Laporan Praktikum Mikrobiologi

“Teknik Aseptis, Pembuatan Media dan Sterilisasi”

Oleh :
Nama : Nadila Restu Mutiasari
NIM : 1304617040
Kelompok : 8 (Delapan)
Tanggal Praktikum : Selasa, 24 September 2019
Dosen : Dr. Dalia Sukmawati, M.Si

Pendidikan Biologi B 2017

Jurusan Pendidikan Biologi
Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Jakarta
2019
 BAB I
PENDAHULUAN
a. Latar Belakang
Mikrobiologi merupakan ilmu terapan yang memanfaatkan mikroorganisme
(mikroba) sebagai alat untuk peningkatan kualitas hidup manusia. Pada awalnya
pemanfaatan mikroba hanya berkisar pada industri makanan saja. Seiring dengan
berkembangnya ilmu pengetahuan, mikroba pun banyak digunakan untuk kegiatan
manusia yang lain seperti pengolahan limbah, pengembangan ilmu di bidang rekayasa
genetika dan lain sebagainya.
Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat dan bahan-bahan
dari segala macam bentuk kehidupan, terutama mikroba, sehingga dalam sterilisasi
nanti alat-alat tidak terkontaminasi dengan mikroba lain. Oleh karena itu, bagi seorang
pemula di bidang mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi karena
merupakan dasar kerja dalam laboratorium mikrobiologi. Steril merupakan syarat
mutlak keberhasilan kerja dalam lab laboratorium. Sterilisasi adalah suatu proses yang
menghancurkan semua bentuk kehidupan mikroba, termasuk spora, pada permukaan
bedan mati prosesnya dapat berupa pemanasan, pemberian zat kimia, radiasi/filtrasi
(Gruen deman dan Fernsebner, 2006).
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik,
fisik, dan kimiawi. Sterilisasi secara mekanik dapat dilakukan dengan melakukan
filtrasi menggunakan suatu saringan berpori sangat kecil (0,22 atau 0,45 mikron)
sehingga tidak ada mikroba yang lolos dari saringan tersebut. Sterilisasi mekanik ini
dapat dilakukan pada bahan yang tahan panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.
Sterilisasi fisik, dilakukan dengan cara pemanasan atau penyinaran. Pemanasan dapat
dilakukan dengan pemijaran, pemanasan basah dan pemanasan kering (Agahoco,
2008). Sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi.
Metode sterilisasi yang umum digunakan secara rutin dilaboratorium mikrobiologi
ialah yang menggunakan panas (Hadioetomo, 1993).
Setelah mensterilkan alat, maka tahap selanjutnya adalah pembuatan media.
Media biakan adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (Nutrien) yang
berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media
maka isolasi, perbanyakan, dan perhitungan sejumlah mikroba dapat dilakukan.
Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan (nutrien)
yang digunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan mikroorganisme.
Mikroorganisme juga merupakan makhluk hidup, untuk memeliharanya dibutuhkan
medium yang harus mengandung semua zat yang dibutuhkan untuk pertumbuhannya,
yaitu antara lain senyawa-senyawa organik (protein, karbohidrat, lemak, mineral dan
vitamin). Medium digunakan untuk melihat gerakan dari suatu gerakan
mikroorganisme apakah bersifat motil atau nonmotil. Medium ini ditambahkan bahan
bahan pemadat 30% (Hedietomo, 1990).
Beberapa bakteri yang dibudidayakan di laboratorium dapat tumbuh dengan
baik pada media apapun, ada juga bakteri yang memerlukan media khusus untuk
memenuhi kebutuhan nutrisinya, ada juga bakteri yang masih belum bisa berkembang
 dan hidup di media budidaya. Sehingga untuk menumbuhkannya suatu budidaya
bakteri, harus diketahui kriteria apa yang harus dipenuhi oleh medium budidaya
(Turtora, et.al, 1986).
Nutrient agar adalah medium pertumbuhan mikrobiologi umum digunakan
untuk budidaya rutin non pemilih bakteri. Hal ini berguna karena tetap solid bahkan
pada suhu relatif tinggi. Juga bakteri tumbuh di nutrient agar tumbuh di permukaan dan
jelas terlihat koloni kecil. Dalam kaldu nutrisi bakteri tumbuh dalam cairan, dan
dipandang sebagai zat pekat bukan rumpun yang dibedakan (Vidi, 2012).
Mikroorganisme dapat berkembang biak secara alami atau dengan campur
tangan manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia di antaranya
melalui pertumbuhan menggunakan media. Pada pembuatan media ini, haruslah
dimengerti jenis-jenis nutrien yang diperlukan oleh bakteri dan juga keadaan
lingkungan fisik yang dapat menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya.
Pembiakan mikroba secara buatan memerlukan media pertumbuhan untuk menjadi
tempat tumbuh dan penyedia nutrien bagi mikroba. Media pertumbuhan terdiri dari
garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT).
Pembuatan media ini dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik
dan senyawa kompleks lainnya.

b. Tujuan Praktikum
1. Untuk mengenal alat-alat yang dipergunakan pada praktikum mikrobiologi.
2. Untuk mengenal dan mengetahui alat-alat yang digunakan untuk sterilisasi dan cara
penggunaannya.
3. Untuk mengetahui jenis-jenis media dan cara pembuatannya.
4. Mengetahui cara kerja serta tahapan sterilisasi
5. Mengetahui apa itu teknik aseptis serta cara menerapkannya
 BAB II
METODOLOGI PRAKTIKUM

a. Alat dan Bahan

1. Alat
 Cawan Petri
 Tabung Reaksi
 Gelas Ukur
 Corong Gelas
 Labu Erlenmeyer
 Tali kasur
 Pipet ukur
 Pengaduk
 Kapas
 Autoclave
 Timbangan dengan akurasi 0,01 gram
 Kompor gas dan lampu spirtus
 Yellow pages, label
 Serbet
 Rak tabung reaksi

2. Bahan
 Aquades
 Alkohol 70% dan 90%
 Agar untuk media
- NA (Natrium Agar) : Media agar nutrient
- NB (Natrium Broth) : Media daging segar cair
- PDA (Potato Dektrose Agar) : Media agar kentang dekstrosa

b. Cara Kerja
1. Pembuatan PDA sintetis 100 ml
 Timbang 3.90 gram PDA sintetis untuk 100 ml aquades menggunakan
timbangan digital.
 Ukur aquades sebanyak 100 ml menggunakan gelas ukur
 Larutkan 3.90 gram PDA sintetis dalam 100 ml aquades kedalam tabung
erlenmeyer dan aduk dgn spatula
 Panaskan larutan PDA Sintetis dan terus diaduk menggunakan spatula sampai
mendidih. Kemudian setelah mendidih, angkat larutan PDA sintetis
 Siapkan 2 tabung reaksi
 Tuang larutan PDA sintetis ke dalam setiap tabung reaksi sebanyak 5 ml
  Tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas, pastikan sumbat kapas terpasang
kencang pada tabung reaksi
 Beri label pada setiap tabung reaksi
 Letakkan beberapa tabung reaksi yg berisi PDA sintetis ke dalam gelas kimia
berukuran besar
 Tutup bagian atas gelas kimia dgn yellow page & ikat dgn tali kasur
 Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121°C selama 15 menit

2. Pembuatan PDA alami

 Kentang dikupas dan dicuci bersih. Kemudian sebanyak 75 gr di potong dadu
 Masukkan aquades +- 150 ml ke dalam 75 gr kentang tsb
 Panaskan selama 20 menit, tidak boleh lebih dan kurang
 Selama pemanasan, apabila airnya menyusut, tambahkan aquades hingga hasil
akhirnya 150ml
 Setelah dipanaskan, saring dengan kertas saring sebanyak beberapa kali hingga
jernih
 Hasil akhir dari pemanasannya kurang lebih 150 ml
 Timbang agar dan sukrosa masing-masing sebanyak 2gr.
 Tuang ekstrak sebanyak 100ml ke dalam tabung erlenmeyer ditambahkan
dengan agar&sukrosa yang telah ditimbang sebelumnya. Kemudian aduk
hingga rata
 Panaskan tabung tersebut hingga mendidih, lalu angkat
 Tutup tabung erlenmeyer dengan sumbat kapas
 Sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit. kemudian
diamkan hingga suhu menurun sampai 0°C jika ingin mengambil media

3. Pembuatan NB Sintetis
 Timbang 0.8 gram bubuk NB untuk 100 ml aquades
 Larutkan dalam aquades menggunakan tabung erlenmeyer dan spatula
 Panaskan larutan NB Sintetis hingga mendidih
 Tuang larutan NB ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml
 Tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas, pastikan sumbat terpasang kencang
 Sterilisasi tabung reaksi berisi larutan NB Sintetis menggunakan autoclave
hingga mencapai suhu 121°C selama 15 menit, kemudian biarkan suhu turun
jika ingin mengambil media

4. Pembuatan Ekstrak Daging + NA

 Daging potong kecil kecil, kasih aquades 150ml, rendem semaleman
 Besoknya, aquades di panasin sekitar 20 mnt. kalo berkurang, tambahin aquades
lagi sampe 150ml
 Timbang NA sebanyak 2 gr. lalu tuang 2gr NA ke ekstak daging 150ml tadi.
aduk merata, lalu panaskan hingga mendidih. angkat.
  Tuang sebanyak 5ml ke tabung reaksi
 Tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas
 Sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit

5. Pembuatan NA Sintetis
 Timbang NA sintetik sebanyak 4 gram
 Masukan ke dalam erlenmeyer
 Tambahkan aquades 200 ml
 Panaskan diatas kompor, sambil diaduk sampai mendidih
 Angkat dari kompor kemudian tutup menggunakan kapas dan beri label
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

a. Hasil
Hasil akhir dari proses sterilisasi yang kita dapatkan setelah menginkubasi
peralatan/bahan ke dalam autoclave pada suhu 121℃ selama 20 menit, serta jarum ose
yang dipanaskan di atas api lampu bunsen tersebut menjadi steril (matinya
mikroorganisme yang terdapat pada alat dan bahan). Adapun tolak ukur sterilisasi yang
dilakukan untuk bahan yang diamati ialah pada warna, hasilnya dalam tabel sebagai
berikut:

Nama Pengamatan Pengamatan

Fungsi
Medium Sebelum Sterilisasi Setelah Sterilisasi

Sebagai tempat
PDA Warna kuning keruh Warna bening
pembiakan mikroba

Sebagai tempat
NB Warna kuning keruh Warna bening
pembiakan mikroba

b. Pembahasan
1. Sterilisasi
Sterilisasi adalah proses yang dilakukan untuk membebaskan suatu alat atau
bahan dari kehidupan mikroorganisme. Dalam praktikum kali ini, telah dilakukan
sterilisasi dengan cara fisik, yaitu menggunakan uap bertekanan dengan alat
autoclave. Penggunaan autoclave dalam sterilisasi bertujuan untuk memberikan
panas di bawah tekanan dengan tujuan dekontaminasi. Pemanasan menggunakan
autoclave dinamakan pemanasan basah. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121℃
dengan waktu 15-20 menit.
Alat-alat yang akan disterilkan tidak langsung dimasukkan ke dalam autoclave
melainkan melalui berbagai tahap dahulu agar proses sterilisasi berhasil seperti yang
sudah dijelaskan di cara kerja. Pembungkusan ini bertujuan untuk mencegah
terjadinya keretakan pada alat yang digunakan dan mencegah kontaminas saat akan
dikeluarkan dari autoclave. Lalu, untuk tabung erlenmeyer dan tabung reaksi, bagian
mulutnya ditutup terlebih dahulu dengan menggunakan kapas agar tidak ada uap air
di dinding dan di dalam tabung ketika dipanaskan. Setelah semua alat terbungkus,
barulah alat tersebut dimasukkan ke dalam autoclave.
 Menurut literatur, untuk memberikan jaminan yang lebih luas dan mendukung
hasil uji sterilisasi, sebaiknya gunakan ruangan produksi yang steril dan memenuhi
syarat sterilisasi. Diantaranya bebas mikroorganisme aktif. (Austatan Governmen,
2005, Sandle, 2008).
Suhu yang digunakan pada autoclave 121℃ hal ini sesuai dengan literature
yang menyatakan “Pemanasan basah adalah sterilisasi panas yang digunakan
bersama-sama dengan uap air. Pemanasan basah biasanya dilakukan di dalam
autoklaf atau aterillsator uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air
jenuh bertekanan 2 atm pada suhu 121℃ selama 15 menit (Hadioetomo,1985).
Dalam pemanasan menggunakan autoklaf, ketika tekanan dan suhu sudah
tercapai, maka proses sterilisasi dimulai dengan timer mulai menghitung mundur.
Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan
turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan
mencapai 0 psi (Marino and Bejamin, 1986 : Luka, 2006).

2. Pembuatan Media
Media atau medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme di dalamnya. Medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat yaitu
harus mengandung kimia zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, mempunyai
tekanan osmosis, tegangan permukaan dan plt yang sesuai dengan kebutuhan
mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak mengandung zat penghambat dan harus
dalam keadaan steril sebelum digunakan agar mikroba yang tumbuh dapat tumbuh
dengan baik.
Pada praktikum kali ini menggunakan Natrium Agar (NA), Natrium Broth (NB)
dan Potato Dextrose Agar (PDA).
 Natrium Agar (NA)
Digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri dimana dalam pembuatannya
terlebih dahulu menimbang bahan yang akan digunakan, lalu memasukkan bahan
yang akan digunakan ke dalam erlenmeyer. Bahan yang diambil adalah 5 gram
NA dan 250 Ml aquades, kemudian diaduk hingga tercampur rata, lalu
dipanaskan. Tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk
menghomogenkan NA dengan aquades, dimana dengan pemanasan dapat
mempercepat pelarutan NA dan aquades. Setelah dipanaskan beberapa menit
larutan berubah warna menjadi kuning kecoklatan. Hal ini menandakan bahwa
larutan sudah homogen. Setelah itu ditutup dengan kapas dan sterilkan dengan
autoclave pada suhu 121℃ dan dilakukan selama 15-20 menit. Hal ini bertujuan
untuk membunuh spora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, dimana
sel ini tahan terhadap pemanasan.
NA dibuat dengan komposisi agar-agar yang sudah dipadatkan sehingga NA
juga bisa disebut sebagai Nutrisi padat yang digunakan untuk menumbuhkan
bakteri (Sanara,2013).
 Nutrien Broth (NB)
NB merupakan medium yang berbentuk cair dengan bahan dasar ekstrak beet.
Susunan kimiawinya sama dengan Nutrient Agar. Fungsi kimia dari Nutrien
 Broth adalah Medium umum. NB berwarna kuning pudar dan berguna untuk
menumbuhkan bakteri. Perbedaan konsentrasinya yaitu pada Natrium Agar
berbentuk padat sementara Natrium Broth berbentuk cair.
 Potato Dextrose Agar (PDA)
PDA digunakan untuk menumbuhkan jamur. Pembuatan medium pada
percobaan ini dengan menggunakan PDA dimana dalam pembuatannya terlebih
dahulu dengan cara menyiapkan PDA dan aquades. Untuk langkahnya sama
seperti medium Natrium Agar (NA). PDA merupakan medium yang dibuat
dengan menggunakan bahan alami yang direbus dan bahan sintetik dari
kandungan glukosa, sehingga PDA termasuk media semi-alami. Berdasarkan
konsistensinya merupakan media padat karena mengandung agar yang
memadatkan medium, berdasarkan kegunaannya merupakan medium untuk
pertumbuhan jamur. Medium PDA terdiri dari kentang yang berfungsi sebagai
sumber energi, nitrogen organik, karbon dan vitamin, dekstrosa sebagai sumber
karbon, agar sebagai bahan pemadat medium dan aquades sebagai pelarut untuk
menghomogenkan medium dan sumber 𝑂2.

3. Teknik Aseptis

Teknik aseptis sangat diperlukan untuk menghindarkan mikroorganisme dari

kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Teknik aseptis
digunakan sepanjang kegiatan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar
maupun praktikannya, untuk alat dan bahan praktikum dapat diterapkan metode
sterilitas. Penguasaan teknik aseptis ini sangat diperlukan dalam keberhasilan
laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan
yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi.

Teknik aseptis merupakan teknik dasar yang harus dikuasai oleh seorang
analisis mikrobiologi dalam menangani suatu mikroba. Media yang dipakai dalam
teknik aseptis adalah aquades dan media yang dibuat dari Natrium broth.
Penggunaan aquades dimaksudkan untuk menguji seberapa aseptikkah pekerjaan
yang dilakukan oleh seorang analis, karena didalam aquades murni tidak terdapat
bakteri sehingga jika pekerjaannya aseptis maka tidak akan ada bakteri yang tumbuh
pada media, sedangkan jika pekerjaannya tidak aseptis maka pada media akan
menjadi keruh, yang menandakan didalam media terdapat bakteri yang hidup dan
berkembang biak (Pelczar 2008).
 BAB IV
PENUTUP

a. Kesimpulan
1. Sterilisasi bertujuan untuk membebaskan suatu bahan/alat dari segala macam
bentuk kehidupan terutama mikroorganisme yang tidak diinginkan.
2. Teknik sterilisasi dapat dilakukan dengan tekanan uap tinggi menggunakan
autoclave sehingga alat dan media steril. Autoclave dengan suhu 121℃ selama 15-
20 menit.
3. Percobaan ini harus dilakukan secara aseptis untuk menghindari kontaminasi
mikroorganisme yang tidak diinginkan.
4. Sterilisisasi dapat dilakukan secara mekanik, fisik dan kimiawi.
5. Pembuatan media dilakukan dengan 3 metode yaitu media Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB), dan Potato Dextrose Agar (PDA).
6. Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) digunakan sebagai media untuk
menumbuhkan bakteri.
7. Potato Dextrose Agar (PDA) digunakan untuk menumbuhkan fungi atau jamur.
8. Komposisi media sangat penting dalam memenuhi kebutuhan nutrisi sterilisasi
dilakukan bakteri demi mengoptimalkan pertumbuhannya.
 DAFTAR PUSTAKA

Amni U. 2009. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti.

Harry. 2012. Komposisi Nutrient Agar dan Nutrient Broth dan Kegunaannya. Gramedia:
Samarinda.
Irianto, K. 2007. Mikrobiologi Umum. Bandung: CV Yrama Widya.
Irianto, K. 2013. Mikrobiologi Jilid 1. Bandung: CV Yrama Widya.
Sandra. 2013. Mikrobiologi Umum. Jakarta: Erlangga.
Subaghdja, Rickie. 2010. Sterilisasi dan Pengenalan Alat Mikrobiologi. Bandung:
Yudistira.
Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Universitas
Indonesia.