss-Prot (version 54.2) ainsi que tous les P450s présent sur la PDB. À noter que
parmi ces 782 séquences, seuls 753 correspondent réellement à des P450s et 29 correspondent à des
protéines non P450s. Par ailleurs, 42 séquences de P450s ne présentent pas ce motif et ne sont pas
détectées par Prosite (source : http://www.expasy.org/prosite/PS00086)
2.3.4.2 Blocks
La base BLOCKS (Henikoff et al., 1999) est également basée sur un système qui détecte et
assemble les régions conservées de protéines apparentées. La détection des blocs similaires de
séquences est effectuée sur des alignements multiples de séquences. Un bloc ne contient pas
d’insertion ni de délétion. L'ensemble de tous ces blocs forme la base. C'est ainsi que Henikoff et
Henikoff (1991) ont défini 1764 blocs à partir des 437 groupes de protéines recensés durant
l'établissement de PROSITE. Les motifs représentés par la base BLOCK sont généralement plus courts
que ceux donnés par la base PROSITE mais les différences fondamentales entre ces deux banques
résident dans la représentation des données. Les motifs de PROSITE sont définis sous forme de
chaînes de caractères prenant en compte des insertions et des ambiguïtés sur les acides aminés
conservés alors que les motifs de la base BLOCK sont représentés par blocs d'alignements multiples.
Dans la banque de données Blocks, les blocks sont générés automatiquement à l’aide du programme
PROTOMAT (Henikoff et Henikoff, 1991), à partir des entrées de la base InterPro et en utilisant des
séquences issues de Swiss-Prot et TrEMBL, en association avec des références croisées à PROSITE
et/ou PRINTS et /ou SMART et/ou PFAM et/ou ProDom (toutes ces bases se référencent entre elles).
2.3.4.3 Pfam
Pfam (Bateman et al., 2004) est une banque de domaines de familles protéiques. Elle contient une
large collection d’alignements de séquences multiples ainsi que les profils associés de modèles de
Markov cachés (HMM pour Hidden Markov Model) qui permettent de retrouver ces domaines dans de
nouvelles séquences. Pour chaque famille, Pfam fournit également une annotation fonctionnelle, les
références bibliographiques ainsi que des liens vers d’autres banques de données. Chaque famille dans
Pfam est représentée par deux alignements de séquences multiples : (i) un alignement dit seed (graine)
contenant un petit nombre de membres de la famille et (ii) un alignement complet qui contient tous les
membres qui peuvent être détectés dans la base. Tous les alignements sont effectués à partir de
séquences provenant de la pfamseq (une banque construite à partir de la SwissProt et de la TrEmbl),
un ensemble de protéines non redondantes issues de la Swiss-Prot et SP-TrEMBL. Le profil HMM est
alors construit à partir de l’alignement seed en utilisant le package HMMER (http://hmmer.wustl.edu/)
qui permet une recherche de nouvelles séquences sur cette même banque pfamseq. Selon un seuil
défini, les séquences trouvées sont alors incorporées à l’alignement complet. À ce jour, dans la version
22.0 de Pfam (juillet 2007), on répertorie 9318 entrées (ou familles). L’entrée correspondante aux
P450s est la PF00067. Il s’agit d’un domaine d’une vingtaine de résidus, placé coté C-terminal. Cette
entrée est définie à partir d’un alignement seed comprenant 51 séquences, l’alignement complet quant
à lui comporte 6906 séquences de P450s.
2.3.4.4 HOMSTRAD
HOMSTRAD –pour Homologous Structure Alignment Database– (Mizuguchi et al., 1998) est
une banque d’alignement de structures de familles homologues (1032 familles / 3454 structures
alignées en 2005). L’homologie, ordinairement utilisé dans le sens d’origine évolutionnaire commune,
est ici inférée par un degré d’identité suffisamment élevé. Les classifications de SCOP, Pfam,
PROSITE et SMART sont combinées avec les résultats de recherche de similarités de PSI-BLAST et
de FUGUE – une méthode de threading liée à HOMSTRAD – pour définir les familles, qui sont
représentées de manière à montrer l’environnement structural local de chaque résidu. Les alignements
structuraux sont réalisés automatiquement par les logiciels MNYFIT (Sutcliffe et al., 1987), STAMP
(Russell & Barton, 1992) et COMPARER (Sali & Blundell, 1990; Zhu et al., 1992) puis vérifiés par
une expertise humaine.
HOMSTRAD est la banque utilisée dans le logiciel SYBYL (Tripos Inc, St Luis, USA) pour
construire des modèles par homologie.
2.3.5 Récupération des données de banques
La récupération d’information telle que la séquence ou la structure d’une protéine est très aisée
dès lors que l’on dispose de son identité ou de son numéro d’accession. Elle se fait à l’aide d’une
simple requête à partir des logiciels dédiés comme GCG (Devereux et al., 1984) ou SRS (Etzold et
Argos, 1993). En revanche, lorsqu’on désire récupérer les séquences « voisines » ou les structures
proches de notre protéine d’intérêt, des techniques d’alignements sont nécessaires. Elles permettent de
récupérer uniquement les séquences dont le score d’alignement excède un certain seuil. Un alignement
repose sur une notion de ressemblance entre séquences qu’il convient définir. Ainsi, par exemple, on
peut mesurer le pourcentage d’identité global entre deux séquences après alignement. On peut aussi
utiliser le nombre et la qualité de sous-alignements locaux entre deux séquences. Les méthodes de
recherches sont donc basées sur des alignements et des scores attribués à ces alignements.
Communément, pour récupérer les séquences « voisines » d’une protéine étudiée, les outils les
plus utilisés sont FASTA (Pearson et Lipman, 1988), BLAST (Altschul et al., 1990) ou PSI-BLAST
(Altschul et al., 1997), qui sont des heuristiques d’alignement. À noter également que chaque banque
de données précédemment décrite dispose dans la plupart des cas de son propre « moteur » de
recherche. Au cours de ma thèse, je me suis principalement servi de BLASTP et PSI-BLAST pour
récupérer les séquences d’intérêt.
Il existe parallèlement des logiciels analogues à BLAST pour la recherche de structures

« voisines » d’une protéine. Certains ont été abordés plus haut comme le serveur DALI de la base
FSSP. Il existe également de nombreux outils comme par exemple le très récent logiciel YAKUSA
(http://www.rpbs.jussieu.fr/Yakusa/) mis au point par M. Carpentier (Carpentier et al., 2005) de
l’Atelier de BioInformatique (ABI) avec lequel je travaille en étroite collaboration. Ce logiciel utilise
le concept des angles α (coordonnées internes) pour les aligner les structures. Les angles α sont
également utilisés par l’un des outils que j’ai utilisé pour comparer les structures de P450s (GOK).
2.4 Traitement des données sources
L’étape qui suit la récupération des données sources est celle de comparaison entre les données
récupérées. Nous décrirons dans le paragraphe qui suit, les diverses méthodes d’alignements de
séquences et de structures.
2.4.1 Comparaison de séquence à séquences : matrices et algorithmes
La recherche de similitude entre séquences est un élément fondamental qui constitue souvent la
première étape des analyses de séquences. Elle permet de révéler des régions proches dans leur
séquence primaire en considérant le minimum de changements en insertion, suppression, ou
substitution qui séparent deux séquences. Cette méthode est largement utilisée dans les recherches de
motifs sur une séquence, dans la caractérisation de régions communes ou similaires entre deux ou
plusieurs séquences, dans la comparaison d'une séquence avec l'ensemble ou sous-ensemble des
séquences d'une base de données, ou bien encore dans l'établissement d'un alignement multiple sur
lequel sont basées les analyses d'évolution moléculaire. Pour aligner deux séquences entre elles, il est
possible de chercher à optimiser le pourcentage de positions identiques dans l’alignement. Néanmoins,
cette mesure ne tient pas compte de la fréquence relative des différents acides aminés qui composent
les protéines. Or, cette fréquence est très variable. Ainsi, dans un alignement de séquence, la
conservation d’un acide aminé « rare » (Tryptophane, Cystéine) n’a pas la même significativité
statistique que la conservation d’un acide aminé « abondant » (Alanine, Valine). De plus, certains
acides aminés présentent des structures et des fonctions chimiques voisines. Le remplacement d’un
acide aminé par un autre acide aminé de fonction voisine peut être considéré comme une forme de
conservation. Afin de tenir compte des caractéristiques propres à chaque acide aminé, des matrices de
scores, appelée matrice de similarité, ont été développées.
Traitement des données sources 83
2.4.1.1 Les matrices de scores

Pour quantifier la similitude entre séquences, un score est calculé pour chaque paire d’acides
aminés alignés. Ce score peut être un score de distance (à minimiser) ou de similarité (à maximiser).
Ces matrices de scores servent donc à réaliser une pondération de remplacement d’un acide aminé par
un autre selon divers critères. Il s’agit donc d’attribuer des scores différents aux ~200 « mutations »
symétriques possibles (20x19/2) entre acides aminés. Plusieurs matrices ont été développées, basées
sur les caractéristiques physico-chimiques des acides aminés, mais surtout à partir d’analyse
statistiques des substitutions au sein d’un ensemble de familles de séquences alignées. Ces dernières,
telles que les matrices PAM ou BLOSUM, sont couramment utilisées.
PAM. M. Dayhoff et ses collègues ont établi une méthode permettant d’estimer la probabilité
qu’un acide aminé i soit remplacé par un acide aminé j à une position donnée au cours de l’évolution,
sans que la fonction de la protéine ne soit altérée (Dayhoff et al., 1972, 1978 ; Kosiol et Goldmann,
2005). Cette estimation repose sur l’analyse d’alignements de séquences proches au sein desquelles il
est peu probable qu’une mutation de A vers B résulte de mutation successives A→X→Y→B. Elle a
été obtenue à partir de l’analyse de 71 alignements globaux de famille de protéines (~1300 séquences)
très semblables (à 85% d’identité en séquences). Les matrices de probabilités de mutation issues de
ces analyses dépendent donc des différences de séquences, fréquences et mutations observées au sein
de ces 1300 séquences pour 100 sites estimés sur un temps d'évolution particulier (1 mutation sur 100
sites). On parle alors d'une 1PAM (1 Percent Accepted Mutations) matrice. Si la matrice est multipliée
par elle-même un certain nombre de fois, une matrice XPAM est obtenue, et donne des probabilités de
substitution pour des distances d'évolution plus grande. Pour être plus facilement utilisable dans les
programmes de comparaison de séquences, chaque matrice XPAM est transformée en une matrice de
similitudes PAM-X appelée matrice de mutation de Dayhoff. Cette transformation revient à diviser la
probabilité de substitution observée pour une paire, par les fréquences des deux acides aminés la
composant. On obtient une chance (« odd »), c'est-à-dire un rapport de probabilité (la probabilité
d’obtenir une substitution observée dans des alignements de familles, divisée par la probabilité
d’obtenir cette substitution par hasard (due seulement à la composition des séquences). Afin
d’additionner les scores (au lieu de multiplier les probabilités) on prend le logarithme de cette
« chance » (« log-odd »). C’est ce nombre (ramené à un entier) qui constitue le score d’alignement
d’une paire d’acides aminés. Des études de simulation ont montré que la PAM-250 semble optimale
pour distinguer des protéines apparentées de celles possédant des similarités dues au hasard (Schwartz
et Dayhoff, 1979). C'est pourquoi, la matrice PAM-250 est devenue la matrice de mutation standard de
Dayhoff. Cette matrice est basée sur un échantillon assez large et représente assez bien les probabilités
de substitution d'un acide aminé en un autre suivant que cette mutation engendre ou pas des
changements dans la structure ou la fonctionnalité des protéines. Néanmoins, elle présente un certain
nombre d'inconvénients. Principalement, elle considère que les points de mutation sont équiprobables
au sein d'une même protéine (George et al., 1990). Or, on sait que ceci n'est pas vrai et qu'une protéine
peut présenter plusieurs niveaux de variabilité le long de la séquence. De plus, l'ensemble des
protéines utilisé en 1978 n'est pas entièrement représentatif des différentes classes de protéines
connues. Ainsi l'échantillon de 1978 était composé essentiellement de petites molécules solubles très
différentes des protéines membranaires ou virales que l'on peut étudier aujourd'hui. Ce constat a
conduit à une réactualisation de la matrice (Jones et al., 1992) en considérant 16 130 séquences issues
de la version 15 de Swiss-Prot, ce qui correspond à 2 621 familles de protéines. Cette étude a permis
de prendre davantage en compte les substitutions qui étaient mal représentées en 1978. Une autre
critique –mais qu’on peut adresser à l’ensemble des matrices de scores– est que l’on ne prend pas en
compte l’environnement (voisinage) de la paire considérée.
BLOSUM. On doit cette matrice à Henikoff et Henikoff (Henikoff et Henikoff, 1992). Une
approche différente a été réalisée ici pour mettre en évidence le caractère de substitution des acides
aminés. Alors que les matrices PAM dérivent d'alignements globaux (cf. la recherche d'alignements
optimaux page 85) de protéines très semblables, ici le degré de substitution des acides aminés a été
mesuré en observant des blocs d'acides aminés issus de protéines plus éloignées. Chaque bloc est
obtenu par l'alignement multiple sans insertion-délétion de courtes régions très conservées (cf. la base
BLOCK page 80). L’hypothèse sous-jacente est que ces blocs correspondent à des éléments bien
conservés au sein des structures tridimensionnelles des protéines correspondantes. Au sein de chaque
alignement, les séquences sont ensuite regroupées en familles partageant plus d’un certain pourcentage
seuil d’identité. Les fréquences de substitution pour toutes les paires d’acide aminé sont alors
calculées et permettent d’obtenir une matrice logarithmique de probabilité dénommée BLOSUM
(BLOcks Substitution Matrix). Différentes matrices ont été calculées en faisant varier le pourcentage
d’identité seuil. A titre d’exemple, la matrice BLOSUM62 (cf. Figure 2-9) a été obtenue en utilisant
un seuil de 62% d’identité : si deux séquences d’un même alignement initial partagent plus de 62%
d’identité, elles ne sont alors représentées qu’une seule fois dans l’alignement servant à construire la
matrice BLOSUM62.
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *
A 4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 0 -3 -2 0 -2 -1 0 -4
R -1 5 0 -2 -3 1 0 -2 0 -3 -2 2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1 0 -1 -4
N -2 0 6 1 -3 0 0 0 1 -3 -3 0 -2 -3 -2 1 0 -4 -2 -3 3 0 -1 -4
N -2 -2 1 6 -3 0 2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4
C 0 -3 -3 -3 9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -2 -4
Q -1 1 0 0 -3 5 2 -2 0 -3 -2 1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2 0 3 -1 -4
E -1 0 0 2 -4 2 5 -2 0 -3 -3 1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -1 -4
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 2 -3 0 0 -1 -4
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 2 -3 1 0 -3 -2 -1 -3 -1 3 -3 -3 -1 -4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 -2 2 0 -3 -2 -1 -2 -1 1 -4 -3 -1 -4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 0 1 -1 -4
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 0 -2 -1 -1 -1 -1 1 -3 -1 -1 -4
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 -4 -2 -2 1 3 -1 -3 -3 -1 -4
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -2 -4
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 1 -3 -2 -2 0 0 0 -4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 -2 -2 0 -1 -1 0 -4
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 2 -3 -4 -3 -2 -4
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 -1 -3 -2 -1 -4
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 -3 -2 -1 -4
B -2 -1 3 4 -3 0 1 -1 0 -3 -4 0 -3 -3 -2 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4
Z -1 0 0 1 -3 3 4 -2 0 -3 -3 1 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4
X 0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -2 0 0 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -4
* -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 1
Figure 2-9 Matrice de substitution BLOSUM62. Les scores positifs indiquent les acides aminés considérés
comme similaire. Les scores de la diagonale correspondent aux valeurs attribuées en cas d’identité. On compte 24
acides aminés au lieu de 20 : X et * correspondent à des acides minés indéterminés, B correspond à D ou N, et Z
peut remplacer E ou Q.
Il est à noter que par la suite, d’autres matrices ont vu le jour, dérivées d’alignements structuraux
(Risler et al., 1988 ; Overington et al., 1990 ; Bowie et al., 1991).
2.4.1.2 La prise en compte des insertions dans les alignements par paires
La comparaison locale de deux séquences, qu’elles soient nucléiques ou protéiques, repose sur
une hypothèse d’évolution par mutations ponctuelles, à savoir, l’un des trois cas de figure qui suit : (i)
le remplacement d’un acide aminé ou d’un nucléotide par un autre, (ii) une délétion (iii) ou une
insertion. Afin d’évaluer la qualité d’un alignement, un score élémentaire issu de la matrice de
substitution est calculé à chaque position alignée et une pénalité est également calculée en cas
d’insertion ou de délétion (« indel »). La valeur attribuée aux pénalités d’indel est généralement
calculée avec une loi affine associant une pénalité d’ouverture de l’indel à une pénalité d’extension
augmentant linéairement avec la longueur de l’indel. L’avantage de ce calcul est sa simplicité mais la
modélisation de la pénalité à attribuer aux insertions fait encore l’objet d’optimisation, en particulier
dans le cas de l’alignement de séquences très divergentes.
2.4.1.3 Les algorithmes d’alignement

Il existe un certain nombre de façon d’aligner deux séquences entre elles en tenant compte des
insertions et/ou délétions. Ainsi, pour deux séquences de longueur M et N, le nombre d’alignements
possibles est de n=2M2N. Par exemple, rien que pour deux séquences de 20 résidus, il y aurait 2(40)
façons différente d’aligner, soit à peut près 137 milliards de combinaisons possibles. Il existe une
solution pour trouver l’alignement optimal : la programmation dynamique.
Programmation dynamique. Les méthodes de programmation dynamique sont des approches

algorithmiques développées par le mathématicien Richard Bellman visant à réduire la complexité de
certains problèmes combinatoires par recherche d’optimum de sous problèmes. Appliquées au
problème des alignements de séquences, les méthodes programmation dynamique construisent un
alignement optimal de sous-séquences de plus en plus longues en utilisant les scores obtenus pour les
sous-séquences. Les méthodes de programmation dynamique les plus couramment utilisées pour les
alignements de séquences sont les algorithmes de Needleman et Wunsch (1970) et Smith et Waterman
(1981).
Needleman et Wunsch (NWS). L’algorithme de Needleman et Wunsch a été développé pour

réaliser l’alignement global de deux séquences protéiques (Needleman et Wunsch, 1970). Cet
algorithme s’organise en deux étapes. Une matrice d’alignement dont les deux dimensions
correspondent aux deux séquences à aligner, est remplie à chaque position par le score maximal d’un
alignement qui se terminerait à cet élément (règle de récurrence simple présenté à la Figure 2-10)
selon la formule suivante :
S (i − 1, j − 1) + S SubMatrix ( ai , a j )

S (i, j ) = max  S (i, j − k ) + k × Winsert
 S (i − l , j ) + l × W
 insert
Où S(i,j) est le score somme de la case d'indice i et j, SSubMatrix(ai,aj) le score de la matrice de

similarité (score PAM ou BLOSUM par exemple) entre l’acide aminé ai et aj, et Winsert la pénalitée
d’insertion d’un gap sur la séquence. À chaque case de la matrice, le chemin d’où l’on provient
(substitution, délétion ou insertion) est noté.
Enfin, la matrice d’alignements, parcourue en sens inverse, à partir du bout des deux séquences en
remontant le chemin noté, permet d’identifier l’alignement global optimal entre les deux séquences
(flèches vertes dans la Figure 2-11). De nombreux programmes utilisent cet algorithme d'alignement.
Le programme ALIGN (Dayhoff et al., 1979) en est une application directe avec l'utilisation de
pénalités à deux paramètres (dépendant et indépendant de la longueur).
Figure 2-10 Construction de la matrice des scores d'alignement entre les deux séquences « HEAGAWGHEE »
et « PAWHEAE » calculée à partir d’une matrice de similarité basée sur les scores de substitution BLOSUM62 et
un coût d’insertions (Winsert) constant de -8. La séquence horizontale est indicée en i et la séquence verticale en j.
Pour chaque cellule, le score maximal obtenu à partir des trois flèches de couleurs est attribué à cette cellule. Dans
l’exemple, la flèche rouge correspond à une absence d’insertion et le score associé se calcule par S(i,j)= S(i-1,j-
1) + SBLOSUM62(W,H) = –16 –2= –18, la flèche verte à une insertion dans la séquence 1 dont le score associé est
S(i,j)= S(i,j-k) + k*Winsert = –10 –8 = –18 avec (k=1), et la flèche bleue, à une insertion dans la séquence 2
ayant un score associé de S(i,j) = S(i-l,j) + l*Winsert = –24 –8= –32 (l=1). Dans la Figure 2-11 ci-dessous,
seuls les parcours passant par les flèches bleues et vertes sont conservés car ils sont associés aux trajectoires ayant
fourni les scores maxima.
Figure 2-11 Lecture de la matrice de scores d’alignement afin d’identifier l’alignement optimal par
l’algorithme NWS. Les flèches indiquent à partir de quelle cellule le score d’alignement a été obtenu à l’étape de
construction de la matrice (Figure 2-10). Les flèches vertes indiquent le parcours produisant le score optimal
parmi les flèches rouges illustrant les sous-parcours optimaux. Les flèches bleues indiquent les parcours
produisant les mêmes scores que le parcours optimal. L’alignement optimal (parcours vert) est présenté en
également.
Smith-Waterman. L’algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, 1981) permet

d’identifier le(s) meilleur(s) alignement(s) local(aux) deux séquences. La procédure est directement
inspirée de celle de Needleman et Wunsch. La principale différence vient du fait que n’importe quelle
case de la matrice d’alignement peut être considérée comme un point de départ pour une trajectoire
maximisant un score d’alignement. On arrive à ce comportement en réinitialisant le score à 0 dès qu’il
devient inférieur à 0. Ainsi, la case en question peut être considérée comme un nouveau point de
départ d’un petit alignement de type NWS (qui s’arrêtera dès que le score diminue). Une fois la
matrice d’alignement remplie, il suffit de noter la case de score le plus élevé et de remonter jusqu’au
prochain zéro pour obtenir le meilleur alignement local (on peu répéter l’opération pour obtenir les
autres meilleurs alignements locaux)
Figure 2-12 Lecture de la matrice de scores d'alignement afin d'effectuer l'alignement optimal par l'algorithme
de Smith et Waterman. Les flèches indiquent à partir de quelle cellule le score d’alignement maximal a été obtenu
à l’étape de construction de la matrice. Les flèches vertes indiquent le parcours produisant le score optimal parmi
les flèches rouges illustrant les sous-parcours optimaux. L’alignement optimal correspondant au parcours vert est
présenté.
Développement des méthodes heuristiques. Les méthodes de programmation dynamique

permettent l’obtention d’un alignement optimal entre deux séquences, mais elles présentent en
contrepartie un coût en temps de calcul et en mémoire important. Ces méthodes sont donc adaptées
pour aligner un nombre limité de séquences, mais sont moins utilisées pour comparer une séquence
avec un grand ensemble de séquences (bases de données)3. Le but de ces méthodes heuristiques est de
calculer à moindre coût des alignements pas nécessairement optimaux mais de qualité suffisante pour
établir des relations de similarités entre les séquences. Ces méthodes heuristiques ont été déjà
évoquées précédemment : il s’agit des algorithmes FASTA et BLAST.
3
Du moins, jusqu’à présent, car vu l’augmentation des puissances de calcul, les logiciels tels que BLITZ
(Sturrock et Collins, 1994) ou SSEARCH (Pearson, 1991) permettent de le faire à présent.
Figure 2-13 Algorithme FASTA. (a) Comparaison de la position et de la nature de segments de longueur L
entre deux séquences afin de repérer les régions les plus denses en identités partagées. (b) Évaluation des 10
régions présentant les plus hauts scores de similarité calculés à partir des matrices de substitution. Cette étape
correspond à une recherche de similitude sans insertions. Le score init1 est attribué à la région ayant le plus fort
score parmi les 10 analysées (initn est le score incluant les autres régions). (c) Jonction des régions précédentes,
s’il en existe au moins deux et si chacune d’elles possède un score supérieur à un seuil donné. Ce seuil correspond
à un score moyen attendu pour des régions non apparentées. Les régions initiales sont réunies à chaque fois que
leur score diminué d’une pénalité de jonction est supérieur ou égal au score init1. Cette étape permet d’éliminer les
segments peu probables parmi ceux définis à l’étape précédente. (d) Alignement optimal (par programmation
dynamique) des deux séquences en considérant uniquement les régions définies à l’étape précédente avec calcul
d’un score (opt). Cette étape n’est accomplie que pour les « meilleurs » séquence de la banque (Source Barton,
1996)
FASTA est un logiciel d’alignement de séquences aussi bien protéiques que nucléiques. Il a été
pour la première fois décrit par D.J Lipman et W.R Pearson (Pearson et Lipman, 1988) sous le nom de
FASTP car il n’était élaboré que pour la recherche de similarité dans les séquences protéiques. FASTA
est apparu ensuite comme une amélioration de FASTP, incluant la recherche de similarité entre
séquence nucléique contre séquence nucléique, et séquence de protéine traduite contre séquence
nucléique. Cette nouvelle version de FASTA incorpore une évaluation de la signifiance statistique des
alignements obtenus. Le logiciel FASTA présenté précédemment procède en quatre étapes telles
présentées sur la Figure 2-13. Le programme calcule ensuite un z-score qui correspond à un score
diminué de la moyenne des scores des séquences de la banque et normalisé par l’écart type des scores.
BLAST (pour Basic Local Alignement Searc Tool) développé par S.F Altschul (Altschul et al.,
1990), est lui aussi un outil pour comparer les séquences biologiques primaires. A ce jour, il est
certainement l’outil le plus utilisé en bioinformatique, probablement parce qu’il repose sur une grande
efficacité algorithmique associée à une fiabilité statistique suffisante. Ces deux propriétés font de lui
l’un des programmes de recherche les plus rapide à ce jour, permettant ainsi la recherche sur des
grandes banques de données. Il permet ainsi de répondre à ce genre de questions qu’un chercheur a
l’habitude de se poser : « D’où provient cet ADN que je viens juste de séquencer ? » ou encore
« Quels autres gènes codent pour des protéines qui présentent des structures ou motifs tels que celui
dont je viens de déterminer ? » etc. … BLAST s’est vu décliné en plus de 7 versions différentes,
comme BLASTN qui compare deux séquences nucléiques, BLASTP, deux séquences protéiques,
BLASTX une protéine traduite à partir d’une séquence nucléique selon les 6 cadres de lecture… L’une
de ces versions, appelé PSI-BLAST présente des caractéristiques fort intéressantes car l’algorithme est
itératif et permet un affinement de la recherche basée sur les similarités déjà trouvées. Tout comme
FASTA, BLAST est une heuristique d’alignement local. Son fonctionnement peut être décrit en trois
étapes. D’abord, il cherche des coïncidences de mots de longueur W (usuellement égale à W=3 pour
les séquences protéiques) qui se ressemblent entre la séquence requête et les séquences de la banque.
Pour ce faire, BLAST calcule un dictionnaire des mots équivalents à ceux de la séquence requête et ne
conserve que ceux dont le score d’alignement obtenu à l’aide d’une matrice de substitution, dépasse un
certain seuil (seuil "T"). Une fois ces mots rangés, BLAST parcours ensuite les séquences de la
banque, et s'arrête à chaque mot d'une séquence de la banque ayant un correspondant dans le
dictionnaire de mots similaires tiré de la séquence. BLAST essaie alors d'étendre l'alignement local
(sans insérer de gap) de part et d'autre des ces "amorces" – constituées des 2 mots coïncidant – pour
obtenir un alignement local optimal (ou HSP pour "High-scoring Segment Pairs") dont le score est au
moins à S ou une E-value inférieur à un seuil spécifié.
Figure 2-14 Algorithme du logiciel BLAST (Altschul et al., 1990) (source de la figure :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/BLAST_algorithm.html)
Pour évaluer la validité statistique d’un alignement, le programme BLAST s’appuie sur une
expression analytique qui permet de calculer la probabilité d’obtenir l’alignement par hasard à partir
du score de l’alignement en question. La distribution des scores d’alignement obtenus par la
comparaison d’une séquence avec l’ensemble des séquences d’une base de données est supposée
suivre une loi de distribution dite des valeurs extrêmes. Fonction du score, la E-value (ou nombre
d’alignement attendu par hasard ayant un tel score) peut s’écrire de la façon suivante :
E - value = K × L1 × L2 × e − λ ×Score
Dans cette expression L1 et L2 sont des longueurs des deux séquences à aligner, K et λ des
paramètres de normalisation ajustés en fonction de la matrice de substitution utilisée, de la taille de la
base de données, de la taille des séquences. Plus la E-value est faible, plus l’alignement est supposé
significatif.
2.4.2 Les méthodes d’alignements multiples
La recherche par paires entre une séquence d’intérêt et les séquences des bases de données a
permis d’identifier un ensemble de séquences (supposées homologues). L’étape qui suit a pour objectif
d’agencer en colonne les acides aminés qui possèdent la même histoire évolutive : c’est l’étape
d’alignement multiple. L’obtention d’alignements multiples constitue une étape essentielle de
l’analyse bioinformatique : elle permet de mettre en évidence les positions importantes pour la
structure et/ou la fonction. Dans le contexte de la prédiction de structure, l’optimisation des
alignements multiples revêt donc une importance cruciale.
2.4.2.1 Méthodes optimales

L’algorithme de programmation dynamique (NWS) décrit précédemment pour deux séquences est
généralisable à l’alignement de N séquences (Kruskal et Sankoff, 1983). Le souci qu’on rencontre lors
d’utilisation de cet algorithme est sa complexité en temps et en mémoire (de l’ordre de O(Nk)).
Quelques astuces ont été mises au point pour accélérer le temps de calcul, comme dans la méthode
MSA où la matrice n-dimensionnelle est « tronquée de ses coins », mais les calculs demeurent de
infaisables sur plus d’une dizaine de séquences.
2.4.2.2 Méthodes heuristiques

De la même manière que pour les alignements deux à deux, des méthodes heuristiques ont été
développées pour pallier à la complexité de l’algorithme. Une façon de résoudre le problème de
l’alignement de N séquences consiste à utiliser une procédure progressive d’alignement par paires qui
peut être esquissée comme suit : (i) Alignement par programmation dynamique des deux première
séquences, (ii) Alignement de la 3e séquence avec l’alignement précédent, (iii) Alignement de la
séquence N avec l’alignement obtenu sur les N-1 premières séquences. Ce type de méthode présente
toutefois une part de difficulté : il faudra toujours définir l’ordre dans lequel les séquences doivent être
prises en compte car l’alignement final en dépend. Plusieurs solutions ont été envisagées pour
contourner ce dernier problème. Il est possible dans un premier temps de limiter la difficulté à
l’alignement de trois courtes séquences (Murata et al., 1985) ou de séquences relativement proches
(Bains, 1986). On peut également chercher à définir d’abord « l’ordre de passage » des séquences à
traiter au moyen d’arbres de distances (Higgins et al., 1992 ; Higgins et Sharp, 1988 ; Sankoff et al.,
1976) ou en utilisant les scores obtenus par alignement par paire des différentes séquences pour
ensuite les aligner en sous groupes, puis en groupes (Corpet, 1988 ; Taylor,1987). Un nombre
important de logiciels et de programmes exploitent ces différentes approches : il serait long de tous les
présenter. Ici, on se propose de décrire ClustalW, l’un des plus simples, rapides largement utilisé (et
aussi cours de cette thèse).
CLUSTALW. De tous les logiciels, ClustalW (Thompson et al., 1994) est sans conteste l’un des
plus populaire dans la production d’alignements multiples à partir de séquences récupérés à partir d’un
BLAST par exemple. Il procède en plusieurs étapes. La première étape calcule un arbre
« dendogramme » qui sert de guide pour l’alignement multiple. Pour cela, un alignement de toutes les
séquences deux à deux est effectué par un algorithme relativement frustre mais extrêmement rapide
(n.(n-1) comparaisons) qui donne un score de distance pour chaque couple. Un arbre est alors construit
par Neighbor-Joining à partir de la matrice des distances. Les deux séquences les plus proches sur
l’arbre sont alignées. Un « profil » est alors construit à partir de cet alignement. Chaque position de ce
profil représente la « moyenne » des deux séquences de la paire. La séquence suivante (ou profil de
séquences déjà alignées) la plus proche (par rapport à la topologie de l’arbre) est alors alignée sur le
profil de la paire. On peut noter que les gaps aux positions terminales des séquences ne coûtent rien.
Les gaps seront introduits soit dans la nouvelle séquence (ou le nouveau profil), soit dans le profil. Ce
point représente une des principales limites du programme car il lui est impossible d’effectuer un gap
ou de le recalculer sur seulement une portion des séquences déjà alignées.
2.4.2.3 Alignements multiples et profils.

PSI-BLAST. Les procédés heuristiques précédemment décrits génèrent généralement un grand
nombre d’insertions qui rend les alignements multiples difficiles à exploiter. Ces procédés constituent
néanmoins une première approximation efficace. PSI-BLAST a été créé pour rechercher des
homologies éloignées, à faible identité de séquence. Sa première itération est un simple BLASTP qui
va donner les voisins proches de la séquence protéique recherchée. À partir des résultats obtenus, la
distribution des acides aminés et des insertions dans chaque colonne de l’alignement multiple permet
d’extraire une fréquence d’occurrence pour chaque position qui peut être traduite en termes de scores
de probabilité sous forme d’une matrice appelée PSSM (Position Specific Score Matrix ou « profil »).
Un exemple de PSSM généré par le logiciel PSI-BLAST est illustré sur la Figure 2-15. C’est ce profil
qui est alors utilisé en remplacement de séquence dans une seconde itération pour rechercher de
nouvelles séquences.
Figure 2-15 Représentation d'un profil paramétrant un alignement de 4 séquences, présenté en vertical à
gauche. Pour Chaque position un score de substitution différent est calculé pour chaque acide aminé et pour les
insertions (Gribskov et al., 1987).
Plusieurs itérations permettent d’affiner progressivement le profil et d’augmenter

considérablement la sensibilité de la méthode de détection. Ces itérations peuvent être effectuées
jusqu’à la convergence, c'est-à-dire qu’aucune nouvelle séquence n’est détectée. L’avantage de cette
méthode est qu’elle « gomme » les particularités de la séquence requête grâce aux séquences voisines
(supposées être de sa famille). Le principal reproche qu’on peut donner à cette méthode vient du fait
qu’un faux positif puisse apparaître au cours des itérations et qu’il soit pris en compte pour construire
la PSSM : ce faux positif serait alors susceptible de biaiser l’ensemble du profil aux itérations
ultérieurs. Quelques tentatives d’optimisations ont été proposées pour réduire le danger potentiel de
l’intégration de ces faux-positifs (Schaffer et al., 2001). Par ailleurs, l’approche itérative telle qu’elle
vient d’être décrite présente un risque : lorsque le nombre de séquences est faible, les probabilités
d’occurrence de certains acides aminés peuvent être estimées, faussant ainsi le profil associé à la
famille de séquences homologues. Par exemple, l’observation d’une position exclusivement occupée
par une isoleucine devrait laisser la possibilité que d’autres hydrophobes tels que la leucine ou la
valine soient également probables. Pour améliorer les profils, il est possible d’enrichir les fréquences
observées dans l’alignement par la connaissance que l’on a, a priori, des relations entre acides aminés.
Ces fréquences d’occurrence observées peuvent être corrigées par la méthode de « pseudo-count »
comme c’est le cas dans PSI-BLAST. Dans cette approche, on ajoute une contribution variable des
scores des matrices BLOSUM et PAM aux fréquences observées. L’importance de ces scores de
« connaissance a priori » est pondérée en fonction de la richesse d’informations déjà contenues dans
l’alignement multiple.
Les approches HMM. La notion de profil a été généralisée par le développement du formalisme
des Chaînes de Markov Cachées (HMM) (Eddy, 1998). Ce formalisme associé aux HMM fournit un
ensemble d’outils statistiques très performants pour manipuler et évaluer la vraisemblance d’un
alignement. Les méthodes HMM sont très utilisées dans le traitement des séquences à grande échelle,
dans la constitution et l’interrogation des bases de données de domaines telles que PFAM et SMART,
mais également pour la détection et l’alignement des homologues lointains. Sans rentrer dans les
détails, le formalisme HMM permet de générer un modèle statistique d’un alignement multiple dans
lequel l’apparition des acides aminés dans l’alignement suit un processus stochastique de Markov (la
probabilité de l’état n dépend uniquement de l’état n-1). Un alignement multiple peut être ainsi
modélisé par une chaîne d’éléments qui possèdent 3 états (M pour une position alignée, I pour une
insertion, D pour une délétion) avec des probabilités d’émission et de transition attribuées entre
chacun des états (Figure 2-16). Les modèles HMM fournissent une flexibilité accrue par rapport aux
profils en autorisant les états de délétions en plus des états d’insertions, et surtout en modélisant la
relation de voisinage (ignorée dans le cas des PSSM). Les probabilités qui sous-tendent un alignement
sont inconnues (variables « cachées ») et le premier objectif est de les estimer à partir des fréquences
d’occurrence observées à chaque position. Comme pour les profils présentés précédemment, cette
information est enrichie par la connaissance a priori des probabilités d’occurrence des acides aminés
en fonction des contextes.
Le modèle HMM ainsi paramétré peut être utilisé pour reconnaître les séquences susceptibles
d’être reliées aux séquences de l’alignement tel qu’il est décrit dans la Figure 2-16. L’algorithme de
Viterbi, de façon similaire aux algorithmes de programmation dynamique, permet d’identifier la
trajectoire la plus probable au sein du modèle HMM. Formellement, une séquence n’est pas alignée
sur un HMM. Ce qu’on mesure, c’est la probabilité qu’un HMM donné puisse générer la séquence
alignée de façon optimale. La base Pfam dont je me sers pour identifier des P450s, est créée à partir
d’HHMER, un logiciel utilisant les HMM.
Seq A : A-YET
Seq B : A-FET
Seq C : GSY-T
Seq D : A-F-T
M1 : I1 : M2 : M3 : M4 :
pA=2/3 pS=1 pY=2/3 pE=1 pT=1
pG=1/3 pF=1/3
I0 I1 I2 I3 I4
0 1/3 1 0 0 0
1 2/3 2/3 1 1
Début M1 M2 M3 M4 Fin
0 0 1/3 0
1
0
D1 D2 D3 D4
Figure 2-16 Architecture simplifié d’un modèle HMM (HMMER plan 7) et exemple de paramétrage.
L’alignement des trois séquences A,B et C peut être représenté par une chaîne à 4 états. Les probabilités de
transitions entre ces états déduites de l’alignement multiple sont indiquées en rouge au dessus de chaque flèche.
Les probabilités d’émission de chaque acide aminé au sein de chaque état sont indiquées au dessus du modèle.
L’indentification de la trajectoire pour le HMM génère la séquence D alignée de façon optimale par l’algorithme
de Viterbi. La trajectoire permettant de maximiser des probabilités lors du parcours du HMM est indiquée en vert.
L’alignement optimal pour la séquence D est indiqué en haut. (Source : thèse de V. Meyer)
2.4.3 Comparaison de deux structures
Après avoir abordé les comparaisons des séquences primaires issues des bases de données, il est
intéressant de s’attarder à la comparaison de structure. Les techniques de comparaison de structures
protéiques sont essentielles dans beaucoup de domaines de recherche, notamment dans la prédiction de
structure d’une protéine et dans la compréhension de l’évolution des structures protéique. Initialement,
les première méthodes de comparaison servaient à comparer une structure avec elle-même : il
s’agissait tout simplement de comparaison de postions atomiques. Très vite, ces méthodes se sont
montrées limitées : lors de comparaison de structures différentes, un problème de choix de
correspondance entre les éléments à comparer se posait : comme deux protéines ne sont pas
composées de la même séquence en acides aminés, il n’est pas possible de comparer tous les atomes,
chaînes latérales comprises. Dans un premier temps, il a fallu ainsi se restreindre aux atomes du
squelette peptidique. Toutefois, le rôle des chaînes latérales (dans le cas de reconnaissance ou fixation
de ligand) ne pouvant être négligé, l’incorporation de ces atomes dans la comparaison devaient être
également prise en compte. Par ailleurs, l’organisation des structures secondaires semblait être
conservée dans les protéines – même lointaines – d’une même famille. Ne comparer que celles-ci
serait donc plus pertinent, au moins pour des protéines assez différentes. Au final, trois niveaux de
représentation ont pu être recensés : une représentation « tout atome », une représentation restreinte
aux atomes du squelette peptidique et une représentation en termes de structures secondaires. A ces
trois représentations, une dernière peut être ajoutée : il s’agit de la représentation qui tient compte la
forme générale de la molécule.
De façon similaire à la comparaison des séquences, l’hypothèse sous-jacente à la comparaison de

structures est généralement l’homologie supposée de ces structures (ou d’une de leurs sous-structures).
Ainsi, on cherche à mettre en correspondance la position des acides aminés tout en tenant compte de
leur séquence et de sa divergence. Dans le cas où l’on veut mesurer la convergence éventuelle des
structures ou des sites, la comparaison ne doit pas prendre en considération la séquence des résidus.
Quelles que soient les méthodes utilisées, le principe dans la comparaison de structure demeure
inchangé : il s’agit de mettre en correspondance un élément d’une structure avec un seul élément de
l’autre structure. L’objectif recherché est le calcul d’une mesure quantitative de similarité entre deux
structures protéiques et/ou de générer un alignement structural, souvent converti ensuite en alignement
de séquences. Quatre points sont importants lors d’une comparaison structurale. Ceux-ci ont été
définis par Holm et Sander (Holm et Sander, 1996).
- La représentation des structures : les structures protéiques sont toujours simplifiées mais les
caractéristiques conservées doivent être suffisantes pour la comparaison. Exemples : les Cα
sont décrits par leur coordonnées cartésiennes ou par leurs distances internes ; les Structures
Secondaires sont décrites par des vecteurs ; etc…
- La mesure de similarité ou de dissimilarité : il faut pouvoir déterminer si un sous-
alignement est meilleur qu’un autre pendant le processus d’alignement. Cette mesure est bien
sûr totalement dépendante de la représentation ;
- L’algorithme de comparaison : un algorithme général bien connu peut être adapté au
problème (recherche des cliques maximales dans un graphe, Monte Carlo…) ou un algorithme
ad hoc peut être développé ;
- Les post-traitements : par exemple le calcul d’un score exprimant la significativité des
résultats (il peut être empirique ou statistique, humain ou automatique).
Tout comme pour les séquences, les techniques et méthodes associées à ces comparaisons de
structures sont extrêmement riches et diversifiées. Dans les sections qui suivent, ne seront présentées
que succinctement les méthodes les plus usuelles et surtout celles qui ont servi pour cette thèse.
2.4.3.1 Description au niveau atomique

Les méthodes utilisant cette représentation permettent rarement de comparer des protéines
entières. La majorité d’entre elles sont utilisées pour l’amarrage de molécules (docking). Elles se
regroupent usuellement en deux catégories : les méthodes comparant des atomes ou des groupes
d’atomes et les méthodes comparant des surfaces. La première catégorie est plus spécifique dans la
comparaison de protéines entières tandis que la seconde est plus utilisée pour comparer des sites
spécifiques. Dans ces catégories, il existe des méthodes de graphes, des méthodes de constructions de
motifs structuraux, des méthodes par hachage géométrique mais également les méthodes fondées sur
la forme, utilisées en morphométrie où l’on cherche à déceler des homothéties. Toutes ces méthodes
permettent selon des principes et algorithmes différents de comparer deux structures entre elles, en
prenant en compte tous les atomes.
Étant donné qu’aucune de ces méthodes n’a été utilisée dans mon travail de thèse, il n’est pas
nécessaire de s’attarder d’avantage sur ces méthodes au niveau atomique.
2.4.3.2 Description au niveau du squelette peptidique

Les méthodes utilisées à ce niveau, déjà plus communes que celles décrites précédemment,
présentent deux manières d’aborder cette description. Dans la première, le squelette peptidique est
décrit par les coordonnées cartésiennes, dans la majeure partie du temps limitée à celles des Cα. Pour
comparer deux structures à l’aide de cette description, il faut effectuer une transformation rigide d’une
structure sur l’autre. Cette description est appelée « externe » par opposition aux descriptions internes
où les deux structures peuvent être comparées directement. Les descriptions internes peuvent être des
distances internes, des angles dièdres (φ,ψ) ou (α,τ) ou encore d’autres repères définis par des
éléments des structures.
Mesures de similarité : les RMSD. Quelque soit les descriptions – externes ou internes – des
mesures de similarités ont été mise en place afin de comparer deux structures. La plus usitée de toutes,
est certainement le RMSD (Root Mean Square Deviation) sur les coordonnées. Il s’agit de la racine
carrée de la moyenne des carrées des distances entre les atomes mis en correspondance dans les deux
structures – décrits par leurs coordonnées cartésiennes –. Ce RMSDc est donc :
∑ D (a , b' )
i i
2
RMSDc = i =1
N
où N est le nombre d’atomes mis en correspondance : dans la structure B, l’atome b’i est mis en
correspondance avec l’élément ai de la structure A, et D(ai,b’i) est la distance entre les atomes ai et b’i
après superposition optimale de tous les atomes mis en correspondance (ensembles M(A) et M(B)).
Une superposition optimale de M(A) et M(B) est donc une transformation rigide T (une translation-
rotation) telle que le RMSDc est minimal. Il existe de nombreuses méthodes pour trouver cette
transformation optimale, comme celles faisant appel au formalisme fondé sur les quaternions
(Kearsley, 1989) ou encore diagonalisation de matrices (Kabsch, 1976, 1978) itérations successives
(Sippl et Stegbuchner, 1991) ou encore minimisation (McLachlan, 1979,1982). D’autres RMSD tels
que le RMSDd et l’URMS et les RMSD pour les angles, existent mais ne seront pas présentées car elles
n’ont pas été utilisées durant ce travail de thèse.
Coordonnées cartésiennes des Cα. Les premières méthodes de comparaison de structures

protéiques utilisent la description des coordonnées cartésiennes, sont généralement restreintes à la
comparaison des Cα. Dans ces méthodes, qui sont plutôt des méthodes de comparaison globale,
l’objectif est de minimiser la valeur du RMSDc avec un maximum de Cα en correspondance possible.
Deux types de méthodes exploitant ces propriétés se distinguent : (i) les méthodes itératives de
superposition - alignement et (ii) les méthodes basées sur des fragments structuraux similaires. Dans
un cas, il s’agit de processus itératifs où les meilleures correspondances d’un ensemble de paires
P(A,B) entre les deux structures A et B sont recherchées. Ces processus se font en deux étapes, la
première par correspondance des Cα, cherche une superposition optimale des deux ensembles de
points de P(A,B), et la seconde, par programmation dynamique, détermine une nouvelle et meilleure
correspondance en prenant en compte la superposition précédemment effectuée. Les programmes tels
que SHEBA (Jung et Lee, 2000) TMalign (Zhang et Skolnick, 2005) ou encore MINAREA (Falicov et
Cohen, 1996) illustrent cette catégorie de méthodes. Dans l’autre cas, il s’agit de travailler avec des
fragments de taille donnée pour caractériser les paires de protéines similaires. Toutefois, ces
méthodes-ci ne permettent pas l’alignement des deux structures entre elles. Ces méthodes basées sur
les fragments structuraux similaires, sont décomposées en trois étape, comprenant dans la première
étape une recherche de fragments similaires (AFP) dans les deux structures avec un RMSDc faible,
puis dans une seconde étape une recherche des meilleures séries de AFP, et enfin dans la dernière
étape qui est similaire aux méthodes de superposition – alignement, un affinement de l’alignement ou
de la correspondance au niveaux des résidus. On retiendra ici les programmes tels que WHAT IF
(Vriend, 1990 ; Vriend et Sander, 1991) ou encore Flexprot (Shatsky et al., 2002, 2004).
Coordonnées internes : les distances « internes ». L’utilisation des coordonnées internes

dispense de l’étape de superposition. Les méthodes exploitant ces coordonnées entre atomes d’une
même structure, ne prennent en compte que les Cα (ou quelques autres atomes) pour comparer les
structures au niveau peptidique. Il y a N2/2 descripteurs pour chaque structure (N étant le nombre
d’atomes) au lieu des 3 x N paramètres de la description en coordonnées cartésiennes. Ces N2/2
descripteurs sont souvent présentés sous la forme d’une matrice (symétrique) dite de distances internes.
Les matrices de contact sont aussi parfois utilisées : elles sont remplies par des 1 si la paire d’atomes
satisfait à certaines conditions (par exemple si la distance interne est en dessous d’un seuil) 0 sinon.
Les méthodes utilisant les coordonnées internes sont très coûteuses en temps de calcul, aussi, à
l’image de celles vues pour les séquences, diverses heuristiques ont été utilisées. Ces différentes
méthodes développées se classent entre trois grandes catégories : méthodes utilisant la programmation
dynamique, méthode d’assemblage d’AFP, méthodes utilisant les graphes. Dans le cas des méthodes
utilisant la programmation dynamique, le programme SSAP (Structure and Sequence Alignment
Program) – ou ses dérivés – (Taylor et Orengo, 1989a, 1989b) en est le seul représentant. Son dérivé
SAP (Structure Alignment Program) (Taylor, 1999) est d’ailleurs utilisé pour établir la classification
CATH (cf. section 2.3.3.3, page 76). Il procède par une méthode dite de double programmation
dynamique avec un score basé sur les distances internes et se servant également d’autres descripteurs
comme l’information de séquence, l’accessibilité au solvant etc.… Pour ce qui concerne les méthodes
d’assemblage d’AFP, le principe repose sur la recherche de petits fragments similaires (AFP) puis de
la meilleure série d’AFP par assemblage d’AFP entre eux. Les deux programmes les plus connus,
DALI (cf. section 2.3.3.1 page 75) et CE (Combinatorial Extension Shindyalov et Bourne, 1998)
utilisent ce principe. Enfin, dans le cas des méthodes utilisant les graphes, les distances internes sont
considérées comme des « relations » entre atomes : chaque structure est représentée par un graphe
ayant pour sommet les atomes et les distances pour arêtes pondérées. Par ailleurs, dans cette méthode,
la contrainte de séquentialité a permis de réduire le problème de recherche des sous-graphes communs
isomorphes. L’alignement est ensuite affiné en ajoutant les Cα voisins des régions communes.
Coordonnées internes : les angles. Les angles utilisés pour la comparaison de structures
protéiques sont les angles (φ,ψ) ou (α,τ) ou encore des dérivés de ceux-ci. A ce jour, il existe assez
peu de méthodes de comparaison structurales qui utilisent cette description angulaires des structures.
Ces méthodes reposant sur les angles ont pourtant été utilisées très tôt pour comparer les structures
entre elles. En dépit de leur rapidité, l’alignement fourni ne se révélait pas toujours très précis. Ce
n’est que récemment que les angles ont été mieux exploités dans la comparaison de structure. GOK
(Jean et al, 1997), le logiciel dont je me suis servi pour rechercher les similitudes communes entre les
structures de P450s utilise les angles (α,τ) pour représenter la trajectoire du squelette protéique et
comparer les structures des protéines entre elles. Il permet de déterminer les sous-trajectoires
communes les plus longues, entre deux ou plusieurs structures. Son fonctionnement sera détaillé
ultérieurement (cf. section 2.4.4.3, page 106).
2.4.3.3 Description en éléments de structures secondaires

Les structures secondaires sont des éléments structuraux réguliers, souvent considérés comme
fragments structuraux les mieux conservés dans des structures similaires ou homologues. De plus, en
raison de son niveau de représentation qui engendre moins d’éléments (~qu’une dizaine de SSE pour
une protéine de 300 résidus), les comparaisons de structures sont plus rapides que les précédentes. Les
méthodes de comparaison travaillant à ce niveau sont donc bien adaptées pour la recherche de
similarités structurales dans les banques de structures. En contrepartie, les méthodes exploitant les
SSE sont biens moins précises que celles vues précédemment, certaines régions de protéines pouvant
être ignorées. Les structures secondaires prises en comptes par ces méthodes sont généralement
uniquement des hélices α et des feuillets β. Il existe plusieurs méthodes d’attribution des éléments de
structure secondaire. La plus courante est probablement DSSP (Kabsch et Sander, 1983).
Méthodes avec SSE représentés par des vecteurs. Les méthodes de comparaison utilisant les
SSE sont très nombreuses. Pour la plupart, les SSE y sont représentées par des vecteurs colinéaires à
leur axe principal qui n’est autre qu’une droite pour laquelle l’inertie des éléments (souvent
uniquement des Cα) du SSE est minimale. Le vecteur dont les extrémités correspondent aux
projections des atomes aux extrémités des SSE est orienté de l’extrémité N-terminal vers l’extrémité
C-terminale. En conséquent, une structure est représentée par un ensemble de vecteur, réduisant le
problème à la comparaison de deux ensembles de vecteurs (l’ordre des SSE pouvant être prise en
compte ou non lors de la comparaison). Les algorithmes les plus utilisés pour la comparaison des
ensembles de vecteurs proviennent de la théorie des graphes. Tous disposent d’une procédure assez
similaire qui se déroulent en quatre étapes : (i) dans un premier temps, les SSE sont attribués et les
paramètres des vecteurs calculés, (ii) puis un graphe est construit pour chaque structure ayant aux
sommets les SSE et pour arêtes des informations sur l’organisation spatiale relative des vecteurs ; (iii)
les graphes sont alors comparés ente eux avec une recherche de sous-graphes similaires communs et
enfin en dernière étape (qui peut être facultative) un retour au niveau peptidique avec alignement
résidu par résidu. Parmi les programmes qui utilisent ces méthodes de graphes, on citera à titre
d’exemple POSSUM (Protein Online Substructure Searching) (Mitchell et al., 1990 ; Artymiuk et al.,
1990), PROFET (Grindley et al.,1993), GRATH(Harrison et al., 2003), VAST (Gibrat et al., 1996 ;
Madej et al., 1995) ou encore le très récent SSM (Krissinel et Henrick, 2004). Les méthodes de
graphes ne sont pas exclusives dans l’utilisation des vecteurs de SSE. On y trouve également des
méthodes par programmation dynamique utilisées dans le programme LOCK (Singh et Brutlag, 1997 ;
Shapio et Brutlag, 2004) par exemple ou encore PrISM (Yang et Honig, 1999, 2000).
Méthodes avec SSE représentés par d’autres caractéristiques. Outre la représentation par
vecteur, les SSE peuvent être dans certains cas représentés par d’autres caractéristiques. Dans la
méthode MATRAS (Kawabata, 2003) la comparaison se fait par programmation dynamique à partir
de scores de similarités basés sur un modèle d’évolution. Cette méthode a été largement utilisée au
cours de la thèse pour comparer ses résultats avec le logiciel GOK : une description plus détaillée est
donc nécessaire pour comprendre son fonctionnement. Dans cette méthode, trois scores de similarité
structurale sont calculés de manière analogue au modèle de Dayhoff (matrice PAM) pour la
substitution des acides aminés. Ces scores sont calculés entre paires de protéines homologues d’une
banque non-redondante à 95% d’identité extraite de SCOP, regroupées et alignées grâce à leurs
séquences. Une formule générale de log-odds est utilisée pour le calcul des trois scores :
P(i → j )
S (i, j ) = log
P( j )
Où i et j sont les états des caractéristiques structurales (telles que la distance inter résidus par
exemple), P(j) la probabilité que l’état j apparaisse par hasard, et P(i→j) la probabilité que l’état i
passe à l’état j durant l’évolution, suivant une transition du modèle de Markov. Les trois scores de
similarité structurale sont les suivants :
- un score SSSE, de paires de SSE, où trois états sont les combinaisons d’hélices α et de feuillets
β. Les SSE sont représentés comme des vecteurs. Quatre fonctions de similarité géométrique
sont estimées pour chaque type de paire (θ1, θ2, d et φ, voir la Figure 2-17) ainsi que deux
fonctions de similarité de longueur (L1 et L2). Le score SSSE est la somme de ces six fonctions
estimées sur l’échantillon des protéines homologues ;
- un score environnemental Senv où les états sont les deux structure secondaire (hélices α et
feuillets β) ainsi que 3 types de boucles définis selon leurs angles (φ,ψ). Chacune des
catégories peut être enfouie ou exposée, ce qui donne 10 états ;
- une score de distances Sdis où les états sont les distances internes entre Cβ discrétisées avec un
pas de 1Å. Les bornes sont [0,50Å], il y a donc 50 états. Le score Sdis entre une distance Dix –
entre le ie et le xe résidu d’une protéine – et la distance Djy – entre le je et le ye résidu d’une
autre protéine – est évalué par les transitions observées entre ces distances pour tous les
intervalles k en résidus (k=|i–x|=|j-y|, l’intervalle est identique sur les deux structures).
Figure 2-17 Les quatre paramètres géométriques associées aux pairs de vecteurs de SSE de MATRAS : la
distance minimale entre les deux SSE d, les deux angles (plans) θ1 et θ2 et l’angle dièdre φ entre les plans formés
par chacun des deux vecteurs et la droite minimale en pointillée. Les deux longueurs sont L1, L2 exprimées en
résidus. Figure extraite de (Kawabata, 2000).
L’alignement se déroule alors en trois étapes :

1. premier alignement grossier des SSE en utilisant les scores SSSE ; les meilleures suites de
SSE sont trouvées par branch and bound ;
2. un second alignement des SSE est obtenu par programmation dynamique (alignement
local avec pénalités d’ouverture et d’extension de gap) en utilisant le score
environnemental Senv et en affectant un bonus pour l’alignement des SSE déjà en
correspondance avec l’étape précédente ;
3. alignement des résidus : l’alignement précédant étant utilisé comme initialisation,
plusieurs alignements successifs par programmation dynamique sont effectués en
utilisant le score de distance Sdis. Cette étape est répétée jusqu’à convergence.
Un Z-score est calculé avec le score final de l’alignement, la moyenne et l’écart type étant
calculés en comparant la structure requête avec toute la banque.
Méthodes utilisant les alphabets structuraux. Dans ces méthodes, les structures protéiques sont
converties en suites de symboles qui correspondent à des classes de blocs structuraux. Les blocs
structuraux sont le plus souvent de taille fixe, comportent quelques résidus (moins de 10) et sont
chevauchant. Ils sont classés en comparant toutes les sous-structures d’une taille donnée d’une banque
non redondante de structure. Ces classes de blocs partitionnent le mieux possible l’espace de structures.
Un symbole est très souvent affecté à chaque classe de blocs, c’est pourquoi on parle d’alphabets
structuraux. Dans la méthode nommée SA-Search (Guyon et al., 2004), un modèle de loi normale
multivariée a permis de discrétiser le squelette peptidique en classes de blocs structuraux de longueur
4 résidus (un critère d’information est utilisé pour déterminer le nombre de classes optimales). Les
blocs structuraux – symboles d’un alphabet structural – sont décrits par 4 distances internes (voir
Figure 2-18).
Figure 2-18 Chaque fragment de 4 résidus es représenté par un vecteur de taille 4 qui contient 3 distances entre
Cα non consécutifs (d1=d(Cαi - Cαi+2), d1=d(Cαi - Cαi+3), d1=d(Cαi+1 - Cαi+3)) et la projection
orthogonale d4 de Cαi+3 sur le plan formé par les premiers Cα. Figure extraite du site
http://bioserv.rpbs.jussieu.fr/Help/SAHelp.html
Cet alphabet structural comporte 27 symboles et permet une description précise de l’ensemble des
structures (Camproux et al., 2004). Après cette étape, l’enchaînement des blocs structuraux est évalué
par un modèle de Markov entraîné sur une banque non redondante. Pour comparer les structures,
celles-ci sont d’abord converties en suites de symboles de l’alphabet structural avec l’algorithme de
Viterbi (Baum et al, 1970) qui permet de déterminer la meilleure série de symboles en prenant en
compte la dépendance Markovienne. La comparaison des deux structures est ensuite faite soit par
programmation dynamique (Smith et Watermann), soit par construction d’arbre de suffixes pour
rechercher des motifs exacts. Ces deux méthodes sont assez rapides pour rechercher les similarités
structurales dans une banque.
2.4.4 Comparaison multiple de structures
Les méthodes de comparaison multiple de structure s’appuient souvent sur des méthodes de
recherche de motifs. L’objectif est de déterminer les éléments communs à plusieurs structures, ces
éléments formant alors le(s) motif(s) caractéristique(s) du groupe de structures. De telles méthodes
sont assez répandues au niveau des séquences, mais il est plus difficile de les appliquer au niveau des
structures. Les méthodes d’alignement multiple de structure ont été initialement conçues pour la RMN,
où il fallait comparer les modèles obtenus entre eux afin de déterminer un cœur structural rigide d’une
structure. Toutefois, lorsque des structures différentes sont comparées, comme pour les comparaisons
de paires de structures, la définition de correspondances entre les éléments est nécessaire.
Un objectif des méthodes de comparaison multiple de structure est de déterminer des régions ou
blocs structuraux conservés au sein d’une même famille de structures homologues. De tels blocs
structuraux sont utilisés notamment pour la modélisation par homologie ou par reconnaissance de
repliement. Plusieurs serveurs sont consacrés aux alignements structuraux multiples ; certains ont été
présentés précédemment. La caractérisation de ces blocs structuraux conservés peut apporter aussi des
informations sur les mécanismes d’évolution des structures protéiques ainsi que sur le repliement.
Les méthodes de comparaison multiple peuvent être regroupées en deux catégories : les méthodes
procédant à des comparaisons de paires de structures et les méthodes réellement multiples procédant
sans comparaison préalable des paires de structures.
2.4.4.1 Méthodes avec comparaison des paires de structures

De nombreuses méthodes abordées dans la section précédente ont été adaptées à la comparaison
structurale multiple. Elles peuvent être subdivisées en trois sous-catégories : les méthodes avec une
structure pivot (moyenne ou réelle), les méthodes d’alignement hiérarchique (avec construction d’un
dendogramme) et les méthodes utilisant les graphes. Des méthodes de superposition multiple ont aussi
été développées mais nécessitent une correspondance ou un alignement préalable. De manière
comparable aux séquences biologiques, il faut noter que toutes les paires de structure ne sont pas
forcément alignées de manière optimale dans un alignement optimal multiple : ces méthodes
s’appuyant sur les alignements optimaux par paires, sont des heuristiques.
Méthodes d’alignement hiérarchique et méthode de structures moyennes. Dans ces méthodes,

les structures sont représentées au niveau des résidus et la procédure générale s’effectue en trois
étapes : (i) alignement de toutes les paires de structure (N(N-1)/2 alignements) ;(ii) construction d’un
dendogramme à partir des scores calculés ; (iii) alignement de toutes les structures dans l’ordre
indiqué par le dendogramme (en commençant par la paire de structures les plus similaires). On trouve
parmi ces méthodes les programmes COMPARER (Sali et Blundell, 1990) ou encore STAMP (Russell
et Barton, 1992) qui ont servi pour établir la base HOMSTRAD. Dans ces deux cas, l’alignement
d’une structure avec un ensemble de structures déjà alignées se fait par programmation dynamique.
MATRAS utilise également ce principe pour l’alignement multiple. La similarité entre toutes les
paires de structures est calculée par alignement, comme décrite précédemment, et un arbre est ensuite
construit par la méthode UPGMA. L’alignement entre deux groupes suit celui entre les deux structures
appartenant à chacun des groupes qui alignent le mieux.
2.4.4.2 Méthodes avec structure pivot ou moyenne

Dans ce genre de méthode, une structure réelle ou calculée va servir de référence pour aligner les
autres structures. Plusieurs méthodes sont proposées ici, comme celle de Gerstein et Altman (Gerstein
et Altman, 1995) qui ont développé une méthode pour trouver un cœur structural d’une famille de N
structures. Pour ce faire, ils n’utilisent pas de blocs structuraux mais de résidus en équivalence
(pouvant être discontinus) sur l’ensemble de chaque structure. Un alignement multiple (ou cœur)
initial étant donné, deux étapes suivantes sont alors répétées : (i) calcul de la position moyenne de tous
les éléments de ce cœur et superposition de toutes les structures par rapport à cette structure moyenne ;
(ii) calcul de la variation des positions de toutes les structures par rapport à la structure moyenne, pour
ôter la position ayant la plus forte variation. Les deux étapes sont répétées jusqu’à ce qu’il n’y ait plus
de résidu dans le cœur. L’analyse statistique des résultats de cette procédure permet d’identifier le
cœur.
Une autre méthode décrite par Gerstein et Levitt (Gerstein et Levitt, 1996, 1998) utilise la
méthode itérative classique de superposition-alignement par programmation dynamique pour aligner
les paires de structures autour d’une structure « médiane » choisie, celle qui est en moyenne la plus
proche des autres structures. Après superposition, de nouveaux alignements entre la structure médiane
et les autres structures sont calculés par programmation dynamique, le score dépendant de la distance
externe entre les Cα. Ces alignements sont ensuite combinés pour former l’alignement multiple et les
structures sont à nouveau superposées selon ces nouvelles correspondances entre Cα.
Il existe bon nombre d’autres méthodes, mais les deux exemples présentés ci-dessus illustrent
bien les méthodes avec structure moyenne (pour la première méthode) ou pivot (pour la seconde
méthode).
2.4.4.3 Méthodes sans alignement des paires

Ces méthodes sont similaires dans leur concept à celles qui ont déjà été vues : il y a les méthodes
utilisant les graphes, les méthodes de hachage géométrique et les méthodes de recherche de motifs
répétés. Parmi ces derniers, trois logiciels, dont deux importants dans mon travail de thèse, peuvent
être cités : GOK, YAKUSA et GAKUSA. Dans ces trois outils, la conformation des squelettes
peptidiques est décrite par une suite d’angles (φ,ψ) ou (α,τ). Les valeurs des angles pouvant être
échantillonnées suivant un pas –ou maille– δ, la conformation du squelette peut alors être décrite par
une chaîne de « caractères » d’un alphabet fini comptant 360/δ symboles. La recherche de similarités
structurales entre structures se ramène alors à la recherche de motifs répétés dans des chaînes de
symboles constituées de la concaténation des structures.
2.4.5 Recherche de similarités structurales locales développé à l’ABI
2.4.5.1 Logiciel GOK

GOK utilise une méthode nommée KMRC est inspiré de l’algorithme de recherche de motifs
répétés exacts de Karp, Miller et Rosenberg, nommé algorithme de KMR (Karp et al, 1972). Afin de
comprendre les expressions qui seront utilisées ultérieurement, il est nécessaire de définir
préalablement les termes utilisés
Nomenclature. L’alphabet sera nommé Σ et le « texte » dans lequel les motifs sont cherchés s. Le
symbole en position i dans le texte sera noté s[i]. Un motif de longueur k sera désigné par k-motif, et
un k-motif répété, un motif répété au moins une fois dans au moins q structures, q étant le quorum4.
Dans le cas de motifs exacts, une instance d’un motif représente ce motif. Par contre, dans le cas de
motifs approchés, une instance ne représente pas le motif car elle est « stricte ». Une distinction se fera
alors entre motif et instance d’un motif. Les occurrences p d’un motif sont les positions de ses
instances. L’ensemble des occurrences d’un motif sera nommé extension.
Description. La recherche de motifs répétés est un problème connu et très étudié. Beaucoup de
solutions ont été proposées dont certaines permettent de trouver des motifs approchés (Crochemore et
Rytter, 1994). Dans l’algorithme de KMR, la construction des motifs répétés exacts est progressive :
les motifs de taille k permettent de construire les motifs de taille 2k. En effet, si un motif de taille k a
pour extension {i,j} et qu’un second motif répété a pour extension {i+k,j+k}, il est possible de
combiner ces deux motifs pour former le motif de taille 2k présent en i et j. La recherche des motifs
répétés est donc faite en largeur d’abord.
Cependant, les motifs construits à chaque étape ne respectent pas obligatoirement la condition de
quorum, ils ne sont pas toujours répétés. Soient par exemple deux k-motifs, un dont l’extension est {i,j}
et l’autre dont l’extension est {i+k,l} avec l ≠ j + k. La combinaison de ces deux k-motifs aura pour
4
Dans tous les exemples, le quorum est de 2.
extension {i}, le nouveau motif n’existant pas en j. Ce nouveau 2k-motif n’est pas un motif répété, il
doit donc être éliminé. Il n’est pas possible de savoir quel motif sera répété avant de les avoir
construits. Une étape de filtrage des motifs répétés – i.e. ne respectant pas le quorum – est donc
nécessaire après chaque étape de construction.
Il sera bien sûr dommage de ne construire que des motifs de taille multiple de deux mais il n’est
pas obligatoire que deux motifs soient contigus pour être combinés : ils peuvent être chevauchants et
donner naissance à des motifs de taille intermédiaire (entre k et 2k). En théorie, il est aussi possible de
combiner des motifs de taille variable. Cependant, il est plus simple qu’à une étape donnée, tous les
motifs aient la même taille. Un des intérêts de cet algorithme est qu’à chaque étape, seuls les motifs
existants réellement son créés et traités.
La méthode proposé par H Soldano et coll. (Soldano et al., 1995) est une généralisation de cet
algorithme permettant de trouver des motifs approchés. Pour trouver des motifs approchés, certains
symboles sont considérés comme similaires. Soit par exemple l’alphabet Σ = {a,b,c}, a est similaire à
b et b est similaire à c, mais a n’est pas similaire à c. L’instance de 2-motif « aa » est similaire à
« ab » et « ab » est similaire à « ac » mais « ac » n’est pas similaire à « aa ». Ces similarités peuvent
être représentées par un pavage de l’espace des symboles : l’espace de l’alphabet Σ est découpé en
pavés recouvrant Gi tels que l’ensemble des pavés G = {G1,G2,….G|G|} avec Gi ⊆ Σ pour 1≤ i ≤ |G| et
aucun 1≤ i,j ≤ |G| avec i ≠ j tel que Gi ⊆ Gj. Ces pavés peuvent donc être chevauchants mais ne
peuvent pas se recouvrir totalement. Les symboles dans un même pavé sont similaires. Dans notre
exemple, l’alphabet est découpé en deux pavés : G0 = {a,b} et G1 = {b,c}. L’alphabet utilisé pour
décrire les motifs sera pour les motifs approchés cet ensemble de pavés Gi, aussi nommé alphabet
dégénéré. L’algorithme de construction des motifs suit le même principe que l’algorithme pour les
motifs exacts : les motifs de taille k permettent de construire les motifs de taille 2k. Il faut cependant
noter que – puisqu’un symbole peut appartenir à plusieurs pavés – plusieurs motifs différents peuvent
exister en une même position. Toujours avec le même exemple, l’instance « ab » est similaire à « aa »
et à « ac » mais ces deux instances sont différentes. L’instance « ab » appartient donc à deux 2-motifs,
qui sont les motifs G0G0 et G0G1 lorsqu’ils sont écrits avec l’alphabet dégénéré.
Un effet de cette dégénérescence est que beaucoup plus de motifs sont générés à chaque étape et
certains des motifs ont une extension incluse dans l’extension d’un autre motif. Prenons par exmple le
texte s « abba », le même alphabet et les mêmes pavés que précédemment. Le symbole b appartient à
plusieurs pavés, le texte peut don être représenté de la manière suivante :
positions 1 2 3 4
symboles a b b a
pavés G0 G0 G0 G0
G1 G1
Quatre 2-motifs sont présents : G0G0 dont l’extension est {1,2,3}, G1G0 dont l’extension est {2,3},
G0G1 dont l’extension est {1,2}, et G1G1 dont l’extension est {2}. Ce dernier motif ne respecte pas le
quorum, il est donc éliminé. Par ailleurs, les deux motifs G0G1 et G1G0 ont chacun une extension
contenant deux occurrences, mais ces extensions sont chacune incluses dans l’extension du premier
motif G0G0. Ces deux motifs sont donc éliminés et seul le premier motif, G0G0 est conservé. Ce motif
est dit maximal. Les motifs maximaux seuls sont suffisants pour construire tous les motifs maximaux
de taille supérieure.
Cette méthode a été appliquée aux structures protéiques. Les symboles sont des angles discrétisés
selon une « maille » δ donnée. Les symboles sont alors des entiers représentant un intervalle d’angles.
Cependant, si δ = 10°, un angle de 8° est représenté par le symbole « 0 » car il fait partie de
l’intervalle [0°,10°[, il est alors considéré comme différent de l’angle 11° car ce dernier est représenté
par un symbole « 1 » (intervalle [10°,20°[). Or, ces deux angles devraient être similaires. La similarité
pour les angles fait intervenir un paramètre entier κ appelé « marge ». Si κ = 1, le symbole 1 est
similaire aux symboles 0 et 2. Deux angles sont donc considérés comme similaires si leur différence
angulaire est inférieur à (2 x κ +1) x δ.
La complexité de cet algorithme est : O(n.kmax.g2kmax.logkmax) avec n la longueur totale de la

structure, kmax la longueur maximale des motifs répétés, g la mesure de la dégénérescence ou nombre
maximal de pavés auxquels un symbole de l’alphabet peut appartenir. Dans l’exemple précédent, la
dégénérescence est de 3. Par exemple, le symbole 2 appartient aux pavés G0 = {0,1,2}, G1 = {1,2,3},
G2 = {2,3,4}
Cette méthode a été appliquée à la recherche de blocs structuraux similaires dans les cytochromes
P450 par P. Jean et coll. (1997) en vue de la modélisation de la structure du P450eryF.
2.4.5.2 Logiciel GAKUSA

GAKUSA est un autre logiciel, à l’instar de GOK, représentant la structure d’une protéine par sa
description en terme d’angles de coordonnées internes. Contrairement à GOK, GAKUSA repose sur
un algorithme de « Gibbs Sampling » (Lawrence et al, 1993). Cet algorithme permet de générer des
blocs d’alignement multiple sans passer par l’étape d’alignement par paires. Supposons qu’un bloc
structural similaire de taille l est recherché dans les m structures recodées en angles α discrétisés
(symboles). L’algorithme suivant est alors répété plusieurs fois :
• Un segment de taille l est d’abord choisi au hasard dans chacune des m structures ;
• puis, les deux étapes suivantes sont répétées jusqu’à convergence :
1. une structure est exclue et les probabilités de chaque angle αi à chaque position j dans les
segments des m-1 autres structures sont calculées selon la formule :
ci , j + b j
qi, j =
m −1+ β
Avec ci,j le nombre d’angles αi en position j des segments, bi les pseudo-
comptes pour l’angle αi, et m-1 le nombre de structures considérées ici. Les
« pseudo-comptes » bi sont évalués comme bi=βρi, ρi étant la fréquence des angles αi
dans les toutes structures et β une constante (en général β = \/‾(m-1)) Les fréquences pi
des αi hors des segments sont aussi calculées selon cette formule ;
2. dans la structure exclue précédemment, pour tous les segments de taille l, les ratio qi,j/pi
sont calculés pour toutes les positions j, puis normalisés en probabilités. Une position au
hasard est ensuite tirée selon ces probabilités. Le segment correspondant devient la
nouvelle position du segment pour cette structure.
Dans la méthode originale de « Gibbs sampling » décrite ci dessus, seule l’identité des angles est
prise en compte et non la similarité : ceci conduit à une estimation trop stricte et donc infructueuse des
blocs structuraux similaires. Il a été décidé d’ajouter dans l’étape 1) un terme supplémentaire de
« pseudo-comptes » basé sur la similarité entre les angles : si un angle à une position donnée est
compté, une fraction de ce comptage est rajoutée dans le comptage des angles voisins de cet angle. La
nouvelle formule s’écrit alors de la manière suivante :
∑γ
k = an lg es
jk ci , k + b j
qi , j =
m −1+ β
Où ci,k est toujours le nombre d’angles αk en position i et γik est la probabilité de l’angle discrétisé
k dans une gaussienne de moyenne i et d’écart type choisi (plus l’écart type est grand, plus la similarité
entre angles différents est élevée). Ceci permet donc de prendre en compte la similarité entre les
angles α discrétisés, indispensable lorsqu’on travaille sur les structures.
En fait, cette méthode de « pseudo-comptes de similarité » - développée pour les structures - peut
être étendue avec profit à l’alignement multiple de séquence d’acides aminés (domaine original
d’application de la méthode de « Gibbs sampling »). En effet, les « pseudo-comptes » supplémentaires
de similarité sont alors basés sur les fréquences de substitution (fréquences de mutabilité) tirées d’une
matrice de similarité de type BLOSUM ou PAM. Cette extension permet d’améliorer la
reconnaissance de blocs similaires difficiles à exhiber par le « Gibbs sampling » classique : on ajoute
de l’ « information biologique » quant à la substituabilité des acides aminés.
2.4.5.3 Logiciel YAKUSA

YAKUSA décrit est le troisième outil développé à l’ABI, utilisant les angles de coordonnées
internes pour décrire une structure. Il utilise cette fois ci cette description dans un algorithme de
recherche de motifs, dérivé de l’algorithme d’Aho-Corasik (Aho et Corasick, 1975). Un automate est
construit avec tous les petits motifs (appelés « graines ») d’une taille donnée de la séquence requête et
leurs « voisins ». Un motif voisin est un motif qui n’existe pas dans la structure requête, mais qui est
suffisamment similaire à un motif de la requête du point de vue de sa conformation. De par sa
structure, cet automate permet de rechercher tous les motifs « graines » qu’il contient, en temps
linéaire sur la banque de structures, et tous les motifs sont recherchés en parallèle. Pour chaque
protéine de la banque, les motifs « graines » communs avec la structure requête sont étendus si
possible, donnant ainsi des motifs communs plus grands. Un classement est ensuite effectué et donne
les protéines montrant les plus grandes similarités en structure avec la structure requête. Le principal
avantage de cette méthode, par rapport aux quelques méthodes existantes, est sa rapidité : le « scan »
par une structure requête des 1700 structures d'une banque non redondante tirée de la PDB est effectué
en 1 à 2mn sur un PC de bureau. Un autre avantage est que les similarités structurales exhibées sont
locales, ce qui permet la mise en évidence de sous structures communes, même si il n’y a pas de
ressemblance globale des deux protéines.
2.5 Construction d’un modèle
On doit le principe de reconstruire un modèle de protéine à partir de sa séquence aux travaux

d’Anfisen qui, pour comprendre le mécanisme de repliement des protéines, a émis au cours des années
60 l’hypothèse que la conformation native, fonctionnelle, d’une protéine correspond à celle qui
présente l’énergie libre la plus basse. Par conséquent, si le repliement s’effectue sous des contraintes
thermodynamiques, cette conformation ne devrait dépendre que de la séquence en acides aminés de la
protéine (Anfinsen, 1973). Cette hypothèse est fondamentale dans la mesure où elle laisse supposer
que la seule connaissance de la séquence en acides aminés de la protéine devrait – en théorie – être
suffisante pour obtenir sa structure 3D. De nombreux travaux sont venus nuancer l’hypothèse
d’Anfinsen sans pour autant la remettre totalement en cause, notamment avec l’addition au contrôle
thermodynamique d’un contrôle cinétique (lié à la vitesse de repliement) et avec l’identification de
protéines assistant le repliement comme les protéines chaperons. Aujourd’hui, le problème du
repliement protéique est encore loin d’être résolu. Par contre, il a conduit à l’émergence de méthodes
bioinformatiques visant à prédire la structure d’une protéine à partir de sa séquence en acides aminés.
Ces méthodes constituent une véritable alternative aux méthodes expérimentales de détermination de
structures pour réduire l’écart entre le nombre de structures et de séquences connues.
Les différents traitements de données sources décrites dans le paragraphe précédent sont
nécessaires à l’obtention d’un modèle qui copie au mieux la réalité. Selon les données à disposition et
les traitements qu’on a pu leur faire subir, différentes techniques de reconstruction sont possibles pour
prédire la structure d’une protéine à partir de sa séquence. Les méthodes de prédiction in silico de la
structure 3D des protéines à partir de la séquence en acides aminés sont généralement regroupées en
trois grandes catégories : la modélisation par homologie (ou comparative), les méthodes de
reconnaissance de repliement (ou d’enfilage) et les méthodes ab initio / de novo. Le choix de la
méthode dépend de l’existence ou non dans la PDB d’une protéine de séquence similaire à celle de la
protéine à modéliser (ou protéine homologue), et du taux d’identité de séquences entre ces protéines
(homologie plus ou moins distante).
Construction d’un modèle 113
Figure 2-19 Précision et applications possibles des modèles protéiques. L’application des méthodes de
modélisation par homologie (ou comparative), d’enfilage (ou threading) et ab initio / de novo dépend
principalement du taux d’identité de séquence avec des structure connue. La précision des modèles diminue
lorsque ce taux diminue : la valeur du RMSD des atomes de la chaîne principale du modèle (en rouge) par rapport
à la vrai structure (en bleu) augmente. Lorsque le taux d’identité de la séquence se situe entre 30% et 50% par
exemple, les modèles construits par homologie ont généralement environ 90% des atomes de la chaîne principale à
1,5Å de la vraie structure. Différentes applications sont possibles en fonction de la précision des modèles. Figure
extraite de (Baker et Sali, 2001)
Des problèmes majeurs sont liés à l’évaluation des performances des méthodes de prédiction
développées et à leur comparaison. Une solution à ces problèmes a été la mise en place d’une réunion
nommée CASP (Critical Assessment of Structure Prediction) qui a lieu tous les deux ans (Moult et al.,
1995). Cette dernière est née d’une volonté de tester la fiabilité des méthodes développées en évaluant
leurs performances sur un même jeu de protéines, et avec les mêmes critères. Elle consiste à proposer
aux différents groupes de recherche d’appliquer leurs méthodes sur des protéines dont la structure
vient d’être déterminée expérimentalement mais n’est pas encore déposée dans la PDB, ni publiée. Les
méthodes sont donc appliquées en aveugle. A la fin de la compétition, les différents modèles proposés
sont évalués par rapport à la vraie structure 3D. La première compétition CASP (ou CASP1) date de
1994. Les résultats publiés les plus récents sont ceux de CASP6 qui a eu lieu en 2004 (Moult et al.,
2005). Ceux de CASP7 qui s’est déroulé en Novembre dernier à Asilomar Conference Center en
Californie devraient être publiés cette année. Cette compétition permet d’évaluer les progrès réalisés
au cours des années dans les différentes catégories de méthodes de prédiction de structure (Ginalski et
al., 2005 ; Moult, 2005).
La précision des modèles obtenus par les différentes méthodes de modélisation ainsi que leurs
applications possibles sont résumées dans la Figure 2-19.
2.5.1 Modélisation par homologie
2.5.1.1 Principe
La modélisation par homologie (ou modélisation comparative) nécessite l’existence d’une
protéine de structure connue présentant plus de 30% d’identité de séquence avec la protéine à
modéliser (protéine cible), et qui pourra servir de structure de référence (Marti-Renom et al., 2000).
En effet, ce fort taux d’identité de séquence laisse supposer que les deux protéines sont homologues et
qu’elles adoptent des structures tridimensionnelles proches (Chlothia et Lesk, 1986).
Différentes étapes sont nécessaires. (i) Une structure de référence est sélectionnée pour servir de
support. (ii) Les séquences des protéines cible et support sont alignées. Le modèle peut alors être
construit avec (iii) la modélisation des régions conservées de la chaîne principale, (iv) la modélisation
des boucles, puis (v) le positionnement des chaînes latérales. Les dernières étapes correspondent à
l’optimisation et à la validation du modèle.
Actuellement, cette méthode est celle qui permet d’obtenir les modèles les plus précis. Toutefois,
ces méthodes sont loin d’être parfaites, de nombreux problèmes majeurs restent à traiter. L’alignement
des séquences par exemple est particulièrement délicat à réaliser lorsque le taux d’identité de séquence
diminue (Venclovas, 2003). De même, la modélisation des boucles, régions structurellement
divergentes, est complexe. De nombreuses études proposent des méthodes pour prédire la
conformation des boucles, soit ab initio (Fiser et al., 2000 ; Galaktionov et al., 2001), soit à partir de
banques de boucles (Donate et al., 1996 ; Oliva et al., 1997 ; Rufino et al., 1997 ; Wojcik et al., 1999 ;
Michalsky et al., 2003), ou encor par des méthodes mixtes (Deane et Blundell, 2001).
2.5.1.2 Quelques exemples

CASP donne un bon aperçu des différentes méthodes utilisées en modélisation comparative.
Toutes les méthodes présentes plus ou moins leurs avantages et leurs défauts, les facteurs pouvant
affecter la qualité d’un modèle sont souvent soit le choix de la séquence de départ (et donc le nombre
d’insertions – délétions qui apparaîtront au cours de l’étape d’alignement) soit le logiciel utilisé, soit
enfin l’expérience de la personne qui reconstruit la protéine. Outre les méthodes manuelles, on citera
ici trois logiciels, les plus communs, et surtout ceux que j’ai utilisé durant ma thèse : COMPOSER
(Sutcliff et al., 1987), SwissModel (Schwede et al., 2003) et Modeler (Sali et Blundell, 1993).
COMPOSER est un programme de modélisation comparative utilisé dans SYBYL, un ensemble

de programmes distribué par Tripos. Il correspond plus ou moins à une automatisation de la méthode
manuelle classique de reconstruction par homologie, et procède en six étapes : La première est une
étape de recherche d’homologue en séquence sur la PDB. La seconde étape consiste ensuite à
déterminer les graines (« seeds »), à savoir des résidus à topologie équivalente dans l’ensemble du set
de « structures homologues ». Cette identification se fait sur la similarité de séquence. En troisième
étape, un alignement structural est réalisé, à partir des graines déterminées dans l’étape précédente.
C’est à cette étape que des régions structuralement conservées (RSC) sont déterminés, donnant une
structure moyenne de RSC. Ces RSC sont trouvés par calcul de RMSD entre les Cα. Les séquences
des structures avec la séquence cible sont alors alignées. Au cours de la cinquième étape, le modèle est
d’abord reconstruit au niveau des RSC, et enfin, pour les régions plus variables, COMPOSER se sert
d’une base de boucles et de rotamères pour les chaînes latérales. Une fois le modèle construit, il faudra
alors procéder à son raffinement, et son évaluation.
SwissModel est quant à lui un serveur qui propose de prédire la structure d’une protéine à partir
d’une séquence fournie par l’utilisateur. Contrairement à COMPOSER, SwissModel est un logiciel
académique, qui ne nécessite donc aucune licence pour utilisation. Il procède en quatre étapes. La
première étape est similaire à celle de COMPOSER, c'est-à-dire la recherche de « templates » qui
serviront de références pour reconstruire le modèle. Cette recherche se fait à l’aide d’un BLASTP sur
une base ExNRL-3D, une base de séquences dont les structures sont connues. La seconde étape
consiste à définir les zones à modéliser. Un programme, SIM, ne retient que les séquences dont
l’identité locale de séquence est supérieure à 25% et définit des fragments de la séquence cible qui
seront modélisés en fonction de la similarité des séquences templates. Suite à ce travail, un alignement
structural des templates est réalisé avec construction du modèle. Pour cela, le programme ProMod
(Peitsch, 1996) est sollicité pour aligner les structures 3D des templates. Les parties structurales des
templates proches spatialement sont alors utilisées pour définir un nouvel alignement structural en
séquences primaires des templates. La séquence de la protéine à modéliser est alors alignée sur cet
alignement multiple. Les parties de la séquence cible qui n’ont pu être alignées (généralement les
boucles) sont alors modélisées à partir d’une bibliothèque de fragments issue de la Protéine Data Bank.
Les chaînes latérales manquantes sont ensuite reconstruites et celles incorrectes, corrigée. Enfin, une
minimisation énergétique est réalisé sur la structure obtenue, assurée par le logiciel GROMOS96
(Scott et al., 1999). La validation du modèle se fait alors par l’outil Profil 3D. Il existe des limites à
l’utilisation de ce serveur, qui sont d’au moins 30% d’identité de séquence sur au moins 60% de la
longueur de la séquence.
Modeller est certainement le logiciel de modélisation comparative le plus utilisé dans la

communauté scientifique. Gratuit à usage académique, c’est un programme entièrement automatisé :
l’utilisateur doit fournir un alignement de séquence (réalisé par ses propres soins) et le programme se
charge de calculer un modèle (sans atome d’hydrogène) en satisfaisant à la fois les contraintes
spatiales, la stéréochimie, les angles, les torsions, liaisons hydrogènes etc…. Les contraintes sont en
fait issues d’une analyse statistique des relations entre paires de structures homologues. Cette analyse
repose sur une banque de données de 105 alignements de familles qui incluent 416 protéines de
structures connues. En scannant la base, des tables quantifiant diverses corrélations sont obtenues,
comme celles entre deux distances équivalentes Cα – Cα, ou entre deux angles dièdres équivalents.
Ces relations sont exprimées en tant que fonctions de probabilité de densité (PDF) et peuvent être
utilisées directement comme des contraintes spatiales. Celles-ci sont donc obtenues de manière
empirique, à partir de banque d’alignement de structure protéique. Ces contraintes sont combinées
avec les énergies de CHARMM5 en une fonction objective. Finalement, un modèle 3D est obtenu
après optimisation de la fonction objective dans le plan cartésien. Cette optimisation fait appel à
5
Les champs de forces seront expliqués un peu plus tard dans le manuscrit
plusieurs méthodes dont le gradient conjugué, la dynamique moléculaire et le recuit simulé. Enfin, le
programme est également en mesure de reconstruire de novo les boucles des structures protéiques.
Figure 2-20 D’abord, les templates sont alignés avec la séquence cible à modéliser. Puis, les contraintes de
distances, d’angles etc. sont transféré à la cible afin d’obtenir des contraintes spatiales pour cette structure à
construire. Enfin, un modèle 3D est construit en essayant de satisfaire ces contraintes autant que possible.
2.5.2 Méthodes de reconnaissance de repliement
La modélisation devient beaucoup plus difficile lorsque le taux d’identité de séquence diminue et
qu’aucun homologue proche de structure connue n’est disponible. Les méthodes de reconnaissance de
repliement, qui cherchent à mettre en évidence des similitudes structurales lorsque l’identité de
séquence est beaucoup plus faible, sont une alternative. L’idée consiste à identifier parmi les
repliements connus celui qui pourrait adopter la séquence cible. Comme il l’a été déjà évoqué, le
nombre de repliements protéiques est limité, une nouvelle protéine a par conséquent de grandes
chances d’adopter un repliement déjà connu. Ces méthodes sont également appelées méthodes
d’enfilage (ou « threading » : de manière imagée, la séquence de la protéine à modéliser est « enfilée »
dans des repliements connus afin de déterminer celui qui lui correspondrait le mieux par calcul d’un
score de compatibilité. Ces méthodes sont généralement applicables entre 15% et 30% d’identité de
séquence. Leurs principales difficultés résident dans la réalisation des alignements de séquence –
structure et dans l’évaluation des repliements potentiels. De plus, elles sont limitées par le nombre de
repliements uniques connus (Sippl et al., 2001 ; Kinch et al., 2003).
2.5.3 Méthodes ab initio / de novo
Finalement, les méthodes ab initio cherchent à prédire la structure d’une protéine à partir de sa
seule séquence en acides aminés (sans utilisation de structure de référence). Elles constituent donc un
défi scientifique majeur et trouvent tout leur intérêt dans ce contexte de séquençage à grande échelle
qui génère un grand nombre de séquences pour lesquelles aucun homologue de structure connue n’est
disponible ou tout du moins trop difficile à déceler. Il convient ici de distinguer les méthodes ab initio
« pures » des méthodes dites de novo. Les méthodes ab initio « pures » reposent uniquement sur les
propriétés physico-chimiques des protéines et sur l’hypothèse que la structure 3D adoptée par une
protéine (ou structure native) est celle qui est la plus stable (d’énergie la plus faible) parmi l’ensemble
des structures possibles (même si quelques contre-exemples existent) (Bonneau et Baker, 2001). Les
méthodes de novo vont quant à elles exploiter des informations statistiques obtenues de l’analyse des
structures 3D connues (Skolnick et al., 2003).
Actuellement, les résultats les plus encourageants sont obtenus par des méthodes de modélisation
de novo construisant des modèles protéiques à partir de courts fragments de structure. La plus connu
est ROSETTA développé par le groupe de Baker et cool. (Simons et al., 1997). On trouve également
parmi ces méthodes de reconstruction l’utilisation de bibliothèques de fragments comme ceux
présentés pour l’alphabet structural.
2.5.4 Évaluation des modèles
Afin d’interpréter et exploiter les modèles 3D de protéines, il est essentiel d’estimer leur précision,
aussi bien globale que locale à certaines régions du modèle. Les erreurs dans les modèles proviennent
de deux sources principalement : (i) l’échec de la recherche conformationnelle pour trouver la
conformation optimale ainsi que (ii) l’échec de la fonction de scoring à identifier la conformation
optimale. Les modèles 3D sont généralement évalués selon des préférences géométriques des résidus
ou des atomes, qui sont dérivées de structures protéiques connues. En pratique, on a coutume
d’aborder une évaluation d’un modèle donné dans une manière hiérarchique. Dans un premier temps,
il est nécessaire d’évaluer si le modèle dispose au moins d’un repliement (« fold ») correct. Le modèle
aura un repliement correct si le « bon » template est utilisé et correctement aligné sur la séquence cible.
Une fois le repliement du modèle confirmé, une autre évaluation détaillée sur la précision globale de
la protéine peut être effectuée, basée sur la similitude globale de séquence sur lequel le modèle est
basé. Finalement, une variété de profils d’erreurs peut être construite pour quantifier les erreurs
possibles dans les différentes régions du modèle. Une bonne stratégie est d’utiliser différentes
méthodes d’évaluation de modèles et d’en sortir un consensus. De plus, les fonctions d’énergies sont
généralement développées pour travailler sur un certain degré de détails, et ne sont pas appropriées
pour juger les modèles à un degré plus fin ou plus grossier (Park et al., 1997). Il existe un nombre
important de programmes ou de serveurs d’évaluation (cf. Tableau 2.3).
Les modèles ont besoin d’une stéréochimie correcte. Les programmes les plus usuels pour évaluer
la stéréochimie sont PROCHECK (Laskowski et al., 1993), AQUA (Laskowski et al., 1996), SQUID
(Oldfield, 1992) et WHATCHECK (Hooft et al., 1996). Ces programmes vérifient les caractéristiques
suivants : les longueurs des liaisons (« bond length »), les angles de liaisons, les liaisons peptidique et
la planéité des cycles des chaînes latérales, la chiralité, les angles de torsion pour la chaîne principale
et les chaînes latérales, et les collisions entre les paires d’atomes non liés. En plus d’une bonne
stéréochimie, un modèle doit également avoir une faible énergie en terme d’énergie de champs de
force comme CHARMM, AMBER ou encore GROMOS. Toutefois, une faible énergie de mécanique
moléculaire ne signifie pas forcément que le modèle est correct (Novotny et al., 1984,1988). Ainsi, les
distributions de plusieurs caractéristiques spatiales ont été compilées à partir de structures de protéines
à haute résolution et chaque déviation aussi large soit-elle de la valeur la plus « probable » est
interprétée comme une indication forte d’erreurs dans le modèle. De telles caractéristiques incluent
l’empaquetage (Gregoret et Cohen, 1991), la formation de cœurs hydrophobes (Bryant et Amzel,
1987), l’accession au solvant (Chiche et al., 1990 ; Holm et Sander, 1992), la distribution spatiale des
groupes chargés (Bryant et Lawrence, 1991), la distribution des distances inter atomes (Colovos et
Yeates, 1993), le volume atomique (Pontius et al., 1996), les liaisons hydrogènes de la chaîne
principale (Laskowski et al., 1993).
D’autres groupes de méthodes pour tester les modèles 3D qui prennent en compte implicitement
plusieurs critères cités ci-dessus, mettent en jeu des profils 3D et des potentiels statistiques (Sippl,
1990 ; Luthy et al., 1992). Ces méthodes évaluent l’environnement de chaque résidu dans le modèle
en respectant l’environnement attendu comme celui trouvé dans les structures X à haute résolution.
Les programmes qui implémentent ces approches sont VERIFY3D (Luthy et al., 1992), PROSA
(Sippl, 1993), HARMONY (Topham et al., 1994) et ANOLEA (Melos et Feytmans, 1998).
Tableau 2.3 Quelques exemples de programmes d'évaluation

Programme Adresse internet Commentaires
d’évaluation
PROCHECK http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html Vérification de la stéréochimie
WHATCHECK http://www.sander.embl-heidelberg.de/whatcheck/ Système de validation structurale

Détermine le repliement natif de la
ProsaII http://www.came.sbg.ac.at
protéine
ProCyon http://www.horus.com/sippl/
Suite de programme dévaluation

BIOTECH http://biotech.embl-ebi.ac.uk:8400/
comprenant PROCHECK, PROVE et WHATIF
Outil d’évaluation pour le raffinement des
VERIFY3D http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Verify3D.html
structures RX
ERRAT http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Errat.html Evaluation des structures RX
Evalue l’environnement non local des
ANOLEA http://www.fundp.ac.be/pub/ANOLEA.html
atomes lourds de la molécule
AQUA http://www-nmr.chem.ruu.nl/users/rull/aqua.html
SQUID http://www.yorvic.york.ac.uk/~oldfield/squid Programme d’analyse de cristallographie
PROVE http://www.ucmb.ulb.ac.be/UCMB/PROVE.html Evaluation par calcul du volume atomique
2.6 Exploitation du modèle
Une fois le modèle obtenu, on dispose enfin d’un support d’étude. Toutefois, ce modèle n’est pas
encore exploitable : de même que pour les structures cristallographiques, il faut « relâcher »la
molécule afin qu’elle adopte une conformation stable de basse énergie. Ce travail de relaxation peut
être effectué par différentes méthodes dont (i) la chimie quantique (aussi appelée ab initio) dans
laquelle seuls les électrons sont traités, (ii) la méthode semi-empirique qui étudie seulement les
électrons de valence avec un hamiltonien plus simple qu’en ab initio, et (iii) la mécanique moléculaire
qui ne traite pas de l’électronique du système mais utilise les lois de la mécanique newtonienne. En
raison de la puissance de calcul demandé, les deux premières méthodes limitent la taille de molécules
étudiées à quelques atomes. C’est la mécanique moléculaire qui représente la forme la plus courante
des logiciels utilisés car elle est rapide, fiable et permet d’optimiser des molécules de poids très élevé
(macromolécules), avec un temps de calcul raisonnable.
2.6.1 Mécanique moléculaire
La structure 3D d'une molécule va dépendre des interactions intramoléculaires et des interactions

avec le solvant. La recherche des conformations consiste donc à déterminer les minima de l'énergie
globale d'interaction qui en général est réduite aux interactions intramoléculaires. La surface d'énergie
Exploitation du modèle 121
d'une molécule peut être approchée à l'aide d’une fonction analytique dont les termes sont une somme
de plusieurs fonctions analytiques aux constantes déterminées empiriquement. Celles-ci englobent
généralement une série de terme qui sont les suivants : un terme d’élongation des liaisons, un terme de
variation des angles, un terme d’énergie de torsion des angles dièdres, un terme prenant en compte les
énergies d’interaction entre atomes non-liés (Van der Waals) , un terme prenant en compte les énergies
d’interaction électrostatiques entre atomes non liés et enfin un terme prenant en compte les liaisons
hydrogènes. Tous ces termes se décrivent sous la forme Ks(r – r0) ou Kθ(θ – θ0) … Ks, Kθ sont
appelées constantes de force. Ces constantes dépendent bien sûr du type d'atome, mais aussi de leur
environnement. La liste complète de ces constantes est appelée champs de forces.
2.6.2 Champs de Forces
Un champ de force est une liste de constantes qui décrit les interactions entre atomes liés et non
liés. L'élaboration d'un champ de force doit répondre à 2 critères : (i) tout d’abord un critère de
simplicité pour pouvoir être calculée rapidement et ensuite (ii) un critère de précision pour calculer de
manière acceptable les propriétés structurales et thermodynamiques des molécules. De tels champs de
force sont apparus dés 1970 et continuent à évoluer aujourd’hui. On distingue dans les champs de
force deux catégories d’interaction : (i) les interactions entre atomes liés correspondent à des énergies
de déformation des liaisons, des angles de valence et de torsion des angles dièdres ; (ii) les interactions
entre atomes non liés correspondent aux interactions de Van der Waals, électrostatiques, liaisons
Hydrogène. En biologie, les champs de forces habituellement utilisés sont CHARMM, AMBER,
OPLS et GROMOS.
2.6.2.1 Atomes liés

La combinaison des interactions entre atomes liés est appelée champs de force de valence : il
s’agit d’une description simplifiée des forces du système, élaborée pour reproduire les propriétés
structurales, thermodynamiques ou dynamiques des molécules.
Élongation des liaisons ("Stretching"). La déformation des liaisons est en général faible (de
l'ordre de 0.05 Å) et est exprimée par un potentiel harmonique6 décrit par la fonction suivante :
1 n
El = ∑ k r ,i (ri − ri0 ) 2
2 i =1
6
Il existe un autre potentiel pour les élongations des liaisons appelés Potentiel de Morse. Celui-ci prend en
compte la dissociation, mais est nettement plus cher en temps de calcul, c’est pourquoi le potentiel harmonique
est le plus utilisé.
Déformation des angles ("Bending"). La déformation des angles est également faible (de l'ordre
de quelques degrés) et est exprimée par la fonction suivante :
1
Eθ = ∑
2 ij
kθ ,ij (θ ji − θ ij0 ) 2
Torsion des angles dièdres ("Torsion"). Pour des atomes co-planaires, la torsion des angles
dièdres est décrite par une fonction périodique développée en série de Fourrier :
1
Eτ = ∑ Ai ,n [1 + cos(nτ i − φ )]
2 i
2.6.2.2 Atomes non liés

Interactions de Van der Waals. L’énergie de Van der Waals entre 2 atomes i,j distants de rij
comprend: (i) un terme attractif variant en -1/rij6.Cette fonction est connue sous le nom d'énergie de
dispersion de London Edisp= -Cij/rij6. Les coefficients Cij sont établis pour les différentes paires
d'atomes présents dans la molécule. (ii) Un terme répulsif variant en en 1/rij12, traduisant le
recouvrement des nuages électroniques à courtes distances. Cette fonction (Lennard-Jones) est
couramment appelée potentiel 6-12 :
1   rij 
12 6
0
  r0 
E vdw = ∑ Aij  − Bij  ij  
2 ij   rij 

 rij


 
 
Interactions électrostatiques.
1. Il y a d’abord les calculs de charge-charge : l'énergie électrostatique entre 2 atomes ij de
charges qi et qj est représentée par la loi de Coulomb
qi q j
E el = ∑
ij 4πε ij rij
Où l constante diélectrique prend en général des valeurs de 2 à 4(1.5 couramment).Dans

certains programmes elle peut également varier en 1/rij.
2. Dans les interactions électrostatiques, on comptabilise également les calculs
dipôle-dipôle
Énergie des liaisons hydrogènes. La liaison Hydrogène est une interaction de 2 à 5 Kcal/mole
d'importance. Elle s'exerce entre un Hydrogène déficient en électrons et un atome de forte densité
électronique (comportant des doublets).
2.6.2.3 CHARMM, AMBER et GROMOS

CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics) est le nom d'un ensemble
de champs de force largement utilisés en biologie pour la dynamique moléculaire. C’est aussi le nom
du programme de simulation et d'analyses de mécanique moléculaire associé (Brooks et al., 1983 ;
Mackerelle et al., 1998). Le développement et la maintenance de CHARMM regroupent un réseau de
collaborateurs à travers le monde autour de M.Karplus et de son groupe à Harvard. Des licences sont
disponibles pour le milieu académique. La version commerciale de CHARMM, appelée CHARMm
(avec un 'm' minuscule), est fournie par Accelrys. Il existe plusieurs types de champs de force
CHARMM se différenciant tous par le numéro de version qu’ils portent, selon que l’on s’intéresse à
l’étude de protéines ou d’acides nucléiques ou lipide. Les numéros de version de ces champs de force
correspondent à la première version de CHARMM qui les a incorporés, cependant ils peuvent être
utilisés avec n'importe quelle version ultérieure du programme, ainsi que par d'autres programmes de
dynamique moléculaire compatibles, par exemple NAMD.
AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement) est une autre famille de champs
de force pour la dynamique moléculaire de biomolécules. Il a été développé par le groupe de P.
Kollman à l’Université de Californie (Duan et al., 2003). AMBER est aussi le nom du « package »,
l’ensemble d’outils pour les simulations de MD, qui implémente ces champs de force. Il est maintenu
par une active collaboration entre D. Case et ses collaborateurs. Comme pour CHARMM, il existe
différents champs de force AMBER plus ou moins adapté pour un type de molécule en particulier.
GROMOS est le troisième champs de force largement utilisé pour les biomolécules (Van
Gunsteren et al., 1996). Il a été développé à l’université de Groningen et l’ETH de Züirch. C’est le
logiciel GROMACS (Groningen Machine for Chemical Simulation) qui utilise principalement ce
champ de force. Contrairement aux deux autres champs de force, GROMOS est un champ de force de
type « atome unis » plutôt que de type tout atome, ce qui signifie par exemple qu’un groupe méthyle
est considéré comme un seul atome. Il a été optimisé pour respecter les propriétés des phases
condensées des alcanes. Cette simplification dans sa représentation des éléments fait de GROMACS le
programme le plus rapide en simulation moléculaire.
2.6.3 Minimisation
Avant toutes simulations de dynamique moléculaire, on a coutume de procéder préalablement à

une minimisation. Cette étape de minimisation consiste à diminuer l’énergie du système par
optimisation géométrique jusqu’à obtention d’un minimum local. En effet, aucun algorithme de
minimisation ne permet de garantir de façon absolue l’obtention d’un vrai minima (ou minimum
global). Il existe néanmoins des techniques comme celles de « recherche conformationnelle » qui
visent à extraire la molécule de son puits de potentiel.
Les algorithmes de minimisation consistent à chercher à partir de la géométrie initiale, des jeux de
coordonnées cartésiennes qui réduisent à son minimum la somme de toutes les contributions
énergétiques. Les méthodes couramment utilisées reposent sur la dérivée première de l’énergie
potentielle (Steepest descent ou Conjugate grandient). Ces algorithmes consistent à rechercher la
direction de la plus grande pente c.-à-d. celle sur laquelle l'énergie décroît le plus rapidement et à
modifier la structure en conséquence. La direction imposée aux coordonnées suit alors celle indiquée
par l'opposé au gradient d'énergie.
2.6.4 Dynamique Moléculaire
2.6.4.1 Définition
La dynamique moléculaire consiste à étudier la trajectoire d'une molécule en appliquant les lois de
la mécanique classique newtonienne c'est-à-dire, à simuler les mouvements atomiques au cours du
temps. Ces mouvements correspondent à des vibrations autour d'un minimum ou au passage d'un
minimum à un autre minimum d'énergie. Ainsi la dynamique moléculaire permet de s'extraire d'un
minimum local.
2.6.4.2 Description
Dans les simulations de dynamiques moléculaires, on souhaite connaître la position et la vitesse
des particules à chaque pas de temps. Ce temps évolue de manière discrète au cours de la simulation.
Le calcul des forces d'interaction s’effectue entre les atomes : il permet de déterminer l'évolution des
vitesses, et donc des positions, en utilisant les lois de la dynamique classique de Newton discrétisées.
Un des points important est la conservation d’énergie totale du système au cours de la simulation. La
méthode utilisée pour calculer les forces d'interaction (ou le potentiel dont elles dérivent) caractérise
une simulation. Par exemple on parle de dynamique moléculaire ab initio si le potentiel est calculé à
partir des calculs de la mécanique quantique. Si en revanche les forces dérivent d'un potentiel fixé
empiriquement, on parlera de dynamique moléculaire classique.
La dynamique moléculaire s'applique aussi bien à l'étude structurale des molécules qu'à des
systèmes en interaction de grande taille. Néanmoins, en raison des capacités limitées de calcul, le
nombre de particules dans une simulation l'est aussi. Pour simuler un matériau infini dans une, deux
ou trois dimensions, les particules sont placées dans un espace périodique : on parlera alors d'une boîte
de simulation. Lors du calcul des forces, la périodicité de l'espace devra être tenu en compte. En
pratique, on distinguera dans la force d'interaction des termes à courte portée, qui ne seront pas
affectés par la périodicité, c'est-à-dire que seules les particules les plus proches seront prises en compte,
et un terme à longue portée, qui devra en tenir compte. Le terme à longue portée est généralement de
type coulombien et sera calculé par la somme d'Ewald.
2.6.5 Le docking (ou arrimage)
En biologie structurale, on s'intéresse au rapport entre la structure des molécules et leur fonction
biologique. De manière générale, on peut dire que le domaine recouvre des questions relevant d'une
part de la pharmacologie (conception de médicaments) et d'autre part de la biologie cellulaire (étude
du fonctionnement de la cellule). Dans le premier cas, un récepteur étant connu, il s'agit de trouver un
ligand, c’est-à-dire une (ou plusieurs) molécule(s) complémentaire(s). Dans le second, on s'intéresse
plutôt à l'interaction entre macromolécules (protéines ou acides nucléiques) intervenant dans les cycles
cellulaires. On distingue donc les interactions entre ligand-protéine et les interactions entre
protéine-protéine. Une question centrale commune aux deux problématiques est le docking. Le
docking est l'étude des interactions intervenant lors de la formation de complexes moléculaires. Il
repose sur l’hypothèse que les ligands formant des interactions favorables avec le récepteur doivent
avoir une affinité de liaison élevée. Ces interactions entre molécules sont non liantes et concernent
donc : (i) les interactions VDW, (ii) les interactions électrostatiques, et (iii) les interactions hydrogènes.
Pour le sujet de thèse, on s’attachera plus au docking ligand-protéine. La plupart des programmes de
docking automatique effectuent une exploration systématique de l’espace des configurations pour
générer et évaluer un grand nombre de liaisons potentielles. Les structures générées sont alors
soumises à un critère de score pour identifier les plus intéressantes. C’est justement cette identification
qui pose problème lors du docking, à savoir si la génération et l’évaluation des complexes sont
plausibles. C’est pourquoi, il est préférable parfois de former manuellement les complexes, lorsque
l’utilisateur a une idée du placement des molécules entre-elles. Dans les expériences de docking, on
distingue les algorithmes de docking rigide (où les molécules sont figées) et ceux de docking flexible.
Dans le premier cas, il y a une simplification des degrés de libertés comme les deux molécules sont
rigides. L’un des premiers programme à utiliser ce genre d’algorithme est le programme DOCK
(Kuntz et al., 1982) : DOCK a été développé pour trouver des molécules à haut complémentarité de
forme avec le site de liaison. Pour cela, le site est transformé en image négative qui consiste en une
collection de sphères chevauchantes dont les rayons touchent la surface moléculaire en seulement
deux points. Les ligands sont ensuite confrontés à ces sphères en minimisant les interactions stériques
entre le ligand et le récepteur (cf. Figure 2-21)
Figure 2-21 L'algorithme DOCK (Kuntz et al., 1982). Les atomes sont positionnés au centre des sphères et la
molécule est positionnée à l’intérieur du site de liaison. Figure extraite de la page 556 de Molecular Modelling
d’AR. Leach.
Dans le cas des docking flexibles, tous les degrés de liberté conformationnels sont pris en compte,
même si la plupart du temps ils ne sont appliqués qu’aux ligands, le récepteur restant rigide. Plusieurs
méthodes sont utilisées pour effectuer cette recherche conformationnelle. On peut citer par exemple la
méthode de Monte Carlo (MC), souvent associé à du recuit simulé (Goodsell et Olson, 1990). A
chaque itération de la procédure MC, la conformation interne du ligand est changée (par rotation
autour d’une liaison) ou la molécule entière est aléatoirement translatée ou retournée. L’énergie du
ligand à l’intérieur du site est alors calculé par mécaniques moléculaires, et le mouvement est alors
accepté ou rejeté suivant le critère de Metropolis. Les algorithmes génétiques peuvent aussi être
appliqués pour le docking moléculaire (Judson et al., 1994 ; Jones et al., 1995 ; Oshiro et al., 1995).
Chaque chromosome code non seulement pour les conformations internes du ligand, mais aussi pour
sont orientation à l’intérieur du site. L’orientation et les conformations internes varient donc pendant
Conclusion 127
que la population évolue. Le score de chaque structure complexée agit comme une fonction de fitness
utilisée par chaque individu à chaque itération. Enfin, la distance géométrique peut également être
utilisée pour ce genre de docking moléculaire.
2.7 Conclusion
Il a été vu au cours de ce chapitre quelles sont les étapes nécessaires pour étudier une protéine in
silico par modélisation moléculaire. Afin de pouvoir étudier la fonction biologique d’une protéine, on
s’intéresse d’abord à sa structure : c’est le concept de la biologie structurale. Celle-ci repose sur
l’obtention d’un modèle des plus fiables possibles afin d’être utilisé en tant que support d’étude.
Lorsqu’on s’intéresse aux mécanismes de reconnaissance d’une protéine, l’obtention du meilleur
modèle outre la structure cristallographique, est le modèle par modélisation comparative. Ce modèle
repose sur un alignement des plus rigoureux et des plus fiables possibles. Dans le cas des P450s, la
construction de modèle ne pose pas de problème au sein d’une même famille. Ainsi, reconstruire un
CYP2C8 à partir d’un CYP2C9 ne pose pas en soi une difficulté majeure. En revanche, lorsque l’on ne
dispose pas de structure d’une même famille, le problème d’alignement est flagrant : les P450s étant
très divergentes en séquences, il s’avère extrêmement difficile d’obtenir un alignement de séquence
correct avec les outils actuellement disponibles. C’est pour cette raison que nous avons développé au
sein du laboratoire, une méthode nouvelle qui prend en compte la conservation de la structure pour
produire cet alignement : c’est le sujet du prochain chapitre.
Une fois le support obtenu, la compréhension des mécanismes de reconnaissance des CYPs
nécessitera l’analyse de résultats de docking de ligands dans le site actif qui peut être à l’état natif ou
légèrement modifié afin de repérer les résidus essentiels dans la reconnaissance du substrat.
Deuxième Partie
Nouvelles méthodes
129
CHAPITRE 3
3 Modélisation comparative adaptée pour les superfamilles
« Il faut construire sa vie et son bonheur avec ses

propres outils et non avec ceux du voisin »
Daniel Desbiens (1954– ?? ap JC)
131
132 Chapitre 3. Modélisation comparative adaptée pour les superfamilles
3.1 Introduction à la méthode
À mon arrivée au laboratoire, on m’a d’abord confié un sujet portant sur l’étude et la
compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans les phénomènes de reconnaissance de
multiples substrats par les cytochromes P450 de la famille des 3A (CYP3A). Je devais pour cela avoir
recours à une approche bioinformatique qui combine des techniques variées et complémentaires, telles
que la modélisation comparative, l’arrimage moléculaire (docking) et la dynamique. En début de thèse,
aucune structure cristallographique de la famille CYP3A n’était disponible dans la PDB, mais
plusieurs structures de P450s de micro-organisme (P450cam, P450terp, P450eryF, P450nor et CYP 51) et de
mammifère (en général privés de leur hélice d’ancrage à la membrane : CYP 2C5, CYP 2C8,
CYP 2C9, CYP 2B4) étaient dipsonibles. L’idée était d’utiliser les structures connues de CYPs pour
construire un modèle de CYP3A, mais la faible identité en séquence des structures disponibles fut le
premier frein à la proposition d’un modèle de CYP3A fiable.
Toutefois, une propriété importante et caractéristique des P450s pouvait être mise à profit : leur
repliement unique, de la bactérie au mammifère. Ainsi, une stratégie en 3 étapes inspirée de celle de
P.Jean (Jean et al., 1997) pour reconstruire un P450eryF a été adoptée. A la différence des techniques
classiques de modélisation comparative qui s’appuient sur un alignement purement séquentiel, la
méthodologie consiste ici à aligner par éléments structuraux plusieurs templates, pour définir des
zones fixes, en termes de structure. Ces zones correspondent à des morceaux d’hélices ou de feuillets,
mais ne sont pas limitées aux SSE uniquement : avec la technique de recherche utilisée, des morceaux
de boucles sont également pris en compte. Ces zones, appelées Blocs Structuraux Communs (CSBs),
sont utilisées pour être alignées avec la séquence du P450 à modéliser. Les zones variables seront
quant à elles reconstruites sans information structurale a priori. Ainsi, cette méthode s’affranchit de
l’utilisation d’une structure unique, évitant d’obtenir un modèle trop proche des templates initiaux, et
permet également de fournir un alignement en séquence plus fiable.
Cette méthodologie en trois étapes fera l’objet de ce chapitre : dans un premier temps je montre
comment obtenir les CSBs. Puis, je décrirai brièvement le principe d’alignement des CSBs sur la
séquence cible à modéliser. Enfin, je présenterai les procédures suivies pour l’obtention d’un modèle à
partir de l’alignement obtenu.
Recherche des éléments structuraux conservés 133
3.2 Recherche des éléments structuraux conservés

3.2.1 Structures de départ : un choix crucial pour la reconstruction
Comme pour toutes les méthodologies de reconstruction par modélisation comparative, la

première question à laquelle un modélisateur se confronte, est celle du choix des structures de départ,
celles qui serviront de « référence », les templates. La méthodologie de reconstruction par CSBs des
P450s a été appliquée plusieurs fois dans l’histoire du laboratoire. Chaque fois, un jeu de structures de
départ différent a été choisi selon la disponibilité et l’évolution des structures cristallographiques de
P450s dans la PDB au moment de l’étude. Ainsi, N. Loiseau est le premier au laboratoire à avoir
expérimenté cette méthode : il s’est servi d’un jeu initial de templates de six structures, les seules
disponibles à l’époque (Loiseau, 2002) : P450nor, P450eryF, P450terp, P450BM3, P450cam et CYP 2C5 qui
était alors la première structure de mammifère publiée dans la PDB. En 2003, M. Cottevieille
expérimente à nouveau cette méthodologie pour construire un CYP 3A7 à partir d’un nouveau
nouveau jeu de templates, assez similaire à celui de N. Loiseau mais plus restreint et dont les
structures étaient mieux résolues : P450eryF, P450BM3, CYP 51 et CYP 2C5. À mon tour, en 2004, j’eus
à exploiter cette méthode pour reconstruire un CYP 3A4, mais en bénéficiant d’une PDB
significativement enrichie en structures de P450 membranaires de mammifères. Paradoxalement,
l’identité de séquence avec la cible 3A4 ne fut pas réellement meilleure que pour les P450s bactériens.
Le choix des structures de référence pour la reconstruction du CYP3A4 a alors été guidé par plusieurs
critères, tels que les données biochimiques de chaque enzyme utilisé, la nature et la taille des substrats
reconnus, mais également la résolution atomique de chaque structure. Par ailleurs, ces structures ont
été choisies de façon à être de longueur adéquate pour l’alignement sur la séquence du CYP3A4. Ainsi,
en accord avec ces critères, j’ai sélectionné six structures cristallines : trois bactériennes et trois de
mammifère. L’idée de reconstruire un P450 humain tel que le CYP3A4 aurait pu me conduire à
restreindre mon choix des templates aux seules structures cristallines de mammifère. Cependant les
seules structures disponibles à cette époque provenaient exclusivement de la famille des 2C, très
homologues entre elles. Le résultat aurait inévitablement débouché sur un modèle trop proche de celui
des CYP2C, à l’image d’une stratégie « mono-template », alors qu’il n’y a pas de raison fonctionnelle
pour privilégier le repliement du 2C, en dehors de l’origine (microsomale). Il est à noter qu’une autre
structure de mammifère était disponible à cette époque : celle du CYP 2B4 à conformation ouverte. En
raison de sa conformation différente des autres P450s, ce cristal n’a pas pu servir dans le jeu de
templates.
Un bon compromis fut donc d’ajouter à ce jeu de structures « mammifères », trois structures
bactériennes avec des homologies fonctionnelles. Ce choix respecte ainsi l’universalité du repliement
P450 et l’absence d’identité marquée pour l’un ou l’autre des templates. L’ensemble des structures
choisies figure dans Tableau 3.1.
Tableau 3.1 Structures cristallines utilisées pour reconstruire le CYP3A4. Les identités sont données par un Blastp de la séquence du
CYP3A4 sur la PDB.
Jeux de P450 Code Organisme Référence Identité Longueur de la séquence

templates PDB avec
Réelle cristallisée
CYP3A4
A cam 3CPP Pseudomonas Raag et Poulos, 1990 20% 414 414

putidas
A terp 1CPT Pseudomonas sp. Boddupalli et al., 1992 24% 428 412
A nor 1ROM Fusarium Park et al., 1997 20% 403 403

oxysporum
AB 2C5 1DT6 Oryctolagus Williams et all., 2000 26% 487 473
cuniculus
B 51 1E9X Mycobacterium Podust et all., 2001 26% 522 455
tuberculosis
ABC eryF 1OXA Saccharopolyspo Cupp-Vickery et Poulos, 1995 26% 406 403
ra erythraea
ABC BM3 2HPD Bacillus Ravichandran et al., 1993 28% 1049 471
megaterium
C 154C1 1GWI Streptomyces Podust et al., 2003 23% 407 411
coelicolor
C 2C5 1NR6 Oryctolagus Wester et al., 2003 26% 487 473
cuniculus
C 2C8 1PQ2 Homo sapiens Schoch et al., 2004 26% 490 476
C 2C9 1OG5 Homo sapiens Williams et al., 2003 28% 490 475
Les structures qui ont servi de templates à chaque utilisateur sont représentées par les symboles :
− A pour ceux de N. Loiseau,
− B pour ceux de M. Cottevieille,
− C pour ceux de T.A Nguyen.
Les trois jeux comportent trois templates en commun :

− CYP 2C5, qui est un P450 microsomal (lapin),
− P450eryF qui reconnaît des substrats similaires à ceux du CYP 3A4
− P450BM3 qui est lié à la CPR et donc proche des P450s microsomaux
À l’issue des travaux combinés de N. Loiseau, M. Cottevieille et de moi-même, trois jeux de

blocs ont finalement été définis à partir de trois groupes de structures plus ou moins différents. Les
structures utilisées présentent un taux moyen d’identité avec le CYP3A4 compris entre 20 et 28%, et
ce taux est encore plus faible dans la moitié N-terminale ce qui rend la modélisation par homologie
peu fiable si elle se base uniquement sur l’alignement des séquences primaires. Nous avons utilisé les
informations de l’alignement tridimensionnel exclusivement au départ pour améliorer l’alignement des
séquences (en particulier dans la région N-terminale) et imposer à notre modèle des contraintes
spatiales.
3.2.2 GOK, l’outil d’alignement 3D
Pour réaliser l’alignement structural, et pallier la faible identité de séquence entre les différents
P450s dans la partie très variable, nous avons choisi d'employer une méthode utilisant une
comparaison structurale multiple à l’aide du logiciel GOK développé par Joël Pothier à l'Atelier de
BioInformatique de l'Université Paris VI (A.B.I.). Cette méthode, décrite dans la section 2.4.5.1,
utilise les coordonnées internes de la chaîne peptidique, à savoir un jeu d'angles dièdres, puisque la
protéine peut être décrite comme une trajectoire dans le plan de Ramachandran. Il travaille avec le
couple (α, τ) (Levitt, 1976), mais dans le cas de notre étude, seules les coordonnées angulaires α sont
utilisées, l'angle τ étant à peu près constant (cf. section 2.2.4). Une sous-structure commune (CSB pour
« Conserved Structural Blocs ») est donc définie comme un segment de trajectoire commun à toutes
les structures dans une marge d’erreur définie par l’utilisateur. Le quadrillage de ce plan (la maille) et
l'utilisation d'une marge de tolérance (la marge) permettent de définir un critère de similarité multiple
et précis (cf. Figure 3-1).
marge
maille
marge Cα n+2
τ α τ C α n-1
Cα n+1
C αn
Figure 3-1 Comparaison structurale dans GOK : la maille (définie en unités d’angle) et la tolérance (marge en
unités de maille) pour l’angle dièdre α définissent une zone de similarité. Les sous-structures ayant un angle α
compris dans cette zone, sont considérées comme similaires. Dans la présente figure, chaque marge correspond à
une maille.
GOK propose deux mesures rms multiple pour vérifier que les correspondances entre les
coordonnées internes et les structures 3D déterminées sont bien en accord. Le premier, noté mp-rms
(pour « mean of all pairwise rms deviation »), est une moyenne arithmétique des déviations calculées
par paires de structures. Si on note S1, S2, …, Sm les m structures, chacune composée de n carbones α,
et sij = (xij, yij, zij) les coordonnées du Cα j dans la structure i (i = 1, …, m ; j = 1, …, n), alors la
déviation minimale rms ∆kl entre les structures k et l est définie comme suit :
n 2
∆2kl = min ∑ Rs kj + t − s lj  n
Rt
 j =1 
où le minimum est pris sur toutes les rotations propres R et translations t (Kabsch, 1976 ; Sippl et
Stegbuchner, 1991). Le mp-rms est alors défini de la façon suivante :
m(m − 1)
mp − rms = ∑∆
1≥ k > l ≥ m
kl
2
Le deuxième critère, noté s-rms (pour « star-rms »), est obtenu par le calcul de la moyenne
arithmétique de toutes les déviations rms entre chaque template et une structure « moyenne » S0 (c-à-d
recalculée sur les angles moyens) calculé sur le bloc. Celle-ci est définie comme suit :
m
s − rms = ∑ ∆ 0 k m
k =1
GOK est donc une méthode qui a l'avantage de tester toutes les solutions possibles sans favoriser
l'une des structures en tant que « pivot » et permet, en théorie, la comparaison simultanée d'un grand
nombre de structures.
Au moyen de cette méthode, des éléments structuraux communs sont alors identifiables sur
l’ensemble des structures choisies en template. Ces éléments qu’on appellera également Blocs
Structuraux Communs (CSB) ou encore, blocs, correspondent souvent à des éléments de structures
secondaires. Pour désigner ces éléments de structure secondaire chez les P450s nous utiliserons celle
proposée par Poulos (Poulos et al, 1985) et revue par Hasemann (Hasemann et al., 1995). Toutefois,
un bloc ne correspond pas à un simple élément de structure secondaire, il peut contenir un
fragment d’un tel élément, par exemple une partie de brin ou d’hélice, ou encore un groupe de SSEs
contigus.
Dans l’étude des P450s, et selon les structures présentes dans chaque jeu, un nombre différent de
CSBs a été déterminé. Ce nombre de blocs tourne autour d’une vingtaine et la longueur totale des
blocs couvre à peu près 60 à 70% de toute la protéine. Ils serviront alors d’ossature pour la
reconstruction de la protéine cible, un peu à la manière des techniques d’enfilage (ou threading). Ils
sont présentés en détail dans le chapitre 5.
3.2.3 Vers un jeu de blocs général…
Avec trois ensembles différents de structures cristallines –comprenant toutefois des structures
communes– nous sommes parvenus par trois fois à obtenir à peu près le même jeu de blocs. Chaque
jeu de blocs a été aligné indépendamment sur les mêmes P450s cibles en vue de reconstruire leurs
modèles. La plupart du temps (comme il sera montré dans la partie résultats) les modèles obtenus sont
différents. Cette différence pouvant provenir de l’alignement des blocs sur la séquence cible, je me
suis intéressé de près aux positionnements des blocs pour les trois jeux de blocs. Il s’est alors avéré
que selon le jeu de blocs utilisés, le positionnement de certains blocs ne concordait pas d’un jeu à
l’autre. Comme nous n’avions pas utilisé les mêmes structures pour chacun des jeux, l’idée m’est
venue de faire un jeu de blocs général qui comprendrait les onze différentes structures utilisées au
travers des trois jeux de templates. GOK recherche des trajectoires 3D communes et fournit les
résultats de blocs sous forme de courts sous-alignements (cf. Figure 3-2) comme le font la plupart des
logiciels d’alignement structural. Pour élaborer un jeu global de blocs à partir des trois jeux
disponibles, il suffisait donc a priori de fusionner entre eux les sous-alignements de chaque bloc. Cette
tâche qui semblait aisée au premier abord s’est révélée moins évidente que prévue : certains sous-
alignements de blocs ne concordaient pas avec leurs homologues provenant d’un set de templates
différent. Par exemple, deux séquences d’un même bloc pour un jeu de templates donné n’étaient pas
trouvées alignées de la même façon dans un autre jeu, pour ce même bloc.
La plupart des désaccords trouvent leur origine dans un décalage en séquence en début ou fin de
bloc. Ces décalages de quelques résidus (d’1 résidu à 6) sont observés chaque fois au niveau d’un bloc
comprenant une partie d’hélice α. Ce décalage des sous-alignements est explicable : lors d’une
identification de bloc par le logiciel GOK, l’utilisateur doit choisir un sous-alignement structural qui
représente une trajectoire commune à tous les templates, parmi plusieurs sous-alignements possibles.
Cette sélection s’effectue graphiquement via l’interfaçage du logiciel de visualisation Midas (UCSF,
Université de Californie), couplé à GOK. Les nombreux sous-alignements structuraux proposés sont
souvent chevauchant entre eux, et se distinguent alors les uns par rapports aux autres par un décalage
au niveau de l’initiation (et par conséquent de la terminaison) du sous-alignement, d’une structure ou
plus, parmi toutes les structures présentes dans le jeu. La Figure 3-2 présente justement un exemple de
ce cas de figure où un décalage d’1 résidu et un décalage de 6 résidus sont observés pour le bloc 4
(voir numérotation des blocs, chapitre 5.2). Dans cet exemple, les structures des P450cam (pdb 1oxa),
P450BM3 (pdb 2hpd) et CYP 2C5 (pdb 1dt6) sont présentes dans les 3 jeux de templates. Visuellement,
et en ne prenant en considération que les alignements correctement superposés (cf. légende de la
Figure 3-2), les sous-alignements structuraux de chaque région correspondent bien à une trajectoire
similaire sous GOK : il s’agit ici d’un morceau d’hélice G. En revanche, en s’intéressant de plus près
aux séquences des sous-alignements de ce bloc, un décalage est observé entre les deux jeux de blocs
(entre A et B) de 6 résidus pour la séquence du P450BM3 et de 1 résidu pour la séquence du CYP 2C5
par rapport à la séquence du P450eryF. Pour trancher entre ces deux résultats, il a donc fallu comparer
ce bloc avec celui de mon jeu de blocs, en prenant également en considération les autres structures de
ce même bloc non montrées ici : dans les trois jeux, lorsque les sous-alignements d’un même bloc sont
en accord dans au moins deux jeux, c’est ce sous-alignement qui est choisi. Dans certains cas,
l’utilisation d’un autre logiciel d’alignement structural a été nécessaire (Matras).
Figure 3-2 Décalage observée pour le bloc 4 entre le jeu de N. Loiseau (A) et celui de M. Cottevieille (B).
L’hélice G correspondant au bloc 4 dans les structures 1oxa (en vert) 2hpd (en rouge) et 1dt6 (en bleu) est
représenté en trace sous VMD. Dans (B), la représentation est volontairement calée sur le même alignement
structural que dans (A) pour mettre en évidence le décalage de sous-alignement. En pratique, sous Midas (couplé à
GOK), les 3 fragments d’hélices seraient bien sûr superposés pour former un bloc. L’alignement en séquence
correspondant est montré. Dans cet exemple, un décalage de 6 résidus est observé sur 2hpd et un décalage de 1
résidu sur 1dt6. Comme une hélice a une même trajectoire dans l’espace, un décalage de 1 résidu ou de 3 n’est pas
observable sous Midas. À noter que le bloc trouvé par M. Cottevieille est plus court que celui trouvé par NL.
Ce décalage de 1 à 6 résidus au niveau des blocs n’est pas surprenant en soi, c’est une limite de
principe de la détection par les angles α : la trajectoire d’une hélice est décalable d’un ½ tour (1 à 2
résidus décalés dans les sous-alignements), ou même d’un tour (3 à 4 résidus). Sachant qu’il faut 3,6
résidus pour faire un tour d’hélice, un décalage de 3 à 4 résidus en alignement séquetiel est
compréhensible pour un décalage d’un pas d’hélice. Dans certains cas, lors de la recherche, GOK
propose comme sous-alignement une région d’une hélice pour cinq structures, et une région d’une
autre hélice pour la sixième structure. Comme les trajectoires des hélices se ressemblent dans l’espace,
GOK a pu considérer des morceaux d’hélices différents comme une même trajectoire commune.
Au final, l’évaluation de la « bonne » trajectoire commune n’est pas facilitée par la lisibilité du
programme de visualisation et il n’est pas rare, notamment au niveau des hélices α d’observer des
décalages d’un résidu ou plusieurs résidus. En prenant connaissance de cette analyse, j’ai pu
finalement constituer un jeu de blocs communs aux trois jeux de templates (cf. Figure 5-4 et Figure
5-5 dans la partie des résultats) qui couvre plus de 60% de la séquence des P450s alignés. À noter
que les deux structures du CYP 2C5 (1nr6 et 1dt6) ont été conservées dans le jeu de bloc général car
les séquences sont légèrement différentes en raison de mutations introduites pour la cristallisation.
3.2.4 Et pourquoi pas un jeu de blocs universel des 29 templates de P450s ?
3.2.4.1 Les limites de GOK

Le logiciel GOK a été développé courant 1997, prévu pour fonctionner sur des Silicon Graphics
(SGI) et couplé à Midas, un logiciel de visualisation de structures qui avait l’avantage de pouvoir
intégrer des modules « maison ». Du fait de son ancienneté et du support sur lequel il tourne, il s’est
montré (et demeure) limité dans son fonctionnement. Ainsi, déterminer 24 CSBs sur un jeu de 6
templates nécessitait plus de deux semaines de travail et de calcul sur une SGI Octane R10000. Ce
programme a été ensuite exporté et recompilé sur Linux, mais n’offrait plus la possibilité de
visualisation. Sans l’outil de visualisation, les problèmes liés au décalage sont difficilement repérables.
C’est une des raisons pour lesquelles je n’ai pas refait de nouveau jeu de blocs sous GOK avec un jeu
de templates enrichi et à jour de la PDB. En effet, le rythme de publications de nouvelles structures de
P450s dans la PDB s’est intensifié durant mes trois années de thèse. Par ailleurs, du fait que les
structures récentes balayent un spectre plus large de P450s, les incorporer dans notre jeu de templates
rend la reconstruction d’un P450 inconnu plus aisée : en augmentant le nombre de templates avec de
nouvelles structures, on augmente également la chance d’avoir dans le jeu un template proche du P450
inconnu à reconstruire. Dans l’optique de valider ma méthodologie de reconstruction de P450s à faible
taux d’identité, il était préférable de ne conserver que les 11 templates dont je disposais à l’époque où
j’ai commencé ce travail.
3.2.4.2 GAKUSA : un remplaçant pour GOK ?

L’information des blocs que fourniraient les 29 différentes formes de P450s cristallisées (29
structures non redondantes à la date du 12 avril 2007) n’est pourtant pas négligeable : le passage à 29
templates permettait de vérifier la solidité du jeu de blocs inital à 11 templates. De façon intuitive, on
peut penser que sur un ensemble plus grand de structures de référence, des blocs en nombre et de
longueur moins importante seraient identifiés. Comme l’alignement sous GOK des 29 templates
n’était pas envisageable (lié à la limitation de calcul des machines), il fallait trouver un autre logiciel
au fonctionnement similaire à celui de GOK. GAKUSA est un autre logiciel développé à l’ABI
(Atelier de Bioinformatique, Institue Curie) basé sur une approche comparable à GOK dans sa
représentation des structures. En revanche, (voir section 2.4.5.2), son algorithme est totalement
différent. Contrairement à GOK, GAKUSA ne dispose pas d’interface graphique, mais est compensé
par son automatisation : il identifie en un temps rapide tous les CSBs des structures. L’utilisateur peut
de plus imposer une longueur minimale de recherche de blocs : GAKUSA détermine alors
itérativement chaque position de CSBs trouvés avec un score associé. À chaque itération, les positions
trouvées sont cachées pour l’itération suivante, forçant le logiciel à identifier de nouveaux blocs
(comme dans GOK). Lors des premiers essais sur un jeu de structures restreintes de P450s, GAKUSA
paraissait non seulement beaucoup plus rapide que GOK, mais permettait également de traiter un plus
grand nombre de structures simultanément. J’ai donc utilisé ce logiciel afin de comparer les blocs
obtenus sur l’ensemble des 29 templates de P450 par rapport aux jeux de blocs dont je disposais déjà.
Pour constituer le jeu des 29 templates (cf. Tableau 3.2), seules les structures les mieux résolues
ont été retenues en cas de redondance (substrats, mutants, etc.). Dans le Tableau 3.2, on peut
remarquer que les structures bactériennes sont plus représentées, mais le jeu dispose quand même de
10 templates de P450s microsomaux de plus en plus diversifés alors qu’ils étaient dominés par des
structure de P450s de la famille 2C en 2004.
3.3 Positionnement des CSBs sur la séquence cible
Lorsque les blocs structuraux sont identifiés, la seconde étape de la méthode consiste à rechercher
la meilleure correspondance entre les sous-alignements en séquences de ces blocs (définis
structuralement et indépendamment de la nature des acides aminés), avec la séquence cible qui elle-
même peut être alignée avec d’autres séquences à fort taux de similarité. Pour cela, tous les CSBs sont
transformées en « profils » (ou PSSM) puis sont alignés sur la séquence de la P450 de structure
inconnue ou contre un pré-alignement de séquences de plusieurs P450s homologues. Ce pré-
alignement permet de tenir compte de la dégénérescence de séquence au sein d’une sous-famille de
P450, ce qui peut aider à compenser la faible identité en séquence entre les différents P450s. Cette
étape de recherche de positionnement des CSBs est par ailleurs très importante : la qualité
Positionnement des CSBs sur la séquence cible 141
d’alignement des blocs sur la séquence cible est cruciale pour la reconstruction du modèle,
l’alignement de la partie N-terminale pouvant conduire à de nombreuses incertitudes et ambiguïtés.
Tableau 3.2 Liste des structures ayant servi pour constituer le set de templates général.
Rés Date de Nombre de structures
CYP PDBID Espèce
(A) publication disponibles
P450cam 1re9 1.45 16/11/2003 Pseudomas putida 57

P450BM3 2ij2 1.20 07/11/2006 Bascillus megaterium 21
P450nor 2jfb 1.00 20/12/2001 Fusarium oxysporum 12
P450eryF 1z8o 1.70 12/04/2005 Saccharopolyspora erythrea 9
P450Oxyb 1lfk 1.70 11/12/2002 Amicolatopsis orientalis 3
P450Oxyc 1ued 1.89 09/12/2003 Amicolatopsis orientalis 1
P450epok 1q5d 1.93 28/10/2003 Polyangium cellulosum 2
CYP 119 1io7 1.50 28/02/2001 Solfobus solfataricus 5
CYP 121 1n40 1.06 04/02/2003 Mycobacterium tuberculosis 4
CYP 152A1 1izo 2.09 18/03/2003 Bacillus subtillis 1
CYP 154A1 1odo 1.85 02/01/2004 Streptomyces coelicolor 1
CYP 154C1 1gwi 1.92 29/01/2003 Streptomyces coelicolor A3(2) 1
CYP 158A2 1s1f 1.50 11/01/2005 Streptomyces coelicolor A3(2) 5
CYP 175A1 1n97 1.79 25/02/2003 Thermus thermophilis 2
CYP 51 1x8v 1.55 23/11/2004 Mycobacterium uberculosis 6
P450st 1ue8 3.00 13/07/2004 Sulfobus tokodaii 1
P450PIKC 2cd8 2.85 20/02/2007 Streptomyces venezuelae 5
P450terp 1cpt 2.29 31/01/1994 Pseudomas sp. 1
CYP 199A2 2fr7 2.00 16/01/2007 Rhodopseudomonas palustris 1
CYP 2A6 2fdu 1.85 28/11/2006 Homo sapiens 6

CYP 2B4 1suo 1.89 20/07/2004 Oryctolagus cuniculus 3
CYP 2C5 1nr6 2.03 12/08/2003 Oryctolagus cuniculus 3
CYP 2C8 1pq2 2.70 13/01/2004 Homo sapiens 1
CYP 2C9 1r9o 2.00 15/06/2004 Homo sapiens 3
CYP 2D6 2f9q 3.00 20/12/2005 Homo sapiens 1
CYP 3A4 1tqn 2.04 27/07/2004 Homo sapiens 6
CYP 8A1 2iag 2.15 10/10/2006 Homo sapiens 1
CYP 2R1 2ojd 2.70 30/01/2007 Homo sapiens 1
CYP 1A2 2hi4 1.95 20/02/2007 Homo sapiens 1
3.3.1 SmartConsAlign, le premier logiciel d’alignement de CSBs sur la

séquence cible
N. Loiseau et M. Cottevieille, ont tous deux utilisé un même logiciel pour aligner leur jeu de
blocs : SmartConsAlign, développé à l’ABI (Jean et al., 1997). Ce logiciel été écrit pour trouver la
meilleure correspondance possible entre le profil de chaque CSBs et la séquence à aligner. Pour ce
faire, à chaque bloc structural était associé une matrice dite consensus (ou profil/PSSM) donnant la
répartition des différents acides aminés pour chaque position dans ce bloc (cf. Figure 3-3). Dans
SmartConsAlign, la dimension de cette matrice est de 20 lignes, et d’un nombre de colonnes égale à la
longueur de la séquence correspondante. Chaque ligne correspond à un symbole de l’alphabet utilisé,
généralement à un type d’acide aminé. D’autre part, les coefficients de la matrice sont pondérés par un
facteur tenant compte des similarités entre acides aminés : en pratique la matrice finalement utilisée
est le produit de la matrice consensus par la matrice de similarité BLOSUM 62. Un score de similarité
est alors défini pour chaque position de la matrice le long de la séquence de la protéine à modéliser. La
recherche du meilleur score par déplacement de la matrice consensus considérée sur l’alignement
préétabli de séquences, permet donc de déterminer la portion la plus similaire. Il est à noter que les
matrices consensus sont construites sans insertions ni délétions, mais la position correspondante sur la
séquence peut en comporter.
1 2 3 4 5 6 7 8
A D T V D V R G Bloc structural
E D T G F L G G
S D Y F E F H G
A 0 0 0
B 0 0 0
C 0 0 0
D 1 1/3 0
E 0 1/3 0
F 0 1/3 0 PSSM
G 0 0 1
. . . .
. . . .
– 0 0 0
Calcul du score
Séquence(s) de P450 de structure inconnue
Figure 3-3 Construction et schéma d'utilisation d'une matrice consensus dans SmartConsAlign
Pour chaque bloc, SmartConsAlign propose différentes solutions classées suivant le score et
calcule également pour chaque solution la probabilité (p-value) que le score obtenu soit égal au score
obtenu avec une séquence quelconque (Goldstein et Waterman, 1994). Cette probabilité permettait
d’estimer la fiabilité d’une solution : plus la valeur donnée était proche de 1, plus la fiabilité était
faible. Ainsi, le positionnement final des blocs sur la séquence cible résulte d’une prise en compte à la
fois des scores d’alignement, mais aussi des positions relatives des CSBs en cas d’ambiguïté.
La principale faiblesse de ce programme vient justement de ces ambiguïtés : chaque bloc est traité
indépendamment des autres, sa position peut alors chevaucher celle d’un autre bloc, voire être inversée
par rapport à l’ordre initial des blocs structuraux identifiés dans les templates. Ces erreurs peuvent être
corrigées en utilisant des informations biochimiques ou issues de la littérature.
3.3.2 Caliseq, vers une extension multi bloc de SmartConsAlign
En réponse aux problèmes d’ambiguïté du positionnement des blocs, il fallait mettre en place un
nouveau logiciel permettant le traitement simultané de tous les blocs, d’une part qui tienne compte de
l’ordre logique des blocs structuraux, d’autre art qui empêche le chevauchement des blocs. L’idée était
de reprendre le principe de « matrice consensus » pour représenter chaque bloc, de les traiter en un
seul passage et surtout de permettre à ces blocs de « glisser » librement sur la séquence cible jusqu’à
leur positionnement définitif. La prise en compte de tous les blocs en un passage ainsi que ce
glissement de blocs sur la séquence cible permettrait d’éviter le chevauchement des blocs entre eux et
surtout prendrait en compte l’ordre des blocs tels qu’ils ont été identifiés sur les structures de
références. Selon ces critères, j’ai donc été amené à développer une nouvelle extension pour le logiciel
SmartConsAlign, un module qui a été baptisé Caliseq pour Consensus Alignement of Sequences. Les
caractéristiques de cet outil seront détaillées dans le chapitre 4.
3.3.3 Du positionnement des blocs vers l’obtention de l’alignement final
En sortie de Caliseq, on obtient un alignement du jeu de blocs sur une séquence (ou sur un
alignement de séquence). Cette forme actuelle d’alignement n’est pas immédiatement exploitable par
les logiciels de reconstruction 3D par homologie : il faut supprimer les séquences alignées avec la
séquence de P450 à reconstruire lorsqu’elles sont présentes, et surtout compléter les parties entre les
blocs par les séquences respectives. En effet, les logiciels de reconstruction requièrent la séquence
complète des structures de référence. Selon la méthode utilisée pour la reconstruction du modèle, le
« remplissage » de ces parties « inter-blocs » a plus ou moins son importance.
3.3.3.1 Les différentes stratégies utilisées

Dans la méthodologie initiale utilisée au laboratoire, il faut construire un jeu de contraintes de
distances et d’angles de type RMN dans chaque bloc, représentant une « moyenne » des informations
structurales. Ainsi, pour chaque région structuralement conservée, les données structurales de tous les
templates sont intégrées simultanément, tandis que les parties variables (inter-blocs) sont reconstruites
sans contraintes en même temps que les parties structuralement conservées. De ce fait, l’alignement
des parties hors blocs des séquences des templates sur la séquence cible est sans importance.
L’utilisateur pouvait aligner ces régions à sa guise sachant que l’information des résidus au niveau
inter-blocs ne serait pas prise en compte lors de la reconstruction.
Il n’en est pas de même lorsqu’on opte pour une autre stratégie utilisant des outils
bioinformatiques automatiques de reconstruction par homologie. En effet, la précédente stratégie est
très efficace mais nécessite des manipulations manuelles pour un bon nombre d’étapes. Dans un souci
de simplification, d’automatisation et de production à grande échelle de modèles, il a été convenu de
changer de stratégie, à savoir utiliser des logiciels disponibles de reconstruction par homologie. Cette
stratégie devait néanmoins incorporer la « philosophie » des reconstructions par blocs avec priorité
absolue des calculs de contraintes dans les blocs. Le logiciel Modeller pouvait répondre au cahier des
charges : un fichier d’alignement ainsi qu’un fichier de directives étaient pris en entrée et la
construction d’un (ou de plusieurs) modèle pouvait être effectué en tenant compte des contraintes
spatiales déterminées par l’alignement.
Avec Modeller, deux approches ont pu être exploitées ici : soit en respectant l’esprit de la
première stratégie, utiliser seulement l’automatisation et la rapidité de reconstruction de Modeller, soit
en tirant profit des avantages de Modeller pour reconstruire les régions inter-blocs grâce à l’utilisation
de sa banque de repliement pour imposer des contraintes spatiales dans les zones inter-blocs. Dans le
premier cas, il suffit de ne mettre aucune séquence de templates en correspondance avec les régions
inter-blocs tel que cela est montré en Figure 3-4. La seule contrainte dans le second cas est la nécessité
de fournir un alignement aussi précis que possible des régions inter-blocs.
template aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-----bbbbbbbbcccccccccccccccccccccccccccccc
target ddddddddddddddddddddddddeeeee--------ffffffffffffffffffffffffffffff
Figure 3-4 Méthodes pour neutraliser le calcul de contraintes dans les régions inter-blocs sous Modeller : les
régions hors blocs du template ne sont pas alignées avec la séquence. Dans l’exemple, aucune contrainte spatiale
dérivée de la séquence template ne sera utilisée pour construire la région ‘eeeee’ de la cible, et la région
‘bbbbbbbb’ du template n’est pas prise en compte dans le calcul.
3.3.3.2 L’alignement inter-bloc, mesure de sécurité et nouvelle difficulté ?

Durant ma thèse, j’ai donc opté pour l’utilisation de Modeller pour la reconstruction à grande
échelle des modèles. Les deux approches ont été utilisées. Dans le cas de la seconde approche
(utilisation de la banque de repliement de Modeller pour les régions inter-blocs), il était important de
bien aligner les parties entre les blocs. La majeure difficulté de cette opération venait du fait que ces
régions étaient par nature structuralement variables (non sélectionnées par GOK) et aussi, souvent de
tailles très différentes. Par exemple, les P450s microsomaux possèdent de nombreuses boucles non
présentes chez leurs homologues bactériens. Il y a donc deux difficultés : aligner des zones de
longueur très hétérogènes entre les templates, puis aligner ces régions sur la séquence cible. Plusieurs
stratégies ont été essayées pour réaliser cet alignement inter-bloc.
Alignement visuel. La première stratégie est celle de l’approche manuelle. Dans un premier
temps, j’ai effectué manuellement tous les alignements inter-blocs des séquences des P450s de
référence (cf. Figure 5-5 page 194). Pour cela, j’ai essayé de maximiser les correspondances d’acides
aminés en fonction de leur identité ou de leurs propriétés (polarité, hydrophobicité). Cette stratégie est
manipulateur-dépendant.
Utilisation de l’information des SSE. Il est possible d’améliorer les résultats d’un alignement en
séquence en tenant compte des structures secondaires des templates. Dans l’alignement des régions
inter-blocs, j’ai utilisé à la fois les informations de SSE décrites dans les fichiers PDB de chaque
structure de référence, mais j’ai également eu recours à des logiciels comme le serveur MATRAS (cf.
section 2.4.3.3) pour l’alignement des structures secondaires entre elles. La principale difficulté
rencontrée ici vient de fait que les régions inter-blocs correspondent la plupart du temps à des régions
non structurées. Or et les alignements de structures secondaires proposés sont en désaccord avec les
alignements de GOK : n’étant déjà pas en accord sur les régions considérés comme structuralement
conservée par GOK, l’alignement inter-bloc est difficilement réalisable.
Utilisation de Clustalw adapté. Finalement, une dernière stratégie a été expérimentée en ayant
recours à Clustalw dans un mode de fonctionnement un peu détourné. En effet, il est possible de
fournir à Clustalw sa propre matrice de similarité afin d’adapter l’alignement produit en fonction des
correspondances indiquées dans la matrice. Pour forcer le calage des blocs (et donc des débuts et fin
de zones inter-blocs), j’ai introduit un nouveau caractère dans la matrice (cf. Figure 3-5) pénalisé
fortement lorsqu’il se retrouve aligné face à un autre résidu et favorisé fortement lorsqu’il est aligné
face à lui-même.
# Matrix made by matblas from blosum62.iij

# X matches with itself with a high score
# * column uses minimum score
# BLOSUM Clustered Scoring Matrix in 1/2 Bit Units
# Blocks Database = /data/blocks_5.0/blocks.dat
# Cluster Percentage: >= 62
# Entropy = 0.6979, Expected = -0.5209
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *
4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 0 -3 -2 0 -2 -1 -9 -4
-1 5 0 -2 -3 1 0 -2 0 -3 -2 2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1 0 -9 -4
-2 0 6 1 -3 0 0 0 1 -3 -3 0 -2 -3 -2 1 0 -4 -2 -3 3 0 -9 -4
-2 -2 1 6 -3 0 2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -9 -4
0 -3 -3 -3 9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -9 -4
-1 1 0 0 -3 5 2 -2 0 -3 -2 1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2 0 3 -9 -4
-1 0 0 2 -4 2 5 -2 0 -3 -3 1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -9 -4
0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -9 -4
-2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 2 -3 0 0 -9 -4
-1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 2 -3 1 0 -3 -2 -1 -3 -1 3 -3 -3 -9 -4
-1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 -2 2 0 -3 -2 -1 -2 -1 1 -4 -3 -9 -4
-1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 0 1 -9 -4
-1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 0 -2 -1 -1 -1 -1 1 -3 -1 -9 -4
-2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 -4 -2 -2 1 3 -1 -3 -3 -9 -4
-1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -9 -4
1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 1 -3 -2 -2 0 0 -9 -4
0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 -2 -2 0 -1 -1 -9 -4
-3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 2 -3 -4 -3 -9 -4
-2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 -1 -3 -2 -9 -4
0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 -3 -2 -9 -4
-2 -1 3 4 -3 0 1 -1 0 -3 -4 0 -3 -3 -2 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -9 -4
-1 0 0 1 -3 3 4 -2 0 -3 -3 1 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -9 -4
-9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 -9 999 -9
-4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -9 1
Figure 3-5 Matrice BLOSUM 62 modifiée : le caractère X est fortement pénalisé (-9) lorsqu’il se retrouve en
face d’un autre résidu et fortement favorisé (+999) lorsqu’il se retrouve en face de lui-même.
En utilisant ce caractère pour remplacer les résidus à l’intérieur des blocs, le résultat escompté est
un alignement où Clustalw force les blocs à s’aligner entre eux, et traite normalement les résidus
inter-blocs. Cette méthode n’est pas toujours adaptée : certains blocs ne pourront pas être utilisés dans
Clustalw, principalement ceux qui ne sont pas trouvés dans toutes les structures. En effet, n’ayant pas
de correspondance dans les autres séquences des templates, ils viendraient à fausser le résultat par un
décalage des blocs. Par exemple, dans l’alignement de la Figure 5-5 page 194, le premier bloc (CSB0)
n’est présent que sur 5 des 11 structures. En remplaçant tous les résidus des blocs par le symbole X,
certaines séquences du CSB0 sont venus s’aligner sur les séquences du CSB1* provoquant ainsi
quelques décalages dans l’alignement comme le montre la Figure 3-6. Par ailleurs, même en
supprimant des jeux les blocs non trouvés dans toutes les structures, Clustalw n’a pas été en mesure
d’aligner correctement les blocs entre eux à l’aide de ce caractère : des décalages sont toujours
observés, et dans certains cas, les décalages se prolongent dans tout l’alignement.
1oxa 1 --ATVPDLES DSFH------ ---------- ---VDWYSTY AELRETA--P VTPVRF-LGQ DAWLVTGYDE AKAALSDLRL 56

2hpd 1 ---------- -TIKEMPQPK TFGELKNLPL LNTDKPVQAL MKIADELG-E IFKFEA-PGR VTRYLSSQRL IKEACDESRF 67
1pq2 1 ---------- ---KLPPGPT PLPIIGNMLQ IDVKDICKSF TNFSKVYG-P VFTVYF-GMN PIVVFHGYEA VKEALIDNGE 65
1og5 1 ---------- -----PPGPT PLPVIGNILQ IGIKDISKSL TNLSKVYG-P VFTLYF-GLK PIVVLHGYEA VKEALIDLGE 63
1nr6 1 ---------- --GKLPPGPT PFPIIGNILQ IDAKDISKSL TKFSECYG-P VFTVYL-GMK PTVVLHGYEA VKEALVDLGE 66
1gwi 1 --ARIPLD-- ---------- PFV------- ---TDLDGES ARLRAAG--P LAAVELPGGV PVWAVTHHAE AKALLTDPRL 54
1e9x 1 MSAVALPRVS GGHDEHGHLE EFR------- ---TDPIGLM QRVRDECG-D VGTFQL-AGK QVVLLSGSHA NEFFFRAGDD 68
1dt6 1 ---------- -----PPGPT PFPIIGNILQ IDAKDISKSL TKFSECYG-P VFTVYL-GMK PTVVLHGYEA VKEALVDLGE 63
1rom 1 --APSFPFSR ASGPEPP--- ---------- -----AEFAK LRATN----P VSQVKLFDGS LAWLVTKHKD VCFVATSEKL 56
1cpt 1 MDARATIPEH IARTVILPQG YADDE----- ---V-IYPAF KWLRDEQ--P LAMAHIEGYD PMWIATKHAD VMQIGKQPGL 69
3cpp 1 --NLAPLPPH VPEHLVFDFD MYNPSNLSAG -----VQEAW AVLQESNVPD LVWTRCNG-- GHWIATRGQL IREAYEDYRH 71
CSB0 CSB1* CSB1** CSB1
Alignement par clustalw après

remplacement des résidus
intra bloc par le symbole X
1oxa 1 ---------- ----ATVPDL ESDSFHVDXX XXX------- X---XXXX-- TAXXXXXXX- LGQXXXXXXX XXXXXXXXSD 53

2hpd 1 ---------- -----TIKEX XXXXXXXXXX XXXXLNTDKX XXXXXXXXXE LGXXXXXXX- PGRXXXXXXX XXXXXXXXDE 65
1pq2 1 ---------- -------KLX XXXXXXXXXX XXXXIDVKDX XXXXXXXXXV YGXXXXXXX- GMNXXXXXXX XXXXXXXXID 62
1og5 1 ---------- ---------X XXXXXXXXXX XXXXIGIKDX XXXXXXXXXV YGXXXXXXX- GLKXXXXXXX XXXXXXXXID 60
1nr6 1 ---------- ------GKLX XXXXXXXXXX XXXXIDAKDX XXXXXXXXXC YGXXXXXXX- GMKXXXXXXX XXXXXXXXVD 63
1gwi 1 ---------- -------ARI PLDPFVTDXX XXX------- X---XXXX-- AGXXXXXXXP GGVXXXXXXX XXXXXXXXTD 51
1e9x 1 ---MSAVALP RVSGGHDEHG HLEEFRTDXX XXX------- X---XXXX-E CGXXXXXXX- AGKXXXXXXX XXXXXXXXRA 65
1dt6 1 ---------- ---------X XXXXXXXXXX XXXXIDAKDX XXXXXXXXXC YGXXXXXXX- GMKXXXXXXX XXXXXXXXVD 60
1rom 1 ---------- ---APSFPFS RASGPEPPXX XXX------- X---XXXX-- --XXXXXXXF DGSXXXXXXX XXXXXXXXTS 53
1cpt 1 --MDARATIP EHIARTVILP QGYADDEVXX XXX------- X---XXXX-- EQXXXXXXXE GYDXXXXXXX XXXXXXXXKQ 66
3cpp 1 NLAPLPPHVP EHLVFDFDMY NPSNLSAGXX XXX------- X---XXXXSN VPXXXXXXX- -NGXXXXXXX XXXXXXXXED 68
Figure 3-6 Problème lié aux blocs non présents sur tous les templates: lorsque les résidus à l’intérieur de ces
blocs sont remplacés par le symbole X, Clustal a du mal à les aligner correctement. Un code de couleur a été
utilisé pour représenter les résidus de chaque bloc. Dans les templates où le bloc 0 est absent, des résidus X du
bloc suivant (CSB 1*) se sont détachés pour s’aligner sur CSB0 des autres templates.
La stratégie initiale par calcul de jeu de contraintes uniquement dans les blocs de type RMN
n’accordait pas de valeur à l’alignement inter-bloc : les régions variables inter-blocs étaient censées ne
contenir aucune information structurale et donc être reconstruite sans information a priori. En
reproduisant cette stratégie par la première approche de Modeller, les régions inter-blocs sont
généralement mal reconstruites, Modeller étant incapable de construire ces régions de façon ab initio.
C’est pourquoi, c’est finalement la seconde approche (par utilisation de la banque de repliements de
Modeller) qui a été utilisée pour produire les modèles de P450s. Dans cette approche, on pouvait se
contenter de produire un alignement grossier inter-bloc pour satisfaire Modeller, et optimiser les
régions inter-blocs une fois le modèle obtenu. Il était cependant préférable de produire le meilleur
alignement inter-bloc possible : aucune stratégie hormis l’alignement manuel n’a pu donner de
résultats convaincants. Il a été vu en effet que ni l’utilisation d’autres informations (SSE par exemple)
ni l’alignement Clustalw « adapté » pour les zones inter-blocs n’ont pu être exploitables. Au final,
pour construire les modèles de P450s obtenus sous Modeller, l’alignement des zones inter-blocs a
été réalisé manuellement.
3.4 Construction des modèles de Cytochrome P450
Pour la troisème étape, après l’alignement des templates sur la séquence cible, deux procédures
ont été mises au point pour construire les modèles : (i) la procédure initiale mettant en jeu des logiciels
et des concepts issus de la détermination structurale par RMN, utilisée par N. Loiseau et
M. Cottevieille, et (ii) la procédure que j’ai appliquée, plus automatisée et plus commune pour la
construction de modèles par homologie.
3.4.1 Méthode initiale basée sur la RMN
L’alignement structural obtenu par GOK distingue deux types de régions : (i) les blocs
structuralement conservés et (ii) les segments d’acides aminés qui les séparent et qui ne fournissent
aucune information structurale. Les premiers servent de support à la reconstruction du P450 désiré, les
seconds sont quant à eux sans importance. Dans les régions alignées (blocs), les atomes conservés
pour le calcul des contraintes dépendent des chaînes latérales des résidus alignés. S’il n’y a pas de
glycine à une position donnée de l’alignement, les Cβ sont conservés. Les atomes de rang γ peuvent
également être conservés s’ils existent dans tout le bloc (cf. Figure 3-7). La conservation des atomes
de rang δ et au-delà est plus rare, sauf dans le cas d’identité absolue dans le bloc.
H
N
χ1
Cβ
Cγ
Cα
H
E L A
O K I G
N C D L G
Figure 3-7 Exemple de conservation des atomes pour le calcul des contraintes de distances.
Si Cβ et Cγ sont conservés dans le bloc, ces atomes du résidu cible sont imposés et le χ1 fixé.
En revanche, si seuls les Cβ sont conservés et que le résidu cible comporte un Cγ (ou plus),
il faut alors choisir un rotamère χ1. Sur cette figure sont également représentées (en flèches
rouges) les distances calculées pour les contraintes (distances au plus proche voisin, ne
prenant pas en compte les atomes covalemment liés).
Construction des modèles de Cytochrome P450 149
L’une des premières étapes de cette méthode consiste en la sélection des atomes conservés dans
les chaînes latérales des résidus du bloc, puis à sélectionner les rotamères quand il manque de
l’information. Les angles de torsion des chaînes latérales, χ1, χ2, etc… des acides aminés d’une
protéine adopte généralement trois orientations préférentielles : +60°, –60° ou +180°. Au sein de la
protéine, la distribution de ces angles de torsion dépend de l’élément de structure secondaire auquel
participe l’acide aminé et donc de la conformation locale de son squelette. L’équipe de Karplus
(Dunbrack et Karplus, 1993) a établi une librairie de rotamères à partir de l’étude de 132 structures,
qui permettait de corréler la position d’un couple (φ,ψ) dans le plan de Ramachandran avec un
rotamère particulier (cf. Figure 3-8). Ces tables permettent de sélectionner le rotamère le plus probable
pour chacun des acides aminés des blocs conservés à partir des angles (ϕ,ψ) « expérimentaux ».
180 3 3 3 2 8
160 5 9 9 8 9 8
140 5 5 5 5
χ2=–60 ± 60 χ2=0 ± 30 χ2=–60 ± 30 120 5 5 5 5 5
100 5 8 4
80 5 5 7
60 9
χ1=–60 ± 60 3,5 (1) 8,8 (2) 4,7 (3) 40 2 2 8 2
20 2 8 8
χ1=180 ± 60 6,8 (4) 9,8 (5) 11,8 (6) 0 7 8 8
-20 9 8 7
χ1= 60 ± 60 29,6 (7) 18,7 (8) 5,3 (9) -40 8 9 8
-60
-80
Pourcentage de chacune des combinaison (χ1,χ2) sur la population d’asparagine -100
-120
de 132 protéines sélectionnées à la PDB. Chaque rotamère est désigné par un -140
numéro entre parenthèse. -160 2
-180 3 3 2 2
-180
-160
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
ψ/ϕ
Figure 3-8 Exemple de distribution des rotamères les plus probables en fonction des angles (ϕ,ψ) : cas de
l’asparagine (d’après Dunbrack et Karplus, 1993). Le tableau de gauche montre une liste des 9 rotamères possible
de l’asparagine et le pourcentage de précesne de ces rotamères dans la PDB. Le tableau de droite correspond à une
table de correspondance des rotamères les plus probables en fonction de la configuration locale (ϕ,ψ).
L’étape suivante consiste en la construction des fichiers de contraintes d’angles et de distances.

Pour chacun des résidus des blocs conservés, les angles dièdres ϕ, ψ, χ1, χ2, sont dérivés de
l’alignement ou inférés à partir des rotamères probables pour constituer le jeu de contraintes
angulaires. Chacun des angles ϕ, ψ est défini par une valeur et un écart type résultant de la moyenne
arithmétique des données expérimentales de l’ensemble des structures templates tandis que les valeurs
et écart types des angles χ1, χ2, sont repris de celles fournies par Dunbrack et Karplus. Le fichier de
contraintes de distances nécessaire à la construction des modèles est lui établi à partir du calcul de
toutes les distances entre un atome donné et tous les atomes voisins conservés (non liés covalemment)
pour chaque structure templates dans un rayon maximal donné (ou cut off) (cf. Figure 3-7). Pour ne
pas générer un fichier de contraintes trop important ou redondant, on choisit de : (i) sélectionner toutes
les distances inter atomiques inférieures à 8 Å, (ii) de compléter par des distances conservées
hème-résidus pour ancrer l’hème, (iii) les distances entre chaînes latérales (par exemple Cβ,– Cβ de 2
résidus voisins dans l’espace ou dans la séquence) sont intégrées pour conserver l’agencement des
différentes blocs entre eux, en particulier entre blocs non contigus. Les distances ainsi conservées
permettent de décrire l’environnement local de chacun des atomes. Chaque contrainte est définie par
deux valeurs (moyenne ± écart type).
Lors de la reconstruction, les 30 premiers résidus en N-terminal – notamment lors de

reconstruction de P450s membranaires à partir de templates bactériens – sont généralement supprimés :
n’ayant pas d’équivalent structural, cette partie modélisée sans contrainte pouvait perturber l’ensemble
du modèle. La reconstruction à partir des contraintes géométriques et la minimisation sont conduites
sous le logiciel DYANA (Güntert et al, 1997) initialement destiné au calcul des structures de protéines
ou d’acides nucléiques à partir de contraintes conformationnelles provenant d’expériences RMN7.
Dans cette étape d’optimisation géométrique, les boucles (ou régions inter-blocs) sont
reconstruites sans contraintes. Il peut en résulter des configurations anormales dans l’espace des ϕ, ψ
au sens des régions autorisées de l’espace de Ramachandran. Pour rendre ces structures plus
acceptables au sens de Ramachandran, un programme établissant des contraintes angulaires est
appliqué pour le squelette des acides aminés dans les régions hors blocs. Il consistait à déplacer un
point (ϕ,ψ) d’une zone interdite vers une zone autorisée la plus proche. Les modèles ainsi travaillés
étaient ensuite soumis à un recuit simulé sous contrainte par le logiciel X-Plor (Brunger, 1992),
permettant de relâcher les modèles obtenus parfois trop compacts après minimisation par DYANA.
Cette première méthode globale procurait en son temps des modèles de très bonne faction aussi
bien d’un point vue géométrique qu’énergétique. Elle nécessitait hélas une succession importante
d’étapes, longues et lourdes en calcul avec manipulations de nombreux fichiers au format différent.
Aucune automatisation n’était envisageable dans ce cadre, c’est pourquoi j’ai choisi une autre
approche pour la construction des modèles, approche réalisée en grande partie par un seul logiciel :
Modeller (cf. section 2.5.1.2).
7
DYANA a succédé au logiciel DIANA (Distance geometry Alogrithm for NMR Applications) et n’est plus
supporté actuellement. La dernière version en date est DYANA v1.5
Construction des modèles de Cytochrome P450 151
3.4.2 Modeller, un logiciel de modélisation comparative prêt à l’emploi
3.4.2.1 Utilisation conventionnelle de Modeller

Largement répendu dans la communauté scientifique, le logiciel Modeller offre l’avantage de
calculer lui-même les contraintes d’angles et de distances de façon automatisée : il suffit pour cela de
lui fournir un ensemble de structures de références, un fichier d’alignement de ces structures et enfin
un fichier de commandes contenant une liste de directives. Il dispose également de procédures de
recuit simulé pour la reconstruction de boucles et de minimisation pour produire des modèles stables
énergétiquement. Bref, c’est un package complet pour la construction de modèles par homologie. La
principale contrainte pour nous est le respect de la « philosophie » des blocs, à savoir le respect de la
topologie et les contraintes structurales au niveau des blocs. Le problème lors d’utilisation de logiciels
de type « boîte noire », c’est qu’il n’est pas toujours évident d’avoir un contrôle sur ce genre de chose.
Nous avons d’abord pensé utiliser le programme pour construire les modèles et exploiter les fichiers
de contraintes générés par Modeller par retour à la stratégie d’optimisation en recuit simulé sous
contraintes (section 3.4.1). Cela n’a pas été possible dans la mesure où le fichier de contraintes
récupéré n’était pas compréhensible et donc non exploitable. Par ailleurs, ce logiciel suit une
procédure rigoureuse qu’il faut respecter au mieux si l’on désire profiter de sa pleine potentialité pour
construire un modèle correct. Par exemple, une des contraintes imposée par le programme est de
fournir un alignement des templates le plus précis possible sur la séquence cible. Ceci suppose un
alignement à la fois des blocs sur la séquence cible, mais aussi des régions inter-blocs, jugées non
prioritaires pour la reconstruction dans la philosophie des blocs. Par conséquent, Modeller traite donc
à niveau égal aussi bien les régions reconnues par GOK comme structuralement conservées et les
régions hors blocs. En effet, Modeller détermine lui-même les régions conservées et les régions dites
variables et se charge de reconstruire ces régions variables à l’aide d’informations qu’il puise dans sa
banque de repliements.
Une petite remarque peut être formulée pour l’attachement de l’hème lors de la reconstruction du
P450. En fait, Modeller n’est pas en mesure de reconnaître de nouveaux résidus (par exemple une
cystéine modifiée) ou construire des cofacteurs (comme l’hème par exemple), et se contente de copier
les coordonnées de l’hème d’une des structures de référence au modèle. En conséquence, il n’y a pas
d’attachement de l’hème à la cystéine proximale du P450. Il devra être effectué a posteriori par
l’utilisateur.
3.4.2.2 Traitement additionnel lors de reconstruction de boucles

Une première possibilité est de laisser le programme agir avec les paramètres par défaut, mais j’ai
pu également expérimenter un autre moyen qui « mimait » au mieux la première méthode pour le
traitement des régions inter-blocs, puisque Modeller offre également la possibilité de construire des
boucles de novo. Il est possible en effet de « forcer » Modeller à ne pas s’appuyer sur les contraintes
spatiales fournies par les templates au niveau des régions inter-blocs : il suffit de ne pas aligner ces
régions comme il a été présenté à la Figure 3-4. Ne disposant pas de contraintes spatiales dérivées des
structures de référence, Modeller reconstruit alors ces régions de façon ab initio. Une reconstruction
ab initio donne toujours de longues boucles non structurées au niveau de ces régions privées de
contraintes spatiales. Ainsi, dans ce cas, on applique une seconde procédure à Modeller pour
« raffiner » ces régions, exactement de la manière utilisée dans la première stratégie issue de la
détermination structurale par RMN. Cette procédure peut s’effectuer durant la reconstruction (voir
exemple en annexe 4.2) Elle ne nécessite que le fichier de structure du modèle à traiter et un script de
commandes similaire au fichier général de commandes, utilisé pour la reconstruction des modèles.
L’utilisateur doit donc informer au programme au moyen de ce script, les régions qu’il considère
comme des boucles à reconstruire (voir annexe 4.2). Afin de conserver l’arrangement spatial des blocs
les uns par rapport aux autres au cours de ce processus, un jeu de contraintes entre chaque Cα des
résidus de fin de bloc avec celui de début du bloc suivant, est également défini dans le fichier de
directives. Ces contraintes spatiales sont appliquées au niveau de la distance, des angles de torsions,
des angles impropres et dièdres. Une fois toutes ces informations déclarées, le fichier de directives
commande Modeller qui va déplacer aléatoirement les coordonnées cartésiennes des Cα de chaque
boucle, puis procéder à une optimisation locale par recuit simulé de chaque boucle, et ce de façon
itérative. C’est un peu l’équivalent du recuit simulé effectué par le programme Xplor pour reconstruire
les boucles dans la première stratégie, mais cette fois-ci, de manière automatisée.
3.5 Évaluation, sélection et raffinement des modèles
Quelles que soient les méthodes utilisées pour la reconstruction, un nombre important de modèles
doit être généré. En effet, les méthodes de reconstruction donnent rarement une solution unique
puisque tous les modèles générés sont triés par le seul critère de la fonction énergétique. Pour explorer
au mieux l’espace des solutions les plus énergétiquement favorables, il faut multiplier le nombre de
modèles et sélectionner selon les critères d’évaluation définis par l’utilisateur.
Évaluation, sélection et raffinement des modèles 153
3.5.1 Les différents critères d’évaluation
Les différents outils et critères d’évaluation ont été déjà abordés lors de la section 2.5.4. Selon les
méthodes utilisées pour la reconstruction, les critères d’évaluation n’ont pas été les mêmes. Ainsi,
pour les premières méthodes basées sur des outils RMN, le critère essentiel était celui de la géométrie
au niveau du plan de Ramachandran. Le logiciel de référence pour ce genre d’évaluation est
PROCHECK. Il permet entre autres de vérifier si les couples (ϕ,ψ) sont bien situés dans les zones
autorisées du diagramme de Ramachandran, de contrôler de la distorsion géométrique des chaînes
latérales, la planéité des cycles aromatiques etc. Les meilleurs modèles PROCHECK étaient alors
sélectionnés pour une relaxation, et une seconde sélection se fait ensuite sur le critère de l’énergie
totale de chaque modèle après relaxation.
Pour les modèles issus de Modeller, un processus assez similaire a été appliqué. Modeller dispose
de son propre score, appelé fonction objective, qu’il calcule pour tous les modèles qu’il génère. Ce
score est une combinaison de plusieurs paramètres aussi bien statistiques qu’énergétiques. Plus ce
score est bas, meilleure est la structure. Cependant, la meilleure fonction objective n’est pas toujours
synonyme de meilleure solution. En effet, la notion de « meilleur modèle » est variable selon les
logiciels d’évaluation utilisés. De ce fait, chaque fois que j’ai eu à sélectionner un modèle parmi
l’ensemble de ceux générés par Modeller, j’ai dû chercher un compromis entre les différentes
méthodes d’évaluation. Avec l’expérience, certains programmes ont été privilégiés : ainsi, je n’ai pas
eu à utiliser PROCHECK dans la mesure où tous les modèles sortis par Modeller étaient « propres »
au niveau du plan Ramachandran. J’ai en revanche utilisé ANOLEA, PROQ ainsi que Prosa II pour
évaluer les modèles (cf. Tableau 2.3 à la page 120). Il n’a pas été possible pour moi d’établir un script
pour le choix des modèles par ces outils : les scores étant calculés différemment, un consensus n’est
pas réalisable. La recherche d’un meilleur compromis entre les scores calculés par ces différents
programmes est encore manuelle.
3.5.2 Affinement avant d’être exploité
Une fois le modèle choisi, vient l’étape d’affinement. Le modèle est dans un premier temps
soumis au logiciel SCWRL (http://bioserv.cbs.cnrs.fr/HTML_BIO/frame_scwrl.html) (Canutsecu et
al., 2003) qui réattribue les chaînes latérales de façon à minimiser les « clashes » entre chaînes
latérales, et entre chaînes latérales et squelette peptidique. SCWRL dispose pour cela d’une
bibliothèque de rotamère et propose une liste de valeurs de χ1-χ2-χ3-χ4 en fonction des valeurs ϕ et ψ
du squelette peptidique. Lorsque les chaînes latérales sont correctement positionnées, une
minimisation est opérée suivie d’une dynamique pour « relâcher » la molécule. C’est d’ailleurs au
cours de cette étape que l’on procède à la « fixation » de l’hème sur la cystéine proximale, et ce quel
que soit le logiciel utilisé pour la dynamique. Au cours de ma thèse, j’ai été conduit à tester différents
champs de force sur les modèles que j’obtenais : GROMOS, CHARMM et AMBER. J’ai d’abord
travaillé avec le champ de force GROMOS en raison de la simplicité du programme GROMACS pour
le paramétrage et sa robustesse. Dans ses premières versions (V3.1.4) il était très aisé d’attacher
l’hème à l’apoprotéine : GROMACS disposait en effet des fichiers nécessaires à la reconnaissance de
l’hème et sa fixation à la cystéine la plus proche. Cette procédure de fixation se faisait
automatiquement, sans intervention de l’utilisateur. Dans les versions plus récentes, la présence de
l’hème dans le site actif, empêche l’encapsulation de la protéine entière dans une boîte d’eau. Comme
je n’ai pas réussi à trouver l’origine du problème, je suis passé à une version plus ancienne de
GROMACS et plus tard à une nouvelle suite de logiciels. J’ai adopté par la suite le programme
NAMD pour réaliser les simulations, car c’est un outil qui offre la possibilité d’utiliser aussi bien le
champ de force CHARMM qu’AMBER. Les différentes simulations opérées sur les modèles ont
montré qu’il n’y avait pas de différences notables entre ces deux champs de force, au niveau des
résultats. Pour la suite des expériences, c’est finalement le champ de force AMBER que j’ai utilisé.
Quels que soient les outils utilisés pour la simulation, les paramétrages des simulations ont été à
peu près équivalents. Dans tous les cas, le modèle à relaxer a été placé dans une boîte d’eau périodique
–on parle alors de simulations en solvant explicite– dont les bords sont situés à 10 Å du bord des
résidus de surface de la protéine. En fait, la taille de la boîte est définie par l’utilisateur, et peut être
plus petite. Par sécurité, la marge de 10 Å autour de la protéine a toujours été appliquée, conduisant à
des boîtes périodiques parallèlipédiques de l’ordre de 95x85x75 Å3. La forme de la boîte n’est quant à
elle pas importante (cubique, octaédrique …), seule sa périodicité l’est. En effet, les conditions
périodiques (correspondant à une duplication de la boîte le long des trois axes du référentiel)
permettent le maintient du nombre de molécules total, de volume et de pression dans les ensembles
NVT ou NPT. Une des conséquences indirecte lors de l’utilisation de ces conditions périodiques est
de s’affranchir d’un nombre trop important de molécules dans le système et donc soulager le temps de
calcul pour chaque simulation. Ainsi, si une molécule d’eau par exemple sort de la boîte par une face,
elle est générée systématiquement aussitôt sur la face opposée, permettant au système de conserver le
même nombre d’atomes. Dans un souci de neutralité du système, des contre-ions sont ajoutés au
système (Na+ ou Cl–). Une fois la solvatation réalisée, le système peut alors être minimisé, équilibré et
soumis à une simulation de MD pour des temps variables allant de la picoseconde à la nanoseconde,
Évaluation, sélection et raffinement des modèles 155
qui se traduisent en temps de calcul de quelques jours à quelques semaines. En fin de dynamique,
l’énergie du système est évaluée pour vérifier si le modèle obtenu est stable ou non. Après cette ultime
étape, je dispose alors d’un support de travail pour analyser les mécanismes de reconnaissance des
P450s in silico.
3.5.3 Traitement additionnel (et optionnel) des régions inter-blocs sur les
modèles obtenus
Lorsque j’ai voulu valider la méthodologie de reconstruction à l’aide de blocs structuraux

conservés, j’ai souvent été confronté à des « divergences structurales » au niveau des régions
inter-blocs entre le modèle et la structure de référence (exemple 1tqn pour le modèle du CYP 3A4).
Quelle que soit l’approche utilisée sous Modeller (avec ou sans alignement inter-bloc), des différences
de repliements sont observées entre la structure-test et les modèles générés, localisées surtout au
niveau de ces régions qui ne devaient pas porter d’information structurale. La méthode de
reconstruction des boucles proposées par le logiciel Modeller n’a pas donné les résultats espérés,
comme cela a été déjà évoqué. Dans l’ancienne stratégie basée sur les outils RMN, N. Loiseau et M.
Cottevieille essayaient de s’affranchir de ce problème par l’utilisation du recuit simulé sous Xplor.
C’était possible car les fichiers de contraines étaient générés explicitement en format Xplor, et le
programme pouvait calculer toutes les violations des contraintes spatiales pour chaque modèle généré.
Avec Modeller, cette étape n’est pas accessible du fait d’un format obscure des fichiers : la
récupération des fichiers de violations des contraintes de Modeller n’était d’aucune aide, étant dans
l’incapacité de les exploiter.
Il fallait donc trouver une alternative à cette étape ultime d’affinement sous Xplor. Cela m’a
conduit à prendre contact avec K. Zimmermann du MIG (Mathématique, Informatique et Génome) à
l’INRA de Jouy-en-Josas. Je cherchais un minimisateur efficace et seul ORAL (Zimmermann, 1991)
semblait adapté à l’esprit de la minimisation par blocs : il relaxe uniquement des portions d’une
molécule bordées par deux blocs rigides (ou semi-rigides) déterminés par l’utilisateur. Son concept
plutôt novateur était cependant limité par la génération de champ de force qu’il intègre : AMBER4.
Avec mes simulations conduites sous AMBER6, les topologies n’étaient pas compatibles. Il a donc
fallu reconstruire toutes les topologies sous AMBER4. Par ailleurs, ORAL utilise le package
d’AMBER, qui est sous licence. Je ne disposais pas de licence sur mes propres machines.
3.6 Conclusion
Au travers de ce chapitre, j’ai présenté la stratégie de reconstitution de P450s inconnus à basse

identité de séquences mise au point au laboratoire. Avec les différentes générations de modélisateurs,
cette stratégie s’est vue modifiée. J’ai réalisé les principaux changements au cours de ma thèse, en
apportant une nouvelle façon d’aligner ainsi qu’une nouvelle manière de construire les modèles, tout
en conservant la philosophie initiale : celle d’utiliser les éléments structuraux communs à tous les
P450s pour servir d’ossature aux nouveaux modèles. Ainsi, pour chaque étape, j’ai présenté les deux
méthodes (l’ancienne et la nouvelle) afin que l’on puisse se rendre compte à la fois de leurs
différences, mais également des problèmes auxquels j’ai été confronté pour adapter cette
méthodologie aux nouveaux outils mis à disposition. À chaque difficulté rencontrée dans l’adaptation
de la méthode, différentes approches pour trouver une solution ont été présentées.
On dit souvent qu’un beau dessin vaut mieux qu’un long discours, aussi, je terminerai ce chapitre
par un schéma récapitulatif présentant la méthodologie générale de reconstruction de P450s utilisée au
laboratoire sous ses deux aspects : avant et après mon arrivée. La dualité sera alors plus visible pour
chaque étape de la reconstruction.
Le prochain chapitre est consacré au logiciel que j’ai développé pour automatiser de façon non
ambiguë le positionnement des blocs sur la séquence cible : Caliseq. Ce logiciel prend donc place à
l’une des étapes les plus importantes de la méthodologie, à savoir fournir au logiciel de construction
de modèle par homologie, l’alignement le plus fiable.
Conclusion 157
Ancienne stratégie Nouvelle stratégie

Etape 1 :
Identification des CSBs
Choix des P450s de référence Choix des P450s de référence
Identification des CSBs Identification des CSBs
. Logiciel GOK . Logiciel GOK

. Fusion des 3 jeux de templates
. Logiciel GAKUSA
Etape 2 :
Alignement des CSBs
Transformation de chaque bloc en PSSM puis Alignement simultané de l’ensemble des

alignement des blocs sur la séquence du P450s Blocs sur la séquence du P450s à
à reconstruire, indépendamment les uns des reconstruire, par programmation dynamique
autres par déplacement des profils sur la
séquence cible . Programme Caliseq
. Logiciels Make_consenus et SmartConsAlign
Alignement des régions de

séquences inter-blocs
. Programme Clustalw
. Utilisation des SSE
. Alignement manuel
Etape 3 :
Construction des modèles
Construction du modèle par homologie à Construction du modèle par homologie de

l’aide de logiciels de RMN en utilisant les manière automatisée
contraintes spatiales entre les atomes des
résidus dans les blocs . Logiciel Modeller
. Banque de rotamères de Karplus, utilisation

du logiciel DYANA pour la construction selon
les contraintes spatiales et enfin logiciel
Recuit simulé sur les régions inter-blocs
XPLOR pour le recuit simulé et pour
optimisation
. Utilisation de la fonctionnalité de Modeller
pour reconstruire les boucles de novo
. Programme ORAL (sous AMBER4)
Etape finale :
Sélection du modèle final
Evaluation des modèles générés Evaluation des modèles générés
. Logiciel Procheck . Compromis Fonction Objective de Modeller,

. Evaluation de l’énergie globale logiciel ProsaII, logiciel ProQ et logiciel Anolea
Affinement des modèles sélectionnés en boîte

de solvant
. Gromacs
. NAMD
Figure 3-9 Schéma récapitulatif de la méthodologie appliquée à la reconstruction à bas taux d'identité des
P450s
CHAPITRE 4
4 Voyage au centre de Caliseq
« Mon oncle Lidenbrock nous met tous à la diète

jusqu’au moment où il aura déchiffré un vieux
grimoire qui est absolument indéchiffrable !»
Jules Verne (1828– 1905 ap JC)
159
160 Chapitre 4. Voyage au centre de Caliseq
4.1 Présentation de l’outil
Ce chapitre présente le programme qui réalise non seulement l’alignement des blocs sur la
séquence cible pour la reconstruction ultérieure du modèle, mais qui offre une autre possibilité: celle
de scanner les banques de séquences à la recherche de nouveaux P450s. Caliseq est donc un outil à
deux facettes, auquel j’ai consacré une grande partie de ma thèse, pour son développement, puis pour
son optimisation à la suite de résultats obtenus lors de son utilisation. À l’origine, Caliseq a été conçu
comme une extension au programme SmartConsAlign, utilisé par mes prédécesseurs pour réaliser le
positionnement des blocs indépendamment les uns des autres. En réponse à des attentes liées à la
méthodologie, comme par exemple l’alignement simultané de tous les blocs (représentés par un
ensemble de PSSMs séquentielles), un nouveau cahier des charges précis a été défini. Celui-ci imposa
de nouvelles contraintes au programme si bien que son mode de fonctionnement ainsi que son
algorithme se sont progressivement éloignés de ceux du programme d’origine, conduisant Caliseq à
une « entité » à part dans SmartConsAlign. Du programme SmartConsAlign, Caliseq n’en utilise plus
que « l’interfaçage » et partage encore quelques fonctions d’ouverture, de lecture et d’écriture de
fichiers de séquences. Toutes les parties d’alignement, de calcul de scores et de calcul de seuils sont
propres à Caliseq. L’interfaçage de SmartConsAlign est des plus simples, sans représentation
graphique : SmartConsAlign, de même que Caliseq, ont en effet été tous deux écrits en langage C et
sont utilisables sur différentes plateformes (Linux, Unix et MacOSX).
Au cours de ce chapitre, je décrirai dans une première partie les grands points du logiciel ainsi que
ses paramètres, puis dans une seconde partie, je discuterai des différentes évolutions apportées au
programme pour l’adapter au mieux à l’étude des P450s. Le manuel d’utilisation du programme est
présenté en Annexe 3, avec une description succincte des fonctions principales qui composent le
programme.
4.2 Fonctionnement de Caliseq

4.2.1 De nouvelles entrées pour le programme
Bien que reprenant le principe d’alignement de blocs du programme SmartConsAlign, les fichiers
d’entrées du nouveau programme devaient être redéfinis pour prendre en compte un ensemble de blocs
à la place d’un bloc unique. Tous les blocs (donnés sous forme de sous-alignements de séquences par
GOK) sont donnés en entrée dans un même fichier. Le format d’entrée regroupe chaque sous-
Fonctionnement de Caliseq 161
alignement de séquences les uns à la suite des autres, séparées par un délimiteur (cf. Annexe 2). Ce
fichier d’entrée n’est alors plus adapté à une transformation en matrice consensus effectuée lors d’une
étape préalable dans la version originale de SmartConsAlign : la construction des profils (profile en
anglais) liés à ces alignements se fait désormais directement dans le programme Caliseq.
Par ailleurs, deux autres fichiers étaient présentés en entrée standard au programme
SmartConsAlign : i) la séquence de la protéine inconnue à reconstruire (ou son alignement avec
d’autres P450s de la même famille) et ii) optionnellement, une matrice de similarité BLOSUM ou
PAM pour rajouter du « flou » à la recherche. Dans Caliseq, le fichier d’alignement « cible » ne
nécessite pas de transformation préalable. La matrice de similarité pour sa part n’est plus utilisée dans
la dernière version de Caliseq, pour des raisons expliquées plus loin.
Il est à noter que contrairement à SmartConsAlign, le programme Caliseq autorise la présence des
gaps (‘–‘) (insertion ou délétions) dans les profils des blocs : certains blocs n’ayant pas été trouvés sur
toutes les structures, leur séquence dans le sous-alignement correspondant sera remplacée par des gaps.
4.2.2 Un algorithme de programmation dynamique adapté
En raison du traitement simultané de tous les blocs, le procédé initial de recherche par
déplacement des matrices position par position le long de la séquence cible comme le faisait
SmartConsAlign (cf. section 3.3.1) n’était plus envisageable. Ce procédé a donc cédé la place dans
Caliseq à une méthode d’alignement plus adaptée : la programmation dynamique de type NWS (cf.
section 2.4.1.3). J’ai dû toutefois adapter cette méthode à nos besoins : d’une part le programme devait
prendre en considération des profils au lieu de séquences, et d’autre part il devait autoriser le
« glissement » libre –sans pénalité– des blocs sur la séquence cible.
Dans la programmation dynamique classique, il faut, pour aligner deux séquences A et B, de

longueur M et N respectivement, créer une matrice d’alignement de dimension M x N où chaque
colonne et chaque ligne correspondent à un acide aminé de la séquence A et B respectivement. Pour
prendre en compte les profils, ce principe de création d’une matrice M x N reste inchangé sauf qu’à la
place d’un symbole unique, chaque ligne et chaque colonne correspondent désormais à un ensemble
de 20 symboles, un pour chaque type d’acide aminé (voir la Figure 3-3, page 142). En fait, j’ai utilisé
plus de 20 symboles dans les matrices consensus puisqu’il faut aussi plusieurs poids de gap : il y a le
poids de gap contre acide aminé (asymétrique, selon que le gap est inséré dans la séquence ou dans le
profil, donc deux valeurs différentes) ou encore le poids gap contre gap. Dans Caliseq, le poids
attribué à une insertion à une position donnée dépend de la fréquence des gaps à cette position du
profil du jeu des blocs (des « PSSMs séquentielles ») ainsi que du poids d’ouverture de gap. Cet aspect
est abordé plus en détail dans la section 3.4.6 de l’Annexe 3. Concernant le « glissement » libre des
profils sur la séquence cible, l’astuce a consisté à ne pas pénaliser les gaps entre les blocs (en fait, sur
la première ou la dernière colonne de chaque PSSM). L’utilisation de cette astuce impliquera toutefois
certaines contraintes, notamment d’ « accrochage » de certains blocs sur la séquence cible comme il
sera vu plus tard. L’alignement proprement dit est affiché en sortie de programme au format clustal ou
fasta.
4.2.3 Le deuxième rôle de Caliseq
Caliseq a été développé initialement pour aligner un jeu de blocs sur une séquence cible à
reconstruire, et ce de façon simultanée et automatique. Par son fonctionnement, Caliseq est capable de
lire une séquence cible ou un alignement de séquences comprenant la séquence cible, pour le
confronter à un ensemble de blocs. Dans la mesure où il peut lire des alignements de séquences, rien
ne l’empêche a priori de lire individuellement chaque séquence de l’alignement comme des séquences
d’une banque 8 . Le but était d’utiliser le jeu de blocs comme une signature spécifique aux P450s
contenant l’information de conservation structurale pour identifier de façon fiable les séquences de
P450s inconnues (non annotées) ou encore, mettre en évidence des P450s dans des génomes
nouvellement séquencés. Cette recherche a alors un intérêt double : non seulement elle permet d’avoir
à disposition une banque de séquences de P450s, mais également, en combinant avec la méthodologie
de reconstruction par blocs, d’obtenir une banque de structures et/ou sites actifs de P450s reconstruits
à partir des séquences identifiées. La banque de modèles 3D pourrait ainsi servir comme base d’études
de criblage virtuel à haut débit9.
L’identification de P450s sur les banques de séquences par Caliseq se fait au moyen du score
d’alignement des blocs sur la séquence traitée, obtenu en fin de programmation dynamique : ce score
servant de critère de sélection, est évalué à un seuil d’acceptation imposé par l’utilisateur. Dans les
premières versions de Caliseq, ce score ne pouvait pas être utilisé tel quel, et nécessitait une
8
Il s’agit de banques de séquences enregistrées au format fasta, au sein d’un même fichier. C’est le genre de
fichier qui est généralement récupérable à partir des FTP de banques de données telles que Swiss-Prot, TrEmbl,
Pfam, etc.
9
Ces criblages se font généralement avec des méthodes de docking sur site rigide. Les approches virtuelles à
haut débit sont utilisées dans le domaine pharmaceutique pour tester des banques de composés contre une cible
thérapeutique (ADN ou protéine)
Les différentes évolutions de Caliseq 163
normalisation préalable. Les scores normalisés étaient alors comparés au seuil d’acceptation basé sur
un calcul de ratio. Cette première version du seuil n’étant pas suffisamment rigoureuse pour détecter
les nouveaux P450s, un nouveau seuil a été ensuite implémenté, basé cette fois-ci sur un calcul
de z-score. L’évolution de ce seuil, ainsi que la nécessité de son remplacement sont expliquées dans le
paragraphe qui suit.
4.3 Les différentes évolutions de Caliseq
Depuis son développement initial, l’outil Caliseq a été décliné en plusieurs versions, chacune
apportant son lot de nouveautés. Initialement, Caliseq était prévu pour remplacer le programme
SmartConsAlign en réalisant les alignements d’un ensemble de blocs –correspondant à des sous-
alignements de séquences de structures de P450s cristallisés– sur une séquence ou un pré-alignement
de séquences cibles dans le but de reconstruire un modèle 3D de la protéine cible. Caliseq apportait
par rapport à SmartConsAlign la possibilité de traiter en une seule fois l’ensemble des blocs, en
conservant l’information de leur ordre, et en évitant ainsi leur chevauchement possible observé
lorsqu’ils étaient traités séparément. Autrement dit, l’information contenue dans l’ensemble de blocs
était renforcée par rapport à celle de chaque CSB pris séparément : l’information de repliement
commun à tous les P450s n’est plus morcelée par blocs, mais au contraire, présente sur toute la
protéine. Partant de ce constat, on a attribué au programme la possibilité de scanner les banques de
séquences : celui-ci utilise alors cette information contenue dans les ensembles de blocs pour détecter
et identifier des séquences de P450s. L’outil Caliseq offrait donc un intérêt nouveau dans le domaine
de la génomique, en cherchant de nouvelles séquences de P450s dans les génomes récents. Ce
« deuxième mode » de Caliseq, celui de recherche sur banque, a donné lieu à la première évolution de
l’outil Caliseq. De nombreuses modifications dans la structure même du programme ont alors dû être
opérées : de nouvelles fonctions ont été conçues, et certains algorithmes, repensés.
Ainsi, par rapport à la version initiale, le calcul de la matrice de substitution a été complètement
revu pour mieux répondre au besoin du « scoring » d’alignement sur banque, score qui a servi de
critère de sélection des CYPs. Par ailleurs, un système de seuil a été mis en place, testé puis affiné.
L’ensemble de tous ces ajustements avait pour objectif principal d’améliorer la sensibilité et la fiabilité
de l’outil. Un comparatif des résultats obtenus pour chaque version sera exposé en résultat dans le
paragraphe 5.5.
4.3.1 Vers un nouveau système de calcul des « PSSMs séquentielles »
4.3.1.1 Une matrice initiale de similarité empruntée à PAM/BLOSUM

Dans la première version de Caliseq, la création du profil pour le jeu des blocs s’appuyait sur une
matrice de similarité de type PAM ou BLOSUM qui permettait de pondérer les fréquences des acides
aminés dans le profil. Le calcul des poids pour une position donnée du profil (des « PSSMs
séquentielles ») correspondait donc dans la version initiale de Caliseq à un calcul de fréquences,
pondérées par les coefficients de similarités des acides aminés tels qu’ils apparaissent dans la matrice
de similarité utilisée. Ainsi le score de substitution W(j,i), pour aligner la position i des « PSSMs
séquentielles » avec la position j dans le pré-alignement de séquence s’obtenait selon la formule
suivante :
 N 
20
 ∑ (M ( a k , a ni ) ) 
W ( j , i ) = ∑  n =1  × f (a )
k =1
 N  pre kj
 
 
Où ak est l’un des 20 acides aminés, ani l’un des acides aminés à la position i de la « PSSMs
séquentielles », M(ak,ani) le coefficient de l’acide aminé ak contre l’acide aminé ani dans la matrice de
similarité (PAM/BLOSUM), N le nombre de séquence dans un CSB donné des « PSSMs
séquentielles » et fpre(akj) la fréquence de l’acide aminé ak à la position j des séquences pré-alignées.
Un exemple de calcul de profil à partir de cette formule est présenté dans la Figure 4-1.
Comme il sera vu dans le chapitre des résultats, la construction de la matrice d’alignement par
cette formule a permis au final d’obtenir un alignement de blocs sur la séquence cible similaire à celui
de N. Loiseau et M. Cottevieille et ce, sans avoir à replacer manuellement les blocs dont les positions
attribuées par SmartConsAlign étaient incertaines. L’alignement par programmation dynamique a donc
donné directement le résultat optimal, sans avoir recours à l’intervention humaine, prouvant ainsi
l’apport de l’outil Caliseq par rapport à SmartConsAlign.
Néanmoins, l’utilisation des scores de la matrice de similarité était moins bien adaptée pour la
recherche sur banque. En effet, lorsqu’on se penche à nouveau sur la matrice de score (Figure 4-1),
force est de constater que les scores attribués aux résidus présents dans l’alignement (marqués en gras
dans la matrice) ne correspondent pas toujours aux scores les plus élevés. Ceci est lié en fait à
l’utilisation d’une matrice de similarité.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A 4.00 -2.00 -2.00 -0.67 -2.00 -0.33 -1.00 0.00 -1.33
B -2.00 4.00 -3.00 -3.67 0.00 -3.33 -2.00 -3.00 -2.33
C 0.00 -3.00 -2.00 -1.00 -3.00 -1.00 -3.00 9.00 -1.67
D -2.00 6.00 -3.00 -3.67 -1.00 -3.33 -1.00 -3.00 -2.33
E -1.00 2.00 -3.00 -2.67 0.00 -2.33 -1.00 -4.00 -2.33
F -2.00 -3.00 6.00 -0.33 -1.00 -0.67 -4.00 -2.00 3.33
G 0.00 -1.00 -3.00 -3.67 -2.00 -3.33 -2.00 -3.00 -2.67
H -2.00 -1.00 -1.00 -3.00 8.00 -3.00 -2.00 -3.00 -1.33
I -1.00 -3.00 0.00 2.33 -3.00 2.67 -3.00 -1.00 -0.33
J -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00
K -1.00 -1.00 -3.00 -2.00 -1.00 -2.00 -1.00 -3.00 -2.33
L -1.00 -4.00 0.00 3.00 -3.00 2.00 -3.00 -1.00 -0.33
M -1.00 -3.00 0.00 1.67 -2.00 1.33 -2.00 -1.00 -0.33
N -2.00 1.00 -3.00 -3.00 1.00 -3.00 -2.00 -3.00 -2.00
O -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00
P -1.00 -1.00 -4.00 -2.67 -2.00 -2.33 7.00 -3.00 -3.00
Q -1.00 0.00 -3.00 -2.00 0.00 -2.00 -1.00 -3.00 -2.33
R -1.00 -2.00 -3.00 -2.33 0.00 -2.67 -2.00 -3.00 -2.33
S 1.00 0.00 -2.00 -2.00 -1.00 -2.00 -1.00 -1.00 -1.00
T 0.00 -1.00 -2.00 -0.67 -2.00 -0.33 -1.00 -1.00 0.33
U -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00 -4.00
V 0.00 -3.00 -1.00 2.00 -3.00 3.00 -2.00 -1.00 -0.67
W -3.00 -4.00 1.00 -2.33 -2.00 -2.67 -4.00 -2.00 0.00
X 0.00 -1.00 -1.00 -1.00 -1.00 -1.00 -2.00 -2.00 -0.67
Y -2.00 -3.00 3.00 -1.00 2.00 -1.00 -3.00 -2.00 1.33
Z -1.00 1.00 -3.00 -2.67 0.00 -2.33 -1.00 -3.00 -2.33
- -7.00 -7.00 -7.00 -7.00 -7.00 -7.00 -7.00 -7.00 -7.00
@ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
$ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
? 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
! 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
& 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
3 Blocs : Exemple de calcul des scores de la matrice :
A1 M(A,A) + M(A,A) + M(A,A) (4+4+4)/3 = 4

ADF LHV PCF A2 M(B,A) + M(B,A) + M(B,A) (-2-2-2)/3 = –2
ADF LHV PCT H4 M(H,L) + M(H,L) + M(H,V) (-3-3-3)/3 = -3
ADF VHL PCF L4 M(L,L) + M(L,L) + M(L,V) (4+4+1)/3 = 3
V4 M(V,L) + M(V,L) + M(V,V) (1+1+4)/3 = 2
123 456 789 F9 M(F,F) + M(F,T) + M(F,F) (6–2+6)/3 = 3.33
T9 M(T,F) + M(T,T) + M(T,F) (–2+5–2)/3 = 0.33
Figure 4-1 Exemple de « PSSMs séquentielles » générées à partir de l’ancienne formule. La matrice du haut
donne les scores obtenus pour le set des trois blocs présentés en bas à gauche. Chaque colonne de la matrice
correspond à une position dans l’alignement des blocs, allant de 1 à 9. Des exemples de calcul de scores sont
donnés en bas à droite, où M(X,Y) correspond au poids de similarité BLOSUM62 (cf. Figure 2-9, page 85)
entre les deux résidus X et Y. Il n’y a que trois séquences dans les blocs, donc N est égale à 3.
C’est le cas de la dernière colonne de l’exemple (Figure 4-1) pour la thréonine dont la valeur est
de 0.33. Il est vrai que ce genre de substitution (F↔T) n’est pas usuel, et le remplacement d’une
phénylalanine (F) par une tyrosine (Y) (d’un score 1.33) est davantage favorisé. Toutefois, comme il a
été remarqué lors de la recherche de CSBs par le logiciel GOK, certains blocs présentent un
alignement en séquences non conventionnel, avec de nombreux mésappariements (cf. l’exemple de
bloc de la Figure 3-2, page 138). L’existence d’un grand nombre de résidus différents à une même
position de l’alignement, entraînerait alors une création de scores assez homogènes à cette position,
masquant ainsi l’information qui pouvait y être présente. Ce constat m’a donc conduit à réviser la
formule pour obtenir les scores de substitution, mettant plus en valeur les résidus présents dans les
alignements des blocs, tout en conservant toutefois une certaine « flexibilité » à l’aide d’une matrice
de similarité.
4.3.1.2 Vers la création d’une matrice de similarité propre à l’alignement de la superfamille

L’idée est de calculer les scores de la matrice d’alignement à l’aide d’une formule de log-odd qui
s’apparente à celle utilisée pour la matrice BLOSUM ou PAM : en quelque sorte, il s’agit de
reconstruire une matrice « BLOSUM like » tirée de nos alignements. Pour mémoire, le score de
similarité de la matrice BLOSUM d’un couple (aiaj) est obtenu par la formule suivante :
 f (ai a j ) 
S ij = log 2  
 2 × f (a i ) f (a j ) 
Où f(aiaj) correspond à la fréquence observée du couple (aiaj) à une position donnée de
l’alignement (voir plus bas) et f(ai), f(aj) les fréquences attendues (dues à la composition) –
« background frequencies» récupérées des statistiques de SwissProt– des résidus ai et aj
respectivement. Ce score de type « log-odd » est alors multiplié par deux et arrondi à l’entier le plus
proche pour obtenir le score BLOSUM définitif pour le couple (aiaj). Le calcul de la fréquence
observé du couple (aiaj) s’effectue quant à lui de la manière suivante :
Nai × Na j
f (ai a j ) = 2 ×
L( L − 1)
Où Nai et Naj sont respectivement le nombre de résidus ai et aj dans une colonne d’alignement de
longueur L. Il est à noter que cette formule dérive de celle utilisée pour connaître le nombre total de
couples dans un ensemble L d’objets.
Le score de substitution W(j,i), pour aligner la position i des « PSSMs séquentielles » avec la
position j dans le pré-alignement de séquence est alors calculé selon la nouvelle formule qui suit :
20
 f (a ) 
W ( j , i ) = ∑ log 2  CSB ki  × f pre (a kj )
k =1  f bck ( a k ) 
Où ak est l’un des 20 acides aminés, fCSB(aki) est la fréquence de l’acide aminé ak à la position i
dans les « PSSMs séquentielles », calculée avec des pseudo-comptes (voir plus bas), fbck(ak) est la
fréquence « background » de l’acide aminé ak dans le set de données et fpre(akj) est la fréquence de
l’acide aminé ak à la position j dans les séquences pré-alignées. Pour la position i dans les « PSSMs
séquentielles », la fréquence fCSB(aki) pour l’acide aminé ak est calculée de la manière suivante :
N CSB (a ki ) + eak
f CSB (a ki ) =
N+E
NCSB(aki) est le nombre d’acides aminés ak à la position i dans les « PSSMs séquentielles », N est
le nombre de séquences dans la CSB donnée des « PSSMs séquentielles », eak donne les pseudo-
comptes (Lawrence et al., 1993) pour un acide aminé ak où eak=E*fbck(ak). Les pseudo-comptes,
comme expliqué précédemment, ont été mis en place pour pallier l’apparition d’une fréquence nulle
pour un acide aminé ak (qui aurait pour effet d’invalider le score). L’idée est d’ajouter au compte réel,
une proportion de pseudo-comptes calculés à partir d’une « probabilité attendue » de l’acide aminé ak.
La valeur de E, à l’image de N, donne le poids entre les pseudo-comptes et les comptes réels (E est
habituellement fixé à \/‾N). Une matrice de score obtenue par cette nouvelle formule et à partir des
trois mêmes blocs que dans l’exemple de la Figure 4-1 est présentée dans la Figure 4-2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
3 Blocs : A 3.09 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
B -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99
C -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 5.35 -1.45
ADF LHV PCF D -1.45 3.62 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
ADF LHV PCT E -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
ADF VHL PCF F -1.45 -1.45 4.01 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 3.44
G -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
H -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 4.82 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
123 456 789 I -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
J -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99
K -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
L -1.45 -1.45 -1.45 2.25 -1.45 1.36 -1.45 -1.45 -1.45
M -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
N -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
O -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99
P -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 3.75 -1.45 -1.45
Q -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
R -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
S -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
T -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 2.08
U -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99
V -1.45 -1.45 -1.45 1.81 -1.45 2.74 -1.45 -1.45 -1.45
W -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
X -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
Y -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
Z -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99 -99.99
- -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45 -1.45
@ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
$ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
? 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
! 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
& 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Figure 4-2 Exemple de « PSSMs séquentielles » générées à partir de la nouvelle formule de score basé sur une
« BLOSUM like ». La matrice du haut donne les scores obtenus pour le jeu des trois mêmes blocs que la Figure
4-1 et rappelés en bas à gauche. La matrice de score est cette fois-ci construite à la manière d’une matrice
BLOSUM en utilisant les acides aminés présents dans les séquences des blocs.
Cette matrice n’est pas très variée en raison des séquences utilisées pour la construire : je voulais
juste montrer les différences entre les matrices au niveau des scores des acides aminés présents dans
l’alignement. Bien entendu, cette matrice aurait été plus « riche » si les séquences dans les blocs
étaient plus variées : comme on construit une « BLOSUM like » à partir des séquences contenues dans
les CSBs, les mésappariements « exceptionnels » ne seront plus « dilués ».
Il est à noter que la matrice peut être plus diversifiée, donnant un caractère plus « flexible » aux
« PSSMs séquentielles », si on ajoute aux séquences dans les blocs d’autres séquences proches d’elles.
4.3.2 Seuils pour la sélection des séquences dans les banques
Le « nouveau mode » de Caliseq, celui de recherche de P450s dans les banques, nécessitait la
détermination d’un critère ainsi que la mise en place d’un système de seuil pour sélectionner les
séquences identifiées par les CSBs comme étant des cytochromes P450 avec un bon taux de confiance.
Dans l’outil Caliseq, l’unique critère spécifique à chaque séquence est le score d’alignement entre
cette séquence et le jeu de blocs. Un seuil a été mise en place, en dessous duquel l’alignement n’est
pas considéré comme significatif. Ce seuil, contrôlable par l’utilisateur en paramètre d’entrée au
programme, a également connu diverses modifications dans les différentes versions de Caliseq.
4.3.2.1 Premier seuil, basé sur un ratio

Le premier système de calcul du seuil s’apparente à celui des poids de gaps dans le programme
SmartConsAlign (cf. Annexe 3) : l’utilisateur fournit en entrée au programme un coefficient qui sert à
ajuster le seuil à partir duquel le score d’alignement est significatif. Ce dernier dépend d’une part du
score maximal SMAX obtenu par un alignement parfait des blocs, à savoir sans insertion de gap ni
délétion, et d’autre part, d’un score moyen SMEAN obtenu par alignement de ces blocs sur une séquence
« aléatoire ». Pour obtenir le score maximal SMAX, il suffit juste d’aligner les blocs sur eux-mêmes,
donnant le score maximal pour ces blocs. Pour obtenir le score moyen SMEAN, le programme calcule le
score du jeu de blocs contre les fréquences de base des acides aminés (celles de la banque Swiss-Prot).
Le calcul du seuil Threshold est alors calculé à l’aide de la formule suivante :
S MEAN + coefficient × ( S MAX − S MEAN )
Threshold =
S MAX
Le score d’alignement pour chaque séquence de la banque est alors normalisé par le score
maximal SMAX puis comparé à ce seuil Threshold correspondant au seuil minimal de significativité
pour l’alignement. La normalisation du score d’alignement était en effet nécessaire pour la
comparaison : de valeur variable, il dépendait beaucoup de la nature, de la longueur de chaque
séquence. L’idée est donc de récupérer les séquences dont les scores sont supérieurs à celui obtenu par
une séquence aléatoire, légèrement ajustée par l’utilisateur.
Pour la recherche sur banque, cette méthode de sélection offre des résultats assez satisfaisants
(détaillés au chapitre des résultats). Le problème de cette méthode vient du fait que le seuil n’est
calculé qu’à partir du jeu de blocs et des statistiques sur la banque, et non de l’information qu’apporte
l’alignement des blocs sur chacune des séquence de la banque de séquences (c'est-à-dire le score
individuel de chacune de ces séquences).
4.3.2.2 Deuxième seuil, limitant la longueur des séquences alignées

Pourquoi le score d’alignement est-il un frein à la méthode ? En fait, Caliseq offre aux blocs la
possibilité de « glisser » sur la séquence cible sans pénaliser pour autant le score. Cette astuce concède
aux blocs une extrême liberté pour leur positionnement, conduisant à des scores d’alignement élevés
parfois même lorsque deux blocs sont distants d’un très grand nombre de résidus. Cela se traduit par
l’existence d’un grand nombre de gaps ‘–‘ entre l’alignement de deux blocs sur une séquence. Ainsi,
ce genre de cas était rencontré lors d’alignements du jeu des blocs sur de très longues séquences :
certains blocs trouvaient leurs positions idéales en début de séquence, d’autres en fin de séquence,
sans que le score d’alignement n’en soit affecté. Un tel résultat n’était pas compatible avec notre
objectif, apportant dans les résultats un lot de faux positifs. Pour remédier à ce problème, un « cut
off » a été implémenté. Ce dernier devait limiter la longueur de l’alignement des blocs sur la séquence
cible. En pratique, il a suffi d’établir un seuil de distance, au-delà duquel l’alignement ne pouvait être
considéré comme significatif. Cette distance a été mise en place entre la première position du premier
bloc et la dernière position du dernier bloc. Concernant les P450s, la moyenne des longueurs de
séquences tourne autour de 400 à 500 résidus. Certains P450s sont associés à leur domaine réductase,
comme c’est le cas de P450BM3, conduisant à des séquences plus longues de l’ordre de 700 à 800
résidus. J’ai choisi un « cut off » sur la distance entre 800 et 1200 résidus pour laisser de la marge, en
particulier pour de nouvelles séquences qui associeraient au domaine oxydase un domaine réductase.
Par ailleurs, une deuxième vérification a été implémentée dans le programme : lorsque la taille de
la séquence à aligner est inférieure à la taille totale des séquences contenues dans les blocs. En effet,
l’outil Caliseq réalise l’alignement d’un ensemble de blocs sur une séquence, et il n’a pas été prévu
que cette dernière soit plus petite que l’ensemble des blocs. Cette condition est vraie pour les deux
modes de fonctionnement de Caliseq.
4.3.2.3 Amélioration du premier seuil par calcul d’un Z-score

Comme il a été signalé en section 4.3.2.1, le calcul du seuil de significativité pour le score
d’alignement ne dépendait que du jeu de blocs et d’une statistique Swiss-Prot, et n’exploitait
nullement l’information d’alignement sur les « vraies » séquences de la banque de données. Le calcul
du seuil a donc été repensé conduisant à la mise en place d’un calcul de Z-score. Le Z-score
correspond à une mesure statistique permettant de quantifier la distance (mesurée en écart type) à
laquelle une donnée individuelle se trouve par rapport à la moyenne du jeu de données dont est issue la
donnée à traiter. Le z-score s’obtient par un processus appelé standardisation donnée par la formule
suivante :
score − µ
z=
σ
Score correspond ici au score d’alignement, µ correspond à la moyenne des scores et σ l’écart
type à la moyenne. L’écart type est donné par la formule suivante :
N
∑ (score − µ score )
1
σ= i
2
N i =1
N est le nombre total de séquences que Caliseq a pu aligner et pour lesquelles il a pu fournir un
score (ce nombre dépend des contraintes imposées sur la longueur des séquences à aligner ou de la
longueur total de l’alignement), scorei le score d’alignement pour une séquence i donnée, et µscore la
moyenne des scores d’alignement. Il est à noter que je n’ai pas utilisé la formule de l’écart type sans
biais, dans la mesure où je ne traitais pas un échantillon, mais l’ensemble des séquences contenues
dans la base. Le z-score peut être représenté par une distribution normale comme le montre la Figure
4-3.
Figure 4-3 Diagramme d’écarts-type. La partie bleu foncée correspond à un écart type de la moyenne. Pour une
distribution normale, cela correspond à une quantité de 68,27% de l’ensemble des données, tandis que deux écarts
(bleu foncé et marron) comptent pour 95,45% et trois écarts-types (bleu foncé, marron et vert) compte pour
99,73%. (source : http://en.wikipedia.org/wiki/Standard_score)
L’ensemble des « grandes valeurs » de scores d’alignement, ceux qui sont significatifs, est présent
dans la partie droite de la distribution. Ainsi, le seuil donné par l’utilisateur en paramètre d’entrée
correspondra au seuil d’écart type au dessous duquel le score d’alignement n’est pas significatif. Plus
grand sera ce seuil, plus on sera sélectif et moins il y aura de séquences récupérées.
Pour le calcul du z-score, il était nécessaire de « scanner » une première fois la banque de
séquences afin de pouvoir mesurer la moyenne et l’écart type des scores d’alignement de toutes les
séquences. En raison de la complexité et du nombre important de séquences à traiter dans une seule
banque (pouvant atteindre l’ordre du million de séquences) les séquences présentant les meilleurs
scores d’alignement étaient gardées lors du premier scan. Ainsi, la sélection ne s’opérait plus que sur
un sous-ensemble, allégeant fortement le temps de calcul. Pour réaliser ce sous-ensemble, une
structure en « arbre » a été implémentée dans le programme, retenant les séquences présentant les
meilleurs scores d’alignement avec le jeu de blocs. Ainsi, c’est lors du second passage de Caliseq que
le z-score est calculé pour chaque séquence. Les meilleures séquences sont alors filtrées sur le critère
du seuil de leur z-score : elles correspondent aux séquences identifiées comme P450s selon notre
critère.
4.3.3 Pondération des profils pour les séquences trop identiques
Lorsqu’il y a dans les alignements, aussi bien pour les séquences des structures de référence que
pour le pré-alignement de séquences cibles, des séquences présentant une identité trop importante, ces
dernières peuvent « biaiser » le profil en favorisant l’alignement final vers des séquences proches
d’elles. C’est le cas par exemple de mon set de templates : sur les six structures de référence que j’ai
choisies pour identifier les CSBs puis les positionner sur des séquences de P450s inconnus, trois
d’entre elles sont de mammifère, de la sous famille 2C. Ces trois structures ont des séquences très
proches, si bien qu’elles conduisent à la création d’un profil en leur faveur. Pour éviter de donner un
poids trop important à ces séquences proches et donc pour favoriser les séquences peu représentées, un
système de pondération a été mis en place. Comment cette pondération a-t-elle été implémentée ? La
méthode de pondération résulte d’une discussion collective avec J. Pothier et AL. Abraham
(Université Paris VI) dont le travail conduisait à un problème similaire au mien. Cette méthode est la
suivante : sur un ensemble de N séquences, on calcule pour chaque séquence la fréquence moyenne
d’identité entre cette séquence et les autres de l’ensemble. Le complémentaire de cette fréquence
moyenne permettra alors d’accentuer le poids des séquences « sous représentées » et d’amoindrir celui
des séquences présentant une identité trop importante avec les autres. La formule de la pondération
Weight(i) pour une séquence i d’un alignement de N séquences, peut s’écrire de la manière suivante :
 1 N −1 
Weight (i ) = 1 −  ∑ % id (i, j ) 
 N − 1 j =1; j ≠i 
Dans la formule, j est une autre séquence de l’ensemble, différente de i, et %id(i,j) est le taux
d’identité entre les séquences i et j. Un exemple de calcul de pondération est présenté dans le Tableau
4.1.
Tableau 4.1 Exemple de calcul de pondération sur un ensemble de trois séquences A, B et C. A et B sont très proches tandis que C est
plus éloignée des deux autres séquences.
Taux d’identité entres Séquences Calcul de fmoy fmoy 1– fmoy

les séquences
%id(A,B) = 0,9 A (%id(A,B)+%id(A,C))/2 0,5 0,5
%id(B,C) = 0,1 B (%id(A,B)+%id(B,C))/2 0,5 0,5
%id(A,C) = 0,1 C (%id(A,C)+%id(B,C))/2 0,1 0,9
fmoy est la fréquence moyenne des identités entre les séquences

1-fmoy est le complémentaire de fmoy
4.4 Conclusion
L’outil Caliseq a brièvement été présenté le long des paragraphes de ce chapitre. Une description
plus détaillée du programme figure en Annexe 3. Certains paragraphes de cette annexe pourraient
sembler obscurs à des personnes non habituées au vocabulaire de la programmation, mais j’ai essayé
de rendre cette partie annexe du manuscrit la plus claire possible pour mettre en valeur les différents
mécanismes et principes sous-jacents à l’outil Caliseq, les différents problèmes auxquels j’ai été
confronté lors de son développement, ou lors de son utilisation, et quelles solutions j’ai pu apporter.
Au final, l’outil Caliseq n’est pas qu’une simple amélioration du programme SmartConsAlign : en
plus de réaliser un alignement de jeux de blocs sur une séquence cible, il offre la possibilité d’utiliser
l’information contenue dans les CSBs pour explorer les banques de données de séquences ou les
génomes nouvellement séquencés à la recherche de P450s. Cette nouvelle caractéristique du
programme met en jeu un nombre important de paramètres, ajustables par l’utilisateur, qui influent sur
les filtres de sélections. L’intérêt au-delà d’une simple identification de P450s ou même de création
d’une banque « propre » de séquences de P450s serait à long terme la combinaison de la recherche sur
banque et de la reconstruction tridimensionnelle des P450s non résolus sur le plan structural : Caliseq
offrirait-il un moyen de constituer une banque de sites actifs de P450s ? L’existence d’une telle banque
serait un support précieux pour l’étude des mécanismes de reconnaissance des P450s : à l’aide d’une
chimiothèque, on pourrait tester les différents ligands potentiels dans les sites actifs de ces modèles et
au travers des résultats de docking (molécules reconnues ou non reconnues, en face de l’hème ou sur
Conclusion 173
un site distant) commencer à formuler des hypothèses sur le mode de reconnaissance des différents
P450 de microorganismes ou microsomaux. Avant de pouvoir se lancer dans une telle fiction, il faut
bien sûr estimer la fiabilité de l’outil Caliseq pour identifier les séquences de P450s, et maîtriser
l’alignement des blocs pour l’obtention du modèle le plus fiable. C’est là le sujet du prochain chapitre
qui portera sur la place de nos nouvelles méthodes par rapport à celles déjà existantes. Apportent-elles
oui ou non une réelle innovation, une valeur ajoutée ?
Troisième Partie
Résultats
175
CHAPITRE 5
5 Comparaison des méthodes
« La prospérité découvre nos vices

Et l’adversité nos vertus.»
Francis Bacon (1561– 1626 ap JC)
178 Chapitre 5. Comparaison des méthodes
5.1 Introduction
Les propriétés structurales des P450s, ainsi que les problématiques que ces enzymes soulèvent,
ont été décrites dans les précédents chapitres. La plupart des études conduites sur ces protéines in
silico par des méthodes conventionnelles se sont heurtées à des limites liées à la complexité de ces
P450s. La première d’entre elles est certainement l’obtention d’un modèle, rendu difficile en raison de
la grande variabilité en séquence de cette superfamille. Plusieurs solutions ont été proposées pour
contourner ces limites, en particulier, la construction fiable des modèles de cytochromes P450 qui
passe selon nous par une recherche préalable de motifs structuralement conservés sur l’ensemble des
P450s. L’idée sous-jacente est de nous appuyer sur le repliement extrêmement conservé dans cette
superfamille comme information 3D à utiliser pour la reconstruction de modèles de P450s. Dans le but
de vérifier et de valider cette hypothèse, des expériences de modélisation de P450 à basse identité de
séquences ont été menées selon la méthode développée au laboratoire. Puis, elles ont été comparées à
d’autres méthodes existantes. Ce nouveau chapitre présentera donc les résultats de comparaison des
différentes méthodes, aussi bien sur la détection des informations 3D au sein de cette superfamille, que
leur utilisation pour améliorer l’alignement en séquences. Le chapitre comporte également les
comparaisons de modèles issus des différents alignements. Ce n’est qu’à partir de cette comparaison
entre modèles qu’il sera possible de juger de l’intérêt apporté par l’information 3D (sous forme de
blocs structuraux conservés) pour améliorer les alignements. Cette information 3D semblait en outre
caractéristique des P450s : elle a été utilisée pour la recherche de P450s nouveaux dans des banques de
séquences dans le cadre de la génomique exploratoire. Les résultats de ces recherches correspondent
au dernier point traité dans ce chapitre.
Dans le cadre de ma thèse, j’avais pour premier objectif d’améliorer cette méthodologie
préexistante de reconstruction à l’aide de blocs structuraux conservés, en vue de construire le modèle
d’un CYP d’intérêt : le CYP 3A4. À mon arrivée au laboratoire, aucune structure n’était disponible et
de nombreuses équipes de par le monde tentaient de produire un modèle par homologie. Hélas, la
structure du CYP 3A4 a finalement été publiée sur la PDB au cours de ma première année de thèse.
Cette structure est alors devenue ma structure de référence pour valider la méthodologie que notre
équipe mettait au point. En la validant avec cette structure, peu commune par rapport aux autres CYP,
cette méthode devait pouvoir s’appliquer à n’importe quel P450 inconnu dont l’identité en séquence
avec les structures disponibles est faible.
Les CSBs, une utilisation innovante ? 179
5.2 Les CSBs, une utilisation innovante ?

5.2.1 Une signature 3D pour les protéines à repliement conservé
Partant sur le dogme qu’au cours de l’évolution, la structure d’une protéine est mieux conservée
que sa séquence, nous avons choisi d’utiliser l’information de repliement conservé des P450s pour
améliorer l’alignement de séquences, nécessaire à la reconstruction d’un modèle. Il est en effet
intéressant de se demander pourquoi, en dépit d’une forte variabilité en séquence notamment dans la
région N-terminale (et à degré moindre C-terminale) de l’enzyme, le repliement reste inchangé pour
tous les P450s. Lors des alignements structuraux par les outils bioinformatiques disponibles (cf.
sections 2.4.3 et 2.4.4) certaines régions semblaient mieux conservées que d’autres, ce qui a conduit à
la recherche de blocs structuralement conservés (CSB) à travers toutes les structures disponibles.
L’hypothèse formulée fut la suivante : ces CSBs pouvaient servir d’empreinte ou de signature
caractéristique des P450s, et donc présents sur tous les CYPs, un peu à la manière de la signature
héminique dite « cys-pocket » des P450s.
5.2.2 Obtention des CSBs par l’outil GOK
5.2.2.1 Description des blocs obtenus

La recherche des CSBs a d’abord été opérée par l’outil GOK sur trois jeux historiques de
templates différents (cf. Tableau 3.1 de la page 134). Quel que soit le jeu de templates de départ, les
mêmes blocs ont été trouvés, avec quelques variantes minimes liées au jeu des structures utilisées. Par
ailleurs, parmi les blocs obtenus, certains correspondent à ceux initialement identifiés par P. Jean (Jean
et al., 1997). D’autres ont été ajoutés en raison de leurs bons rms et bien qu’ils soient généralement
assez courts, ils ont été conservés pour permettre d’une part d’obtenir des « points d’ancrage » pour la
reconstruction ultérieure, et d’autre part de couvrir une plus grande surface de la séquence de la
structure à reconstruire10. À noter que l’identification et la longueur des blocs dépendent des valeurs
de maille et de marge, utilisées durant la recherche : plus les valeurs de maille et de marge sont faibles,
plus le bloc observé est pertinent et bien conservé. Un bloc apparaissant avec une maille et une marge
faible est un bloc facilement identifiable par GOK. Les blocs des trois jeux historiques sont indiqués
dans les Tableau 5.1, Tableau 5.2, et Tableau 5.3 respectivement. La position de chaque bloc est
représentée sur une structure de P450 microsomal (la CYP 2C5) en Figure 5-1 et Figure 5-2.
10
Il est rappelé que les contraintes spatiales pour la construction du modèle sont calculées prioritairement au
niveau de ces zones.
Tableau 5.1 Position des 22 blocs structuraux obtenus avec GOK pour le jeu de 6 templates (d’après la thèse de N. Loiseau, 2002). En
première colonne, la nomenclature de P. Jean, basée sur l’alignement structural de 3 structures bactériennes, et que nous avons suivie dans un
souci de continuité. Dans la deuxième colonne, la nomenclature de Poulos, utilisée depuis 1985, basée sur la structure du P450cam.
Structures EryF BM3 CAM Nor 2C5 Terp maille

CSB taille mp–rms
Secondaires 1OXA 2HPD 3CPP 1ROM 1DT6 3CPT marge
1* A 16 – 23 23 – 32 38 – 45 20 – 27 50 – 57 27 – 34 08 0,37 15/2
1** ß1–1 28 – 35 38 – 45 52 – 59 30 – 37 63 – 70 39 – 46 08 1,36 20/3
1 ß1–2 + B 38 – 51 48 – 61 61 – 74 41 – 54 73 – 86 50 – 63 14 0,44 15/2
2A* B' 79 – 84 72 – 77 89 – 94 73 – 78 99 – 104 81 – 86 06 0,40 15/2
2A** Boucle B’ - C 89 – 95 85 – 91 99 – 105 85 – 91 111 – 117 101 – 107 07 0,81 30/2
2A C 96 – 109 94 – 107 106 – 119 92 – 105 118 – 131 108 – 121 14 1,53 15/2
2B D 114 – 132 115 – 133 127 – 145 113 – 131 141 – 159 129 – 147 19 1,00 15/3
3 E 138 – 160 139 – 161 148 – 170 138 – 160 164 – 186 151 – 173 23 3,15 20/2
4 F 161 – 175 172 – 186 171 – 185 161 – 175 192 – 206 174 – 188 15 1,94 20/3
5 G 185 – 205 205 – 225 193 – 213 184 – 204 233 – 253 212 – 232 21 0,84 10/2
6 H 210 – 217 232 – 239 218 – 225 209 – 216 262 – 269 237 – 244 08 0,08 15/3
7A I 227 – 259 250 – 282 234 – 266 225 – 257 280 – 312 253 – 285 33 1,23 15/3
7B J 260 – 269 283 – 292 267 – 276 258 – 267 313 – 322 286 – 295 10 0,13 15/1
8 K 272 – 288 312 – 328 279 – 295 270 – 286 343 – 359 298 – 314 17 1,06 15/3
9 ß1–4 + ß2–1 292 – 303 332 – 343 298 – 309 291 – 302 364 – 375 318 – 329 12 0,96 20/2
ß2–2 +
10 304 – 326 345 – 367 310 – 332 303 – 325 376 – 398 330 – 352 23 1,85 15/1
ß1–3 + K’
11 Meander 327 – 334 369 – 376 333 – 340 326 – 333 399 – 406 353 – 360 08 0,40 20/2
12A Cys Pocket 341 – 347 390 – 396 347 – 353 342 – 348 422 – 428 367 – 373 07 0,30 20/3
12B L 348 – 372 397 – 421 354 – 378 349 – 373 429 – 453 374 – 398 25 0,61 15/2
13A ß3–3 374 – 378 422 – 426 381 – 385 375 – 379 454 – 458 400 – 404 05 1,17 20/3
13B ß4–1 383 – 391 429 – 437 387 – 395 384 – 392 464 – 472 406 – 414 09 4,86 25/3
13 ß4–2 + ß3–2 394 – 401 439 – 446 397 – 404 394 – 401 474 – 481 416 – 423 08 1,24 30/2
Note 1 : Les nouveaux blocs intermédiaires identifiés après P. Jean sont notés par une lettre complémentaire (A ou B)
après le numéro de blocs, et parfois par un asterisque (* ou **) lorsqu’une nouvelle subdivision est apparue.
Note 2 : Certains blocs identifiés par des structures secondaires peuvent en réalité englober qu’une partie de la structure,
ou parfois être plus large.
Tableau 5.2 Position des 27 blocs structuraux obtenus avec GOK pour le jeu des 4 templates proposés par M. Cottevieille (d’après le
rapport de DEA de M. Cottevieille, 2003). Pour les nomenclatures, voir la légende du Tableau 5.1. M. Cottevieille identifie cinq nouveaux
blocs par rapport à N. Loiseau.
Structures EryF BM3 51 2C5 maille

CSB Secondaires taille mp–rms
1OXA 2HPD 1E9X 1DT6 marge
s
1* A 14 – 28 23 – 37 24 – 38 48 – 62 15 0,70 20/2
1** ß1–1 29 – 35 39 – 45 40 – 46 64 – 70 07 0,89 10/3
1 ß1–2 + B 36 – 51 46 – 61 47 – 62 71 – 86 16 1,35 15/2
2A* B' 80 – 84 73 – 77 77 – 81 100 – 104 05 0,31 10/3
2A** Boucle B' – C 92 – 94 88 – 90 90 – 92 114 – 116 03 – 20/3
2A C 97 – 113 95 – 111 93 – 109 119 – 135 17 2,57 30/2
2B D 114 – 132 115 – 133 110 – 128 141 – 159 19 1,36 15/2
2C Boucle D – E 133 – 135 134 – 136 129 – 131 160 – 162 03 – 100/1
3 E 137 – 157 138 – 158 133 – 153 163 – 183 21 3,04 20/2
4 F 166 – 175 172 – 181 164 – 173 196 –205 10 0,25 –
5 G 182 – 205 202 – 225 191 – 214 230 – 253 24 0,51 10/1
6 H 210 – 217 232 – 239 224 – 231 262 – 269 08 0,07 10/2
7* Boucle H – I 219 – 223 241 – 245 232 – 236 270 – 274 05 2,58 30/2
7A I 226 – 259 249 – 282 241 – 274 279 – 312 34 4,57 15/3
7B J 260 – 269 283 – 292 275 – 284 313 – 322 10 0,12 10/1
7B* J(fin) – 293 – 298 285 – 290 323 – 328 06 0,15 40/1
7C J' – 301– 311 294 – 304 332 – 342 11 7,37 60/1
8 K 272 – 290 312 – 330 305 – 323 343 – 361 19 1,12 15/2
9 ß1–4 + ß2–1 292 – 303 332 – 343 325 – 336 364 – 375 12 1,44 15/2
10A ß2–2 304 – 306 345 – 347 337 – 339 376 – 378 03 – 15/2
10B ß1–3 + K’ 307 – 326 348 – 367 340 – 359 379 – 398 20 2,02 15/1
11 Meander 327 – 335 369 – 377 360 – 368 399 – 407 09 0,85 20/2
12A Cys Pocket 337 – 345 386 – 394 380 – 388 418 – 426 09 3,48 30/2
12B L 347 – 372 396 – 421 390 – 415 428 – 453 26 0,48 20/2
13A ß3–3 374 – 380 422 – 428 416 – 422 454 – 460 07 1,21 20/2
13B ß4–1 383 – 389 429 – 435 425 – 431 464 – 470 07 1,85 25/3
13 ß4–2 + ß3–2 391 – 401 437 – 447 433 – 443 473 – 483 11 2,97 30/2
Note : Cinq nouveaux blocs ont été identifiés par rapport à ceux identifiés par N. Loiseau : il s’agit des CSB 2C, 7*,
7B*, 7C, et celui issu de la subdivision du CSB 10 en deux.
Tableau 5.3 Positions des 24 blocs structuraux obtenus avec GOK pour le jeu de templates proposé dans ce travail de thèse. Pour les
nomenclatures, voir la légende du Tableau 5.1. Les blocs identifiés sont un compromis entre ceux identifiés par N. Loiseau et ceux identifiés
par M. Cottevieille.
Structures eryF BM3 2C8 2C9 2C5 154C1 maille

CSB taille mp-rms
Secondaires 1OXA 2HPD 1PQ2 1OG5 1NR6 1GWI marge
0 A’ - 8 – 19 33 - 44 33 - 44 33 - 44 - 12 0,33 10/3
1* A 14 - 25 23 – 34 48 - 59 48 - 59 48 - 59 17 - 28 12 0,21 20/2
1** ß1-1 28 - 34 38 – 44 63 - 69 63 - 69 63 - 69 31 - 37 07 0,45 10/3
1 ß1-2 + B 35 - 52 45 - 62 70 - 87 70 - 87 70 - 87 39 - 56 18 1,78 15/3
2A* B' 78 - 85 71 - 78 99 - 106 99 - 106 99 - 106 79 - 86 08 1,75 20/2
2A** B' – C 89 - 93 85 - 89 111 - 115 111 - 115 111 - 115 91 - 95 05 0,29 10/3
2A C 96 - 113 94 - 111 118 - 135 118 - 135 118 - 135 98 - 115 18 2,05 20/2
2B D 114 - 132 115 - 133 141 - 159 141 - 159 141 - 159 116 - 134 19 1,02 10/3
3 E 137 - 157 138 - 158 163 - 183 163 - 183 163 - 183 140 - 160 21 2,80 15/3
4 F 160 - 175 171 - 186 191 - 206 191 - 206 191 -206 163 - 178 16 1,49 20/2
5 G 182 - 205 202 - 225 230 - 253 230 - 253 230 - 253 184 - 207 27 0,65 10/2
6 H 210 - 216 232 - 238 262 - 268 262 - 268 262 - 268 212 - 218 07 0,03 10/2
7A I 227 - 259 250 - 282 283 - 315 283 - 315 280 - 312 228 - 260 33 0,87 10/3
7B J 260 - 268 283 - 291 316 - 324 316 - 324 313 - 321 261 -269 09 0,07 10/1
7C J' - 304 - 309 338 - 343 338 - 343 335 - 340 - 06 0,21 10/1
8 K 274 - 290 314 - 330 348 - 364 348 - 364 345 - 361 275 - 191 17 0,92 10/3
9 ß1-4 + ß2-1 292 - 303 332 - 343 367 - 378 367 - 378 364 - 375 294 - 305 12 1,04 15/2
ß2-2 +
10 304 - 327 345 - 368 379 - 402 379 - 402 376 - 399 306 - 329 24 3,81 15/3
ß1-3 + K’
11 Meander 328 - 335 370 - 377 403 - 410 403 - 410 400 - 407 331 - 338 08 0,31 20/2
12A Cys Pocket 339 - 346 388 - 395 423 - 130 423 - 430 420 - 427 - 08 1,47 20/3
12B L + turn 347 - 372 396 - 421 431 - 456 431 - 456 428 - 453 351 - 376 26 0,32 10/3
13A ß3-3 374 - 380 422 - 428 457 - 463 457 - 463 454 - 460 378 - 384 07 1,14 15/3
13B ß4-1 381 - 389 - 465 - 473 465 - 473 462 - 470 385 - 393 09 1,91 20/3
13 ß4-2 + ß3-2 390 - 401 436 - 447 475 - 486 475 - 486 472 - 483 394 - 405 12 3,21 30/2
Note 1: Un nouveau bloc a été identifié (CSB0) par rapport aux deux autres jeux de blocs. Les blocs identifiés sont plus
proches en nombre et en position de ceux de N. Loiseau (un seul bloc pour le CSB 10, pas de CSB 2C ni de
CSB 7* ou 7B*). En revanche, comme pour le jeu de M. Cottevieille, le CSB 7C a été ici aussi identifié.
Note 2 : Initalement, la structure du CYP 2B4 (1po5) était présente dans ce jeu. En raison de sa conformation ouverte,
elle empêchait la détection de blocs sous GOK : elle a donc été retirée du jeu
Figure 5-1 Représentation des CSB0 à CSB7 sur la structure du CYP 2C5 (1nr6). La protéine est en
représentation « cartoon » en gris et l’hème figure en orange. Les CSB sont représentés en vert. Les structures
secondaires correspondantes sont également annotées. Ceux-ci correspondent à des blocs postérieurs à la
nomenclature de P. Jean. Les images ont été générées par PYMOL
Figure 5-2 Représentation des CSB8 à CSB13 sur la structure du CYP 2C5 (1nr6). Pour les légendes, se
reporter à ceux de la Figure 5-1.
Une moyenne de 24 blocs (CSBs) a été identifiée sur les trois jeux de templates. Ces CSBs ont été
initialement numérotés de 1 à 13 selon la nomenclature de P. Jean (Jean et al., 1997) dans la première
reconstruction d’un P450 utilisant cette méthode. Cette nomenclature a été conservée avec de légères
variations lorsque certains blocs étaient subdivisés en plusieurs fragments (par exemple CSB1, CSB2
ou encore CSB7), ou lorsqu’un nouveau bloc fut identifié. Cette évolution des blocs a été nécessaire
dès que les premières structures de P450 microsomaux ont été publiées. Le jeu initial de P. Jean avec
13 blocs historiquement identifiés s’appuyait en effet sur l’alignement de 3 structures bactériennes.
Ainsi, le bloc 0 (noté CSB0 sur la Figure 5-1) n’est trouvé que dans mon jeu de templates qui
comporte le plus de structures issues de mammifères. Ce bloc est relativement court et correspond à
une partie d’hélice placée en amont de l’hélice A, située au niveau de l’hélice d’ancrage à la
membrane chez les P450s microsomaux. Une particularité du CYP 154C1, d’origine bactérienne, peut
être soulignée : 1gwi présente un brin β à cette position, qui n’a été observé que sur cette structure X
de P450s. Cette structure confirme la règle observée pour les autres structures bactériennes : le bloc 0
ne pouvait pas être identifié sur cette structure. En revanche, il est surprenant d’identifier ce bloc dans
la structure du P450BM3 qui est d’origine bactérienne. Dans la littérature, rien ne semble pourtant
indiquer que ce P450 soit ancré à la membrane. On sait juste qu’il est le seul CYP naturel présentant
sur la même chaîne polypeptidique la partie hémoprotéique et la partie réductase, ce qui fait de lui un
P450 proche des P450s microsomaux.
Le bloc 1* également court, est constitué de la première partie de l’hélice A en N-terminal de la

protéine. Ce bloc est identifié dans les 3 jeux de templates, sur toutes les structures. Sa taille varie
selon le jeu, de 8, pour le jeu de N. Loiseau à 15 résidus pour le jeu de M. Cotevieille.
Le bloc 1** contient le premier brin du feuillet β1. Il fait partie des blocs simples à identifier sous
GOK avec des valeurs faibles de mp-rms et de taille de maille.
Le bloc 1 contient quant à lui deux SSE : le deuxième brin du feuillet β1 (β1-2), l’hélice B ainsi que
la boucle qui les lie. C’est ici un exemple concret qui montre que les blocs ne sont pas uniquement
limités aux SSEs isolés.
Les blocs 2A* et 2A** appartiennent à la longue boucle B–C décrite comme une région
importante pour la reconnaissance du substrat, formant une face du site actif très mobile. Le bloc 2A*
correspond à la micro-hélice B’. Sachant que cette hélice est située dans un zone soumise à des
changements conformationnels de la protéine (cf. section 1.4.4.2) et de surcroît, est connue pour être
labile chez les CYPs de mammifères –on la trouve aussi bien structurée que déstructurée–, on peut se
demander si ce bloc est pertinent ou non. Il semble bien conservé localement sur les différents
templates, en dépit d’une grande variabilité aussi bien en séquence qu’en organisation spatiale (boucle
B-C). À noter que le mp-rms de ce bloc est plutôt bas dans les jeux de N. Loiseau et M. Cottevieille
(~0.5 Å), contrairement à celui de mon jeu de templates. Sachant que dans mon jeu, il y a davantage
de cristaux de P450s de mammifère, un mp-rms supérieur (~1,75 Å) pour ce bloc n’est pas surprenant :
dans la structure du CYP 2C5, l’hélice B’ disparaît presque en totalité pour laisser la place à une
boucle présentant une allure d’hélice. Le bloc 2A** correspond à une portion de boucle B’–C. Celle-ci
est située à proximité de l’hème et contient des acides aminés impliqués dans la reconnaissance du
substrat (SRS-1, voir Figure 1-18 à la page 44). La boucle constituant le bloc 2A** correspond en
quelque sorte au levier qui permet à la boucle B–C sa grande mobilité. Étant donné sa petite taille, et
son rôle important, il est assez surprenant de l’identifier en tant que bloc : on s’attend en effet à une
boucle très variable pour rendre compte de la diversité des substrats reconnus. Pourtant, le repliement
dans l’espace des (α,τ) décrit cette région comme conservée.
Les blocs 2A et 2B sont contigus quels que soient les différents jeux de templates. La description
en SSEs de cette zone correspond aux trois hélices, C, C’ et D (dans cet ordre dans la séquence).
L’hélice C’ a déjà été observée par Hasemann (Hasemann et al., 1995) qui l’a décrite comme
désordonnée. Lors de l’identification des blocs par GOK, le logiciel décompose cette région en deux
blocs seulement, coïncidant au milieu de cette hélice C’. L’angle formé au niveau de C’ entre les
hélices C et D est variable. Chacune des parties de part et d’autre de C’ (hélice C et hélice D) est
localement bien conservée.
Le bloc 2C n’est qu’observé dans le jeu de M. Cottevieille. Il est extrêmement court (3 résidus) et
correspond à un morceau de la boucle D–E. Étant donné les paramètres de maille et de marge (100/1)
et un mp-rms non renseigné, ce bloc n’est probablement pas significatif.
Le bloc 3 est constitué de l’hélice E. L’hélice E’, trop courte et non adjacente à l’hélice E, n’a pas
pu être identifiée comme région structuralement conservée.
Le bloc 4 comprend une partie de l’hélice F. Cette hélice est de longueur variable sur tous les
templates utilisés. Dans la littérature, les hélices F et G formant le toit du site actif sont spécifiques
selon le P450 observé : elles sont à la fois de longueur variable – plus longues chez les bactériens que
chez les mammifères par exemple – et également de structuration variable (présence ou non de micro-
hélices dans la boucle F–G). L’identification de ce bloc fut par conséquent délicate : la plus petite
hélice (correspondant à une structure hélicoïdale dans l’espace des (α,τ)) pouvait se superposer à
plusieurs positions différentes sur les longues hélices F (également des structures hélicoïdale dans
l’espace des (α,τ)). À noter qu’en plus de la longueur variable de l’hélice, ce bloc est également très
mal conservé en séquence. M. Cottevieille n’a pas été en mesure de trouver la même longueur pour ce
bloc que N. Loiseau et moi-même, montrant ainsi la difficulté à obtenir ce bloc. Hasemann a
également rencontré des difficultés pour l’alignement structural de cette région et propose deux
alignements possibles selon qu’il considère la conservation structurale ou la conservation séquentielle.
Dans le cas du bloc 5 correspondant à l’hélice G, Hasemann a rencontré des problèmes identiques
au bloc précédent. A l’inverse, le logiciel GOK a pu identifier aisément une solution unique avec un
mp-rms très bas quel que soit le jeu de templates (0.84 Å pour le plus élevé chez N. Loiseau). Ce bloc
est par ailleurs relativement long par rapport aux autres blocs, il est l’un des trois plus longs dans tous
les jeux de templates. Cette observation est assez surprenante lorsque l’on sait que les hélices F et G
sont justement des hélices de longueur variable, relativement courtes chez les mammifères (ex : CYP
3A4)…
Le bloc 6, formé par l’hélice H est également identifié facilement par GOK. Il semblerait
d’ailleurs, au vu de tous les templates que l’ensemble des blocs 5 + 6 soit bien conservé spatialement :
la boucle qui les relie en revanche est très variable selon les structures, et est responsable notamment
de la scission du bloc en 2 parties : bloc 5 et bloc 6. Cette observation renforce l’idée d’utiliser les
blocs comme armature pour le P450 à reconstruire et de laisser les régions inter-blocs se reconstruire
sans contrainte apparente.
Le bloc 7 est sans nul doute le plus long de tous : il est constitué des hélices I (bloc 7A), J (bloc
7B) et une partie de l’hélice J’ (bloc 7C), observé chez les P450s de mammifères. Suivant les
paramètres de recherche, il peut être obtenu en une, deux, trois ou cinq parties. Les parties
correspondant à l’hélice J’ (bloc 7C), n’ont été observées que dans le jeu de templates de
M. Cottevieille et le mien, plus riche en P450s de mammifère, et il n’est pas identifié dans le jeu de
N. Loiseau très dominé par les P450s bactériens. Le bloc 7C qui n’est d’ailleurs pas présent dans
toutes les structures (P450eryF et CYP 154C1 en sont dépourvus) montre un mp-rms élevé de 7,4 Å,
laissant supposer que l’hélice J’ est certainement très fluctuante. De même, le bloc 7* correspondant à
la boucle H–I n’est présent que dans le jeu de M. Cottevieille. Il semble trop court pour être retenu
dans les blocs structuralement bien conservés de la famille.
Les quatre blocs suivants, du bloc 8 au bloc 11, constituent un ensemble structural continu et bien
conservé : les blocs y sont quasiment contigus. En fait, cet ensemble est obtenu en plusieurs parties en
raison des insertions ou délétions de quelques résidus dans un des templates, mais les quatre blocs sont
superposables simultanément. Il est à noter que seul le set de M. Cottevieille dispose de cinq blocs au
lieu de quatre : le bloc 10 est séparé en deux dissociant le brin β2-2 du reste formé par l’hélice K’ et β1-3,
alors que ces structures sont trouvées dans un seul bloc pour le set de N. Loiseau et le mien.
Comme pour les blocs 2A et 2B, le bloc 12, correspondant à la Cys-Pocket et l’hélice L, est
constitué de deux parties jointives et « articulées » autour d’un acide aminé voisin de la cystéine liant
l’hème.
Le dernier bloc, bloc 13, est constitué principalement de brins β relié par des boucles. De façon
moins évidente que pour la boucle B-C, cette région formée par les brins β intervient généralement
dans l’obstruction du site actif. Bien que structuralement conservée, il est à noter que cette région est
extrêmement variable au niveau de sa séquence primaire.
5.2.2.2 Apport des structures de mammifères pour les CSBs par comparaison aux
structures bactériennes
Au fil des années dans la PDB, les structures bactériennes ont été complétées par des structures de
mammifères. Ainsi, pour mon jeu de blocs, il y a eu autant de structures bactériennes que de structures
de mammifères – uniquement de CYPs de la famille 2C rappelons-le – ayant servi comme templates.
Cet apport en structures microsomales a entraîné de légères variations dans la détermination et la
fiabilité des blocs (nombre de blocs, tailles des blocs, mp-rms de chaque bloc etc.). À première vue,
les structures microsomales présentent les mêmes éléments de structure secondaire que ceux présents
dans les P450s bactériens. Toutefois, une divergence visible de ces éléments avec ceux de l’enzyme
microbienne la plus proche (P450BM3) est observée. La plus grande différence entre ces structures avec
la structure microbienne est dans le positionnement relatif du feuillet β N-terminal vis-à-vis des
hélices de la partie centrale (cf. Figure 1-15 page 41) : un décalage spatial est constaté. On observe
également une différence au niveau des longueurs des brins β entre les structures de mammifères et les
structures bactériennes. Pourtant, pris individuellement, chacun des éléments structuraux se superpose
relativement bien.
Dans le jeu de NL, la structure du P450 bactérien qui se superpose le mieux à l’unique structure
de mammifère présente dans ce jeu (CYP 2C5) est celle du P450Terp. Les différences les plus
importantes entre le CYP 2C5 et le P450Terp se situent d’une part au niveau du positionnement des
hélices F et G qui couvrent le site actif et déterminent son accès, et d’autre part au niveau des boucles
entre les SSEs.
Dans mon jeu, c’est la structure du CYP 154C1 qui est la plus proche de celle du CYP 2C5. Ici
aussi, de faibles différences sont remarquées, notamment au niveau des hélices F’ et G’ uniquement
observables chez la structure du lapin (CYP 2C5), au niveau de l’hélice F plus courte chez le CYP
microsomal, mais également au niveau de certaines boucles (par exemple B–C), plus longue chez le
CYP 154C. À noter que le CYP 2C5 montre parfois au niveau de ces boucles des débuts de
structuration en hélice α, là où la structure bactérienne n’en montre pas. Cette caractéristique est
commune aux trois structures bactériennes par opposition aux trois structures microsomales. C’est
d’ailleurs une des raisons qui me pousse à considérer le bloc 4 comme un bloc assez peu significatif
(ou « flou ») : dans ce bloc, la courte hélice F de la structure microsomale a été identifiée à différentes
positions (plusieurs choix de superposition proposés par GOK) sur les hélices plus longues des
structures bactériennes, et il a fallu choisir visuellement et sans critère spécifique, la meilleure
superposition pour définir le bloc.
En résumé, l’enrichissement en structures microsomales a entraîné principalement l’apparition de

nouveaux blocs par rapport à ceux initialement identifiés : ceux-ci pouvant être nouveaux (comme les
blocs 0 et 7C) ou correspondant à des sous-divisions de blocs déjà existants (bloc 10 devenant 10A et
10B dans le jeu de M. Cottevieille). Ces structures apportent également des changements dans la
détection et la fiabilité des blocs initialement identifiés. Finalement, « l’ossature » en elle-même des
P450s demeure globalement inchangée dans la mesure où un même nombre de blocs (de 22 à 27) est
identifié dans les trois jeux, d’autant plus qu’il s’agit des mêmes blocs (positionnement conservé)
observés dans les trois jeux.
5.2.2.3 Position des CSBs par rapport aux SRS

Les six SRS définis par Gotoh (Gotoh et al., 1992) (cf. Figure 1-18 page 44) sont présents dans
les blocs identifiés. Seuls les SRS-2, SRS-3, SRS-4 situés respectivement sur les hélices F, G et I sont
présents dans leur intégralité dans les blocs correspondants (respectivement 4, 5 et 7). Même si les
SRS-1 et SRS-6 ne sont pas présents en intégralité dans les blocs 2 et 13 respectivement, leurs résidus
de liaison au substrat (identifiés par Gotoh sur le P450cam) sont en revanche présents dans ces blocs.
Dans les structures microsomales (CYP 2C5, CYP 2C8 et CYP 2C9), le SRS-5 qui est trouvé dans la
partie polypeptidique entre l’hélice K et le feuillet β1-4 (entre les blocs 8 et 9) formant le côté opposé
du site d’interaction du substrat avec l’hélice I, n’est présent qu’en partie dans les blocs. Ces
positionnements des SRS dans les blocs, pour les trois jeux, confortent l’idée d’information
« pertinente » présente dans les blocs.
Il est surprenant toutefois qu’un bloc « flou » comme le bloc 4, puisse contenir un SRS dans son
intégralité. En revanche, le fait que le SRS-5 soit plutôt situé dans une région inter-bloc n’est pas
surprenant : il correspond à une région entre l’hélice K et le feuillet β1-4 qui varie significativement
d’une structure à l’autre, de bactérienne à microsomale (ex : entre les CYP 2C et le P450BM3, on relève
une différence de 3,3 Å de rmsd sur les Cα dans cette région).
Lorsqu’on compare en fait les SSEs (hélice F, G, et le feuillet C-terminal), qui portent les autres
SRS (SRS-2, SRS-3 et SRS-6 respectivement), il s’avère qu’une même divergence (structurale) est
également observée sur l’ensemble des structures, de même ordre de grandeur (par rapport au P450BM3
par exemple). Ces différences aux niveaux de ces SSEs bordant la poche du site actif, pourraient être
une cause de l’orientation et le positionnement du substrat dans le site actif et par conséquent la
sélectivité de l’enzyme pour les différents substrats.
5.2.2.4 Alignement des blocs entre les trois jeux de templates

Dans chacun des jeux de templates, les valeurs de déviation multiple mp-rms et s-rms varient
parfois significativement. Il serait donc intéressant de savoir si une règle peut être dégagée en
comparant les mp-rms des trois jeux : peut être serait-il possible de dégager des blocs « flous » et des
blocs « nets ».
Malgré le fait qu’il comporte moins de structures templates, c’est pourtant le jeu de M. Cotevieille
qui montre les valeurs les plus hautes. Il comporte des valeurs élevées pour les blocs 1, 2A, 2B, 3, 7*,
7C, 8, 9, 10, 12 et tous ceux de la série 13. Ces fortes valeurs résultent également du besoin de
rechercher des blocs plus longs et de nouveaux blocs en forçant les paramètres de maille et de marge,
pour couvrir la fraction maximale de la séquence en bloc. Ce jeu est constitué de quatre structures dont
trois bactériennes et une microsomale. Il se trouve que ces quatre structures sont plutôt divergentes,
conduisant à des détections de blocs par GOK à valeur élevée de mp-rms. En réalité, M. Cottevieille
n’est pas la seule à avoir identifié des blocs à valeur élevée de mp-rms : pris indépendamment, chaque
jeu en présente au moins au niveau d’un bloc.
Il est possible toutefois de classer ces valeurs élevées de mp-rms d’un jeu à l’autre. Ainsi, dans
mon jeu de templates, la région N-terminale est marqué par de hautes valeurs de mp-rms (blocs 1 et
2A*, structure β1-2 et hélice B, cf. Tableau 5.3). Une explication a déjà été fournie pour ce cas, où
l’hélice B’ est très « fluide » dans les structures microsomales. Dans le jeu de NL, au niveau de cette
région, seul le bloc 1** (brin β1-1) porte une forte valeur de mp-rms. Dans le jeu de M. Cottevieille,
pourtant marqué par de fortes valeurs de mp-rms, on trouve des tendances inversées : par exemple
dans les blocs 4 et 5 (hélices F et G) les valeurs de mp-rms (~0.5 Å) sont trouvées plus basses que
dans les deux autres jeux (~1,00 Å). Enfin, la série des blocs 13 présente des valeurs élevées de mp-
rms dans les trois jeux, le bloc le plus « flou » dans le jeu de N. Loiseau est trouvé au niveau de la
structure β4-1 tandis que dans les deux autres jeux, il est situé au niveau des structures β4-2 et β3-2.
Certains blocs à valeur élevée de mp-rms, sont trouvés en revanche en accord sur l’ensemble des
trois jeux : c’est le cas de l’hélice E (bloc 3) par exemple, mais également du bloc 10, comprenant 3
SSEs (brin β2-2, brin β1-3, K’). En dépit des valeurs élevées de mp-rms, ces blocs peuvent toutefois être
considérés comme des blocs « fiables » (ou « nets ») : les valeurs élevées de mp-rms peuvent être
expliquées par la divergence d’un seul template dans le jeu par rapport aux autres, qui se retrouve dans
les trois jeux, expliquant de ce fait une valeur élevée de mp-rms similaire pour les trois jeux de blocs.
Globalement, en dépit des différences observées sur les trois jeux, on peut établir une certaine
tendance pour des régions plus variables que d’autres (notion de blocs « flous ») en se basant sur les
constats précédemment décrits (utilisation des valeurs de mp-rms inter jeu) : la variabilité en séquence
au niveau de la région C-terminale est donc accentuée par une variabilité structurale, les blocs situés
dans cette partie étant marqués par des valeurs élevées de mp-rms, exprimées à des positions
différentes dans les blocs de la série 13. Pour ces mêmes raisons (variabilité entre les jeux des valeurs
élevées de mp-rms), les blocs du feuillet β en N-terminal peuvent être également considérés comme
des blocs « flous », très mal conservés structuralement (blocs de la série 1). Ces tendances ne sont pas
liées à l’apport des nouvelles structures de P450s microsomales, elles étaient déjà présentes dans les
structures bactériennes. Enfin, on peut également inclure parmi ces blocs « flous » ceux correspondant
à la boucle B–C comprenant l’hélice B’, et ceux comportant les hélices F et G. Le caractère « flou » de
ces blocs 4 et 5 est beaucoup plus marqué dans les alignements comportant plus de structures
microsomales.
Toutes ces remarques sur un plan structural, se retrouvent également observées dans l’alignement
réalisé par Caliseq, des blocs des trois différents jeux de templates sur la séquence du CYP 3A4,
comme présenté sur la Figure 5-3. Ainsi, les blocs de la série 1 (CSB1*, CSB1**, et CSB1) ne se
trouvent pas à la même position sur les trois différents jeux de blocs. Il en est de même pour les blocs
de la série 2 (CSB2A*, CSB2A** et CSB2A) et de la série 13 (CSB13A, CSB13B, CSB13). En
revanche, ni le CSB4 ni le CSB5 ne semblent poser de problème de positionnement dans les trois jeux,
ce qui est assez déroutant, compte tenu de ce qui a été dit précédemment. Cela dit, comme il sera vu
plus tard, le positionnement de ces blocs à des endroits similaires sur d’autres séquences cibles n’est
pas toujours observé.
CYP3A4 A 1 MALIPDLAME TWLLLAVSLV LLYLYGTHSH GLFKKLGIPG PTPLPFLGNI LSYHKGFCMF DMECHKKYGK VWGFYDGQQP 80

CYP3A4 B 1 MALIPDLAME TWLLLAVSLV LLYLYGTHSH GLFKKLGIPG PTPLPFLGNI LSYHKGFCMF DMECHKKYGK VWGFYDGQQP 80
CYP3A4 C 1 MALIPDLAME TWLLLAVSLV LLYLYGTHSH GLFKKLGIPG PTPLPFLGNI LSYHKGFCMF DMECHKKYGK VWGFYDGQQP 80
CSB0 CSB1* CSB1**
CYP3A4 A 81 VLAITDPDMI KTVLVKECYS VFTNRRPFGP VGFMKSAISI AEDEEWKRLR SLLSPTFTSG KLKEMVPIIA QYGDVLVRNL 160
CYP3A4 B 81 VLAITDPDMI KTVLVKECYS VFTNRRPFGP VGFMKSAISI AEDEEWKRLR SLLSPTFTSG KLKEMVPIIA QYGDVLVRNL 160
CYP3A4 C 81 VLAITDPDMI KTVLVKECYS VFTNRRPFGP VGFMKSAISI AEDEEWKRLR SLLSPTFTSG KLKEMVPIIA QYGDVLVRNL 160
CSB1 CSB2A* CSB2A** CSB2A CSB2B
CYP3A4 A 161 RREAETGKPV TLKDVFGAYS MDVITSTSFG VNIDSLNNPQ DPFVENTKKL LRFDFLDPFF LSITVFPFLI PILEVLNICV 240
CYP3A4 B 161 RREAETGKPV TLKDVFGAYS MDVITSTSFG VNIDSLNNPQ DPFVENTKKL LRFDFLDPFF LSITVFPFLI PILEVLNICV 240
CYP3A4 C 161 RREAETGKPV TLKDVFGAYS MDVITSTSFG VNIDSLNNPQ DPFVENTKKL LRFDFLDPFF LSITVFPFLI PILEVLNICV 240
CSB3 CSB4
CYP3A4 A 241 FPREVTNFLR KSVKRMKESR LEDTQKHRVD FLQLMIDSQN SKETESHKAL SDLELVAQSI IFIFAGYETT SSVLSFIMYE 320
CYP3A4 B 241 FPREVTNFLR KSVKRMKESR LEDTQKHRVD FLQLMIDSQN SKETESHKAL SDLELVAQSI IFIFAGYETT SSVLSFIMYE 320
CYP3A4 C 241 FPREVTNFLR KSVKRMKESR LEDTQKHRVD FLQLMIDSQN SKETESHKAL SDLELVAQSI IFIFAGYETT SSVLSFIMYE 320
CSB5 CSB6 CSB7A
CYP3A4 A 321 LATHPDVQQK LQEEIDAVLP NKAPPTYDTV LQMEYLDMVV NETLRLFPIA MRLERVCKKD VEINGMFIPK GWVVMIPSYA 400
CYP3A4 B 321 LATHPDVQQK LQEEIDAVLP NKAPPTYDTV LQMEYLDMVV NETLRLFPIA MRLERVCKKD VEINGMFIPK GWVVMIPSYA 400
CYP3A4 C 321 LATHPDVQQK LQEEIDAVLP NKAPPTYDTV LQMEYLDMVV NETLRLFPIA MRLERVCKKD VEINGMFIPK GWVVMIPSYA 400
CSB7B CSB7 CSB8 CSB9 CSB10
CYP3A4 A 401 LHRDPKYWTE PEKFLPERFS KKNKDNIDPY IYTPFGSGPR NCIGMRFALM NMKLALIRVL QNFSFKPCKE TQIPLKLSLG 480
CYP3A4 B 401 LHRDPKYWTE PEKFLPERFS KKNKDNIDPY IYTPFGSGPR NCIGMRFALM NMKLALIRVL QNFSFKPCKE TQIPLKLSLG 480
CYP3A4 C 401 LHRDPKYWTE PEKFLPERFS KKNKDNIDPY IYTPFGSGPR NCIGMRFALM NMKLALIRVL QNFSFKPCKE TQIPLKLSLG 480
CSB11 CSB12A CSB12B CSB13A CSB13B
CYP3A4 A 481 GLLQPEKPVV LKVESRDGTV SGA 503

CYP3A4 B 481 GLLQPEKPVV LKVESRDGTV SGA 503
CYP3A4 C 481 GLLQPEKPVV LKVESRDGTV SGA 503
CSB13
Figure 5-3 Comparaison du positionnement des blocs pour les trois différents jeux de templates sur la
séquence cible du CYP 3A4. Les couleurs utilisées pour délimiter les blocs sont les mêmes sur les trois jeux. Le
jeu de templates de N. Loiseau figure sur la première ligne (A), celui de M. Cottevieille en seconde ligne (B) et le
mien en dernière ligne (C). Un décalage sur les trois jeux de blocs est observé aussi bien en région N-terminal au
niveau de la série des CSB1 (1*, 1**, 1) et en région C-terminale au niveau de la série des CSB13 (13A, 13B, 13).
5.2.3 Intérêt d’un jeu de blocs généralisés
En raison des divergences sur les positionnements relatifs des blocs entre les trois jeux de
templates, j’ai dû établir un jeu de blocs général correspondant à un compromis des sous-alignements.
Ce dernier a pour but de lever les ambiguïtés de positionnement des blocs qui posent des difficultés à
Caliseq, en particulier dans la série des blocs 1 en N-terminal ou encore de la série des blocs 13 en
C-terminal. Ce jeu de blocs global est présenté Figure 5-4 et Figure 5-5 : il symbolise l’ossature
générale conservée d’un P450.
Figure 5-4 Blocs structuraux en représentation carbones Cα, déterminés à partir d’un consensus des trois jeux
de blocs (11 structures au total). Les structures ont été superposées sur les atomes du squelette des hélices I et J
(blocs 7A et 7B) indiquées par les flèches noires. Le code couleur est le suivant : P450eryf en vert, P450BM3 en
cyan, CYP 2C8 en violet, CYP 2C9 en jaune, CYP 2C5 (1nr6) en rose clair, CYP 154C1 en gris, CYP 51 en bleu,
CYP 2C5 (1dt6) en orange, P450nor en vert clair, P450terp en vert kaki et enfin P450cam en rose foncé.
Le compromis des trois différents jeux de blocs (cf. méthode décrite à la section 3.2.3) fournit un
jeu global composé de blocs plus courts que ceux rencontrés dans les trois jeux de blocs initiaux.
Toutefois, pour certains blocs, aucune modification n’a été apportée : il s’agit de blocs généralement
robustes, comme les CSBs de la série 7 ou de la série 12. À l’inverse, ceux de la série 1 et surtout ceux
de la série 13 ont subi un raccourcissement drastique pour réaliser le consensus : ils étaient déjà à
l’origine des principaux désaccords entre les différents jeux de blocs. Par ailleurs, selon le
raccourcissement imposé aux blocs de la série 13, leur positionnement par le programme Caliseq sur
la séquence du CYP 3A4 par exemple, se voit perturbé dans cette région : c’est la preuve que les blocs
identifiés à cette région C-terminale sont plutôt peu fiables.
1oxa 1 ---------- ---------- A-TV-----P D--LESDSFH ------VDWY STYAELRETA --PVTPVRF- LGQDAWLVTG YDEAKAALSD --L-RLSSDP 60
1gwi 1 ---------- -----ARIP- -LDPFV---- ---------- ------TDLD GESARLRAAG --PLAAVELP GGVPVWAVTH HAEAKALLTD P---RLVKDI 58
1rom 1 -----APSFP FSRASGPEPP ---------- ---------- --------AE FAKLRATN-- --PVSQVKLF DGSLAWLVTK HKDVCFVATS --E-KLSKVR 60
1cpt 1 MDARA----- --TIPEH--- --------IA R-TVILPQGY ADDEVIYPAF KWLRDEQ--P LAMAHIEGYD PMWIATKHAD VMQIGKQP-- --G-LFSNAE 74
3cpp 1 -----NLAPL PPHVPEHLVF DFDMYNPSNL SAG--V---- ------QEAW AVLQESNV-- P-DLVWTRCN G--GHWIATR GQLIREAYED --YRHFSSEC 76
1e9x 1 ---MSAVALP RVSGGHDEHG HLEEFR---- ---------- ------TDPI GLMQRVRDEC G-DVGTFQL- AGKQVVLLSG SHANEFFF-R AGDDDLDQAK 74
2hpd 1 ---------- ----TIKEMP QPKTFGELKN LPLLNT---- ------DKPV QALMKIADEL G-EIFKFEA- PGRVTRYLSS QRLIKEAC-D -ES-RFDK-- 69
1pq2 1 ---------- ------KLPP GPTPLPIIGN MLQIDV---- ------KDIC KSFTNFSKVY G-PVFTVYF- GMNPIVVFHG YEAVKEALID NGE-EFS--- 68
1og5 1 ---------- --------PP GPTPLPVIGN ILQIGI---- ------KDIS KSLTNLSKVY G-PVFTLYF- GLKPIVVLHG YEAVKEALID LGE-EFS--- 66
1nr6 1 ---------- -----GKLPP GPTPFPIIGN ILQIDA---- ------KDIS KSLTKFSECY G-PVFTVYL- GMKPTVVLHG YEAVKEALVD LGE-EFAGRG 72
1dt6 1 ---------- --------PP GPTPFPIIGN ILQIDA---- ------KDIS KSLTKFSECY G-PVFTVYL- GMKPTVVLHG YEAVKEALVD LGE-EFAGRG 69
CSB0 CSB1* CSB1** CSB1
1oxa 61 KK----KYPG VEV-EFP-AY LGFPEDVRN- -YF--AT--- ---------- NMGTSDP--P THTRLRKLVS QEFTVRR--- --VEAMRPRV EQITAELLDE 130
1gwi 59 NVWGAWRRGE IPADW----- ----PLIGLA -N--PGR--- ---------- SMLTVDG--A EHRRLRTLVA QALTVRR--- --VEHMRGRI TELTDRLLDE 126
1rom 61 TRQGFPEL-- -------S-- ----ASGKQA -AKAKP---- ---------- TFVDMDP--P EHMHQRSMVE PTFTPEAVKN --LQPYIQRT VDDLLEQMKQ 126
1cpt 75 GSEILY---- ---------- ---DQNNEA- --FMR--SIS GGCPH-VID- SLTSMDP--P THTAYRGLTL NWFQPASIRK --LEENIRRI AQASVQRLLD 146
3cpp 77 PFI------- ------P--- ----REAGEA ----Y----- --------DF IPTSMDP--P EQRQFRALAN QVVGMPVVDK --LENRIQEL ACSLIESLRP 135
1e9x 75 AY-------- ---------- ----PFMTPI -F--GE---- ---------- GVVFDAS--P ERRKEMLHNA ALRGEQ---- --MKGHAATI EDQVRRMIAD 127
2hpd 69 ---------- ----NLS--- ----QALKFV -RDFAGD--- ---------- GLFTSWTHEK NWKKAHNILL PSFSQQAMKG -YHAMMVDIA VQLVQKWERL 133
1pq2 68 ---------- ----GRGN-S ----PISQRI -T--KGL--- ---------- GIISSNG--K RWKEIRRFSL TTLRNFGMGK RSIEDRVQEE AHCLVEELRK 131
1og5 66 ---------- ----GRGI-F ----PLAERA -N--RGF--- ---------- GIVFSNG--K KWKEIRRFSL MTLRNFGMGK RSIEDRVQEE ARCLVEELRK 129
1nr6 72 ---------- ----SV---- ----PILEKV -S--KGL--- ---------- GIAFSNA--K TWKEMRRFSL MTLRNFGMGK RSIEDRIQEE ARCLVEELRK 132
1dt6 69 ---------- ----SV---- ----PILEKV -SKGL----- ---------- GIAFSNA--K TWKEMRRFSL MTLRNFGMGK RSIEDRIQEE ARCLVEELRK 129
CSB2A* CSB2A** CSB2A CSB2B
1oxa 131 VGDS--G-VV DIVDRFAHPL PIKVICELLG V--------D EAARGAFGRW SSEIL-V--- ---------- MDP-ER-A-- EQRGQAAREV VNFILDLVER 201
1gwi 127 L--PADGGVV DLKAAFAYPL PMYVVADLMG IE-------E ARLPRLKVLF EKFF---ST- --Q------- ------TPPE E-VVATLTEL ASIMTDTVAA 197
1rom 127 K--GCANGPV DLVKEFALPV PSYIIYTLLG VP-------F NDLEYLTQQN AIRTN--GSS ---------- -------TAR E-ASAANQEL LDYLAILVEQ 197
1cpt 147 F-----DGEC DFMTDCALYY PLHVVMTALG VP-------E DDEPLMLKLT QDFFG-VE-- ---------- -------AAR R-FHETIATF YDYFNGFTVD 213
3cpp 136 Q------GQC NFTEDYAEPF PIRIFMLLAG LP-------E EDIPHLKYLT DQMTR----- ---------- ----PDGSM- -TFAEAKEAL YDYLIPIIEQ 201
1e9x 128 W---GEAGEI DLLDFFAELT IYTSSACLIG -KKFRDQLDG RFAKLYHELE RGTD-----P -LAYVD--PY LPIESF---R R-RDEARNGL VALVADIMNG 211
2hpd 134 N--A--DEHI EVPEDMTRLT LDTIGLCGF- NYRFNSFYRD QPHPFITSMV RALDEAMNKL QRANPDDPAY DEN------K RQFQEDIKVM NDLVDKIIAD 222
1pq2 132 T--K--ASPC DPTFILGCAP CNVICSVVF- QKRFD-YK-D QNFLTLMKRF NENFRILNSP WIQVCNNFPL LID-CFPGTH NKVLKNVALT RSYIREKVKE 223
1og5 130 T--K--ASPC DPTFILGCAP CNVICSIIF- HKRFD-YK-D QQFLNLMEKL NENIEILSSP WIQVYNNFPA LLD-YFPGTH NKLLKNVAFM KSYILEKVKE 221
1nr6 133 T--N--ASPC DPTFILGCAP CNVICSVIF- HNRFD-YK-D EEFLKLMESL HENVELLGTP WLQVYNNFPA LLD-YFPGIH KTLLKNADYI KNFIMEKVKE 224
1dt6 130 T--N--ASPC DPTFILGCAP CNVICSVIF- HNRFD-YK-D EEFLKLMESL HENVELLGTP ---------- -LD-YFPGIH KTLLKNADYI KNFIMEKVKE 210
CSB3 CSB4 CSB5
1oxa 202 RRTEPGD--- --DLLSALIS VQD--D--DD -G-RLSADEL TSIALVLLLA GFEASVSLIG IGTYLLLTHP DQLALVRADP ---------- --------SA 272
1gwi 198 KRAAPGD--- --DLTSALIQ ASE--N--G- -D-HLTDAEI VSTLQLMVAA GHETTISLIV NAVVNLSTHP EQRALVLSGE ---------- --------AE 267
1rom 198 RLVEPKD--- --DIISKLCT EQV--K--P- -G-NIDKSDA VQIAFLLLVA GNATMVNMIA LGVATLAQHP DQLAQLKANP ---------- --------SL 267
1cpt 214 RRSCPKD--- --DVMSLLAN SKL--D--G- -N-YIDDKYI NAYYVAIATA GHDTTSSSSG GAIIGLSRNP EQLALAKSDP ---------- --------AL 283
3cpp 202 RRQKPGT--- --DAISIVAN GQV--N--G- -R-PITSDEA KRMCGLLLVG GLDTVVNFLS FSMEFLAKSP EHRQELIERP ---------- --------ER 271
1e9x 212 RIANPPTDKS DRDMLDVLIA -VKAET--G- TP-RFSADEI TGMFISMMFA GHHTSSGTAS WTLIELMRHR DAYAAVIDEL DELYGDGRSV SFHALRQIPQ 306
2hpd 223 RKASGEQSD- --DLLTHMLN GKDPET--G- -E-PLDDENI RYQIITFLIA GHETTSGLLS FALYFLVKNP HVLQKAAEEA ARVLV-DPVP SYKQVKQLKY 313
1pq2 224 HQASLDVNNP R-DFIDCFLI KMEQ-EKDN- QKSEFNIENL VGTVADLFVA GTETTSTTLR YGLLLLLKHP EVTAKVQEEI DHVIGRHRSP CMQDRSHMPY 320
1og5 222 HQESMDMNNP Q-DFIDCFLM KMEK-EKHN- QPSEFTIESL ENTAVDLFGA GTETTSTTLR YALLLLLKHP EVTAKVQEEI ERVIGRNRSP CMQDRSHMPY 318
1nr6 225 HQKLLDVNNP R-DFIDCFLI KMEQ-E--N- -NLEFTLESL VIAVSDLFGA GTETTSTTLR YSLLLLLKHP EVAARVQEEI ERVIGRHRSP CMQDRSRMPY 318
1dt6 211 HQKLLDVNNP R-DFIDCFLI KMEQ-E--N- -NLEFTLESL VIAVSDLFGA GTETTSTTLR YSLLLLLKHP EVAARVQEEI ERVIGRHRSP CMQDRSRMPY 304
CSB6 CSB7A CSB7B
1oxa 273 LPNAVEEILR YIAPPETT-T RFAAEEVEIG G-VAIPQYST VLVANGAANR DPSQF-PDPH RFDVTR---D -----T---R G-------HL SFGQGIHFCM 351
1gwi 268 WSAVVEETLR FSTPTSHVLI RFAAEDVPVG D-RVIPAGDA LIVSYGALGR DERAHGPTAD RFDLTR---T --SGNR---- --------HI SFGHGPHVCP 349
1rom 268 APQFVEELCR YHTASALAIK RTAKEDVMIG D-KLVRANEG IIASNQSANR DEEVF-ENPD EFNMNR---K WP-P------ -----QD-PL GFGFGDHRCI 349
1cpt 284 IPRLVDEAVR WTAPVKSF-M RTALADTEVR G-QNIKRGDR IMLSYPSANR DEEVF-SNPD EFDITRF--P ----NR---- --------HL GFGWGAHMCL 362
3cpp 272 IPAACEELLR RFSLVAD--G RILTSDYEFH G-VQLKKGDQ ILLPQMLSGL DEREN-ACPM HVDFSR-Q-K ----V----- S-------HT TFGHGSHLCL 349
1e9x 307 LENVLKETLR LHPPLIIL-M RVAKGEFEVQ G-HRIHEGDL VAASPAISNR IPEDF-PDPH DFVPARY-EQ -P---RQEDL LNRWT---WI PFGAGRHRCV 395
2hpd 314 VGMVLNEALR LWPTAPAF-S LYAKEDTVLG GEYPLEKGDE LMVLIPQLHR DKTIWGDDVE EFRPERF-EN -----PSA-- I---PQHAFK PFGNGQRACI 401
1pq2 321 TDAVVHEIQR YSDLVPTGVP HAVTTDTKFR N-YLIPKGTT IMALLTSVLH DDKEF-PNPN IFDPGHF-LD -KNGNFKK-- S---D--YFM PFSAGKRICA 409
1og5 319 TDAVVHEVQR YIDLLPTSLP HAVTCDIKFR N-YLIPKGTT ILISLTSVLH DNKEF-PNPE MFDPHHF-LD -EGGNFKK-- S---K--YFM PFSAGKRICV 407
1nr6 319 TDAVIHEIQR FIDLLPTNLP HAVTRDVRFR N-YFIPKGTD IITSLTSVLH DEKAF-PNPK VFDPGHF-LD -ESGNFKK-- S---D--YFM PFSAGKRMCV 407
1dt6 305 TDAVIHEIQR FIDLLPTNLP HAVTRDVRFR N-YFIPKGTD IITSLTSVLH DEKAF-PNPK VFDPGHF-LD -ESGNFKK-- S---D--YFM PFSAGKRMCV 393
CSB8 CSB9 CSB10 CSB11 CSB12A
1oxa 352 GRPLAKLEGE VALRALFGRF PALSLGI--- --DADDVVWR R-SLLLRGID HL-PVRLDG- -------- 403
1gwi 350 GAALSRMEAG VALPALYARF PHLDLAV--- --PAAELRNK P-VVTQNDLF EL-PVRLA-- -----HHH 403
1rom 350 AEHLAKAELT TVFSTLYQKF PDLKVAV--- --PLGKINYT P-LNRDVGIV D-LPVIF--- -------- 399
1cpt 363 GQHLAKLEMK IFFEELLPKL KSVELSG--- -----PPRLV A-TN-FVGGP KNVPIRFTKA -------- 412
3cpp 350 GQHLARREII VTLKEWLTRI PDFSIAP--- --GA-QIQHK S-G-IVSGVQ A-LPLVWDPA TTKAV--- 405
1e9x 396 GAAFAIMQIK AIFSVLLREY E-FEMAQ--- PP--ESYRND HSK-MVVQLA QPACVRYR-R RT------ 449
2hpd 402 GQQFALHEAT LVLGMMLKHF D-FEDHT--- NY---ELDIK E-T-LTLKPE GF-VVKAKSK KIPLGG-- 457
1pq2 410 GEGLARMELF LFLTTILQNF N-LKSVDDLK NL---NTTAV TKG-IVSLPP SY-QICFIPV -------- 463
1og5 408 GEALAGMELF LFLTSILQNF N-LKSLVDPK NL---DTTPV VNG-FASVPP FY-QLCFIPV -------- 461
1nr6 408 GEGLARMELF LFLTSILQNF K-LQSLVEPK DL---DITAV VNG-FVSVPP SY-QLCFIPI -----H-- 462
1dt6 394 GEGLARMELF LFLTSILQNF K-LQSLVEPK DL---DITAV VNGFVSVPPS Y--QLCFIPI -----HH- 449
CSB12B CSB13A CSB13B CSB13
Figure 5-5 Alignement structural des 11 structures templates : P450eryF (1oxa), CYP 154C1 (1gwi), P450nor
(1rom), P450terp (1cpt), P450cam (3cpp), CYP 51 (1e9x), P450BM3 (2hpd), CYP 2C8 (1pq2), CYP 2C9 (1og5),
CYP 2C5 (1nr6), CYP 2C5 (1dt6). L’ordre des structures dans l’alignement a été établi arbitrairement. Les blocs
structuraux (CSBs) sont indiqués en blanc sur fond noir. La partie inter-bloc a été alignée à la main. La partie
N-terminale est souvent tronquée en raison de son alignement incertain. Le bloc 0 détecté sur le jeu de templates
dominé par les protéines microsomales est surligné en gris.
L’élaboration de ce jeu de blocs global ne change pas le positionnement des blocs « robustes ». Ils
permettent en revanche de trancher sur les incertitudes et désaccords entre les alignements des trois
différents jeux de blocs. En revanche, comme ce jeu de blocs global se base sur un compromis
séquentiel, il n’est pas certain que les sous-alignements obtenus seraient identiques à ceux obtenus par
une recherche 3D par GOK. En raison de la limite du logiciel à identifier les CSBs sur un nombre de
templates trop important, je n’ai pas pu effectuer cette vérification sur le jeu complet à 11 templates, et
j’ai considéré que le jeu de bloc global retraduisait correctement l’information 3D des CSBs, sachant
que les sous-alignements mis en commun provenaient eux-mêmes d’une identification 3D de blocs.
5.2.4 Alignement de toutes les structures représentatives de P450 dans la

PDB
Au cours de la thèse, avec l’émergence de nouvelles méthodes ainsi que la puissance croissante
des machines de calcul, il a été enfin possible de déterminer des blocs structuralement conservés sur
l’ensemble des templates des P450s. En Avril 2007, 29 structures de P450 non redondantes étaient
présentes dans la PDB. Cette identification a été rendue possible par l’utilisation de l’outil GAKUSA,
développé par M.Carpentier (Université Paris VI) au cours de sa thèse, dont le principe repose sur le
« Gibbs Sampling » (cf. section 2.4.5.2 à la page 110). Les structures utilisées pour la recherche de
blocs conservés sont présentées sur le Tableau 3.2 à la page 141. Des 29 structures présentées sur ce
tableau, une structure a été finalement retirée car elle comportait trop de régions non résolues dans sa
structure, empêchant GAKUSA de déterminer correctement les CSBs. Il s’agit de la structure du CYPs
P450Oxyb (1lfk) d’origine bactérienne. Les résultats de la recherche de CSBs par GAKUSA sur
l’ensemble des templates différents disponibles dans la PDB sont montrés sur le Tableau 5.4.
Les CSBs identifiés par GAKUSA sur l’ensemble des templates différents de P450 disponibles
dans la PDB devaient servir initialement à vérifier la solidité ou l’incertitude des blocs du jeu global
présenté à la Figure 5-5 : quelles étaient les différences observables avec l’apport de nouveaux
templates (publiés en 2006 et 2007), et où étaient situées ces différences ?
Tableau 5.4 Positions des blocs structuraux obtenus avec GAKUSA sur un jeu de 28 templates : la structure du P450Oxyb a été retirée
du jeu initial car elle comportait trop de régions manquantes. En première colonne, la nomenclature de P. Jean, basée sur l’alignement de 3
structures bactériennes, dans la deuxième colonne, la nomenclature de Poulos.
Structures cam BM3 nor EryF OxyC epok 119

CSB taille
Secondaires 1RE9 2IJ2 2JFB 1Z8O IUED 1Q5D 1IO7
1 β1−1+β1−2+B 44-68 41-65 34-58 31-55 12-36 41-65 12-36 25

2B-3 D+E 126-160 127-161 126-160 126-160 100-134 131-165 103-137 35
7 I+J 222-262 248-288 223-263 225-265 195-235 238-278 194-234 41
8 K 266-290 310-334 268-292 270-294 236-260 283-307 236-260 25
9-10A β1−4+β2−1+β2−2 291-311 336-356 294-314 295-315 261-281 309-329 261-281 21
10B-11 β1−3+K'+Meander 317-329 362-374 320-332 321-333 287-299 335-347 287-299 13
12-13 CysPocket+L+β3−3 337-373 390-426 342-378 341-377 307-343 355-391 307-343 37
13 β4−1+β4−2+β3−2 377-396 430-449 381-400 383-402 345-364 394-413 345-364 20
121 152A1 154A1 154C1 158A2 175A1 51

1N40 1IZO 1ODO 1GWI 1S1F 1N97 1X8V
1 β1−1+β1−2+B 34-58 38-62 32-56 35-59 43-67 35-59 42-66 25

2B-3 D+E 119-153 119-153 126-160 129-163 130-164 114-148 120-154 35
7 I+J 217-257 226-266 226-266 226-266 225-265 205-245 240-280 41
8 K 262-286 272-296 271-295 271-295 270-294 250-274 303-327 25
9-10A β1−4+β2−1+β2−2 288-308 297-317 298-318 297-317 297-317 275-295 328-348 21
10B-11 β1−3+K'+Meander 314-326 323-335 324-336 323-335 323-335 299-311 354-366 13
12-13 CysPocket+L+β3−3 335-371 353-389 344-380 345-381 343-379 326-362 384-420 37
13 β4−1+β4−2+β3−2 374-393 393-412 383-402 387-406 385-404 364-383 426-445 20
st PIKC terp 199A2 2A6 2B4 2C5

1UE8 2CD8 1CPT 2FR7 2FDU 1SUO 1NR6
1 β1−1+β1−2+B 47-71 44-68 43-67 49-73 70-94 67-91 66-90 25

2B-3 D+E 134-168 130-164 139-173 136-170 156-190 153-187 152-186 35
7 I+J 229-269 227-267 251-291 235-275 285-325 282-322 278-318 41
8 K 274-298 272-296 296-320 280-304 348-372 345-369 341-365 25
9-10A β1−4+β2−1+β2−2 300-320 298-318 321-341 305-325 374-394 371-391 367-387 21
10B-11 β1−3+K'+Meander 326-338 324-336 347-359 331-343 400-412 397-409 393-405 13
12-13 CysPocket+L+β3−3 346-382 344-380 367-403 351-387 429-465 426-462 422-458 37
13 β4−1+β4−2+β3−2 384-403 383-402 406-425 390-409 473-492 470-489 466-485 20
2C8 2C9 2D6 3A4 8A1 2R1 1A2

1PQ2 1R9O 2F9Q 1TQN 2IAG 2OJD 2HI4
1 β1−1+β1−2+B 66-90 66-90 70-94 73-97 66-90 78-102 77-101 25

2B-3 D+E 152-186 152-186 160-194 158-192 150-184 165-199 174-208 35
7 I+J 281-321 281-321 289-329 289-329 267-307 294-334 301-341 41
8 K 344-368 344-368 352-376 352-376 337-361 357-381 364-388 25
9-10A β1−4+β2−1+β2−2 370-390 370-390 378-398 377-397 366-386 383-403 390-410 21
10B-11 β1−3+K'+Meander 396-408 396-408 404-416 403-415 393-405 409-421 416-428 13
12-13 CysPocket+L+β3−3 425-461 425-461 433-469 432-468 431-467 438-474 448-484 37
13 β4−1+β4−2+β3−2 469-488 469-488 476-495 474-493 477-496 480-499 490-509 20
Initialement, je pensais que l’utilisation d’un jeu de templates plus important (28 structures contre
11 dans le jeu global) conduirait à l’obtention de blocs moins nombreux et plus courts. Les résultats
montrent que les blocs identifiés sous GAKUSA sont effectivement moins nombreux que dans le jeu
global (8 blocs identifiés contre 23 blocs sur le jeu global) mais de taille moyenne plus importante : la
plupart des blocs identifiés sous GOK se retrouvent agglomérés lors de l’identification par GAKUSA.
Ainsi, les blocs de la série 1 sont à présents réunis en un seul bloc de 25 résidus. Il en de même pour
les blocs de la série 7 et 13. À noter que les blocs identifiés par GAKUSA bouleversent un peu la
nomenclature mise en place par P. Jean : certains blocs correspondent à une réunification de blocs de
séries voisines. C’est le cas par exemple du second bloc déterminé par GAKUSA dans le tableau, qui
réunit le bloc CSB2B et le bloc CSB3 (d’autres exemples sont observés, voir Tableau 5.4).
Toutefois, l’utilisation de GAKUSA est limitée dans la recherche exhaustive de tous les blocs
identifiés sous GOK : la version actuelle du programme ne permet pas d’identifier les blocs de la
boucle B–C (incluant l’hélice B’) et les hélices F, G, H. À l’instar de GOK, GAKUSA identifie
chaque bloc pas à pas. Lorsqu’un résultat de bloc n’est pas convenable, il faut recommencer la
recherche depuis la toute première étape, et modifier les paramètres de recherche une fois à l’étape
précédant celle qui aboutissait à un résultat non convenable11. Schématiquement, lorsque le résultat de
bloc n’est pas satisfaisant à l’étape 5, il faut repartir de l’étape 1 et modifier les paramètres une fois à
l’étape 4. Ces blocs jugés non convenables, correspondent en fait à ceux présentant des morceaux
d’hélices de certains templates qui devraient constituer un bloc X, et qui se retrouvent finalement
attribués avec les hélices des autres structures au niveau d’un bloc Y. Par exemple, l’hélice F de la
structure du P450OxyC est identifiée dans le bloc des hélices H pour les autres structures. Cet exemple
illustre d’ailleurs la dernière étape où il n’a plus été possible d’aller plus loin pour identifier de
nouveaux blocs sans avoir ce cas de figure (autrement dit, il est possible d’identifier d’autres blocs
mais ils comprennent des erreurs d’attribution). La difficulté à identifier correctement les blocs dans
ces régions est probablement liée à la similarité des trajectoires en coordonnées internes (α,τ) –hélices
principalement– ainsi que la variabilité des éléments de structures secondaires au niveau de ces
régions (hélice B’ parfois déstructurée et à des positions variables le long de la boucle B–C, et les
hélices F et G sont variables).
11
À la différence de GOK qui utilise des paramètres de maille et de marge, GAKUSA utilise un paramètre de
longueur de bloc à ajuster.
Best score for this pattern scaled to len= 21 F=1116.82132 G/free param= 1.29120
1CPT OXIDOREDUCTASE(OXYGENASE) ALADTEVRGQNIKRGDRIMLS 321 341
1IO7 OXIDOREDUCTASE TKERVKLGDQTIEEGEYVRVW 261 281
1N40 OXIDOREDUCTASE ATADIQVGDVLVRKGELVLVL 288 308
1N97 ELECTRON TRANSPORT LERPLLLGEDRLPPGTTLVLS 275 295
1IZO OXIDOREDUCTASE VKKDFVWNNCEFKKGTSVLLD 297 317
1GWI OXIDOREDUCTASE AAEDVPVGDRVIPAGDALIVS 297 317
1Q5D OXIDOREDUCTASE ARQDLEYCGASIKKGEMVFLL 309 329
1RE9 OXIDOREDUCTASE LTSDYEFHGVQLKKGDQILLP 291 311
1S1F OXIDOREDUCTASE ALEDVEIKGVRIRAGDAVYVS 297 317
2IAG ISOMERASE AMPMADGREFNLRRGDRLLLF 366 386
1UE8 STRUCTURAL GENOMICS, UNKNOWN FUNCTION TKEKVKIRDQVIDEGELVRVW 261 281
1UED OXIDOREDUCTASE AIKDVVIDGQLIKAGDYVLCS 300 320
1X8V OXIDOREDUCTASE AKGEFEVQGHRIHEGDLVAAS 328 348
1Z8O OXIDOREDUCTASE AAEEVEIGGVAIPQYSTVLVA 295 315
2CD8 OXIDOREDUCTASE PVEPVDLDGTVIPAGDTVLVV 298 318
2OJD OXIDOREDUCTASE TSEDAVVRGYSIPKGTTVITN 383 403
2FR7 OXIDOREDUCTASE TTRDVELAGATIGEGEKVLMF 305 325
1ODO OXIDOREDUCTASE VTDIALPDGRTIARGEPILAS 298 318
2IJ2 OXIDOREDUCTASE KEDTVLGGEYPLEKGDELMVL 336 356
1JFB OXIDOREDUCTASE AKEDVMIGDKLVRANEGIIAS 294 314
2FDU OXIDOREDUCTASE VKKDTKFRDFFLPKGTEVYPM 374 394
1SUO OXIDOREDUCTASE VTKDTQFRGYVIPKNTEVFPV 371 391
1PQ2 OXIDOREDUCTASE VTTDTKFRNYLIPKGTTIMAL 370 390
1R9O OXIDOREDUCTASE VTCDIKFRNYLIPKGTTILIS 370 390
1NR6 OXIDOREDUCTASE VTRDVRFRNYFIPKGTDIITS 367 387
2F9Q OXIDOREDUCTASE TSRDIEVQGFRIPKGTTLITN 378 398
2HI4 OXIDOREDUCTASE TTRDTTLNGFYIPKKCCVFVN 390 410
1TQN OXIDOREDUCTASE CKKDVEINGMFIPKGVVVMIP 377 397
1-> | 1|19| 9|34| 5|34|17|12|30| 4| 1| 3| 8|21|32| 4| 1| 3| 3| 2|35|

2-> | 1|16|12|35| 5|35|14|15|27| 3| 2| 5| 9|19|31| 5| 2| 2| 2| 3|35|
3-> | 0|20| 9|35| 5|35|12|16|26| 3| 3| 4| 9|20|30| 6| 1| 2| 2| 3| 1|
4-> |35|19|11| 2| 2|35|10|17|27| 1| 1| 4| 9|21|31| 4| 3| 1|35| 1| 0|
5-> | 0|19| 8|32| 6|34|17|12|29| 4| 1| 2| 8|20|31| 5| 0| 2| 3| 5|35|
6-> | 0|19|10| 2| 4|35|12|16|24| 3| 4| 4| 8|20|29| 6| 1| 0| 5| 2|34|
7-> | 1|18|11|33| 6|35|16|13|29| 4| 1| 3| 9|19|31| 6| 1| 2| 3| 3|35|
8-> | 1|17|10|35| 4| 0|16|13|29| 4| 1| 4| 8|20|31| 4| 1| 3| 0| 2| 1|
9-> | 1|18|11|35| 4| 0|16|12|30| 5| 0| 4| 8|21|30| 5| 1| 1| 2| 3| 0|
10-> | 2| 3| 2| 6|24| 9|29| 2| 2| 5| 2| 4| 7|21|29| 5| 3| 0| 0| 1|35|
11-> | 0|19|11| 0| 2| 0|13|15|27| 2| 1| 3| 9|22|31| 6| 1| 2| 2| 3|35|
12-> |35|21| 7| 0| 4|35|15|13|28| 4| 1| 3| 8|21|29| 4| 2| 2| 3| 2|35|
13-> | 0|18|11|35| 4| 0|15|13|29| 4| 2| 3| 9|20|31| 5| 1| 0| 1| 3| 0|
14-> |35|19|10| 1| 3|35|17|12|29| 4| 2| 5| 9|20|32| 5| 1| 1| 2| 3|35|
15-> | 3|19|11| 2| 2| 0|14|13|29| 2| 1| 5| 8|20|31| 7| 0| 1| 3| 4| 0|
16-> | 2|17|12| 2| 2|35|15|12|29| 4| 1| 4| 9|20|32| 6| 1| 2| 2| 3|35|
17-> | 0|20| 9|35| 4|35|14|13|29| 4| 0| 4| 9|21|32| 5| 1| 3| 2| 2|35|
18-> |18|11| 1| 5| 3| 7|23| 8|30| 5| 3| 4| 9|20|30| 6| 2| 1| 3| 1|34|
19-> |17|11|33| 6| 3|16|10|24|24| 3| 1| 4| 9|20|32| 5| 0| 2| 3| 2| 0|
20-> | 1|17|12| 0| 4| 0|12|16|26| 3| 2| 3|10|20|30| 5| 1| 1| 1| 3| 0|
21-> | 3|17|13| 1| 2|35|13|14|28| 4| 0| 4| 9|20|32| 5| 2| 2| 1| 3|35|
22-> | 3|18|11| 2| 3|34|15|13|28| 4| 1| 5| 9|19|32| 6| 1| 2| 2| 3| 0|
23-> | 3|17|12| 1| 4| 0|12|16|27| 3| 1| 5| 9|20|32| 7| 2| 0| 1| 4|35|
24-> | 3|17|12| 0| 4|35|12|16|27| 3| 1| 4| 9|20|32| 6| 2| 1| 2| 3|35|
25-> | 2|18|11| 0| 3| 1|12|15|26| 4| 1| 4| 9|20|32| 6| 2| 1| 1| 4|35|
26-> | 1|17|11|35| 5|35|16|12|30| 5| 1| 4| 9|20|33| 6| 1| 1| 2| 3|34|
27-> | 2|18|10|33| 5| 1|16|12|30| 5| 0| 4| 9|20|33| 5| 1| 1| 2| 3|34|
28-> | 1|18|11|33| 4| 0|14|15|26| 5| 1| 4| 9|20|31| 5| 3| 1| 2| 3|35|
Figure 5-6 Exemple de sortie de GAKUSA pour le bloc 9-10A (β1-4/β2-1/β2-2). La première partie du résultat (en
haut) correspond à la description des templates, leurs séquences respectives au niveau du bloc identifié ainsi que
les positions du bloc sur les templates. La partie du bas correspond à l’alignement des angles α à chaque position
du bloc (valeurs discrètes de 0 à 35 par tranches de 10° d’angle). Dans cet exemple, on peut voir l’effet de
« moyenne » exercé dans la sélection des blocs, par exemple la dixième structure (2iag) montre à la position 5 un
angle α très écarté de la moyenne de la colonne, de même dans d’autres positions du début de bloc. Pourtant, ce
bloc est sélectionné parce que le score global sur tout le bloc reste favorable. Dans GOK, une position divergente
comme cet exemple suffirait à provoquer une rupture de blocs, ce qui explique le morcellement et la taille des
blocs dans les deux méthodes.
Ce qui est nouveau par rapport aux blocs identifiés par GOK, c’est la longueur trouvée pour
chaque bloc : est-ce un artefact du logiciel (lié aux paramètres trop « permissifs » fournis par
l’utilisateur) ? Peut-on attribuer une interprétation possible à cette observation ? Il existe en effet sous
GAKUSA des paramètres semblables à la maille de GOK mais ces paramètres sont réglés par défaut
pour être « stringent » et GAKUSA ne permet pas la détection de nombreux blocs. Dans la version
actuelle du programme, il n’est possible d’attribuer ce paramètre qu’une seule fois, au lancement du
programme. Ainsi, j’ai dû utiliser un paramètre moins « stringent » que ceux définis par défaut, ce qui
a permis de détecter plus de blocs, de taille plus importante. Par ailleurs, la similarité des trajectoires
communes semble plus marquée lorsque l’on dispose de plus de templates : avec seulement deux
templates, les différences dans les trajectoires sont facilement décelées tandis qu’avec un jeu plus
conséquent de templates, il y a un effet de « moyenne » (lié au calcul de score) qui tend à atténuer les
écarts des valeurs des angles (α,τ) trouvées (cf. Figure 5-6). Les templates pris séparément peuvent
être un peu divergents au niveau de ces blocs, mais pris ensemble, présentent des régions
structuralement conservées au niveau des blocs.
Ainsi, les blocs obtenus par GAKUSA soulèvent de nombreux points de discussion : les matrices
PSSMs générées à partir de ces blocs seront-elles plus informatives que celles issues préalablement
sous GOK ? On peut le penser dans la mesure où elles sont issues d’un jeu de templates global, à
savoir toutes les structures non redondantes. Cependant, une telle longueur de bloc supposerait
implicitement une même longueur de la zone concernée pour toutes les structures inédites de P450
(non référencées encore dans la PDB). Le problème de longueur ne pose en pratique aucun problème :
Caliseq repose sur une programmation dynamique et cherche le meilleur positionnement pour les
blocs, quitte à introduire des gaps dans la séquence cible. Ainsi, la réunion des blocs présente
l’avantage d’éviter les alignements « imprécis » pour les blocs en N- et C-terminal par exemple. Le
positionnement d’un long bloc sur la séquence cible pourrait être plus robuste que le positionnement
de trois petits blocs. En effet, les trois blocs se positionneront au mieux sur la séquence cible, sachant
que les gaps ne sont pas pénalisés pour leur glissement, pouvant conduire à de mauvais placements des
blocs. Au contraire, pour positionner le bloc long, il faudra introduire des gaps dans la séquence cible,
qui ont un coût et la longueur du bloc impose une délimitation naturelle de positionnement pour le
bloc. Par exemple, lorsque deux blocs identifiés par GOK sont contigus au niveau d’une SSE, ces
blocs peuvent être séparés entraînant la perte de la SSE présent à cheval sur les deux blocs. Ce
problème n’existera pas en revanche sous GAKUSA, qui intègrera les deux blocs identifiés par GOK
en un seul bloc.
5.2.5 Comparaison des blocs avec d’autres méthodes d’alignement 3D

publiées
5.2.5.1 Les autres méthodes d’alignement structural

Outre la recherche de blocs par GAKUSA, d’autres logiciels d’alignement de structures (présentés
en sections 2.4.3 et 2.4.4) ont été appliqués sur les 11 templates du jeu global (ceux de la Figure 5-5),
afin de comparer les blocs obtenus par la méthode GOK aux alignements structuraux proposés par ces
autres logiciels. En raison de leur nombre important, j’ai limité les comparaisons aux logiciels
d’alignements structuraux de type multiple uniquement, et qui diffèrent tous par un descripteur
particulier (Cα, SSE, géométrie…). Il est à noter que certains logiciels d’alignement structuraux ne
permettent pas d’imposer les structures à aligner, mais utilisent un système de recherche automatique
de templates, similaire à BLAST : ces logiciels ont été exclus de la comparaison. Enfin, il faut se
rappeler que les logiciels utilisés pour la comparaison sont plus récents dans leur conception que le
logiciel GOK. Ces différents logiciels ainsi que leurs caractéristiques sont présentés sur le Tableau 5.5.
Tableau 5.5 Liste des logiciels d’alignement structuraux utilisés pour évaluer les CSBs identifiés par GOK. Excepté le logiciel Matras
qui n’accepte qu’une comparaison de 9 templates, les alignements structuraux par ces logiciels ont été opérés sur les 11 structures template
du jeu global.
Logiciel Description Année Descriptif Référence Lien internet
utilisé
MultiProt Multiple Alignment of Protein 2004 Géométrie Shatsky et al., 2004 http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt
Structures
SSM Secondary Structure Matching 2003 SSE Krissinel et Henrick, 2004 http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm/
Matras MArkovian TRAnsition of protein 2000 Cα et SSE Nishikawa, 2000 http://biunit.aist-nara.ac.jp/matras/
Structure
Vorolign Fast structure alignment using 2007 Cellules de Birzele et al., 2007 http://www.bio.ifi.lmu.de/Vorolign/
Voronoi contacts Voronoï

GAPS Gaussian-based Alignment of 2000 Cα et Mestres et al., 2000 NC
Protein Structures représentation
Gaussienne
NC : Non communiqué
Contrairement à l’outil GOK qui ne fournit que les fragments de séquences structuralement
conservées sur un ensemble de templates, la plupart des autres logiciels utilisés montre le résultat de
l’alignement structural sous forme d’un alignement global de séquences. Pour effectuer des
comparaisons avec les résultats de GOK, des blocs structuralement conservés ont été prélevés de ces
alignements multiples résultants : on peut en effet assimiler à des blocs CSB les régions de
l’alignement dépourvues de gap sur l’ensemble des templates issus des autres logiciels (du Tableau
5.5).
1oxa 1 ---------- ---------A -TV-----PD ---LE--SDS FHV--D---- -WYSTYAELR ET-A---PVT PV-R-FL-G- QDAWLVTGYD EAKAAL-SD- 53
1gwi 1 ---------- ---------- -AR-----IP ---LD--PF- -VT--D---- -LDGESARLR AA-G---PLA AV-E-LPGG- VPVWAVTHHA EAKALL-TD- 51
1rom 1 ---------- ---------- --A-----PS ---FP--FS- -RA--S---- GPE-PPAEFA KL-RATNPVS QV-K-LFDG- SLAWLVTKHK DVCFVA-TS- 53
1cpt 1 ---MDARA-- ---------T IPEH---IAR -TVIL--PQG YADDEV---- -IYPAFKWLR DE-Q---PLA MAHIE---GY DPMWIATKHA DVMQIG-KQ- 66
3cpp 1 --------NL APLPPHVPEH -LV-----FD ---FDMYNPS NLS--AGVQE -AWAVLQE-- SNVP---DLV WT-R-CN--- GGHWIATRGQ LIREAY-ED- 68
1e9x 1 MS-AVALP-- ---------R VSGGHDEHGH L-EEFR--TD PIG---L--- -MQRVRDE-- -C-G---DVG TFQLA---G- KQVVLLSGSH ANEFF-FRAG 66
2hpd 1 --TIKEMP-- ---------Q PKTFGELKNL PLLNT--DKP VQ---A---- -LMKIADE-- -L-G---EIF KFEAP---G- RVTRYLSSQR LIKEA--CD- 63
1og5 1 ------PP-- ---------G PTPLPVIGNI LQIGI--KDI SK---S---- -LTNLSKV-- -Y-G---PVF TLYFG---L- KPIVVLHGYE AVKEA-LIDL 61
1nr6 1 ---GKLPP-- ---------G PTPFPIIGNI LQIDA--KDI SK---S---- -LTKFSEC-- -Y-G---PVF TVYLG---M- KPTVVLHGYE AVKEA-LVDL 64
MCSB1* MCSB1** MCSB1
1oxa 53 -L-RLSSDPK K---KYPGVE V--EFP---A --Y---L--- GF--PEDVRN YF----A-TN MGTSDPPT-- HTRLRKLVSQ EFTVRRV--E AMRPRVEQIT 124
1gwi 51 -P-RLVKDIN VWGAWRRGEI PADWPL-IGL --A------- --------N- -P----G-RS MLTVDGAE-- HRRLRTLVAQ ALTVRRV--E HMRGRITELT 120
1rom 53 -E-KLSKVRT R-QGF----- --PELS-ASG --K------- --------Q- -A--AKAKPT FVDMDPPE-- HMHQRSMVEP TFTPEAV--K NLQPYIQRTV 117
1cpt 67 PG-LFSNA-- ---------- E--GSE---I -LYDQNN-EA FMRSISGGCP HV----I-DS LTSMDPPT-- HTAYRGLTLN WFQPASI--R KLEENIRRIA 137
3cpp 68 -YRHFSSEC- ---------- ----P----F --I---PR-- EA--GE--A- -Y----D-FI PTSMDPPE-- QRQFRALANQ VVGMPVV--D KLENRIQELA 126
1e9x 67 DD-DL----- ---------- ---DQAK--A -YP------- -F-------M TPIF--G-EG VV-FDASP-- ERRKEMLHNA ALRGEQM--K GHAATIEDQV 121
2hpd 64 ES-RFDK--- ---------- ---NLSQ--A -LK------- -F-------V RDFA--G-DG LFTSWTHEKN WKKAHNILLP SFSQQAM--K GYHAMMVDIA 123
1og5 62 GE-EFS---- ---------- ---GRGI--- -FP------- -L-------A ERAN-RG-FG IVFSNGKK-- WKEIRRFSLM TLRNFGMGKR SIEDRVQEEA 120
1nr6 65 GE-EFA---- ---------- ---GRGS--- -VP------- -I-------L EKVS-KG-LG IAFSNAKT-- WKEMRRFSLM TLRNFGMGKR SIEDRIQEEA 123
MCSB2A** MCSB2A MCS2B
1oxa 125 AELLDEV--- GD--S--GVV DIVDRFAHPL PIKVICE-LL GVDE-A---- -A---RGAFG RWSSE-IL-- V--------- ---------M DP-ERAE-QR 184
1gwi 121 DRLLDEL--- PA-DG--GVV DLKAAFAYPL PMYVVAD-LM GIEE-A---- -RLPRLKVLF EKFFS----- T--------- ---------- Q--TPPE-EV 180
1rom 118 DDLLEQM-KQ KGCAN--GPV DLVKEFALPV PSYIIYT-LL GVPF-N---- -DLEYLTQQN AIRTN----- G--------- ---------- S--STAR-EA 180
1cpt 138 QASVQRLL-- DF--D--GEC DFMTDCALYY PLHVVMT-AL GVPE-D---- -D---EPLML KLTQDFFG-- V--------- ---------- -E---AARR- 195
3cpp 127 CSLIESL--- RP--Q--GQC NFTEDYAEPF PIRIFML-LA GLPE-E---- -D---IPHLK YLTDQ-MT-- R--------- ---------P D--GSM--TF 184
1e9x 122 RRMIA----- DW--GEAGEI DLLD-FFAEL TIYTSSACLI GKKFR----D QL---DGRFA KLYHELER-G TDPLAYVDP- ---YL--PI- --E--SFRR- 193
2hpd 124 VQLVQKWE-- RL--NADEHI EVPE-DMTRL TLDTIGL-CG FNYRFNSFYR DQ---PHPFI TSMVRALDEA MN---KLQ-R A-NPDDPAY- -DE--NKRQ- 204
1og5 121 RCLVEELR-- KT--K-ASPC DPTF-ILGCA PCNVICS-II FHKRFD-YKD QQ---FLNLM EKLNENIEIL SSPWIQVYNN FPALLD-YF- -PG--THNK- 203
1nr6 124 RCLVEELR-- KT--N-ASPC DPTF-ILGCA PCNVICS-VI FHNRFD-YKD EE---FLKLM ESLHENVELL GTPWLQVYNN FPALLD-YF- -PG--IHKT- 206
CSB3A CSB3B CSB3C CSB4
1oxa 185 G--QAAREVV NFILDLVERR RTE-----PG DDLLSALISV QD--D--DD- G-RLSADELT SIALVLLLAG FEASVSLIGI GTYLLLTHPD QLALVRADP- 270
1gwi 181 V--ATLTELA SIMTDTVAAK RAA-----PG DDLTSALIQA SE--N--G-- D-HLTDAEIV STLQLMVAAG HETTISLIVN AVVNLSTHPE QRALVLSGE- 265
1rom 181 S--AANQELL DYLAILVEQR LVE-----PK DDIISKLCTE QV--K--P-- G-NIDKSDAV QIAFLLLVAG NATMVNMIAL GVATLAQHPD QLAQLKANP- 265
1cpt 196 FHET-IATFY DYFNGFTVDR RSC-----PK DDVMSLLANS KL--D--G-- N-YIDDKYIN AYYVAIATAG HDTTSSSSGG AIIGLSRNPE QLALAKSDP- 281
3cpp 185 A--EAKEALY DYLIPIIEQR RQK-----PG TDAISIVANG QV--N--G-- R-PITSDEAK RMCGLLLVGG LDTVVNFLSF SMEFLAKSPE HRQELIERP- 269
1e9x 194 RDEA-RNGLV ALVADIMNGR IANPPTDKSD RDMLDVLIA- VKAET-GT-- PR-FSADEIT GMFISMMFAG HHTSSGTASW TLIELMRHRD AYAAVIDELD 287
2hpd 205 FQED-IKVMN DLVDKIIADR KASG-E--QS DDLLTHMLNG KDPET--G-- E-PLDDENIR YQIITFLIAG HETTSGLLSF ALYFLVKNPH VLQKAAEEAA 295
1og5 204 LLKN-VAFMK SYILEKVKEH QESM-DMNNP QDFIDCFLMK MEK-EKHN-Q PSEFTIESLE NTAVDLFGAG TETTSTTLRY ALLLLLKHPE VTAKVQEEIE 299
1nr6 207 LLKN-ADYIK NFIMEKVKEH QKLL-DVNNP RDFIDCFLIK MEQ-E--N-- NLEFTLESLV IAVSDLFGAG TETTSTTLRY SLLLLLKHPE VAARVQEEIE 299
MCSB5 MCSB6 MCSB7
1oxa 270 ---------- --------SA LPNAVEEILR YIAPPETT-T -RFAAEEVEI G-GVAIPQYS TVLVANGAAN RDPSQFP--D PHRFDVTR-- -D-----T-- 337
1gwi 265 ---------- --------AE WSAVVEETLR FSTPTSHV-L IRFAAEDVPV G-DRVIPAGD ALIVSYGALG RDERAHG-PT ADRFDLTR-- -T-----S-- 334
1rom 265 ---------- --------SL APQFVEELCR YHTASALA-I KRTAKEDVMI G-DKLVRANE GIIASNQSAN RDEEVFE--N PDEFNMNR-- -KW----P-- 334
1cpt 281 ---------- --------AL IPRLVDEAVR WTAPVKSF-M -RTALADTEV R-GQNIKRGD RIMLSYPSAN RDEEVFS--N PDEFDITR-- FP-----N-- 349
3cpp 269 ---------- --------ER IPAACEELLR RFSLV-AD-G -RILTSDYEF H-GVQLKKGD QILLPQMLSG LDERENA--C PMHVDFSR-Q -K-----V-- 336
1e9x 288 ELYGDGRSVS -FHALRQIPQ LENVLKETLR LHPPLIIL-M -RVAKGEFEV Q-GHRIHEGD LVAASPAISN RIPEDFP--D PHDFVPARY- EQ-P---RQE 376
2hpd 296 RVLV-DPVPS YKQ-VKQLKY VGMVLNEALR LWPTAPAF-S -LYAKEDTVL GGEYPLEKGD ELMVLIPQLH RDKTIWGD-D VEEFRPERF- EN-----PS- 383
1og5 300 RVIGRNRSPC MQD-RSHMPY TDAVVHEVQR YIDLLPTSLP -HAVTCDIKF R-NYLIPKGT TILISLTSVL HDNKEFP--N PEMFDPHHF- LD-EGGNFK- 391
1nr6 300 RVIGRHRSPC MQD-RSRMPY TDAVIHEIQR FIDLLPTNLP -HAVTRDVRF R-NYFIPKGT DIITSLTSVL HDEKAFP--N PKVFDPGHF- LD-ESGNFK- 391
MCSB8 MCSB9 MCSB10 MCSB11
1oxa 337 ---R-G---- HLSFGQGIHF CMGRPLAKLE GEVALRALFG RFPALSLGI- ----DAD-DV VWRR-SLLLR GID-HLPVRL D--G------ ------ 403
1gwi 334 --GN-R---- HISFGHGPHV CPGAALSRME AGVALPALYA RFPHLDLAV- ----PAA-EL RNKP-VVTQN DLF-ELPVRL A--H-H-H-- ------ 403
1rom 334 --PQ-D---- PLGFGFGDHR CIAEHLAKAE LTTVFSTLYQ KFPDLKVAV- ----PLG-KI NYTP-LNRDV GIV-DLPVIF ---------- ------ 399
1cpt 349 -----R---- HLGFGWGAHM CLGQHLAKLE MKIFFEELLP KLKSVELSG- --------PP RLVA-TNFVG GPK-NVPIRF T--KA----- ------ 412
3cpp 336 -----S---- HTTFGHGSHL CLGQHLARRE IIVTLKEWLT RIPDFSIAP- ----GA--QI QHKS-G-IVS GVQ-ALPLVW DPAT--TKAV ------ 405
1e9x 377 DL--LNRW-T WIPFGAGRHR CVGAAFAIMQ IKAIFSVLLR EYE-FEMAQ- --PP---ESY RNDHSK---M VVQLAQPACV RYR--RR--- --T--- 449
2hpd 383 -A---IPQHA FKPFGNGQRA CIGQQFALHE ATLVLGMMLK HFD-FEDHT- --NY----EL DIKE-T-LTL KPE-GFVVKA K--SK----- KIPLGG 457
1og5 391 -K---SK--Y FMPFSAGKRI CVGEALAGME LFLFLTSILQ NFN-LKSLVD PKNL----DT TPVVNG-FAS VPP-FYQLCF I--PV----- ------ 461
1nr6 391 -K---SD--Y FMPFSAGKRM CVGEGLARME LFLFLTSILQ NFK-LQSLVE PKDL----DI TAVVNG-FVS VPP-SYQLCF I--PI----- H----- 462
MCSB12 MCSB13A MCSB13B MCSB13 MCSB13C
Figure 5-7 Identification des « blocs » conservés (MCSB) sur un alignement effectué sous Matras de 9
templates similaires à celui de la Figure 5-5 sans la structure du CYP 2C8 (1pq2) et du CYP 2C5 (1dt6) en raison
de la limitation de nombre de structures à aligner sous Matras. La numérotation des MCSBs suit la nomenclature
de P. Jean. Les structures retirées ont été choisies de façon à ne pas supprimer trop d’informations structurales : le
CYP 2C9 (1og5) et le CYP 2C5 (1nr6) figurent encore dans l’alignement. Les MCSBs correspondent aux régions
de l’alignement sans gap à l’exception du MCSB1*, où j’ai autorisé la présence d’un gap dans la structure du
P450nor (1rom). Les régions identifiées sont situées non loin des CSBs identifiés par GOK, à quelques décalages
près : elles portent en conséquence les mêmes désignations. Dans certains cas, il a fallu ajouter des numérotations,
comme pour le MCSB3 qui est en trois « blocs » ici au lieu de un dans l’alignement sur la Figure 5-5.
Un exemple de cette identification de blocs est présenté à la Figure 5-7 où la méthode

d’alignement utilisée est Matras. Les blocs identifiés sous Matras sont nommés MCSB et
correspondent aux régions de l’alignement dépourvues de gap sur l’ensemble des templates utilisés.
Les templates utilisés sont les mêmes que ceux du jeu de blocs global à 11 templates. En raison de la
limitation du serveur Matras à 10 templates12, les structures 1dt6 (CYP 2C5) et 1pq2 (CYP 2C8) ont
été écartées de l’alignement. Le choix s’est porté sur ces deux structures en raison de l’existence d’une
autre structure de CYP 2C5 (1nr6) incluse dans l’alignement structural, ainsi que la présence d’une
structure de CYP 2C9, très similaire à la structure du CYP 2C8.
En 2005, J. Mestres (Mestres, 2005) a publié un alignement séquentiel pour les P450s basés sur
leurs informations structurales. L’information de similarité structurale a été évaluée cette fois-ci par
une approche Gaussienne, implémentée par un programme maison d’alignement structural GAPS
(pour Gaussian-based Alignment of Protein Structures) (Mestres, 2000). Dans ses travaux, J. Mestres a
utilisé un total de 12 templates de P450s, dont 10 sont communs avec ceux du jeu global (à 11
templates) : cela facilite la comparaison avec notre alignement en comparant les « blocs » prélevés de
son alignement multiple aux CSBs issus de GOK. Les templates utilisés par J. Mestres sont présentés
au Tableau 5.6 et l’alignement est présenté en Figure 5-8.
Tableau 5.6 Liste des Cytochromes P450 utilisés par J. Mestres pour ses analyses (source Mestres, 2005).
CYP Classe PDB ID Résolution (Å) Date Source
101 (cam) I 1phc 1.60 31/10/1993 Pseudomonas putida

102 (bm3) II 2bmh 2.00 31/07/1994 Bascillus megaterium
107 (eryF) I 1oxa 2.10 07/12/1995 Saccharopolyspora erythraea
108 (terp) I 1cpt 2.30 31/01/1994 Pseudomonas sp.
119 I 1io7 1.50 28/02/2001 Sulfolobus solfataricus
121 I 1n40 1.06 04/02/2003 Mycobacterium tuberculosis
51 I 1e9x 2.10 01/11/2000 Mycobacterium tuberculosis
55 (nor) I 1rom 2.00 15/10/1997 Fusarium oxysporum
2C5 II 1dt6 3.00 27/09/2000 Oryctolagus cuniculus
2B4 II 1po5 1.60 07/10/2003 Oryctolagus cuniculus
2C8 II 1pq2 2.70 13/01/2004 Homo sapiens
2C9 II 1og2 2.60 17/07/2003 Homo sapiens
Note : Les classes utilisées ici, sont ceux de la nomenclature à 4 classes (cf. section 1.2.2.1, page 25)
12
Seuls 9 templates sur les 10 autorisés par le serveur Matras ont été utilisés. Une place de réserve a été laissée à
une dixième structure pouvant servir à « caler » l’alignement des templates sur la structure d’une séquence
proche de la séquence cible, ou même, celle de la séquence cible, lorsqu’elle était disponible. Je reviendrai sur ce
point ultérieurement.
Figure 5-8 Alignement séquentiel de J. Mestres, basé sur des informations de structures de 9 P450s (source
Mestres, 2005). Les noms des SSEs sont reportés au dessus des séquences et les SRS en dessous. Les
surlignements correspondent à des valeurs de RMSD inférieures à 2 Å. Les caractères en minuscule correspondent
à une valeur de RMSD > 3 Å, et en majuscule < 3 Å. Ainsi, les zones surlignées et en majuscule peuvent être
assimilées à des blocs CSBs
5.2.5.2 Résultats de la comparaison avec les autres logiciels

Globalement, un nombre similaire de blocs sont identifiés, localisés pour la plupart aux mêmes
endroits dans les séquences des templates (donc conduisant à des sous-alignements en séquences
similaires à GOK). Les principales différences sont situées au niveau de la longueur des blocs et
également dans le décalage d’une ou plusieurs séquences du sous-alignement. Aucune des méthodes
citées dans le Tableau 5.5 ne donne un même alignement global, mais il existe en revanche une
certaine tendance pour les sous-alignements des blocs : par exemple, les sous-alignements des blocs
« centraux » (CSB3, CSB6 à CSB12) présentent peu de divergence d’un logiciel à un autre. En
revanche, les blocs structuraux situés en N-terminal (CSB1* et CSB 1**), au niveau des hélices B’
(CSB2A**), F (CSB4) et G (CSB5), et en C-terminal (série des 13) sont ceux qui font l’objet de plus
d’interprétations divergentes au niveau du sous-alignement selon les méthodes utilisées.
On retrouve ces caractéristiques dans l’alignement de J. Mestres (cf. Figure 5-8). Dans ce dernier
sont indiquées les régions à forte valeur de RMSD (séquence écrite en minuscule) et les régions à
faible valeur de RMSD (séquence écrite en majuscule) qui correpondent donc à des régions
structuralement conservées, comparables aux blocs identifiés sous GOK. Ainsi, la région
correspondant au bloc CSB1* (hélice A) ne peut pas être assimilée à un bloc (RMSD > 3Å). En
revanche, la région correspondant au bloc CSB1** est trouvée pour un RMSD de moins de 3Å dans le
jeu de structures de J. Mestres, et peut donc être assimilée à un bloc, relativement court. La région
comprenant les CSB2A (boucle B–C) n’est pas identifiable dans son alignement. Il en est de même
pour les CSB correspondant aux hélices F, G et H ainsi que les régions C-terminales. On voit donc que
les blocs qui posaient des problèmes de désaccord entre les différentes méthodes, ne sont pas
assimilables à des blocs dans cet alignement. À noter que l’hélice H aussi n’est pas conservée dans cet
alignement, comme dans le cas de GAKUSA, tandis que les autres méthodes parviennent à identifier
cette hélice comme un bloc dont les sous-alignements sont assez en accord entre les différentes
méthodes.
Encore une fois, les mêmes régions, sources de désaccord, posent problème : aucune des
méthodes utilisées n’a donné le même sous-alignement pour ces régions. Pourtant, les éléments
structuraux dans ces régions semblent conservés, puisque toutes les méthodes (même celle de
J. Mestres) proposent un sous-alignement dépourvu de gap dans ces zones. Il est délicat ici de
déterminer le meilleur alignement, dans la mesure où les alignements dépendent d’algorithmes
différents.
Caliseq et les autres méthodes d’alignement 205
En conclusion, mis à part GAKUSA, les logiciels d’alignement structuraux (présenté au Tableau
5.5) permettent d’identifier les mêmes CSBs que GOK, quel que soit le descriptif utilisé pour
l’alignement de séquences. Avec environ 10 ans d’antériorité, GOK montre qu’il n’est pas contredit :
la notion de CSBs (du moins chez les P450s) est donc maintenue et valide quelle que soit la méthode
sollicitée. Ainsi, les logiciels disponibles aujourd’hui en ligne pourraient servir de méthodes
alternatives à GOK dans la détection de CSBs, notamment pour valider un sous-alignement d’un CSB
(dans le cas bien sûr où les blocs proposés sont en accord entre les méthodes, ce qui n’est pas le cas
pour certaines régions des P450s).
5.3 Caliseq et les autres méthodes d’alignement

5.3.1 Obtention des alignements par Caliseq : rappel
Une fois les blocs structuraux définis, Caliseq réalise le positionnement des sous-alignements de
ces blocs sur une séquence cible ou son pré-alignement avec des séquences homologues à fort taux
d’identité. Il est d’ailleurs préférable d’utiliser un pré-alignement de séquences à une séquence cible
unique13 : en effet, même si les séquences de ce pré-alignement sont très semblables, une variabilité
des résidus alignés à certaines positions peut exister. Cette variabilité est importante pour
l’enrichissement des profils dans le programme Caliseq. Ainsi, Caliseq ne conduit pas toujours à un
même positionnement des blocs selon qu’ils ont été alignés sur une séquence cible unique ou sur un
pré-alignement de séquences. Il est d’ailleurs intéressant de constater que les blocs dont le
positionnement diffère selon l’utilisation d’une séquence cible unique ou d’un pré-alignement,
correspondent à certains blocs précédemment cités qui étaient source de désaccord entre les différentes
méthodes d’alignement structural. Cette remarque souligne le caractère « flottant » de ces blocs.
L’étape de positionnement des blocs n’est en réalité qu’une étape préalable à l’obtention d’un
alignement multiple final, qui servira de point de départ pour la reconstruction du modèle. En effet, le
positionnement des blocs sur la séquence cible n’est qu’un alignement partiel : toute la partie inter-
bloc doit être complétée par la suite, et ce, sans information spécifique. Selon l’importance que
l’utilisateur portera sur ces régions inter-blocs, cette manipulation peut s’avérer délicate. D’ailleurs,
c’est la principale contrainte de la modélisation par blocs.
13
Sauf lors de la recherche de P450s dans les banques de séquences où les blocs sont positionnés sur une seule
séquence, permettant ainsi de déterminer (selon le score d’alignement) si elle est reconnue ou non comme un
P450. Voir la section 4.2.3.
5.3.2 Les différentes méthodes d’alignements pour la reconstruction 3D
5.3.2.1 Nomenclature
En vue de valider les alignements produits par Caliseq, on se propose de les évaluer par rapport à
des alignements produits par d’autres logiciels académiques, pouvant servir eux aussi à la
reconstruction de modèles de CYP. Pour des raisons de commodité d’explication, il convient d’établir
une nomenclature pour tous les jeux de templates, qui sera utilisée jusqu’à la fin de ce chapitre.
Chaque jeu diffère par la méthode d’alignement utilisée, méthodes qui seront présentés dans la section
suivante. La nomenclature est présentée dans le Tableau 5.7.
Tableau 5.7 Nomenclature pour désigner les jeux de templates utilisés pour construire les modèles. Pour certains logiciels (Matras ou
HHpred) il n’a pas été possible de reprendre exactement les templates de référence de la thèse (A,B,C ou D) : un sous ensemble a été alors
utilisé ou même un nouveau jeu (jeu G pour HHpred)
Jeu Correspondance Méthode Structures (ref)

d’alignement
A 6 Templates de N. Loiseau GOK (3D) / Clustalw (1D) P450eryF, P450BM3, P450cam, P450nor, P450terp, CYP 2C5
B 4 Templates de M. Cottevieille GOK (3D) / Clustalw (1D) P450eryF, P450BM3, CYP 51, CYP 2C5
C 6 Templates TA. NGUYEN GOK (3D) / Clustalw (1D) P450eryF, P450BM3, CYP 154C1, CYP 2C5, CYP 2C8, CYP 2C9
C’ 6 Templates TA. NGUYEN Matras (3D) Jeu C
D 11 Templates communs de A,B et C GOK (3D) Jeu commun de A∪B∪C
D’ 9 Templates (sous ensemble du jeu D) Matras (3D) Jeu D – {CYP 2C8}
E 28 Templates représentatifs des P450s GAKUSA (3D) P450eryF, P450BM3, P450cam, P450nor, P450terp, P450OxyC,
P450epok, P450st, P450PIKC, CYP 51, CYP 119, CYP 121,
CYP 152A1, CYP 154A1, CYP 154C1, CYP 158A2, CYP 175A1,
CYP 199A2, CYP 2A6, CYP 2B4, CYP 2C5, CYP 2C8, CYP 2C9,
CYP 2D6, CYP 3A4, CYP 8A1, CYP 2R1, CYP 1A2
F 4 Templates (sous ensemble du jeu C) HHpred (HMM) Jeu C – {CYP 2C5, CYP 2C8}
G 3 Templates (sous ensemble du jeu B) Hhpred (HMM) Jeu B – {CYP 2C5}
H 10 Templates (variante de F∪G) Hhpred (HMM) CYP 2B4, CYP 2C9, CYP 51, CYP 154C1, CYP 154 A1,
CYP 175A1, P450BS, P450BM3, P450eryF, P450terp
Note 1 : Le jeu D’ correspond au 11 templates du jeu D privé de la structure du 1pq2 (CYP 2C8) et 1dt6 (CYP 2C5) en raison
de la limitation des templates utilisables par le serveur pour produire l’alignement. Un 10ème template peut être utilisé
pour permettre l’alignement sur la séquence cible (le template pouvant être soit la structure d’une séquence proche
de la séquence cible, soit le structure de la séquence cible, lorsqu’elle est disponible)
Note 2 : Le jeu E est différent de celui présenté au Tableau 3.2, page 141. La structure du P450OxyB a été retirée car elle
comportait trop de régions non résolues.
Note 3 : Le jeu H est une variante du jeu commun F et G. Il correspond à l’union des templates de F et G et comprend
également 6 autres structures proposées par HHpred. Ce jeu H offrait la possibilité d’avoir les alignements avec tous
les templates de l’époque (2005). Il s’agit du cas où le CYP 3A4 a été soumis en requête.
5.3.2.2 Présentation des méthodes

Nombreuses sont les méthodes qui proposent un alignement de séquences permettant la
reconstruction d’un modèle, comme il a été vu dans le chapitre 2 au paragraphe 2.4. Une comparaison
exhaustive de ces méthodes n’est pas l’objet de cette thèse. Nous avons choisi les plus représentatives
du moment pour pouvoir évaluer l’alignement obtenu à la suite du positionnement des blocs par
Caliseq, en le comparant à ceux obtenus avec les autres méthodes. Parmi celles que nous avons
retenues, il y a les méthodes simples d’alignement de séquences comme Clustalw, des méthodes plus
complexes basées sur les HMM comme HHpred, et des méthodes d’alignements basées sur
l’information structurale, comme Matras. Pour tous les logiciels d’alignement, les templates de nos
jeux de blocs ont été utilisés à chaque fois que cela était possible pour comparer l’alignement par
Caliseq aux alignements effectués par les autres méthodes. Pour certains logiciels en revanche
(HHpred ou Matras), il n’a pas été possible d’utiliser la totalité des templates d’un jeu donné (jeu D’,F,
ou G) : à la place, un sous ensemble a été utilisé (respectivement, D, C, ou B), et parfois même un jeu
original a été créé (jeu G).
Le logiciel Clustalw (cf. section 2.4.2.2 sur les méthodes heuristique, à la page 92), réalise un
alignement basé exclusivement sur les informations de séquences primaires des templates. Sa grande
simplicité et son accessibilité se révèlent suffisants et adaptés pour des analyses d’évolution et de
construction d’arbres phylogénétiques.
Matras (section 2.4.3.3) correspond à une méthode d’alignement structural (à descriptif SSE) qui
fournit en résultat un alignement de séquences. L’inconvénient lors de l’utilisation de Matras est d’une
part sa limitation du nombre de structures templates utilisables pour l’alignement (10 templates au
maximum), et d’autre part l’impossibilité d’incorporer dans l’alignement la séquence cible du P450 à
reconstruire lorsque sa structure est inconnue. En effet, Matras utilise les structures disponibles dans la
PDB pour réaliser l’alignement structural, il est donc normal que la structure à modéliser n’en fasse
pas partie. Pour contourner cette contrainte, nous avons exploité l’alignement de Matras de deux
manières : i) lorsque la structure de la séquence cible (ou la structure d’une séquence vraiment proche,
à plus de 70% d’identité) était disponible, cette dernière était incorporée aux jeux C’ ou D’, au niveau
du 10ème template autorisé par le serveur14 et ii) lorsqu’aucune structure pouvant aider l’alignement sur
la séquence cible n’était disponible, des blocs (les MCSBs) ont été prélevés de l’alignement structural
de Matras des 9 templates et soumis à Caliseq. Cette deuxième manière « hybride » permet non
seulement de contourner le problème de réalignement sur la séquence cible de l’alignement structural
Matras, mais présente aussi l’avantage par rapport aux blocs provenant de GOK, d’avoir tout de suite à
disposition les alignements inter-blocs entre les templates.
14
Dans ce premier cas d’utilisation de Matras, l’alignement produit par Matras sur la séquence cible est
largement favorisé, puisque que la structure de cette dernière a été alignée structuralement avec les autres
templates
Le serveur HHpred (http://protevo.eb.tuebingen.mpg.de/hhpred ) (Söding et al., 2005) permet

d’obtenir un alignement de séquences à la suite de la soumission de la séquence cible. La méthode
d’alignement utilisée par ce seveur repose sur les HHMs. Dans cette méthode, les premières étapes
correspondent à celles d’un PSI-BLAST où les SSEs, annotés par PSIPRED à la dernière itération sont
pris en compte pour la construction d’un profil HMM. Ce profil HMM est alors confronté à ceux pré-
calculés d’une base, contenant également des informations de SSE soit prédites par PSIPRED soit
déterminées par DSSP, et permet d’identifier les séquences qui sont les plus proches de la séquence
cible requête. Après sélection des structures de références, l’alignement peut être proposé sous forme
de fichier d’entrée au programme Modeller. Il est à noter que les templates utilisés pour la recherche
de blocs structuraux sous GOK, ne sont pas forcément les premiers à sortir lors de la recherche par
HHpred : elle n’est basée que sur la similarité de la séquence, contrairement à nos templates, choisis
en fonction des ligands communs reconnus, et de la forme du site actif. Dans certains cas, nos
templates n’apparaissent pas dans les structures proposées par HHpred (la recherche a été effectuée sur
la PDB70, construite sur des structures partageant au moins 70% d’identité en séquence). Il a donc
fallu dans ces cas soit choisir une structure du même CYP mais sous un nom pdb différent (par
exemple pour le CYP 2C9, utiliser le 1ro9 à la place du 1og5, la seule différence résidant dans le
substrat co-cristallisé), soit avoir à se passer des templates non trouvés par HHpred. Ainsi, les jeux F
et G sont dérivés des jeux B et C respectivement (à un ou deux templates près, cf. Tableau 5.7) pour
rester au plus près des conditions expérimentales de GOK. Il est d’ailleurs surprenant qu’HHpred ne
propose pas la structure du CYP 2C5 ni celle du CYP 2C8 pourtant proches de celle du CYP 2C9
quelles que soient les requêtes. Le jeu H, lui, est proposé par HHpred en réponse à une requête de
CYP 3A4 et englobe non seulement les structures des jeux F et G, mais également un certain nombre
de nouvelles structures d’origine bactérienne qui n’étaient pas disponibles lorsque nous avons travaillé
avec les jeux A, B et C. Parmi les 10 structures du jeu H, 6 sont communes avec le jeu D : il s’agit des
CYP 2C9, CYP 154C1, CYP 51, P450BM3, P450terp et P450eryF. Ces templates identifiés comme
proches de la séquence du CYP 3A4 confirme le choix des templates utilisés dans les jeux A, B, C et
par conséquent D. Outre l’absence des structures du CYP 2C5 et CYP 2C8, les P450cam et P450nor ne
sont pas non plus proposés par HHpred. Ces dernières structures (P450cam et P450nor) existaient dans le
jeu historique A. Ces structures pourraient donc, si on en croit HHpred, être une source de divergence
pour tous les alignements qui les comportent. Une dernière remarque concerne la structure du CYP
2B4 : il s’agit de la forme ouverte 1po5, qui avait été exclue du jeu C lors de la recherche sur GOK,
car trop divergente. Elle se retrouve pourtant dans le jeu H proposé par HHpred. La présence de cette
structure ne devrait-elle pas compromettre la reconstruction du CYP 3A4, en dépit d’un bon
alignement multiple ?
5.3.3 Comparaison des différents alignements
Évaluer une méthode d’alignement et déterminer si elle est meilleure qu’une autre n’est pas une
tâche aisée. Il faut pour cela disposer d’un critère fiable, permettant la comparaison des alignements
entre eux. On peut considérer qu’une fois les structures connues, le bon alignement correspond à celui
qui relie au mieux la séquence à la structure quand celle-ci est connue. Ce critère doit être néanmoins
utilisé avec précaution : il a été vu précédemment que les logiciels d’alignement structuraux ne
fournissent pas toujours des résultats d’alignement en accord. Un moyen d’évaluer et de comparer les
méthodes de reconstruction consiste donc à reconstruire des modèles d’une structure connue qui
servira de référence pour la comparaison avec les modèles générés. Cette évaluation est donc
postérieure à la reconstruction. Comme cette évaluation fait l’objet d’une section ultérieure, la
comparaison des alignements dans cette section sera purement descriptive. Les alignements sont
sensibles à plusieurs paramètres : l’algorithme de la méthode et le choix des templates utilisés pour
l’alignement. Ainsi, un alignement différent peut être obtenu en ne retirant qu’une seule séquence du
jeu de templates à aligner sur la séquence cible. Différentes séquences cibles à reconstruire ont été
utilisées pour la comparaison : CYP 3A4, CYP 2C9, CYP 119, P450cam et CYP 1A2 (toutes sont
présentes dans la PDB). Ce sont les alignements sur la structure la plus emblématique de la
superfamille, le CYP 3A4 qui seront comparés dans cette section.
5.3.3.1 Caliseq : comparaison des alignements issus des différents jeux de templates
Examinons d’abord les alignements obtenus par Caliseq avec des jeux de templates différents.
Ces alignements dépendent fortement du positionnement des blocs sur la séquence cible. La première
comparaison a donc été effectuée sur les trois jeux de blocs A, B et C (cf. résultats des alignements à la
section 5.2.2.4). Cette comparaison est facilitée par le fait que chacun de ces jeux comporte au moins
deux templates en commun avec les autres jeux de blocs.
La Figure 5-3 de la page 192, présente un exemple de résultat de positionnement des trois jeux de
blocs par Caliseq sur la séquence cible CYP 3A4. Les sous-alignements, montrant déjà des
divergences, ont résulté en un désaccord sur certaines positions de blocs sur la séquence cible, lequel
entraîne un désaccord pour certaines régions inter-blocs. Les alignements séquentiels finaux diffèrent
donc par suite d’un enchaînement : au premier niveau, des décalages présents (selon le jeu choisi A, B
ou C) dans les sous-alignements lors de l’identification des blocs par GOK, entraînent au second
niveau des désaccords de positionnement de ces sous-alignements sur la séquence cible, eux-mêmes se
répercutant sur l’alignement inter-bloc.
Pour les premiers jeux historiques de templates (A, B et C), Caliseq conduit à des alignements
légèrement différents (en comparant les templates communs aux trois jeux avec la séquence cible). À
noter que pour les jeux A et B, il faut tronquer la séquence cible de 20 à 30 résidus en N-terminal
lorsque celle-ci est microsomale, afin d’améliorer le positionnement des blocs dans cette région. Les
régions conservées (au sens « d’absence de gap ») sont principalement observées au niveau des blocs.
Parmi elles, celles qui sont localisées au niveau des blocs « fiables » correspondent à des zones fixes,
retrouvées toujours aux mêmes endroits de la séquence cible sur les alignements des trois jeux. Il
existe également des régions conservées qui sont décalées d’un alignement à l’autre : ces régions
correspondent aux blocs « flous » sur lesquels aucune autre méthode d’alignement (ni Matras, ni
Clustalw) n’a été en mesure de trancher. Concernant les régions variables, elles sont généralement
localisées au niveau des zones inter-blocs. Différentes méthodes ont été essayées pour optimiser les
alignements à ces endroits (cf. section 3.3.3.2) sans pour autant donner de résultat satisfaisant : elles
ont été finalement alignées à la main, Clustalw n’étant pas en mesure de les réaliser sur des fragments
isolés et trop divergents.
Lorsque le jeu de blocs global (jeu D) a été conçu, un alignement nouveau a été observé par
rapport à ceux obtenus à partir des jeux A, B et C. De manière similaire, il existe des régions en accord
avec au moins deux des autres alignements. Comme toujours, ces régions « fixes » correspondent aux
blocs « fiables ». Concernant la partie inter-bloc, les différences sont moindres, mais cela résulte d’un
travail d’alignement manuel. Bien qu’étant nouveau, l’alignement à partir du jeu D est pourtant celui
qui présente le moins de différences avec chacun des trois autres alignements pris séparément, ce qui
est rassurant dans la mesure où les blocs de ce jeu global de templates résultent d’un compromis avec
ceux des autres jeux.
Pour la méthode « hybride » (jeu C’ ou D’) où les blocs ont été prélevés dans l’alignement
structural fourni par Matras, il existe déjà une différence dans les sous-alignements des blocs par
rapport à ceux identifiés par GOK (jeu C et D), qui se répercute ensuite sur tout l’alignement. Au final,
on n’obtient pas un même alignement que ceux produits à partir des jeux C et D. Néanmoins des
régions fixes de l’alignement sont toujours observables, localisées aux mêmes endroits de la séquence
cible que celles des alignements précédemment évoqués. Comme toujours, elles correspondent à des
régions à haute conservation structurale (bloc « fiable »).
L’alignement des 28 templates (jeu E) sur la séquence cible du CYP3 A4 n’a pas été effectué car
la structure du CYP 3A4 figure parmi ces 27 templates. En revanche, le positionnement des blocs a été
réalisé, et semble correct : dans les sous-alignements des blocs, les « morceaux » de séquence
correspondant à la structure du 1tqn (CYP 3A4) s’aligne parfaitement avec la séquence cible du CYP
3A4. Ce même constat de positionnement a été observé lorsque j’ai aligné sur une séquence cible de
P450 bactérienne, le CYP 119, dont le template correspondant est le 1io7 et également sur une autre
séquence cible de P450 microsomal, le CYP 1A2, dont le template est le 2hi4.
Pour les jeux de templates A à E alignés par Caliseq, on retiendra que des régions conservées
fixes par rapport à la séquence cible sont observées sur tous les alignements, quel que soit le jeu utilisé
(sauf le jeu E qui n’a pas été testé et qui comporte de surcroît des blocs plus longs). Ces régions
correspondent systématiquement aux blocs « fiables », déjà discutés.
5.3.3.2 Alignements obtenus par HHpred

Le serveur HHpred offre l’avantage de proposer un alignement de séquences comprenant la
séquence requête. Cette séquence requête correspond à la séquence cible dont le modèle 3D est à
reconstruire. En revanche, les alignements obtenus par ce serveur présentent beaucoup de différences,
ne serait-ce qu’entre eux, avec des jeux de templates différents (jeux F, G et H, cf. Tableau 5.7 page
206). Les alignements par HHpred sont étonnamment « aérés », résultant d’un nombre important
d’insertions de gaps au niveau des régions variables. Les mêmes régions conservées fixes sont
trouvées dans les alignements produits par HHpred. Elles sont en revanche de taille plus courte.
Comme toujours, les régions de l’alignement correspondant aux SSEs de la boucle B–C, dans les
régions des hélices F et H et dans le feuillet en C-terminal correspondent à des régions mal alignées.
En revanche, la partie correspondante à l’hélice G ne pose pas de problème dans l’alignement, sans
aucun gap sur toutes les séquences de l’alignement (aussi bien sur l’alignement des jeux F et H
montrés en annexe que sur celui du le jeu G). L’apport des structures bactériennes dans le jeu H
n’apportent rien à l’alignement d’HHpred : c’est comme si les alignements des jeux F et G n’étaient
que des sous-alignements de celui du jeu H. C’est peut être ainsi d’ailleurs que les alignements sont
obtenus : un alignement global est réalisé, donnant une multitude de sous alignements.
En changeant la séquence cible en requête, d’autres séquences templates sont proposées,

conduisant alors à un alignement inévitablement différent. Au final, il n’est pas réellement évident
d’effectuer des comparaisons d’alignement avec le logiciel HHpred, dans la mesure où les templates
utilisés changent tout le temps en fonction de la séquence requête (le logiciel cherche les templates
d’identité la plus proche de la séquence cible). Ces autres alignements réalisés à partir d’une séquence
cible différente (CYP 119, CYP 2C9, P450cam ou CYP 1A2) semblent néanmoins présenter des régions
conservées fixes (par rapport aux jeux F, H et G), qui sont placées aux mêmes endroits selon la
séquence requête demandée.
On retiendra donc pour les alignements d’HHpred que les régions conservées fixes sont les
mêmes que celles précédemment repérées sur les alignements par Caliseq à partir des jeux A, B, C, D,
C’ et D’. En changeant de séquence cible, les régions conservées « fixes » ne sont pas trop perturbées.
Par extrapolation, il est possible de penser que ces régions conservées fixes sont localisées sur tous les
P450s aux mêmes endroits. Comme ces régions conservées fixes coïncident avec les positionnements
des blocs « fiables », nous avons là un nouvel argument en faveur de l’utilisation des CSBs.
5.3.3.3 Alignements obtenus par Clustalw

L’alignement par Clustalw ne dépend que de la séquence primaire, aussi subit-il d’énormes
modifications selon les templates utilisés. Les alignements par Clustalw furent historiquement les
premiers testés pour comparer à ceux obtenus soit par SmartConsAlign, soit par Caliseq. Dans le cas
des jeux A, B ou C, un faible nombre de templates était proposé à Clustalw pour l’alignement, dont
l’identité en séquence était extrêmement basse pour envisager une reconstruction par homologie : nous
n’avions pas réellement de choix sur ces templates, car il s’agissait des seules structures alors
disponibles dans la PDB. En raison des divergences en séquence des templates, les alignements
présentaient alors de nombreux mésappariements et de désaccords entre les alignements des jeux A, B
et C. En effet, contrairement aux autres méthodes, Clustalw semble préférer les mésappariements à
l’introduction de gaps, même en diminuant le poids alloué aux ouvertures et aux extensions de gap
dans le programme. En revanche, en combinant certains paramètres de poids et en utilisant la matrice
de similarité BLOSUM30 (pour les séquences à moins de 30% d’identité), des alignements plus
proches de ceux obtenus par Caliseq sont observés, avec la présence de régions conservées plus
courtes. Comme pour Caliseq, cet alignement est très variable en N-terminal et C-terminal.
L’alignement peut être amélioré en supprimant les quelques premiers résidus 15 N-terminaux,
conduisant à une diminution des mésappariements en N-terminal lorsque peu de structures templates
sont disponibles pour l’alignement (et surtout lorsqu’elles sont majoritairement d’origine bactérienne).
Comme toujours, on note la présence de régions conservées (dépourvues de gap) au niveau central,
lorsque les bons paramètres ont été ajustés pour l’alignement, mieux positionnées par rapport à ceux
situés aux extrémités, et en accord avec celles observées dans les alignements des autres méthodes. Il
15
Cette manipulation pour améliorer l’alignement n’a été possible qu’une fois en possession des structures de la
séquence cible : l’alignement structural fournissait alors des informations sur l’alignement en N-terminale. Sans
ce dernier, dans le cas d’un cytochrome P450 inconnu, il n’est pas aisé de décider si les premiers résidus doivent
être supprimés ou non (tout dépend du nombre de templates d’origine microsomale dans les jeux d’alignement).
semblerait donc, en dépit d’une certaine variabilité, que les régions centrales, correspondant à l’hélice
I et J, soient aussi bien conservées structuralement que séquentiellement, comme il a été remarqué sur
les alignements des autres méthodes mais également celui fourni par Clustalw.
Avec les templates du jeu global (jeu D), Clustalw produit des alignements proches de ceux des
autres méthodes (aussi bien Caliseq, que des logiciels d’alignement structural) sans avoir à ajuster les
paramètres de Clustalw. L’alignement par Clustalw des 11 templates du jeu D sur la séquence cible est
nettement plus en accord avec ceux des autres méthodes que ne le sont les alignements des 4 ou 6
templates des jeux A, ou B et C respectivement. Il existe toujours des désaccords dans les
appariements en N- et C-terminal et dans certaines régions correspondant aux SSE des hélices B’, F et
G.
Enfin, avec un jeu de tous les templates disponibles de P450s (jeu E), un alignement
étonnamment « propre » est observable, en accord avec les alignements structuraux et permettant de
bien séparer les séquences de templates d’origine bactérienne des séquences de templates d’origine
microsomale. Cet alignement (jeu E) est légèrement différent de ceux qu’on pourrait obtenir par
Caliseq, mais plus en accord avec ceux des autres méthodes comme Matras ou HHpred par exemple.
Un tel résultat est assez choquant, et remet en question le travail d’alignement par Caliseq : à quoi bon
développer une méthode aussi complexe lorsqu’un simple alignement par Clustalw fournit un
alignement plus proche de ceux obtenus par des logiciels d’alignement structuraux ? Une hypothèse a
été formulée : la qualité de cet alignement fourni par Clustalw résulte en fait du nombre important de
templates utilisés (actuellement disponibles dans la PDB). Ce nombre a augmenté rapidement ces cinq
dernières années (cf. Figure 1-14, page 39). L’alignement Clustalw remet en question l’intérêt de
l’outil spécifique pour l’alignement à bas taux d’identité.
Afin de confirmer cette hypothèse, la manipulation suivante a été opérée : plusieurs alignements
ont été réalisés itérativement sous Clustalw (dans son fonctionnement par défaut), avec le jeu de 28
templates, où des séquences sont chaque fois retirées de façon aléatoire. Après quelques itérations, le
nombre de séquences retirées est augmenté, et le processus d’alignement itératif, relancé. J’ai procédé
ainsi jusqu’à observation d’un changement radical dans l’alignement. L’idée de cette manipulation est
de connaître le nombre minimal de séquences nécessaire pour l’obtention d’un alignement de
séquences proche de l’alignement structural. Comme je l’ai fait remarquer précédemment, pour
chaque suppression de séquences de templates, un léger changement dans l’alignement est observé.
Celui-ci est d’ailleurs plus important lorsque la séquence retirée correspond à certaines structures de
P450 d’origine bactérienne. Il semblerait selon cette observation que c’est la présence de structures
issues de mammifère qui imposeraient une certaine pression sur l’alignement. Néanmoins, au fur et à
mesure que des templates sont retirés, il est possible d’observer l’évolution des alignements par
Clustalw. Il fut très difficile de délimiter un seuil minimal, sachant que la comparaison d’alignement
est relativement difficile : à quel moment dit-on qu’un alignement est différent du précédent ? J’ai dû
faire le choix de considérer que l’alignement devenait réellement différent lorsque les régions censées
conservées n’étaient plus homogènes avec celles observées sur les alignements structuraux. Selon ce
critère, les alignements des P450s ne semblent pas fiables à moins de huit templates. C’est d’ailleurs
pour cette raison qu’avec le jeu global (jeu D) aucun paramétrage de Clustalw n’a été nécessaire pour
proposer un alignement relativement proche de ceux des autres méthodes.
5.3.3.4 Alignements obtenus par Matras

Pour Matras, deux approches ont été testées. Pour la première approche, l’alignement structural
comporte non seulement les templates, mais aussi la structure de la séquence cible à reconstruire. En
procédant ainsi, il semble évident que l’alignement obtenu est largement favorisé par rapport aux
autres méthodes dans la mesure où Matras utilise l’information structurale. Dans l’alignement proposé
par Matras sur la structure 1tqn du CYP 3A4, environ 80% de l’alignement correspondent à des
régions conservées, à savoir des régions dépourvues de gap. En revanche, dans les régions variables
(en N-terminal principalement) un nombre important de gaps est observé dans l’alignement. À noter
que la suppression ou le remplacement d’un template par un autre n’entraînent qu’une légère
modification, principalement sur la taille des régions conservées : ainsi, contrairement aux alignements
séquentiels, les alignements structuraux semblent mieux préservés (du moins avec cette méthode pour
la famille des P450s) reflétant la caractéristique de repliement commun de cet enzyme. Les différences
entre les alignements obtenus de cette première approche par Matras et ceux par Caliseq sont les
mêmes que ceux déjà décrits pour la différence entre les blocs (cf. section 5.2.5.2).
La première méthode n’est pas applicable lorsque la séquence à modéliser est de structure
inconnue. Lorsqu’aucun template n’est proche en identité de la séquence à modéliser, il s’avère
difficile d’exploiter l’alignement des templates obtenus par Matras. C’est ainsi que j’ai eu l’idée
d’utiliser les régions conservées dans l’alignement de Matras comme des blocs, que j’ai positionnés
sur la séquence cible à l’aide de Caliseq. Il s’agit donc d’une méthode « hybride » utilisant
l’information structurale fournie par Matras et l’alignement par profils réalisé par Caliseq. Une
expérience intéressante a consisté justement à comparer l’alignement obtenu par la méthode
« hybride » avec celui obtenu uniquement par Matras, lorsque la structure de la séquence cible est
disponible (pour le cas du CYP 3A4 par exemple, j’ai pris la structure d’1tqn). Pour cela, après avoir
aligné les structures templates (jeu D’) avec la structure du CYP 3A4 (1tqn), les « blocs
d’alignement » des régions conservées ont été récupérés pour être positionnés par Caliseq, en
supprimant préalablement les séquences du 1tqn de tous les sous-alignements. Les différences de
positionnements des « MCSB » par les deux logiciels sont montrées en Figure 5-9.
Les différences de positionnements des MCSBs ne sont pas nombreuses. En considérant que
Matras fourni un alignement structural fiable, sur les 18 MCSBs Caliseq ne s’est trompé que sur 4 :
deux d’entres eux sont en C-terminal et ne correspondent pas à des décalages significatifs, en revanche,
les deux autres (MCSB2A* et MCSB4) ne sont pas du tout bien positionnés. À noter que les blocs en
N-terminal n’ont pas été identifiés par l’alignement de Matras comme régions conservées. Du fait des
décalages sur le positionnement de ces blocs initiaux, il y a donc également quelques décalages dans
l’alignement global, principalement aux niveaux des régions inter-blocs. Enfin, comme les MCSBs ne
correspondent pas tout à fait aux CSBs identifiés par GOK, au niveau des sous-alignements,
l’alignement par la méthode « hybride » diffère légèrement de ceux obtenus par Caliseq avec le jeu D.
CYP3A4(c) 1 MALIPDLAME TWLLLAVSLV LLYLYGTHSH GLFKKLGIPG PTPLPFLGNI LSYHKGFCMF DMECHKKYGK VWGFYDGQQP 80

CYP3A4(m) 1 MALIPDLAME TWLLLAVSLV LLYLYGTHSH GLFKKLGIPG PTPLPFLGNI LSYHKGFCMF DMECHKKYGK VWGFYDGQQP 80
MCSB1* MCSB1**
CYP3A4(c) 81 VLAITDPDMI KTVLVKECYS VFTNRRPFGP VGFMKSAISI AEDEEWKRLR SLLSPTFTSG KLKEMVPIIA QYGDVLVRNL 160
CYP3A4(m) 81 VLAITDPDMI KTVLVKECYS VFTNRRPFGP VGFMKSAISI AEDEEWKRLR SLLSPTFTSG KLKEMVPIIA QYGDVLVRNL 160
MCSB1 MCSB2A* MCSB2A** MCSB2A MCSB2B
CYP3A4(c) 161 RREAETGKPV TLKDVFGAYS MDVITSTSFG VNIDSLNNPQ DPFVENTKKL LRFDFLDPFF LSITVFPFLI PILEVLNICV 240
CYP3A4(m) 161 RREAETGKPV TLKDVFGAYS MDVITSTSFG VNIDSLNNPQ DPFVENTKKL LRFDFLDPFF LSITVFPFLI PILEVLNICV 240
MCSB3A MCSB3B MCSB3C MCSB4
CYP3A4(c) 241 FPREVTNFLR KSVKRMKESR LEDTQKHRVD FLQLMIDSQN SKETESHKAL SDLELVAQSI IFIFAGYETT SSVLSFIMYE 320
CYP3A4(m) 241 FPREVTNFLR KSVKRMKESR LEDTQKHRVD FLQLMIDSQN SKETESHKAL SDLELVAQSI IFIFAGYETT SSVLSFIMYE 320
MCSB5 MCSB6 MCSB7
CYP3A4(c) 321 LATHPDVQQK LQEEIDAVLP NKAPPTYDTV LQMEYLDMVV NETLRLFPIA MRLERVCKKD VEINGMFIPK GWVVMIPSYA 400
CYP3A4(m) 321 LATHPDVQQK LQEEIDAVLP NKAPPTYDTV LQMEYLDMVV NETLRLFPIA MRLERVCKKD VEINGMFIPK GWVVMIPSYA 400
MCSB8 MCSB9 MCSB10
CYP3A4(c) 401 LHRDPKYWTE PEKFLPERFS KKNKDNIDPY IYTPFGSGPR NCIGMRFALM NMKLALIRVL QNFSFKPCKE TQIPLKLSLG 480
CYP3A4(m) 401 LHRDPKYWTE PEKFLPERFS KKNKDNIDPY IYTPFGSGPR NCIGMRFALM NMKLALIRVL QNFSFKPCKE TQIPLKLSLG 480
MCSB11 MCSB12 MCSB13A MCSB13B
CYP3A4(c) 481 GLLQPEKPVV LKVESRDGTV SGA 503

CYP3A4(m) 481 GLLQPEKPVV LKVESRDGTV SGA 503
MCSB13C MCSB13
Figure 5-9 Positionnement des MCSBs sur la séquence du CYP 3A4 par Caliseq (c) et par Matras (m). Dans
cet alignement, quatre blocs sont en désaccord, dont deux importants : MCSB2A* et MCSB4 correspondant aux
SSE B’ et F respectivement.
5.3.4 Bilan de la comparaison
Comparer les alignements provenant de différentes méthodes a été assez délicat, surtout pour
juger de la fiabilité relative de chaque alignement, étant donné qu’ils sont tous différents. A priori, les
alignements structuraux sont censés être les plus « fiables » selon les concepts de la biologie
structurale. Néanmoins, comme il a été vu précédemment, les alignements structuraux – qu’ils soient
multiples ou « pairwise » – dépendent énormément de la méthode utilisée ainsi que des paramètres
choisis par l’utilisateur. Ainsi, aucune des méthodes utilisées n’a donné exactement le même
alignement. De ce fait, il est difficile de savoir réellement la place occupée par Caliseq parmi les
autres méthodes à la seule vue de l’alignement. Seule la reconstruction d’un modèle peut aider à
déterminer si Caliseq produit des alignements de qualité.
En revanche, pour chaque méthode, des régions conservées fixes et des régions variables sont
observées dans les alignements, quelle que soit la nature de la méthode, aussi bien séquentielle que
structurale. Il existe également des régions que j’appellerai « semi-conservées », à savoir celles ne
présentant aucun gap dans l’alignement, mais jamais positionnées à un même endroit selon les
alignements (généralement un décalage de quelques résidus) : elles correspondent aux SSE des
boucles B’, F, G et la boucle B–C et le feuillet en C-terminale. Dans tous les alignements, ces trois
types de régions sont observés, quelle que soit la nature de la méthode. Elles semblent d’ailleurs
renseigner sur les propriétés structurales des P450s. En effet, les régions « semi-conservées », celles
qui ont posé problème à la fois pour leur identification structurale et leur positionnement, se situent
dans des régions SRS identifiées par Gotoh en 1992 (cf. Figure 1-18 de la page 44) : SRS-1, SRS-2,
SRS-3 et SRS-6, correspondant respectivement aux hélices B’, F, G et au feuillet C-terminal. Sur la
structure des P450s, ces SSEs bordent la cavité du site actif16. Dans la littérature, ces SSEs de P450 ont
été décrits comme super variables : l’hélice B’ par exemple, supposée flexible pour laisser passer les
substrats, a été observée aussi bien structurée que déstructurée (Poulos et al., 1987). Il n’est pas
surprenant que séquentiellement, des problèmes de positionnement apparaissent dans ces régions. La
bonne nouvelle concerne les régions « vraiment » conservées dans tous les alignements qui reflètent
bien cette caractéristique de conservation de repliement sur toutes les structures de CYP. Celles-ci ont
bien été identifiées dans les alignements par Caliseq, Matras, et HHpred à un niveau moindre, et
16
En fait, ce n’est pas exactement le feuillet 3 qui borde le site actif, mais plutôt la structure en « beta hairpin ».
Il s’agit du coude plus ou moins long selon des P450s qui est formé par les deux brins β4 antiparallèles et relié à
la base par le feuillet 3
Construction de modèles de P450s, quelle méthode adopter ? 217
difficilement sous Clustalw, sauf pour ce dernier en augmentant le nombre de séquences dans
l’alignement.
5.4 Construction de modèles de P450s, quelle méthode adopter ?

5.4.1 Comparaison des modèles reconstruits à une structure connue :
CYP 3A4 (1tqn)
En dessous de 30% d’identité en séquence, la modélisation comparative n’est pas la méthode la

plus adaptée pour construire un modèle (cf. Figure 2-19 de la page 113) et on lui préfère généralement
les méthodes d’enfilage ou « threading » (cf. section 2.5.2). Par certains aspects, la méthode de
reconstruction par blocs structuraux conservés est proche des concepts des méthodes d’enfilage, dans
la mesure où un squelette protéique est créé à partir des blocs, et où les parties inter-blocs sont
construites sans information a priori, et donc de façon ab initio. Cependant, dans la méthodologie
développée au laboratoire pour reconstruire les P450s à faible identité en séquence, ce n’est pas une
banque de repliements qui est utilisée pour générer la structure du squelette peptidique mais des
structures de P450s homologues structuralement, qu’on impose comme templates. Le modèle est
reconstruit alors à la manière d’une modélisation par homologie. Il s’agirait donc d’une méthode
« hybride » entre l’enfilage et la modélisation comparative, du moins pour le cas de protéines à
repliement extrêmement conservé. Pour confirmer ces dires, l’idée a consisté ici aussi à comparer
notre méthode à différentes méthodes existantes. À la manière du concours CASP, les modèles des
séquences cibles sont évalués par rapport à la structure connue des séquences cibles utilisées. J’ai
choisi ici le critère de RMSD pour la comparaison entre les structures et les modèles. Plusieurs tests de
comparaison ont été effectués, à la fois sur des CYPs d’origine bactérienne (P450cam, CYP 119) et sur
des CYPs d’origine microsomale (CYP 2C9, CYP 1A2, CYP 3A4). Les résultats étant relativement en
accord, je ne présenterai ici que les résultats de comparaison pour les meilleurs modèles du CYP 3A4
(selon les critères d’évaluation de ProsaII, Anolea, ProQ, et de la fonction objective de Modeller), dont
les premières structures sont apparues au début de ma thèse (cf. Tableau 5.8)
Tableau 5.8 Comparaison des modèles de CYP 3A4, construits selon différentes méthodes. Le RMSD a été calculé par rapport au
squelette peptidique de la structure X (1tqn) par le logiciel Profit. Pour les modèles générés à partir de notre stratégie, un RMSD au niveau
des blocs a été également calculé. Le modèle par le serveur SwissModel n’a pas pu être obtenu car son logiciel d’alignement n’était pas en
mesure d’aligner les structures imposées au programme. Modeller n’a pas pu construire le modèle Clustalw avec le jeu C en raison
également d’un alignement trop mauvais. Pour le dernier cas, on a utilisé des blocs tirés de l’alignement structural de Matras. Pour HHpred,
un psi-blast est utilisé : il n’a pas toujours été possible d’utiliser tous les templates d’un jeu donné.
RMSD (Å)
Nombre de Sur la base
Année Modèle RMSD (Å) au niveau
templates du jeu
des blocs
2002 Ancienne stratégie 6 A 5,83 4.95

2004 Clustalw 6 C échec -
2004 Nouvelle stratégie 6 C 5,06 4.09
2004 Nouvelle stratégie 6 C’ 6,76 6.04
2005 Clustalw 6 A 9,70 -
2005 Clustalw 4 B 7,59 -
2005 Nouvelle stratégie 4 B 3,53 3.28
2005 HHpred 4 F 5,14 -
2005 HHpred 3 G 5,53 -
2005 HHpred 10 H 5,04 -
2005 SwissModel 6 C échec -
2006 Nouvelle stratégie 11 D 4,19 3.83
2006 Clustalw 11 D 4,31 -
2007 Sybyl 2 - 7,30 -
2007 Sybyl 12 - 9,99 -
2007 Matras 10 D 3,33 -
2007 Nouvelle stratégie 10 D' 5,07 4.50
Ancienne stratégie : CSBs + SmartConsAlign + Dyana/Xplor

Nouvelle stratégie : CSBs + Caliseq + Modeller
ClustalW : Clustalw + Modeller
HHPred : HHpred + Modeller
SwissModel : Serveur
Matras : Matras (avec 1tqn.pdb en template) + Modeller
Sybyl : Fugue/Orchestrar + Composer
Le Tableau 5.8 retrace l’historique des principaux modèles construits au cours de ma thèse pour la
construction du CYP 3A4. La structure de ce cytochrome P450 ayant été publiée pendant ma première
année de thèse, les expériences de modélisation avaient pour but unique de valider la méthode mise au
point au laboratoire. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour le comparatif : l’une d’elle est une
version améliorée des méthodes d’enfilage (Fugue/Orchestrar), une autre correspond à un serveur
automatique de reconstruction (SwissModel), mais la plupart des méthodes propose uniquement des
alignements, qui nécessitent l’utilisation du logiciel Modeller pour la reconstruction 3D. Ces dernières
sont celles présentés à la section précédente. Concernant la méthode Fugue/Orchestrar, il s’agit d’une
méthode très proche de notre méthode dans sa façon de construire les modèles, puisque Fugue effectue
d’abord une recherche sur la base HOMSTRAD des structures qui serviront de templates, en
comparant pour cela la séquence cible (ou un pré-alignement cible) à des profils structuraux de chaque
famille dans la banque de données. Orchestrar, une suite d’applications, prend ensuite le relais,
commence à déterminer les régions structuralement conservées entre les templates et la séquence cible
et construit le modèle (uniquement le squelette peptidique) en fonction de ces informations. Les
boucles sont ensuite reconstruites à partir d’une banque de repliement et les chaînes latérales sont
enfin ajoutées en accord avec une banque de rotamères. Cette méthode ressemble beaucoup à la
méthode de reconstruction utilisée au laboratoire par N. Loiseau et M. Cottevieille.
Les RMSDs ont été calculés en utilisant l’algorithme de McLachlan (McLachlan, 1982) par le
logiciel Profit (Martin, A.C.R., http://www.bioinf.org.uk/software/profit/), sur les atomes du squelette
peptidique pour centrer la comparaison sur les repliements. Ainsi, pour le CYP 3A4, aucune méthode
n’a pu produire de modèle à moins de 3 Å de la structure 1tqn utilisée. Il faut néanmoins garder en
mémoire que pour deux structures d’une même isoforme, une différence de RMSD existe. Ainsi, rien
qu’en comparant la structure nue du CYP 3A4 (1tqn) avec une structure disposant d’un substrat
comme l’érythromycine (2j0d) ou le ketaconazole (2v0m), des RMSD de 1,21 et 1,74 Å
respectivement sont observés. Plus impressionnant encore, le RMSD entre la conformation fermée
(1suo) et la conformation ouverte (1po5) du CYP 2B4 est trouvé à 5,53 Å montrant l’énorme
flexibilité de la molécule. De ce fait, une différence de 0,5 à 1 Å pour les modèles n’est pas réellement
significative, et peut être considérée comme un bruit de fond.
Ainsi, un modèle proche de 3 Å de RMSD peut être considéré comme un modèle relativement
correct. De tous les modèles produits, seuls ceux obtenus par Matras (avec utilisation de la séquence
d’1tqn pour guider l’alignement structural ce qui introduit le biais en faveur de Matras) et par la
nouvelle méthode de reconstruction (combinaison de GOK, Caliseq et Modeller) avec les templates de
M. Cottevieille (jeu B) s’en approchent le plus, avec respectivement des RMSDs de 3,33 Å et 3,58 Å.
Ce dernier constat est plutôt surprenant dans la mesure où le jeu B comporte peu de templates. Les
plus « mauvais » modèles ont été obtenus par Sybyl, selon la méthode Fugue/Orchestrar, avec des
RMSD de 7,30 Å à 9,99 Å. Les méthodes « hybrides » (C’ et D’) n’ont pas donné d’excellents
modèles non plus, avec 6,76 Å et 5,07 Å respectivement. À noter qu’une légère amélioration du
modèle est perceptible lors de l’utilisation d’un nombre plus important de templates dans l’alignement.
Aucun modèle de CYP 3A4 n’a été obtenu par le serveur SwissModel en raison des templates
imposés au serveur (ceux du jeu C) : SwissModel n’était pas en mesure d’aligner les templates fournis.
Toutefois, ce résultat doit être considéré avec précaution : il n’est désormais plus possible d’imposer
ses propres templates sur le serveur. Par ailleurs, il n’est plus possible d’utiliser ce programme à des
fins de comparaison avec notre méthode dans la mesure où il imposera forcément la structure de la
séquence cible (1tqn dans le cas du CYP 3A4) dans son alignement.
À l’image des modèles obtenus par Fugue/Orchestrar, les alignements de Clustalw conduisent à
de mauvais modèles lorsque peu de templates sont utilisés (jeu B et C, avec respectivement 4 et 6
templates dans chaque jeu). Dans un cas notamment (lors de l’utilisation des templates du jeu C)
Modeller n’a pas réussi à produire de modèle tant les distances entre les résidus des séquences de
l’alignement étaient importantes, et ce en raison d’un mauvais alignement. En revanche, avec un
nombre de templates plus important, une amélioration notable du modèle est observée, à peu près
équivalent (voire sensiblement meilleur) au modèle obtenu par l’alignement effectué par Caliseq avec
le même nombre de templates.
Justement, qu’en est-il des modèles produits par la méthode de reconstruction à bas taux d’identité
développée au laboratoire ? Le modèle obtenu par N. Loiseau avec l’ancienne méthode (Combinaison
de GOK, SmartConsAlign et Dyana/X-plor) a un RMSD plutôt élevé (5,83 Å) par rapport à la vraie
structure du CYP 3A4 lorsqu’il est calculé sur toute la longueur de l’enzyme, et descend à 4,95 Å, soit
un gain de près de 1 Å lorsque le RMSD n’est calculé qu’au niveau des CSBs. Cette observation
souligne le fait que la reconstruction des régions inter-blocs posait déjà un sérieux problème et n’était
pas si bien résolue par le recuit simulé opéré par Xplor. Concernant les modèles obtenus par la
nouvelle méthode (combinaison GOK, Caliseq et Modeller), outre le modèle produit à partir du jeu B,
les RMSDs semblent corrects, situés aux alentours de 4-5 Å. Au niveau des blocs, un gain de 1 Å
environ est aussi observé.
Pour des jeux de templates plus réduits, HHpred donne également des modèles assez proches de
ceux obtenus par notre méthode, aux alentours de 5 Å.
5.4.2 Choix de la méthode idéale ?
5.4.2.1 Discussion et évaluation

Pour toutes les méthodes, les RMSDs semblent fluctuer énormément en fonction des templates
utilisés : typiquement, les modèles du CYP 3A4 semblent moins bons que lorsque les templates sont
dérivés du jeu C (jeux C et F) alors qu’ils ont tendance à s’améliorer lorsque des dérivés du jeu B sont
utilisés (jeux B et G) : cela est observé aussi bien sur la nouvelle méthode que sur Clustalw ou HHpred.
Ce constat va à l’encontre des idées que j’avais eues lors des choix de mon jeu de templates. En effet,
dans le jeu C, j’avais mis autant de structures issues de P450s bactériens que de structures issues de
P450s microsomaux. Je pensais alors que les structures de P450s microsomaux m’aideraient à me
rapprocher de la structure du CYP 3A4. Par ailleurs, même si les résultats ne sont pas montrés dans ce
manuscrit, le jeu C est celui qui a donné les plus mauvais modèles avec les autres tests (P450cam, CYP
119, CYP 1A2) excepté le modèle du CYP 2C9. Une explication probable est la présence en nombre
trop important de templates de la famille des 2C dans ce jeu, qui orienterait toutes les reconstructions
vers un modèle proche des structures de CYP de la famille 2C. En revanche, cette information pourrait
être diluée lorsque d’autres templates sont ajoutés au jeu, comme dans le cas du jeu global D.
Les alignements proposés par Clustalw et par Caliseq, desquels dépend la reconstruction du
modèle, sont d’ailleurs meilleurs avec un nombre de templates plus important dans l’alignement
(chose qui avait été déjà démontré pour Clustalw) : un gain d’au moins 1 Å est observé ainsi. En outre,
les imprécisions de reconstruction des régions inter-blocs semblent également s’amoindrir avec la
nouvelle méthode et lorsque le nombre de templates est plus important. En dépit des problèmes
rencontrés pour aligner les régions inter-blocs, il s’avère au final que Modeller est parvenu à
« corriger » les régions approximativement alignées en partie inter-bloc. Ainsi, toutes les méthodes
visant à optimiser l’alignement inter-bloc n’ont finalement pas été exploitées comme évoqué plus haut,
et les méthodes visant à optimiser structuralement les parties inter-blocs, comme la méthode de
minimisation par blocs développée par K. Zimmermann ou la reconstruction ab initio de boucles par
Modeller, non plus. Dans aucun cas, ces dernières méthodes n’ont permis de diminuer le RMSD du
modèle à la structure 1tqn du CYP 3A4.
Il est difficile d’expliquer en revanche le bon RMSD attribué au modèle issu de la nouvelle
méthode à partir du jeu B qui n’a nécessité qu’un alignement inter-bloc manuel. Est-ce en raison du
nombre de blocs plus important dans ce jeu, ou encore de la nature des templates utilisés dans ce jeu ?
Nous n’avons pour le moment pas d’explication à proposer (à noter que ce même alignement produit
des modèles de qualité reproductible, avec une variation de quelques dixièmes d’Angström).
Partant d’un bon concept, Fugue/Orchestrar n’a pu fournir de modèles réellement convaincants.
Le principal problème est survenu lors du choix des templates proposés par Fugue : le logiciel
conseillait de ne prendre que deux structures (d’origine bactérienne qui plus est) pour pouvoir par la
suite identifier les régions structuralement conservés (nommé SCR dans le programme). À la place j’ai
imposé au programme le jeu des 12 templates disponibles dans le programme pour un essai de
reconstruction du CYP 3A4. Autant les SCRs ont été simples à identifier pour Orchestrar dans le jeu
de 2 templates, autant le programme a eu du mal pour le jeu des 12 templates. Cela s’est ressenti lors
de la production du modèle : un modèle déstructuré à 9,99 Å de la véritable structure du CYP3A4.
Une cause possible peut être liée à la banque de structure HOMSTRAD, peut être trop obsolète.
Néanmoins, je doute qu’avec plus de structures le programme ne s’en serait mieux sorti, étant donné
les difficultés qu’il a eues pour identifier des SCRs sur les 12 templates.
Le serveur HHpred qui fournit des alignements pour Modeller a généré des modèles de qualité
moindre que ceux générés par notre méthode, avec moins de templates. Il nécessite également moins
de manipulations pour le modélisateur. Néanmoins, les templates utilisés n’ont pas été nécessairement
les mêmes que ceux utilisés dans notre méthode. Parmi les templates utilisés, surtout pour le jeu H, de
nombreuses structures n’étaient pas disponibles lors de l’analyse sous GOK. Idéalement, il aurait fallu
refaire une analyse GOK avec les templates du jeu H pour pouvoir réellement comparer les modèles.
5.4.2.2 Verdict
Au final, quelle serait la méthode la plus adaptée pour la reconstruction d’un CYP inconnue à
basse identité de séquence ? En fait, tout dépend du moment de la reconstruction sur l’échelle de
temps. Il semble évident qu’à ce jour, le nombre de templates disponibles dans la PDB est tel qu’un
alignement simple sous Clustalw permet de produire des modèles convenables et meilleurs que ceux
qu’on pourrait obtenir avec un enfilage. HHpred semble être également un bon candidat dans la
mesure où les modèles obtenus sont généralement de qualité constante quel que soit le nombre de
templates utilisés. D’autant plus qu’HHpred fournit directement le fichier d’alignement pour Modeller.
En revanche, lorsque peu de structures sont disponibles et donc exploitables en tant que templates, il
semblerait bien qu’HHpred et la méthodologie mise au point au laboratoire soient à égalité. HHpred
serait plus rapide et moins complexe d’utilisation. Néanmoins, il n’est pas sûr que l’alignement produit
avec moins de templates soit aussi fiable : celui-ci dépend du profil HHM qui a été calculé en prenant
en compte toutes les séquences des structures de P450s disponibles au moment où j’ai effectué le test
de comparaison. En bref, la nouvelle méthode semble aujourd’hui un peu dépassée, mais demeure
probablement une bonne méthode de reconstruction par homologie à basse identité de séquence, et
lorsque les templates disponibles sont en nombre limité. Pour vérifier cette hypothèse, il faudrait donc
dans l’idéal expérimenter la méthode sur une autre famille de protéines à repliement très conservé.
Vers l’obtention d’une banque de P450s 223
5.5 Vers l’obtention d’une banque de P450s

5.5.1 Données initiales
5.5.1.1 Les CSBs, un nouveau critère de sélection

Nous avons signalé que l’information de repliement conservé des P450s contenue dans les CSBs
pouvait être exploitée pour la reconstruction de modèles 3D de CYPs inconnus. Il était alors
intéressant de savoir si cette information pouvait également servir de « signature » structurale pour
identifier spécifiquement les P450s dans des banques de données ou des génomes nouvellement
séquencés. L’utilisation des CSBs dans la génomique exploratoire n’a nécessité qu’une légère
modification du programme Caliseq, lui offrant ainsi la possibilité de positionner les blocs sur toutes
les séquences d’un fichier qui correspond à une banque de séquences. Grâce au score d’alignement
pour chaque séquence et à un seuil défini, Caliseq détermine si la séquence testée appartient à la
superfamille des P450s. Ainsi, en traitant toute une banque de séquences, une banque spécifique de
P450s peut en être extraite et exploitée : combinée avec notre méthode de reconstruction, il serait
envisageable d’obtenir une banque de sites actifs pour des études d’arrimage par exemple.
5.5.1.2 Méthodes déjà existantes de sélection des P450s

Il existe de nombreuses ressources dédiées aux CYPs sur Internet, comme par exemple « the
Cytochrome P450 Homepage » (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html), « the P450
Knowledgebase » (http://cpd.ibmh.msk.su/) (Lisitsa et al., 2001), « the Arabidopsis P450 database »
(http://www.p450.kvl.dk/), « the Insect P450 Site » (http://p450.antibes.inra.fr/) etc. Étonnamment,
aucune banque globale de P450s (de séquences ou de structures) n’a été mise au point. Pourtant les
outils ne manquent pas : un certain nombre de méthodes existent déjà permettant d’attribuer le
caractère « P450 » à une séquence donnée. Parmi ces méthodes, deux nous parraissent intéressantes :
celles utilisées par Prosite et Pfam.
Ainsi, Prosite (cf. section 2.3.4.1) est une base construite sur une méthode qui reconnaît un motif
(ou pattern) particulier présent sur la séquence des protéines. Dans le cas des P450s, ce motif est
appelé « Cytochrome P450 cysteine heme-iron signature ». Pfam (cf. section 2.3.4.3) est une banque
de domaines. Dans cette base, les domaines de P450 correspondent à des alignements de P450s, codés
dans des profils HMM. Par commodité, je ferai dans la suite de ce chapitre l’amalgame entre le nom
de la base et la méthode associée.
J’ai utilisé ces deux méthodes pour construire des bases spécifiques de séquences de P450s qui me
serviront d’éléments de comparaison avec la base que j’ai construite avec Caliseq et un jeu de blocs.
Pour les trois méthodes à comparer, les banques de P450s sont obtenues à partir des bases de
séquences SptrEmbl (supposées non redondantes) de 2005 et de 2007. À noter que les premiers essais
de Caliseq avec l’ancien système de score ont été opérés sur la base de 2005, tandis que le nouveau
score a été expérimenté sur la dernière version 2007 de SptrEmbl. Le nombre de séquences de P450s
identifiées par les deux méthodes sur les bases de séquences SptrEmbl2005 et SptrEmbl2007, est
présenté en Tableau 5.9
Tableau 5.9 Nombre de séquences de P450s identifiées sur SptrEmbl par Pfam et Prosite.
Nombre de séquences Nombre de CYPs Nombre de CYPs
Année
dans SptrEmbl identifiés par Pfam1 identifiés par Prosite2
2005 2345429 5166 3392

2007 3169275 6478 4859
1
les données de Pfam ont été récupérées à partir d’un unique fichier SptrEmblPfam distribué par Pfam
2
les données de Prosite ont été récupérées à partir de deux fichiers (uniprot_swissprot et uniprot_trEmbl) distribuées par la banque Uniprot
À première vue, la méthode Pfam permet d’identifier plus de P450s que la méthode Prosite. En
revanche, entre 2005 et 2007, Prosite semble avoir subi une légère amélioration : alors que Pfam
identifie 1312 nouvelles séquences, Prosite en identifie 1487. La différence, soit 175 séquences,
correspond aussi bien à des nouvelles séquences dans SptrEmbl2007 que Pfam n’a pas identifiées,
mais également des séquences préexistantes dans SptrEmbl2005, présentes dans Pfam et que Prosite
n’avait pas identifiées à l’époque. En réalité, il semblerait qu’entre ces deux années, l’algorithme de
Prosite ait légèrement évolué, et la sélection ne se fait plus exclusivement sur un motif séquentiel.
5.5.2 Création des bases de P450s par Caliseq
Caliseq a été lancé sur les deux bases SptrEmbl2005 et SptrEmbl2007, en faisant varier à chaque
essai un paramètre différent : l’idée était alors de déterminer les paramètres idéaux pour la détection de
séquences de P450. Chaque criblage sur banque complète par Caliseq prend environ une heure de
calcul17. Ces résultats sont montrés au Tableau 5.10.
17
La mesure a été réalisée en utilisant seulement un processeur Xeon 3 Ghz d’un seul nœud d’un cluster de PC.
5.5.2.1 Processus d’obtention du paramétrage optimal

Les paramètres optimaux ont été affinés de la manière suivante : chaque fois qu’une valeur de
paramètre a permis d’obtenir un résultat jugé convenable, il était conservé pour faire varier un autre
paramètre et ainsi de suite. De faibles incréments du paramètre ont été choisis pour l’exploration. Il
s’avère que les résultats sont peu sensibles dans une certaine zone (pas d’augmentation ou de
diminution significative du nombre de séquences récupérées), et basculent rapidement dès qu’un
certain seuil est franchi. Durant cette phase de recherche, j’ai choisi de favoriser les faux négatifs par
rapport aux faux positifs pour la banque de P450s : le choix qui a été privilégié était de ne pas détecter
des séquences de P450s plutôt que d’attribuer une séquence en tant que P450 alors qu’elle ne l’est pas.
5.5.2.2 Évolution du ratio T

La détermination du seuil d’indentification de P450 par Caliseq a évolué au cours de la thèse.
Ainsi, dans les premiers essais sur la SptrEmbl2005, le seuil de sélection reposait sur un ratio (cf.
section 4.3.2.1), que j’ai appelé T. Dans les premiers criblages, j’ai fait évoluer T d’une valeur de 0,05
à 0,40 par pas de 0,05. Selon la formule de ce seuil, plus le ratio (ou coefficient) est bas, plus le seuil
sera proche d’un score attribué à un alignement des blocs sur une séquence aléatoire. À l’inverse, plus
le ratio est élevé, plus le seuil sera sélectif et proche d’un score attribué à un alignement parfait des
blocs sur eux-mêmes. Ainsi, dans le Tableau 5.10, le jeu A (templates de N. Loiseau) combiné à des
ratios T de valeur faible entraîne l’attribution d’un nombre très élevé de séquences à des P450s par
Caliseq (Nombre de séquences récupérées dans le Tableau 5.10). Sachant que Pfam et Prosite n’en
décelaient au maximum que 5566 (cf. Tableau 5.9) la présence d’un nombre important de faux positifs
était fort probable. Cela est d’autant plus vrai qu’à un seuil de 0,05, Caliseq identifie presque la moitié
de la base StprEmbl2005 ! Puis, de 0,05 à 0,25, le nombre de séquences récupérées décroît
relativement rapidement, passant de la moitié de la banque récupérée au dixième.
À partir d’un seuil de 0,30, la sélection passe un palier significatif, du dixième de la SptrEmbl
récupérée au cinquantième. Passé le seuil de 0,35 pour ce ratio (toujours avec le jeu A) Caliseq
commence à donner des résultats plus proches de Pfam et Prosite, dans les 3000 séquences identifiées
comme P450s.
Tableau 5.10 Comparatif des méthodes de sélection de P450s par Caliseq/Pfam/Prosite. Pour tous les calculs, le poids de gap dans Caliseq a été fxé à 2. Dans certain cas (lorsque la limite L a été mise à 350), un jeu
de 10 blocs a été utilisé à la place de la vingtaine de blocs des jeux A, B ou C. Les meilleurs paramètres (pour l’ancien seuil et le nouveau seuil) sont indiqués en gras.
Jeu de base Méthode seuil limite nb séquences Exclusif à Exclusif à Pfam Exclusif à Exclusif à Exclusif Caliseq Exclusif Pfam Commun % faux
bloc récupérées Caliseq Prosite Caliseq et Pfam et Prosite et Prosite positif
A sptrEmb2005 T-ratio 0,05 1000 926721 922313 654 0 1296 98 202 3014 99,52
A sptrEmb2005 T-ratio 0,05 800 874849 870480 673 0 1277 90 214 3002 99,50
A sptrEmb2005 T-ratio 0,10 1000 907779 903376 659 0 1291 98 202 3014 99,51
A sptrEmb2005 T-ratio 0,10 800 855908 851544 678 0 1272 90 214 3002 99,49
A sptrEmb2005 T-ratio 0,15 1000 807466 803106 688 0 1262 92 210 3006 99,46
A sptrEmb2005 T-ratio 0,15 800 755596 751275 707 0 1243 84 222 2994 99,43
A sptrEmb2005 T-ratio 0,20 1000 612523 608225 728 0 1222 81 221 2995 99,30
A sptrEmb2005 T-ratio 0,20 800 560669 556410 747 0 1203 73 233 2983 99,24
A sptrEmb2005 T-ratio 0,25 1000 301691 297543 837 0 1113 56 237 2979 98,63
A sptrEmb2005 T-ratio 0,25 800 249985 245876 856 0 1094 48 249 2967 98,36
A sptrEmb2005 T-ratio 0,30 1000 42760 38790 936 0 1014 19 279 2937 90,72
A sptrEmb2005 T-ratio 0,30 800 16428 12491 955 0 995 17 291 2925 76,03
A sptrEmb2005 T-ratio 0,35 1000 3680 34 1141 0 809 11 390 2826 0,22
A sptrEmb2005 T-ratio 0,35 800 3633 15 1157 0 793 11 402 2814 0,00
A sptrEmb2005 T-ratio 0,40 1000 2558 5 1488 0 462 4 1129 2087 0,00
A sptrEmb2005 T-ratio 0,35 350 2845 14 1282 0 668 9 1062 2154 0,00
A sptrEmb2005 T-ratio 0,40 350 2057 3 1514 0 436 5 1603 1613 0,00
B sptrEmb2005 T-ratio 0,35 1000 2280 0 1566 0 384 0 1320 1896 0,00
C sptrEmb2005 T-ratio 0,35 1000 1610 1 1708 0 242 0 1849 1367 0,00
A sptrEmb2005 T-ratio 1,50 1000 3123 10 1344 0 606 7 716 2500 0,00
A sptrEmb2005 T-ratio 1,25 1000 3489 13 1208 0 742 8 490 2726 0,00
A sptrEmb2005 T-ratio 0,50 1000 3664 23 1144 0 806 11 392 2824 0,14
A sptrEmb2005 T-ratio 0,25 1000 3664 23 1144 0 806 11 392 2824 0,14
A sptrEmb2005 T-ratio 0,05 1000 3664 23 1144 0 806 11 392 2824 0,14
A sptrEmb2005 T-ratio 0,05 1200 3713 58 1133 0 817 11 389 2827 0,78
A sptrEmb2007 Z-score 0,05 1000 4508 22 1262 264 636 15 745 3835 0,02
A sptrEmb2007 Z-score 0,05 1200 4534 36 1260 264 638 15 735 3845 0,20
D sptrEmb2007 Z-score 0,05 1000 4417 16 1272 266 626 13 818 3762 0,00
D sptrEmb2007 Z-score 0,05 1200 4436 24 1269 266 629 13 810 3770 0,09
E sptrEmb2007 Z-score 0,05 1000 4906 28 1158 252 740 27 469 4111 0,00
E sptrEmb2007 Z-score 0,05 1200 4914 28 1156 252 742 27 463 4117 0,00
A: Jeu de 6 templates de N. Loiseau (GOK)

Nb : Nombre
B: Jeu de 4 templates de M.Cottevieille (GOK) %faux positif : Nombre de faux positifs dans
Base : Base de séquences, utilisée pour les identifications de P450s
C: Jeu de 6 templates TA.Nguyen (GOK) les séquences inédites de
Limite : Distance maximale autorisée premier bloc/dernier bloc
D: Jeu de bloc global 11 templates (alignement) Caliseq
Méthode : Méthode pour déterminer le seuil d’identification de P450s
E: Jeu de 6 templates de TA.Nguyen (GAKUSA)
5.5.2.3 Évolution du seuil Z (Z-score)

Une nouvelle fonction de score basée sur un « log-odd » pour coder les profils (cf. section 4.3.1.2),
ainsi que l’utilisation du calcul d’un Z-score comme critère de sélection (cf. section 4.3.2.3), ont été
implémentés dans le but d’améliorer la sensibilité de la méthode lors de la recherche sur banque
(réduction des faux positifs dans les séquences récupérées et réduction des faux négatifs non
identifiés). Ils ont été testés sur une banque mise à jour, la SptrEmbl2007. En raison du nombre
important des séquences contenues dans cette banque, et du fonctionnement de Caliseq lié au calcul du
Z-score –Caliseq effectue un double passage : le premier pour récupérer les meilleurs scores
d’alignement et le second pour sélectionner ceux dont le Z-score est au dessus du seuil souhaité– il
faut un peu plus de temps pour obtenir les résultats qu’avant, mais cela demeure raisonnable pour un
algorithme de programmation dynamique (de 1 heure ½ à 2 heures sur un nœud du clusteur). À
l’instar du seuil de T-ratio, j’ai fait évoluer la valeur seuil pour le Z-score de 0,05 à 0,20 par pas de
0,05. La nouvelle méthode est réellement plus sensible : même avec de mauvais paramètres, elle
récupère dès le départ moins de faux positifs. Dans tous les cas, le nombre est limité par la structure de
l’arbre qui mémorise les meilleures séquences. Ainsi, si l’utilisateur décide de récupérer seulement
10000 séquences au premier passage de Caliseq, le maximum de séquences pouvant être récupérées au
second passage est également de 10000 séquences. Quoiqu’il en soit, avec cette fonction de score en
« log-odd » et le filtre sur les z-score, il s’agissait cette fois de trouver les bons paramètres pour
augmenter le nombre de séquences récupérées plutôt que de le faire diminuer, comme c’était le cas
avec la précédente méthode avec le T-ratio. Finalement, la meilleure valeur de seuil a été trouvée pour
0,05. Cette valeur est très proche de la moyenne, comme présentée à la Figure 4-3, page 170 : on
récupère donc quasi toutes les valeurs positives de z-score, à savoir, quasi toutes les séquences
identifiées par Caliseq, P450 ou non (le seuil est vraiment très bas).
5.5.2.4 Influence de la limitation sur la distance entre les blocs

La limitation de la distance entre le premier résidu du premier bloc et le dernier résidu du dernier
bloc a été mise en place pour limiter le nombre de faux positifs récupérés par Caliseq. En effet, le
score d’alignement dépend du positionnement des blocs sur la séquence cible. Quelle que soit la
distance séparant ces blocs, tant que le positionnement des blocs est correct, le score est élevé, puisque
les pénalités de glissement des blocs ne sont pas comptées. Imposer une limitation de distance à
800-1000 permet de supprimer tous les faux positifs de grande taille dont le score d’alignement est
favorable. Bien que ne figurant pas dans le tableau, cette limitation a permis de réduire d’1/5 le
nombre de séquences récupérées lors de la sélection par un T-ratio par Caliseq (pour la plupart des
faux positifs). En revanche, lorsque le Z-score a été utilisé, la limitation a pu être augmentée
légèrement, pour récupérer plus de séquences : la méthode combinant le Z-score et la nouvelle
fonction de score étant plus sélective, il fut possible de récupérer plus sélectivement des séquences qui
ne pouvaient être récupérées par l’ancienne méthode sans entraîner avec elles des faux positifs.
5.5.2.5 Jeu de templates utilisé

Un total de cinq jeux de templates a été utilisé pour construire une base de P450 à l’aide de
Caliseq. Le jeu A est celui qui a servi pour tester les effets des variations de paramètres. Lorsque le
meilleur compromis a été trouvé pour les paramètres, les autres jeux de templates ont été utilisés : B et
C pour la base SptrEmbl2005, et D et E pour la base SptrEmbl2007.
5.5.3 Comparaison avec les autres méthodes : Prosite et Pfam
Sur le Tableau 5.10, sont présentés également les recouvrements des séquences récupérées avec
ceux de Prosite et ceux de Pfam. Pour obtenir ces recouvrements, les numéros d’accession de chaque
séquence ont été utilisés : il devenait alors possible de vérifier si une séquence était identifiée par
toutes les méthodes. Ainsi, pour chaque ligne du tableau, la composition des séquences récupérées par
Caliseq est renseignée, à savoir combien de séquences sont exclusives à i) Caliseq, ii) à Pfam, iii) à
Prosite, iv) combien sont trouvées uniquement dans Caliseq et Pfam, v) Caliseq et Prosite, vi) Pfam et
Prosite, et enfin vii) combien sont trouvées en commun par les trois méthodes. Une information
supplémentaire a été indiquée pour les séquences identifiées comme P450s exclusivement par Caliseq :
il s’agit du taux de faux positifs comptabilisés dans cet ensemble (exclusif à Caliseq). Le
dénombrement des faux positifs résultent d’une expertise manuelle des séquences quand cela est
possible (nombre de séquences exclusif à Caliseq < 200). Dans les cas où les séquences identifiées par
Caliseq sont trop nombreuses, toutes ont étés considérées comme faux positifs (vérification manuelle
impossible). Pour les séquences récupérées de la SptrEmbl2005, il était en effet possible d’avoir une
idée sur la nature de ces séquences grâce à la SptrEmbl2007. En revanche, dans le cas de la
SptrEmbl2007, j’ai été amené à vérifier l’annotation de la séquence (annotée comme CYP, putatif ou
hypothétique, etc.). J’ai également eu recours à d’autres serveurs comme SMART ou ProDom qui
pouvaient m’indiquer selon leurs critères si ces séquences sont des P450s. En dernier recours, il était
possible de vérifier après une recherche PSIBLAST si des séquences de P450s proches apparaissent en
résultat.
5.5.3.1 Quelques remarques générales

Examinons d’abord les différences globales entre les trois ensembles de séquences identifiées
comme P450 par les trois différentes méthodes. Dans le Tableau 5.9, Pfam identifiait plus de P450s
que Prosite aussi bien sur SptrEmbl2005 que sur SptrEmbl2007. Pourtant, toutes les séquences
identifiées par Prosite ne sont pas incluses dans ceux identifiés par Pfam et vice versa (colonnes 10 et
11 sur le tableau). Néanmoins Pfam comporte plus de séquences inédites que Prosite.
Par ailleurs, Prosite semble avoir connu une amélioration entre sa version 2005 et sa version en
2007 : sur la colonne des séquences uniquement identifiés par Prosite, aucune séquence n’a été trouvée
exclusivement par Prosite dans la SptrEmbl2005 par rapport aux deux autres méthodes, tandis
qu’environ 260 séquences sont exclusives à Prosite dans la SptrEmbl2007. Même avec les meilleurs
paramètres pour Caliseq et l’utilisation du meilleur jeu de blocs, une dizaine seulement de ces
séquences ont pu être détectées par Caliseq, et environs 250 séquences restent propres à Prosite.
Un détail amusant pour Caliseq est que même en récupérant la moitié des séquences de
SptrEmble2005 (première ligne du tableau), il n’a pas été en mesure de récupérer 856 séquences
présentes dans Pfam, dont 202 en commun avec Prosite. Ce constat est donc fort surprenant
5.5.3.2 Obtention des meilleurs paramètres pour Caliseq

Avec l’ancienne méthode, l’augmentation de la valeur du seuil T-ratio a permis de diminuer
drastiquement le nombre de séquences récupérées par Caliseq, dont la majeure partie correspondait à
des faux positifs. Au fur et à mesure que le nombre de séquences récupérées atteint un seuil
convenable, il est possible parallèlement de voir « réapparaître » des séquences parmi les séquences
exclusivement déterminées par Pfam ou Pfam/Prosite. À l’inverse, le nombre de séquences
exclusivement communes entre Caliseq et Pfam, entre Caliseq et Prosite, ou encore communes aux
trois méthodes, tend à diminuer. Ceci caractérise en fait les faux négatifs non détectés par Caliseq, à
savoir des séquences de P450s qui ne sont plus identifiées par Caliseq.
Partant du principe qu’il est préférable d’avoir des faux négatifs que des faux positifs, un
paramétrage de T-ratio=0,35 et L=1000 avec le jeu A, fut un bon compromis (cf. Figure 5-10 A) :
3680 séquences ont été ainsi détectées par Caliseq, et seulement 1531 séquences (1147 de Pfam + 390
de Pfam et Prosite) identifiés par les deux autres méthodes n’ont pu être détectées par Caliseq. Parmi
les 3680 séquences, 34 sont trouvés exclusivement par Caliseq, avec seulement 8 faux positifs
(détecter comme étant des transporteurs et des kinases par les autres serveurs), soit un taux de faux
positifs égal à 0,22% (en considérant que les 3646 autres séquences détectées en accord avec les deux
autres méthodes sont des vrais P450s). De manière encourageante, parmi ces 26 séquences (34 –8 faux
positifs), l’une d’elles est inconnue de Prosite et de Pfam sur la StprEmbl2005, mais identifiée comme
P450 par Pfam sur la SptrEmbl2007.
(A) (B)
Caliseq (3680) Caliseq (4914)
34 28
809 11 742 27
2826 4117
390 463
1147 0 1156 252
Pfam Prosite Pfam Prosite

(5166) (3392) (6478) (4859)
Figure 5-10 Représentation en diagramme de Venn des séquences de P450s de la SptrEmbl, identifiées selon
les trois méthodes (Caliseq, Pfam et Prosite). En (A) figurent les résultats pour la SptrEmbl2005 où Caliseq a été
utilisé avec le jeu de blocs de N. Loiseau avec le premier système de scoring (T-ratio) et en (B) sont présentés les
résultats pour la SptrEmbl2007 où Caliseq a été utilisé avec le jeu de blocs déterminé par GAKUSA avec le
nouveau système de scoring (Z-score).
Le T-ratio permet donc de trouver le bon seuil d’élimination quasi-totale des faux positifs,
tandis que le paramètre L permet d’ajuster la sélection. Par exemple, si on resserre le paramètre L
de 1000 à 800, le nombre total de séquences passe de 34 à 15, et ces 15 séquences sont incluses dans
les 34. De plus, il existe dans la base Prosite de P450s des faux positifs connus, issus des séquences de
la Swissprot (une sous partie de la SptrEmbl). Ces séquences annotées par Prosite comme faux positifs
ne font pas partie des 3680 séquences récupérées par Caliseq. Les jeux B et C n’ont pas donné de
meilleurs résultats, ce qui n’est pas surprenant pour le jeu C, mais plus pour le jeu B qui contient
moins de templates. Une plus grande diversité du jeu A par rapport au jeu B pourrait éventuellement
être un élément de réponse. Quoiqu’il en soit, Caliseq semblerait être une bonne méthode à l’interface
entre Pfam et Prosite : les CSBs sont parfaitement adaptés pour servir de signature structurale dans des
expériences de génomique exploratoire.
Lors des essais avec la fonction de score en « log-odd » et du Z-score, la recherche du

paramétrage a été opérée à l’inverse de la première méthode : au lieu d’essayer d’éliminer les faux
positifs, nous avons cherché à abaissé le taux de faux négatifs. À titre d’exemple, le paramètre sur la
distance entre les blocs, L, n’affecte plus les séquences uniquement trouvées par Caliseq. En passant
d’une valeur de L de 1000 à 1200, quelques séquences seulement, qui étaient uniquement identifiées
soit par Prosite, soit par Pfam, sont désormais reconnues par Caliseq. Avec les jeux A et D, Caliseq
récupérait moins de séquences que Pfam (6478) ou Prosite (4859). En revanche, avec le jeu E (jeu des
28 templates), Caliseq retrouve sa position à l’interface des deux autres méthodes alors que le jeu de
blocs E diffère franchement en nombre et longueur de bloc (cf. Figure 5-10B).
Tableau 5.11 Identité des séquences identifiées par Caliseq comme CYP sur la SptrEmbl2007 avec le jeu de bloc issu de GAKUSA.
Toutes ces séquences sont en réalité des P450s non identifiées par les autres méthodes.
Numéro
Désignation de la séquence
d’accession
Q27DW3 Conserved hypothetical heme-thiolate monooxygenase.
Q28N78 Cytochrome P450 family protein.
Q25S09 Hypothetical protein.
Q3GYB6 Probable cytochrome P450 125 Cyp125.
Q3W4R4 Putative cytochrome P450.
Q3W4R5 Putative cytochrome P450-family protein.
Q70AR6 Putative cytochrome P450 (EC 144).
Q93PA6 MS125, putative cytochrome P450.
Q9F840 TDP-4-keto-6-deoxyhexose 3,4-isomerase.
P95746 Hypothetical NDP hexose 3,4 isomerase.
Q2P9Y8 Cytochrome P450-like.
Q3WMN4 Similar to Cytochrome P450.
Q3WV35 Fatty acid alpha hydroxylase.
Q4NF21 Fatty acid alpha hydroxylase.
Q5SFA9 Putative NDP-hexose 3,4-isomerase.
Q67G14 CvhE.
Q9RN55 SnogN.
Q5YNS9 Cytochrome P450 monooxygenase.
Q93RT1 Putative cytochrome P450.
Q9L141 Putative cytochrome P450-family protein.
Q73XP8 Hypothetical protein.
Q82GL6 Cytochrome P450 hydroxylase.
Q9RJQ6 Putative cytochrome P450.
Q2J4W2 Putative cytochrome P450.
Q3J3U8 Putative fatty acid beta hydroxylase (Cytochrome P450) (EC 14.-.- ).
Q47KL4 Putative cytochrome P450.
Q47L36 Putative cytochrome P450-family protein.
Q2G529 Cytochrome P450 family protein.
Ainsi, le meilleur paramétrage de Caliseq pour identifier des P450s sur la SptrEmbl2007 fut
Z=0.05, L=1200 avec le jeu E (cf. Figure 5-10 B et deuxième ligne en gras du Tableau 5.10). Caliseq
détermine 4914 séquences comme étant des P450s, et ne détecte pas un total de 1871 séquences
identifiées par les deux autres méthodes. Comme pour la première version de Caliseq, ces 4914
séquences ne contiennent aucun faux positif connu de Prosite, et comprennent également 28 séquences
inconnues des deux autres méthodes. Ces 28 séquences sont montrées dans le Tableau 5.11.
Après vérification de ces séquences sur les autres serveurs (SMART ou ProDom) il s’avère que
100% sont des séquences de P450s. Caliseq se montre donc très sensible et très spécifique (mais peut
être trop sélectif…) pour l’identification de séquences de P450s dans les banques de séquences.
5.5.3.3 Les faux négatifs ?

Une attention particulière a été portée aux séquences identifiées par les deux autres méthodes et
non identifiées par Caliseq. Après examen de quelques unes manuellement, j’ai pu constater que ces
séquences correspondaient pour la plupart à des fragments de séquences (moins de 200 résidus, ce qui
est trop court pour être une P450). Ainsi, une statistique sur les longueurs de ces séquences (PFAM et
Prosite) a été réalisée (cf. Figure 5-11)
Sur cette figure, on peut constater qu’un pic de P450 non reconnu par Caliseq est observé pour
des séquences courtes de moins de 200 résidus. Par nature, ce genre de séquence n’est pas repérable
par Caliseq : les blocs recouvrent environs 60 à 70% de la longueur totale d’un P450. Sachant qu’un
P450 fait en moyenne une longueur de 400 à 500 résidus, la longueur minimale de séquences
identifiables par Caliseq est donc d’environ 300 résidus. En effet, Caliseq n’est pas en mesure de
positionner des blocs de séquences sur une séquence cible plus courte que la longueur totale des blocs.
Ainsi, une grande partie des séquences situées en dessous de ce seuil limite n’est pas identifiable par
Caliseq. Il en est de même pour les séquences trop longues en raison de la limite imposée par le
paramètre L.
Ces séquences courtes n’ont pas de pertinence dans le cadre d’un projet de reconstruction de
modèle 3D et d’une banque de sites actifs de CYP.
Figure 5-11 Statistique des longueurs de séquences non identifiées par Caliseq sur SptrEmbl2005 et
SptrEmbl2007. Le jeu de blocs de N. Loiseau a été utilisé sur la SptrEmbl2005 avec une limite de distance de
1000 résidus, et le jeu de blocs issu de GAKUSA a été utilisé sur la SptrEmbl2007 avec une limite de distance de
1200 résidus. En bleu, le nombre de P450s identifiés seulement par Pfam et non trouvé par Caliseq ni Prosite, en
mauve, le nombre de P450s identifiés uniquement dans Pfam et Prosite à la fois, et en rouge le nombre de P450s
exclusifs à Prosite. Beaucoup de faux positifs pour Caliseq correspondent en fait à des fragments de P450s.
5.5.4 Essais complémentaires
À la suite de ces expériences de génomique exploratoire avec les CSBs identifiés par GOK ou
GAKUSA, deux autres manipulations ont été effectuées.
La première a consisté à utiliser à la place des blocs de GOK ou GAKUSA, des « blocs »
(autrement dit, les régions conservées de l’alignement) issus d’un alignement de Clustalw ou de
Matras. Quels que soient les paramétrages utilisés, le nombre de séquences récupérées avec ces deux
jeux de blocs n’ont pu dépasser celui obtenu avec le jeu E. Néanmoins, il est toutefois possible de
récupérer sur la SptrEmbl plus de 4000 séquences, ce qui n’est pas négligeable. À noter également que
les blocs (MCSB) de Matras donnent de meilleurs résultats que ceux prélevés de Clustalw.
L’information structurale contenue dans les blocs n’est donc pas négligeable dans la génomique
exploratoire.
La deuxième expérience a consisté à utiliser le logiciel PSI-BLAST en utilisant les blocs pour
construire le profil pour PSI-BLAST. La construction de cette matrice a de plus été bien pensée, dans
la mesure où il est possible de restreindre la construction de la matrice à certaines positions et utiliser
une matrice de similarité de type BLOSUM à d’autres positions de l’alignement fourni pour construire
la matrice consensus. L’expérience a été lancée sur la base NR (Non Redondante). Deux inconvénients
ont été trouvés pour cette méthode : i) la recherche des séquences ne dépend pas uniquement du profil,
mais également (et surtout) de la séquence requête utilisée (la méthode est donc trop « requête
dépendante » et la séquence « pivot » influence le résultat) et ii) beaucoup de faux positifs sont
récupérés lors de cette recherche. PSI-BLAST, ne semble donc pas adapté pour utiliser l’information
des CSBs en génomique exploratoire.
5.6 Conclusion et perspectives
Les résultats montrés au cours de ce chapitre ont souligné l’importance de l’utilisation de

l’information structurale à la fois dans l’amélioration des alignements multiples de séquence pour une
éventuelle reconstruction par homologie, et dans la recherche et la reconnaissance des séquences de
protéines recherchées dans une banque de séquences.
Cette information structurale peut être exploitée sous forme de blocs structuraux conservés (CSBs)
dans une approche qui associe justement la reconstruction de modèle protéique à bas taux d’identité, et
la recherche sur banque par utilisation des CSBs comme signatures structurales spécifiques de la
protéine dont sont issus les CSBs. Cette méthode à double fonction a su donner des résultats
convenables et encourageants, dans ces deux champs d’études pour les P450s. Bien qu’étant conduites
uniquement pour le moment sur la superfamille des P450s, il serait fort intéressant d’appliquer cette
méthode sur d’autres familles de protéines à repliement conservé.
Les alignements obtenus suite aux positionnements des CSBs par Caliseq, ne semblent pas à
première vue se démarquer de ceux obtenus par des méthodes plus classiques, ou plus complexes,
compte tenu de l’état des connaissances actuelles. Néanmoins, placé dans le contexte historique, il
s’agit pourtant d’une méthode fiable et innovante pour produire des alignements satisfaisants pour la
construction de « bons » modèles lorsque l’information structurale, à savoir le nombre de structures
qu’il est possible d’utiliser en templates, est limitée.
Conclusion et perspectives 235
Concernant l’exploration génomique, les CSBs ont montré leur capacité à être utilisés en tant que
signature structurale spécifique de P450s. Même si la méthode identifie moins de séquences que les
méthodes homologues, elle montre en revanche une sensibilité et une spécificité très surprenante :
aucun faux positif n’a été comptabilisé parmi les séquences identifiées par l’association des CSBs et
de Caliseq. Par ailleurs, il a été également vu que seule une utilisation de l’information de type
structurale est en mesure de proposer un tel résultat.
Par ailleurs, au cours de ces expériences d’exploration génomique, des phénomènes de palier ont
été observés lors du filtrage par le z-score : des sous-ensembles de la banque sont en effet récupérés
« par paquet » en fonction de l’ajustement du seuil de sélection. Il serait alors intéressant de vérifier si
ces sous-ensembles sont identiques selon le jeu de blocs utilisé (qui sont fonction des templates qui le
composent). Des expériences de clustérisassions pourraient peut être mettre en évidence une relation
entre ces sous-ensembles et le jeu de blocs utilisés, conduisant au choix des meilleurs templates à
utiliser pour la construction d’un modèle d’une cible donnée.
Cette méthode offrira donc une réelle innovation à partir du moment où la reconstruction par
homologie, à savoir, toutes les étapes comprises entre le positionnement des blocs et l’obtention des
modèles, sera effectuée de manière automatisée, sans intervention humaine. En effet, il deviendra alors
envisageable d’exploiter en même temps les deux aspects différents et pourtant complémentaire de la
méthode : en combinant efficacement l’exploration génomique à la reconstruction par homologie aux
moyens des CSBs, il sera éventuellement possible de mettre en place une banque de modèles, voire
seulement de sites actifs à disposition de la communauté scientifique. Une telle base peut servir d’outil
pour des tests de pharmacologie et de prédiction d’interactions substrat-P450. En outre, par
comparaison globale du devenir d’un même substrat utilisé sur tous les sites actifs de P450s de la
banque, il sera peut être possible de fournir des éléments nouveaux dans la compréhension des
mécanismes de reconnaissance des substrats.
CHAPITRE 6
6 Du virtuel au concret : applications sur le CYP2B6
« Le monde de la réalité a ses limites ;

le monde de l’imagination est sans frontières.»
Jean-Jacques Rousseau (1712 – 1778 ap JC)
237
238 Chapitre 6. Du virtuel au concret : applications sur le CYP2B6
6.1 Introduction
C’est au cours de ma seconde année de thèse que l’équipe de l’INSERM UMR517 (I. de Waziers
et P. Beaune) en étroite collaboration avec P. Dansette (CNRS UMR8601), a fait appel à nos
compétences en modélisation moléculaire. Cette équipe travaille dans le domaine de la pharmacologie
dont les sujets d’études sont étroitement liés à la cancérologie et l’oncologie. L’une des méthodes
expérimentales qu’ils ont développées, consistant à utiliser les CYP comme des activateurs de
prodrogues, implique un cytochrome P450 non cristallisée à ce jour : le CYP 2B6. Ce cytochrome,
comme la plupart de ses homologues impliqués dans la dégradation des composées exogènes, se
retrouve principalement concentré au niveau du foie humain. Il est entre autre responsable du
métabolisme spécifique d’un composé, le cyclophosphamide (CPA) dont le produit de dégradation
(gaz moutarde) est cytotoxique pour les cellules en s’attaquant directement à leur ADN. En raison de
ces propriétés cytotoxiques, le CPA est largement utilisé en tant qu’agent chimiothérapique, mais la
difficulté majeure de son utilisation réside dans le non contrôle de son ciblage. En effet, lorsque le
CPA est administré aux patients, ce dernier est dégradé au niveau du foie. Le produit de cette
dégradation, très cytotoxique, se propage alors dans le corps à travers le flux sanguin. Il n’atteint pas
que la tumeur, mais également des tissus non tumoraux. Afin de limiter son champ d’action, une
stratégie particulière, la GDEPT (pour gene-directed enzyme prodrug therapy) a été adoptée. Celle-ci
consiste à introduire dans un vecteur le gène d’un CYP 2B6, et à l’exprimer dans les cellules
tumorales avant d’ajouter le CPA. Cette stratégie souffre toutefois d’un inconvénient majeur :
l’affinité faible du CPA pour le CYP 2B6. La collaboration entre nos deux équipes avait donc pour
objectif d’expliquer et d’améliorer l’affinité du CPA pour le CYP 2B6, par diverses approches
prédictives de la modélisation moléculaire. L’équipe d’I. de Waziers nous a contactés pour produire un
modèle fiable du CYP 2B6 afin de repérer les résidus du site actif candidats à des mutations
susceptibles de modifier l’affinité du substrat à l’enzyme.
Disposant des outils nécessaires à leur traitement in silico, nous avons également proposé de
construire virtuellement les mutants du CYP 2B6 et de conduire des simulations de dynamiques
moléculaires sans contrainte de quelques nanosecondes, pour étudier, comprendre et expliquer le
comportement du CPA dans le site nouvellement modifié. Cette approche a donné des résultats forts
prometteurs, avec de bonnes convergences entre prédictions et expériences. L’ensemble de résultats
fait l’objet d’un article en cours de soumission, ayant pour titre : « Analysis of CYP 2B6
Différentes approches exploitées pour un seul modèle final 239
cyclophosphamide activation by molecular modeling and site-directed mutagenesis : from in silico to

ex vivo. ».
Dans ce chapitre, je ne décrirai pas toutes les techniques déjà présentées dans l’article. Au
contraire, j’aborderai des points qui n’ont pas été détaillés, ou qui ont été réalisés après la rédaction de
l’article.
6.2 Différentes approches exploitées pour un seul modèle final
La construction d’un modèle de CYP 2B6 était l’occasion d’expérimenter les différentes
stratégies de reconstruction par homologie disponibles, et de les comparer à la méthodologie mise en
place au laboratoire. À part SwissModel, qui propose un modèle final à partir de références de
structures de P450s, les méthodes ne proposent que des alignements : c’est à l’utilisateur d’exploiter
cet alignement, en le fournissant à des logiciels de reconstruction comme Modeller. Dans tous les cas,
la première tâche consiste en la sélection des structures de référence.
6.2.1 Choix des structures de référence par différentes méthodes
La soumission de la séquence du CYP 2B6 à BLASTP sur les séquences des protéines contenues
dans la PDB donne les résultats présentés au Tableau 6.1, par ordre d’identité (requête d’octobre 2005).
Tableau 6.1 Résultats de la recherche d’homologues du CYP 2B6 par un BLASTP sur la PDB
Taux d’identité Recouvrement
PDB Nom du CYP
avec CYP 2B6 avec CYP 2B6
1SUO / 1PO5 78% 351/447 CYP 2B41

1Z11 / 1Z10 52% 234/447 CYP 2A6
1PQ2 50% 237/447 CYP 2C8
1DT6 / 1NR6 / 1N6B 49% 221/446 CYP 2C5
1OG5 / 1OG2 / 1R9O 48% 217/446 CYP 2C9
1TQN / 1W0G / 1W0F / 1W0E 25% 103/427 CYP 3A4
1Q5E / 1PKF 26% 44/164 P450epok
1JPZ / 1BU7 / 2BMH / 1BVY 24% 49/203 P450BM3
1
.1SUO et 1PO5 ne présentent pas tout à fait les mêmes valeurs, dans la mesure où 1P05 comporte des résidus non résolus. Par ailleurs,
1PO5 est une forme sans substrat et ouverte.
Dans ce tableau, les structures des CYP 2B4 présentent une identité de 78% avec le CYP 2B4. A
ce niveau d’identité, il est admis qu’une reconstruction en monotemplate (une seule structure de
référence utilisée) est suffisante, voire même fortement conseillée. Comme mon idée était de tester les
différentes méthodes, j’ai quand même entrepris l’essai des autres méthodes, juste par curiosité :
allaient-ils me donner un modèle équivalent à celui obtenu en monotemplate ?
Les structures de référence et les méthodes employées pour aligner les séquences des structures de
références sur la séquence cible ont été les suivantes :
a) Pour la reconstruction du CYP 2B6 en monotemplate, la forme fermée de la structure du CYP
2B4 a été choisie (1SUO) : comme détaillé dans l’article, l’avantage que présentait la structure
1SUO du CYP 2B4 est de comporter un substrat, le 4-(4-chlorophenyl)imidazole (CPI)
co-cristallisé dans son site actif. De plus, ce dernier étant structuralement proche du CPA, sa
position dans le site actif du CYP 2B4 pouvait fournir un bon point de départ pour le
positionnement du CPA. L’alignement quant à lui est aisément réalisé à l’aide du logiciel
Clustalw.
b) Le serveur SwissModel a choisi pour sa part, les structures 1SUO, 1PO5, 1Z11 et 1Z10
(respectivement CYP 2B4 et CYP 2A6) pour construire le modèle. Il est en effet possible
d’imposer ses propres structures de référence, mais par défaut, SwissModel effectue un
BLASTP et choisit les meilleures séquences des structures présentant la meilleure identité
avec la séquence cible soumise.
c) Sous le serveur Matras (cf. 2.4.4.3), j’ai fourni le même set de structures que celui de
SwissModel : Matras se charge alors de retourner un alignement de ces quatre structures de
référence entre eux. Il me reste alors à aligner les séquences de ces quatre structures sur la
séquence du CYP 2B6. La réalisation de cet alignement est triviale dans la mesure où la
séquence du CYP 2B4 est très proche de celle du CYP 2B6.
d) Un autre serveur, HHPred (Söding et al., 2005) a été utilisé à l’occasion. Pour mémoire, ce
serveur utilise un programme basé sur les HMM pour réaliser l’alignement de séquences en
recherchant les homologues du CYP 2B6. L’avantage que présente ce serveur est de fournir en
résultat un alignement pré formaté pour le logiciel Modeller : il ne reste alors plus qu’à
préparer le fichier de commande. Les structures retenues en référence par HHPred sont le
1X8V (CYP 51), 1PO5 (CYP 2B4), 1R9O (CYP 2C9), 1Z10 (CYP 2A6), 1IZO (P450BSbeta),
1UE8 (P450st), 1IO7 (CYP 119), 1N4O (CYP 121), IUED (P450OxyC) et 1LFK (P450OxyB).
Mises à part les structures des CYP 2C9 et du CYP 2A6, toutes les autres structures sont celles
de bactéries. Ce résultat est assez surprenant dans la mesure où HHPred a proposé pour
templates de nombreuses structures en dessous du seuil d’identité de 26%, indiqué par le
BLASTP (non présentées dans le Tableau 6.1).
Différentes approches exploitées pour un seul modèle final 241
e) Enfin, la méthode de blocs structuraux, proposée au laboratoire a aussi été testée, en

n’utilisant que mon jeu de blocs, qui contient un plus grand nombre de P450s microsomaux.
En fait, les trois jeux de blocs ont été testés, et mon jeu de blocs a été celui qui a fourni les
résultats les plus convaincants au niveau de l’alignement. Il est à noter que le jeu global de
blocs n’a été instauré que vers la fin de ma deuxième année de thèse, je n’ai pas pu le tester à
ce moment-là. Pour mémoire, mon jeu de blocs possède six structures : 1OXA, (P450eryF),
2HPD (P450BM3), 1PQ2 (CYP 2C8), 1OG5 (CYP 2C9), 1NR6 (CYP2C5) et 1GWI
(CYP 154C1).
6.2.2 Choix de la méthode finale
6.2.2.1 Départage sur l’alignement

De manière surprenante, les alignements sont très proches, et ce, en dépit de la diversité des
templates utilisés – certaines méthodes incluent des structures bactériennes à taux d’identité faible par
rapport au CYP 2B6 –. Une explication possible de cette similitude entre les alignements, est la
présence d’au moins une séquence de la famille des 2C dans chacun des jeux de structures pour
chaque méthode. En effet, l’identité de séquences pour les structures de cette sous-famille est forte
(~50%) vis-à-vis du CYP 2B6 comme le montre le Tableau 6.1. En conséquence, la présence de ces
structures a permis un « ancrage » favorable des séquences des templates sur la séquence du CYP 2B6,
aboutissant à un alignement similaire pour toutes les méthodes. Il est à noter que cette observation de
« similarité » d’alignement n’a pu être effectuée que sur les séquences de structures communes à
toutes les méthodes, qui sont généralement les structures de P450s microsomaux.
6.2.2.2 Départage sur le modèle 3D

La différence entre les méthodes s’observe davantage pour les modèles obtenus : le logiciel
Modeller prenant en compte toutes les contraintes spatiales des templates, le résultat final dépend
fortement des structures utilisées comme références. Comme celles-ci diffèrent d’une méthode à
l’autre, il n’est donc pas étonnant d’obtenir des modèles divergents. Le meilleur modèle, selon la
fonction objective de Modeller a été évalué pour chaque stratégie par des logiciels d’évaluation de
structures RX (Prosa II, ProQ et Anolea). Tous les modèles générés répondent correctement aux
critères d’évaluation. Les RMSDs de ces meilleurs modèles calculés sur le squelette peptidique, ont
été calculés par rapport au modèle du CYP 2B6 (qui sert ici de référence) obtenu en monotemplate
(Tableau 6.2).
Tableau 6.2 RMSD calculé sur le backbone entre les modèles de CYP 2B6 générés par les différentes méthodes d’alignement. La
structure de référence pour le calcul de RMSD est le modèle obtenu en monotemplate. Pour information, le modèle du CYP 2B6
monotemplate a un RMSD de 1,77 Å de la structure RX du CYP 2B4
Modèle obtenu par la méthode d’alignement RMSD avec le modèle obtenu en monotemplate
Matras 0,38 Å
1
SwissModel 0,63 Å
Caliseq 1,85 Å
HHpred 2,69 Å
1
SwissModel est la seule méthode entièrement automatisée, pour les 3 autres, nous avons utilisé Modeller 7
Sur ce tableau, les deux modèles qui semblent diverger le plus par rapport à celui construit à partir
de 1SUO sont ceux générés par l’alignement HHPred et Caliseq. Encore une fois, ce résultat n’est pas
surprenant : les méthodes HHPred et Caliseq comportent en effet plus de structures de référence
bactériennes, alors que les autres n’en disposent pas. À constater également qu’à partir d’un jeu
identique de templates, la méthode Matras et SwissModel ne donnent pas tout à fait le même résultat :
le programme de reconstruction utilisé est différent (Modeller pour Matras, PromodII pour
SwissModel), mais la différence n’est pas significative. D’ailleurs, à une simple minimisation près, les
modèles obtenus pour SwissModel, Matras et en monotemplate sont équivalents.
Le choix final de la méthode pour reconstruire le CYP 2B6 s’est porté sur la stratégie en
monotemplate pour les raisons évoquées précédemment (~78% d’identité en séquence). Les autres
constructions ont été réalisées en vue de comparer les différentes méthodes. À noter enfin que de
toutes les méthodes, la méthode de recontruction par blocs structuraux est la plus défavorisée pour
l’alignement : elle est la seule qui ne comporte pas la séquence d’un CYP 2B4. Toutefois, ce
désavantage est compensé par la structure du CYP 2B4 utilisée par les autres méthodes comme
templates pour la reconstruction : 1PO5 est une forme ouverte du CYP 2B4, à 5 Å de RMSD de la
structure du 1SUO –le RMSD est calculé sur les atomes des squelettes peptidiques–. Utiliser cette
forme ouverte du CYP 2B4 pourrait ainsi expliquer (en plus du nombre de structures bactériennes
utilisées) la divergence avec le modèle construit en monotemplate.
6.2.2.3 Obtention du modèle final

Comme expliqué plus en détail dans l’article, le modèle monotemplate du CYP 2B6 a été généré à
partir d’une structure minimisée du CYP 2B4 1SUO et relaxée par 2 ns de dynamique moléculaire
libre. Cette opération de pré-reconstruction a été réalisée dans le but de limiter les défauts structuraux
Docking manuel et mutations in silico 243
qui pourraient être présents sur la structure X initiale. Cette opération peut sembler inutile, dans la
mesure où Modeller est censé relaxer les structures templates avant d’utiliser leurs contraintes
spatiales. Mais la relaxation par MD pendant une longue durée (2 ns) et dans une boîte de solvatation
explicite permet de rechercher une meilleure structure à l’équilibre. Cette étape permet en outre de
préparer le protocole GROMACS qui sera appliqué sur le modèle final du CYP 2B6.
Le modèle, une fois construit et validé par les logiciels d’évaluation de structures (Prosa II, ProQ
et Anolea), a été comparé à la structure du CYP 2B4. De l’évolution des structures lors de la
dynamique, aux canaux d’accès suggérés par le logiciel CAVER (Petrek et al., 2006) en passant par le
volume du site actif déterminé par le logiciel Voidoo (Kleywegt et al., 2006), tout a été passé en revue
comme cela est décrit dans l’article. Le but de ces manœuvres était de vérifier si le modèle du CYP
2B6 n’était pas une simple copie de la structure du CYP 2B4 et d’observer de vraies variations dans le
site actif. Le RMSD final entre le modèle du CYP 2B6 relaxé et équilibré et la structure du CYP 2B4
est de 1,77 Å, ce qui suggère que ces deux protéines sont structuralement distantes.
6.3 Docking manuel et mutations in silico
La seconde étape a consisté à placer le substrat dans le site actif du CYP 2B6 afin de déterminer
les résidus en contact étroit avec le CPA. Ceux-ci seront alors proposés à des mutations en vue de
modifier le comportement du CPA envers son enzyme.
6.3.1 Docking du CPA
6.3.1.1 Obtention du fichier PDB du CPA

Ne disposant pas de structure cristallographique du CPA, il a fallu le construire, en partant de sa
simple formule chimique (cf. Figure 6-1) récupérée à partir du serveur de composés chimiques
ChemIdPlus (http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/). Cette formule a été ensuite soumise au serveur
Dundee PRODRG2 (http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/programs/prodrg/) (Shuettelkopf et Aalten,
2004) qui fournit à la fois un fichier de topologie exploitable par GROMACS ainsi que le fichier de
structure du CPA au format PDB.
Le composé est chiral au niveau du phosphore, or PRODRG ne propose qu’un seul des deux
énantiomères : le S. Sachant que l’équipe d’I. de Wazier utilisait un mélange racémique pour les
mésures d’activités, il fallait donc construire son énantiomère R pour disposer d’une reproduction
complète des données expérimentales en machine. Pour cela, j’ai utilisé le logiciel SYBYL (Tripos inc,
St Louis, USA) (fonction « invert chirality »).
Cl
O
O
P N
N
H Cl
Figure 6-1 Formule chimique du Cyclophosphamide (CPA), chiral au niveau du P.
6.3.1.2 Positionnement du CPA dans le site actif

La procédure de positionnement du CPA dans le site actif du CYP 2B6 est expliquée dans l’article,
dans la partie Materials and Methods ainsi que dans la partie Results « Initial positionning of CPA ».
Brièvement, j’ai donc profité du fait que le CPI, une molécule structuralement proche du CPA, a été
co-cristallisé avec le CYP 2B4 dans 1SUO. Après superposition des modèles, j’avais donc un point de
départ pour positionner le CPA : les deux atomes faisant face à l’hème pour les deux molécules ont été
superposés grâce à un script TCL sous VMD18. Ce placement du CPA dans le site actif du CYP 2B6
ne s’effectue pas sans conflit stérique, c’est pourquoi un léger réajustement manuel suivi d’une
minimisation locale a été nécessaire. Les paramètres de la minimisation locale sont décrits dans
l’article, tandis que le réajustement a nécessité l’utilisation d’un autre logiciel de visualisation :
SPdbViewer (http://www.expasy.org/spdv/). Ce logiciel offrait en effet l’avantage de figer la protéine
et permettait de ne manipuler que le substrat par utilisation de deux fichiers distincts pour chacune des
entités. Il existe toutefois un inconvénient à manipuler deux fichiers indépendants sous SPdbViewer :
le logiciel ne peut pas tenir compte des interactions entre les atomes des deux fichiers. C’est pourquoi,
lorsqu’une position de CPA semblait correcte, les coordonnées cartésiennes du CPA étaient
enregistrées et traitées sous SYBYL qui se chargeait de la minimisation locale du CYP 2B6 sur les
résidus avoisinant le CPA, hème exclu. Il est à noter que la dernière partie de la procédure, la
minimisation locale autour du CPA, a été réalisée pour chaque mutant du CYP 2B6 construit
ultérieurement.
18
VMD est un logiciel de visualisation de structures, qui peut recevoir des directives au moyen de scripts écrits
en langage TCL. C’est l’outil dont je me suis le plus servi pour visualiser mes résultats, mais pas pour générer
les images : elles ont été réalisées sous PYMOL.
Docking manuel et mutations in silico 245
6.3.2 Mutations in silico
Le placement du CPA dans le site actif du CYP 2B6 a permis de repérer les résidus en contact
étroit avec le CPA (cf. article). Ces derniers ont été alors proposés pour des expériences de mutations
ponctuelles, en vérifiant préalablement si ces mutants avaient déjà été signalés dans la littérature. Les
premiers mutants opérés par l’équipe d’I. de Waziers ont porté principalement sur le remplacement
des résidus proposés par des résidus à caractère polaire : I. de Waziers et coll. pensaient en effet
exploiter le caractère polaire du groupement P=O du CPA en remplaçant des résidus hydrophobes du
site actif par des résidus polaires. Ces résultats n’ont pas été convaincants comme on peut le constater
sur le Tableau 6.3, dérivé du Tableau 5 de l’article avec les caractéristiques des résidus en plus. Avec
l’appui du modèle du site actif, d’autres combinaisons ont été essayées portant sur le caractère
« encombrement stérique» des résidus. Trois mutants (V477F, I114V, V477W) ont révélé des résultats
intéressants au niveau de l’affinité (Km) et de la vitesse de réaction (Vmax). Ces trois mutants ont été
testés in silico afin d’observer le comportement du CPA placé à l’intérieur. L’analyse des simulations
des trois mutants a conduit à la réalisation d’un double mutant (I114V/V477W) qui a montré en ex
vivo des résultats très encourageants, interprettables par le comportement du substrat dans les
simulations de MD in silico.
Pour la réalisation de chaque mutant, le modèle du CYP 2B6 vide, équilibré et relaxé par 2 ns de
simulation de MD a été repris comme point de départ, et soumis au logiciel SYBYL. Pour chaque
mutant, une série de rotamères pour les chaînes latérales est proposée : ceux-ci résultent d’une
observation statistique de rotamères dans la PDB. Ainsi, on choisira le rotamère le plus « naturel » à
savoir celui dont la fréquence est la plus importante dans la PDB. Afin de supprimer les « bumps »
éventuels (ou contacts non désirés) survenus lors de la mutation, une minimisation locale est appliquée.
Le CPA est ensuite soumis à une minimisation locale, toujours conduit sous SYBYL. Suite à cet
ajustement, une simulation de 2 ns de MD a été réalisée. Les résultats de la simulation sont ensuite
analysés.
Tableau 6.3 Analyse cinétique du métabolisme du CPA par les levures exprimant les CYP 2B6 wt et mutant. Les mutants sont répartis en
trois groupes : polymorphisme, mutations canines et mutations du site actif des résidus prédits in silico. (source : I. de Wazier)
Comparaison par rapport

Mutation Vmax Km Vmax/Km
au CYP2B6wt
sauvage
taille de la
min-1 % of wt mM % of wt % of wt
muté
chaîne
latérale
CYP 2B6wt 63 100 5 100 13 100
Q172H 33 53 4 86 8 62
F107V - 96 153 6 133 15 115

L199M + 125 200 5 98 26 205
S207A 70 112 6 113 13 99
K236N 47 75 56 1153 1 7
M365I - 13 21 4 77 3 27
C475I 2 3 5 96 0 3
I114V - 65 104 2 47 28 221

G366V + 1 2 NQ - - -
G366E NQ - NQ - - -
+V367L +
V367L + 90 144 9 181 10 80
V367F ++ 27 43 13 264 2 16
V367S 5 8 NQ - - -
V367T 24 39 6 131 4 30
V367H 2 2 NQ - - -
V477S - NQ - NQ - - -
V477T 37 59 9 182 4 33
V477Y ++ 29 46 6 121 5 38
V477N +++ NQ - NQ - - -
V477D 3 4 NQ - - -
V477E 2 3 NQ - - -
V477I ++ 77 124 3 66 24 189
V477F ++ 81 130 3 68 25 191
V477W +++ 100 160 3 57 36 278
G478A + 28 45 6 129 4 35
G478V ++ 36 58 3 53 14 110
G478S 7,51 12,0 NQ - - -
G478E 5,4 8,6 NQ - - -
-
I114V 58,47 93,6 1,11 22,793 52,6757 411
+V477W +++
Hydrophobe NQ: non quantifiable

Polaire, non chargé +/- Taille de la chaîne latérale par rapport au wt
Polaire, chargé négativement
Polaire, chargé positivement
Les mutations conduisant à une meilleure activité catalytique sont indiquées en grisé. À l’inverse, ceux conduisant à
une diminution de l’activité enzymatique sont indiqués en italique.
Simulation de MD 247
6.4 Simulation de MD
Les simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées sous deux champs de force différents :
GROMOS87 pour toutes les simulations présentées dans l’article, et AMBER7 pour quelques
simulations postérieures à l’article. L’idée sous-jacente était de vérifier la conformité des résultats
selon deux méthodes différentes. Le choix de GROMOS87 (ou plus exactement, GMX, un champ de
force dérivé de GROMOS87) a été guidé d’une part par l’utilisation du serveur PRODRG2 qui
fournissait des topologies pour logiciel GROMACS exclusivement, et d’autre part par le fait que
GROMACS incorporait la topologie de l’hème et permettait sa fixation à l’enzyme sans instructions
supplémentaires particulières. La différence majeure entre les deux champs de force vient de leur
traitement des atomes d’hydrogène : le champ de force GROMOS est de type « tout uni » et non tout
atome, accélérant énormément les temps de calculs. Ainsi, en réalisant des simulations avec NAMD,
qui utilise le champ de force AMBER (tout atome), je voulais vérifier si les résultats obtenus sous
GROMACS étaient reproductibles.
6.4.1 Utilisation de GROMACS
6.4.1.1 Procédure pour les complexes substrat-enzyme

Pour réaliser la dynamique moléculaire du CYP 2B6 (de l’un de ses mutants, ou du CYP 2B4)
avec son substrat placé dans son site actif, une procédure en sept étapes, dérivée du tutorial de
J.E. Kerrigan (http://www2.umdnj.edu/~kerrigje/pdf_files/trp_drug_tutor.pdf), a été adoptée :
1. Création des deux fichiers GROMOS pour l’enzyme (un fichier gro contenant les coordonnées
cartésiennes des atomes de la protéine et un fichier top qui décrit toute la topologie de la
protéine, à savoir distances, angles etc.) et ligation de l’hème par la fonction pdb2gmx.
2. Création des deux fichiers GROMOS pour le substrat par requête au serveur PRODRG2 (on un
fichier gro de coordonnées cartésiennes et un fichier itp, de similaire au fichier top de l’enzyme
sont alors récupérés).
3. Renumérotation manuelle du fichier gro du substrat puis incorporation en fin de fichier gro de
l’enzyme. Utilisation de la commande #include dans les fichiers top de l’enzyme pour prendre
en comptes ceux du substrat (fichier itp).
4. Création de la boîte d’eau par solvatation explicite et neutralisation des charges par des contre-
ions (de 1 à 3 dans le cas des CYP 2B6, et 4 dans le cas du CYP 2B4).
5. Minimisation du système (protéine, substrat, solvant et contre ions). La minimisation du
système s’arrête lorsqu’il y a convergence du système (Fmax < 1000) ou lorsqu’un nombre de
pas fixé par l’utilisateur est atteint (5000 pas).
6. Equilibration du système (20 ps) pour permettre à l’eau de bien diffuser.

7. Dynamique Moléculaire du complexe enzyme-substrat solvaté avec ou sans contraintes.
L’avantage de cette méthodologie est multiple : il n’y a pas besoin de créer le fichier de topologie
pour le substrat, puisque c’est le serveur PRODRG qui s’en occupe, ni de définir la topologie de
l’hème déjà présente dans le champ de force GMX, ni de l’attacher au CYP 2B6 car la ligation est
réalisée automatiquement lors de l’utilisation du script pdb2gmx. Néanmoins, dans cette stratégie, la
commande #include présente l’inconvénient de traiter l’enzyme et le substrat dans deux fichiers
séparés : l’application d’une contrainte de distance entre l’hème présent dans un des fichiers de
topologie et le substrat présent dans l’autre fichier de topologie n’était pas réalisable, car le
programme ne peut pas gérer les interactions entre les deux systèmes de coordonnées. L’utilisation de
contraintes de distance est pourtant intéressante lorsque l’on désire favoriser une interaction
particulière (par exemple maintenir le CPA dans l’environnement de l’hème). Sous GROMACS, cette
contrainte de distance correspond en fait à une pénalité énergéique ajoutée à l’énergie potentielle,
lorsque la distance entre deux atomes d’une paire spécifiée excède un certain seuil. Pour pouvoir
utiliser les contraintes de distances dans mes simulations, j’ai été amené à modifier le protocole de
J.E. Kerrigan, en réalisant une fusion des informations topologiques du CPA et de celles l’enzyme,
dans un seul et même fichier de topologie. Deux scripts python ont été écrits à cet effet :
Addgro2gro.py permet la renumérotation et la fusion des fichiers gro, Additp2top.py permet de
fusionner le fichier itp de topologie du substrat au fichier top de topologie de l’enzyme. Non
seulement la troisième étape de la stratégie devenait désormais automatisée, mais aussi les contraintes
de distances ont pu être appliquées.
Les différents paramètres utilisés pour la minimisation, l’équilibration et la dynamique sont

détaillés dans l’article.
6.4.1.2 Résultats et analyses des simulations

Un total de 25 simulations a été réalisé selon le nouveau protocole établi, comprenant également
celles du CYP 2B4 en présence et en absence de son substrat. Pour la plupart des mutants, deux types
de simulations ont été calculées : un premier essai de 500 ps pour vérifier si la dynamique s’exécutait
sans erreur, puis une autre simulation exhaustive de 2 ns. Pour le CYP 2B6wt, et les mutants V477F et
V477W, des essais de contraintes de distances appliquées entre le carbone à oxygéner et le fer de
l’hème ont été réalisés. Nous n’avons pas pu observer une différence avec la simulation sans
contrainte, ce qui suggère que le substrat est dans une position d’équilibre favorable dans la poche du
site actif. Enfin, pour des contraintes de temps de calcul, j’ai réalisé le docking des deux énantiomères
uniquement pour le CYP 2B6wt, le double mutant I144V/V477W et le mutant V477Y. Pour ce dernier
mutant, il s’agissait d’expliquer par la dynamique la différence observée lors du remplacement de la
valine en position 477 par un résidu encombrant : une meilleure efficacité catalytique est observée lors
d’un remplacement par une phénylalanine ou un tryptophane, tandis que le remplacement par une
tyrosine entraîne une chute de l’activité (cf. Tableau 6.3). Pour chaque simulation, la trajectoire de
celle-ci est alors observée puis analysée.
Outre l’observation de la trajectoire de la simulation sous VMD, le logiciel GROMACS offre une
panoplie d’outils d’analyse des simulations, permettant de détecter d’éventuelles anomalies
énergétiques au cours de la dynamique, ou vérifier si la durée de cette dernière est suffisante pour que
le système atteigne une position d’équilibre. Ces outils permettent également d’analyser des distances,
ou l’évolution des liaisons hydrogène créée entre le substrat et l’enzyme au cours de la trajectoire.
Stabilité du modèle. Toutes les simulations sous GROMACS ont été construites dans l’ensemble
NPT (Nombre de molécule constant, Pression constante et Température constante). Pour s’assurer du
respect de ces conditions, la fonction g_energy de GROMACS a été utilisée pour fournir des
renseignements sur la pression, température, l’énergie du système à chaque « frame » (ou temps19) de
la simulation. En dehors de l’énergie potentielle qui évolue logiquement selon la qualité du modèle du
complexe de départ, les courbes sont similaires pour toutes les simulations réalisées.
19
Dans les simulations de MD conduites sous GROMACS, chaque frame correspond à 2 femtosecondes.
Figure 6-2 Exemple de contrôle de la pression durant la dynamique du double mutant CYP 2B6
(I114V/V477F). La courbe de pression montre une oscillation normale du comportement de la pression autour de
1 bar. Pour plus de clarté, un frame sur 20 est montré.
Figure 6-3 Exemple de contrôle de la température durant la dynamique du double mutant CYP 2B6
(I114V/V477F). La courbe de température montre une oscillation normale du comportement de la température
autour d’une moyenne de 300K, la température de consigne.
Figure 6-4 Évolution de de l’énergie potentielle pour le complexe double mutant (I114V/V477W) / CPA.
Dans le cas présent, l’équilibration du système a été obtenue rapidement (~ –761 500 kJ/mol).
Mouvements des atomes durant la simulation. Pour contrôler les fluctuations du squelette du
modèle ainsi que de son substrat, la fonction g_rms a été utilisée. Celle-ci calcule à chaque temps, le
RMSD entre le squelette peptidique du modèle (ou les atomes lourds du CPA) à un temps t et sa (leurs)
position(s) à l’instant initial t0. L’ensemble de ces RMSD forme une courbe comme celles montrées en
figures 1 et 7 de l’article. Ces courbes permettent de voir à partir de quel moment le modèle a atteint
un point d’équilibration, et si la dynamique est suffisamment longue. La plupart du temps, cette
position d’équilibre était atteinte aux environs de 500 ps. Les premières simulations atteignent cette
« limite » des 500 ps : elles ont donc été étendues à 2 ns (soit 4 fois le temps d’atteinte à l’équilibre).
Par ailleurs, la courbe de RMSD du CPA (figure 7 de l’article) rend compte des mouvements du CPA,
observés lors de la simulation. En effet, au cours de la trajectoire dynamique, il a été observé que le
CPA était moins mobile dans le site du double mutant, ou dans le site du mutant V477F par rapport au
CYP 2B6wt. L’évolution du RMSD au cours du temps est un moyen commode de rendre compte des
mouvements observés sur la vidéo.
Liaisons H formées entre le substrat et l’enzyme. Afin de connaître les interactions impliquées
entre le CPA et le CYP2B6, nous avons cherché à caractériser le nombre de liaisons hydrogènes
formées entre les deux molécules au cours de la dynamique. La fonction g_hbond dans GROMACS a
permis cette analyse. Par défaut, cette fonction prend une distance de rDA = 2,5 Å entre l’atome
donneur D et l’atome accepteur A, ainsi qu’un angle de α=60° autour des atomes pour trouver leurs
partenaires potentiels (cf. Figure 6-5). Étonnamment, aucune liaison H n’a été observée (même
transitoirement) entre le CPA et le CYP2B6 quelle que soit la dynamique et quel que soit le mutant
considéré, et ce même en modifiant les paramètres par défaut du programme. Ce résultat peut
expliquer l’absence d’effets positifs sur l’affinité pour le CPA dans la série des différents mutants
testés sur la base de la polarité.
rDA
D A
Figure 6-5 Relations géométriques utilisé par g_hbond. D correspond à l’atome Donneur et A à l’atome
Accepteur. H représente l’atome d’hydrogène. Par défaut, la distance entre les deux atomes est réglée à rDA = 2,5 Å
et α = 60°.
Recherche des interactions dans le site actif. Une autre fonction de GROMACS qui a été très
utile lors de l’étude d’interaction CPA-CYP 2B6, est la fonction g_dist. Cette dernière permet de
calculer la distance entre deux atomes tout le long de la dynamique. Cette information de distance
s’est révélée intéressante lorsque j’ai cherché à connaître l’évolution de la distance entre l’atome
d’oxygène du groupe P=O du CPA avec les résidus polaires les plus proches dans le site actif. Même
si aucune liaison H ne se formait, il y avait peut-être une interaction possible avec les résidus
avoisinant en dehors de la répulsion stéarique exercée par la mutation de la valine 477 par un résidu
« encombrant ». Sous VMD20, cinq résidus polaires intéressants ont été trouvés à environ 10 Å du
CPA : la serine 294, le glutamate 301, la thréonine 302 et les phénylalanines 206 et 297 (cf. Figure
6-6). L’évolution de ces distances est montrée sur la Figure 6-7.
20
La Figure 6-6 a été obtenue à l’aide du logiciel Pymol.
Figure 6-6 Représentation du site actif avec les 5 résidus à 10 Å du groupe P=O du CPA : Ser294 (noir),
Glu301 (rouge), Thr302 (vert), Phe206 (jaune) et Phe297 (bleu). Les résidus, l’hème et le CPA sont représentés en
bâtonnet, tandis que le reste de la protéine est représenté en rubans (logiciel Pymol). Les hélices I, G, F et B’ sont
mentionnées à titre indicatif.
Figure 6-7 Distances entre l’atome d’oxygène du groupe P=O du CPA avec un atome des résidus avoisinants :
Ser294 (noir), Glu301 (rouge), Thr302 (vert), Phe206 (jaune) ou Phe297 (bleu).
Cette information nous a permis de révéler l’existence d’un contact polaire (défavorable) entre le
groupe P=O du CPA et l’un des oxygènes du carboxylate du résidu Glu301. Comme montré sur la
Figure 6-7, la distance entre les atomes d’oxygène reste relativement constante durant toute la
simulation, et tend même à diminuer en fin de simulation. La présence de ce contact polaire
défavorable est liée au contexte environnemental du Glu301 qui se retrouve encapsulé entre des
résidus à caractère hydrophobe (cf. article, section discussion). C’est pourquoi, l’atome d’oxygène du
P=O s’oriente plus volontiers vers le Glu301, plus favorable que son voisinage. Cette interaction peut
par ailleurs être favorisée en présence d’une molécule d’eau au voisinage (cf. Figure 6-8), qui n’a
malheureusement pas été observée au cours de la dynamique.
O
δ+ δ- –
C
P=O
H H O
CPA H2O GLU 301
Figure 6-8 Interaction CPA – GLU301 favorisé par la présence d’une molécule d’eau. Les formules du CPA et
du GLU 301 sont partiellement représentées. Les interactions sont représentées par des traits en pointillés.
En résumé, GROMACS a été utilisé pour les expériences de MD dans l’article, en raison de sa
facilité d’utilisation, sa rapidité d’exécution par rapport aux autres outils disponibles, et aussi pour
l’ensemble des outils qu’il propose pour l’étude des simulations. Néanmoins, GROMACS reste
sensible à la stabilité du modèle de départ. Le programme peut diverger à la suite de « clashs »
survenant lors des processus d’équilibration ou de dynamique moléculaire, et ce, en dépit d’une
minimisation préalable.
Souvent, il a fallu modifier légèrement la position initiale du CPA dans le site actif avant de
pouvoir relancer correctement l’ensemble de la dynamique. J’avais d’ailleurs écrit un script pour
générer différentes positions initiales pour le substrat : mais l’étroitesse du site rend cette approche
souvent non productive, il n’a que peu de marge possible dans le placement initial du substrat dans le
site actif, non rattrapable dans GROMACS.
6.4.2 Utilisation d’AMBER7 sous NAMD
Dans le but de vérifier la pertinence et la reproductibilité des résultats de simulation, les

simulations ont été portées sous un autre champ de force, celui d’AMBER7 utilisé par le logiciel
NAMD. La procédure à suivre pour générer une MD avec cet outil est plus complexe que celle à
suivre pour GROMACS. Néanmoins, il était intéressant de l’expérimenter, dans la mesure où le
champ de force AMBER, contrairement à GROMOS87, est un champ de force tout atome.
6.4.2.1 Procédure pour les complexes substrat-enzyme

À l’instar de GROMACS, il faut convertir les fichiers de structures des protéines ou modèles en
fichiers de topologie (.top) et de coordonnées (.crd) afin qu’ils soient lus et traités par NAMD. La
création de ceux-ci nécessite préalablement un travail sur le fichier de structure de la protéine
(définition des extrémités N-terminales et C-terminales de la protéine, réattribution des noms des
atomes et des résidus selon le dictionnaire des librairies d’AMBER …) ainsi que l’obtention du fichier
de topologie (.prep ou .frcmod) de la molécule, non présente dans les librairies d’AMBER.
NAMD ne possède pas de serveur automatique dédié au calcul de topologie des petites molécules.
À la place, il faut utiliser antechamber, un package dédié à la création de topologies pour le champ de
force AMBER. Il existe deux méthodes pour créer la topologie des petites molécules sous
antechamber selon la manière de calculer et d’attribuer les charges à la molécule (cf. Figure 6-9). La
première méthode est réalisée par RESP qui effectue un calcul quantique pour reproduire des
potentiels électrostatiques afin d’attribuer les charges à la molécule. La seconde méthode dite
AM1BCC est de nature semi-empirique : elle consiste à calculer les charges partielles dérivées de la
fonction d’onde AM1, qui sont ensuite corrigées par BCC afin de générer et d’attribuer les charges
partielles.
Figure 6-9 Organigramme de la procédure à suivre pas à pas pour générer une topologie AMBER d’une
molécule sous antechamber. Les procédures basiques de calcul des charges sont montrées dans les rectangles en
pointillés (AM1-BCC à gauche et RESP à droite) (Source : Manuel d’antechamber)
Nous avons appliqué la méthode AM1-BCC pour construire la topologie du CPA. Par ailleurs,
NAMD ne connaît pas non plus la topologie de l’hème, contrairement à GROMACS. Une création de
topologie de l’hème sous antechamber se voyait donc également nécessaire. À la suite d’une
publication parue en 2005 (Oda et al., 2005), il a été possible d’utiliser une topologie déjà existante et
disponible sur le net.
Lorsque les deux fichiers de topologies (.prep ou .frcmod) sont construits, ils peuvent être utilisés
pour créer les fichiers de topologies et de coordonnées du complexe entier (fichier .top et .crd). Ces
derniers sont construits à l’aide de l’utilitaire Leap, utilisable sous forme de ligne de commandes.
Ainsi, c’est sous Leap que l’utilisateur demande l’attachement de l’hème à la protéine (en précisant sur
quels atomes cette liaison doit s’opérer) mais aussi la création de la boîte de solvatation périodique et
son remplissage par de l’eau et des contre-ions.
Lorsque les fichiers de topologie et de coordonnées sont générés, NAMD peut effectuer la
simulation de MD. Contrairement à GROMACS, rien n’est automatisé ici : l’utilisateur doit définir
lui-même comment les forces vont être appliquées au système, renseigner sur la taille de la boîte ainsi
que les conditions périodiques (par calcul du volume sous VMD) etc. NAMD impose donc un contrôle
complet des paramètres de la simulation. Les étapes de la simulation sont les mêmes que celles
adoptées sous GROMACS : d’abord une étape de minimisation, puis d’équilibration (principalement
en fonction de la température dans un premier temps) et une phase de dynamique moléculaire. Les
paramètres sont également identiques à ceux utilisés lors des simulations de MD sous GROMACS :
température identique à l’équilibre (300K), solvant explicite, pression constante (1 bar), nombre de pas
et durée de simulation (2 ns) etc. NAMD travaillant en « tout atome » le temps de calcul pour une
même trajectoire est plus long. Pour cette raison, seules 3 trajectoires ont été simulées sous NAMD
pour comparer avec les résultats de simulations sous GROMACS (avec les deux énantiomères) : le
modèle sauvage du CYP2B6, le simple mutant V477Y, et le double mutant, I114V/V477F.
6.4.2.2 Résultats et Analyses des simulations NAMD

Visuellement, les simulations obtenues sous NAMD ne semblent pas si différentes de celles
obtenues sous GROMACS. L’hème semble se déformer un peu plus, mais cette déformation reste
minime. Pour une analyse plus quantitative, nous avons entrepris d’analyser les résultats de simulation
sous NAMD à l’aide des outils de GROMACS présentés plus haut (section 6.4.1.2). Pour cela, il
fallait préalablement transformer les fichiers de trajectoires AMBER (.dcd) en format lisible par
GROMACS (.trr) et également construire un fichier de topologie GROMOS à partir de la structure du
système. Pour les trajectoires, cette transformation peut se faire par le logiciel VMD. En revanche, la
topologie GROMOS ne s’obtient qu’en appliquant le protocole de GROMACS (utilisation du
programme pdb2gmx).
Ces manipulations une fois réalisées, on obtient alors les résultats présentés dans les Figure 6-10
et Figure 6-11.
Figure 6-10 Évolution du RMSD du CYP 2B6 wild type (en rouge) et CYP 2B6 I114V/V477W (en noir)
durant les 2ns de MD sous NAMD. Dans les deux simulations, un plateau aux alentour de 2 Å est atteint après 1 ns
de simulation. Ce plateau est plus haut par rapport à celui obtenu sous GROMACS, et est atteint également plus
tard.
Sous le champ de force AMBER, les modèles semblent atteindre une conformation stable après
seulement 1,2 ns, ce qui est nettement plus tardif par rapport aux simulations sous GROMACS où les
modèles atteignaient leurs conformations stables à 500 ps (cf. Figure 1 de l’article). Par ailleurs, sous
AMBER, le plateau semble moins bien marqué, aux alentours de 2,3 Å, alors que sous GROMOS, il
était de 1,7 Å. Néanmoins, les simulations sont relativement similaires, dans la mesure où les modèles
atteignent au final une conformation stable, quel que soit le champ de force utilisé. En fin de
simulation de MD, le RMSD calculé sur le squelette peptidique pour le CYP 2B6wt est de 2,44 Å par
rapport à son homologue sous GROMACS, tandis que celui du CYP 2B6dm est de 2,41 Å : on obtient
à peu près les mêmes structures d’arrivée pour les deux méthodes.
Ce premier résultat est très encourageant, puisqu’il confirme que l’approche par dynamique
moléculaire en solvant explicite est fiable, et indépendamment du champ de force utilisé. Le fait aussi
que les simulations s’équilibrent autour de la même configuration dénote aussi d’une certaine
reproductibilité des modèles construits pour le CYP2B6 et ses mutants.
Après avoir vérifié la stabilité des modèles, la seconde vérification porte sur le comportement du
CPA dans le site actif du CYP 2B6 sauvage et du CYP 2B6 double mutant I114V/V477W. La Figure
7 de l’article montre justement par l’évolution des RMSDs du CPA lors de la simulation de MD la
restriction de mobilité du CPA dans le site actif du double mutant par rapport au site actif sauvage.
Cette perte de mobilité pouvait alors expliquer l’augmentation de l’efficacité de son métabolisme dans
le double mutant.
Figure 6-11 Comportement lors de la dynamique sous NAMD du CPA (énantiomère S dans cet exemple) dans
le site actif du CYP 2B6 wt (en rouge) et CYP 2B6 I114V/V477W (en noir). Comme sous GROMACS, la
tendance des amplitudes est en faveur d’une restriction de mobilité du CPA dans le site actif du double mutant.
Cette tendance est cependant moins marquée que sous GROMACS.
Sous NAMD, les mêmes fluctuations du RMSD sont retrouvées, avec différence entre le double
mutant et le sauvage un peu moins marquée que dans l’expérience sous GROMACS. L’allure générale
est conservée : le CPA semble également dans ces simulations plus contraint, moins mobile dans le
CYP 2B6 I114V/V477W que dans le CYP 2B6 sauvage. Comme pour les simulations sous
GROMACS, le « décrochage » observé en début de simulation dans le cas du CYP 2B6 double mutant
et les niveaux de RMSD correspondent au repositionnement du CPA. Les différents paliers dans le
RMSD du CPA (S) du CYP 2B6 sauvage (à 700 ps et à 1800 ps) correspondent à des changements
d’orientations du groupe P=O du CPA : par moment pointant vers l’hélice I, par moment pointant vers
le côté opposé. Ceci peut trouver une explication dans le fait qu’à part le glutamate en position 301, les
résidus voisins de l’hélice I sont à caractère hydrophobe, sans affinité particulière pour le groupe
polaire P=O du CPA : le groupe P=0 subit donc moins de répulsion en face de l’O du carboxyle du
GLU 301 que lorsqu’il fait face aux groupements hydrophobes voisins. De ce fait, ce dernier peut se
trouver soit en position défavorable (sauf lorsqu’une molécule d’eau se trouve dans le voisinage, mais
cela n’a pas été observé non plus sous NAMD), tourné vers le GLU 301 soit dans une position
opposée à l’hélice I où il se trouve la plus grande partie du temps. Dans les deux cas, aucun des deux
positionnements ne semble favoriser une position particulière du métabolisme (Carbone près du
groupement NH) plus que l’autre. À noter enfin que ce basculement du CPA est moins prononcé sur
l’énantiomère R, mais la simulation n’est peut être pas suffisamment longue pour pouvoir observer ce
phénomène.
6.5 Conclusion
Dans le cas particulier de cette collaboration entre l’équipe d’I. de Waziers et la nôtre, les
méthodes de la bioinformatique structurale ont pu apporter des réponses concrètes aux préoccupations
des cliniciens impliqués dans cette approche de prodrogue activée sous thérapie génique. La
confrontation des simulations et des paramètres cinétiques mesurés a permis en particulier de fournir
des éléments prédictifs pour la conception de nouveaux mutants. L’issue la plus notable de cette
collaboration fut l’obtention d’un double mutant du CYP 2B6 qui, selon les expériences ex vivo de
cytotoxicité sur des cellules cancéreuses humaines, présente une meilleure affinité ou du moins une
meilleure efficacité sur le CPA : le CYP 2B6 double mutant est donc un candidat à fort potentiel pour
des expériences de thérapie génique qui utilisent le CPA comme agent chimiothérapique.
Par ailleurs, d’autres simulations ont été opérées sur les modèles, visant à confirmer les premiers
résultats. Celles-ci ont été effectuées sous un champ de force et un environnement très différents. Les
résultats obtenus sont en accord avec ceux décrits dans l’article, prouvant la fiabilité des premiers
résultats obtenus.
L’ensemble de tout ce travail, à la fois expérimental, prédictif, et reproductible permet donc de

dresser un « profil » de site actif de CYP 2B6 adapté au métabolisme du CYP 2B6. Ainsi, les
mutations pour lesquelles une amélioration de l’efficacité catalytique a été observée, correspondent
dans la majeure partie des cas à des résidus positionnés dans une boucle ou une hélice faisant partie du
toit du site actif, à savoir les structures secondaires extrêmement variables des P450s : l’hélice F pour
Article 261
le mutant L199M, la boucle B–C pour les mutants F107V et I114V, et enfin le long coude en β hairpin
formé de part et d’autre du feuillet C-terminal (β4) pour les mutations de la série 477. Ces informations
viennent donc compléter les observations et remarques formulées dans les chapitres antérieurs
concernant ces fameuses régions où il était difficile aussi bien de déterminer que de positionner les
blocs structuraux lors de la reconstruction d’un modèle de CYP. Ainsi, même si les mécanismes mis
en jeu dans la reconnaissance des substrats ne sont pas encore élucidés, ces résultats apportent des
renseignements supplémentaires sur les régions impliquées dans la reconnaissance du substrat.
Par ailleurs, le façonnage du site actif du CYP 2B6 a abouti à de meilleurs résultats par voie
stérique, en respectant les polarités d’origine du site pour ne pas disperser les positions stables du CPA
dans le site actif : la stratégie « polaire » (mutation par des résidus polaires) s’est en effet conclue par
des échecs, probablement en raison d’une dissipation (ou à l’inverse, multiplicité) des positions
d’interactions établies avec le CPA, entrainant une diminution de la statistique de positionnement
favorable au métabolisme.
Enfin, le GLU 301 semble jouer un rôle important vis-à-vis du CPA. Ainsi, par remplacement de
ce résidu par une Arginine, une Glutamine ou par un groupement hydrophobe, pourrait supprimer le
basculement du CPA et orienter le groupe P=0 vers une position unique à l’opposé de l’hélice I. Le cas
d’un triple mutant a donc été soulevé avec nos collaborateurs, mais aucune expérience n’a été entamée
encore.
6.6 Article
Les pages qui suivent correspondent à l’article intitulé « Improvement of Cyclophosphamide

Activation by CYP2B6 Mutants : from in Silico to ex Vivo » (en soumission au moment de la
rédaction du manuscrit).
Quatrième Partie
Conclusion
Conclusion et perspectives
263
CHAPITRE 7
7 Bilan et nouvelles idées
« Savoir ce que tout le monde sait, ce n’est rien savoir.

Le savoir commence là où commence ce que le monde ignore.»
Rémy de Gourmont (1858– 1915 ap JC)
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266 Chapitre 7. Bilan et nouvelles idées
L’objectif de ce travail a été initialement de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués

dans la reconnaissance de substrats par les cytochromes P450, en se servant de l’exemple du CYP3A4.
Il est évident qu’en raison de la complexité du sujet et des moyens mis en œuvre pour étudier le sujet,
il n’a pas été possible ni question de venir à bout de cette problématique au bout de ces trois années de
thèse, d’autant plus que de par le monde, je n’étais pas le seul à travailler sur ce sujet : d’autres
équipes étrangères, avec parfois le soutien de compagnies pharmaceutiques, sont sur l’étude de cette
superfamille depuis déjà plusieurs années.
Je pense néanmoins avoir développé et mis en place les bases d’une méthode suffisamment
précise qui peut apporter quelques éléments de réponse à cette problématique : cette méthode allie à la
fois la recherche et la sélection de séquences de P450s, à leur reconstruction par homologie, même à
bas taux d’identité. Dans les deux cas, la méthode se base sur des informations structurales, contenues
dans des éléments particuliers et innovants : les CSBs. Afin d’exploiter l’information contenue dans
ces CSBs, l’ensemble de la méthode s’articule autour d’un programme que j’ai développé au cours de
mes trois années de thèse : le programme Caliseq. C’est ce dernier qui va permettre le positionnement
optimal des CSBs sur une séquence cible, soit vers un but de production d’alignement de séquences
(pour une construction de modèle par exemple), soit pour une identification de P450s à l’aide de ces
CSBs utilisés comme signature structurale des P450s.
Pour le moment, c’est principalement le travail d’identification de P450s, à savoir la recherche de

séquences de P450s dans un banque de données (ou dans un génome nouvellement séquencé) qui a
donné les résultats les plus prometteurs. Les alignements construits suite au positionnement des blocs
n’ont pour leur part pas pu conduire à l’obtention des meilleurs modèles lors de comparaison avec
d’autres méthodes si l’on se base sur le calcul du RMSD entre la structure connue avec le modèle.
Sachant que les jeux de templates utilisées et logiciel de reconstruction (Modeller) sollicité sont les
mêmes pour toutes les méthodes utilisées, la principale différence réside donc exclusivement au
niveau de l’alignement produit. Cet alignement multiple de séquences dépend principalement du
positionnement des blocs sur la séquence cible : si le positionnement des CSBs sur la séquence cible
est mal réalisée, toutes les étapes qui suivent s’en trouvent affectées. Pour le moment, l’information
structurale (3D) contenue dans les CSBs doit être transformée en information séquentielle (1D) pour
permettre l’alignement des blocs sur la séquence cible. Pour ne pas perdre toute l’information lors de
ce « passage » 3D vers 1D, des profils sont générés. Dans la version finale de Caliseq, ces profils sont
en outre construits à partir d’une matrice de similarité spécifique aux séquences contenues dans les
Conclusion et Perspectives 267
blocs, à savoir, ceux des templates de P450s : cela avait pour but d’aider l’alignement de ces profils
sur la séquence cible avec une fonction de score spécifique aux P450s.
De nombreuses méthodes ont été proposées pour améliorer l’alignement inter-blocs, mais aucune
en revanche n’a été suggérée pour favoriser le positionnement des blocs sur la séquence cible, en
dehors d’un calcul d’une matrice de similarité spécifique aux P450s. Il est donc intéressant en
perspective de faire un tour rapide des informations à « mi-chemin » entre la 3D et la 1D qui n’ont pas
été encore exploitées pour améliorer le positionnement des blocs sur la séquence cible par Caliseq, et
pouvoir trancher sur les incertitudes rencontrées au cours de la thèse pour les blocs « flous ».
La première idée qui vient à l’esprit est l’utilisation des éléments de structures secondaires dans
les alignements. Ceux-ci ne seraient pas exploités à la manière de Matras, comme base pour
l’alignement structural, mais plutôt comme une information supplémentaire qui seraient incluse ou
non dans le profil. Il conviendrait alors d’appliquer le logiciel DSSP sur les templates, pour avoir les
informations de structures secondaires de ces templates. Concernant la séquence cible, il n’est pas
possible d’attribuer les SSEs dans la mesure où la structure est censée être inconnue, mais il est en
revanche possible de les prédire grâce à des logiciels comme PSIPRED (Jones, 1999) par exemple.
Lors d’essais de PSIPRED sur les séquences de P450s (dont les structures sont connues) j’ai obtenus
des résultats d’une fiabilité de 50 à 60% en moyenne, où des décalages d’hélices sont observés par
exemple, entre les SSEs de la structure réelle et ceux prédits par PSIPRED. Au vu de ces résultats, il
paraît donc dangereux d’enrichir l’information des blocs par cette information de structure secondaire
prédite sur la structure cible par PSIPRED et fournie des templates à partir de DSSP. Il serait
néanmoins intéressant d’essayer en attendant une amélioration de PSIPRED ou d’un logiciel
équivalent.
L’équipe de JP. Mornon (CNRS UMR 7590) a beaucoup travaillé sur la présence de résidus
hydrophobes cruciaux, à certaines positions spécifiques dans des alignements structuraux, formant des
« amas hydrophobes » lors du repliement. La conservation de repliement des protéines serait liée à la
présence et à la position dans la séquence de ces résidus hydrophobes qui constitueraient le cœur de la
protéine. Ces amas hydrophobes se formeraient dans les tout premiers stades de repliement de la
protéine et guideraient la formation ultérieure des structures secondaires (Papandreou et al., 2004). La
méthode HCA, ou Hydrophobic Cluster of Analysis (Gaboriaud et al., 1987), repose sur la détection et
l’analyse de ces amas hydrophobes et permet entre autres, la comparaison de séquences, même très
divergentes. Comme il s’agit ici de comparer des séquences à basse identité de séquence (< 30%), on
pourrait envisager d’utiliser cette information d’amas hydrophobe dans le positionnement des CSBs
sur la séquence cible. En effet, ces CSBs sont censés contenir l’information de repliements conservés
spécifiques des P450s : l’utilisation des amas hydrophobes renforcerait peut être l’information de
conservation de repliement contenue dans les CSBs.
Ces deux approches (prise en compte des SSEs et des amas hydrophobes) pour améliorer le
positionnement des blocs sur la séquence cible seraient déjà intéressantes à étudier. Le positionnement
correct des blocs étant la clef vers la reconstruction de modèles plus précis, il est crucial de trouver des
approches pour l’améliorer.
Lorsque les deux approches seront réellement au point, il sera alors temps de les combiner pour
fournir des éléments de réponse à la problématique posée. En effet, la force de la méthode ne se situe
pas dans les deux approches prises indépendamment –d’autant plus que depuis le début du mois
d’Août, une banque spécifique des P450s, appelée CYPED est disponible (Fischer et al., 2007)– mais
dans leur utilisation complémentaire : à terme, l’objectif consiste à construire une véritable banque de
sites actifs de P450s, à partir des séquences identifiées et reconstruites à partir des CSBs. Cette banque
qui sera mise à disposition de la communauté scientifique (idéalement au travers d’un serveur) peut
servir de base de cibles structurales pour le criblage virtuel des divers composés chimiques ou
médicamenteux, avec dans l’idéal, la possibilité de faire un tri grossier entre P450 affins et non affins
pour une molécule donnée. Une telle banque peut permettre des comparaisons pour tester des
méthodes rapides de docking en soumettant des molécules connues dont les cibles sont identifiées.
Elle peut aussi fournir des éléments de réponse sur les mécanismes de reconnaissance des substrats par
les P450s. Enfin des expériences de mutations in silico comme ceux opérés dans le modèle du CYP
2B6 pour des expériences de thérapie génique, pourront être effectuées à partir des modèles de cette
banque.
Pour le moment, je n’en suis pas encore là, dans la mesure où il faudrait préalablement doter la
méthode d’une automatisation qui réaliserait toutes les étapes entre le positionnement des blocs sur la
séquence cible et la reconstruction et la validation du modèle obtenu à partir de l’alignement.
Par ailleurs, la banque de sites actifs présenterait une valeur ajoutée si elle était conçue de manière
à ce que l’utilisateur puisse soumettre en requête un composé chimique et récupérer en résultat les
modèles de P450s qui présenteraient la meilleure affinité pour ce ligand. Pour cela, il faudrait donc
doter la banque d’un moyen « d’apprentissage » qui en fonction du ligand soumis, décidera quels
Conclusion et Perspectives 269
P450s retourner. L’idée que je propose pour répondre à ce problème est l’utilisation combinée des
méthodes d’apprentissage (comme les SVM pour Support Vector Machine) aux méthodes de
Screening Virtuels à Haut débit. Pour chaque modèle de P450 de cette banque, il faudrait rassembler
dans un premier temps, l’ensemble des ligands du P450 étudié dont les données biochimiques sont
disponibles, puis les séparer en deux groupes (généralement 2/3-1/3), les premiers pour l’apprentissage
et les seconds pour le test. Ces ligands seraient utilisés dans des essais de criblage et le score attribué à
chaque arrimage serait appris par le SVM. Cette étape est importante, dans la mesure où il faudra
indiquer au SVM s’il a bien appris avec les donnés du premier groupe (distinguer les ligands reconnus
par le P450 des ligands non reconnus en fonction du score). Une fois l’apprentissage effectué, les
ligands du jeu de test seraient alors « dockés » dans chaque P450 et selon le score d’arrimage (et ce
qu’il a appris), le SVM serait en mesure de déterminer si le ligand testé devrait être reconnu ou non
par le P450 concerné. Par cette méthode, c’est le score d’arrimage qui servira à déterminer les CYPs
qui reconnaissent le ligand soumis.
Ne disposant pas encore de cette banque, j’ai tout de même fait appel à M. Montes (INSERM
U648), pour des essais de criblage virtuel à haut débit sur certaines structures de P450s disposant d’un
ligand co-cristallisé. L’idée était de vérifier la faisabilité des expériences de docking automatisé sur ce
genre de protéine. Les premiers résultats de docking par divers logiciels de docking (FRED, GOLD,
FLEX, AutoDock) obtenus avec le CYP 2C921 et son ligand (8-bromo-adenosine-5'-monophosphate)
co-cristallisé (pdb 1ro9) n’ont pas abouti aux résultats espérés : un positionnement similaire du ligand
dans le site actif, à celui du cristal X a été observé, mais inversé au niveau de la polarité (l’atome à
métaboliser se retrouvant à l’opposé du fer de l’hème). Nous n’avons pas eu le temps d’explorer
davantage ces méthodes pour le moment. Dans tous les cas, il faudra nécessairement réussir à
reproduire un positionnement de ligand observé dans les cristaux à partir de ces logiciels de docking
dans un premier temps, avant d’envisager un criblage à plus grande échelle. Une fois les premiers tests
avec des données structurales concluants, il sera alors le moment d’expérimenter des données
biochimiques dont on ne dispose d’aucune information structurale. Pour cela, différents
positionnements des ligands seront retenus, et ce n’est plus un score unique d’arrimage qui est appris
pour un complexe (P450-substrat) donné, mais une répartition ou plutôt, un intervalle de confiance. Ce
n’est qu’une fois ces expériences validées, que la méthode pourra être applicable sur une banque de
sites actifs de P450s.
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Nous avons commencé par le CYP 2C9 dans la mesure où c’était le P450 qui disposait le plus de données
expérimentales (aussi bien structurales que biochimiques).
Il reste donc beaucoup à faire, et l’issue de la méthode proposée (élaboration de la banque de sites
actifs, couplée avec un système d’apprentissage) ne fournira qu’un outil de travail pour la
problématique posée : les mécanismes de reconnaissances moléculaire par les P450s sont loin d’être
élucidés. Finalement, mon travail de thèse a été réellement insignifiant par rapport à la masse de
travail qui reste encore à fournir pour comprendre ces enzymes. Ma pierre posée à l’édifice de la
connaissance des P450s me parait si fragile et anodine. Je suppose que c’est l’état d’esprit de la plupart
des étudiants qui arrivent au terme de leur thèse, frustrés de n’avoir pu en faire plus. Je me console
tant bien que mal en me disant que je ne suis pas seul à travailler sur ce sujet, et que cela fait déjà plus
d’un demi-siècle que les chercheurs se concentrent sur cette superfamille.
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ZHAO, Q., MODI, S., SMITH, G., PAINE, M., MCDONAGH, P. D., WOLF, C. R., TEW, D., LIAN, L. Y., ROBERTS, G.
C. et DRIESSEN, H. P. (1999). "Crystal structure of the FMN-binding domain of human cytochrome P450
reductase at 1.93 A resolution." Protein Sci 8(2): 298-306.
ZHAO, Y., WHITE, M. A., MURALIDHARA, B. K., SUN, L., HALPERT, J. R. et STOUT, C. D. (2006). "Structure of
microsomal cytochrome P450 2B4 complexed with the antifungal drug bifonazole: insight into P450
conformational plasticity and membrane interaction." J Biol Chem 281(9): 5973-81.
ZIMMERMANN, K. (1991). "ORAL: All Purpose Molecular Mechanics Simulator and Energy Minimizer." J.
Comput. Chem. 12: 310-319.
Annexes
289
ANNEXE 1
Annexe 1 Le monde merveilleux des protéines
« Pour réaliser quelque chose de vraiment extraordinaire,

commencez par la rêver »
Walt Disney (1901 – 1966 ap JC)
292 Annexe 1. Le monde merveilleux des protéines
1.1 Généralités
Les protéines sont parmi les principaux types de molécules du vivant (les autres étant les acides
nucléiques, les lipides et les glucides). Dans la cellule elles assurent la grande majorité des fonctions
enzymatiques, et une bonne part des fonctions de maintien de la structure et de transport. Ces protéines
disposent d’une organisation à quatre niveaux :
- Structure primaire : séquence d’acides aminés ;

- Structure secondaire : répartition de certaines structures locales régulières nommées
structures secondaires (hélice α et feuillet β) ;
- Structure tertiaire : organisation dans l’espace comprenant l’interaction entre eux des
éléments de structure secondaire ;
- Structure quaternaire : organisation spatiale de monomères (protéines multimériques).
1.2 Les composants de la protéine : les acides aminés

1.2.1 Structure générale d’un acide aminé
Au nombre de 20 (si on ne compte que les acides aminés naturels terrestres), les acides aminés
sont les constituants de la protéine (ou du peptide). Ils sont composés d’un atome de carbone central
(Cα) chiral le plus souvent (exception de la glycine), lié à un groupe aminé (NH2), à un groupe
carboxylique (COOH), à un atome d’hydrogène (Hα) et à un des 20 groupements chimiques différents
appelés chaînes latérales (cf. Figure A 1-1 et Figure A 1-2).
Figure A 1-1 Schéma simplifié d'une séquence primaire d’une protéine. R correspond à n’importe quelle
chaîne latérale parmi les 20 existantes. Les acides aminés sont reliés entre eux par des liaisons peptidiques.
(source : http://www2.lifl.fr/~touzet/BI/TP2)
Les composants de la protéine : les acides aminés 293
L-Cystéine (Cys / C) Acide L-glutamique (Glu / E) L-Glutamine (Gln / Q) Glycine (Gly / G)
L-Histidine (His / H) L-Isoleucine (Ile / I) L-Leucine (Leu / L) L-Lysine (Lys / K)
L-Méthionine (Met / M) L-Phénylalanine (Phe / F) L-Proline (Pro / P) L-Sérine (Ser / S)
L-Thréonine (Thr / T) L-Tryptophane (Trp / W) L-Tyrosine (Tyr / Y) L-Valine (Val / V)

Figure A 1-2 Formules chimiques des 20 acides aminés avec leur code à 3 lettres et à une
lettre.
Les résidus et leurs fonctions chimiques différentes confèrent aux protéines leur diversité
fonctionnelle. Les protéines sont des chaînes polypeptidiques où le groupe α-carboxylique d’un acide
aminé est relié au groupe α-aminé de l’amino-acide suivant par une liaison peptidique (–CO–NH–).
Les protéines naturelles sont généralement constituées de 50 à 2000 résidus d’acide aminé (Stryer,
1994). La chaîne non ramifiée des résidus est polarisée de l’extrémité aminée (extrémité NH2
terminale) à l’extrémité carboxy-terminale (COOH). La chaîne d’atome répétant régulièrement les
liaisons peptidiques se nomme le squelette peptidique (ou carboné si seuls les Cα sont pris en compte).
La liaison peptidique est rigide et plane en raison du caractère partiel de double liaison –CO–NH–,
mais des rotations sont possibles autour des autres liaisons (Cα–CO et NH– Cα).
1.2.2 Propriétés générales des acides aminés
Figure A 1-3 Diagramme de Venn des propriétés des acides aminés.
1.2.2.1 Solubilité
La plupart des acides aminés subissent facilement la solvatation par les solvants polaires tels que
l'eau, ou l'alcool (particulièrement proline et hydroxyproline) dans lesquels ils sont solubles. D'autre
part, les acides α-aminés sont solubles, mais à moindre degré dans les solvants non polaires. Il est
important de retenir que cette solubilité est largement dépendante des propriétés de la chaîne latérale:
la solubilité diminue avec le nombre d'atomes de carbone du radical, mais inversement augmente si ce
radical R est porteur de fonctions polaires (NH2, COOH) ou hydrophiles (OH).
1.2.2.2 Propriétés ioniques

Les acides aminés contiennent un groupement carboxyle -COOH acide et un groupement
amino -NH2 basique. En solution, ces groupements existent sous deux formes, l'une chargée, l'autre
neutre :
- +
R-COOH ; R-COO + H
+ +
R-NH3 ; R-NH2 + H
Les acides aminés sont appelés pour cette structure diionique amphotères. L'ionisation varie avec
le pH : les acides aminés existent, en solution aqueuse, sous 3 formes possibles :
Les composants de la protéine : les acides aminés 295
a) en milieu acide : La fonction amine s'ionise en captant un proton et la dissociation du

carboxyle est inhibée. L'acide aminé se trouve sous forme de cation.
b) en milieu basique La fonction acide s'ionise en libérant un proton, la base du milieu bloque
l'ionisation du groupement amino. L'acide aminé se trouve sous forme d'anion.
c) Le pH pour lequel les 2 dissociations s'effectuent est appelé point isoélectrique : ou pHi. À ce
pH, on a un ion dipolaire ou zwitterion de charge nette nulle, donc ne migrant pas dans un
champ électrique.
De part et d'autre du pHi, on définit des pH qui correspondent à une demi-dissociation de COOH
et de NH3+, ce sont les pKs. Il existe donc 2 pK :
• le pK de COOH (environ 2 – 3)
• le pK de NH3+ (environ 10)
Le point (ou pH) isoélectrique ou isoionique est égal à la demi somme des pKs. Le radical R,
lorsqu'il renferme un groupe ionisable, participe à la valeur du point isoélectrique. Un pK
supplémentaire apparaît alors. Par exemple pour l'histidine :
• pK1 acide
• pK2 demi dissociation du groupe imidazole
• pK3 amine
1.2.2.3 Propriétés des chaînes latérales

Les interactions entre atomes de chaînes latérales et celles entre atomes du squelette
polypeptidique sont responsables du repliement des protéines et de sa stabilité. On observe trois types
de liaisons non covalentes dans les protéines : (a) les liaisons hydrogènes, (b) les interactions de Van
der Waals et (c) les interactions électrostatiques. La liaison hydrogène est formée lorsqu’un atome
d’hydrogène est partagé entre un donneur d’hydrogène (l’atome lié covalemment à l’hydrogène) et un
accepteur d’hydrogène. Les liaisons électrostatiques interviennent entre atomes chargés positivement
et négativement. Enfin, les liaisons de Van der Waals sont des liaisons de type dipôle induit – dipôle
induit : une asymétrie passagère de charge autour d’un atome (possible parce que la distribution
électronique de charge autour d’un atome évolue avec le temps) induit une asymétrie opposée dans un
atome adjacent : ils s’attirent alors mutuellement. Les liaisons de Van der Waals sont plus faibles que
les liaisons hydrogène ou électrostatiques, mais elles sont efficaces en grand nombre. Ces liaisons sont
les principales responsables du repliement des protéines.
Enfin, l’encombrement stérique joue également un rôle dans la structure des protéines car lorsque
la chaîne protéique s’enroule, une chaîne latérale encombrante peut empêcher une courbure forte. La
répulsion des atomes est provoquée par le recouvrement des nuages électroniques lorsque les atomes
se rapprochent. Les liaisons covalentes inter-résidus – sous forme de points disulfures entre les résidus
cystéines – permettent une meilleure stabilité pour les protéines qui sortent de l’environnement
cellulaire (Brandon et Tooze, 1999).
1.3 Propriétés structurales des protéines

1.3.1 Détermination
1.3.1.1 La Radiocristallographie aux rayons X

La cristallographie aux RX est la méthode de choix pour résoudre la structure atomique des
protéines. La première structure déterminée par cristallographie fut la myoglobine : elle a été
déterminée par M. Perutz et Sir J.C Kendrew en 1958 (Kendrew et al., 1958, Prix Nobel de Chimie en
1959). Cette méthode s’appuie sur la diffraction des RX par les électrons dans un cristal. Le principe
repose sur un concept simple : les RX diffractés par les différents « plans » réticulaire du cristal seront
en phase à différents angles d’incidence selon la longueur d’onde du rayonnement (obtention de la
distance entre ces plans par interférence). Le nuage électronique des atomes lourds (la « densité
électronique ») est déterminé par cette méthode. La seconde étape consiste à placer les atomes
correctement dans cette densité électronique par des techniques de modélisation moléculaire. La
limitation la plus importante de la cristallographie est l’obtention d’un cristal de protéine, opération
difficile voir impossible, notamment pour les protéines membranaires pour les protéines flexibles.
1.3.1.2 La Résonance Magnétique Nucléaire

La RMN permet d’obtenir la structure des protéines en solution. Plusieurs paramètres
géométriques peuvent être calculés sur la structure protéique, comme les angles de torsion par la
mesure du couplage scalaire, ou bien les distances entre atomes (hydrogène généralement) via la
mesure du couplage dipolaire (Nuclear Overhauser Effect ou NOE). Ces dernières mesures étant
sensibles à la dynamique de la protéine, elles peuvent donner une indication sur celle-ci. Les
contraintes de distances entre atomes obtenues par RMN sont utilisées lors de calculs de dynamique
moléculaire afin d’approcher la structure de la protéine (et sa dynamique). Une des limitations de la
RMN porte sur la taille de la protéine à analyser.
Propriétés structurales des protéines 297
1.3.2 Arrangement structural
1.3.2.1 Le repliement
En théorie, une protéine pourrait adopter plusieurs conformations mais concrètement, la plupart se
replie spontanément dans une forme stable particulière et unique. Cette forme particulière provient du
fait que les groupes polaires du squelette peptidique et les chaînes latérales interagissent entre eux et
aussi avec l’eau. Ainsi, certaines conformations ont plus d’interactions stabilisantes que d’autres et
sont donc favorisées (Alberts et al., 1994). Le paradigme du rapport entre la séquence protéique et sa
structure tridimensionnelle provient des études de C. Anfinsen sur la ribonucléase (Anfinsen, 1973). Il
a déterminé qu’une protéine repliée aléatoirement est inactive et que les protéines isolées en solution
peuvent retrouver leur conformation active originale après dénaturation. La conclusion était donc que
toute l’information nécessaire au repliement d’une protéine devait être inhérente à l’ordre des acides
aminés (Alberts et al., 1994). D’autres études ont également tiré les mêmes conclusions, menant à la
théorie générale que la séquence des acides aminés d’une protéine spécifie sa conformation (Stryer,
1994). Il est intéressant de noter que sur l’ensemble des séquences possibles, la population des
différents repliements est limitée, 9 repliements représentent 46% des protéines d’une base de données
non redondante (Thornton et al., 1995). Pour résumer, en environnement aqueux, le repliement des
protéines est conduit par la tendance des résidus hydrophobes à être exclus de l’eau. Les résidus et les
groupes polaires du squelette peuvent interagir entre eux dans le cœur hydrophobe et avec l’eau à
l’extérieur. Le repliement des protéines destinées aux environnements non aqueux, par exemple les
protéines membranaires, diffère car les résidus non polaires ne doivent plus forcément se trouver dans
un cœur hydrophobe.
1.3.2.2 L’organisation de la structure des protéines

Outre les quatre niveaux d’organisation décrits précédemment, d’autres niveaux sont souvent
ajoutés à cette hiérarchie. Par exemple, on définit les structures super-secondaires (supersecondary
structures) ou les domaines.
- Les structures secondaires sont des conformations locales et périodiques présentes dans les
protéines. Les hélices alpha et les brins bêta – ces dernier étant associés par paires ou plus de
manière parallèle ou anti-parallèle – en sont les plus fréquences. Ces structures locales sont
stabilisées par des liaisons hydrogènes. Elles sont aussi nommées structures périodiques car
elles sont caractérisées par une répétition de valeur d’angles (φ,ψ) ou (α,τ) proches. L’hélice α
la plus fréquente est une hélice droite comportant 3,6 résidus par tour. Elle est stabilisée par
des liaisons hydrogène, entre le groupe CO du résidu i et le groupe NH du résidu i + 4 (cf.
Figure A 1-4 A et B). D’autres hélices droites existent telles les hélices 3-10 et les hélices pi.
Les hélices gauches sont très peu fréquentes. Dans le feuillet β, les liaisons hydrogènes
établies mettent en jeu des régions distantes. Les brins β sont donc généralement organisés en
feuillets β parallèles ou antiparallèles (cf. Figure A 1-4 C), mais des coudes « bêta » peuvent
aussi se former. Les résidus qui n’appartiennent pas à une structure locale de ces types sont
dits organisés en boucle. Tous ces termes (hélices α, brins/feuillets β) sont par la suite
regroupés sous le terme de Secondary Structure Elements (SSE).
Figure A 1-4 Structures secondaires – Pour les trois figures, les traits pointillés indiquent les liaisons
hydrogènes. (A) hélice α (source : http://pages.usherbrooke.ca/bcm-514-bl/2b.html); (B) trois types d’hélice α
(source : http://www.imb-jena.de/IMAGE.html); (C) Brins et feuillets β. Les chaînes latérales (R) se répartissent
de part et d’autre du feuillet. (source : http://sti-bio.scola.ac-paris.fr/pedago/proteines/html/structure_prot.html)
- Les structures super-secondaires (Rao et Rossmann, 1973 ; Richardson, 1981) sont des
organisations de structures secondaires récurrentes dans les protéines. Elles se situent donc
entre les niveaux de structure secondaire et tertiaire. Certaines des plus connues sont les
Propriétés structurales des protéines 299
motifs βαβ où deux brins β parallèles sont reliés par une hélice α et les motifs en épingle à
cheveux (β hairpin et α hairpin).
- Entre ce denier niveau et les structures tertiaires se trouvent également les domaines. La
définition du terme domaine est délicate et n’est pas consensuelle. Un domaine structural est
défini comme étant une unité compacte qui pourrait être stable indépendamment même si cela
n’a pas été prouvé expérimentalement (Rose, 1979). Néanmoins, les résidus d’un domaine
structural partagent plus de contact entre eux qu’avec d’eux d’un autre domaine. Le terme de
domaine fonctionnel est lié à la notion de site fonctionnel (par exemple site de fixation d’une
molécule). Les domaines fonctionnels sont plus restreints en terme d’étendue et de nombre de
résidus et peuvent être localisés à l’interface des domaines structuraux.
ANNEXE 2
Annexe 2 Fichier, Format et Exemples
« Sans exemple, on ne peut renseigner correctement. »

Columelle (1e siècle ap JC)
302 Annexe 2. Fichier, Format et Exemples
2.1 Format standard des fichiers de séquences et de structures
A l’image des banques, il existe une multitude de format utilisé pour présenter les données
sources. Certains sont bien entendu plus utilisés que d’autres suivant le besoin : ils ne sont pas égaux
en termes d’informations. Durant ma thèse, j’ai principalement utilisé trois types de format : deux pour
les séquences et la dernière pour les structures.
2.1.1 Les formats FASTA et CLUSTAL pour les séquences
2.1.1.1 Le format FASTA

Le format fasta est un forma basé sur du texte pour représenter soit une séquence nucléique soit
une séquence protéique, dans lesquelles chaque base (ou résidu) est représenté par un code à simple
lettre. Ce format permet également de renseigner la séquence sur son nom ou toute sorte de
commentaire dans un champ spécial précédent la séquence. C’est un format simple qui le rend très
facilement manipulable par des scripts de « parsing ». Une séquence au format fasta commence
toujours par une ligne unique de description (appelé header), suivi par des lignes de données de
séquences. La ligne de description se distingue des lignes de données de séquences par le symbole
« > » (chevron) à la première colonne. Tout ce qui suit ce symbole sur cette ligne est considéré comme
description. On a coutume de placer juste après le chevron l’identifiant de la séquence. En principe, il
ne devrait pas y avoir d’espace entre le chevron et l’identifiant. Il n’y a pas de taille limite pour cette
première ligne, mais on recommande généralement de mettre un texte inférieur à 80 caractères. La
séquence est considérée entière lorsqu’on atteint la fin du fichier ou qu’une autre ligne débute par le
chevron, indiquant la présence d’une nouvelle séquence.
>gi|117205|sp|P20813|CP2B6_HUMAN Cytochrome P450 2B6 (CYPIIB6) (P450 IIB1)

MELSVLLFLALLTGLLLLLVQRHPNTHDRLPPGPRPLPLLGNLLQMDRRGLLKSFLRFREKYGDVFTVHL
GPRPVVMLCGVEAIREALVDKAEAFSGRGKIAMVDPFFRGYGVIFANGNRWKVLRRFSVTTMRDFGMGKR
SVEERIQEEAQCLIEELRKSKGALMDPTFLFQSITANIICSIVFGKRFHYQDQEFLKMLNLFYQTFSLIS
SVFGQLFELFSGFLKYFPGAHRQVYKNLQEINAYIGHSVEKHRETLDPSAPKDLIDTYLLHMEKEKSNAH
SEFSHQNLNLNTLSLFFAGTETTSTTLRYGFLLMLKYPHVAERVYREIEQVIGPHRPPELHDRAKMPYTE
AVIYEIQRFSDLLPMGVPHIVTQHTSFRGYIIPKDTEVFLILSTALHDPHYFEKPDAFNPDHFLDANGAL
KKTEAFIPFSLGKRICLGEGIARAELFLFFTTILQNFSMASPVAPEDIDLTPQECGVGKIPPTYQIRFLP
R
>gi|85544275|pdb|2BDM|A Chain A, Structure Of Cytochrome P450 2b4 With Bound Bifonazole

MAKKTSSKGKLPPGPSPLPVLGNLLQMDRKGLLRSFLRLREKYGDVFTVYLGSRPVVVLCGTDAIREALV
DQAEAFSGRGKIAVVDPIFQGYGVIFANGERWRALRRFSLATMRDFGMGKRSVEERIQEEARCLVEELRK
SKGALLDNTLLFHSITSNIICSIVFGKRFDYKDPVFLRLLDLFFQSFSLISSFSSQVFELFSGFLKYFPG
THRQIYRNLQEINTFIGQSVEKHRATLDPSNPRDFIDVYLLRMEKDKSDPSSEFHHQNLILTVLSLFFAG
TETTSTTLRYGFLLMLKYPHVTERVQKEIEQVIGSHRPPALDDRAKMPYTDAVIHEIQRLGDLIPFGVPH
TVTKDTQFRGYVIPKNTEVFPVLSSALHDPRYFETPNTFNPGHFLDANGALKRNEGFMPFSLGKRICLGE
GIARTELFLFFTTILQNFSIASPVPPEDIDLTPRESGVGNVPPSYQIRFLARHHHH
Figure A 2-1 Exemple de format fasta

Format standard des fichiers de séquences et de structures 303
Après la ligne de description, un ou plusieurs commentaires peuvent apparaître sous forme de

colonne. Comme la plupart des BDD ne reconnaisse pas ces commentaires, leur utilisation s’est vu
disparaître, alors qu’elles font partie de la nomenclature officielle de ce format. Concernant
l’extension de fichier, les fichiers au format fasta arborent généralement les
extensions .fasta, .fsa, .fna, .fa ou encore .mfa. Une dernière remarque concerne la partie
« identifiant » de la séquence au niveau de la première ligne. Cette partie est maintenant codifiée
comme il apparaît en Figure A 2-2.
GenBank gi|gi-number|gb|accession|locus
EMBL Data Library gi|gi-number|emb|accession|locus
DDBJ, DNA Database of Japan gi|gi-number|dbj|accession|locus
NBRF PIR pir||entry
Protein Research Foundation prf||name
SWISS-PROT sp|accession|name
Brookhaven Protein Data Bank (1) pdb|entry|chain
Brookhaven Protein Data Bank (2) entry:chain|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
Patents pat|country|number
GenInfo Backbone Id bbs|number
General database identifier gnl|database|identifier
NCBI Reference Sequence ref|accession|locus
Local Sequence identifier lcl|identifier
Figure A 2-2 Nomenclature de la partie « identifiant »
2.1.1.2 Le format d’alignement Clustal

Il s'agit d'un format standard d'alignement de séquences nucléotidiques ou protéiques. C'est le
format de sortie de l'outil d'alignement multiple Clustalw. Le mot CLUSTAL figure sur la première
ligne du fichier. L'alignement est divisé en bloc de longueur fixe où chaque ligne de ce bloc
correspond à une séquence. Chaque ligne de chaque bloc commence avec le nom de la séquence (sur
un nombre de caractères limité, maximum 10), suivi d'au moins un espace. La séquence est ensuite
représentée: en majuscules ou minuscules, les gaps sont indiqués par des tirets hauts "–". Le nombre
de résidus est parfois ajouté à la fin de la première ligne de chaque bloc. Un exemple de format Clustal
est présenté en Figure A 2-3.
CLUSTAL W (1.8) multiple sequence alignment

1 60
TRGJ1_01 ------------GAATTATTATAAGAAACTCTTTGGCAGTGGAACAACACTGGTTGTCAC
TRGJ2_01 ------------GAATTATTATAAGAAACTCTTTGGCAGTGGAACAACTCTTGTTGTCAC
TRGJP_01 TGGGCAAGAGTTGGGCAAAAAAATCAAGGTATTTGGTCCCGGAACAAAGCTTATCATTAC
TRGJP1_01 --------ATACCACTGGTTGGTTCAAGATATTTGCTGAAGGGACTAAGCTCATAGTAAC
TRGJP2_01 --------ATAGTAGTGATTGGATCAAGACGTTTGCAAAAGGGACTAGGCTCATAGTAAC
** **** ** ** * ** * * **
61 68
TRGJ1_01 AG------
TRGJ2_01 AG------
TRGJP_01 AG------
TRGJP1_01 TTCACCTG
TRGJP2_01 TTCGCCTG
Figure A 2-3 Exemple de format Clustal

2.1.2 Le format PDB pour les structures
Le format le plus couramment observé pour les structures est le format pdb, format original de la
banque. Le guide de ce format a été révisé à plusieurs reprises ; la version actuelle est la version 2.2,
qui existe depuis 1996. Les fichiers au format pdb contiennent différentes informations telles que les
coordonnées cartésiennes des atomes, la bibliographie, les informations structurales, les facteurs de la
structure cristallographique et les données expérimentales de la RMN. A l’origine, le format pdb a été
dicté par l’utilisation et la largeur de cartes perforées pour ordinateur. En conséquence, chaque ligne
contient exactement 80 caractères. Un fichier au format pdb est un fichier texte où chaque colonne
possède sa signification : chaque paramètre est positionné de façon immuable. Ainsi, les 6 premières
colonnes, c’est-à-dire les 6 premiers caractères pour une ligne donnée, déterminent le champ du fichier.
On retrouve par exemple les champs « TITLE_ » (c'est-à-dire le titre de la macromolécule étudiée),
« KEYWDS » (les mots-clé de l’entrée), « EXPDTA » qui donne des informations sur la méthode
expérimentale employée, « SEQRES » (la séquence de la protéine étudiée), « ATOM__ » ou
« HETATM », champs comprenant toutes les informations liées à un atome particulier. Dernier
exemple, dans ces derniers champs, le nom de l’atome est décrit par les colonnes 13 à 16 (soit du
treizième au seizième caractère de la ligne). Les lignes « ATOM__ » concernent les acides aminés ou
les acides nucléiques, et les lignes « HETATM » sont dédiées aux autres molécules (solvant, substrat,
ion, détergent…). Il y a autant de lignes « ATOM__ » et « HETATM » que d’atomes observés par
l’expérimentateur, pour une macromolécule ou un complexe donné.
La longue histoire du format pdb a abouti sur des données non uniformes. Ce format laisse
également la place à de nombreuses erreurs, qui ne sont pas systématiquement éliminées lors des
contrôles accompagnant le dépôt des structures. Il peut s’agir de désaccords entre la séquence et les
résidus représentés, ou de problèmes liés à la nomenclature des atomes des acides aminés ou des
ligands. Par ailleurs, ce format présente des limites liées à sa conception même : le fait même qu’il ne
puisse contenir que 80 colonnes fait de lui un format relativement restrictif. Le nombre maximum
d’atomes d’un fichier pdb est de 99999, vu qu’il n’y a que 5 colonnes allouées pour les numéros des
atomes. De même le nombre de résidus par chaîne est au maximum de 9999 : il n’y a que 4 colonnes
autorisées pour ce chiffre. Le nombre de chaînes, lui, est limité à 62 : une seule colonne est disponible,
et les valeurs possibles sont une des lettres des 26 lettres de l’alphabet, en minuscule ou en majuscule,
ou un des chiffres de 0 à 9. Quant ce format a été défini, ces limitations ne semblaient pas restrictives,
mais elles ont plusieurs fois été franchies lors du dépôt de structures extrêmement grandes, comme des
virus, des ribosomes ou des complexes multienzymatiques.
Format standard des fichiers de séquences et de structures 305
HEADER OXIDOREDUCTASE 17-JUN-04 1TQN

TITLE CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN MICROSOMAL P450 3A4
COMPND MOL_ID: 1;
COMPND 2 MOLECULE: CYTOCHROME P450 3A4;
COMPND 3 CHAIN: A;
COMPND 4 EC: 1.14.14.1;
COMPND 5 ENGINEERED: YES
SOURCE MOL_ID: 1;
SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS;
SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN;
SOURCE 4 GENE: CYP3A4;
SOURCE 5 EXPRESSION_SYSTEM: ESCHERICHIA COLI;
SOURCE 6 EXPRESSION_SYSTEM_COMMON: BACTERIA;
SOURCE 7 EXPRESSION_SYSTEM_STRAIN: DH5 ALPHA;
SOURCE 8 EXPRESSION_SYSTEM_VECTOR_TYPE: PLASMID;
SOURCE 9 EXPRESSION_SYSTEM_PLASMID: PSE3A4DHHIS
KEYWDS P450, CYP3A4, MONOOXYGENASE, DRUG METABOLIZING ENZYME,
KEYWDS 2 OXIDOREDUCTASE, HEME
EXPDTA X-RAY DIFFRACTION
AUTHOR J.K.YANO,M.R.WESTER,G.A.SCHOCH,K.J.GRIFFIN,C.D.STOUT,
AUTHOR 2 E.F.JOHNSON
REVDAT 2 14-SEP-04 1TQN 1 JRNL
REVDAT 1 27-JUL-04 1TQN 0
JRNL AUTH J.K.YANO,M.R.WESTER,G.A.SCHOCH,K.J.GRIFFIN,
JRNL AUTH 2 C.D.STOUT,E.F.JOHNSON
JRNL TITL THE STRUCTURE OF HUMAN MICROSOMAL CYTOCHROME P450
JRNL TITL 2 3A4 DETERMINED BY X-RAY CRYSTALLOGRAPHY TO 2.05-A
JRNL TITL 3 RESOLUTION
JRNL REF J.BIOL.CHEM. V. 279 38091 2004
JRNL REFN ASTM JBCHA3 US ISSN 0021-9258
REMARK 1
[…]
SEQRES 1 A 486 MET ALA LEU TYR GLY THR HIS SER HIS GLY LEU PHE LYS
SEQRES 2 A 486 LYS LEU GLY ILE PRO GLY PRO THR PRO LEU PRO PHE LEU
SEQRES 3 A 486 GLY ASN ILE LEU SER TYR HIS LYS GLY PHE CYS MET PHE
SEQRES 4 A 486 ASP MET GLU CYS HIS LYS LYS TYR GLY LYS VAL TRP GLY
SEQRES 5 A 486 PHE TYR ASP GLY GLN GLN PRO VAL LEU ALA ILE THR ASP
SEQRES 6 A 486 PRO ASP MET ILE LYS THR VAL LEU VAL LYS GLU CYS TYR
SEQRES 7 A 486 SER VAL PHE THR ASN ARG ARG PRO PHE GLY PRO VAL GLY
SEQRES 8 A 486 PHE MET LYS SER ALA ILE SER ILE ALA GLU ASP GLU GLU
SEQRES 9 A 486 TRP LYS ARG LEU ARG SER LEU LEU SER PRO THR PHE THR
[…]
ATOM 1 N HIS A 28 -30.070 8.178 -13.891 1.00 62.96 N
ATOM 2 CA HIS A 28 -29.618 8.226 -15.315 1.00 62.61 C
ATOM 3 C HIS A 28 -28.098 8.416 -15.437 1.00 60.27 C
ATOM 4 O HIS A 28 -27.574 9.544 -15.459 1.00 60.60 O
ATOM 5 CB HIS A 28 -30.349 9.350 -16.065 1.00 65.70 C
ATOM 6 CG HIS A 28 -31.223 8.866 -17.185 1.00 68.78 C
ATOM 7 ND1 HIS A 28 -32.203 7.912 -17.008 1.00 70.34 N
ATOM 8 CD2 HIS A 28 -31.276 9.222 -18.492 1.00 70.01 C
ATOM 9 CE1 HIS A 28 -32.823 7.701 -18.158 1.00 69.94 C
ATOM 10 NE2 HIS A 28 -32.281 8.484 -19.074 1.00 70.77 N
ATOM 11 N SER A 29 -27.405 7.284 -15.471 1.00 56.14 N
ATOM 12 CA SER A 29 -25.961 7.227 -15.632 1.00 50.52 C
[…]
HETATM 3801 C1D HEM A 500 -15.561 -22.334 -8.362 1.00 36.10 C
HETATM 3802 C2D HEM A 500 -15.431 -21.280 -7.478 1.00 36.32 C
HETATM 3803 C3D HEM A 500 -15.279 -20.141 -8.213 1.00 36.60 C
HETATM 3804 C4D HEM A 500 -15.329 -20.563 -9.563 1.00 35.03 C
HETATM 3805 CMD HEM A 500 -15.447 -21.345 -5.937 1.00 35.22 C
HETATM 3806 CAD HEM A 500 -15.092 -18.715 -7.649 1.00 33.19 C
HETATM 3807 CBD HEM A 500 -13.578 -18.419 -7.435 1.00 36.93 C
HETATM 3808 CGD HEM A 500 -13.146 -17.057 -6.844 1.00 38.80 C
HETATM 3809 O1D HEM A 500 -12.106 -16.955 -6.219 1.00 40.03 O
HETATM 3810 O2D HEM A 500 -13.867 -16.061 -7.005 1.00 39.63 O
HETATM 3811 O HOH 1 -17.896 -22.802 -11.166 1.00 39.05 O
HETATM 3812 O HOH 2 -30.465 -23.810 -12.844 1.00 47.23 O
HETATM 3813 O HOH 3 -19.375 -19.692 -9.011 1.00 54.56 O
HETATM 3814 O HOH 4 -19.657 -17.459 -10.200 1.00 59.14 O
HETATM 3815 O HOH 5 -20.277 -10.689 -11.676 1.00 37.63 O
HETATM 3816 O HOH 6 -25.143 -21.181 -18.039 1.00 28.45 O
HETATM 3817 O HOH 7 -25.255 -18.716 -10.661 1.00 37.59 O
HETATM 3818 O HOH 8 -16.940 -10.863 -5.739 1.00 45.76 O
[…]
CONECT 3806 3803 3807
CONECT 3807 3806 3808
CONECT 3808 3807 3809 3810
CONECT 3809 3808
CONECT 3810 3808
MASTER 320 0 1 24 9 0 0 6 3999 1 45 38
END
Figure A 2-4 Exemple de fichier PDB (Source 1TQN). Le fichier a été sectionné en raison de son volume.
À noter que certains logiciels qui ont été utilisés dans ce travail de thèse, comme SYBYL,
admettent également un autre type de format pour les structures : le format MOL2. Il s’agit d’un
format de coordonnées beaucoup plus complète et précise que celle de PDB. Toutefois, comme les
structures de la PDB sont données au format PDB, les formats MOL2 n’ont pas été utilisés.
2.2 Format spécifique à certains logiciels
Les formats de fichier présentés précédemment sont les plus utilisés en bioinformatique. La
plupart des logiciels sont en mesure de lire et d’interpréter les séquences ou les structures écrites sous
ces formats. Toutefois, certains programmes nécessitent des informations supplémentaires qui doivent
être renseignées dans un même fichier que les séquences ou les structures. Pour cela, de nouveaux
formats spécifiques à certains programmes sont dérivés des formats standards. C’est le cas par
exemple pour le logicielle Modeller qui utilise un format particulier de séquence, dérivé du format
FASTA.
2.2.1 Format d’alignement de séquence de Modeller
Le fichier d’alignement pour Modeller s’apparente beaucoup à un fichier de séquences au format

FASTA. En entête, le chevron est suivit du symbole « P1 ; » puis du code PDB de la structure. En
seconde ligne, juste après l’entête, un champ spécial est utilisé par Modeller pour déterminer la
« nature » de la séquence qui suit : s’agit-il d’une séquence de template ou de la séquence cible à
reconstruire. Dans le premier cas, le mot clef « structureX » doit apparaitre pour désigner les structures
de références, suivi de la correspondance entre les résidus de la séquence et ceux de la structure : il
faut donc indiquer le numéro de résidu de début et de fin (ainsi que la chaîne d’appartenance)
correspondant dans le fichier PDB. Chacune de ces informations sont séparés par un délimiteur de
champs : « : ». Modeller est très pointilleux sur cette délimitation des résidus : la séquence de la
structure utilisée dans le fichier d’alignement doit comporter le même nombre de résidus (et surtout les
mêmes) que ceux présent dans le fichier PDB correspondant. Dans le cas de la séquence à reconstruire,
la deuxième ligne de renseignement est simplifiée : elle débute par le délimiteur « sequence » puis
suivi de champ vide entre les délimiteurs « : ». Une fois les deux premières lignes renseignées, vient
ensuite la séquence. La séquence comportant des gaps (« – ») est placé ensuite sous la deuxième ligne.
Il n’y a pas de règle particulière pour la longueur de chaque ligne pour la séquence, mais chaque
séquence doit être marqué par un délimiteur de fin : l’astérisque « * ». À ce délimiteur de fin, on peut
ajouter un autre délimiteur « /h » lorsqu’on désire utiliser les hétéroatomes d’un fichier PDB. Il est à
noter que dans ce cas, il faut penser à modifier le numéro correspondant au résidu final de la seconde
Format spécifique à certains logiciels 307
ligne. Par exemple 1suo comporte les résidus 28 (une glycine) à 492 (une histidine). Le fait d’avoir
ajouté « /h » informe à Modeller de prendre en compte les hétéroatomes présents dans le fichier
1suo.pdb. Comme je n’ai laissé qu’un seul hétéroatome, l’hème, il a fallu inscrire 493 au lieu de 492
(cf. Figure A 2-5). Pour la séquence, il y a moins d’information à donner, sauf le fait qu’il reçoit des
hétéroatomes, c’est pourquoi la balise « /h » est placé en fin de séquence.
>P1;1suo
structureX:1suo:28:A:493:::::
----GKLPPGPSPLPVLGNLLQMDRKGLLRSFLRLREKYGDVFTVYLGSRPVVVLCGTDA
IREALVDQAEAFSGRGKIAVVDPIFQG---YGVIFA--NGERWRALRRFSLATMRDFGMG
KR-------SVEERIQEEARCLVEELRKSKGAL--LDNTLLFHSITSNIICSIVFGKRFD
YKDPVFLRLLDLFFQSFSLISSFSSQVFELFSGFLKYFPGTHRQIYRNL-QEINTFIGQS
VEKHRATLDPSNP-RDFIDVYLLRMEKDKSDPSSEFHHQNLILTVLSLFFAGTETTSTTL
RYGFLLMLKYPHVTERVQKEIEQVIGSHRPPALDDRAKMPYTDAVIHEIQRLGDLIPFGV
PHTVTKDTQFRGYVIPKNTEVFPVLSSALHDPRYFETPNTFNPGHFLDANGALK---RNE
GFMPFSLGKRICLGEGIARTELFLFFTTILQNFSIASPVPPEDIDLTPRESGVGNVPPSY
QIRFLARH---/h*
>P1;2p85
structureX:2p85:31:A:494:::::
----GKLPPGPTPLPFIGNYLQLNTEQMYNSLMKISERYGPVFTIHLGPRRVVVLCGHDA
VKEALVDQAEEFSGRGEQATFDWLFKG---YGVAFS--NGERAKQLRRFSIATLRGFGVG
templates KR-------GIEERIQEEAGFLIDALRGTHGAN--IDPTFFLSRTVSNVISSIVFGDRFD
YEDKEFLSLLRMMLGSFQFTATSTGQLYEMFSSVMKHLPGPQQQAFKEL-QGLEDFIAKK
VEHNQRTLDPNSP-RDFIDSFLIRMQEEEKNPNTEFYLKNLVMTTLNLFFAGTETVSTTL
RYGFLLLMKHPEVEAKVHEEIDRVIGKNRQPKFEDRAKMPYTEAVIHEIQRFGDMLPMGL
AHRVNKDTKFRDFFLPKGTEVFPMLGSVLRDPRFFSNPRDFNPQHFLDKKGQFK---KSD
AFVPFSIGKRYCFGEGLARMELFLFFTTIMQNFRFKSPQSPKDIDVSPKHVGFATIPRNY
TMSFLPR----*
>P1;2f9q
structureX:2f9q:34:A:497:::::
-------PPGPLPLP----------QNTPYCFDQLRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAA
VREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGVFLAR-YGPAWREQRRFSVSTLRNLGLG
KK-------SLEQWVTEEAACLCAAFANHSGRP--FRPNGLLDKAVSNVIASLTCGRRFE
YDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVP-VDRHIPALAGKVLRFQ-KAFLTQLDEL
LTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLRIVVADLFSAGMVTTSTTL
AWGLLLMILHPDVQRRVQQEIDDVIGQVRRPEMGDQAHMPYTTAVIHEVQRFGDIVPLGM
THMTSRDIEVQGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHFLDAQGHFV---KPE
AFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTG-QPRPSHHGVFAFLVSPSPY
ELCAVPR----*
>P1;CYP1A2
sequence:CYP1A2::::::::
VPKGLKSPPEPWGWPLLGHVLTLG-KNPHLALSRMSQRYGDVLQIRIGSTPVLVLSRLDT
IRQALVRQGDDFKGRPDLYTSTLITDG---QSLTFSTDSGPVWAARRRLAQNALNTFSIA
SDPASSSSCYLEEHVSKEAKALISRLQELMAGPGHFDPYNQVVVSVANVIGAMCFGQHFP
P450 à reconstruire ESSDEMLSLVKNTHEFVETAS--SGNPLDFFP-ILRYLPNPALQRFKAFNQRFLWFLQKT
VQEHYQDFDKNSV-RDITGALFKHSKKGPRASGNLIPQEKIVNLVNDIFGAGFDTVTTAI
SWSLMYLVTKPEIQRKIQKELDTVIGRERRPRLSDRPQLPYLEAFILETFRHSSFLPFTI
PHSTTRDTTLNGFYIPKKCCVFVNQWQVNHDPELWEDPSEFRPERFLTADGTAINKPLSE
KMMLFGMGKRRCIGEVLAKWEIFLFLAILLQQLEFSVPPG-VKVDLTP-IYGLTMKHARC
EHVQARRFSIN/h*
Figure A 2-5 Exemple de fichier d'alignement pour Modeller. Trois templates sont utilisés ici pour construire le
modèle du CYP 1A2. Ces trois templates sont le 1suo (CYP 2B4), 2p85 (CYP 2A13) et 2f9q (CYP 2D6). Les
templates sont identifiés par Modeller par l’identifiant présent sur la seconde ligne (en rouge) : « structureX »
suivit de plusieurs champs séparés par des « : ». Parmis ces champs, on retrouve leur code PDB les numéros de
résidus de début et de fin de séquence dans le fichier PDB correspondant, la chaîne etc… Un astérisque (*) est
placée en fin de chaque séquence pour informer au logiciel de la fin de chaque séquence. Des marqueurs
supplémentaires tels que « /h » peuvent être ajoutés lorsqu’on désire prendre en compte les hétéroatomes présents
dans le fichier PDB. La séquence cible est reconnue avec un même type de délimiteur (en vert) avec « sequence »
à la place.
2.2.2 Format des fichiers de CSBs
Dans le programme Caliseq, un ensemble de blocs doit être fourni au programme. Ces derniers
contiennent des sous-alignements des séquences des structures utilisées en référence. Par souci de
simplicité, j’ai opté le format FASTA pour représenter chaque sous-alignement correspondant chacun
à un bloc. Afin de séparer chaque bloc et conserver ainsi leur séquentialité, chaque sous-alignement
sont séparé par le symbole « # » qui sert de délimiteur. Par ailleurs, pour des raisons qui seront
expliquées dans la partie détaillant le programme, il faut penser à avoir le même nombre et le même
ordre des séquences dans chaque sous-alignement. Le contenu des trois fichiers des ensembles de
blocs utilisés sont présentés dans les figures suivantes.
>1OXA >1OXA >1OXA >1OXA >1OXA

------------ NMGTS AEQRGQAAREVVNFILDLVERRRT LPNAVEEILRYIAPPET GIHFCMGRPLAKLEGEVALRALFGRF
>2HPD >2HPD >2HPD >2HPD >2HPD
PKTFGELKNLPL GLFTS KRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKA VGMVLNEALRLWPTAPA GQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHF
>1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2
PTPLPIIGNMLQ GIISS HNKVLKNVALTRSYIREKVKEHQA TDAVVHEIQRYSDLVPT GKRICAGEGLARMELFLFLTTILQNF
>1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5
PTPLPVIGNILQ GIVFS HNKLLKNVAFMKSYILEKVKEHQE TDAVVHEVQRYIDLLPT GKRICVGEALAGMELFLFLTSILQNF
>1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6
PTPFPIIGNILQ GIAFS HKTLLKNADYIKNFIMEKVKEHQK TDAVIHEIQRFIDLLPT GKRMCVGEGLARMELFLFLTSILQNF
>1GWI >1GWI >1GWI >1GWI >1GWI
------------ SMLTV PEEVVATLTELASIMTDTVAAKRA WSAVVEETLRFSTPTSH GPHVCPGAALSRMEAGVALPALYARF
# # # # #
VDWYSTYAELRE PTHTRLRKLVSQEFTVRR DLLSALI TRFAAEEVEIGG ALSLGID
DKPVQALMKIAD KNWKKAHNILLPSFSQQA DLLTHML SLYAKEDTVLGG DFEDHTN
>1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2
KDICKSFTNFSK KRWKEIRRFSLTTLRNFG DFIDCFL PHAVTTDTKFRN NLKSVDD
>1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5
KDISKSLTNLSK KKWKEIRRFSLMTLRNFG DFIDCFL PHAVTCDIKFRN NLKSLVD
>1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6
KDISKSLTKFSE KTWKEMRRFSLMTLRNFG DFIDCFL PHAVTRDVRFRN KLQSLVE
TDLDGESARLRA AEHRRLRTLVAQALTVRR DLTSALI IRFAAEDVPVGD HLDLAVP
# # # # #
PVTPVRF VEAMRPRVEQITAELLDEV SADELTSIALVLLLAGFEASVSLIGIGTYLLLT VAIPQYSTVLVANGAANRDPSQFP ADDVVWRRS
EIFKFEA YHAMMVDIAVQLVQKWERL DDENIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVK YPLEKGDELMVLIPQLHRDKTIWG ---------
>1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2
PVFTVYF IEDRVQEEAHCLVEELRKT NIENLVGTVADLFVAGTETTSTTLRYGLLLLLK YLIPKGTTIMALLTSVLHDDKEFP KNLNTTAVT
>1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5
PVFTLYF IEDRVQEEARCLVEELRKT TIESLENTAVDLFGAGTETTSTTLRYALLLLLK YLIPKGTTILISLTSVLHDNKEFP KNLDTTPVV
>1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6
PVFTVYL IEDRIQEEARCLVEELRKT TLESLVIAVSDLFGAGTETTSTTLRYSLLLLLK YFIPKGTDIITSLTSVLHDEKAFP KDLDITAVV
PLAAVEL VEHMRGRITELTDRLLDEL TDAEIVSTLQLMVAAGHETTISLIVNAVVNLST RVIPAGDALIVSYGALGRDERAHG AAELRNKPV
# # # # #
LGQDAWLVTGYDEAKAAL VVDIVDRFAHPLPIKVICELL HPDQLALVR DPHRFDVT LLLRGIDHLPVR
PGRVTRYLSSQRLIKEAC HIEVPEDMTRLTLDTIGLCGF NPHVLQKAA DVEEFRPE TLTLKPEGFVVK
>1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2
GMNPIVVFHGYEAVKEAL PCDPTFILGCAPCNVICSVVF HPEVTAKVQ NPNIFDPG GIVSLPPSYQIC
>1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5
GLKPIVVLHGYEAVKEAL PCDPTFILGCAPCNVICSIIF HPEVTAKVQ NPEMFDPH GFASVPPFYQLC
>1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6
GMKPTVVLHGYEAVKEAL PCDPTFILGCAPCNVICSVIF HPEVAARVQ NPKVFDPG GFVSVPPSYQLC
GGVPVWAVTHHAEAKALL VVDLKAAFAYPLPMYVVADLM HPEQRALVL TADRFDLT VTQNDLFELPVR
# # # #
>1OXA >1OXA >1OXA >1OXA
FPEDVRNY DEAARGAFGRWSSEIL ------ RGHLSFGQ
>2HPD >2HPD >2HPD >2HPD
LSQALKFV HPFITSMVRALDEAMN SYKQVK HAFKPFGN
>1PQ2 >1PQ2 >1PQ2 >1PQ2
NSPISQRI DQNFLTLMKRFNENFR CMQDRS DYFMPFSA
>1OG5 >1OG5 >1OG5 >1OG5
IFPLAERA DQQFLNLMEKLNENIE CMQDRS KYFMPFSA
>1NR6 >1NR6 >1NR6 >1NR6
SVPILEKV DEEFLKLMESLHENVE CMQDRS DYFMPFSA
>1GWI >1GWI >1GWI >1GWI
DWPLIGLA EEARLPRLKVLFEKFF ------ --------
# # # #
Figure A 2-6 Fichier de l’ensemble de blocs de TA. NGUYEN. Il s’agit d’un unique fichier contentant 24 sous-
alignements des six structures de référence : 1oxa, 2hpd, 1pq2, 1og5, 1nr6 et 1gwi. Trois sont bactériennes et trois
proviennent des mammifères.
>1rom >1rom >1rom >1rom >1rom

AEFAKLRA PEHMHQRSMVEPTF DIISKLCT KLVRANEGIIASNQSANRDEEVF KINYTPLNR
>1oxa >1oxa >1oxa >1oxa >1oxa
WYSTYAEL PTHTRLRKLVSQEF DLLSALIS VAIPQYSTVLVANGAANRDPSQF DVVWRRSLL
>1cpt >1cpt >1cpt >1cpt >1cpt
IYPAFKWL PTHTAYRGLTLNWF DVMSLLAN QNIKRGDRIMLSYPSANRDEEVF PPRLVATNF
>3ccp >3ccp >3ccp >3ccp >3ccp
VQEAWAVL PEQRQFRALANQVV DAISIVAN VQLKKGDQILLPQMLSGLDEREN AQIQHKSGI
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
PIGLMQRV PERRKEMLHNAALR DMLDVLIA HRIHEGDLVAASPAISNRIPEDF SYRNDHSKM
>2hpd >2hpd >2hpd >2hpd >2hpd
PVQALMKI KNWKKAHNILLPSF DLLTHMLN YPLEKGDELMVLIPQLHRDKTIW YELDIKETL
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
ISKSLTKF KTWKEMRRFSLMTL DFIDCFLI YFIPKGTDIITSLTSVLHDEKAL LDITAVVNG
# # # # #
>1rom >1rom >1rom >1rom >1rom
PVSQVKLF LQPYIQRTVDDLLEQMKQK DKSDAVQIAFLLLVAGNATMVNMIALGVATLAQ ENPDEFNM VGIVDLPV
>1oxa >1oxa >1oxa >1oxa >1oxa
PVTPVRFL VEAMRPRVEQITAELLDEV SADELTSIALVLLLAGFEASVSLIGIGTYLLLT PDPHRFDV RGIDHLPV
>1cpt >1cpt >1cpt >1cpt >1cpt
PLAMAHIE LEENIRRIAQASVQRLLDF DDKYINAYYVAIATAGHDTTSSSSGGAIIGLSR SNPDEFDI GGPKNVPI
>3ccp >3ccp >3ccp >3ccp >3ccp
DLVWTRCN LENRIQELACSLIESLRPQ TSDEAKRMCGLLLVGGLDTVVNFLSFSMEFLAK ACPMHVDF SGVQALPL
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
DVGTFQLA MKGHAATIEDQVRRMIADW SADEITGMFISMMFAGHHTSSGTASWTLIELMR PDPHDFVP VQLAQPAC
>2hpd >2hpd >2hpd >2hpd >2hpd
EIFKFEAP YHAMMVDIAVQLVQKWERL DDENIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVK DDVEEFRP LKPEGFVV
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
PVFTVYLG IEDRIQEEARCLVEELRKT TLESLVIAVSDLFGAGTETTSTTLRYSLLLLLK PNPKVFDP VSVPPSYQ
# # # #
>1rom >1rom >1rom >1rom
LAWLVTKHKDVCFV VDLVKEFALPVPSYIIYTLLGVP HPDQLAQLKA PLGFGFGDHRC
>1oxa >1oxa >1oxa >1oxa
DAWLVTGYDEAKAA VDIVDRFAHPLPIKVICELLGVD HPDQLALVRA HLSFGQGIHFC
>1cpt >1cpt >1cpt >1cpt
PMWIATKHADVMQI CDFMTDCALYYPLHVVMTALGVP NPEQLALAKS HLGFGWGAHMC
>3ccp >3ccp >3ccp >3ccp
GHWIATRGQLIREA CNFTEDYAEPFPIRIFMLLAGLP SPEHRQELIE HTTFGHGSHLC
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
QVVLLSGSHANEFF IDLLDFFEALTIYTSSACLIGKK HRDAYAAVID WIPFGAGRHRC
>2hpd >2hpd >2hpd >2hpd
VTRYLSSQRLIKEA IEVPEDMTRLTLDTIGLCGFNYR NPHVLQKAAE FKPFGNGQRAC
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
PTVVLHGYEAVKEA CDPTFILGCAPCNVICSVIFHNR HPEVAARVQE FMPFSAGKRMC
# # # #
SASGKQ FNDLEYLTQQNAIRT SLAPQFVEELCRYHTAS IAEHLAKAELTTVFSTLYQKF
PEDVRN EAARGAFGRWSSEIL SALPNAVEEILRYIAPP MGRPLAKLEGEVALRALFGRF
DQNNEA EDDEPLMLKLTQDFF ALIPRLVDEAVRWTAPV LGQHLAKLEMKIFFEELLPKL
PREAGE EEDIPHLKYLTDQMT ERIPAACEELLRRFSLV LGQHLARREIIVTLKEWLTRI
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
AKAYPF GRFAKLYHELERGTD PQLENVLKETLRLHPPL VGAAFAIMQIKAIFSVLLREY
SQALKF PFITSMVRALDEAMN KYVGMVLNEALRLWPTA IGQQFALHEATLVLGMMLKHF
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
SVPILE EEFLKLMESLHENVE PYTDAVIHEIQRFIDLL VGEGLARMELFLFLTSIlQNF
# # # #
TFVDMDP ASAANQELLDYLAILVEQRLV KRTAKEDVMIGD PDLKV
NMGTSDP RGQAAREVVNFILDLVERRRT TRFAAEEVEIGG ALSLG
SLTSMDP FHETIATFYDYFNGFTVDRRS MRTALADTEVRG SVELS
IPTSMDP FAEAKEALYDYLIPIIEQRRQ GRILTSDYEFHG FSIAP
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
GVVFDAS RDEARNGLVALVADIMNGRIA MRVAKGEFEVQG EFEMA
GLFTSWT FQEDIKVMNDLVDKIIADRKA SLYAKEDTVLGG DFEDH
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
GIAFSNA LLKNADYIKNFIMEKVKEHQK PHAVTRDVRFRN KLQSL
# # # #
Figure A 2-7 Fichier de l’ensemble de blocs de N. Loiseau. Celui-ci contient 22 sous-alignements de six
structures de référence : 1rom, 1oxa, 1cpt, 3cpp, 1e9x, 2hpd, 1dt6. Dans ce jeu, une seule structure provient des
mammifères : il s’agit du 1dt6, le CYP 2C5 de lapin.

VDWYSTYAELRETAP VVDIVDRFAHPLPIKVICELL ----------- ALSLGID
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
TDPIGLMQRVRDECG EIDLLDFFAELTIYTSSACLI RSVSFHALRQI EFEMAQP
DKPVQALMKIADELG HIEVPEDMTRLTLDTIGLCGF PVPSYKQVKQL DFEDHTN
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
KDISKSLTKFSECYG PCDPTFILGCAPCNVICSVIF RSPCMQDRSRM KLQSLVE
# # # #
VTPVRFL AFGRWSSEIL SALPNAVEEILRYIAPPET DVVWRRS
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
VGTFQLA RFAKLYHELE PQLENVLKETLRLHPPLII SYRNDHS
IFKFEAP PFITSMVRAL KYVGMVLNEALRLWPTAPA YELDIKE
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
VFTVYLG KLMESMVRAL PYTDAVIHEIQRFIDLLPT LDITAVV
# # # #
GQDAWLVTGYDEAKAA AEQRGQAAREVVNFILDLVERRRT TRFAAEEVEIGG LLRGIDHLPVR
>1e9x >1e9x >1e9x >1e9x
GKQVVLLSGSHANEFF FRRRDEARNGLVALVADIMNGRIA MRVAKGEFEVQG MVVQLAQPACV
GRVTRYLSSQRLIKEA KRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKA SLYAKEDTVLGG LTLKPEGFVVK
>1dt6 >1dt6 >1dt6 >1dt6
MKPTVVLHGYEAVKEA HKTLLKNADYIKNFIMEKVKEHQK PHAVTRDVRFRN FVSVPPSYQLC
# # #
>1oxa >1oxa >1oxa
EDVRN DLLSALIS VAI
>1e9x >1e9x >1e9x
PFMTP DMLDVLIA HRI
>2hpd >2hpd >2hpd
QALKF DLLTHMLN YPL
>1dt6 >1dt6 >1dt6
VPILE DFIDCFLI YFI
# # #
>1oxa >1oxa >1oxa
TSD QDDDD PQYSTVLVANGAANRDPSQF
>1e9x >1e9x >1e9x
DAS VKAET HEGDLVAASPAISNRIPEDF
>2hpd >2hpd >2hpd
TSW KDPET EKGDELMVLIPQLHRDKTIW
>1dt6 >1dt6 >1dt6
FSN KMEQE PKGTDIITSLTSVLHDEKAF
# # #
>1oxa >1oxa >1oxa
THTRLRKLVSQEFTVRR LSADELTSIALVLLLAGFEASVSLIGIGTYLLLT PDPHRFDVT
>1e9x >1e9x >1e9x
PERRKEMLHNAALRGEQ FSADEITGMFISMMFAGHHTSSGTASWTLIELMR PDPHDFVPA
>2hpd >2hpd >2hpd
NWKKAHNILLPSFSQQA LDDENIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVK DDVEEFRPE
>1dt6 >1dt6 >1dt6
TWKEMRRFSLMTLRNFG FTLESLVIAVSDLFGAGTETTSTTLRYSLLLLLK PNPKVFDPG
# # #
>1oxa >1oxa >1oxa
VEAMRPRVEQITAELLDEV HPDQLALVRA DTRGHLSFG
>1e9x >1e9x >1e9x
MKGHAATIEDQVRRMIADW HRDAYAAVID NRWTWIPFG
>2hpd >2hpd >2hpd
YHAMMVDIAVQLVQKWERL NPHVLQKAAE PQHAFKPFG
>1dt6 >1dt6 >1dt6
IEDRIQEEARCLVEELRKT HPEVAARVQE KSDYFMPFS
# # #
>1oxa >1oxa >1oxa
GDS ------ GIHFCMGRPLAKLEGEVALRALFGRF
>1e9x >1e9x >1e9x
GEA ELDELY GRHRCVGAAFAIMQIKAIFSVLLREY
>2hpd >2hpd >2hpd
NAD EAARVL GQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHF
>1dt6 >1dt6 >1dt6
NAS EIERVI GKRMCVGEGLARMELFLFLTSILQNF
# # #
Figure A 2-8 Fichier de l’ensemble de blocs de M. Cotevieille. Celui-ci contient 27 sous-alignements de quatre
structures de référence : 1oxa, 1e9x, 2hpd, 1dt6. Dans ce jeu, une seule structure provient des mammifères : il
s’agit du 1dt6, le CYP 2C5 de lapin.
2.2.3 Format des fichiers de GROMACS
Le programme pdb2gmx génère à partir d’un fichier de structure PDB, deux fichiers : i) un fichier
de topologie contenant toutes les interactions présentes à l’intérieur de la protéine, et ii) un ficher de
structure spécifique à GROMACS.
2.2.3.1 Fichier de Topologie (.top ou .itp)

Le fichier de topologie est un fichier ascii (un fichier texte) contenant les informations
d’interactions d’une protéine ou un composé, généré à partir de pdb2gmx ou du serveur PRODRG.
; Exemple de fichier ITP généré par le serveur [ angles ]
; PRODRG (pour le CPA) ; ai aj ak fu c0, c1, ...
; 1 2 3 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; CLAK CAJ CAI
; 2 3 4 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; CAJ CAI NAH
3 4 5 1 109.5 376.6 109.5 376.6 ; CAI NAH CAL
[ moleculetype ] 3 4 8 1 109.5 376.6 109.5 376.6 ; CAI NAH P8
; Name nrexcl 5 4 8 1 109.5 376.6 109.5 376.6 ; CAL NAH P8
CPA 3 4 5 6 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; NAH CAL CAM
5 6 7 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; CAL CAM CLAN
[ atoms ] 4 8 9 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; NAH P8 O9
; nr type resnr resid atom cgnr charge mass 4 8 10 1 103.0 397.5 103.0 397.5 ; NAH P8 OAF
1 CL 1 CPA CLAK 1 -0.050 35.4530 4 8 14 1 103.0 397.5 103.0 397.5 ; NAH P8 NAC
2 CH2 1 CPA CAJ 1 0.025 14.0270 9 8 10 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; O9 P8 OAF
3 CH2 1 CPA CAI 1 0.025 14.0270 9 8 14 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; O9 P8 NAC
4 NL 1 CPA NAH 2 -0.281 14.0067 10 8 14 1 103.0 397.5 103.0 397.5 ; OAF P8 NAC
5 CH2 1 CPA CAL 2 0.015 14.0270 8 10 11 1 120.0 397.5 120.0 397.5 ; P8 OAF CAG
6 CH2 1 CPA CAM 2 0.015 14.0270 10 11 12 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; OAF CAG CAA
7 CL 1 CPA CLAN 2 -0.086 35.4530 11 12 13 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; CAG CAA CAB
8 P 1 CPA P8 2 1.337 30.9738 12 13 14 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; CAA CAB NAC
9 OM 1 CPA O9 3 0.000 15.9994 8 14 13 1 109.5 376.6 109.5 376.6 ; P8 NAC CAB
10 OS 1 CPA OAF 4 -0.425 15.9994 8 14 15 1 109.5 376.6 109.5 376.6 ; P8 NAC HAA
11 CH2 1 CPA CAG 4 0.007 14.0270 13 14 15 1 109.5 376.6 109.5 376.6 ; CAB NAC HAA
12 CH2 1 CPA CAA 4 0.007 14.0270
13 CH2 1 CPA CAB 4 0.007 14.0270 [ dihedrals ]
14 NL 1 CPA NAC 4 -0.596 14.0067 ; ai aj ak al fu c0, c1, m, ...
15 H 1 CPA HAA 5 0.000 1.0080 4 3 8 5 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp NAH CAI P8 CAL
8 4 10 9 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp P8 NAH OAF O9
[ bonds ] 14 8 13 15 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp NAC P8 CAB HAA
; ai aj fu c0, c1, ... 4 3 2 1 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih NAH CAI CAJ CLAK
1 2 1 0.178 394315.8 0.178 394315.8 ; CLAK CAJ 2 3 4 8 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih CAJ CAI NAH P8
2 3 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CAJ CAI 6 5 4 3 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih CAM CAL NAH CAI
3 4 1 0.147 376560.0 0.147 376560.0 ; CAI NAH 3 4 8 14 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih CAI NAH P8 NAC
4 5 1 0.147 376560.0 0.147 376560.0 ; NAH CAL 3 4 8 14 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih CAI NAH P8 NAC
4 8 1 0.162 304571.8 0.162 304571.8 ; NAH P8 7 6 5 4 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih CLAN CAM CAL NAH
5 6 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CAL CAM 11 10 8 4 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih CAG OAF P8 NAH
6 7 1 0.178 394315.8 0.178 394315.8 ; CAM CLAN 11 10 8 4 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih CAG OAF P8 NAH
8 9 1 0.148 376560.0 0.148 376560.0 ; P8 O9 4 8 14 15 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih NAH P8 NAC HAA
8 10 1 0.161 251040.0 0.161 251040.0 ; P8 OAF 4 8 14 15 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih NAH P8 NAC HAA
8 14 1 0.162 304571.8 0.162 304571.8 ; P8 NAC 8 10 11 12 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih P8 OAF CAG CAA
10 11 1 0.143 251040.0 0.143 251040.0 ; OAF CAG 13 12 11 10 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih CAB CAA CAG OAF
11 12 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CAG CAA 14 13 12 11 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih NAC CAB CAA CAG
12 13 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CAA CAB 12 13 14 15 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih CAA CAB NAC HAA
13 14 1 0.147 376560.0 0.147 376560.0 ; CAB NAC
14 15 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; NAC HAA
[ pairs ]
; ai aj fu c0, c1, ...
1 4 1 ; CLAK NAH
2 5 1 ; CAJ CAL
2 8 1 ; CAJ P8
3 6 1 ; CAI CAM
3 9 1 ; CAI O9
3 10 1 ; CAI OAF
3 14 1 ; CAI NAC
4 7 1 ; NAH CLAN
4 11 1 ; NAH CAG
4 13 1 ; NAH CAB
4 15 1 ; NAH HAA
5 9 1 ; CAL O9
5 10 1 ; CAL OAF
5 14 1 ; CAL NAC
6 8 1 ; CAM P8
8 12 1 ; P8 CAA
9 11 1 ; O9 CAG
9 13 1 ; O9 CAB
9 15 1 ; O9 HAA
10 13 1 ; OAF CAB
10 15 1 ; OAF HAA
11 14 1 ; CAG NAC
12 15 1 ; CAA HAA
Figure A 2-9 Exemple de fichier .itp généré par le serveur PRODRG pour le CPA. Le fichier .top est similaire
à ce fichier.
2.2.3.2 Fichier de Coordonnées (.gro)

Lorsque le programme pdb2gmx est exécuté pour générer une topologie moléculaire, il traduit
également le fichier de structure (au format .pdb) vers un fichier de structure Gromos87 (au
format .gro). La différence majeur entre le fichier au format pdb et le fichier au format Gromos87 est
d’une part le formatage du fichier, ainsi que le fait qu’un fichier .gro contient également les vitesses.
Toutefois, il n’est pas toujours nécessaire d’utiliser les vitesses, c’est pourquoi le fichier PDB est plus
commun pour tous les programmes. Pour créer une boîte d’eau autour de la molécule, le programme
genbox est appelé couplé au programme editconf qui défini préalablement la taille de la boîte. Le
fichier de sortie du programme genbox est également un fichier de type Gromos87. Les fichiers au
format Gromos87 peuvent être utilisés comme des trajectoires, simplement en les concaténant. En
effet, dans le titre de chaque fichier, le temps peut être signalé par ‘t =’ suivi d’un temps en ps.
MD of 2 waters, t= 0.0
6
1WATER OW1 1 0.126 1.624 1.679 0.1227 -0.0580 0.0434
1WATER HW2 2 0.190 1.661 1.747 0.8085 0.3191 -0.7791
1WATER HW3 3 0.177 1.568 1.613 -0.9045 -2.6469 1.3180
2WATER OW1 4 1.275 0.053 0.622 0.2519 0.3140 -0.1734
2WATER HW2 5 1.337 0.002 0.680 -1.0641 -1.1349 0.0257
2WATER HW3 6 1.326 0.120 0.568 1.9427 -0.8216 -0.0244
1.82060 1.82060 1.82060
Figure A 2-10 Exemple de fichier .gro pour deux molécules d’eau.
Le formatage du fichier .gro est décomposé de la manière suivante (du haut vers le bas) :
• Une ligne de titre (dans un format libre, avec optionnellement en temps en ps après ‘t =’)
• Le nombre d’atome (dans un format libre, mais de type entier)
• Une ligne pour chaque atome (dans un format fixe, voir plus bas)
• Dimension de la boîte (dans un format libre, de type entier séparé par des espaces), les
valeurs étant v1(x) v2(y) v3(z) v1(y) v1(z) v2(x) v2(z) v3(x) v3(y). Les six dernières
valeurs peuvent être omises (elles seront mises à zéro). GROMACS ne supporte que les
boites avec v1(y)=v1(z)=v2(z)=0.
Pour le format fixe, toutes les colonnes sont à une position fixée. Ces colonnes portent les
informations suivantes (de gauche à droite) :
• Numéro du résidu (5 positions, entier)
• Nom du résidu (5 caractères)
• Nom de l’atome (5 caractères)
• Position (en nm, x y z dans 3 colonnes, chacun 8 positions avec 3 places pour les
décimales)
• Vitesse (en nm/ps (ou km/s), x y z dans trois colonnes, chacun 8 poisitons avec 4 places
pour les décimales)
ANNEXE 3
Annexe 3 Caliseq : dissection d’un programme
« Ne cherchons pas hors de nous le mal, il est

chez nous, il est planté en nos entrailles.»
Michel de Montaigne (1533 – 1692 ap JC)
315
316 Annexe 3. Caliseq : dissection d’un programme
3.1 Introduction
Cette annexe a pour objet une description plus poussée de l’outil Caliseq. Il peut être considéré
comme le manuel de référence du programme, décrivant aussi bien la procédure à suivre pour lancer le
programme mais également comment transitent les informations de leurs saisies par l’utilisateur, à leur
affichage en sortie de programme. La première partie de ce chapitre décrira donc l’utilisation de l’outil
Caliseq : qu’attend le programme, quelles sont les options nécessaires à paramétrer, quelles sont celles
optionnelles et pour quelles intérêts. Cette première description est en quelque sorte une présentation
générale d’un point de vu externe au programme, comme une boîte noire qu’on se servirait sans prêter
attention aux mécanismes intrinsèques. Le « contenant » du programme sera vu ensuite plus en détails,
avec une présentation succincte des fichiers sources de Caliseq, où le code du programme est écrit, et
comment compiler ce dernier. Enfin, dans une dernière partie, chaque fonction de l’outil sera
expliquée, accompagné de leur algorithme dans un langage simple et non celui du programme lui-
même, afin qu’un lecteur non initié puisse quand même comprendre son essence, son principe.
3.2 Les paramètres en entrée de Caliseq
Il existe deux manière de faire tourner Caliseq : l’une pour un alignement simple des blocs sur
une séquence ou un pré-alignement de séquences, et l’autre, de faire confronter le jeu de bloc sur une
banque de données de séquence en vu de déterminer des P450s. Pour la suite de cette annexe,
l’alignement simple des blocs sur une séquence (ou un pré-alignement de séquences) sera décrit
comme le « mode normale » de Caliseq, en opposition avec le « mode d’alignement sur banque »
correspondant à l’alignement des blocs sur une banque de séquences. Dans les deux cas, deux fichiers
doivent être fournis en entrée au programme : i) un fichier contenant le jeu de bloc (appelé cons_file
dans le programme) dont le contenu a été présenté dans le chapitre précédent, et ii) un fichier
contentant soit la séquence cible, ou son pré-alignement avec d’autres séquences à fort taux d’identité,
soit une banque où chaque enregistrement figure les uns à la suite des autres (appelé ali_file dans le
programme).
La différence pour distinguer les deux modes de fonctionnement se fera alors sur les autres
paramètres insufflés en entrée. Le listing de l’help du logiciel SmartConsAlign montré à la Figure A
3-1, présente les diverses possibilités du logiciel. Caliseq étant une extension de SmartConsAlign,
certaines options sont requises pour faire fonctionner SmartConsAlign en mode Caliseq.
Les paramètres en entrée de Caliseq 317
[777]nguyen@kezia:~/> smartconsalign -h
Usage: smartconsalign [-h] [-v] [-B <nbseq>] [-N] [-b|-c [-k <nbpos>]| -s [-k <nbpos>]]
[-m matrix_file] [-C <1|2|3>] [-g <gap_penalty>]
[-e <gap_extension_penalty>] [-d <gap_penalty against gap>]
[-o|-O] [-A|F|M] [-S|T|L|Z <score>] ali_file cons_file
=== options ====================================
--- general options ----------------------------
-h : this help
-v : verbose mode
-B <nbseq>: ali_file is a database and the program will process each entry
keeping <nbseq> sequences (need the –N option to work)
-N : cons_file is a multiple consensus (Caliseq program)
--- alignment mode -----------------------------
-b : bestfit mode (default mode)
-s : smith-waterman mode
-c : PSSM consensus mode (2nd file must be consensus file, print only
solutions)
--- in multiple consensus mode (-N option) ------
-a : sequences are ADN sequences
-I : search also on complementary sequences
-w <len> : ali_file is a database and the program will process each entry
with window length <len>
-p <len> : step for moving window
-t <threshold> : threshold for outputting results in window mode
-G : scan mode (in window mode), output window positions and scores along thesequences
--- alignment options --------------------------
-m <matrix_file> :
in bestfit/SW mode : matrix is used for alignment
in consensus mode : compute weight from matrix_file matrix
-C <code for conversion of PAM/BLOSUM/proximity matrix into distance matrix>
1: distance(i,j) is Sqrt[Sum(((i,k)-(k,j))2) for all k]
2: distance(i,j) is 1-((prox(i,j)-min)/(max-min))
3: Chi2 method: (i,j) are turned into probabilities,
and dist(i,j) is Sqrt[Sum((p(i,k)p(k,j))2) for all k]
default mode is mode 1
--- gap options --------------------------------
Gaps costs are input as ratio, if MAX_VAL is the maximum value in
the substitution matrix (BLOSUM for example) and MIN_VAL is the
minimum value, gap cost are computed as:
gap cost = MAX_VAL - ratio * (MAXVAL-MINVAL)
-g <gap_opening_cost> :
in bestfit/SW mode : cost ratio for opening gap (default: 1.20)
-e <gap_extension_cost> :
in bestfit/SW mode : cost ratio for extending gap (default: 0.80)
-d : cost ratio for insertions-deletions against gap (default: 0.50)
--- output options ----------------------------
-A : output alignment in CLUSTAL format (in bestfit, smith-waterman or multiple consensus
mode only)
-F : output alignment in FASTA format (in bestfit, smith-waterman or multiple consensus mode
only)
-M : output alignment in SmartMulti format (in bestfit or smith-waterman mode only)
-o : output results as consensus with no gap (in bestfit mode only)
-O : output results as consensus with gaps (in bestfit mode only)
-k : Number of kept positions in PSSM consensus mode/default 10
or number of optimal alignments to keep in smith-waterman mode/default 10
-S <float value> : minimum score threshold in smith-waterman (default: 5.00)
-T <float value> : ratio for the score threshold in consensus (default: 0.50)
(A random sequence is used for mean score)
-Z <float value> : Zscore threshold in consensus (default: 0.00)
-L <integer value> : cut off between 1st bloc and last bloc for db scanning (default: NO)
=== arguments =================================
ali_file, cons_file : files with single sequence, multiple
alignment (Clustal, Fasta or MSF) or consensus
2 files are mandatory, and sequences in the second file
(cons_file) must be shorter than those in the
first file (ali_file))
Figure A 3-1 Listing de l’aide du logiciel SmartConsAlign. Pour « activer » l’outil Caliseq, il suffit d’ajouter en
ligne de commande l’option « –N ». Le premier fichier « ali_file » correspond alors à la séquence cible ou le pré-
alignement ou la banque de séquence, tandis que le second fichier correspond au fichier de blocs. L’option « –B »
suivi d’un nombre (nombre de séquences maximales à récupérer) doit être ajouté au précédent, si on désire scanner
les banques à la recherche de P450. D’autres options peuvent être informées tels que le z-score « –Z », le poids des
gap « –g », la longueur maximale entre les blocs « –L », tous suivi d’un chiffre décimal (ou d’un entier pour le
dernier).
En fait, l’appel à l’outil Caliseq se fait au moyen de l’option « –N » qui informe alors à
SmartConsAlign que le premier fichier d’entrée est un alignement de séquence, que le second fichier
contient le jeu de blocs dans une nomenclature particulière décrite dans le chapitre précédent, et enfin
que ces deux fichiers doivent être traités par l’outil Caliseq. Pour différencier les deux modes de
fonctionnement de Caliseq, une option supplémentaire est nécessaire : « –B » : dans ce cas, le premier
fichier correspond à une banque de séquences, où chaque enregistrement est traité individuellement,
les uns à la suite des autres. Par ailleurs, l’option « –B » requière un second paramètre correspondant
au nombre maximale de séquences que l’utilisateur désire récupérer de la banque. Comme il sera vu
plus tard, ces séquences récupérées sont alors affichées selon un classement établi sur le score
d’alignement des blocs sur la séquence. En fait, l’option « –B » va principalement influencer sur la
manière de lire et de traiter le fichier « ali_file ».
D’autres options additionnelles peuvent être ajoutées à ces options globales, certains communs
aux deux modes, d’autres spécifiques à un des deux modes. Ainsi, l’option « –g » suivit d’un nombre
réel est commun aux deux modes : il permet à l’utilisateur d’influer sur le poids attribué aux gaps. En
réalité, la valeur indiquée par l’utilisateur ne correspond pas au poids donné aux gaps proprement dit,
mais à un coefficient défini, rappelé comme suit : si MAX_VAL est la valeur maximale dans la
matrice de substitution (BLOSUM par exemple) et MIN_VAL la valeur minimale, alors le poids de
gap est égale à MAX_VAL – coefficient * (MAX_VAL – MIN_VAL). Associer le poids de gap à un
coefficient permet une plus grande souplesse et adaptabilité du programme, notamment lors
d’utilisation de matrices de similarités différentes (PAM à la place de BLOSUM etc…) pour les
alignements. L’option « –A » permet quant à lui d’obtenir les résultats d’alignement au format Clustal
(par défaut, c’est le format fasta qui est affiché). Deux autres options peuvent être utilisés, mais cette
fois-ci spécifiques au mode de recherche sur banque : les options « – Z » pour définir un seuil de z-
score et « – L » pour déterminer la longueur maximale entre le premier et le dernier bloc, que
l’utilisateur autorise au programme pour récupérer des séquences identifiées comme P450. Ces deux
options, comme il le sera décrit plus tard au cours de l’annexe, permettent d’influer sur le nombre de
séquences de P450 récupérées mais surtout de filtrer les faux positifs. Un résumé de toutes les options
utilisées pour Caliseq est présenté dans la Figure A 3-2.
Fichiers sources de Caliseq 319
Smartconsalign –N –A – g <coefficient>
Mode normal de Caliseq <ali_file> <cons_file>
– B <nb seq> – Z <seuil> – L <seuil>
Mode de recherche sur banque de Caliseq
Figure A 3-2 Exemple de ligne de commande pour lancer Caliseq. Les options nécessaires au fonctionnement
de Caliseq sont inscrites dans des rectangles à trait plein, tandis que les options facultatives sont inscrites dans des
rectangles à bords en pointillés. L’option « –N » est obligatoire pour informer le programme SmartConsAlign de
faire appel à l’outil Caliseq. Les options « –A » et « –g » commun aux deux modes de Caliseq sont facultatives et
permettent l’affiche du résultat en format Clustal (le format fasta étant le format par défaut) ainsi que de modifier
le poids attribué aux gaps respectivement. L’option « –B » informe à Caliseq de fonctionner en mode
« recherche » sur banque. Les options supplémentaires tels que « –Z » et « –L » peuvent venir s’y greffer pour
filtrer les résultats. Ali_file dans tous les cas est un fichier comprenant un ou plusieurs enregistrements au format
fasta. Selon le mode, il sera lu et traité différemment par Caliseq. Cons_file est un fichier unique comprenant les
jeux de blocs.
3.3 Fichiers sources de Caliseq
SmartConsAlign a été conçu au départ comme un ensemble d’outils, dont la particularité

commune est de réaliser un alignement de courts alignements de séquences (aussi bien protéique que
nucléique) écrits sous forme de matrice consensus, sur une autre séquence cible seule ou pré alignée
avec d’autres séquences. Le programme comprend actuellement une vingtaine de fichiers sources (cf.
le listing de la Figure A 3-3) qui regroupent chacun des fonctions spécifiques, destinées à une tâche
particulière.
[778]nguyen@kezia:~/Src/SmartConsAlign>ls
total 1216
-rwxr-xr-x 1 thienan users 1838 Jul 27 2006 ADN
-rw-r--r-- 1 thienan users 2071 Jul 27 2006 BLOSUM62
-rwxr-xr-x 1 thienan users 185587 Jul 27 2006 cons_align
-rw-r--r-- 1 thienan users 79841 Jul 27 2006 cons_align.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 4444 Jul 27 2006 cons_align.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 34532 Nov 14 2006 cons_align.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 35079 Jul 27 2006 cons_seqs_bestfit.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 1810 Jul 27 2006 cons_seqs_bestfit.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 6676 Nov 14 2006 cons_seqs_bestfit.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 49217 Jul 27 2006 cons_seqs_sw.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 1482 Jul 27 2006 cons_seqs_sw.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 7916 Nov 14 2006 cons_seqs_sw.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 9187 Jul 27 2006 fasta_io.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 2698 Jul 27 2006 fasta_io.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 3700 Nov 14 2006 fasta_io.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 438 Jul 27 2006 macros.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 2162 Jul 27 2006 Makefile
-rw-r--r-- 1 thienan users 7049 Nov 14 2006 minimier.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 397 Jul 27 2006 minimier.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 3216 Nov 14 2006 minimier.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 55470 Nov 14 2006 mulcons.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 1616 Jul 28 2006 mulcons.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 16948 Nov 14 2006 mulcons.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 37597 Jul 27 2006 Nmatrix.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 3811 Jul 27 2006 Nmatrix.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 14436 Nov 14 2006 Nmatrix.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 15683 Jul 27 2006 README
-rw-r--r-- 1 thienan users 35959 Jul 27 2006 readmultali.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 2007 Jul 27 2006 readmultali.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 18116 Nov 14 2006 readmultali.o
-rwxr-xr-x 1 thienan users 110362 Nov 14 2006 smartconsalign
-rw-r--r-- 1 thienan users 24490 Nov 14 2006 smartconsalign.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 2497 Jul 28 2006 smartconsalign.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 19816 Nov 14 2006 smartconsalign.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 5083 Jul 27 2006 smutil.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 668 Jul 27 2006 smutil.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 2484 Nov 14 2006 smutil.o
-rw-r--r-- 1 thienan users 7933 Jul 27 2006 waterstat.c
-rw-r--r-- 1 thienan users 1474 Jul 27 2006 waterstat.h
-rw-r--r-- 1 thienan users 3312 Nov 14 2006 waterstat.o
Figure A 3-3 Listing du répertoire comprenant les fichiers sources de SmartConsAlign
Ainsi, c’est dans le fichier mulcons.c et sa librairie mulcons.h qu’on retrouve essentiellement
toutes les fonctions et déclarations de variables nécessaire au fonctionnement de Caliseq. Caliseq a
néanmoins besoin du fichier source principal, smarconsalign.c, les fichiers additionnels Nmatrix.c,
readmultali.c, fasta_io.c, smulti.c, minimier.c ainsi que leurs librairies respectives, car ces derniers
comportent quelques fonctions utiles et nécessaires à son utilisation. Par exemple, l’outil Caliseq est
lancé à partir de la procédure principale (« Main() » en langage C) définie dans le fichier source
smartconsalign.c. Il peut lire et écrire des fichiers de séquences au format fasta grâce des fonctions
écrites dans readmultali.c et fasta_io.c. Les créations de matrices de fréquences et de similarités sont
réalisées par des fonctions contenues dans Nmatrix.c tandis que smulti.c regroupe des outils pour
l’indexation des séquences afin que ces dernières soient traitées plus rapidement etc. Pour faire simple,
on peut dire que tous ces fichiers sources se comportent comme de vastes bibliothèques de fonctions,
déjà écrites pour les différents outils présents dans SmartConsAlign. Ces fonctions ont été développées
de manière suffisamment modulaires pour être réintégré dans Caliseq sans en toucher le contenu : il
me suffisait d’adapter dans la majeure partie du temps mon code et utiliser correctement les variables
Quelques fonctions de Caliseq au peigne fin 321
attendues par ces fonctions en arguments22. À d’autres moments, pourtant, il a fallu réécrire certaines
de ces fonctions préexistantes ou du moins, les arranger pour mes besoins en veillant à ce que ces
modifications ne perturbent pas les autres outils de SmartConsAlign utilisant ces fonctions. Ainsi,
même si la majeur partie des fonctions que j’ai écrites pour Caliseq est retrouvée dans les fichiers
source mulcons.c et mulcons.h, certaines fonctions vitales pour le programme se retrouve disséminées
dans les autres fichiers sources. En conséquence, même si Caliseq se comporte comme une « entité »
individuelle dans SmartConsAlign, il a toutefois besoin du programme SmartConsAlign dont il dépend
et de toutes les fonctions relatives à ce dernier. L’ensemble des fichiers sources et de leurs librairies
respectives est regroupé et compilé par le programme Makefile.
3.4 Quelques fonctions de Caliseq au peigne fin
Après avoir décrit les paramètres en entrée au programme (qui serviront donc d’arguments
d’entrée à la fonction Main(), fonction principale du programme SmartConsAlign) ainsi que les
fichiers sources, qui servent de « contenant » aux fonctions permettant le déroulement du programme,
je propose d’examiner chaque fonction du programme l’un après l’autre, en essayant de rester simple
et en expliquant leur grande ligne, sans trop entrer dans les détails. Pour comprendre l’enchevêtrement
ainsi que la connectivité entre toutes les fonctions, deux diagrammes du programme sont proposés sur
les Figure A 3-4 et Figure A 3-5 permettant ainsi de suivre le flux d’information. Le Tableau A 3-1
permet également de retrouver les caractéristiques de chaque fonction. Par souci de clarté, certaines
fonctions seront regroupées ou éludées : le programme étant modulaire, des fonctions ont été
développées pour éviter la répétition de code ou pour un besoin particulier au langage de
programmation, mais ne présentent pas d’intérêt explicatif pour le fonctionnement global du
programme lui-même.
22
On parle de passage d’arguments aux fonctions, lorsqu’on envoie des variables dans ces fonctions pour être
traitées. Le « type » de variable adressée à la fonction doit être similaire à celui attendu par la fonction. Ainsi, si
la fonction attend une variable de type « entier », il faudra fournir en entrée à cette fonction une variable de type
« entier ».
Figure A 3-4 Diagramme du programme Caliseq dans son premier mode. L’ordre d’appel des fonctions se fait
de la gauche vers la droite et du haut vers le bas. L’ordre prioritaire est donc le suivant : haut > gauche > bas >
droite. Les fonctions sont regroupées par des flèches de couleurs pour pouvoir suivre la chronologie
Figure A 3-5 Diagramme du programme Caliseq dans son mode de recherche sur banque avec les mêmes
annotations que précédemment. Caliseq est appelé deux fois (flèches rouges puis violettes).
Tableau A 3-1 Tableaux récapitulatif des principales fonctions usitées par Caliseq
Nom Rôle Appelé par Localisation
AlignToFreq Uniquement dans le mode normal de Caliseq, cette procédure est l’équivalent Main mulcons.c
de ReadMulCons mais pour l’alignement de la séquence cible. Appelle les
mêmes fonctions que ReadMulCons
Backtracking Permet de remonter le chemin optimal en fin de la programmation Calign mulcons.c

dynamique Caliseq
Calign C’est la procédure d’alignement de Caliseq en mode normal et contient Main mulcons.c
l’algorithme de programmation dynamique. Il appelle Backtracking et
PrintAln
Caliseq C’est la procédure d’alignement de Caliseq en mode de recherche sur Main mulcons.c
banque. Il est appelé deux fois : la première pour retenir les séquences
présentant les meilleurs scores d’alignement et calculer les termes
nécessaires au Z-score et la seconde fois pour afficher les séquences
répondant aux critères de sélection. Appelle IndexSequence,
DeIndexsequence, CreateWdel, Bactracking et PrtAlnBank
CreateCons Construit des profils à partir des alignements de séquences. Apelle ReadMulCons mulcons.c
NewRConsensus, unitary_matrix et Getfreq AlignToFreq
CreateWdel Creation de la « matrice » de délétion à partir de la « matrice » de Calign Caliseq mulcons.c

substitution (au sens artifice de programmation)
CreateWeight Établi une pondération pour les séquences trop identiques dans l’alignement ReadMulCons mulcons.c
AlignToFreq
DeIndexSequence Désindexation de la séquence à son état d’origine Caliseq smulti.c
Get_minimier_swres Renvoie de la séquence de l’arbre au rang voulu Main minimier.c
Getfreq Renvoie la fréquence d’un acide aminé dans la banque Swiss-Prot CreateCons mulcons.c
IndexSequence Indexation de la séquence cible au format fasta pour l’alignement par Caliseq smulti.c
programmation dynamique
init_minimier Permet l’initialisation et la construction de l’arbre qui retient les séquences Main minimier.c
identifiés comme P450s dans le mode de recherche sur banque
LengthSeqVSCutOff Vérifie si l’alignement finale n’est pas supérieur au cuttoff « -L » Caliseq mulcons.c
Main Chef d’orchestre du programme, récupère les paramètres d’entrée et lance le utilisateur smartconsalign.c
programme Caliseq selon un des modes.
NewFastaSequence Allocation d’une variable pour recevoir une séquence fasta Main fasta_io.c
NewRConsensus Alloue de la place pour sauvegarder les profils CreateCons cons_align.c

CreateWdel
PrintAln Procédure permettant de créer l’alignement finale à partir du chemin obtenu Calign mulcons.c
par le Backtracking. Appelle deux fonctions non représentées sur les
diagrammes qui permettent d’afficher les alignements soit au format clustal,
soit au format fasta (par défaut)
PrtAlnBank Procédure similaire à PrintAln, mais pour une seule séquence Caliseq mulcons.c
range Permet de ranger dans l’arbre la séquence récupérée en fonction du score Main minimier.c
d’alignement obtenu
read_alignement Permet la lecture de fichiers d’alignement de séquences et la sauvegarde de ReadMulCons readmultali.c

ces séquences dans une structure AlignToFreq
ReadFastaSequence Procédure permettant la lecture d’une séquence fasta Main fasta_io.c
ReadMulCons Procédure permettant la lecture et la conversion des blocs en profil. Appelle Main mulcons.c
read_alignement, CreateWeight et CreateCons
sNewSeq2Keep Création d’un variable pour retenir la séquence dans l’arbre Main minimier.c
unitary_matrix Initialise à zéro une matrice de fréquences sauf au niveau des diagonales où CreateCons Nmatrix.c
la valeur est de un
3.4.1 La fonction Main() de smartconsalign.c
La fonction principale Main() de smartconsalign.c fait partie de ces fonctions préexistantes au

programme SmartConsAlign. Elle permet entre autre de diriger et de lancer les différentes applications
du « package » SmartConsAlign. C’est également une des fonctions que j’ai dû modifier pour insérer
le module Caliseq. En tant que « chef d’orchestre » de l’ensemble du programme, la fonction Main()
(pour « principal » en anglais) est à l’interface entre les directives de l’utilisateur, communiquées via
les paramètres d’entrées, et la transmission de ces directives aux différentes applications du
programme. C’est d’ailleurs dans cette fonction que sont déclarées la plupart des variables utilisées
tout au long du programme. La fonction Main() se charge dans un premier temps de récupérer tous
les arguments optionnels (comme par exemple « –N » ou « –g » etc…) en entrée du programme et de
les traiter à l’aide d’une fonction prédéfinie dans les librairies spécifiques du langage C, getopt().
Des documentations existent pour cette librairie, je ne la décrirai donc pas. L’appel à cette fonction
23
getopt() se fait alors au moyen d’une structure conditionnelle multiple de type « Switch/Case » :
pour chaque paramètre optionnel lu et retourné au programme par getopt(), des instructions sont
associées. Ainsi, pour introduire Caliseq, il m’a fallu définir des instructions pour le cas où getopt()
rencontrerait les options « –N », « –B », « –Z », « –L » et « –T », un ancien paramètre ne sers plus
pour l’alignement protéique, mais est encore utilisé pour l’alignement nucléiques. Pour la plupart des
instructions, il s’agit de déclarer des marqueurs (aussi appelés balises) : la propriété qu’une variable
soit vide ou remplie est alors utilisée. En conséquent, lorsque getopt() renvoie « –N », une balise
signalant que le programme doit utiliser l’outil Caliseq est activé. Cette manœuvre est suivie par la
récupération et sauvegarde dans des variables appropriés, les noms des deux fichiers lus par le
programme (ali_file et cons_file). Comme la balise signalant que Caliseq doit être utilisé est
« activée », le programme peut entre alors dans la partie du programme spécifique à l’utilisation de
Caliseq. Dans cette partie, la première tâche effectuée est la lecture du fichier d’entrée cons_file et de
la création d’une « super variable » – ou structure au sens stricte du terme en langage C, elle sera
détaillé ultérieurement – contenant l’ensemble des informations qui y sont contenues tel que les
séquences, les noms des séquences, la longueur des séquences, mais également le profil au sens
matrice consensus de l’alignement, etc. C’est l’appel à la fonction ReadMulCons() qui permet de
réaliser aussi bien la déclaration, que le remplissage de cette « super variable ». Une fois le traitement
23
L’exécution des instructions du code d’un programme se fait de façon linéaire. Pour modifier cette linéarité,
on a recours à deux types de structures de contrôles principaux : les boucles lorsqu’on a affaire à une instruction
qui doit être répétée, et les structures conditionnelles lorsqu’on a à faire face à plusieurs choix possibles.
Lorsqu’une série d’instruction est usitée un nombre important de fois, il est parfois judicieux de les regrouper en
fonctions (ou procédures).
du jeu de bloc effectué, le programme bifurque entre l’utilisation de Caliseq en mode normal ou
l’utilisation en mode recherche sur banque. Cette bifurcation dépend là encore d’un balise, remplie ou
non, selon que getopt() a rencontré ou non le paramètre « –B ». D’un point de vu algorithmique, le
cas le plus simple est celui du premier mode, même s’il figure après le cas du mode de recherche sur
banque dans le corps du programme comme cela est présenté dans l’Algorithme 7.1 de la fonction
Main().
Ainsi, pour le premier mode, celui d’alignement simple du jeu de blocs sur une séquence ou un
pré alignement de séquences, le fichier ali_file est envoyé à la procédure AlignToFreq(). Celle-ci
est assez similaire à la procédure ReadMulCons() dans la mesure où AlignToFreq() renvoie une
autre « super variable » contenant toutes les informations nécessaires du fichier d’alignement ali_file.
Les deux « super variables » (l’un provenant du traitement de cons_file et l’autre de ali_file) sont alors
passé en arguments à la fonction Calign() (Caliseq dans son premier mode) qui réalise et affiche
l’alignement du jeu de blocs sur la ou les séquence(s) cibles.
L’algorithme pour le mode de recherche sur banque est plus complexe du fait que le
programme sauvegarde dans un arbre (sorte de liste hiérarchisée) en fonction du score d’alignement,
l’ensemble des séquences qu’il a identifié en tant que P450s par le jeu de blocs. La fonction Main()
appelle des fonctions présentes dans le fichier minimier.c pour mettre en place et construire cette arbre.
Par ailleurs, comme un z-score est appliquée sur les scores afin de filtrer les séquences, la procédure
d’alignement des blocs sur les séquences cibles est réalisée deux fois : (i) la première fois sur
l’ensemble des séquences de la base de séquences afin de récupérer chaque score pour un calcul de
moyenne, d’écart type, et finalement du z-score (ii) puis une seconde fois uniquement sur les
séquences retenus dans l’arbre. Le calcul du z-score a été précédemment expliqué dans le manuscrit. Il
est à noté que l’arbre permet la sauvegarde des séquences classées en fonction de leur score. Le
nombre de séquences sauvegardé dans l’arbre dépend du nombre d’éléments (de feuilles) défini en
paramètre d’entrée par l’utilisateur. Lorsque ce nombre est faible, seules les séquences présentant le
meilleur score d’alignement seront sauvegardées dans l’arbre. D’un point de vu algorithmique, chaque
enregistrement du fichier ali_file (banque de séquences au format fasta) est lu indépendamment
successivement, affecté chaque fois à une variable. Cette variable qui contient la séquence est envoyé
en argument avec la « super variable » issu du traitement du fichier cons_file à la fonction Caliseq().
Caliseq() réalise alors l’alignement et attribue un score d’alignement pour la séquence. Selon le
score obtenu, la séquence et son score respectif sont enregistrés dans l’arbre. Par ailleurs, les scores et
le nombre de séquences sont aussi retenus et cumulés dans d’autres variables pour pouvoir calculer la
moyenne et l’écart type, et serviront ultérieurement pour le calcul du z-score. Une fois que toutes les
séquences de la banque traitées, les séquences de chaque feuille de l’arbre sont soumises à nouveau à
la fonction Caliseq() avec la « super variable » représentant le jeu de blocs. C’est au cours de ce
second passage qu’un z-score est calculé pour chaque séquence de l’arbre et comparé à un seuil défini
par l’utilisateur en paramètre d’entrée (ou un seuil égale à 0 par défaut). De cette comparaison,
dépendra l’affichage de l’alignement de cette séquence avec le jeu de blocs.
Fonction Main() :
/* Récupération des paramètres en entrée */
Pour tous les arguments récupéré en paramètre d’entrée par la fonction getopt(), faire :
/* Tous les cas ne sont pas présentés ici */
cas ‘N’ :
balise du mode Caliseq mise activée
cas ‘B’ :
variable read_bank prend la valeur du nombre maximal de feuilles pour l’arbre
cas ‘Z’ :
variable seuil pour le z-score sMinZscoreCons prend la valeur insufflé par l’utilisateur
/* etc… */
fin pour
mémorisation du nom pour le fichier ali_file
mémorisation du nom pour le fichier cons_file
/* Partie spécifique à Caliseq, les autres parties ne sont pas présentées */
Si (balise du mode Caliseq activé) alors :
/* Lecture du fichier cons_file et enregistrement dans une super variable multicons */
multicons récupère les informations en sortie de ReadMulCons(cons_file)
/* Lancement de Caliseq en mode de recherche sur banque selon le remplissage ou non de read_bank */
Si (read_bank est remplie) alors :
init_minimier(read_bank) /* Création de l’arbre au nombre de feuilles défini dans read_bank */
Tant qu’il reste des enregistrements curseq dans le fichier ali_file, faire :
/* Il existe des fonctions de correction pour les enregistrements non « propres » qui ne sont pas présenté */
/* Premier passage par Caliseq */
score récupère les informations en sortie de Caliseq(curseq, multicons)
cumul de score et de son carré, du nombre de séquence dans la banque
seq2keep est créé par sNewSeq2Keep(curseq, score)
seq2keep est envoyé à l’arbre par range(seq2keep)
Si (seq2keep n’est pas conservé dans l’arbre) alors le détruire
fin tant
définition de lim, le nombre total de séquences conservées /* soit égale à la valeur de read_bank soit cumulé précédemment */
calcul de la moyenne mu et de l’écart type ecart à partir des scores cumulés
Pour les lim feuilles de l’arbre, faire :
/* Deuxième passage par Caliseq */
récupération de l’enregistrement contenu dans chaque feuille par get_minimier_swres()
Caliseq(curseq, multicons, mu, ecart, deuxième passage)
fin pour
fin si /* fin du code pour le mode de recherche sur banque */
/* Lancement de Caliseq en mode normal selon le remplissage ou non de read_bank */
Sinon
/* Lecture du fichier ali_file et enregistrement dans une super variable alifreq */
alifreq récupère les informations en sortie de ReadMulCons(cons_file)
Calign(alifreq, multicons)
fin sinon /* fin de Caliseq en mode normal */
fin si /* fin de l’outil Caliseq */
Algorithme 7.1 Algorithme simplifié de la fonction Main() de SmartConsAlign. Seule la partie relative à
Caliseq est présentée. Les arguments passés aux fonctions sont inscrits dans les parenthèses des fonctions. Les
variables sont indiqués en italique.
3.4.2 La fonction ReadMulCons() de mulcons.c
La fonction ReadMulcons() a été développée pour lire le fichier de jeu de bloc – celui là même
qui comporte le symbole « # » comme séparateur – afin de les transformer en matrice consensus ou
profil. Historiquement, c’est d’ailleurs la première fonction qui j’ai écrite et qui a contraint le fichier
cons_file à être écrit tel qu’il est. Dans l’objectif de sauvegarder les informations de ce fichier, il m’a
fallu définir une « super variable » communément appelé « structure » en langage C. Celle-ci est
désignée – on parle également de type – ConsFrags2 et regroupe un grand nombre de variables et de
sous structures. La décomposition de cette « super variable » est présentée dans le Tableau A 3-2. Les
variables multicons et alifreq présenté dans la fonction Main() sont de type ConsFrags2.
Tableau A 3-2 Décomposition de la structure ConsFrags2. Les astérisques « * » correspondent en langage C à un pointeur correspondant
à une adresse mémoire. On souvent recourt aux pointeurs pour créer des tableaux de façon dynamique, mais également lors des passages en
arguments.
Contenu de la structure
Nom de la
Type de la Nom de la Explications relatives
structure
variable variable
ConsFrags2 RConsensus *rcons rcons est un pointeur vers une structure qui permet de
sauvegarder la matrice consensus. L’utilisation du pointeur est
justifiée lorsque qu’une fonction est de type RConsensus et
retourne une structure de type RConsensus
Sseqs **sfrags sfrags est un pointeur vers un tableau de structures contenant
l’ensemble des séquences. L’utilisation du pointeur est justifié
également pour les mêmes raisons que précédemment
Int nbfrags nbfrags est le nombre d’éléments contenu dans le tableau sfrags
Int realsize realsize est utilisé pour allouer de la mémoire pour le tableau de
sfrags
Double fgap_gap Contient le poids attribué au gap face à un gap
Double Fgap_op Contient le poids attribué à l’ouverture d’un gap
Double *weight weight est un tableau de poids pour pondérer lors de la
construction de matrice consensus les séquences trop identiques
Rconsensus Float *poids La matrice consensus est sauvegardée dans un tableau unique à
une dimension
Char *vocab vocab contient la séquence de l’alphabet utilisé pour construire la
matrice
Int len len est la longeur du tableau poids
Sseqs Char **seqs seqs est un tableau de séquences

Char **seqnames seqname est le tableau des noms de séquences associés
Int *seqrealsize seqrealsize est un tableau des longueurs de chaque séquence
Int realsize realsize est utilisé pour allouer de la mémoire pour le tableau de
sfrag
Int nseq nseq est le nombre de séquence contenu dans le tableau
Pour sauvegarder les informations du fichier de blocs, j’ai donc déclaré la variable multicons au
type ConsFraqs2 où chaque bloc est un élément de sfraqs contenant lui-même dans un tableau toutes
les séquences et noms des séquences de chaque bloc. La lecture des informations de chaque bloc a
nécessité un fichier temporaire pour chaque bloc et l’appel à la fonction read_alignement(),
fonction préexistante à SmartConsAlign qui lit un fichier d’alignement de séquences. Un fois les
alignements récupérés, la procédure CreateWeight() est lancé avec multicons en argument pour
calculer les pondérations à utiliser pour chaque séquence. Cette pondération a été mise en place pour
ne pas favoriser lors de la création du profil, le résidu provenant de séquences trop identiques. Enfin,
ReadMulCons() lance la procédure CreateCons() qui permet d’obtenir les profils des blocs. Une
fois la variable multicons remplie, elle est retournée à la fonction Main().
Fonction ReadMulCons(cons_file)
Déclaration de multicons
Déclaration d’un fichier temporaire tmp
/* mise en mémoire des séquences */

Faire tant qu’on atteint pas la fin du fichier cons_file :
Recopier chaque bloc dans le fichier tmp
Lire le fichier tmp et sauvegarder dans mulicons->sfrags les alignements de chaque bloc
Retenir le nombre de bloc dans mulicons->nbfrags
fin faire
/* création d’une table de pondération pour chaque séquence */

muticons reçoit en sortie de CreateWeightl(multicons) lui-même, complété de multicons->weight
/* création de la matrice consensus globale de tout le jeu de bloc */

muticons reçoit en sortie de CreateCons(multicons) lui-même, complété de multicons->rcons
Algorithme 7.2 Algorithme simplifié de la fonction ReadMulCons() qui permet la lecture et la création du
profil pour le jeu de bloc. La fonction reçoit en argument d’entrée le fichier cons_ali (ainsi que son emplacement
pour l’ouverture du fichier) et retourne une variable de type ConsFrags2 dont tous les champs ont été complétés.
3.4.3 La fonction CreateWeight() de mulcons.c
C’est l’une des dernières fonctions que j’ai écrite. À l’origine, elle a été mise en place pour
modérer, assouplir le profil lorsque qu’il y a dans l’alignement de séquences, des séquences trop
identiques. En effet, cette identité entre séquences se répercuterait au niveau des acides aminés où les
fréquences d’apparitions à une position donnée seraient trop importantes, masquant de ce fait la
présence d’un acide aminé conservé sur toutes les séquences. C’est pourquoi il est nécessaire de
pondérer les séquences trop proches entre elles. Pour cela, il faut calculer les identités entre toutes les
séquences et les comparer toutes ces identités entre elles, deux à deux. Le calcul de la pondération est
expliqué en détail dans la section discutant de l’évolution de Caliseq, mais les grandes lignes sont
décrites de la façon suivante : pour chaque paire de séquence, une identité est attribuée. À partir de
cette taux d’identité, il est possible de calculer pour chaque séquence, la fréquence moyenne des
identités entre cette séquence et les autres séquences du jeu. Or, ce n’est pas la fréquence moyenne des
identités qui est intéressante, mais son complémentaire pour à la fois défavoriser les séquences trop
proches et favoriser les séquences n’ayant pas de séquences proches. CreateWeight() est une
fonction qui n’appelle pas d’autres fonctions, mais est dotée d’un algorithme de programmation assez
« fantaisistes », ne serait-ce que pour faire les identités deux à deux.
Fonction CreateWeight(multicons de type ConsFrags2)
/* Création du tableau qui contiendra les identités de chaque couple de séquence */

Déclaration d’un tableau tab_id de taille (nbseq*(nbseq-1)/2) /* nbseq est le nombre de séquences totales dans l’alignement*/
/* Création du tableau qui contiendra les pondérations de chaque séquence. Sa dimension est donc nbseq */
Déclaration de multicons->weight de taille nbseq
Si (il n’y a qu’une seule séquence) alors /* Dans le cas d’une séquence unique, il n’est pas nécessaire de calculer les pondérations */
multicons->weight[0]=1.0
retourner à la fonction appelante multicons
fin si
Initialisation à 0 de tout le tableau multicons->weight
Déclaration d’une variable idpos qui va remplir le tableau d’identité tab_id
/* Remplissage de la table d’identité */

Pour chaque séquence is allant de 0 à nbseq–1, faire : /* il n’est pas nécessaire de comparer la dernière séquence à elle-même */
Pour chaque séquence js allant de is+1 à nbseq, faire : /* la comparaison de toutes les séquences aboutit à une matrice symétrique */
Initialisation des compteurs d’identité identity et du nombre d’acides aminés nbcomp comparé
Pour chaque bloc, faire : /* Parcours des blocs */
Pour chaque position ipos dans la séquence, faire : /* Parcours des positions */
Incrémenter nbcomp
Si (dans le même bloc, à la même position ipos, des séquence is et js sont identiques) alors incrémenter identity
fin pour
fin pour
idpos prends la valeur identity/nbcomp et s’incrémente /* fréquence d’identité entre deux séquences sauvegardé dans tab_id */
fin pour
fin pour
/* Remplissage de la table des poids multicons-> weight par les fréquences d’identité cumulées */
Pour chaque case de multicons-> weight, faire :
cumuler les fréquences associées à chaque séquence
fin pour /* l’algorithme est simplifié ici, car en réalité, il faut parcourir tab_id par « ligne » et par « colonne » */
/* Calculer les fréquences moyennes à partir des fréquences cumuler en enregistrer son complémentaire */
Pour chaque élément i de multicons-> weight, faire :
multicons-> weight[i] reçoit 1– (multicons-> weight[i]/(nbseq-1))
fin pour
retourner à la fonction appelante la variable multicons
Algorithme 7.3 Algorithme (très) simplifié de la procédure CreateWeight() qui permet la mise en place d’une
pondération pour les séquences trop proches dans l’alignement. Cette fonction reçoit une variable de type
ConsFrags2 et retourne cette même variable à la fonction appelante, qui peut être soit ReadMulCons() soit
Alifreq().
3.4.4 La fonction CreateCons() de mulcons.c
CreateCons() est sans nulle doute la fonction la plus importante du programme Caliseq : elle
réalise à elle seule la création d’une grande partie de la « matrice » de substitution (artéfact de la
programmation dynamique), comme il sera vu plus tard. Cette fonction n’a cessé d’être remaniée et
réorganisée, selon l’évolution subite pour le calcul du profil des blocs. Je présenterai ici la version
finale en date de cette fonction, mais les différentes étapes de l’évolution de cette fonction ont été
discutées dans le manuscrit. Cette fonction permet donc la création d’un profil à partir de l’ensemble
des informations déjà disponibles dans la variable de type ConsFrags2 (séquences et pondérations) et
sera sauvegardé dans la structure rcons de cette même variable. À noter que cette fonction est
commune à la création du profil pour le jeu de blocs (provenant du fichier cons_file), mais aussi pour
créer un profil à partir des séquences pré alignées sur la séquence cible (provenant du fichier ali_file).
Il existe néanmoins quelques petites différences au niveau de l’algorithme qui seront vues ci-après.
Pour construire le profil, il faut déclarer une matrice, dont les dimensions ont pour largeur (ou pour
nombre de colonnes) le nombre totale de résidus d’une même séquence sur l’ensemble des blocs et
pour hauteur, l’alphabet (ou l’ensemble des symboles) utilisé pour représenter la séquence. Pour
mémoire, le profil présenté pour SmartConsAlign comportait un alphabet de 20 lettres, chaque lettre
représentant un acide aminé différent. Ici, un alphabet plus conséquent a été utilisé, de 32 symboles,
dont certains caractères ont été sollicités pour mémoriser d’autres informations que celle de fréquence
des acides aminés. Ainsi, une des particularités de l’outil Caliseq a été d’incorporer directement la
matrice d’insertion pour la programmation dynamique à la matrice de substitution, grâce à l’existence
de ces caractères supplémentaires. Pour ce qui est de la largeur du profil, il suffisait par exemple de
compter le nombre total de résidu de la première séquence pour tous les blocs. La déclaration et la
création de cette matrice consensus se fait au moyen de la procédure NewRConsenus() du fichier
cons_align.c. Une autre matrice, de similarité ente résidus, est nécessaire. Elle correspondait
initialement à une matrice de similarité (de type BLOSUM ou PAM), mais finalement est devenue
dans la dernière version de CreateCons() une simple matrice unitaire d’identité, de dimension
alphabet x alphabet. Elle est donc initialisé à 1 pour la diagonale (lorsqu’il y a identité entre les
résidus se trouvant en face) et 0 ailleurs. Cette deuxième matrice de similarité (ou de fréquence de
replacement d’un caractère par un autre) est réalisée par l’appel à la fonction unitary_matrix() du
fichier Nmatrix.c. Ces deux fonctions ne nécessitent pas de description : elles se contentent d’allouer
de la mémoire pour la création d’une matrice (contenu dans un tableau à une dimension, c’est sa seule
particularité, lié à son utilisation en langage C) et d’initialiser cette matrice par des 0 sauf au niveau
des diagonales. Par ailleurs, ces fonctions ont été adaptées de fonctions préexistantes à
SmartConsAlign. Le remplissage de la matrice consensus s’effectue ensuite par calcul d’une simple la
fréquence d’un symbole donné à une position donnée de l’alignement en séquence, et ce, pour chaque
position de l’alignement. La fréquence peut être de plus réajustée en fonction de la fréquence de
similarité tirée de la seconde matrice, ainsi que de la pondération calculée pour chaque séquence (cf.
précédemment). Le calcul de la fréquence pour le profil des alignements issus du fichier cons_file
(qu’on peut aussi nommer « PSSMs séquentielles ») est un peu plus complexe et se voit par ailleurs
ajusté par un facteur supplémentaire : celui des fréquences dites « background » de chaque acide
aminé, à savoir leurs fréquences générales dans toutes les protéines identifiées à ce jour. En fait,
comme il sera expliqué plus tard dans le manuscrit, dans la dernière version de CreateCons(), le
profil généré pour les blocs est construit de la même manière qu’une matrice de similarité BLOSUM.
En effet, pour obtenir les poids de substitution dans une matrice BLOSUM, on calcule dans un
alignement de séquence, le logarithme en base 2 des fréquences de chaque couple d’acide aminé à une
position donnée, divisé par le produit des fréquences « background » de chaque acide aminé du couple.
Dans CreateCons(), le même principe est appliqué pour l’obtention des matrices consensus. Les
fréquences « background » (désignées aussi comme fréquences de fond) des acides aminés permettent
entre autre de calculer des pseudo-comptes, et évitent ainsi d’avoir à soumettre à un logarithme des
fréquences nulles pour certains acides aminés. Ces fréquences « background » ont été récupérées à
partir des statistiques sur les acides aminés de la base de séquences Swiss-Prot. Celles-ci sont stockée
provisoirement en « dur » 24 dans le corps du programme, à l’intérieur d’une fonction nommée
Getfreq() de mulcons.c. Le fonctionnement de cette dernière est simple et ne nécessite pas une
explication poussée : en recevant en argument d’entrée un symbole correspondant à un acide aminé
(code à une lettre), la fonction renvoie la fréquence de l’acide aminé correspondant. Il est à noter que
lors du calcul du profil, la fréquence des gaps dans l’alignement est déterminée de la même manière.
Toutefois, la fréquence « background » pour les gaps (appelés aussi INDEL pour insertion/délétion)
présente la particularité d’avoir été calculé sur la banque d’alignements multiples de séquences
BAliBASE (http://www.igbmc.ustrasbg.fr/BioInfo/BAliBASE2/index.html) (Thompson et al,
1999). Un script python a été écrit à cet effet pour comptabiliser le nombre de gap présents ainsi que le
nombre de caractères total (gap inclus) dans toute la base. Cette fréquence a été elle aussi enregistré en
« dur » dans le corps du programme dans la même fonction Getfreq() de mulcons.c. Il est à noter
que lors du compte, les gaps de type INDEL ont été différenciés des gaps alignés sur d’autres gaps.
24
« Ecriture en dur » exprime en informatique que les données ne peuvent être modifiées qu’à l’intérieur du code.
Ce n’est pas usuellement conseillé de procéder ainsi : la plupart du temps, il est préférable de lire des données en
paramètre d’entrée au programme. Dans notre cas, si les valeurs de fréquences des acides aminés venaient à
changer, il faudrait les changer dans le corps du programme et le recompiler.
Comme expliqué précédemment, la particularité de Caliseq a été d’avoir incorporé la matrice

d’insertion dans la matrice consensus à l’aide des symboles supplémentaires. De plus, les deux
matrices sont construites en même temps. En réalité, cette « matrice d’insertion » n’a finalement de
matrice que le nom : en pratique, c’est une valeur unique qui correspond à la fréquence de gaps
rencontrés à une position donnée de l’alignement des séquences dans les blocs.
Fonction CreateCons(mutlicons de type Consfrags2, et une balise)

/* CreateCons est appelé pour faire le profil des blocs du fichier cons_file mais aussi de l’alignement de séquence du fichier ali_file… */
/* … il lui faut donc une balise pour différencier le traitement des deux */
Pour tous les nbfrags blocs, faire :
totSize : = Cumuler la longueur de la première séquence de l’alignement, sur tous les blocs
/* l’importance que toutes les séquences à l’intérieur d’un même bloc doivent être de même longueur vient de ce calcul */
fin pour
la fonction NewRConsenus(alphabet, totSize) permet de créer la matrice de fréquence (en 1D) dans la variable multicons->rcons
/* NewRConsenus crée une matrice de hauteur alphabet et de largeur totSize */
la fonction unit_matrix() permet de créer et d’initialiser à 0 et 1 (sur la diagonale) une matrice de similarité
/* sa dimension est de alphabet x alphabet et correspond à une matrice de fréquence de remplacement d’un résidu par un autre */
Pour tous les nbfrags blocs, faire : /* Parcours de tous les blocs */
Pour toutes les positions ipos d’alignement en séquences, faire : /* Parcours des positions sur alignement */
Pour tous les symboles isymb de l’alphabet, faire : /* Parcours des symboles*/
Initialiser le compter sum à 0.00
Pour toutes les séquences i de l’alignement, faire :
Récupérer l’index de correspondance entre l’alphabet et le résidu de la séquence i à la position ipos
Si (index est positif et que l’isymb est un caractère d’acide aminé) alors
sum s’incrémente par le produit de la fréquence de remplacer isymb par index, par la pondération pour la séquence i
fin si
Si (index correspond au caractère gap et isymb au caractère utilisé pour retenir la fréquence des gap) alors
sum s’incrémente
fin si
Si (index et isymb ne correspond à aucun résidu, ni gap) alors /* Parmi les 32 symboles, certains ne servent pas */
sum ne reçoit rien
fin si
fin pour
Si (la balise est activée ou isymb correspond à un symbole non utilisée) alors
sum reçoit sa division par le nseq /* calcul de la fréquence normale */
fin si
Sinon /* Calcul du poids comme pour BLOSUM */
sum reçoit le calcul du log en faisant appel à la fonction Getfreq(isymb) pour obtenir les fréquences « background »
fin sinon
Si (sum > la variable logmaxval) alors logmaxval := sum /* logmaxval et logmin val permettent de calculer la fréquence */
Si (sum < la variable logminval) alors logminval := sum /* de poids de gap pour la construction de la matrice de délétion */
sum est mémorisé dans rcons qui passe à l’élément suivant
fin pour
fin pour
fin pour
muticons->fgap_gap := (logmaxval) – gap_gap_ratio * (logmaxval – logminval) /* gap_gap_ratio est donnée en paramètre …*/
muticons->fgap_op := (logmaxval) – gap_op_ratio * (logmaxval – logminval) /* …d’entrée à SmartConsAlign par l’utilisateur */
Retourner à la fonction appelante multicons
Algorithme 7.4 Algorithme simplifié de la fonction CreateCons()qui est appelé soit par ReadMulCons() soit
par AlignToFreq() passant tous deux à CreateCons() une structure de type ConsFrags2. CreateCons() renvoie la
structure de type ConsFrags2 en ayant rempli la matrice consensus rcons ainsi que le poids de gap fgap_gap. A
noter que j’ai utilisé un symbole particulier ici « := » qui signifie affectation.
3.4.5 La fonction AlignToFreq() de mulcons.c
La fonction AlignToFreq() réalise le même travail que ReadMulCons(), mais avec le fichier
ali_file, à savoir la création d’un profil pour le fichier d’alignement de séquences cibles. Cette
procédure n’est appelée que en mode normale de Caliseq, dans la mesure où elle peut lire un
alignement de séquence (alors que dans le mode de recherche de Caliseq, les séquences soumises sont
traitées une à une). La variable utilisé pour retenir les séquences en mémoire est de type ConsFrags2,
du même type que la variable multicons utilisé dans ReadMulCons() : elle s’appelle cette fois ci
alifreq. L’architecture de la fonction AlignToFreq() est elle aussi vraiment similaire à celle de
ReadMulCons(), excepté le fait qu’il n’y a plus besoin de rechercher des « # » qui délimitent les
blocs, ni même de créer un fichier temporaire pour la lecture de ceux-ci : l’intégralité du fichier est lu
par la fonction read_alignement(). CreateWeight() et CreateCons() sont ensuite appelés
pour construire la matrice consensus, qui s’apparente vraiment, dans le cas d’alifreq, à une matrice de
fréquence.
Fonction AlignToFreq(ali_file)
Déclaration de alifreq
/* mise en mémoire des séquences */

Lire le fichier ali_file et sauvegarder dans alifreq->sfrags les alignements de tout le fichier
/* création d’une table de pondération pour chaque séquence */

alifreq reçoit en sortie de CreateWeightl(alifreq) lui-même, complété de alifreq->weight
/* création de la matrice consensus globale de tout le jeu de bloc */

alifreq reçoit en sortie de CreateCons(alifreq) lui-même, complété de multicons->rcons
Algorithme 7.5 Algorithme simplifié de la fonction AlignToFreq() qui permet la lecture et la création du profil
pour la séquence cible ou son pré-alignement. La fonction reçoit en argument d’entrée le fichier ali_ali (ainsi que
son emplacement pour l’ouverture du fichier) et retourne une variable de type ConsFrags2 dont tous les champs
ont été complétés.
3.4.6 La fonction CreateWdel() de mulcons.c
La fonction CreateWdel() permet de construire la troisième et dernière matrice pour la

programmation dynamique (un du moins, une partie), celle des poids de délétion. En effet, la matrice
de substitution est en partie déjà créé par la fonction CreateCons() qui crée également la matrice
d’insertion. En quelque sorte, les « PSSMs séquentielles » issues des blocs correspondent à la
première moitié de la matrice de substitution et il suffit de la multiplier avec la matrice consensus (ou
fréquence) issu de l’alignement de la séquence cible avec ses proches, pour obtenir la matrice finale de
substitution. Il en est de même pour la matrice de délétion.
Caliseq ne gère que les poids d’ouverture de gap (gap_op) et les poids de gap face à un gap
(gap_gap). Le poids d’ouverture de gap peut être contrôlé en entrée du programme à partir de l’option
« –g » suivi d’un coefficient pour atténuer au diminuer la valeur du gap. Le calcul et l’attribution du
poids des deux type de gaps s’effectuent quant à eux dans la procédure CreateCons()
précédemment décrite. Leurs valeurs sont sauvegardées dans la variable de type ConsFrags2 issue des
blocs. C’est d’ailleurs cette même variable qui est passée à la fonction CreateWdel() pour construire
la matrice de délétion. Cette matrice est particulière dans l’outil Caliseq, car il fallait trouver un moyen
pour ne pas pénaliser l’apparition de gap entre les blocs, permettant ainsi aux blocs de « coulisser » sur
la séquence cible (ou le pré-alignement) sans contrainte. Afin de remplir cette condition, l’idée a été de
ne pas pénaliser les l’apparition de gap en fin de chaque bloc. Ainsi, la matrice de délétion peut être
schématisée comme sur la Figure A 3-6, où en fin de chaque bloc, l’apparition d’un gap entre les blocs
n’entraîne aucune pénalité.
Bloc1 Bloc2 … … Blocn-1 Blocn
1234…L1234…L1234…L1234…L1234…L1234…L
A
B
C
.
.
.
Z
alphabet
-
.
.
.
.
&
Figure A 3-6 Schéma de la matrice de délétion. La dimension de la matrice correspond en hauteur à l’alphabet
utilisé (nombre de symbole) et en largeur au nombre total de résidus d’une séquence à travers tous les blocs. Ici
chaque bloc est représenté par des positions (1, 2, 3, 4 …, L) où L correspond à la dernière position du bloc. En
gris correspond aux parties de la matrice dont le poids est gap_op, en vert, gap_gap et en rouge, 0. Ainsi, à la fin
de chaque bloc, l’apparition de gap entre les blocs n’est pas pénalisée (=0)
Cette fonction est appelée juste avant l’algorithme de programmation dynamique, soit par la
fonction Calign() soit par la fonction Caliseq(). Tout comme la matrice consensus, elle a été
programmée sur une matrice à 1 dimension, et est de type RConsenus (cf.Tableau A 3-2).
Fonction CreateWdel(multicons de type ConsFrags2)
Définition de la matrice de délétion Wdel

Récupération des valeurs de gap_op et gap_gap de multicons
/* remplissage de toute la matrice par gap_op */

Pour tous les éléments i de la matrice Wdel, faire :
Wdel->poids[i] := gap_op
fin pour
/* remplissage de la ligne correspondant au symbole « – » de la matrice par gap_gap */

Pour tous les éléments i de la matrice correspondant au symbole « – », faire :
Wdel->poids[i] := gap_gap
fin pour
/* remplissage de la dernière position de chaque bloc par 0 */

Pour chaque bloc, faire :
Pour chaque symbole, faire :
Si (on est sur la position i finale d’un bloc) alors Wdel->poids[i] := 0.00
fin pour
fin pour
/* En réalité, dans le programme, j’utilise un pointeur vers l’adresse de Wdel->poids que je remplie au fur et à mesure */
retourner à la fonction appelante Wdel
Algorithme 7.6 Algorithme simplifié de la fonction CreateWdel() qui prend en entrée la variable de type
ConsFrags2 provenant du fichier cons_file pour créer une matrice de délétion. Elle est appelée par Calign() ou
Caliseq().
3.4.7 Les fonctions Calign() et Caliseq() de mulcons.c
Calign() ainsi que Caliseq() sont les deux fonctions qui réalisent la recherche de
l’alignement optimale entre les profils des blocs et le profil de la séquence cible par un algorithme de
programmation dynamique de type NWS (cf. section 2.4.1.3 page 85). Dans le cas de Calign() qui
permet le lancement de l’outil Caliseq dans son mode normal, la réalisation de l’alignement profil-
profil passe par l’établissement d’une matrice d’alignement M[i,j] où chaque élément de la matrice
donne le score de similarité obtenu pour un sous-alignement optimal des profils séquentielles A (issu
du fichier cons_file), de la position 1 à la position i, avec les séquences cibles (soit simple soit pré-
alignées), B, de la position 1 à la position j. Cette matrice M[i,j] est alors construite à partir de trois
scores de similarité de sous-alignements optimaux M[i–1,j–1], M[i,j–1], M[i–1,j]. En effet, M[i,j] est
le score maximal entre les trois scores suivants :
• M[i–1,j–1] + W(j,i)
• M[i–1,j] + i(ai)
• M[i,j–1]+ d(bj)
où W(j,i) est le score de similarité entre la position i des « PSSMs séquentielles » et la position j du set
de séquences pré-alignées, i(ai) est le poids de gap dans B contre la position i sur A (insertion de la
position i des « PSSMs séquentielles ») et enfin d(bj) est le poids de gap dans A contre la position j sur
B (insertion d’une colonne j des séquences pré-alignées). Le score de similarité W(j,i) pour une
position d’alignement i dans les « PSSMs séquentielles » avec la position j s’obtient alors par le
produit du poids à la position i des « PSSMs séquentielles » avec le poids à la position j du profil pour
les séquences pré-alignées. C’est pour cette raison que je comparais les « PSSMs séquentielles » à une
« demi » matrice de substitution. Le score de délétion s’obtient de la même façon en multipliant le
poids à la position i de la matrice de délétion par le poids de la position j de la matrice consensus pour
les séquences pré-alignées. Le score d’insertion est quant à lui un peu différent, et s’obtient par
addition de la fréquence de gap multiplié par le poids d’un gap contre un gap à la position i avec son
complémentaire (1– fréquence de gap à la position i) multiplié par le poids d’ouverture de gap. Ainsi,
on comprend mieux l’utilité d’avoir préparé les données nécessaires au calcul des trois matrices : i) la
matrice de substitution, contenue dans la variable de type ConsFrags2 a été créée par la fonction
CreateCons(), ii) la matrice d’insertion contenue dans la même variable et a été créée également par
la fonction CreateCons() (mais n’est contenu que dans la variable contenant les « PSSMs
séquentielles » et enfin, iii) la matrice de délétion qui est obtenue par appel à la fonction
CreateWdel(). Dans le cas de la fonction Caliseq(), l’algorithme présenté ci-dessus est
légèrement simplifié, puisqu’il ne s’agit plus d’un alignement profil-profil, mais d’un alignement entre
un profil et une séquence simple. En effet, le fichier d’alignement de séquence ali_file, n’est plus lu
dans sa totalité cette fois-ci, mais chaque enregistrement est lu l’un après l’autre au fur et à mesure du
traitement. Cependant, pour pouvoir adapter l’algorithme précédent au traitement d’une séquence au
lieu d’un profil il a fallu indexer la séquence cible à l’aide de la fonction IndexSequence() et de la
désindexer une fois l’alignement réaliser par la fonction DeIndexSequence(). Cette indexation
correspond en fait à établir une correspondance de chaque position de la séquence avec l’alphabet
utilisé. Les deux fonctions sont préexistantes au programme SmartConsAlign, et ne seront pas
détaillées.
En pratique, que ce soit pour Calign() ou Caliseq(), deux matrices d’alignements sont
utilisés : une contenant les meilleurs scores selon les trois chemins possibles pour chaque élément de
la matrice, et une autre matrice contenant justement les chemins empruntés. Ces deux matrices sont
remplies en simultanées lors de la programmation dynamique. Une fois le remplissage des deux
matrices effectuée, une fonction Backtracking() est appelé pour « remonter » le chemin dans la
matrice des chemins empruntés, correspondant à l’alignement optimale. Cette fonction retourne dans
une variable de type caractère, le chemin « optimal ». Dans la procédure Calign(), les deux profils et
le chemin optimal sont envoyés à la fonction PrintAln() qui réalise l’affichage de l’alignement des
séquences contenues dans chaque bloc sur la séquence cible (ou son pré-alignement). Dans la fonction
Caliseq() en revanche, des opérations supplémentaires sont présentes, comme la vérification de la
longueur d’alignement avec le cut off sur la longueur, défini en paramètre d’entrée (option « –L »)
effectuée par LegnthSeqVSCutOff() ou encore, le calcul du z-score qui selon la comparaison avec
le seuil donnée en paramètre d’entrée (option « –Z ») permettra ou non l’affichage de l’alignement par
la fonction PrtAlnBank() similaire à PrintAln() mais simplifiée.
Fonction Calign( multicons et alifreq de type ConsFrags2)

/* Création des 2 matrices d’alignement */
Récupération des longueurs des profils lpat et lseq
Création des deux matrices de dimension lpat x lseq /* Pathmatrix P et Scorematrix S */
Wdel := Création de la matrice de délétion par CreateWdel(multicons)
/* Algorithme de programmation dynamique */
Pour chaque position i du profil de multicons->rcons, faire :
Pour chaque position j du profil de alifreq->rcons, faire :
Si (on n’est pas sur la première colonne ni la première ligne) alors :
Initialiser la variable poids de substitution wsub=0 /* cette variable permet de mémoriser les substitutions pour tout l’alphabet */
di := ajouter à la valeur de S[i–1,j] le poids d’insertion à la position i du profil multicons->rcons
dd := valeur de S[i–1,j]
Pour tous les symboles de l’alphabet, faire :
Wusb := incrémenter par le produit du poids de la position i de multicons->rcons par le poids de la position j de alifreq->rcons
dd := incrémenter par le produit du poids de délétion Wdel[i] par le poids de la position j de alifreq->rcons
fin pour
ds := incrémentation par ajout de la valeur S[i–1,j–1] par Wsub
Si (ds > dd et ds> di) alors /*cas de la substitution */
S[i,j] := ds
P[i,j] := ‘SUB’ /* on inscrit le chemin par SUB si on vient de la diagonale, INS de la gauche et DEL de dessus*/
fin si
Si (dd > ds et dd > di) alors /* cas de la délétion */
S[i,j] := dd
P[i,j] := ’DEL’
fin si
Si (di > ds et di > dd) alors /* cas de l’insertion */
S[i,j] := di
P[i,j] := ’INS’
fin si
fin si
Si (on est sur la première ligne de la matrice d’alignement) alors
S[i,j] := S[i–1,j]+ poids de gap
P[i,j] := ’INS’
fin si
Si (on est sur la première colonne de la matrice d’alignement) alors
S[i,j] := S[i,j–1]+ 0
P[i,j] := ’DEL’
fin si
Si (on est sur la première case de la matrice d’alignement) alors
S[i,j] := 0
P[i,j] := ‘ROOT’
fin si
fin pour
fin pour
dmax := score de la dernière case de S
bestpath := récupère le chemin optimale par la fonction backtraking(P,lseq, lpat)
PrintAln(bestpath, multicons, alifreq, autres variables à afficher) permet d’afficher le résultat
Retourner dmax à l’application appelante
Algorithme 7.7 L’algorithme simplifié de Calign() est présenté ici. Il pend en arguments d’entrée les deux
variables de types ConsFrags2 multicons issu du fichier cons_file et alifreq issu du fichier ali_file. En pratique, les
matrices Pathmatrix et Scorematrix sont des tableaux à une dimension où les lignes de la matrice sont mises bout à
bout.
Fonction Caliseq( multicons de type ConsFrags2et cureseq de type ‘sequence’, balise, ecart, mu)
/* Caliseq() reçoit plus d’arguments que Calign() dont curseq à la place de alifreq, balise pour savoir si on est ou non à la première lecture,
ecart et mu pour calculer le z-score*/
/* Création des 2 matrices d’alignement */
Récupération des longueurs du profil lpat et de la séquence lseq
Indexation de la séquence curseq par IndexSequence(curseq)
Création des deux matrices de dimension lpat x lseq /* Pathmatrix P et Scorematrix S */
Wdel := Création de la matrice de délétion par CreateWdel(multicons)
/* Algorithme de programmation dynamique */

Pour chaque position i du profil de multicons->rcons, faire :
Pour chaque position j de la séquence de curseq, faire :
Si (on n’est pas sur la première colonne ni la première ligne) alors :
di := ajouter à la valeur de S[i–1,j] le poids d’insertion à la position i du profil multicons->rcons
ds := ajouter à la valeur de S[i–1,j–1] le poids de substitution multicons->rcons->poids[j]
dd := ajouter à la valeur de S[i–1,j] le poids de délétion Wdel[j]
Si (ds > dd et ds> di) alors /*cas de la substitution */
S[i,j] := ds
P[i,j] := ‘SUB’ /* on inscrit le chemin par SUB si on vient de la diagonale, INS de la gauche et DEL de dessus*/
fin si
Si (dd > ds et dd > di) alors /* cas de la délétion */
S[i,j] := dd
P[i,j] := ’DEL’
fin si
Si (di > ds et di > dd) alors /* cas de l’insertion */
S[i,j] := di
P[i,j] := ’INS’
fin si
fin si
Si (on est sur la première ligne de la matrice d’alignement) alors
S[i,j] := S[i–1,j]+ poids de gap
P[i,j] := ’INS’
fin si
Si (on est sur la première colonne de la matrice d’alignement) alors
S[i,j] := S[i,j–1]+ 0
P[i,j] := ’DEL’
fin si
Si (on est sur la première case de la matrice d’alignement) alors
S[i,j] := 0
P[i,j] := ‘ROOT’
fin si
fin pour
fin pour
dmax := score de la dernière case de S
bestpath := récupère le chemin optimale par la fonction backtraking(P,lseq, lpat)
curseq est désindexé par DeIndexSequence(curseq)
/* Si l’utilisateur à déterminer un seuil de longueur maximale entre le premier bloc et le dernier, alors la condition est vérifiée */
Si (LenthSeqCutOff(bestpath) est vrai) alors retourner dmax à la fonction appelante /* première sortie de la fonction */
/* Lorsqu’on lance Caliseq() pour la seconde fois */
Si (balise est activée) alors
Calcul du z-score
Si (z-score > seuil défini par l’utilisateur) alors
PrtAlnBank(bestpath, multicons, alifreq, autres variables à afficher) permet d’afficher le résultat
fin si
fin si
Retourner dmax à l’application appelante
Algorithme 7.8 L’algorithme simplifié de Caliseq() est présenté ici. Il pends en arguments d’entrée la
variables multicons issu du fichier cons_file de type ConsFrags2 et la séquence curseq qui est un enregistrement
du fichier ali_file. La construction des matrices d’alignement est identique à celle de Calign()
3.4.8 Les fonctions PrintAln() et PrtAlnBank() de mulcons.c
Dans le déroulement du programme, les fonctions PrintAlin() et PrtAlnBank() sont les

dernières sollicitées. Elles réalisent toutes les deux l’affichage de l’alignement optimale à partir des
deux « super variables » de type ConsFrags2, contenant les séquences à la fois pour le jeu de blocs
mais aussi de la séquence cible ou pré-alignée avec ses proches, et à partir de la variable contenant le
chemin optimal obtenu de la programmation dynamique. En réalité, ces deux fonctions n’affichent pas
les résultats en sortie standard du programme : elles appellent des procédures prédéfinies qui réalisent
cette tâche, comme PrintFastaAli() ou PrintClustalAli() du fichier readmultali.c. En effet,
PrintAlin() et PrtAlnBank() sont en fait des procédures qui vont déclarer et créer un alignement
virtuel en machine, et sauvegarder cet alignement dans une variable de structure sSeqs (cf. Tableau A
3-2). Pour ce faire, le nombre total de séquences présentes dans les deux « super variables » est
compté, puis utiliser pour déclarer le nombre total de séquence dans la nouvelle structure sSeqs.
Sachant ensuite que le chemin optimal contient les informations pour chaque position de l’alignement
optimal, la longueur des séquences de l’alignement finale est ainsi déterminée et correspond à celle du
chemin optimal.
Une fois déclarée, la variable recueillant l’alignement finale peut alors être complétée : à chaque
position de la variable contenant le chemin optimal contient une directive pour une position de
l’alignement globale. Ces directives sont de trois types : soit i (pour insertion) soit d (pour délétion) et
enfin, soit s (pour substitution). La complétion de l’alignement globale dépend de ces trois directives :
• Lorsqu’il s’agit de la directive ‘DEL’ (ou ‘d’), des gaps ‘–‘ sont placés dans l’alignement
global final à la place des résidus des séquences dans les blocs, tandis que les résidus d’une
même colonne de l’alignement en séquences sont recopiés dans l’alignement global finale ;
• Lorsqu’il s’agit de la directive ‘INS’ (ou ‘i’), des gaps ‘–‘ sont placés dans l’alignement
global final) la place des résidus de l’alignement en séquences, tandis que les résidus d’une
même colonne de l’alignement en séquences dans les blocs sont recopiés dans l’alignement
global finale ;
• Et enfin, lorsqu’il s’agit de la directive ‘SUB’ (ou ‘s’), les résidus d’une même colonne à la
fois pour l’alignement de séquences dans les blocs et pour l’alignement de séquences cibles,
sont recopiés dans l’alignement global finale.
A noter que la fonction PrtAlnBank() est une copie simplifiée de son homologue PrintAln()
qui n’a qu’à afficher les séquences des alignements contenus dans les blocs et une séquence
supplémentaire. Il y a donc moins de traitement (moins de structure de contrôle de type boucle) à faire.
Je ne présenterai donc pas son algorithme.
Fonction PrintAln(multicons et alifreq de type ConsFrags2, bestpath et autres variables à afficher)
Récupération de la longueur pathlen de bestpath

/* Création de la variable qui contiendra l’alignement global final */
Récupération du nombre de séquences dans les blocs nbmul
Récupération du nombre de séquences dans l’alignement cible nbali
Création de la variable sseqs qui contiendra l’alignement global final contenant le nombre nbmul+nbali séquences de longueur pathlen
Pour tous les champs seqnames de sseqs->seqnames, faire /* Cette boucle a été simplifié en ici, en traitant en simultané les deux cas */
Recopier les noms correspondant dans multicons->sfrags->seqnames et alifreq->sfrags->seqnames
fin pour
/*remplissage de l’alignement global final */

Pour toutes les positions i jusqu’à pathlen, faire
Si (bestpath[i] est égale au caractère ‘s’) alors
Pour toutes les séquences id_mul du bloc id_frag à la position pmul, faire :
Recopier sur Ssseqs-> seqs[id_mul][i] le résidu correspondant à multicons->sfrags[id_frag]->seqs[id_mul][pmul]
fin pour
Pour toutes les séquences id_ali à la position pali, faire :
Recopier sur Ssseqs-> seqs[nbmul+id_ali][i] le résidu correspondant alifreq->sfrags[0]->seqs[id_ali][pali]
/*nbmul+id_ali pour ne pas écraser la partie allouée aux alignements dans les blocs*/
fin pour
incrémenter pmul et pali
Si (pmul atteint la dernière position dans un bloc) alors
incrémenter id_frag
remettre pmul à zero /*début d’un autre bloc*/
fin si
fin si
Si (bestpath[i] est égale au caractère ‘d’) alors
Pour toutes les id_mul séquences de l’alignement global final jusqu’à la séquence nbmul, faire :
Ssseqs-> seqs[id_mul][i] := ‘–‘
fin pour
Pour toutes les séquences id_ali à la position pali, faire :
Recopier sur Ssseqs-> seqs[nbmul+id_ali][i] le résidu correspondant alifreq->sfrags[0]->seqs[id_ali][pali]
fin pour
incrémenter pali
fin si
Si (bestpath[i] est égale au caractère ‘i’) alors
Pour toutes les séquences id_mul du bloc id_frag à la position pmul, faire :
Recopier sur Ssseqs-> seqs[id_mul][i] le résidu correspondant à multicons->sfrags[id_frag]->seqs[id_mul][pmul]
fin pour
Pour toutes les id_ali séquences de m’alignement global final jusqu’à la séquence nbali, faire :
Ssseqs-> seqs[nbmul+id_ali][i] := ‘–‘
fin pour
incrémenter pmul
Si pmul atteint la dernière position dans un bloc, alors
incrémenter id_frag
remettre pmul à zero /*début d’un autre bloc*/
fin si
fin si
fin pour
selon le format choisi par l’utilisateur
PrintClustalAli(sseqs, autres variables à afficher)
Ou par défaut PrintFastaAli(sseqs, autres variables à afficher)
fin selon
retourner la valeur 1 à la fonction appelante /* informe la fonction précédente que tout s’est bien déroulé */
Algorithme 7.9 Algorithme simplifié de PrintAln() qui prends le chemin optimal sous forme de chaîne de
caractères bestpath, ainsi que les deux « super variables » de type ConsFraqs2, multicons et alifreq. La procédure
crée alors un alignement globale finale et envoie cet alignement finale en sortie standard par l’appel à deux
fonctions PrintClustalAli() ou PrintFastaAli( )
3.4.9 Les autres fonctions utilisées par l’outil Caliseq
Les fonctions présentées précédemment réalisent les opérations principales de Caliseq, telles
que les lectures des fichiers spécifiques pour Caliseq, les créations de matrices et l’alignement des
blocs sur la séquence cible. L’outil Caliseq nécessite toutefois l’appel à d’autres fonctions dont
l’écriture a été nécessaire pour simplifier ou clarifier le code (comme les fonctions pour déclarer des
tableaux de façon dynamique en langage C) mais aussi des fonctions préexistantes à SmartConsAlign
ou à d’autre programme, suffisamment modulaires pour être réutilisées sans avoir à modifier leur code
source. Il s’agit pour la plupart des fonctions permettant la lecture des fichiers au format fasta et la
sauvegarde séquences qui y sont présentes (comme NewFastaSequence(), ReadFastaSequence()
ou encore read_alignement()) ou de leur écriture au format fasta ou clustal (PrintFastaAli()
ou PrintClustalAli()). On retrouve également des fonctions destinées de créer un arbre,
Init_minimier(), créer les éléments de cet arbre, sNewSeq2Keep(), le remplir, range(), et enfin
récupérer les éléments par ordre hiérarchique, get_minimier_swres(). Ces quatre fonctions sont
d’ailleurs assez communes à la création d’arbre en générale. En fait la particularité principale de cet
arbre est de mémoriser des séquences en fonction d’un score. Pour Caliseq, c’était bien entendu le
score d’alignement qui allait me servir classer les séquences. Le nombre de feuille de l’arbre est quant
à lui déterminé par l’utilisateur en paramètre d’entrée. On peut en outre constater dans l’algorithme de
la procédure Main(), qu’à la fin du premier tour –première fois qu’on utilise la fonction Caliseq()–,
toutes les feuilles sont « remplies ». C’est seulement à la second utilisation de Caliseq(), que les
séquences identifiés comme P450s sont isolées et affiché selon le z-score qui est calculé en fonction de
leur score d’alignement respectif. Comme il sera vu plus tard, la création de l’arbre était importante
pour éviter de relire deux fois la banque de données de séquences. Pourquoi ? Le z-score se calculant à
partir de la moyenne et de l’écart type, il était nécessaire de parcourir au moins une fois toute la
banque.
Il reste enfin trois autres fonctions que j’ai écrites et que je n’ai pas décrites ici : Getfreq(),
Bactracking() et LengthSeqVSCutOff(). Ces fonctions ne présentent pas un intérêt
algorithmique particulier par rapport aux autres fonctions décrites – elles ne comportent aucune
contrainte liée par exemple à la gestion de séquences multiples séparées l’existence des blocs –. La
première permet à la réception d’un symbole (un acide aminé codé sur une lettre ou un gap) de
retourner sa fréquence correspondante : elle repose sur une structure de contrôle type swtich/case. La
seconde fonction permet à partir de la matrice d’alignement contenant les chemins, de récupérer le
chemin optimal en remontant toute la matrice de la case la plus basse à droite vers la case la plus haute
à gauche (‘ROOT’), en suivant chaque fois les informations de directions à chaque case. Une fois le
chemin récupéré, la fonction Backtracking() inverse la séquence (contenant les lettre i, s ou d) du
chemin obtenu, pour l’avoir dans l’ordre et renvoie ce chemin à la procédure appelante. La fonction
LengthSeqVSCutOff() permet quant à elle de vérifier si l’alignement des blocs sur la séquence
cible ne dépasse pas une longueur seuil, imposée par l’utilisateur en paramètre d’entrée. Son intérêt
sera justifié dans les sections à venir. L’astuce pour cette fonction est d’avoir utilisé la séquence du
chemin optimal, et compter le nombre de délétions présentes en début et fin de chemin pour
déterminer par opération de soustraction (entre la taille totale du chemin et le nombre de délétion), la
longueur totale nécessaire pour aligner les blocs sur la séquence cible.
ANNEXE 4
Annexe 4 Modeller : Stratégie adaptée aux blocs
« Changez vos stratégies et tactiques, mais jamais vos principes.»

John Kessel (1950 – 20XX ap JC)
343
344 Annexe 4. Modeller : Stratégie adaptée aux blocs
Le logiciel Modeller n’a pas une nomenclature difficile pour son exécution : il suffit de lancer le
programme avec le fichier de directive désiré. Ce fichier est donc très important et va être détaillé pour
deux cas de figure : i) la construction d’un modèle et ii) la reconstruction des boucles.
4.1 Construction d’un modèle sous Modeller

Quelque soit l’approche, Modeller prends toujours deux fichier en entrée standard pour construire
un modèle (en plus des fichiers PDB de chaque templates) : un fichier d’alignement dans un format
particulier, correspondant dans mon cas aux alignements de P450s – c’est l’alignement des templates
sur la séquence du P450 à reconstruire, issu de Caliseq après traitement – et un ficher de directive,
comprenant les commandes adéquate pour Modeller.
4.1.1 Fichier d’alignement (ali)
Le fichier d’alignement utilisé par Modeller s’apparente beaucoup au format fasta, c’est pourquoi
j’avais dès le départ opté pour travailler les alignements à ce format. Les principales particularités
correspondent aux entêtes, mais également à certains marqueurs qu’il ne faut pas oublier en fin de
séquence comme il a été à la section 2.2.1 des annexes. La Figure A 2-5 de la page 307 présente le
fichier d’alignement que j’ai donné à Modeller pour la reconstruction d’un CYP 2A1 à partir de
structure proche (environs 30% d’identité en séquence). Trois structures de référence ont été utilisées :
un CYP 2B4 (1suo), un CYP 2A13 (2p85) et un CYP 2D6 (2fq9). C’est un cas de figure assez simple
dans la mesure où les CYPs appartiennent tous à la famille des 2. Les séquences des trois structures de
références ont été préalablement alignées avec la séquence de la protéine cible à construire.
4.1.2 Fichier de directives (top)
Le fichier de directives est le fichier contenant toutes les commandes, les renseignements
nécessaire au bon fonctionnement Modeller. La possibilité en commandes est nombreuse. Le fichier se
comporte comme un script shell 25 avec son lot de variables et de fonctions. Il est à noter que le
« langage » de ce fichier change légèrement entre les différentes versions de Modeller. Ainsi, dans sa
dernière version, Modeller 9, l’interfaçage directive/exécution du logiciel fait intervenir un script
python à la place du shell, et le langage s’apparente plus à de l’objet (en terme de programmation).
L’exemple de la Figure A 4-1 est le fichier de directives pour le fichier d’alignement présenté
précédemment.
25
Il s’agit d’un langage de programmation et d’interfaçage avec la machine sous unix
Construction d’un modèle sous Modeller 345
INCLUDE # Include the predefined TOP routines

SET ALNFILE = 'CYP1A2.ali' # alignment filename
SET KNOWNS = '2p85' '1suo' '2f9q' # codes of the templates
SET SEQUENCE = 'CYP1A2' # code of the target
SET ATOM_FILES_DIRECTORY = './:../atom_files' # directories for input atom files
SET STARTING_MODEL= 1 # index of the first model
SET ENDING_MODEL = 100 # index of the last model
SET TOPOLOGY_MODEL = 1, HYDROGEN_IO = on, HETATM_IO = on, WATER_IO = on

SET TOPLIB = '$(LIB)/top.lib'
SET PARLIB = '$(LIB)/par.lib'
SET DEVIATION = 4.0 # have to be >0 if more than 1 model

SET RAND_SEED = -12312 # to have different models from another TOP file
SET FINAL_MALIGN3D = 1
SET MD_LEVEL = 'refine_3'
# SET OUTPUT_CONTROL = 1 1 1 1 1
SET REPEAT_OPTIMIZATION = 3
CALL ROUTINE = 'model' # do homology modelling
Figure A 4-1 Exemple de fichier de directives pour le fichier d’alignement présenté précédemment.
Le fichier de directives ressemble donc à un script shell où tous les commentaires sont protégés
par la balise « # », les variables sont définies par la commande « SET » et le lancement des différentes
fonctions se fait par la commande « CALL ROUTINE ». Bien entendu, il en existe bien d’autres, que
je serai amené à présenter plus tard. Ici, la première commande INCLUDE indique à Modeller de qu’il
doit récupérer toutes les fonctions et les variables prédéfinies et préformatées au programme (sinon, il
faudrait définir chaque variable utilisée). La variable ALNFILE va contenir le nom du fichier
d’alignement pour Modeller. KNOWNS est une variable qui répertorie les codes PDB des structures
de références utilisées (2p85, 1suo et 2f9q dans le cas présent). SEQUENCE est la variable qui
correspond au nom de la protéine à construire à partir de sa séquence. Elle permet également de
donner la racine des noms de fichiers qui sont générés. ATOM_FILES_DIRECTORY renseigne à
Modeller où sont situés les fichiers PDB des structures templates. STARTING_MODEL et
ENDING_MODEL correspondent au premier et au dernier modèle créés. La ligne avec
TOPOLOGY_MODEL permet de prendre en compte à la fois les atomes d’hydrogène, les
hétéroatomes et l’eau (qu’on peut mettre à off). DEVIATION et RAND_SEED permettent lors de
nombreuses constructions de modèle une certaines variabilités entre eux. FINAL_MALIGN3D permet
d’aligner structuralement le modèle résultant avec les templates, MD_LEVEL correspond au degré de
raffinement demandé (par défaut 1) pour les boucles par un recuit simulé (boucles qui sont soit
définies par l’utilisateur, soit automatiquement repéré par Modeller) et REPEAT_OPTIMIZATION
permet enfin de définir le nombre de cycle d’optimisation (par défaut 1). La commande
346 Annexe 4. Modeller : Stratégie adaptée aux blocs
CALL_ROUTINE se charge alors de lancer le programme. Il faut moins d’une heure pour construire
un seul modèle, ce qui est relativement rapide.
4.2 Reconstruction des boucles sous Modeller
Sous Modeller, il est possible de reconstruire les boucles durant le processus de construction du
modèle, vu précédemment. Il est également possible d’effectuer ce travail postérieurement à celui de
la reconstruction du modèle. Dans ce dernier cas, Modeller prends également deux fichiers d’entrée,
dont un seul à paramétrer, le second étant la structure au format PDB sur laquelle on effectue les
opérations. Le fichier de directive est construit de manière identique à celui présenté précédemment. À
la différence près que l’information sur le fichier d’alignement est remplacé par celui du fichier PDB à
utiliser (généralement, un modèle issu de Modeller). Ce fichier comporte un nombre important de
directives, mais les plus importantes sont celles permettant la délimitation des zones de boucles qui
sont présentés à la Figure A 4-2, toujours pour l’exemple du CYP 1A2.
SUBROUTINE ROUTINE = 'select_loop_atoms'

PICK_ATOMS SELECTION_SEGMENT = '73' '82' , SELECTION_STATUS = 'initialize'
PICK_ATOMS SELECTION_SEGMENT = '89' '95' , SELECTION_STATUS = 'add'
RETURN
END_SUBROUTINE
Figure A 4-2 Création d’une fonction permettant la déclaration des régions variables à Modeller. Les numéros
de résidu de début et de fin permettent de délimiter ces régions. Cas de la reconstruction d’un CYP 1A2 en
utilisant mon set de bloc général
Une fois les résidus délimitant les boucles renseignés, c’est au tour des résidus délimitant les
blocs : des contraintes spatiales de distances, d’angles et de torsions vont être appliquées afin de
perturber un minimum l’agencement spatial au niveau de ces régions. La déclaration de ces résidus est
montrée à la Figure A 4-3.
Reconstruction des boucles sous Modeller 347
SUBROUTINE ROUTINE = 'special_restraints'

SET ADD_RESTRAINTS = on
MAKE_RESTRAINTS RESTRAINT_TYPE = 'ALPHA', RESIDUE_IDS = '83' '88'
RETURN
END_SUBROUTINE
Figure A 4-3 Création d’une fonction permettant la déclaration les résidus entre lesquels des contraintes
spatiales vont être appliqués : de distance, d’angles de torsion, impropres et dièdres ϕ, ψ, et χ, etc… Cas de la
reconstruction d’un CYP 1A2 en utilisant mon set de bloc général
ANNEXE 5
Annexe 5 Des alignements en vrac…
« C’est parce qu’on imagine simultanément tous les pas qu’on devrait faire
qu’on se décourage, alors qu’il s’agit de les aligner un à un.»
Marcel Jouhandeau (1888 – 1979 ap JC)
349
350 Annexe 5. Des alignements en vrac…
Dans cette annexe, seront présentés quelques alignements représentatifs qui n’ont pu figurer dans
les résultats, par souci de place. Les régions conservées sont indiquées par des majuscules et les
régions variables par des minuscules.
1oxa 1 ------atVP dleSDSFHVD w--------Y STYAELRETA PVTPVRFLg- qDAWLVTGYD EAKAALSDlR LSSDPkKKyp gvevEFPAYL GFPEDVRNyf 85
1gwi 1 ------arIP ---LDPFVTD l--------D GESARLRAAG PLAAVELPgg vPVWAVTHHA EAKALLTDpR LVKDInVWga wrrgEIPADW PLIGLAN--p 81
1rom 1 -------aPS fpfSRASGPE p--------P AEFAKLRATN PVSQVKLFdg sLAWLVTKHK DVCFVATSeK LSKVR-TR-- ----QGFPEL SASGKQAAka 78
1cpt 1 --mdaratIP ehiARTVILP qgyaddeviY PAFKWLRDEQ PLAMAHIEgy dPMWIATKHA DVMQIGKQpG LFSNAeGSei lydqNNEAFM RSISGGCPhv 98
3cpp 1 ----nlapLP phvPEHLVFD fd------mY NPSNLSAGVQ EAWAVLQEsn vPDLVWTRCN GGHWIATRgQ LIREAyEDyr hfssECPFIP REAGEAYDfi 90
1e9x 1 -----msaVA lprVSGGHDE hg------hL EEFRTDPIGL MQRVRDECg- -DVGTFQLAG KQVVLLSG-S HANEFfFRag dddlDQAKAY PFMTPIFG-- 84
2hpd 1 ----tikeMP qpkTFGELKN lp-------- LLNTDKPVQA LMKIADELg- -EIFKFEAPG RVTRYLSSqR LIKEAcDE-s rfdkNLSQAL KFVRDFAG-d 84
1og5 1 --------PP gptPLPVIGN i--------L QIGIKDISKS LTNLSKVYg- -PVFTLYFGL KPIVVLHGyE AVKEAlID-l geefSGRGIF PLAERANRgf 81
1pq2 1 ------klPP gptPLPIIGN m--------L QIDVKDICKS FTNFSKVYg- -PVFTVYFGM NPIVVFHGyE AVKEAlID-n geefSGRGNS PISQRITKgl 83
1nr6 1 -----gklPP gptPFPIIGN i--------L QIDAKDISKS LTKFSECYg- -PVFTVYLGM KPTVVLHGyE AVKEAlVD-l geefAGRGSV PILEKVSKgl 84
1dt6 1 --------PP gptPFPIIGN i--------L QIDAKDISKS LTKFSECYg- -PVFTVYLGM KPTVVLHGyE AVKEAlVD-l geefAGRGSV PILEKVSKgl 81
CYP3A4 1 hglfkklgIP gptPLPFLGN ---------I LSYHKGFCMF DMECHKKYg- -KVWGFYDGQ QPVLAITDpD MIKTVlVKec ysvfTNRRPF GPVGFMKS-- 87
1oxa 86 atnmGTSDPP THTRLRKLVS QEFTVRRVEA MRPRVEQITA ELLDEV---- ------gDSG VVDIVDRFAH PLPIKVICEL LG------vd eAARGAFGRW 169
1gwi 82 grsmLTVDGA EHRRLRTLVA QALTVRRVEH MRGRITELTD RLLDELp--- ------aDGG VVDLKAAFAY PLPMYVVADL MG------ie eARLPRLKVL 166
1rom 79 kptfVDMDPP EHMHQRSMVE PTFTPEAVKN LQPYIQRTVD DLLEQMkqk- -----gcANG PVDLVKEFAL PVPSYIIYTL LG-------- -VPFNDLEYL 163
1cpt 99 idslTSMDPP THTAYRGLTL NWFQPASIRK LEENIRRIAQ ASVQRLl--- ------dFDG ECDFMTDCAL YYPLHVVMTA LG------vp eDDEPLMLKL 183
3cpp 91 p---TSMDPP EQRQFRALAN QVVGMPVVDK LENRIQELAC SLIESLr--- -------PQG QCNFTEDYAE PFPIRIFMLL AG------lp eEDIPHLKYL 171
1e9x 84 --egVVFDAS PERRKEMLHN AALRGEQMKG HAATIEDQVR RMIADWg--- -------EAG EIDLLDFFAE LTIYTSSACL IGkkfrdqld gRFAKLYHEL 172
2hpd 85 glftSWTHEK NWKKAHNILL PSFSQQAMKG YHAMMVDIAV QLVQKWerln adehievPED MTRLTLDTIG LCGFNYRFNS FYrdqphpfi tSMVRALDEA 184
1og5 82 givfSNGKKW KEIRRFSLMT LRNFGMGKRS IEDRVQEEAR CLVEELr--- ------kTKA SPCDPTFILG CAPCNVICSI IFhkrfdykd qQFLNLMEKL 172
1pq2 84 giisSNGKRW KEIRRFSLTT LRNFGMGKRS IEDRVQEEAH CLVEELr--- ------kTKA SPCDPTFILG CAPCNVICSV VFqkrfdykd qNFLTLMKRF 174
1nr6 85 giafSNAKTW KEMRRFSLMT LRNFGMGKRS IEDRIQEEAR CLVEELr--- ------kTNA SPCDPTFILG CAPCNVICSV IFhnrfdykd eEFLKLMESL 175
1dt6 82 giafSNAKTW KEMRRFSLMT LRNFGMGKRS IEDRIQEEAR CLVEELr--- ------kTNA SPCDPTFILG CAPCNVICSV IFhnrfdykd eEFLKLMESL 172
CYP3A4 88 a--iSIAEDE EWKRLRSLLS PTFTSGKLKE MVPIIAQYGD VLVRNLr-r- -----eaETG KPVTLKDVFG AYSMDVITST SFgvnidsln -NPQDPFVEN 177
1oxa 170 SSEILVMDPE r--------- --------ae qRGQAAREVV NFILDLVERR R-------TE PGDDLLSALI SVQDDDDg-- --RLSADELT SIALVLLLAG 241
1gwi 167 FEKFFSTQTP ---------- --------pe eVVATLTELA SIMTDTVAAK R-------AA PGDDLTSALI QASENGD--- --HLTDAEIV STLQLMVAAG 236
1rom 164 TQQNAIRTNG s--------- ------star eASAANQELL DYLAILVEQR L-------VE PKDDIISKLC TEQVKPG--- --NIDKSDAV QIAFLLLVAG 236
1cpt 184 TQDFFGVEAA r--------- --------r- -FHETIATFY DYFNGFTVDR R-------SC PKDDVMSLLA NSKLDGN--- --YIDDKYIN AYYVAIATAG 252
3cpp 172 TDQMTRPDGS ---------- ---------m tFAEAKEALY DYLIPIIEQR R-------QK PGTDAISIVA NGQVNGR--- --PITSDEAK RMCGLLLVGG 240
1e9x 173 ERGTDPLAYV dp-------- --ylpiesfr rRDEARNGLV ALVADIMNGR Ian--pptDK SDRDMLDVLI AVKAETG--- tpRFSADEIT GMFISMMFAG 257
2hpd 185 MNKLQRANPD dp-------- --ayd-enkr qFQEDIKVMN DLVDKIIADR Kas-----GE QSDDLLTHML NGKDPETg-- -ePLDDENIR YQIITFLIAG 265
1og5 173 NENIEILSSP wiqvynnfpa lldyfpgthn kLLKNVAFMK SYILEKVKEH Qes--mdmNN PQDFIDCFLM KMEKEKHnq- psEFTIESLE NTAVDLFGAG 269
1pq2 175 NENFRILNSP wiqvcnnfpl lidcfpgthn kVLKNVALTR SYIREKVKEH Qas--ldvNN PRDFIDCFLI KMEQEKDnq- ksEFNIENLV GTVADLFVAG 271
1nr6 176 HENVELLGTP wlqvynnfpa lldyfpgihk tLLKNADYIK NFIMEKVKEH Qkl--ldvNN PRDFIDCFLI KMEQENN--- -lEFTLESLV IAVSDLFGAG 269
1dt6 173 HENVELLGTP ---------- -ldyfpgihk tLLKNADYIK NFIMEKVKEH Qkl--ldvNN PRDFIDCFLI KMEQENN--- -lEFTLESLV IAVSDLFGAG 255
CYP3A4 178 TKKLLRFDFL dpfflsitvf pflipilevl nICVFPREVT NFLRKSVKRM KesrledtQK HRVDFLQLMI DSQNSKEtes hkALSDLELV AQSIIFIFAG 277
1oxa 242 FEASVSLIGI GTYLLLTHPD QLALVRADPS ALP------- ---------- -NAVEEILRY IAPP-eTTTR FAAEEVEIGG VA-IPQYSTV LVANGAANRD 321
1gwi 237 HETTISLIVN AVVNLSTHPE QRALVLSGEA EWS------- ---------- -AVVEETLRF STPTshVLIR FAAEDVPVGD RV-IPAGDAL IVSYGALGRD 317
1rom 237 NATMVNMIAL GVATLAQHPD QLAQLKANPS LAP------- ---------- -QFVEELCRY HTASalAIKR TAKEDVMIGD KL-VRANEGI IASNQSANRD 317
1cpt 253 HDTTSSSSGG AIIGLSRNPE QLALAKSDPA LIP------- ---------- -RLVDEAVRW TAPV-kSFMR TALADTEVRG QN-IKRGDRI MLSYPSANRD 332
3cpp 241 LDTVVNFLSF SMEFLAKSPE HRQELIERPE RIP------- ---------- -AACEELLRR FSLV--ADGR ILTSDYEFHG VQ-LKKGDQI LLPQMLSGLD 319
1e9x 258 HHTSSGTASW TLIELMRHRD AYAAVIDELD ELYgdgrsvs fhalrqipql eNVLKETLRL HPPL-iILMR VAKGEFEVQG HR-IHEGDLV AASPAISNRI 355
2hpd 266 HETTSGLLSF ALYFLVKNPH VLQKAAEEAA RVLvdp-vps ykqvkqlkyv gMVLNEALRL WPTAp-AFSL YAKEDTVLGG EYpLEKGDEL MVLIPQLHRD 363
1og5 270 TETTSTTLRY ALLLLLKHPE VTAKVQEEIE RVIgrnrspc mqdrshmpyt dAVVHEVQRY IDLLptSLPH AVTCDIKFRN YL-IPKGTTI LISLTSVLHD 368
1pq2 272 TETTSTTLRY GLLLLLKHPE VTAKVQEEID HVIgrhrspc mqdrshmpyt dAVVHEIQRY SDLVptGVPH AVTTDTKFRN YL-IPKGTTI MALLTSVLHD 370
1nr6 270 TETTSTTLRY SLLLLLKHPE VAARVQEEIE RVIgrhrspc mqdrsrmpyt dAVIHEIQRF IDLLptNLPH AVTRDVRFRN YF-IPKGTDI ITSLTSVLHD 368
1dt6 256 TETTSTTLRY SLLLLLKHPE VAARVQEEIE RVIgrhrspc mqdrsrmpyt dAVIHEIQRF IDLLptNLPH AVTRDVRFRN YF-IPKGTDI ITSLTSVLHD 354
CYP3A4 278 YETTSSVLSF IMYELATHPD VQQKLQEEID AVLpnkappt ydtvlqmeyl dMVVNETLRL FPIA-mRLER VCKKDVEING MF-IPKGWVV MIPSYALHRD 375
1oxa 322 P-SQFPDPHR FDVTRDTRG- ---------H LSFGQGIHFC MGRPLAKLEG EVALRALFGR FPALSLGIDA DdvvWRRSLL LRGIDHLPVR Ldg------- 403
1gwi 318 ErAHGPTADR FDLTRTSGNr ---------H ISFGHGPHVC PGAALSRMEA GVALPALYAR FPHLDLAVPA AelrNKPVVT QNDLFELPVR Lahh------ 402
1rom 318 E-EVFENPDE FNMNRKWPPq d--------P LGFGFGDHRC IAEHLAKAEL TTVFSTLYQK FPDLKVAVPL GkinYTPLNR DVGIVDLPVI F--------- 399
1cpt 333 E-EVFSNPDE FDITRFPNR- ---------H LGFGWGAHMC LGQHLAKLEM KIFFEELLPK LKSVELSGPP R---LVATNF VGGPKNVPIR Ftka------ 412
3cpp 320 E-RENACPMH VDFSRQKVS- ---------H TTFGHGSHLC LGQHLARREI IVTLKEWLTR IPDFSIAPGA Q--iQHKSGI VSGVQALPLV Wdpattkav- 405
1e9x 356 P-EDFPDPHD FVPARYEQPr qedllnrwtW IPFGAGRHRC VGAAFAIMQI KAIFSVLLRE YEFEMAQPPE SyrnDHSKMV VQLAQPACVR Yrrrt----- 449
2hpd 364 KtIWGDDVEE FRPERFENPs ---aipqhaF KPFGNGQRAC IGQQFALHEA TLVLGMMLKH FDFEDHTNYE LdikETLTLK PEGFVVKAKS Kkiplgg--- 457
1og5 369 N-KEFPNPEM FDPHHFLDEg g-nfkkskyF MPFSAGKRIC VGEALAGMEL FLFLTSILQN FNLKSLVDPK N---LDTTPV VNGFASVPPF Yqlcfipv-- 461
1pq2 371 D-KEFPNPNI FDPGHFLDKn g-nfkksdyF MPFSAGKRIC AGEGLARMEL FLFLTTILQN FNLKSVDDLK N---LNTTAV TKGIVSLPPS Yqicfipv-- 463
1nr6 369 E-KAFPNPKV FDPGHFLDEs g-nfkksdyF MPFSAGKRMC VGEGLARMEL FLFLTSILQN FKLQSLVEPK D---LDITAV VNGFVSVPPS Yqlcfipih- 462
1dt6 355 E-KAFPNPKV FDPGHFLDEs g-nfkksdyF MPFSAGKRMC VGEGLARMEL FLFLTSILQN FKLQSLVEPK D---LDITAV VNGFVSVPPS Yqlcfipihh 449
CYP3A4 376 P-KYWTEPEK FLPERFSKKn k-dnidpyiY TPFGSGPRNC IGMRFALMNM KLALIRVLQN FSFKPCKETQ IplkLSLGGL LQPEKPVVLK Vesrdgtvsg 473
1oxa 403 - 403

1gwi 402 - 402
1rom 399 - 399
1cpt 412 - 412
3cpp 405 - 405
1e9x 449 - 449
2hpd 457 - 457
1og5 461 - 461
1pq2 463 - 463
1nr6 462 - 462
1dt6 449 - 449
CYP3A4 474 a 474
Figure A 5-1 Exemple de l’alignement Clustalw avec le jeu de templates D. Les paramètres par défaut ont été
utilisés. Les régions conservées dans la séquence (indiquées en majuscule) coïncident à peu près avec le
positionnement des blocs par Caliseq.
351
1oxa 1 ---------- --ATVPdle- -SDSFHVDWY STYAELRETA PVTPVRFLG- QDAWLVTGYD EAKAALSDLR LSSDPKKKYP GVEVEF-PAY LGFPEDVRny 84
2hpd 1 ----tikemp qpKTFGelkn lPLLNTDKPV QALMKIADEL GEIFKFEAPg RVTRYLSSQR LIKEACDESR FDKNLSQALK FVRDFAgDGL FTSWTHEKnw 96
1gwi 1 ---------- --ARIP---- -LDPFVTDLD GESARLRAAG PLAAVELPGg VPVWAVTHHA EAKALLTDPR LVKDINVWGA WRRGEI-PAD WPLIGLAN-- 80
1og5 1 --------pp gpTPLPvign iLQIGIKDIS KSLTNLSKVY GPVFTLYFGl KPIVVLHGYE AVKEALIDLG EEFSGRGIFP LAERAN-RGF GIVFSNGKkw 91
1pq2 1 ------klpp gpTPLPiign mLQIDVKDIC KSFTNFSKVY GPVFTVYFGm NPIVVFHGYE AVKEALIDNG EEFSGRGNSP ISQRIT-KGL GIISSNGKrw 93
1nr6 1 -----gklpp gpTPFPiign iLQIDAKDIS KSLTKFSECY GPVFTVYLGm KPTVVLHGYE AVKEALVDLG EEFAGRGSVP ILEKVS-KGL GIAFSNAKtw 94
CYP3A4 1 hglfkklgip gpTPLPflgn -ILSYHKGFC MFDMECHKKY GKVWGFYDGq QPVLAITDPD MIKTVLVKEC YSVFTNRRPF GPVGFM-KSA ISIAEDEE-w 97
1oxa 84 -----fATNM GTSDPPTHTR LRKLVSQEFT VRRVEAMRPR VE--QITAEL LDEV---GDS GVVDIVDRFA HP-----LPI KVICELLGVD EAARGAFGRW 169
2hpd 97 kkah--NILL PSFSQQAMKG YHAMMVDIAV QLVQKWERLN ADehIEVPED MTRLt-lDTI GLCGFNYRFN SFyrd--QPH PFITSMVRAL DEAMNKLQRA 191
1gwi 80 -----pGRSM LTVDGAEHRR LRTLVAQALT VRRVEHMRGR IT--ELTDRL LDELp--ADG GVVDLKAAFA YP-----LPM YVVADLMGIE EARLPRLKVL 166
1og5 92 keirrfSLMT LRNFGMGKRS IEDRVQEEAR CLVEELRKTK AS--PCDPTF ILGCapcNVI CSIIFHKRFD YKdqqflNLM EKLNENIEIL SSPWIQVYNN 189
1pq2 94 keirrfSLTT LRNFGMGKRS IEDRVQEEAH CLVEELRKTK AS--PCDPTF ILGCapcNVI CSVVFQKRFD YKdqnflTLM KRFNENFRIL NSPWIQVCNN 191
1nr6 95 kemrrfSLMT LRNFGMGKRS IEDRIQEEAR CLVEELRKTN AS--PCDPTF ILGCapcNVI CSVIFHNRFD YKdeeflKLM ESLHENVELL GTPWLQVYNN 192
CYP3A4 98 krlr--SLLS PTFTSGKLKE MVPIIAQYGD VLVRNLRREA ETgkPVTLKD VFGAysmDVI TSTSFGVNID SLnnpqdPFV ENTKKLLRFD FLDPFFLSIT 195
1oxa 170 SSEILVMDPE rAEQRGQAAR EVVNFILDLV ERRR-----T EPGDDLLSAL ISVQDDDDg- -----RLSAD ELTSIALVLL LAGFEASVSL IGIGTYLLLT 258
2hpd 192 NPDDPAYDEN -KRQFQEDIK VMNDLVDKII ADRKas---G EQSDDLLTHM LNGKDPETg- ----ePLDDE NIRYQIITFL IAGHETTSGL LSFALYFLVK 282
1gwi 167 FEKFFSTQTP -PEEVVATLT ELASIMTDTV AAKR-----A APGDDLTSAL IQASENGD-- -----HLTDA EIVSTLQLMV AAGHETTISL IVNAVVNLST 253
1og5 190 FPALLDYFPG tHNKLLKNVA FMKSYILEKV KEHQesmdmN NPQDFIDCFL MKMEKEKHn- --qpsEFTIE SLENTAVDLF GAGTETTSTT LRYALLLLLK 286
1pq2 192 FPLLIDCFPG tHNKVLKNVA LTRSYIREKV KEHQasldvN NPRDFIDCFL IKMEQEKDn- --qksEFNIE NLVGTVADLF VAGTETTSTT LRYGLLLLLK 288
1nr6 193 FPALLDYFPG iHKTLLKNAD YIKNFIMEKV KEHQklldvN NPRDFIDCFL IKMEQENN-- ----lEFTLE SLVIAVSDLF GAGTETTSTT LRYSLLLLLK 286
CYP3A4 196 VFPFLIPILE vLN-ICVFPR EVTNFLRKSV KRMKesrleD TQKHRVDFLQ LMIDSQNSke teshkALSDL ELVAQSIIFI FAGYETTSSV LSFIMYELAT 294
1oxa 259 HPDQLALVRA DPSALP---- ---------- ----NAVEEI LRYIAPP-ET TTRFAAEEVE IGGVAIPQYS TVLVANGAAN RDP-SQFPDP HRFDVTRDTR 338
2hpd 283 NPHVLQKAAE EAARVLvdp- vpsykqvkql kyvgMVLNEA LRLWPTAPAF SLYAKEDTVL GGEYPLEKGD ELMVLIPQLH RDKtIWGDDV EEFRPERFEN 381
1gwi 254 HPEQRALVLS GEAEWS---- ---------- ----AVVEET LRFSTPTSHV LIRFAAEDVP VGDRVIPAGD ALIVSYGALG RDErAHGPTA DRFDLTRTSG 335
1og5 287 HPEVTAKVQE EIERVIgrnr spcmqdrshm pytdAVVHEV QRYIDLLPTS LPHAVTCDIK FRNYLIPKGT TILISLTSVL HDN-KEFPNP EMFDPHHFLD 385
1pq2 289 HPEVTAKVQE EIDHVIgrhr spcmqdrshm pytdAVVHEI QRYSDLVPTG VPHAVTTDTK FRNYLIPKGT TIMALLTSVL HDD-KEFPNP NIFDPGHFLD 387
1nr6 287 HPEVAARVQE EIERVIgrhr spcmqdrsrm pytdAVIHEI QRFIDLLPTN LPHAVTRDVR FRNYFIPKGT DIITSLTSVL HDE-KAFPNP KVFDPGHFLD 385
CYP3A4 295 HPDVQQKLQE EIDAVLpnka pptydtvlqm eyldMVVNET LRLFPIA-MR LERVCKKDVE INGMFIPKGW VVMIPSYALH RDP-KYWTEP EKFLPERFSK 392
1oxa 339 G--------- HLSFGQGIHF CMGRPLAKLE GEVALRALFG RFPALSLGID ADdvvWRRSL LLRGIDHLPV RLDG------ -- 403
2hpd 382 Ps--aipqha FKPFGNGQRA CIGQQFALHE ATLVLGMMLK HFDFEDHTNY ELdikETLTL KPEGFVVKAK SKKIplgg-- -- 457
1gwi 336 Nr-------- HISFGHGPHV CPGAALSRME AGVALPALYA RFPHLDLAVP AAelrNKPVV TQNDLFELPV RLAHh----- -- 402
1og5 386 Eggnfkksky FMPFSAGKRI CVGEALAGME LFLFLTSILQ NFNLKSLVDP KN---LDTTP VVNGFASVPP FYQLcfipv- -- 461
1pq2 388 Kngnfkksdy FMPFSAGKRI CAGEGLARME LFLFLTTILQ NFNLKSVDDL KN---LNTTA VTKGIVSLPP SYQIcfipv- -- 463
1nr6 386 Esgnfkksdy FMPFSAGKRM CVGEGLARME LFLFLTSILQ NFKLQSLVEP KD---LDITA VVNGFVSVPP SYQLcfipih -- 462
CYP3A4 393 Knkdnidpyi YTPFGSGPRN CIGMRFALMN MKLALIRVLQ NFSFKPCKET QIplkLSLGG LLQPEKPVVL KVESrdgtvs ga 474
Figure A 5-2 Exemple d’alignement par Clustalw avec le jeu C. Comme constaté sur l’alignement, Clustalw
semble favoriser les mésappariements à l’insertion de Gap : les régions conservées sont longues.
1z8o 1 ---------- ---------- ---------- ---------- -tvpdle-sd s----f-hv- DWYRTYAELR E-TAPVTPVR f-LGQDAWLV TGYDEAKAAL 50
1gwi 1 ---------- ---------- ---------- ---------a ripldpf--- -------vt- DLDGESARLR A-AGPLAAVE lpGGVPVWAV THHAEAKALL 49
2ij2 1 ---------- ---------- ---------- -----kempq pktfgelknl pl---l-ntd KPVQALMKIA DeLGEIFKFE a-PGRVTRYL SSQRLIKEAC 60
1r9o 1 ---------- ---------- ---------- ---rgklppg ptpl------ --plqigik- DISKSLTNLS KvYGPVFTLY f-GLKPIVVL HGYEAVKEAL 57
CYP 3A4 1 malipdlame twlllavslv llylygthsh glfkklgipg ptplpflgni ls---y-hk- GFCMFDMECH KkYGKVWGFY d-GQQPVLAI TDPDMIKTVL 94
1z8o 51 sdlrlssdpk kkyp--gvev efpaylgfpe d---vr--NY FATNMGTSd- p-PTHTRLRK LVSQEFTV-- ----rrveAM RPRVEQITAE LLDEVg---- 131
1gwi 50 tdprlvkdin vw-g--awrr geipadwp-l i---gl--AN PGRSMLTVd- g-AEHRRLRT LVAQALTV-- ----rrveHM RGRITELTDR LLDELpa--- 129
2ij2 60 -de--srfd- kn-lsqa--- ---------l k---f-vrDF AGDGLFTSwt heKNWKKAHN ILLPSFSQ-- ----qamkGY HAMMVDIAVQ LVQKWerl-- 131
1r9o 58 idlgeef-s- gr-g--i--- ---------f plae-r--AN RGFGIVFSn- g-KKWKEIRR FSLMTLRNfg mgkr----SI EDRVQEEARC LVEELrktk- 130
CYP 3A4 95 vkecysvft- nr-r--p--- ---------f g---pv--GF MKSAISIAe- d-EEWKRLRS LLSPTFTS-- ----gklkEM VPIIAQYGDV LVRNLrreae 165
1z8o 132 ds-GVVD-IV DRFAHPLPIK VICELLGVDE K----yr-GE FGRWSSeilv m--------- -------d-- ---------p e-raeqrgqa AREVVNFILD 196
1gwi 130 dg-GVVD-LK AAFAYPLPMY VVADLMGIEE A----rl-PR LKVLFEkffs t--------- -------q-- ---------- -tppeevvat LTELASIMTD 193
2ij2 132 nadEHIE-VP EDMTRLTLDT IGLCGFNYRF NsfyrdqpHP FITSMV---- ---------r aldeamnkln pddpaydenk rq-------- FQEDIKVMND 209
1r9o 130 -a-SPCD-PT FILGCAPCNV ICSIIFHKRF Dykdqqf-LN LMEKLNenik ilsspwipii --dyfpg--- ---------- --thnkllkn VAFMKSYILE 209
CYP 3A4 166 tg-KPVT-LK DVFGAYSMDV ITSTSFGVNI Dslnnpq-DP FVENTKkllr fdfld----p fflsitvfp- ------flip ilevlnicvf PREVTNFLRK 251
1z8o 197 LVERRRTE-- --p---GDDL LSALIRV-q- --DDDdgrls adeltsi--- -------ALV LLLAGFEASV SLIGIGTYLL LTHPDQLALV RRDP------ 269
1gwi 194 TVAAKRAA-- --p---GDDL TSALIQA-s- --ENG-dhlt daeivst--- -------LQL MVAAGHETTI SLIVNAVVNL STHPEQRALV LSGE------ 265
2ij2 210 LVDKIIADrk asg-eqSDDL LTHMLNGk-- -dPETge--- -------pld deniryqIIT FLIAGHETTS GLLSFALYFL VKNPHVLQKA AEEAarvlv- 294
1r9o 210 KVKEHQESmd mn---nPQDF IDCFLMKmek ekHNQps--- -------eft ieslentAVD LFGAGTETTS TTLRYALLLL LKHPEVTAKV QEEIervigr 296
CYP 3A4 252 SVKRMKESrl edtqkhRVDF LQLMIDSqns keTEShk--- -------als dlelvaqSII FIFAGYETTS SVLSFIMYEL ATHPDVQQKL QEEIdavlpn 341
1z8o 269 ---------- ---SALPNAV EEILRYIAPP ETTTR-FAAE EVEIGG-VAI PQYSTVLVAN GAANRDPKQF P-DPHRFDVT RDTr------ ---GHLSFGQ 344
1gwi 265 ---------- ---AEWSAVV EETLRFSTPT SHVLIRFAAE DVPVGD-RVI PAGDALIVSY GALGRDERAH GPTADRFDLT RTSg------ --nRHISFGH 343
2ij2 294 -dpvpsykqv kqlKYVGMVL NEALRLWPTA PA-FSLYAKE DTVLGGEYPL EKGDELMVLI PQLHRDKTIW GDDVEEFRPE RFE--npsai pqhAFKPFGN 390
1r9o 297 n-rspcmqdr shmPYTDAVV HEVQRYIDLL PTSLPHAVTC DIKFRN-YLI PKGTTILISL TSVLHDNKEF P-NPEMFDPH HFLdeggnfk kskYFMPFSA 393
CYP 3A4 342 k-apptydtv lqmEYLDMVV NETLRLFPIA MR-LERVCKK DVEING-MFI PKGWVVMIPS YALHRDPKYW T-EPEKFLPE RFSkknkdni dpyIYTPFGS 437
1z8o 345 GIHFCMGRPL AKLEGEVALR ALFGRFPALS LGIda---dD VVWRR-SLLL RGIDhLPVRL Dg-------- 402
1gwi 344 GPHVCPGAAL SRMEAGVALP ALYARFPHLD LAVpa---aE LRNKP-VVTQ NDLFeLPVRL Ahhh------ 403
2ij2 391 GQRACIGQQF ALHEATLVLG MMLKHF-DFE DHT----nyE LDIKE-TLTL KPEG-FVVKA Kskk--ipl- 450
1r9o 394 GKRICVGEAL AGMELFLFLT SILQNF-NLK SLVdpkn-lD TTPVVnGFAS VPPF-YQLCF Ipihh----- 455
CYP 3A4 438 GPRNCIGMRF ALMNMKLALI RVLQNF-SFK PCKet-q-iP LKLSL-GGLL QPEKpVVLKV Esrdgtvsga 503
Figure A 5-3 Exemple d’alignement par HHpred avec le jeu F. Les gaps sont plus nombreux et les régions
conservées moins longues.
1z8o 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ----tvp--d le------sd s----f--hv -d---WYRTY AELRE-t-AP VTPVRF--lg 34
1gwi 1 ---------- ---------- ---------- ---------- --aripl--d pf-------- --------vt -d---LDGES ARLRA-a-GP LAAVELp-gg 33
1n97 1 ---------- ---------- ---------- ---------- -mkrlsl--r -eaw-p--yl kdl--q--q- -d---PLAVL LAWGRah--P RLFLPL--pr 40
1cpt 1 ---------- ---------- ---------- -----mda-r atipe-h--- --iartvilp qg---y--a- -ddevIYPAF KWLRDeq--P LAMAHIegy- 48
1izo 1 ---------- ---------- ---------- ---------- phdks----- l----d--ns lt---l--lk -e---GYLFI KNRTErynSD LFQARL--lg 38
2cib 1 ---------- ---------- ---------- -------a-l prvsgghde- -h---g--hl ee---f--rt -d---PIGLM QRVRDel-GD VGTFQL--ag 43
1odo 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---alvl--d pt-------- --------ga -d---HHTEH RTLRE-g-GP ATWVDV--lg 31
2ij2 1 ---------- ---------- ---------- -------k-e mpqpktf--g el---k--nl pl---l--nt dk---PVQAL MKIADel-GE IFKFEA--pg 44
1po5 1 ---------- ---------- ---------- ----g--k-l ppgpsplpv- -l---g--nl lq---mdr-k -g---LLRSF LRLREky-GD VFTVYL--gs 45
1r9o 1 ---------- ---------- ---------- ---rg--k-l ppgptpl--- ---------- --plqig-ik -d---ISKSL TNLSKvy-GP VFTLYF--gl 41
CYP 3A4 1 malipdlame twlllavslv llylygthsh glfkk--l-g ipgptpl--p fl---g--ni ls---y--hk -g---FCMFD MECHKky-GK VWGFYD--gq 78
1z8o 35 QDAWLVTGYD EAKAALsdlr lssdpkkky- p--------- gvevefpayl gfped---vr --ny------ f-atnmgtsd -p-PTHTRLR Klvsqe---- 106
1gwi 34 VPVWAVTHHA EAKALLtdpr lvkdinvw-- g--------- awrrgeipad wp-li---gl --an------ p-grsmltvd -g-AEHRRLR Tlvaqa---- 103
1n97 41 FPLALIFDPE GVEGAL-lae -gt-t-ka-- tf-------- q--------- ---yr---a- lsrl------ t-grglltdw -g-ESWKEAR Kalkdp---- 97
1cpt 49 DPMWIATKHA DVMQIG-kqp -glfs-na-- egseilydqn n--------- ---ea---f- mrsisggcph v-idsltsmd -p-PTHTAYR Gltlnw---- 120
1izo 39 KNFICMTGAE AAKVFYd--t drf-q--rqn a--------- l--------- ---pkrv-qk --sl------ fgvnaiqgmd -g-SAHIHRK Mlflsl---- 97
2cib 44 KQVVLLSGSH ANEFFFra-g dddl--dq-- a--------- k--------- ---a------ ---------- ---------- --yPFMTPIF G--------- 80
1odo 32 VQAWSVSDPV LLKQLLtssd vskdarahw- p--------- afgevvgtwp ---la---lw --va------ --venmftay -g-PNHRKLR Rlvapa---- 99
2ij2 45 RVTRYLSSQR LIKEAC-de- -srfd-kn-- lsq------- a--------- ---lk---f- vrdf------ a-gdglftsw theKNWKKAH Nillps---- 104
1po5 46 RPVVVLCGTD AIREALvdqa eafsgrgk-- i--------- a--------- ---vv---dp --if------ q-gygvifan -g-ERWRALR RfslatmrdF 108
1r9o 42 KPIVVLHGYE AVKEALidlg eef-s-gr-- g--------- i--------- ---fplae-r --an------ r-gfgivfsn -g-KKWKEIR Rfslmt---- 100
CYP 3A4 79 QPVLAITDPD MIKTVLvkec ysvft-nr-- r--------- p--------- ---fg---pv --gf------ m-ksaisiae -d-EEWKRLR Sllspt---- 136
1z8o 106 -ftv------ rrveAMRPRV EQITAELLDE Vg-----ds- GVVD-IVDRF AHPLPIKVIC ELLgvde-k- ------yr-g -ef------g r-wsseilvm 175
1gwi 103 -ltv------ rrveHMRGRI TELTDRLLDE Lpa----dg- GVVD-LKAAF AYPLPMYVVA DLMgiee-a- ------rl-p -rl------k v-lfekffst 173
1n97 97 -flp------ knvrGYREAM EEEARAFFGE Wr------g- EERD-LDHEM LALSLRLLGR ALFgkpl--- -----s---p -sl------a e-hal----- 158
1cpt 120 -fqp------ asirKLEENI RRIAQASVQR Lldf----d- GECDfMTDCA LYYPLHVVMT ALG-v-ped- -----de--p -lm------l k-ltq----- 185
1izo 97 -mtp------ ---pHQKRLA ELMTEEWKAA Vtrwe--ka- DEVV-LFEEA KEILCRVACY WAG-v----- -plketev-k -er------a d-dfidmvda 167
2cib 80 -lrg------ eqmkGHAATI EDQVRRMIAD Wg--e-a--- GEID-LLDFF AELTIYTSSA CLIgkk---- ---------- ---frdqldg r-faklyhel 148
1odo 99 -fsa------ rrvdAMRPAV EAMVTGLVDR Laelp--ag- EPVD-LRQEL AYPLPIAVIG HLMgvpq-d- ------rr-d -gf------r a-lvdgvfdt 171
2ij2 104 -fsq------ qamkGYHAMM VDIAVQLVQK Werl---nad EHIE-VPEDM TRLTLDTIGL CGFnyrf-ns f---yrdqph -pf------i t-smv----- 176
1po5 109 g--------- mgkrSVEERI QEEARCLVEE Lrksk-g--- ALLD-NTLLF HSITSNIICS IVFgk----- ---------- ---rfdyk-d p-vflrlldl 174
1r9o 100 -lrnfgmgkr ----SIEDRV QEEARCLVEE Lrktk---a- SPCD-PTFIL GCAPCNVICS IIFhkrf-dy k---dqqf-l -nl------m e-klneniki 177
CYP 3A4 136 -fts------ gklkEMVPII AQYGDVLVRN Lrrea-etg- KPVT-LKDVF GAYSMDVITS TSFgvni-ds l---nnpq-d -pf------v e-ntkkllrf 213
1z8o 175 ---------- -------d-- ---------- ----p----e -rae----qr gqaAREVVNF ILDLVErr-- rte------- -p-----gdd lLSALIRV-q 217
1gwi 173 ---------- -------q-- ---------- ---------- tppe----ev vatLTELASI MTDTVAak-- raa------- -p-----gdd lTSALIQA-s 214
1n97 158 ---------k aldrimaq-t rsplalldl- --aae----a r--------- ---FRKDRGA LYREAEal-- iv-------- ---------- -HPPLSHL-- 206
1cpt 185 ---------d f--------- ---------f gveaa----r r--------- ---FHETIAT FYDYFNgf-- tvd--rr-s- cp-----kdd vMSLLANSkl 231
1izo 168 fg-av----- g--------- ---------- ---------- prhw----kg rraRPRAEEW IEVMIEda-- ragllkt-t- -------sgt aLHEMAFH-- 215
2cib 149 er-gt----d ---------p --------l- --ayvdp--- ----ylpies frrRDEARNG LVALVA--di mng--rianp ------dr-d mLDVLIAVk- 204
1odo 171 ---------- -------t-- ---------- ---------- ldqa----ea qanTARLYEV LDQLIAak-- rat------- -p-----gdd mTSLLIAArd 213
2ij2 176 ---------r aldeamnk-l npddpay-d- --enk----r q--------- ---FQEDIKV MNDLVDki-- iad--rk-a- sg--eq-sdd lLTHMLNGk- 236
1po5 175 ff-qs----f -slissfs-s --------q- --vfelfsgf lkhfp---gt hrqIYRNLQE INTFIG--qs vek--hratl dp-snp-r-d fIDVYLLRme 246
1r9o 178 ls-spwipii --dyfpg--- ---------- ---------- -thn----kl lknVAFMKSY ILEKVKeh-- qes--md-m- n----n-pqd fIDCFLMKme 235
CYP 3A4 214 df-ld----p fflsitvf-p --------f- --lip----i levl----ni cvfPREVTNF LRKSVKrm-- kes--rl-e- dt-qkh-rvd fLQLMIDSqn 280
1z8o 217 ---------- --ddddgrls adeltsi--- ---------- -----alvll lAGFEASVSL IGIGTYLLLT HPDQLALVRR Dp-------- ---------- 269
1gwi 214 ---------- --eng-dhlt daeivst--- ---------- -----lqlmv aAGHETTISL IVNAVVNLST HPEQRALVLS Ge-------- ---------- 265
1n97 206 ---------- ---------- ---------- -------pre ralseavtll vAGHETVASA LTWSFLLLSH RPDWQKRVAE S--------- ---------- 250
1cpt 231 ---------- ----dgn--- -------yi- -------ddk yinayyvaia tAGHDTTSSS SGGAIIGLSR NPEQLALAKS D--------- ---------- 280
1izo 215 ----tqedgs ---------- --------ql dsrmaaieli nvl------- -RPIVAISYF LVFSALALHE HPKYKEWLRS Gn-------- ---------- 267
2cib 204 -aet------ g-tprfs--- ---------- --------ad eitgmfismm fAGHHTSSGT ASWTLIELMR HRDAYAAVID Eldelyg--- -dgrsvsfha 271
1odo 214 d--------- -------rls peelrdt--- ---------- -----lllmi sAGYETTVNV IDQAVHTLLT RPDQLALVRK Ge-------- ---------- 261
2ij2 236 ---------- d-petge--- -------pl- -------dde niryqiitfl iAGHETTSGL LSFALYFLVK NPHVLQKAAE Eaarvlv--d p-vp--sykq 302
1po5 247 k--d------ k-sdpss--- -------ef- -------hhq nliltvlslf fAGTETTSTT LRYGFLLMLK YPHVTERVQK Eieqvigsh- r-pp--aldd 315
1r9o 236 k--e------ k-hnqps--- -------ef- -------tie slentavdlf gAGTETTSTT LRYALLLLLK HPEVTAKVQE Eiervigrn- r-sp--cmqd 304
CYP 3A4 281 s--k------ e-teshk--- -------al- -------sdl elvaqsiifi fAGYETTSSV LSFIMYELAT HPDVQQKLQE Eidavlpnk- a-pp--tydt 349
1z8o 269 ----SALPNA VEEILRYIAP PE-tttr-FA AEEVEIg-g- VAIPQYSTVL VANGAANRDp kQFP-DPHRF DVTRDTr--- ---------- --------gh 339
1gwi 265 ----AEWSAV VEETLRFSTP TS-hvlirFA AEDVPVg-d- RVIPAGDALI VSYGALGRDe rAHGpTADRF DLTRTSg--- ---------- -----n--rh 338
1n97 250 ---eEAALAA FQEALRLYPP AW-i-ltrRL ERPLLLg-e- DRLPPGTTLV LSPYVTQRL- -HFP-DGEAF RPERFL--ee rg-tp---s- -----g--ry 326
1cpt 280 ---pALIPRL VDEAVRWTAP VK-s-fmrTA LADTEVr-g- QNIKRGDRIM LSYPSANRDe eVFS-NPDEF DITRF----- ---------- ------pnrh 351
1izo 267 ---sREREMF VQEVRRYYPF GP-f-lgaLV KKDFVWn-n- CEFKKGTSVL LDLYGTNHDp rLWD-HPDEF RPERFAe--- -----reen- -----lf-dm 344
2cib 272 lrqiPQLENV LKETLRLHPP LI-i-lmrVA KGEFEVq-g- HRIHEGDLVA ASPAISNRIp eDFP-DPHDF VPARYEq--- ----p--rqe dllnrw--tw 355
1odo 261 ----VTWADV VEETLRHEPA VK-hlplrYA VTDIALpdg- RTIARGEPIL ASYAAANRHp dWHE-DADTF DATRTVk--- ---------- --------eh 333
2ij2 303 vkqlKYVGMV LNEALRLWPT AP-a-fslYA KEDTVLg-ge YPLEKGDELM VLIPQLHRDk tIWGdDVEEF RPERFE--np --sai--pq- -----h--af 385
1po5 316 rakmPYTDAV IHEIQRLGDL IPfg-vphTV TKDTQFr-g- YVIPKNTEVF PVLSSALHDp rYFE-TPNTF NPGHFLdang --alk--rn- -----e--gf 399
1r9o 305 rshmPYTDAV VHEVQRYIDL LP-tslphAV TCDIKFr-n- YLIPKGTTIL ISLTSVLHDn kEFP-NPEMF DPHHFLdegg --nfk--ks- -----k--yf 388
CYP 3A4 350 vlqmEYLDMV VNETLRLFPI AM-r-lerVC KKDVEIn-g- MFIPKGWVVM IPSYALHRDp kYWT-EPEKF LPERFSkknk --dni--dp- -----y--iy 432
1z8o 340 LSFGQG---- IHFCMGRPLA KLEGEVALRA LFGRFpal-s LGida----D D-VVw-rr-s lllRGIDHLP VRLD-g---- ----- 402
1gwi 339 ISFGHG---- PHVCPGAALS RMEAGVALPA LYARFphl-d LAvpa----A E-LRn-kp-v vtqNDLFELP VRLA-h-hh- ----- 403
1n97 327 FPFGLG---- QRLCLGRDFA LLEGPIVLRA FFRRF-rl-d PL-------P F-PRv-la-q vtlRPEGGLP ARPR-e---- ----- 385
1cpt 352 LGFGWG---- AHMCLGQHLA KLEMKIFFEE LLPKL-ksve LS-------G P-PRl-vatn fvgGPK-NVP IRFT-k-a-- ----- 412
1izo 345 IPQGGGhaek GHRCPGEGIT IEVMKASLDF LVHQI-ey-d VPe-q--s-L H-YSl--a-r mpsLPES-GF VMSG---irr k---- 411
2cib 356 IPFGAG---- RHRCVGAAFA IMQIKAIFSV LLREY-ef-e MAqppe---S YRNDh-skm- vv-QLAQPAA VRYR-r-r-- -t--- 420
1odo 334 LAFGHG---- VHFCLGAPLA RMEVTLALES LFGRFpdl-r LAdpa----E E-LPp-vp-s lisNGHQRLP VLLH--a--- ----- 396
2ij2 386 KPFGNG---- QRACIGQQFA LHEATLVLGM MLKHF-df-e DHt-----nY E-LDi-ke-t ltlKPEG-FV VKAK-s-kk- -ipl- 450
1po5 400 MPFSLG---- KRICLGEGIA RTELFLFFTT ILQNF-si-a SPvppedi-D LTPRes-gv- gn-V-PPSYQ IRFL-a-r-- h---- 465
1r9o 389 MPFSAG---- KRICVGEALA GMELFLFLTS ILQNF-nl-k SLvdpk-n-L D-TTp-vvng fasVPPF-YQ LCFI-p-ihh ----- 455
CYP 3A4 433 TPFGSG---- PRNCIGMRFA LMNMKLALIR VLQNF-sf-k PCket--q-I P-LKl-sl-g gllQPEKPVV LKVE-s-rdg tvsga 503
Figure A 5-4 Exemple d’alignement par HHPred, sur un jeu global G de templates.
353
1jip 1 ---------- ---------t -tvp-dlesd sfhv-----d w--YRTYAEL ret--APVTP VRfl-g-qDA WLVTGYDEAK AALS--dl-R LSSDpkkkyp 65
1gwi 1 ---------- ---------- -ari-pld-- pfvt-----d l--DGESARL raa--GPLAA VElpgg-vPV WAVTHHAEAK ALLT--dp-R LVKDinvwga 63
1lfk 1 ---------- ---------- ------dprp lhir---rqg ldpADELLAA -----GALTR VT----aeTH WMATAHAVVR QVMG--dhqQ FSTRrrwd-- 58
1jfb 1 ---------- ---------- -aps-fpfsr asgp-----e p--PAEFAKL rat--NPVSQ VKlfdg-sLA WLVTKHKDVC FVAT--se-K LSKVrtrq-- 63
1io7 1 ---------- ---------- ---------- ---------- m--YDWFSEM rkk--DPVYY DG------NI WQVFSYRYTK EVLN--nfsK FSSDltgyhe 48
1cpt 1 ---------m daratipehi artvilpqgy adde-----v i--YPAFKWL rde--QPLAM AH-iegydPM WIATKHADVM QIGK--qpgL FSNAegseil 79
1n40 1 ---------- ---------a tvll-evpfs argd-----r i--PDAVAEL rtr--EPIRK VRtitg-aEA WLVSSYALCT QVLE--dr-R FSMKetaaa- 66
1n97 1 ---------- -mkrlslrea wpy---lkdl q-q------d p--LAVLLAW gra--HPRLF LPlp--rfPL ALIFDPEGVE GALL--ae-G TTKAt----- 65
1qmq 1 ----anlapl pphv--pehl vfdfdmynps nlsa-----g v--QEAWAVL qesnvPDLVW TR-cng--GH WIATRGQLIR EAYE--dyrH FSSE--cpfi 80
1e9x 1 --------ms avalprvsgg hdehghleef rt-------d p--IGLMQRV rdec-GDVGT FQlag--kQV VLLSGSHANE FFFR-agddD LDQA------ 73
1jpz 1 -------tik empqpktfge lkn---lpll ntd------k p--VQALMKI ade-lGEIFK FEap--grVT RYLSSQRLIK EACD--esrF DKNLs----- 72
1dt6 1 ---------p pgptpfpi-i gni---lqid a-k------d i--SKSLTKF sec-yGPVFT VYlg--mkPT VVLHGYEAVK EALVdlgeeF AGRGs----- 70
CYP 3A4 1 malipdlame twlllavslv llylygthsh glfkklgipg ptpLPFLGNI ls-yhKGFCM FDmechkkYG KVWGFYDGQQ PVLAitdpdM IKTVlvkecy 99
SCR1* SCR1** SCR1 SCR1***
1jip 65 ---gvevefp aylgfpedvr nyfatnmgts dp--pthtRL RKLVSQEFTV RRVEA--MRP RVEQITAELL DEVG---d-s GVVDIVDRFA HPLPIKVICE 154
1gwi 64 wrrgeipa-- ---dwpligl anpgrsmltv dg--aehrRL RTLVAQALTV RRVEH--MRG RITELTDRLL DELP---adg GVVDLKAAFA YPLPMYVVAD 151
1lfk 58 ---------- ---------- pelvgnlmdy dp--pehtRL RRKLTPGFTL RKMQR--MAP YIEQIVNDRL DEMErag--- SPADLIAFVA DKVPGAVLCE 131
1jfb 63 -------gfp elsa-sgkqa akakptfvdm dp--pehmHQ RSMVEPTFTP EAVKN--LQP YIQRTVDDLL EQMKqkgcan GPVDLVKEFA LPVPSYIIYT 151
1io7 49 rledlrngki r-------fd iptrytmlts dp--plhdEL RSMSADIFSP QKLQT--LET FIRETTRSLL DSIDp----- REDDIVKKLA VPLPIIVISK 132
1cpt 80 ydq----nne afmrsisggc phvidsltsm dp--pthtAY RGLTLNWFQP ASIRK--LEE NIRRIAQASV QRLLdfd--- GECDFMTDCA LYYPLHVVMT 168
1n40 66 -----gaprl naltvppevv n----nmgni ad--a---GL RKAVMKAITP KA-PG--LEQ FLRDTANSLL DNLIteg--- APADLRNDFA DPLATALHCK 146
1n97 65 ---------- -fqyralsrl t--grglltd wg--eswkEA RKALKDPFLP KNVRG--YRE AMEEEARAFF GEWRg----- EERDLDH-EM LALSLRLLGR 142
1qmq 81 p-r----eag e--------- -aydfiptsm dp--peqrQF RALANQVVGM PVVDK--LEN RIQELACSLI ESLRpq---- GQCNFTEDYA EPFPIRIFML 157
1e9x 73 ---------- -kaypfmtpi fgegvvf--- --dasperRK EMLHNAALRG EQMKG--HAA TIEDQVRRMI ADWG----ea GEIDLLD-FF AELTIYTSSA 150
1jpz 72 ---------- -qalkfvrdf a--gdglfts wtheknwkKA HNILLPSFSQ QAMKG--YHA MMVDIAVQLV QKWErln-ad EHIEVPE-DM TRLTLDTIGL 155
1dt6 70 ---------- ----vpilek vskglgiafs na--ktwkEM RRFSLMTLRN FGMGKrsIED RIQEEARCLV EELRktn-a- SPCDPTF-IL GCAPCNVICS 151
CYP 3A4 100 svftnrrpfg pvgfmksais ia-------- --edeewkRL RSLLSPTFTS GKLKE--MVP IIAQYGDVLV RNLRreaetg KPVTLKD-VF GAYSMDVITS 186
SCR2A SCR2B SCR3
1jip 155 LL-gvd---- -ekyrGEFGR WSSE-ilvm- d--------- -----peRAE QRGQAAREVV NFILDLVErr rtepg----- d--dlLSALI Rv-qddddgr 224
1gwi 152 LM-gie---- -earlPRLKV LFEK-ffs-- t--------- -----qtPPE EVVATLTELA SIMTDTVAak raapg----- d--dlTSALI Qa-sen-gdh 219
1lfk 132 LV-gvp---- -rddrDMFMK LCHG-hlda- ---------- -----slSQK RRAALGDKFS RYLLAMIAre rkepg----- e--gmIGAVV Aey--gdd-- 197
1jfb 152 LL-gvp---- -fndlEYLTQ QNAI-rtn-- g--------- -----ssTAR EASAANQELL DYLAILVEqr lvepk----- d--diISKLC Te-qvkpg-n 219
1io7 133 IL-glp---- -iedkEKFKE WSDLvafrlg k--------- -----pgEIF ELGKKYLELI GYVKDHLN-- ---sg----- t--evVSRVV Ns-------n 193
1cpt 169 AL-gvp---- -eddePLMLK LTQD-ffgv- e--------- -------AAR RFHETIATFY DYFNGFTVdr rscpk----- d--dvMSLLA Ns-kld-gny 235
1n40 147 VL-gip---- -qedgPKLFR SLSI-afms- s--------- -----adPIP AAKINWDRDI EYMAGILEnp --nit----- t--glMGELS Rlrkdpaysh 215
1n97 143 ALfgkpls-- -----PSLAE HALKaldrim aqtrsplall ----dlaAEA RFRKDRGALY REAEALIV-- ---------- -----HPPLS H--------- 205
1qmq 158 LA-glp---- -eediPHLKY LTDQ-mtrp- d--------- -------GSM TFAEAKEALY DYLIPIIEqr rqkpg----- t--daISIVA Ng-qvn-grp 224
1e9x 151 CLig---kkf rdqldGRFAK LYHElergtd playvdpylp --i---eSFR RRDEARNGLV ALVADIMNgr ianpptdksd r--dmLDVLI Avkaetgtpr 240
1jpz 156 CGfnyrfnsf yrdqpHPFIT SMVRaldeam nklqranpdd --paydeNKR QFQEDIKVMN DLVDKIIAdr ka-----sqs d--dlLTHML Ngkdpetgep 246
1dt6 152 VIfhnrfdy- kdeefLKLME SLHEnvellg tpl------- --dyfpgIHK TLLKNADYIK NFIMEKVKeh qklld-vnnp r--dfIDCFL Ikmeqennle 238
CYP 3A4 187 TSfgvnidsl nnpqdPFVEN TKKLlrfdfl dpfflsitvf pflipilEVL NICVFPREVT NFLRKSVKrm kesrledtqk hrvdfLQLMI Dsqnsketes 286
SCR4 SCR5 SCR6
1jip 224 ---LSADELT SIALVLLLAG FESSVSLIGI GTYLLLTHPD QLALVRRD-- ---------- ------pSAL PNAVEEILRY Iappett-TR FAAEEVEIG- 301
1gwi 219 ---LTDAEIV STLQLMVAAG HETTISLIVN AVVNLSTHPE QRALVLSG-- ---------- ------eAEW SAVVEETLRF StptshvLIR FAAEDVPVG- 297
1lfk 197 ---ATDEELR GFCVQVMLAG DDNISGMIGL GVLAMLRHPE QIDAFRGD-- ---------- ------eQSA QRAVDELIRY LtvpyspTPR IAREDLTLA- 275
1jfb 219 ---IDKSDAV QIAFLLLVAG NATMVNMIAL GVATLAQHPD QLAQLKAN-- ---------- ------pSLA PQFVEELCRY HtasalaIKR TAKEDVMIG- 297
1io7 193 ---LSDIEKL GYIILLLIAG NETTTNLISN SVIDFTRFN- LWQRIREE-- ---------- -------NLY LKAIEEALRY Sppvmrt-VR KTKERVKLG- 268
1cpt 235 ---IDDKYIN AYYVAIATAG HDTTSSSSGG AIIGLSRNPE QLALAKSD-- ---------- ------pALI PRLVDEAVRW Tapvksf-MR TALADTEVR- 312
1n40 215 ---VSDELFA TIGVTFFGAG VISTGSFLTT ALISLIQRPQ LRNLLHEK-- ---------- ------pELI PAGVEELLRI NlsfadgLPR LATADIQVG- 293
1n97 205 ---LPRERAL SEAVTLLVAG HETVASALTW SFLLLSHRPD WQKRVAES-- ---------- ------eEAA LAAFQEALRL Yppawi-LTR RLERPLLL-g 282
1qmq 224 ---ITSDEAK RMCGLLLVGG LDTVVNFLSF SMEFLAKSPE HRQELIER-- ---------- ------pERI PAACEELLRR Fslv-ad-GR ILTSDYEFH- 300
1e9x 240 ---FSADEIT GMFISMMFAG HHTSSGTASW TLIELMRHRD AYAAVIDEld elygdgrsvs fhalrqiPQL ENVLKETLRL Hpplii-LMR VAKGEFEVQ- 335
1jpz 246 ---LDDENIR YQIITFLIAG HETTSGLLSF ALYFLVKNPH VLQKAAEEaa rvlv-dpvps ykqvkqlKYV GMVLNEALRL Wptapa-FSL YAKEDTVLGg 341
1dt6 238 ---FTLESLV IAVSDLFGAG TETTSTTLRY SLLLLLKHPE VAARVQEEie rvigrhrspc mqdrsrmPYT DAVIHEIQRF IdllptnLPH AVTRDVRFR- 334
CYP 3A4 287 hkaLSDLELV AQSIIFIFAG YETTSSVLSF IMYELATHPD VQQKLQEEid avlpnkappt ydtvlqmEYL DMVVNETLRL F-piamrLER VCKKDVEINg 385
SCR7 SCR8 SCR9
1jip 302 GVAIPQYSTV LVANGAANRD pkqf-PDPHR FDVTRD---- ------t-r- GHLSFGQGIH FCMGRPLAKL EGEVALRALF GrfpALSLgi dad--DVVWR 386
1gwi 298 DRVIPAGDAL IVSYGALGRD erahgPTADR FDLTRT---- ------s-gn RHISFGHGPH VCPGAALSRM EAGVALPALY ArfpHLDLav paa--ELRNK 384
1lfk 276 GQEIKKGDSV ICSLPAANRD pala-PDVDR LDVTRE---- --------pi PHVAFGHGVH HCLGAALARL ELRTVFTELW RrfpALRLad paq--DTEFR 360
1jfb 298 DKLVRANEGI IASNQSANRD eevf-ENPDE FNMNRK---- ------wppq DPLGFGFGDH RCIAEHLAKA ELTTVFSTLY QkfpDLKVav plg--KINYT 384
1io7 269 DQTIEEGEYV RVWIASANRD eevf-HDGEK FIPDRN---- --------pn PHLSFGSGIH LCLGAPLARL EARIAIEEFS KrfrHIEIld ------TEKV 349
1cpt 313 GQNIKRGDRI MLSYPSANRD eevf-SNPDE FDITRF---- --------pn RHLGFGWGAH MCLGQHLAKL EMKIFFEELL PklkSVELs- -g---PPRLV 394
1n40 294 DVLVRKGELV LVLLEGANFD pehf-PNPGS IELDRP---- ------npt- SHLAFGRGQH FCPGSALGRR HAQIGIEALL KkmpGVDLav pid--QLVWR 379
1n97 283 EDRLPPGTTL VLSPYVTQRL --hfp-DGEA FRPERFl--- --eergtpsg RYFPFGLGQR LCLGRDFALL EGPIVLRAFF Rrf-RLDPl- ----pfPRVL 368
1qmq 301 GVQLKKGDQI LLPQMLSGLD eren-AAPMH VDFSRQ---- --------kv SHTTFGHGSH LCLGQHLARR EIIVTLKEWL TripDFSIap ga---QIQHK 384
1e9x 336 GHRIHEGDLV AASPAISNRI pedf-PDPHD FVPARYeq-- prqedllnrw TWIPFGAGRH RCVGAAFAIM QIKAIFSVLL Rey-EFEMaq ppe--SYRND 429
1jpz 342 EYPLEKGDEL MVLIPQLHRD ktiwgDDVEE FRPERFe--- --npsaipqh AFKPFGNGQR ACIGQQFALH EATLVLGMML Khf-DFEDht ---nyeLDIK 432
1dt6 335 NYFIPKGTDI ITSLTSVLHD ekafp-NPKV FDPGHFldes gnfkksd--- YFMPFSAGKR MCVGEGLARM ELFLFLTSIL Qnf-KLQSlv epkdldITAV 429
CYP 3A4 385 -MFIPKGVVV MIPSYALHRD pkyw-TEPEK FLPERFskkn ---kdnidpy IYTPFGSGPR NCIGMRFALM NMKLALIRVL Q---NFSFkp cketqiPLKL 477
SCR10 SCR11 SCR12 SCR13A SCR13B
1jip 387 RSlLLRGIDH -LPVRLd--g ------ 403
1gwi 385 PVvTQNDLFE -LPVRLa--h h----- 402
1lfk 361 LTtPAYGLTE -LMVAW---- ------ 375
1jfb 385 PLnRDVGIVD -LPVIF---- ------ 399
1io7 350 PNeVLNGYKR -LVVRLk--s ------ 366
1cpt 395 ATnFVGGPKN -VPIRFt--- --ka-- 412
1n40 380 TRfQRRIPER -LPVLW---- ------ 394
1n97 369 AQ-VTLRPEG gLPARPre-- ------ 385
1qmq 385 SG-IVSGVQA -LPLVWd--p attkav 406
1e9x 430 HSkMVVQLAQ pACVRYrrrt ------ 449
1jpz 433 ET-LTLKPEG -FVVKAkskk iplggi 456
1dt6 430 VNgFVSVPPS -YQLCFipih h----- 449
CYP 3A4 478 SLgGLLQPEK pVVLKVesrd gtvsga 503
SCR13 SCR13C
Figure A 5-5 Exemple d’alignement réalisé par Fugue/Orchestrar. 12 templates ont été imposés au programme :
P450eryF (1jip), CYP 154C1 (1gwi), P450OxyB (1lfk), P450nor (1jfb), CYP 119 (1io7), P450terp (1cpt), CYP 121
(1n40), CYP 175A1 (1n97), P450cam (1qmq), CYP 51 (1e9x), P450BM3 (1jpz), CYP 2C5 (1dt6). Les SCRs (régions
structuralement conservées par Orchestrar) sont indiquées par des blocs noirs. La nomenclature utilisée pour la
numérotation est la même que celle de P. Jean. Certains blocs n’ont jamais été identifiés avec les autres méthodes,
comme le SCR1*** par exemple.
Conf: 923466899999999999999999985145430103998987605586467514898899
Pred: CCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCHHCCCCCCCCHHHHHHHHHCCCCHHHH
AA: MALIPDLAMETWLLLAVSLVLLYLYGTHSHGLFKKLGIPGPTPLPFLGNILSYHKGFCMF
10 20 30 40 50 60
Conf: 999998369933997789689997298999999726874434445310011457753784
Pred: HHHHHHHCCCCEEEEECCEEEEEECCHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCEEECCCCCCEEEE
AA: DMECHKKYGKVWGFYDGQQPVLAITDPDMIKTVLVKECYSVFTNRRPFGPVGFMKSAISI
70 80 90 100 110 120
Conf: 695389988522063101111134699999888999999752125765433189998633
Pred: CCCHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCHHHHHHHHH
AA: AEDEEWKRLRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNLRREAETGKPVTLKDVFGAYS
130 140 150 160 170 180
Conf: 222257653024334440134589987455665542100000000012331132210012
Pred: HHHHHHHHHCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHCCCCCCCCC
AA: MDVITSTSFGVNIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFDFLDPFFLSITVFPFLIPILEVLNICV
190 200 210 220 230 240
Conf: 379999999999999855421055532001788999876321101335899999999998
Pred: CHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCHHHHHHHHH
AA: FPREVTNFLRKSVKRMKESRLEDTQKHRVDFLQLMIDSQNSKETESHKALSDLELVAQSI
250 260 270 280 290 300
Conf: 621111045367878999987530007999998755420127888977874022468998
Pred: HHHHHHCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCHHHHHCCCHHHHHH
AA: IFIFAGYETTSSVLSFIMYELATHPDVQQKLQEEIDAVLPNKAPPTYDTVLQMEYLDMVV
310 320 330 340 350 360
Conf: 875531012246311213761223765676555511504421633326434300345233
Pred: HHHHHHHCCCCCCCEEECCCEEECCCCCCCCCEEECCHHHHCCCHHHCCCCCCCCCCCCC
AA: NETLRLFPIAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGWVVMIPSYALHRDPKYWTEPEKFLPERFS
370 380 390 400 410 420
Conf: 456652122100015805552876358999999999998762288746888677520243
Pred: CCCCCCCCCCEEECCCCHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHEEEEECCCCCCCCCCCCC
AA: KKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALMNMKLALIRVLQNFSFKPCKETQIPLKLSLG
430 440 450 460 470 480
Conf: 78965997299999658421169
Pred: EEEECCCCEEEEEEECCCCCCCC
AA: GLLQPEKPVVLKVESRDGTVSGA
490 500
Figure A 5-6 Résultat de prédiction de SSE par le logiciel PSIPRED sur la séquence du CYP 3A4. Dans la
nomenclature PSIPRED, H correspond à une structure en hélice α, E à une structure en brin β, et c à un coil (ou
boucle). Sur la séquence, les SSE attribués dans le fichier PDB du CYP 3A4, sont figurés, en rouge pour les
hélices α et en jaune pour les brins β. PSIPRED prédit les SSE avec une fiabilité de 50 à 60%.

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Relations structure - Fonction dans la superfamille des

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Cytochromes P450 (CYP) are monoxygenase enzymes involved in biotransformations of exogenous

ÉTAT DES CONNAISSANCES 9

1 CYTOCHROMES P450 : POURQUOI UN TEL INTERET ? 11

NOUVELLES METHODES 129

3 MODELISATION COMPARATIVE ADAPTEE POUR LES SUPERFAMILLES 131

5 COMPARAISON DES METHODES 177

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 263

7 BILAN ET NOUVELLES IDEES 265

ANNEXE 1 LE MONDE MERVEILLEUX DES PROTEINES 291

ADN = Acide Désoxyribonucléique

En raison de leurs propriétés physico-chimiques et de leur implication dans les réactions de

à-vis de composés hydrophobes (médicaments, pesticides, mycotoxines, ….). Fort de leurs

Un premier modèle moléculaire du CYP3A4 a été développé au laboratoire au cours du travail de

Par ailleurs, le programme développé m’a également permis d’aborder la bioinformatique

État des connaissances

1 Cytochromes P450 : pourquoi un tel intérêt ?

« Nous ne connaissons pas le vrai si nous ignorons les causes »

1.1 A la découverte d’une superfamille d’enzyme…

1.1.2 Identification et caractérisation des CYPs

Figure 1-2 Protoporphyrine IX de fer constituant l'hème des cytochromes P450

Figure 1-3 Représentation schématique d'un CYP

1.1.3 Diversité des cytochromes P450

1.1.3.1 Multiplicité en gènes

À partir d’informations basées sur des alignements de séquences et d’arbres phylogéniques

350 353 357 359 249 252

1.1.3.2 Localisation hétérogène

1.1.3.3 Variabilité en forme

1.1.3.4 Diversité des réactions catalysées

1.1.3.5 Rôles multiples

1.1.3.6 Un large spectre de substrats

1.1.3.7 Un corpus de connaissance croissant

Chimie Sciences des Sciences de

1.1.4 Conséquences structurales

Tableau 1.1 Rôles structuraux de l'apoprotéine P450 (source Lewis, 2001)

1. Liaison à l’hème Hélice I et L, cystéine invariante et usuellement deux résidus

2. Liaison et activation de l’oxygène La région de l’hélice I distale à la partie héminique

6. Régulation de ces activités à Peptide N-terminal de 30-40 résidus de long

SRS = Substrate recognition site (Gotoh, 1992)

Tableau 1.2 Comparaison de l'hélice I entre plusieurs P450s.

Humain 5A1 TXS F L I A G Y E I I T Thromboxane synthase

Rat 5A1 TXS F L I A G H E I T T Thromboxane synthase

Souris 5A1 TXS F L I A G H E V I T Thromboxane synthase

Cochon 5A1 TXS F L I A G Y E I I T Thromboxane synthase

Lin 74 AOS N S W G G F K I L L Allène oxyde synthase

Guayule 74 AOS N T F G G V K I L F Allène oxyde synthase

Humain 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase

Vache 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase

Rat 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase

Souris 19 Arom M L I A A P D T M S Estrogène synthase

Poulet 19 Arom M L I A A P D T L S Estrogène synthase

Truite 19 Arom M V I A A P D T L S Estrogène synthase

Levure 51 14DM V L M G G Q Q T S A Lanosterol 14α-démétylase

Rat 51 14DM L L L A G Q Q T S S Lanosterol 14α-démétylase

Humain 51 14DM L L L A G Q Q T S S Lanosterol 14α-démétylase

Candida 51 14DM V L M G G Q Q T S A Lanosterol 14α-démétylase

1.2 Nomenclature, Classification et Phylogénie