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    01 - Les Applications Du HLA

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    Ce document décrit les applications du système HLA, notamment en transplantation, en médecine légale et dans l'étude des maladies. Il présente les différentes techniques d'étude du polymorphisme HLA comme les techniques sérologiques, moléculaires et cellulaires. Le document est structuré en plusieurs parties et sections.

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    01 -Les applications du HLA

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    01 - Les Applications Du HLA

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    LES APPLICATIONS DU SYSTEME

    HLA

    Pr Y.BOUCHEDOUB
    2019/2020
    I/ RAPPEL
    II/TECHNIQUES D ETUDE DU POLYMORPHISME HLA
    • A/ TECHIQUES SEROLOGIQUES
    • B/ TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
    • C/ AUTRES TECHNIQUES
    III/ APPLICATIONS DU MOLECULES HLA
    • A/ HLA ET TRANSPLANTATION
    • B/ HLA ET MALADIES
    • C/ HLA ET MEDECINE LEGALE
    • D/ HLA ET ANTHROPOLOGIE
    RAPPEL
    Le système HLA est caractérisé par :

    • Un polymorphisme extrême : conditionné par un poly allélisme


    pour chacun des locus.

    • Une étroite liaison : les locus A, B, C, DR, DQ et DP sont


    étroitement liés sur le chromosome. La transmission des gènes se
    fait en bloc.

    • Une expression codominante : chaque allèle sur chaque haplotype


    est exprimé.

    • Les Déséquilibres de liaison ou associations gamétique : certains


    allèles sont plus fréquemment associés à d’autres que le voudrait
    le hasard.
    TECHNIQUES D ETUDE DU POLYMORPHISME HLA
    L’étude du polymorphisme HLA est effectuée par différentes techniques :
    • Techniques cellulaires
    qui permettent de définir les spécificités HLA DP
    • Techniques biochimiques
    qui permettent de définir les produits des gènes.
    • Techniques sérologiques (microlymphocytotoxicité) ++++
    qui permettent de définir les spécificités HLA de classe I et de classe II sauf
    DP. Et le cross match
    • Techniques de biologie moléculaire ++++
    qui permettent de définir les gènes de classe I et de classe II.
    • Cytométrie de flux,
    utilusée surtout pour le cross match.
    • Luminex ++++
     Permet de définir les molécules HLA de classe I et de classe II.
     Le cross match.
     La recherche des allo-anticoprs.
    TECHNIQUES SEROLOGIQUES : MICROLYMPHOCYTOTOXICITE

    1/ Principe
    • La détermination des antigènes HLA par MLC,
    consiste à incuber les lymphocytes du sujet à
    typer, préalablement isolés, avec des sérums tests
    en présence du complément de lapin.
    • Si les lymphocytes sont porteurs de l’antigène
    correspondant au sérum utilisé, il se produit une
    altération de la membrane cellulaire entraînant
    une lyse, qui peut être révélée par un colorant.
    “1” Reaction “2” Reaction “4” Reaction

    0–10% Cells 11–20% Dead Cells 21–50% Dead Cells

    “6” Reaction “8” Reaction

    51–80% Dead Cells 81–100% Dead Cells


    B/ TECHNIQUE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
    1/ Principe
    • Permet l’étude des gènes, après amplification du DNA par la
    DNA polymérase (PCR= Polymérase Chain Reaction),

    • Le protocole Quiagen utilise la méthodologie PCR-SSP est


    basée sur le principe que seules sont amplifiés les
    séquences de l’ADN cible correspondant exactement aux
    amorces présentes.

    • A la fin de l’amplification les fragments amplifiés sont


    séparés sur gel d’agarose . L’interprétation des résultats
    est basée sur la présence ou l’absence de fragments
    amplifiés.
    III/ LES APPLICATIONS DU SYSTEME HLA

    A/TRANSPLANTATION ET GREFFE
    1/Généralités
    a/ Transplantation
    Prélèvement d’un organe avec rétablissement de la continuité par les
    anastomoses vasculaires.
    • Transplantation rénale.
    • Transplantation cardiaque.
    • Transplantation hépatique.
    • Transplantation pulmonaire.

    b/ Greffe
    Prélèvement des tissus sans anastomoses vasculaires :
    • Greffe de moelle osseuse.
    • Greffe de peau.
    • Greffe de cornée.
    • Les antigènes du CMH constituent la barrière
    antigénique principale pour les transplantations et les
    greffes. A l’origine des rejet des greffons.

    • Les autres antigènes impliqués dans le rejet sont :


    -Les antigènes du système ABO
    - MICA (MHC class I polypeptide-related
    sequence A) et MICB (MHC class I polypeptide-related
    sequence B)
    -Les antigènes mineurs d’histocompatibilités.
    Immunologie des greffes:
    Autogreffe

    Donneur et receveur même individu


    Greffe syngénique
    ou isogreffe

    Individus génétiquement identiques (jumeaux monozygotes)

    Allogreffe

    Individus génétiquement différents de la même espèce

    Xénogreffe

    Individus d’espèces animales différentes


    2/ HLA et transplantation rénale
    a/ Introduction
    • Constitue l’un des traitements de l’insuffisance rénale
    terminale, de pratique quotidienne. L’obstacle majeur
    reste le risque de rejet, ce qui impose une sélection
    rigoureuse d’un couple donneur receveur (D/R).

    • Antigènes des groupes ABO


    • Antigènes du CMH surtout (B, DR) : le risque de rejet est
    proportionnelle au nombre d’incompatibilité A, B, DR.
    • Antigènes mineurs d’histocompatibilité et les
    MICA/MICB
    b/ Sélection D/R

    b1 : Groupage sanguin : ABO


    • La compatibilité entre D et R est impérative car toute
    transgression entraîne un rejet sur aigue

    b2 : Typage HLA
    • Typage HLA de classe I :(A et B), le typage HLA de classe II
    (DR, DQ).
    • donneur vivant apparenté→ HLA identique, ou semi
    identique.
    • donneur en état de mort cérébrale (coma dépassée) :→ HLA
    le plus compatible possible
    • La non identité HLA ne contre indique pas la transplantation.
    • La compatibilité HLA augmente la survie de l’organe greffé.
    b3 : La recherche des anticorps anti HLA
    • Le cross match : CM : par microlymphocytotoxicité
    • Il s’agit d’un examen obligatoire destiné à rechercher
    la présence d’anticorps (IgG) dirigés contre les
    antigènes HLA de classe I et de classe II du donneur.

    • Sérum du receveur + lymphocytes du donneurs +


    complément + colorant → lecture au microscope
    (optique ou à fluorescence).

    Le CM anti HLA doit être négatif, le CM positif est une


    contre indication formelle à la transplantation
    rénale.
    • Recherche des anticorps anti HLA sur panel par
    microlymphocytotoxicité

    • Recherche des anticorps anti HLA sur panel par


    ELISA

    Ces anticorps sont développés après : transfusions,


    grossesses, transplantation
    c/ Phénomènes de rejet
    c1 : Rejet hyper aigu
    • Irréversible, du au anticorps cytotoxiques de type IgG anti HLA
    préexistants chez le receveur : en cas de CM positif.

    c2 : Rejet aigu
    • Réversible, à partir de la deuxième semaine, du à l’infiltration du
    greffon par les lymphocytes T cytotoxiques.

    c3 : Rejet chronique
    • Irréversible quelque soit l’identité HLA et quelque soit le
    traitement

    c4 : Immunosuppresseur indispensable
    3/ HLA et transplantation cardiaque et hépatique
    • Il s’agit dans ces cas particuliers des
    transplantations cardiaques, hépatiques, parfois
    pancréatiques, et pulmonaires.

    • L’urgence dans ces cas ne permet pas le choix


    d’un donneur HLA compatible, mais la
    transplantation est effectuée sur la base d’un
    cross match négatif et d’un groupe sanguin ABO
    compatible.
    4/ HLA et greffe
    a/ Greffe de moelle osseuse
    a1 : Indication
    • Leucémies
    • Déficits immunitaires primitifs sévères
    • Aplasie médullaire
    • MM(auto-greffe)

    a2 : Sélection D/R
    • HLA identique (classe I, classe II)
    • Nécessite un phénotypage HLA A, B, DR, DQ,
    DP, des parents et de la fratrie.
    • Par biologie moléculaire, par réaction
    lymphocytaire mixte (MLR) si possible

    a3 : Complications
    • Réaction de rejet des cellules greffées
    • Réaction de RGVH (Réaction Graft Versus Host)
    = réaction du greffon contre l’hôte
    • Infections
    b/ Autres greffes
    • greffe de cornée : généralement bien tolérée
    • greffe de peau : surtout autologue
    • greffe d’os : pas de rejet immunologique car
    l’os greffée ne contient pas de tissus
    immunogénétique.
    B/ HLA ET MALADIES

    1/ La recherche d’une association


    • L’association signifie qu’un antigène HLA donné est retrouvé
    fréquemment dans une population donnée de malade non
    apparenté par rapport à une population contrôle (T).

    Exemples :
    • SPA HLA B27 90 % des malades 04% des témoins
    • Behcet HLA B51 41% des malades 10% des témoins

    • Autres associations : DID, LES: HLA DR3


    MC et DQ2, DQ8
    PR: DR4, DR1
    Sclérodermie: DR11
    Risque relatif : rapport de la fréquence de la maladies chez les sujets
    portant le marqueur HLA par rapport aux témoins de la même
    population.

    RR = fm (1-ft) /ft (1-fm)

    fm; fréquence d’allèle HLA chez les maladies.


    ft ; fréquence de ce même allèle chez les témoins.

    RR>1 le risqué est accrue par la présence du marqueur.

     Risque personnel : risque pour une personne ayant le caractère X de


    contracter la maladie.

     Ce type de calcul n’est valable que pour des malades et des sujets
    contrôles du même groupe ethnique
    2/ Recherche d’une liaison entre HLA et maladies
    • Démontre la présence d’un antigène donné chez les
    membres d’une même famille. Le gène de la maladie est
    hébergé dans la région CMH. Permet de voir le risque chez
    les frères et sœurs selon le nombre d’haplotypes partagés
    avec le premier enfant atteint.
    Exemples :
    • Hémochromatose
    • HLA identique : 100% HLA semi id : 0% HLA : non id 0%

    3/ Gènes protecteurs
    • DR1 protège contre le DID
    • La présence d’un résidu Acide Aspartique en position 57 de
    la chaîne DQ β protège contre le DID.
    C/ HLA ET MEDICINE LEGALE
    • Le polymorphisme du système HLA et
    l’expression codominante sont à l’origine de
    l’identité biologique d’un individu et par
    conséquent les applications en médicine légale
    • L’exclusion(++++) ou la confirmation (++) d’une
    paternité
    Étroite liaison
    Transmission en haplotypes, des parents aux enfants.
    Père Mère
    A1 A2 A2 A3

    B51 B8 B8 B7

    DR15 DR18 DR11 DR13


    a b c d

    A1 A2 A1 A2 A1 A3 A2 A2 A2 A3 A1 A3

    B51 B8 B51 B8 B51 B7 B8 B8 B8 B7 B8 B7

    DR15 DR11 DR15 DR11 DR15 DR13 DR18 DR11 DR18 DR13 DR18 DR13
    a c a c a d b c b d a d
    E5 E1 E2 E3 E4 E6
    25% 25% 25% 25% Recombinant
    4 combinaisons haplotypiques possibles
    La probabilité pour deux enfants d’une même fratrie d’être:

    • HLA identiques est de 25%: deux haplotypes en commun.


    • HLA semi-identiques est de 50%: un haplotype en commun.
    • HLA différents est de 25%: aucun haplotype en commun.
    Crossing over : 0,8% entre A et B, 1% entre B et DR.
    D/ HLA ET ANTHROPOLOGIE
    • Certains allèles sont plus fréquemment
    associés à d’autres, et donnent une
    information sur l’histoire génétique d’une
    population. Car le taux de combinaisons
    entre les allèles est très faible :
    Entre A et B +01/100
    Entre B et C presque nul.

    • Donc certains allèles et haplotypes sont


    caractéristiques d’une population
    • Exemples :
     A3, B7, DR2 dans le nord de l’Europe.
     A33, B14 dans le Maghreb et dans le sud de l’Europe.
     Caucasoïdes A1 B8 DR3 (4%)
     Africains A30 B42 DR3 (2%)
     Asiatiques A24 B52 DR15 (8%)
     Amérindiens A24 B35 DR4 (4%).
     Cw4, Bw35 dans le monde entier (recombinaisons
    exceptionnelles entre B et C).
    • Ce sont des marqueurs utiles pour l’anthropologie.
    (Donnent une information sur l’histoire génétique d’une
    population.

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