HASIL PENELITIAN

UJI AKTIVITAS ANTI OKSIDAN SERTA PENETAPAN KADAR

FENOLIK DAN FLAVANOID DARI DAUN LIBO (Ficus Septica Burm.F)

OLEH:

WA ODE RISKI AULIA RAMADHANI

O1A1 16 124

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
SEPTEMBER 2020
ii
 DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL …………………………………………………... i

HALAMAN PERSETUJUAN…………………………………………... ii
DAFTAR ISI………………………………………………....................... iii
DAFTARTABEL ………………………………………………............... v
DAFTAR GAMBAR ………………….……………………………......... vi
ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN ………………………………... vii
ABSTRAK …………………………………………………...................... ix
ABSTRACT ……………………………..…………………...................... x
BAB I PENDAHULUAN………………………………………………… 1
1.1. Latar Belakang…………………..………………………………… 1
1.2. Rumusan Masalah………………………………………………… 3
1.3. Tujuan Penelitian…………………………………………………. 3
1.4. Manfaat Penelitian…………………………..……………………. 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA………………………………………… 5

2.1. Tanaman Libo (ficus septica burm) …………………………….. 5
2.2. Tahapan Pembuatan Simplisia………………………….………… 9
2.3. Ekstraksi………………………………………………................... 11

2.4. Radikal Bebas…………………………………………………....... 13

2.5. Antioksidan………………………………………………............... 14
2.6. Metode-Metode Pengujian Antioksidan………………………….. 16
2.7. Penetapan Kadar Fenolik…………………………………………. 22
2.8. Penetapan Kadar Flavonoid………………………………………. 23
2.9. Spektrofotometri UV-VIS…………………………………………. 23
2.10. Kerangka Konsep……………………………………………….. 25

iii
BAB III METODE PENELITIAN……………………………………… 26
3.1. Waktu dan Tempat………………………………………………… 26
3.2. Jenis Penelitian………………………………………………......... 26
3.3. Bahan Peneitian…………………………………………………… 26
3.4. Alat yang digunakan………………………………………………. 26
3.5. Variabel Penelitian………………………………………………… 27
3.6. Definisi Operasional………………………………………………. 27
3.7. Prosedur Penelitian………………………………………………... 27

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………… 37

4.1 Determinasi Tanaman Libo ……………………………………...... 37
4.2 Penyiapan Sampel…………………………………………………. 37
4.3 Ekstraksi Daun Libo………………………………………………. 38
4.4 Fraksinasi Daun Libo……………………………………………… 38
4.5 Skrining Fitokimia ………………………………………………… 39
4.6 Uji Aktivitas Antioksidan (Metode DPPH dan ABTS)…………… 43
4.7 Penetapan Kadar Flavanoid Total…………………………………. 49
4.8 Penetapan Kadar Fenolik Total……………………………………. 52

BAB V PENTUP……………………………………………………….... 56
5.1 Kesimpulan …………………………............................................... 56
5.2 Saran ………………………………………………………………. 56

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………….............. 57
LAMPIRAN……………………………………………............................. 57

iv
 DAFTAR TABEL
Nomor Teks Halaman
Tabel 2.1 Sifat antioksidan 20
Tabel 4.1 Hasil fraksi daun libo 38
Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol, dan fraksi 39
Tabel 4.3 Hasil uji aktivitas antoksidan metode DPPH 44
Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antioksidan metode ABTS 47
Tabel 4.5 Hasil kadar flavonoid total pada ekstrak dan fraksi 49
Tabel 4.6 Hasil kadar fenolik total pada ekstrak dan fraksi 52

v
 DAFTAR GAMBAR

Nomor Teks Halaman

Gambar 2.1. Daun Libo 5
Gambar 2.2. Struktur Alkaloid 7
Gambar 2.3. Struktur Flavonoid 7
Gambar 2.4. Struktur saponin 8
Gambar 2.5. Struktur tanin 9
Gambar 2.6. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan 20
Gambar 2.7. Struktur Asam Galat 23
Gambar 2.8. Kerangka Konsep 27
Gambar 4.1. Aktivitas antioksidan metode DPPH 44
Gambar 4.2. Aktivitas antioksidan metode ABTS 47
Gambar 4.3. Hubungan antara kandungan flavonoid dan IC50 DPPH 49
Gambar 4.4. Hubungan antara kandungan flavonoid dan IC50 ABS 51
Gambar 4.5. Hubungan antara kandungan fenolik dan IC50 DPPH 54
Gambar 4.6. Hubungan antara kandungan fenolik dan IC50 ATBS 54

vi
 ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN
% : Persen
(Cu (II) -Nc) : Copper (II) – neocuproine
< : Kurang dari
µg : microgram
ABTS : 2, 2-Azinobis 3-ethyl benzothiazoline 6- sulfonic acid
AlCl3 : Aluminium klorida
APX : Asam askorbat peroksidase
BHA : Butylated hydroxyanisole
BHT : Butylated hydroxytoluene
CAT : Katalase
cm : Senti meter
CUPRAC : Cupric ion reducing antioxidant capacity
DPPH : 2,2 difenil l pikrilhidrazil
FIC : Ferrous Ion Chelating
FIC : Ferrous Ion Chelating
FRAP : Ferric Reducing Antioxidant Power
g : Gram
GR : Glutation reduktase
IC50 : Inhibitory Concentration 50%
L : Liter
m : Meter
M : Molaritas
mg : Miligram
mL : Milliliter
mm : Millimeter
mM : Mili molar
N : Normalitas
nm : Nano meter
°C : Derajat celsius
ORAC method : Oxygen Radical Absorbance Capacity method

vii
p.a. : Pro Analisis
PAM : Perusahaan air minum
PG : Propil galat
POX : Peroksidase
ppm : Part per million
PPO : Polifenol oksidase
PRSC method : Peroxyl Radical Scavenging Capacity method
ROS : Reactive Oxygen Species
SOD : Superoxide dismutase
TBHQ : Tert-butyl hydroquinone
TEAC method : Trolox Equivalent Antioxidant Capacity method
TOSC method : Total Oxyradical Scavenging Capacity method
TPTZ : 2,4,6-tri-(2-pyridyl-s-triazine
TRAP method : Total Radical-Trapping Antioxidant Parametermethod
UV : Ultraviolet
Uv-Vis : Ultraviolet Visibel α : Alfa λmax : Eigenvalue max

viii
 Uji Aktifitas Anti Oksidan Serta Penetapan Kadar Fenolik Dan Flavanoid
Dari Daun Libo (Ficus Septica Burm.F)

Wa ode riski aulia ramadhani

O1A1 16124

ABSTRAK

Antioksidan merupakan molekul yang mampu memperlambat atau mencegah

proses oksidasi berlebihan dalam molekul lain.. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui senyawa metabolit sekunder, mengetahui aktivitas antiksidan,
mengetahui kadar flavonoid dan fenolik total dan korelasi kadar senyawa
flavonoid dan fenolik dalam menghambat radikal bebas. Uji aktivitas antioksidan
dilakukan dengan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
dan metode ABTS (2,2-Azinobis(3ethylbenzothiazoline)6-sulfonic acid. Penetapan
kadar flavonoid total menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan metode
aluminium klorida. Penetapan kadar fenolik total dilakukan dengan metode Folin-
Ciocalteu. Berdasarkan hasil skrining fitokimia ekstrak dan fraksi daun libo
(Ficus septica burm.F) mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid,
flavonoid, terpenoid, fenolik,saponin,dan tanin. Hasil uji aktivitas antioksidan
terhadap metode DPPH dimulai dari ekstrak metanol, fraksi n heksan, frakasi
kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air mempunyai aktivitas antioksidan yang
sangat kuat dengan nilai IC50 berturut-turut 6,70 ppm, 7,30 ppm, 8,50 ppm, 6,00
ppm dan 10,4 ppm dan metode ABTS dimulai dari ekstrak metanol, fraksi n-
heksan, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air mempunyai aktivitas
antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC50 berturut-turut 7,1 ppm, 7,5 ppm,
8,9 ppm, 5,9 ppm, dan 10,6 ppm. dari kedua metode aktivitas yang sangat kuat
terdapat pada fraksi etil asetat. Hasil kadar flavonoid total ekstrak metanol, fraksi
n-heksan,fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air berturut-turut adalah
547,77 mg/g sampel, 652,78 mg/g sampel, 657,77 mg/g sampel, 742,78 mg/g
sampel dan 495,00 mg/g sampel. Hasil kadar fenolik total ekstrak metanol, fraksi
n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air berturut-turut adalah
251,40 mg/g sampel, 261,93 mg/g sampel, 231,93 mg/g sampel, 280,35 mg/g
sampel, dan 75,0 mg/g sampel. Hubungan antara aktivitas antioksidan metode
DPPH dan ABTS dengan kadar flavonoid total berturut-turut adalah 93,3 % dan
97,9 %. Hubungan antara aktivitas antioksidan metode DPPH dan ABTS dengan
kadar fenolik total adalah 88,9 % dan 81,8 %.

Kata Kunci: Ficus Septica Burm.F, metabolit sekunder, aktivitas antioksidan,

flavonoid total, fenolik total.

ix
Antioxidant Activitity Test And Determination Of Total Flavonoids And

Phenolic Of Leaf Libo (Ficus Septica Burm.F)

Wa ode riski aulia ramadhani

O1A1 16124

ABSTRACT

Antioxidants are molecules that are able to slow down or prevent excessive
oxidation in other molecules. This study aims to determine secondary metabolite
compounds, determine the antioxidant activity, know the levels of total flavonoids
and phenolics and correlate levels of flavonoid and phenolic compounds in
inhibiting free radicals. Antioxidant activity tests were carried out using the DPPH
(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) method and the ABTS method (2,2-Azinobis (3
ethylbenzothiazoline) 6-sulfonic acid. Determination of total flavonoid levels
using the UV-Vis spectrophotometer with the aluminum method Chloride
Determination of total phenolic levels was carried out by the Folin-Ciocalteu
method, based on phytochemical screening results of libo leaf extract (Ficus
septica burm.F) containing secondary metabolites of alkaloids, flavonoids,
terpenoids, phenols,saponins, and tannins. starting from methanol extract,
nhexane fraction, chloroform fraction, ethyl acetate fraction and water fraction
have very strong antioxidant activity with IC50 values respectively 6,70 ppm,
7,30 ppm, 8,50 ppm, 6,00 ppm and 10,4 ppm and ABTS method starts from
methanol extract respectively. , n-hexane fraction, chloroform fraction, ethyl
acetate fraction and water fraction have very strong antioxidant activity with IC50
values of successively 7,1 ppm, 7,5 ppm, 8,9 ppm, 5,9 ppm, and 10,6 ppm from
the two very strong activity methods found in the ethyl acetate fraction. The
results of total flavonoid levels of methanol extract, n-hexane fraction, chloroform
fraction, ethyl acetate fraction and water fraction were 547,77 mg/g sample,
652,78 mg/g sample, 657,77 mg/g sample, 742,78 mg/g sample and 495,00 mg/g
sample.The results of total phenolic content of methanol extract, n-hexane
fraction, chloroform fraction, ethyl acetate fraction and water fraction were 251,40
mg/g sample, 261,93 mg/g sample, 231,93 mg/g sample, 280,35 mg/g sample and
75,0 mg/g sample. The relationship between antioxidant activity of DPPH and
ABTS methods with total flavonoid levels were 93,3 % and 97,9 %. respectively.
The relationship between antioxidant activity of DPPH and ABTS methods with
total phenolic levels was 88,9 % and 81,8 %.

Keywords: (Ficus Septica Burm.), antioxidant activity, DPPH, ABTS,

total flavonoids, total phenolics.

x
 BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Radikal bebas adalah sekelompok zat kimia baik berupa atom maupun molekul
yang memiliki elektron tidak berpasangan pada lapisan luarnya atau kehilangan
elektron, sehingga apabila dua radikal bebas bertemu, mereka bisa memakai bersama
elektron tidak berpasangan membentuk ikatan kovalen. Molekul biologi pada
dasarnya tidak ada yang bersifat radikal. Apabila molekul non radikal bertemu
dengan radikal bebas, maka akan terbentuk suatu molekul radikal yang baru. Dapat
dikatakan, radikal bebas bersifat tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron
dari molekul di sekitarnya, sehingga radikal bebas bersifat toksik terhadap molekul
biologi/sel. Radikal bebas dapat mengganggu produksi DNA, lapisan lipid pada
dinding sel, mempengaruhi pembuluh darah, produksi prostaglandin, dan protein lain
seperti enzim yang terdapat dalam tubuh. Radikal bebas yang mengambil elektron
dari DNA dapat menyebabkan perubahan struktur DNA sehingga timbullah sel-sel
mutan. Bila mutasi ini terjadi berlangsung lama dapat menjadi kanker (Werdhasari,
2014).
Stres oksidatif berperan penting dalam patofisiologi terjadinya proses menua
dan berbagai penyakit degeneratif, seperti kanker, diabetes mellitus dan
komplikasinya, serta aterosklerosis yang mendasari penyakit jantung, pembuluh
darah dan stroke. Antioksidan sangat diperlukan oleh tubuh untuk mengatasi dan
mencegah stres oksidatif. Berdasarkan sumbernya, antioksidan dibagi menjadi
antioksidan endogen, yaitu enzim-enzim yang bersifat antioksidan, seperti:
Superoksida Dismutase (SOD), katalase (Cat), dan glutathione peroksidase (Gpx);
serta antioksidan eksogen, yaitu yang didapat dari luar tubuh/makanan. Tubuh
manusia dapat menetralisir radikal bebas bila jumlahnya tidak berlebihan, dengan
mekanisme pertahanan antioksidan endogen. Bila antioksidan endogen tidak
mencukupi, tubuh membutuhkan antioksidan dari luar (Werdhasari, 2014).

1
 Antioksidan eksogen dapat berupa antioksidan alami dan antioksidan buatan.
Antioksidan alami banyak terdapat pada buah-buahan, sayur-sayuran, biji-bijian dan
hewani. Kekhawatiran akan kemungkinan efek samping yang belum diketahui dari
antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi salah satu alternatif
yang sangat dibutuhkan. Di Indonesia, terdapat banyak bahan yang dapat dijadikan
sebagai sumber antioksidan alami. Namun, kurangnya publikasi membuat hanya
sebagian kecil masyarakat yang mengetahui apa saja yang mengandung antioksidan
(Silvia dkk, 2016).
Ficus septica Burm.F adalah salah satu anggota famili Moraceae yang
mengandung senyawa saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, dan polifenol (Hutapea dan
Syamsuhidayat, 1991). Tumbuhan libo (Ficus septica Burm.F) secara empiris
digunakan sebagai obat penyakit kulit, radang usus buntu, gigitan ular berbisa dan
penyakit asma (Sudarsono dan Didik, 2002). Salah satu etnis yang juga terdapat di
Indonesia adalah Suku Muna yang merupakan suku yang berada di Sulawesi
Tenggara, tersebar luas di Kabupaten Muna, Kota Kendari, Kabupaten Buton dan
lain-lain. Secara turun-temurun, sebagian masyarakat Suku Muna telah banyak
menggunakan ramuan dari tumbuhan tradisional yang dipercaya sebagai obat untuk
menyembuhkan penyakit salah satunya adala tanaman libo (Ficus septica Burm.F)
(Kasmawati dkk., 2019).
Senyawa fenolik merupakan senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan sebagai
respons terhadap stres lingkungan. Senyawa fenolik berfungsi sebagai pelindung
terhadap sinar UV-B dan kematian sel untuk melindungi DNA dari dimerisasi dan
kerusakan Komponen pada senyawa ini diketahui memiliki peranan penting sebagai
agen pencegah dan pengobatan beberapa gangguan penyakit seperti arteriosklerosis,
disfungsi otak, diabetes dan kanker. Kelompok terbesar dari senyawa fenolik adalah
flavonoid. Setiap tumbuhan umumnya mengandung satu atau lebih senyawa
kelompok flavonoid dan memiliki komposisi kandungan flavonoid yang khas.
Flavonoid terdapat hampir di semua bagian tumbuhan, seperti daun, akar, kulit

2
tepung sari, nektar, bunga, buah dan biji Senyawa flavonoid memiliki aktivitas
antioksidan yang dapat meningkatkan pertahanan diri dari penyakit yang diinduksi
oleh radikal bebas (Hanin dan pratiwi, 2017).
Berdasarkan latar belakang terserbut, maka peneliti tertarik untuk melakukan
penelitian tentang uji aktivitas antioksidan dan penetapan kadar fenolik dan favanoid
dari hasil ekstrak dan fraksi daun libo (Ficus septica Burm.F).
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang di atas masalah yang dapat dikaji dalam
penelitian ini yaitu:
a. Golongan senyawa apa saja yang terkandung dalam ekstrak dan fraksi daun
libo Ficus septica Burm.F ?
b. Apakah ekstrak dan fraksi daun libo (Ficus septica Burm.F) memiliki potensi
aktivitas sebagai antioksidan terhadap radikal DPPH dan ABTS?
c. Berapa kadar total flavanoid pada ektrak dan fraksi daun libo (Ficus septica
Burm.F) ?
d. Berapa kadar total fenolik pada ektrak dan fraksi daun libo (Ficus septica
Burm.F)?
e. Berapa kemampuan senyawa fenolik dan flavanoid dalam menghambat radikal
bebas ?
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini,yaitu :

a. Untuk mengetahui golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam

ekstrak dan fraksi daun libo (Ficus septica Burm.F).
b. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun libo (Ficus
septica Burm.F).
c. Untuk mengetahui kadar total flavanoid pada ekstrak dan fraksi daun libo
(Ficus septica Burm.F)

3
d. Untuk mengetahui kadar fenolik total pada ektrak dan fraksi daun libo (Ficus
septica Burm.F)
e. Untuk mengetahui kemampuan senyawa fenolik dan flavanoid dalam
menghambat radikal bebas ?
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini adalah:
a. Bagi peneliti, menambah ilmu pengetahuan dan keahlian dalam penelitian
khususnya dalam penelitian antioksidan dari bahan alam.
b. Bagi ilmu pengetahuan, dapat memberikan informasi yang dapat
dipertanggungjawabkan secara ilmiah mengenai manfaat ekstrak metanol dan
fraksi n-heksan, fraksi etila setat, fraksi klorofom, dan fraksi air daun libo
(Ficus septica Burm.F) sebagai antioksidan.
c. Bagi institusi, mewujudkan peran Universitas Halu Oleo khususnya Fakultas
Farmasi dalam mengkaji permasalahan yang terjadi di masyarakat terkait
tanaman obat.
d. Bagi masyarakat, memberikan informasi ilmiah kepada masyarakat terhadap
tumbuhan pohon daun libo (Ficus septica Burm.F) sebagai antioksidan.

4
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanamma Libo (Ficus Septica Burm.F)

a. Karakteristik dan morfologi
Perdu tinggi lebih kurang 1-5 meter. Ranting bulat silindris, berongga, gundul.
Daun penumpu tunggal, besar, sangat rucing. Daun berseling atau berhadapan,
bertangkai 2,5-5 cm, helaian daun oval atau oval bulat telur, dengan pangkal
membulat dan ujung menyempit, cukup tumpul, tepi rata, 9-30 kali 9-16 cm, daun
bagian atas berwarna hijau tua mengkilat, dengan banyak bintik-bintik pucat, bagian
samping. Tulang daun kedua belah sisi menyolok karena warnanya yang pucat. Buah
periuk berpasangan, bertangkai pendek, pada pangkalnya dengan 3 daun pelindung,
hijau muda atau hijau abu-abu, diameter ± 1,5 cm, pada beberapa tanaman ada bunga
jantan dan bunga gal, pada yang lain bunga betina. Banyak di dapat di hutan, rimba,
semak, di tepi jalan (Steenis, 2005).
b. Klasifikasi (Hutapea dan Syamsuhidayat, 1991).
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Ordo : Urticales
Famili : Moraceae
Genus : Ficus
Gambar 2.1: Ficus septica Burm. F
Spesies : Ficus septica Burm. F
(Hutapea dan Syamsuhidayat, 1991

c. Nama lokal
Jawa Ki ciyat (Sunda), Awar-awar (Jawa tengah ), Barabar (Madura),
Awakawak (Bali), Sulawesi Loloyan (Minahasa), Tobo-tobo (Makassar), Dausalo
(Bugis), Babu lutu (Halmahera), Tagalolo (Ternate), Sirih popar (Ambon) (Hutapea

5
dan Syamsuhidayat, 1991). Untuk daerah Sulawesi tenggara sendiri tanaman Ficus
Septica Burm.F biasa di sebut dengan tanaman libo.
d. Khasiat empiris
Ficus septica Burm adalah salah satu anggota famili Moraceae yang
mengandung senyawa saponin, flavonoid alkaloid, tanin, dan polifenol (Hutapea dan
Syamsuhidayat, 1991). Tumbuhan libo (Ficus septica Burm.F) secara empiris
digunakan sebagai obat penyakit kulit, radang usus buntu, gigitan ular berbisa dan
penyakit asma (Sudarsono dan Didik, 2002).
e. Seyawa Metabolit Sekunder
Metabolit sekunder berupa molekul-molekul kecil, bersifat spesifik (tidak
semua organisme mengandung senyawa sejenis), mempunyai struktur yang
bervariasi, setiap senyawa memiliki fungsi atau peranan yang berbeda-beda. Pada
umumnya senyawa metabolit sekunder berfungsi untuk mempertahankan diri atau
untuk mempertahankan eksistensinya di lingkungan tempatnya berada. Metabolit
sekunder merupakan biomolekul yang dapat digunakan sebagai lead compounds
dalam penemuan dan pengembangan obat-obat baru. Senyawa metabolit sekunder
yang umum terdapat pada tanaman adalah : alkaloid, flavanoid, steroid, saponin,
terpenoid dan tannin (Ergina dkk., 2014).
1) Alkaloid
Menurut (Anggraito dkk., 2018 dalam buku metabolit sekunder dari tanaman
aplikasi dan produksi) Senyawa alkaloid mengandung satu atau lebih senyawa
nitrogenpada bagian cincin heterosiklik. Alkaloid memiliki efek antioksidan, melalui
aktivitasnya sebagai scavenger. Gugus indol pada senyawa alkaloid, mampu
menghentikan reaksi berantai radikal bebas secara efisien. Sebagai antioksidan,
alkaloid mampu melindungi sel dari toksisitas dan kerusakan genetik akibat oksidan.

6
 N
Gambar 2.2 Struktur Alkaloid (Robinson, 1995)

2) Flavanoid
Flavonoid merupakan metabolit sekunder yang bertindak sebagai antioksidan
eksogen (Hu et al.,2013). Flavonoid merupakan salah satu senyawa alami yang
banyak ditemukan dalam tumbuhan-tumbuhan dan makanan yang menjanjikan untuk
mengobati berbagai penyakit seperti kanker, antioksidan, bakteri patogen, radang,
disfungsi kardio-vaskular, dan mempunyai kemampuan antioksidannya dalam
mencegah terjadinya luka akibat radikal bebas. Hal ini dikarenakan kemampuan
dalam metilasi flavonoid yang dapat meningkatkan peranan flavonoid dalam bidang
obat-obatan. Metilasi dari flavonoid melalui kelompok hidroksil bebasnya atau atom
C yang dapat meningkatkan stabilitas metaboliknya dan meningkatkan transportasi
membran yang terjadi dalam tubuh. Kemampuan bioaktifitas beberapa golongan
senyawa flavonoid terutama dalam hal antioksidan, dimana aktivitas antioksidan
invitro flavonoid bergantung pada penataan gugus fungsi pada struktur intinya.
Konfigurasi dan jumlah total gugus hidroksil secara substansial mempengaruhi
mekanisme aktivitas antioksidan (Arifin dan Ibrahim, 2018).

OH

Gambar 2.3 Struktur flavonoid (Harborne, 1987)

7
3) Saponin
Saponin adalah golongan senyawa glikosida, dapat membentuk larutan koloidal
dalam air dan membuih bila dikocok. Saponin memberikan rasa pahit menusuk.
Saponin bersifat iritator pada selaput lendir, sehingga memunculkan respon bersin.
Saponin merupakan antioksidan sekunder, mampu menghambat peroksidasi lipid
dengan cara membentuk hidroperoksida. Berdasarkan penelitian Akinpelu et
al.,(2014) saponin memiliki efek antioksidan dan antibakteri. Saponin berfungsi
sebagai antioksidan melalui mekanisme peningkatan pembentukan SOD dan katalase
(Anggraito dkk., 2018).

CO
O
CH 2 OH
OH O
OH

OH

Gambar 2.4 Struktur saponin (Robinson, 1995)

4) Tannin
Tannin adalah salah satu golongan senyawa polifenol yang juga banyak
dijumpai pada tanaman. Tanin dapat didefinisikan sebagai senyawa polifenol dengan
berat molekul yang sangat besar yaitu lebih dari 1000 g/mol serta dapat membentuk
senyawa kompleks dengan protein. struktur senyawa tannin terdiri dari cincin
benzena (C6) yang berikatan dengan gugus hidroksil (-OH). Tanin memiliki peranan
biologis yang besar karena fungsinya sebagai pengendap Protei dan penghelat logam.
Oleh karena itu tannin diprediksi dapat berperan sebagai antioksidan biologis (Noer
dkk., 2018).

8
 O

OH
OH

Gambar 2.4 Struktur tanin (Robinson, 1995)

2.2. Ektraksi
Ekstraksi pelarut yaitu metode pemisahan komponen dari suatu campuran
menggunakan suatu pelarut yang bertujuan untuk menarik zat aktif dalam sampel.
Pelarut yang digunakan didasarkan pada kemampuan melarutkan zat aktif dalam
jumlah yang maksimum, sehingga terbentuklah ekstrak (hasil ekstraksi yang
mengandung berbagai komponen kimia). Prinsip metode ini didasarkan pada
distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak
saling bercampur (Istiqomah, 2013 dalam Susanty dan Fairus, 2016).
Proses ekstraksi dengan menggunakan pelarut secara umum dapat dilakukan
dengan dua metode. Ekstraksi dingin meliputi maserasi dan perkolasi dan ekstraksi
panas meliputi ekstrkasi refluks, ekstraksi soxlet, digesi, infusa dan dekok (Depkes
RI, 2000).
2.3. Tahapan Pembuatan Simplisia
Pada umumnya pembuatan simplisia melalui tahapan seperti berikut :
Pengumpulan simplisia, sortasi basah, pencucian, perajangan, pengeringan, sortasi
kering, pengepakan dan penyimpanan (Wahyuni dkk., 2014).

a. Pengumpulan simplisia
Kadar senyawa aktif dalam suatu simplisia berbeda-beda, dipengaruhi oleh
beberapa faktor seperti bagian tanaman yang digunakan, waktu panen dan lingkungan
tempat tumbuh (Suharmiati dan Herti, 2003).

9
b. Sortasi Basah.
Dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya
dari tumbuhan sebelum pencucian dengan cara membuang bagian-bagian yang tidak
perlu sebelum pengeringan, sehingga didapatkan herbal yang layak untuk digunakan.
Cara ini dapat dilakukan secara manual (Wahyuni dkk., 2014).
c. Pencucian
Dilakukan untuk menghilangkan tanah dan pengotor lainnya yang melekat pada
tumbuhan. Pencucian dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air
sumur atau air PAM. Pencucian dilakukan sesingkat mungkin agar tidak
menghilangkan zat berkhasiat dari tumbuhan tersebut (Wahyuni dkk., 2014).
d. Perajangan
Perajangan dilakukan untuk mempermudah proses pengeringan, pengepakan
dan penggilingan. Sebelum dirajang tumbuhan dijemur dalam keadaan utuh selama 1
hari. Perajangan dapat dilakukan dengan pisau, dengan alat mesin perajang khusus
sehingga diperoleh irisan tipis atau potongan dengan ukuran yang dikehendaki
(Wahyuni dkk., 2014).
e. Pengeringan
Dilakukan pengeringan dengan 3 cara yaitu:
1) Dikering anginkan
2) Terpapar cahaya matahari langsung
3) Dengan menggunakan Oven. Pengeringan ini berlangsung hingga di peroleh
kadar air ≤ 10% (Wahyuni dkk., 2014).
f. Sortasi Kering
Dilakukan untuk memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian
tanaman yang tidak diinginkan dan pengotoran-pengotoran lain yang masih ada dan
tertinggal pada simplisia kering. Proses ini dilakukan secara manual (Wahyuni dkk.,
2014).

10
g. Pengepakan dan penyimpanan
Selama penyimpanan ada kemungkinan terjadi kerusakan pada simplisia.
Untuk itu dipilih wadah yang bersifat tidak beracun dan tidak bereaksi dengan isinya
sehingga tidak menyebabkan terjadinya reaksi serta penyimpangan warna, bau, rasa
dan sebagainya pada simplisia. Untuk simplisia yang tidak tahan panas diperlukan
wadah yang melindungi simplisia terhadap cahaya, misalnya aluminium foil, plastik
atau botol yang berwarna gelap, kaleng dan sebagainya. Penyimpanan simplisia
kering biasanya dilakukan pada suhu kamar (150˚C sampai 300˚C) (Wahyuni dkk.,
2014).
a. Ekstraksi dingin
1) Perkolasi
Pada metode perkolasi, serbuk sampel dibasahi secara perlahan dalam sebuah
perkolator (wadah silinder yang dilengkapi dengan kran pada bagian bawahnya).
Pelarut ditambahkan pada bagian atas serbuk sampel dan dibiarkan menetes perlahan
pada bagian bawah. Kelebihan dari metode ini adalah sampel senantiasa dialiri oleh
pelarut baru. Sedangkan kerugiannya adalah jika sampel dalam perkolator tidak
homogen maka pelarut akan sulit menjangkau seluruh area. Selain itu, metode ini
juga membutuhkan banyak pelarut dan me-makan banyak waktu (Mukhariani, 2014).
2) Maserasi
Maserasi merupakan metode sederhana yang paling banyak digunakan. Cara ini
sesuai, baik untuk skala kecil maupun skala industri. Metode ini dilakukan dengan
memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang
tertutup rapat pada suhu kamar. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai
kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam
sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan
penyaringan. Kerugian utama dari metode maserasi ini adalah memakan ban-yak
waktu, pelarut yang digunakan cukup banyak, dan besar kemungkinan beberapa
senyawa hilang. Selain itu, beberapa sen-yawa mungkin saja sulit diekstraksi pada

11
suhu kamar. Namun di sisi lain, metode maserasi dapat menghindari rusaknya sen-
yawa-senyawa yang bersifat termolabil (Mukhariani, 2014).
b. Ekstraksi panas
1) Refluks
Refluks adalah proses ekstraksi dengan pelarut yang didihkan beserta simplisia
selama waktu tertentu dan jumlah pelarutnya konstan, karena pelarut terus
bersirkulasi didalam refluks (menguap, didinginkan, kondensasi, kemudian menetes
kembali ke menstrum (campuran pelarut dan simplisia) di dalam alat). Umumnya
dilakukan pengulangan pada residu pertama, hingga didapat sebanyak 3-5 kali hingga
didapat proses ekstraksi sempurna (exhaustive extraction) (Depkes RI, 2000).
2) Soxhletasi atau ekstraksi sinambung
Soxhletasi atau ekstraksi sinambung adalah proses ekstraksi dengan
menggunakan pelarut yang selalu baru dengan menggunakan soxhlet. ekstrasi terjadi
secara kontinyu,dengan jumlah pelarut yang relatif konstan (Depkes RI, 2000).
3) Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik (maserasi dengan pengadukan konstan) yang
dilakukan pada suhutemperatur yang lebih tinggi, umumnya 40-50 Celcius (Depkes
RI, 2000).
4) Infus dan dekok
Infus adalah ekstraksi dengan menggunakan air yang mendidih pada suhu 96-
98oC, dalam waktu tertentusekitar 15-20 menit, sedangkan dekok adalah proses infus
yang terjadi selama skitar 30 menit lebih dan temperature terukur sampai titik diidh
air, untuk dekok sekarang sudah sangat jarang digunakan (Depkes RI, 2000).

b. Ekstrak cair-cair
Menurut (Laddha dan Degaleesan., 1978 dalam Mirwan., 2013) ekstraksi cair-
cair atau yang dikenal dengan ekstraksi solvent merupakan proses pemisahan fase
cair yang memanfaatkan perbedaan kelarutan zat terlarut yang akan dipisahkan antara
larutan asal dan pelarut pengekstrak (solvent). Aplikasi ekstraksi cair-cair terbagi

12
menjadi dua kategori yaitu aplikasi yang bersaing langsung dengan operasi
pemisahan lain dan aplikasi yang tidak mungkin dilakukan oleh operasi pemisahan
lain. Apabila ekstraksi cair-cair menjadi operasi pemisahan yang bersaing dengan
operasi pemisahan lain, maka biaya akan menjadi tolak ukur yang sangat penting.
Prinsip dasar ekstraksi cair-cair ini melibatkan pengontakan suatu larutan dengan
pelarut (solvent) lain yang tidak saling melarut (immisible) dengan pelarut asal yang
mempunyai densitas yang berbeda sehingga akan terbentuk dua fase beberapa saat
setelah penambahan solvent. Hal ini menyebabkan terjadinya perpindahan massa dari
pelarut asal ke pelarut pengekstrak (solvent). Perpindahan zat terlarut ke dalam
pelarut baru yang diberikan, disebabkan oleh adanya daya dorong (dirving force)
yang muncul akibat adanya beda potensial kimia antara kedua pelarut. Sehingga
proses ektraksi cair-cair merupakan proses perpindahan massa yang berlangsung
secara difusional.
Ekstraksi cair-cair berguna untuk memisahkan analit yang dituju dari
penggangu dengan cara melakukan partisi sampel antara dua pelarut yang tidak saling
bercampur. Sala satu fasenya seringkali berupa air dan fase yang lain adalah pelarut
organik seperti n-heksan. Senyawa-senyawa yang bersifat polar akan ditemukan
dalam fase air, sementara senyawa-senyawa yang bersifat hidrofobik akan masuk
pada pelarut organik. Analit yang terekstraksi ke dalam pelarut organic akan mudah
diperoleh kembali dengan cara penguapan pelarut (Rohman, 2009).
2.4. Radikal bebas
Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang mengandung satu atau
lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Senyawa radikal bebas
timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, berupa hasil samping
dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernafas,
metabolisme sel, olahraga berlebihan, peradangan atau ketika tubuh terpapar polusi
lingkungan seperti asap kendaraan bermotor, asap rokok, bahan pencemar dan radiasi
matahari atau radiasi kosmis. Radikal bebas dalam tubuh ini bersifat sangat reaktif

13
dan akan berinteraksi secara destruktif melalui reaksi oksidasi dengan bagian tubuh
maupun sel-sel tertentu yang tersusun atas lemak, protein, karbohidrat, DNA, dan
RNA sehingga memicu berbagai penyakit seperti jantung koroner, penuaan dini dan
kanker. Oleh sebab itu dibutuhkan antioksidan untuk mengatasi radikal bebas
(Rosahdi, dkk., 2013).

Menurut (Desrosier, 1998 dalam Khairan 2010) sumber radikal bebas ada yang
bersifat internal yaitu dari dalam tubuh dan ada yang bersifat eksternal dari luar
tubuh. Radikal bebas internal berasal dari oksigen yang kita hirup. Oksigen yang
biasa dihirup adalah penopang utama kehidupan karena menghasilkan banyak energi
namun hasil samping dari reaksi pembentukkan anergi tersebut akan menghasilakan
Reactive Oxygen Species (ROS). Sedangkan radikal eksternal berasal dari polusi
udara, alkohol, rokok, radiasi sinar ultra violet, obat-obatan tertentu seperti
kemoterapi, anestesi, dan peptisida.

2.5. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donors).
Antioksidan mampu menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh.
Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektron kepada senyawa yang
bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan dapat dihambat dan radikal
bebas pun tidak terbentuk (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Antioksidan bekerja dengan cara mencegah pembentukan senyawa radikal
baru, yaitu mengubah radikal bebas menjadi molekul yang berkurang dampak
negatifnya sebelum senyawa radikal bebas bereaksi. Antioksidan memiliki sifat
pemutus reaksi berantai (chain-breaking antioxidant) dan memperbaiki kerusakan
biomolekul sehingga mengubah senyawa radikal menjadi produk-produk yang lebih
stabil (Sayuti dan Yenrina, 2015).
Mekanisme antioksidan dalam menghambat reaksi oksidasi dapat disebabkan
oleh empat macam mekanisme, yaitu: pelepasan hidrogen dari antioksidan, pelepasan
elektron dari antioksidan, adisi asam lemak ke cincin aromatik pada antioksidan, serta

14
pembentukan senyawa kompleks antara lemak dan cincin aromatik dari antioksidan
(Sayuti dan Yenrina, 2015).
Antioksidan dapat berupa antioksidan alami dan antioksidan buatan.
Antioksidan alami banyak terdapat pada hewani, mineral dan tumbuhan seperti yang
ada pada tanaman yaitu buah-buahan, sayur-sayuran dan biji-bijian. Antioksidan
buatan atau sintetis merupakan antioksidan yang berasal dari bahan-bahan kimia
seperti butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), propil
galat (PG) dan tert-butyl hydroquinone (TBHQ) (Pristiadi, 2010). Namun
Kekhawatiran akan kemungkinan efek samping yang belum diketahui dari
antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi salah satu alternatif
yang sangat dibutuhkan Menurut (Inggrid dkk., 2014 dalam silvia, dkk., 2016).
Mekanisme pertahanan terhadap antioksidan terbagi dalam 3 jenis yaitu primer,
sekunder, dan tersier : (Ardie, 2011).
a. Mekanisme primer
Mekanisme pertahanan primer bekerja melalui prinsip netralisir radikal bebas
yaitu dengan memberikan satu elektron kepada molekul yang reaktif. Contoh
antioksidan ini adalah tokoferol, asam askorbat, dan flavonoid (Ardie, 2011).
b. Mekanisme sekunder
Mekanisme pertahanan sekunder bekerja dengan cara mengikat logam dan
menyingkirkan logam transisi yang dapat memicu radikal bebas. Contoh antioksidan
ini adalah albumin, dan transferin (Ardie, 2011).
c. Mekanisme tersier
Mekanisme pertahanan tersier bekerja dengan mencegah penumpukan
biomolekul agar tidak menimbulkan kerusakan lebih lanjut. Contohnya seperti
perbaikan DNA yang rusak oleh enzim metionin reduktase dan protein teroksidasi
oleh enzim proteolitik (Ardie, 2011).

15
2.6. Metode-Metode Pengujian Antioksidan

Metode Pengujian aktivitas antioksidan pada tanaman dan bahan pangan

umumnya dapat menggunakan metode yang berbasis air 2,2-difenil-1- pikrilhidrazil
(DPPH) (reaksi dengan radikal bebas), Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)
(reaksi reduksi-oksidasi), metode CUPRAC (Cupric ion reducing antioxidant
capacity), Ferrous Ion Chelating (FIC) (reaksi kelat atau melalui pembentukan
komplek), dan yang berbasis lemak misalnya dengan Thiobarbituric acid (TBA),
metode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity method), metode TRAP (total
Radical-Trapping Antioxidant Parameter method), metode TEAC (metode Trolox
Equivalent Antioxidant Capacity), metode PRSC (Peroxyl Radical Scavenging
Capacity method), metode TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity method),
(Moon dan Shibamoto 2009; Liu et al., 2006. Banyaknya metode uji aktivitas
antioksidan tersebut dapat memberikan hasil uji yang beragam. Hal tersebut
diakibatkan oleh adanya pengaruh dari struktur kimiawi antioksidan, sumber radikal
bebas, dan sifat fisiko-kimia sediaan sampel yang berbeda (Maesaroh, dkk., 2018).
a. Metode FRAP
Menurut (Benzie dan Strain 1996 dalam Halvorsen, et al., 2002)
mengemukakan bahwa metode FRAP adalah metode yang digunakan untuk menguji
antioksidan dalam tumbuh-tumbuhan. Metode ini dapat menentukan kandungan
antioksidan total dari suatu bahan berdasarkan kemampuan senyawa antioksidan
untuk mereduksi ion Fe3+ menjadi Fe2+ sehingga kekuatan antioksidan suatu senyawa
dianalogikan dengan kemampuan mereduksi dari senyawa tersebut. Prinsip dari uji
FRAP adalah reaksi transfer elektron dari antioksidan ke senyawa Fe 3+ - TPTZ.
Senyawa Fe3+ - TPTZ sendiri mewakili senyawa oksidator yang mungkin terdapat
dalam tubuh dan dapat merusak sel-sel.
Hasil pengujian diinterpretasikan dengan peningkatan absorbansi pada panjang
gelombang 593 nm dan dapat disimpulkan sebagai jumlah Fe 2+ (dalam
mikromolekular) ekuivalen dengan antioksidan standar. Penentuan nilai TAC (Total

16
Antioxidant Capacity) pada sampel dilakukan dengan mencampurkan reagen FRAP
dengan ekstrak sampel. Dalam reagen FRAP terdapat campuran TPTZ, FeCl3 dan
buffer asetat, sehingga reagen FRAP merupakan senyawa komplek Fe3+-TPTZ yang
tidak berwarna (berbeda dengan komplek Fe2+ yang berwarna biru). Senyawa Fe3+-
TPTZ mewakili senyawa oksidator yang mungkin terdapat di dalam tubuh dan dapat
merusak sel-sel tubuh, sedangkan ekstrak sampel mengandung antioksidan yang
kemudian dapat mereduksi Fe3+-TPTZ menjadi Fe2+- TPTZ sehingga senyawa Fe3+-
TPTZ tidak akan melakukan reaksi yang merusak sel-sel tubuh. Semakin banyak
konsentrasi Fe3+- TPTZ yang direduksi oleh sampel menjadi Fe2+-TPTZ, maka
aktivitas antioksidan dari sampel juga semakin besar (Pisoschi dan Gheorghe, 2011).
Menurut (Ou et al., 2002 dalam Karadag., 2009) kelebihan metode FRAP ini
yaitu metodenya murah, reagennya mudah disiapkan dan cukup sederhana dan cepat.
Kekurangan FRAP tidak dapat mendeteksi senyawa yang bertindak dengan
pendinginan radikal (H transfer), terutama tiol dan protein.
b. Metode CUPRAC

Pengujian antioksidan dilakukan juga dengan metode CUPRAC merupakan

salah satu metode untuk melihat daya antioksidan senyawa-senyawa polifenol, dan
Vitamin E yang dikenal mudah untuk dilakukan dan berbiaya rendah. Metode ini
menggunakan reagen copper (II) - neocuproine (Cu(II)-Nc). Metode ini dapat juga
digunakan untuk mengetahui kapasitas antioksidan senyawa- senyawa fenolik (Apak,
2008). Kelebihan dari metode CUPRAC adalah pereaksi yang digunakan cukup cepat
bekerja, selektif, lebih stabil, mudah didapatkan dan mudah untuk diaplikasikan
(Erawati, 2012).
Keuntungan lain dari metode CUPRAC adalah: (a) reagen CUPRAC cukup
cepat untuk mengoksidasi tiol-jenis antioksidan, sedangkan metode FRAP tidak
mengukur antioksidan tiol-jenis tertentu seperti glutathione; (b) reagen lebih stabil
dan dapat diakses dari reagen kromogenik lainnya (misalnya, ABTS, DPPH); (c)
mudah dan diversely berlaku di laboratorium; (d) reaksi redoks menghasilkan spesies

17
berwarna yang dilakukan pada pH 7 sebagai penyangga yang bertentangan dengan
kondisi asam dari FRAP (pH 3,6) atau kondisi dasar dari uji Folin-Ciocalteu (pH 10);
(f) metode ini secara bersamaan dapat mengukur antioksidan hidrofilik dan lipofilik
tidak seperti FCR dan DPPH (Apak et al. 2008 ). Metode CUPRAC dapat dilakukan
dalam hitungan menit untuk asam askorbat, asam urat, asam galat, dan quercetin
tetapi untuk molekul yang lebih kompleks membutuhkan waktu 30 - 60 menit.
Kekurangan pengujian reduksi tembaga masih memiliki masalah yang sama dengan
campuran antioksidan yang kompleks dalam hal memilih waktu reaksi yang tepat
(Prior et al. 2005 ).
c. Metode DDPH
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara in vitro dengan metode
DPPH. DPPH (2,2 difenil-1- pikrihidrazil) merupakan suatu senyawa radikal yang
bersifat stabil. DPPH digunakan untuk mengetahui aktivitas antioksidan melalui
kemampuannya dalam menangkap radikal bebas. Aktivitas antioksidan diukur
berdasarkan transfer elektron yang dilakukan oleh antioksidan. Semula DPPH yang
berwarna ungu pekat memberikan serapan pada panjang gelombang 517 nm namun
setelah mengalami reduksi maka DPPH akan berubah menjadi senyawa difenil pikril
hidrazin yang warnanya akan berangsur-angsur memudar menjadi warna kuning dan
nilai serapannya akan sebanding dengan jumlah elektron yang diterima (Sunarni,
2007).
Kelebihan metode DPPH ini yaitu metodenya yang sederhana, mudah, cepat,
peka, serta memerlukan sampel dalam jumlah kecil. Mudah diterapkan karena
senyawa radikal DPPH yang digunakan bersifat relatif stabil dibanding metode
lainnya. Prinsip dari metode ini adalah adanya donasi atom hidrogen (H+) dari
substansi yang diujikan kepada radikal DPPH menjadi senyawa non radikal difenil
pikril hidrazin yang akan ditunjukkan oleh perubahan warna. Perubahan warna yang
terjadi adalah perubahan warna dari ungu menjadi kuning, di mana intensitas
perubahan warna DPPH berbanding lurus dengan aktivitas antioksidan untuk

18
meredam radikal bebas tersebut (Rahmawati, dkk., 2015). Metode ini sangat umum
digunakan karena sangat sesuai untuk mengukur aktivitas total antioksidan baik
dalam pelarut polar atau larut air maupun dalam pelarut non polar atau larut minyak
(Prakash, 2001). Selain itu, metode ini akurat dan praktis (Haeri dkk., 2018).
mempunyai tingkat sensitivitas tinggi serta dapat menganalisa sejumlah besar sampel
dalam jangka waktu yang singkat (Nurhasnawati dkk., 2017).
Ada beberapa kekurangan yang membatasi penerapannya. DPPH hanya dapat
dilarutkan dalam media yang organik (terutama di media yang beralkohol), tidak
dalam media air, yang merupakan batasan penting ketika melihat peran antioksidan
hidrofilik dan kurangnya keterkaitan langsung hasil uji kapasitas antioksidan dengan
kemampuan antioksidan didalam sistem pangan yang sesungguhnya (Arnao 2000
dalam Karadag, 2009).

NO2 NO2

H
O2 N N N +R-H O2 N N N +R

NO2 NO2

1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazin
(radikal bebas) (nonradikal)

Gambar 2 6. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan (Windono dkk, 2001).

d. Metode ABTS/TEAC
Metode ABTS (2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline) 6-sulfonic acid/ TEAC
pertama kali dikembangkan oleh Miller dan Rice-Evans pada tahun 1993 dan saat ini
telah banyak mengalami 21 perkembangan. Metode TEAC dikembangkan dalam tiga
periode, TEAC I (ABTS+ dihasilkan secara enzimatik dengan metmioglobin dan
hidrogen peroksidase), TEAC II (radikal dihasilkan dengan filtrasi menggunakan
MnO2 sebagai oksidan), TEAC III (dengan K2S2O8 sebagai oksidan). Dari ketiga
metode tersebut, metode TEAC/ABTS mempunyai kelebihan dibanding yang lainnya
yaitu pengujian yang sederhana, mudah diulang dan yang paling penting adalah

19
fleksibel dan dapat digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan yang bersifat
hidrofilik maupun lifofilik dalam ekstrak makanan dan cairan (Apak et al., 2007).
(Menurut Yu, 2008 dalam Wulansari 2018) Prinsip pengujian adalah
penyetabilan radikal bebas melalui donor proton. Pengukuran aktivitas antioksidan
dilakukan berdasarkan penghilangan warna ABTS yang semula berwarna biru hijau
akan berubah menjadi tidak berwarna apabila tereduksi oleh radikal bebas. Metode
ABTS sangat sensitif terhadap cahaya, bahkan pembentukan ABTS memerlukan
waktu inkubasi selama 12-16 jam dalam kondisi gelap. Intensitas warna yang
terbentuk kemudian diukur menggunakan spektrofotometri visible pada panjang
gelombang 734 nm.
Kelebihan ABTS yaitu memberikan absorbansi spesifik pada panjang gelombang
visible dan waktu reaksi yang lebih cepat. Selain itu, ABTS dapat dilarutkan dalam
pelarut organik maupun air sehingga bisa medeteksi senyawa yang bersifat lipofilik
maupun hidrofilik (Karadag, 2009). Kelebihan lainnya Metode ABTS stabil dan
merupakan pilihan yang baik untuk kombinasi dengan FRAP atau metode DPPH.
DPPH dapat memberikan keuntungan jika antioksidan yang diuji lebih larut dalam
pelarut organik. Oleh karena itu, tiga metode ini memberikan pilihan yang baik untuk
digunakan untuk pengukuran antioksidan, yang dapat memenuhi kebutuhan
penelitian (Ozgen M., 2006). Selain itu kekurangan pengujian menggunakan ABTS
tidak menggambarkan sistem pertahanan tubuh terhadap radikal bebas sehingga
ABTS hanya dapat dijadikan sebagai metode pembanding karena tidak mewakili
sistem biologis tubuh (Karadag, 2009). Metode ABTS sangat sensitif terhadap
cahaya, bahkan pembentukan ABTS, memerlukan waktu inkubasi selama 12-16 jam
dalam kondisi gelap (Setiawan dkk., 2018)
Aktivitas penghambatan radikal dapat dihitung dengan rumus : (Zuhra, dkk.,
2008).
% penghambatan = x 100%

20
 Aktivitas antioksidan dari suatu senyawa dapat digolongkan berdasarkan nilai
IC50 yang diperoleh. Jika nilai IC50 suatu ekstrak berada dibawah 50 ppm maka
aktivitas antioksidannya kategori sangat kuat, nilai IC 50 berada diantara 50-100
ppm berarti aktivitas antiszz oksidannya kategori kuat, nilai IC50 berada di antara
100-150 ppm berarti aktivitas antioksidannya kategori sedang, nilai IC 50 berada di
antara 150-200 ppm berarti aktivitas antioksidannya kategori lemah, sedangkan
apabila nilai IC50 berada diatas 200 ppm maka aktivitas antioksidannya
dikategorikan sangat lemah (Molyneux, 2004).
e. Metode ORAC
Menurut (Ou et al., 2001; Cao et al., 1997; MacDonald-Wicks et Al 2006;
dalam Karadag., 2009) metode ORAC mengukur penghambatan antioksidan dari
oksidasi yang diinduksi radikal peroksil dan mencerminkan aktivitas antioksidan dari
pemecah rantai radikal klasik dengan transfer atom H. Dalam tes dasar, radikal
peroksil dihasilkan dari dekomposisi termal AAPH dalam air atau buffer radikal
hidroksil yang dihasilkan dari Cu2+ -H2O2 bereaksi dengan probe fluorescent, substrat
protein teroksidasi, untuk membentuk produk non fluorescent, yang dapat dengan
mudah diukur dengan fluoresensi. Reaksi pemeriksaan dengan radikal peroksil diikuti
oleh hilangnya intensitas fluoresensi berdasarkan waktu. Versi pertama ORAC tes
menggunakan B-phycoerythrin (B-PE, fluorescent protein) sebagai probe. B-PE
dipilih karena sifatnya panjang gelombang eksitasi, hasil fluoresen tinggi, sensitivitas
terhadap ROS, dan kelarutan air.
Keuntungan metode ORAC yang pertama memberikan sumber radikal yang
dapat dikendalikan yang secara akurat menggambarkan model system pangan dan
fisiologis, dapat dengan mudah diadaptasi untuk mendeteksi antioksidan hidrofilik
dan lipofilik dengan merubah sumber radikal dan palarut, dan mudah diatomasi dan
dapat diadaptasi untuk analisis dengan kapasitas tinggi. Kekurangan Metode ORAC
yaitu variabilitas suhu, kebutuhan peralatan khusus (fluorometer) dan waktu analsis
yang lama (Junaidi, 2007).

21
f. Metode TRAP
Menurut (Schlesier et al. 2002 dalam Karadag, 2009) metode TRAP memonitor
total kemampuan senyawa antioksidan untuk mengganggu reaksi antara radikal
peroksil yang diproduksi oleh AAPH atau ABAP dan probe target. Metode TRAP
menggunakan R-phycoerythrin (R-PE) sebagai probe fluoresen dan kemajuan reaksi
R-PE dengan AAPH dimonitor secara fluorometrik dengan panjang gelombang 495
nm dan 575 nm.
Keuntungan metode TRAP melibatkan inisiasi peroksidasi lipid dengan
memproduksi radikal peroksil yang larut dalam air dan sensitif terhadap semua
antioksidan pemecah rantai yang diketahui; konsep ini sangat berguna untuk
mengukur dan membandingkan kapasitas antioksidan. Kekurangan adalah pengujian
TRAP relatif kompleks dan memakan waktu untuk dilakukan, membutuhkan tingkat
keahlian dan pengalaman yang tinggi (Prior et al. 2005).
Kelemahan lain dari uji TRAP adalah penggunaan jeda waktu yang sesuai
dengan penghambatan akumulasi reagen radikal berwarna dengan kehadiran
antioksidan (misalnya, periode waktu yang dibutuhkan untuk muncul radikal
berwarna dalam media reaksi; Apak et al., 2007 ) Untuk mengukur kapasitas
antioksidan karena tidak setiap antioksidan memiliki fase yang jelas (Karadag, 2009).
2.7. Penetapan Kadar Fenolik
Penetapan kadar fenolik total menggunakan metode Folin Ciocalteau. Metode
ini merupakan metode yang paling umum digunakan untuk menentukan kandungan
fenolik total dalam tanaman dengan pertimbangan bahwa dengan teknik
pengerjaannya lebih sederhana, sensitif, dan reagen Folin Ciocalteau digunakan
karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan folin membentuk larutan yang dapat
diukur absorbansinya. Analisis kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-
Ciocalteu yang absorbansinya diukur pada panjang gelombang 765 nm (Pourmorad
dkk; 2006). Larutan standar yang digunakan adalah asam galat yang merupakan salah
satu fenolik alami dan stabil (Sari dan Noverda, 2017).

22
 O

HO
OH

HO
OH

Gambar 2.7. Struktur Asam Galat

2.8. Penetapan kadar Flavonoid

Penetapan Kadar Flavanoid dilakukan dengan metode kolorimetri dengan
aluminium klorida (AlCl3). Analisis dilakukan dengan pembuatan larutan induk
kuersetin, larutan seri standar, penentuan panjang gelombang, penentuan absorbansi
kadar senyawa flavonoid dan kalibrasi hasil pengukuran dengan standar yang sudah
dibuat. Kuersetin digunakan sebagai larutan induk karena kuersetin dapat membentuk
kompleks antara AlCl3 dengan gugus keto pada atom C-4 dan juga dengan gugus
hidroksil pada atom C-3 atau C5 yang bertetangga dari flavon dan flavonol (Menurut
Chang, dkk., 2002 dalam Syamsul, dkk., 2019). Penentuan Panjang Gelombang
Maksimum (λ Maks) Kuersetin dilakukan melalui running larutan kuersetin pada
range panjang gelombang UV-Vis 400-450 nm (Haeria, dkk., 2018).
2.9. Spektrofotometri UV-VIS
Prinsip kerja Spektrofotometer UV-Vis yaitu apabila cahaya monokromatik
melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (I), sebagian
dipantulkan (lr), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Aplikasi rumus tersebut dalam
pengukuran kuantitatif dilaksanakan dengan cara komparatif menggunakan kurva
kalibrasi dari hubungan konsentrasi deret larutan alat untuk analisa suatu unsur yang
berkadar rendah baik secara kuantitatif maupun secara kualitatif, pada penentuan
secara kualitatif berdasarkan puncak-puncak yang dihasilkan spektrum dari suatu
unsur tertentu pada panjang gelombang tertentu, sedangkan penentuan secara
kuantitatif berdasarkan nilai absorbansi yang dihasilkan dari spektrum dengan adanya
senyawa pengompleks sesuai unsur yang dianalisisnya. Adapun yang melandasi

23
pengukuran spektrofotometer ini dalam penggunaannya adalah hukum Lambert-Beer
yaitu bila suatu cahaya monokromatis dilewatkan melalui suatu media yang
transparan, maka intensitas cahaya yang ditransmisikan sebanding dengan tebal dan
kepekaan media larutan yang digunakan berdasarkan persmaan berikut :

atau

Keterangan :
A = absorbansi
a = koefisien serapan molar
b = tebal media cuplikan yang dilewati sinar
c = konsentrasi unsur dalam larutan cuplikan
Io = intensitas sinar mula-mula
I = intensitas sinar yang diteruskan (Yanlinastuti, dan Syamsul., 2016).

24
2.10 Kerangka Konsep

Radikal bebas merupakan atom atau Antioksidan adalah senyawa kimia atau Antioksidan sintetik memberikan
molekul yang mengandung satu atau zat yang dapat menangkal atau efek toksik dan karsinogenik pada
lebih elektron yang tidak berpasangan mencegah stres oksidatif dari radikal tubuh manusia (Silvia dkk, 2016).
pada orbital terluarnya (Werdhasari, bebas (Werdhasari, 2014). . Antioksidan sintesis
2014).
Radikal bebas antioksidan
Antioksidan alami

IC50 Uji aktivitas

antioksidan Tumbuhan Mineral Hewani

Kadar flavonoid Uji kadar Daun Di dalam daun libo (Ficus septica
total flavonoid Burm.f) mengandung senyawa saponin,
Libo flavonoid alkaloid, tanin, dan polifenol
(Hutapea dan Syamsuhidayat, 1991). Yang
Ekstraksi
Kadar fenolik di percayai secara empiris digunakan
total Uji kadar sebagai obat penyakit kulit, radang usus
Ekstrak buntu, gigitan ular berbisa dan penyakit
fenolik Ekstrak
asma (Sudarsono dan Didik,2002).
Keterangan: = Variabel bebas Fraksinasi
= Variabel terikat
Fraksi
Gambar 2.8. Kerangka Konsep

25
 BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian di Laboratorium Farmasi, Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi,
Universitas Halu Oleo, Kendari waktu penelitian dimulai pada Januari hingga Juni.
2020.

3.2 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang dilakukan di
Laboratorium Farmasi dengan melakukan pengujian aktivitas antioksidan dan
penetapan kadar flavonoid dan fenolik dari ekstrak, fraksi air, fraksi etil asetat, fraksi
kloroform dan fraksi n-heksan daun libo.

3.3 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun Libo (Ficus Septica
Burm.F), metanol (teknis), metanol pa, aquades, asam klorida (HCl), asam nitrat
(HNO3), Kloroform (CHCl3), besi (III) klorida (FeCl3), vitamin C (CH8O6), quarsetin
(C15H10O7), asam galat (C7H6O5), magnesium (Mg), asam asetat anhidrat
((CH3CO)2O), asam sulfat (H2SO4), aluminium klorida (AlCl3), kalium asetat
(CH3CO2K), natrium bikarbonat (Na2CO3), reagen Folin Ciocalteau, radikal DPPH
(Sigma-Aldrich®), (K2S2O8) kalium persulfat, radikal ABTS.

3.4 Alat yang digunakan

Alat yang digunakan dalam penelitian yaitu adalah batang pengaduk (Pyrex®),
gelas kimia (Pyrex®), gelas ukur (Pyrex®), corong pisah (Pyrex®), pipet tetes, pipet
ukur, cawan porselin, labu takar, tabung reaksi (Pyrex®), sendok tanduk, rak tabung
reaksi, toples kaca, spatula, mikropipet (Eppendorf®), kertas saring biasa, (Explorer
Ohaus®), hot plate (Stuart®), rotary vaccum evaporator (Rotavapor®R-300),
spektrofotometer

26
3.5 Variabel Penelitian
a. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi fraksi dan ekstrak metanol
daun libo.
b. Variabel terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah IC50, kadar total flavonoid dan
kadar total fenolik.
3.6 Definisi Operasional
Untuk menghindari adanya kekeliruan maka dijelaskan definisi operasional
variabel sebagai berikut:
a. Ekstrak metanol daun libo adalah ekstrak yang diperoleh dari maserasi
menggunakan pelarut metanol
b. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50. Nilai IC50 adalah konsentrasi
antioksidan yang mampu meredam radikal bebas sebanyak 50 %. Zat yang
mempunyai aktivitas antiosidan tinggi, akan mempunyai nilai IC 50 yang rendah.
c. Kadar flavonoid total dalam penelitian ini adalah kadar total flavonoid dalam
ekstrak dan fraksi daun libo yang dihitung berdasarkan ekuivalen quarsetin.
d. Kadar fenolik total dalam penelitian ini adalah kadar total senyawa fenolik dalam
ekstrak dan fraksi daun libo yang dihitung berdasarkan akuivalen asam galat.
3.7. Prosedur Penelitian
a. Determinasi Tanaman
Tanaman yang diperoleh dilakukan determinasi di Laboratorium Pengembangan
Program Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan Dan Ilmu Pendidikan
Universitas Halu Oleo.
b. Penyiapan sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah daun Libo (Ficus septica
Burm.F) dari Kecamatan kambu, Kota Kendari, Sulawesi Tenggara. Sampel daun
libo disortasi untuk menghilangkan zat pengotornya kemudian dicuci sampelnya dan

27
dipotong-potong. Setelah itu dikeringkan dibawah sinar matahari sampai kering,
kemudian diserbukkan dengan menggunakan blender.
c. Pembuatan Ekstrak daun Libo (Ficus septica Burm.F)
Sampel daun libo yang diperoleh dimasukkan, dalam wadah dan diekstraksi
secara maserasi selama 3 x 24 jam dengan dilakukan penyaringan dan pergantian
pelarut setiap 24 jam. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan
ratory evaporator sampai diperoleh ekstrak kental (Sami dan siiti, 2012).
d. Fraksinasi
Ekstrak daun libo difraksinasi dengan metode partisi menggunakan pelarut n-
heksan, kloroform dan etil asetat. Diambil ekstrak daun libo lalu diencerkan terlebih
dahulu menggunakan aquades steril. Kemudian dimasukkan kedalam corong pisah,
ditambahkan pelarut n-heksan dengan perbandingan 1:1 yaitu 200 mL sampel air
yang dimasukkan terlebih dahulu dan kemudian dimasukan 200 mL pelarut lalu
digojok kuat-kuat sampai terbentuk dua lapisan (fraksi n-heksan berada pada lapisan
atas dan sisa air berada dibawah) kemudian didiamkan selama 5- 10 menit.
Kemudian dilakukan fraksinasi ulang (re-use) dengan menggunakan perbandingan 1:
2 (100 mL sisa air dan 200 mL pelarut n-heksan). Selanjutnya sisa air dipartisi
dengan kloroform menggunakan perbandingan 1:1 dimana 200 ml sampel dan 200
ml pelarut (fraksi kloroform berada dibawah dan sisa air ada diatas) kemudian
didiamkan selama beberapa menit. Kemudian dilakukan fraksinasi ulang (re-use)
dengan menggunakan perbandingan 1:2 (100 ml sampel dan 200 ml pelarut
kloroform). Selanjutnya sisa air partisi dengan etil asetat dengan perbandingan 1:1
(200 mL sampel air dan 200 ml pelarut etil asetat) yang kemudian digojok kuat-kuat
sampai terbentuk dua lapisan (fraksi etil asetat berada pada lapisan atas dan sisa air
berada dibawah) kemudian didiamkan selama 5-10 menit. Kemudian dilakukan
fraksinasi ulang (re-use) dengan menggunakan perbandingan 1:2 (100 ml sampel dan
200 ml pelarut etil asetat). Fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etil asetat
yang diperoleh dipekatkan dengan ratory evaporator pada suhu 50°C, sedangkan

28
fraksi air dipekatkan dengan menggunakan oven pada suhu 40°C (Rohman dkk.,
2007; Mistriyani dkk, 2018).
e. Skrining Fitokimia
Dilakukan skrining fitokimia ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi klorofom,
fraksi etil asetat dan fraksi air daun libo dengan langkah-langkah sebagai berikut:
1) Alkaloid
Sebanyak 1 mL ekstrak methanol daun libo, fraksi n-heksan, fraksi kloroform,
fraksi etil asetat dan sisa air ditambah 2 mL HCl 2N dan dikocok. disiapkan 3 tabung
untuk setiap perlakuan yang berbeda kemudian Filtrat dimasukkan. Ditambah 1 tetes
reagen Mayer pada tabung pertama, ditambah 1 tetes reagen Dragendorff tabung
kedua, dan tabung ketiga ditambah reagen Wagner. Untuk reagen Mayer ditandai
dengan terbentuknya endapan putih adanya senyawa alkaloid lalu untuk reagen
Dragendorff diamati terbentuknya endapan jingga menunjukkan adanya senyawa
alkaloid dan untuk reagen wagner diamati terbentuknya endapan coklat
menunjukkan adanya senyawa alkaloid (Tiwari dkk., 2011).
2) Steroid dan Terpenoid
Sebanyak 1 mL ekstrak metanol daun libo, fraksi n-heksan, fraksi kloroform,
fraksi etil asetat dan fraksi air ditambah 0,5 ml asam asetat anhidrat kemudian
ditambah 2 ml H2SO4. Uji positif pada steroid ditunjukkan oleh terbentuknya warna
biru dan hijau. Terbentuknya warna jingga, ungu dan kuning keemasan Menujukkan
uji positif pada triterpenoid (Tiwari dkk., 2011).
3) Fenolik
Sebanyak 1 mL ekstrak methanol daun libo, fraksi n-heksan, fraksi kloroform,
fraksi etil asetat dan fraksi air dimasukan masing-masing kedalam tabung reaksi, lalu
ditambah 10 tetes FeCl31% apabila menghasilkan, merah, ungu, biru, atau hitam
pekat dan warna hijau menunjukkan positif mengandung fenol (Harbone 1987).

29
4) Flavonoid
Sebanyal 1 ml ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etil
asetat dan fraksi air daun masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak
1 mL, ditambahkan 0,2 g serbuk magnesium dan ditambahkan 2 mL HCL pekat.
Terbentuk larutan berwarna merah, warna jingga, dan warna hijau menunjukkan
adanya senyawa flavonoid (Minarno, 2015).
5) Saponin
Sebanyak 1 mL ekstrak methanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etil
asetat, dan fraksi air dimasukan masing-masing kedalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan dengan 10 mL air lalu panaskan selama 2-3 menit. Kemudian
dinginkan, setelah dingin kocok dengan kuat selama 10 detik. Adanya saponin
ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang mantap selama tidak kurang 10 menit
setinggi 1-10 cm dan pada penambahan HCl 2 N buih akan hilang (Depkes RI,1995).
6) Tanin
Sebanyak 1 mL Ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi klorofor, fraksi etil asetat dan
fraksi air daun libo masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan
dengan 1 mL larutan Fe (III) klorida 1%. Jika terbentuk warna biru sampai hitam
menunjukkan adanya senyawa tanin (Harbone, 1987).

3.8 Uji aktivitas antioksidan

a. Metode DPPH
1) Kembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Larutan DPPH 0,4 mM dengan volume 100 ml dibuat dengan menimbang 0,02
gram DPPH dan dilarutkan dalam metanol p.a pada labu ukur 100 ml hingga tanda
batas dan dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan DPPH dengan
konsentrasi 0,4 mM (Sami dan Siti, 2015).

30
2) Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Larutan DPPH 0,4 mM dipipet 1 ml dan ditambahkan 4 ml metanol p.a untuk
diamati serapannya pada panjang gelombang 450 - 600 nm (Kamkar dkk., 2010
dalam Nurhasnawati dkk., 2017).

3) Penentuan Operating time

Penentuan operating time dilakukan dengan cara 1 mL DPPH 0,4 mM
ditambahkan 3 mL metanol p.a, dan 1 mL Vitamin C. larutan tersebut diukur pada
menit 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 pada panjang gelombang maksimum yang telah
diperoleh (Rastuti dan Purwanti., 2012).
4) Pembuatan larutan pembanding
Dibuat larutan Vitamin C 100 ppm sebagai pembanding dengan cara
menimbang 0,01 g dan dilarutkan dalam metanol 100 ml. Larutan induk diencerkan
sehingga diperoleh konsentrasi 1; 2; 3; 4 dan 5 ppm (Sami dan Siti, 2015).
5) Pembuatan Larutan Stok Ekstrak dan Fraksi Daun libo
Larutan induk ekstrak 100 ppm dengan maserasi dibuat dengan cara
menimbang 0,01 g ekstrak dan dilarutkan dalam methanol 100 ml. Larutan induk
diencerkan sehingga diperoleh konsentrasi 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, dan 5 ppm
(Sami dan Siti, 2015).
6) Pengukuran Aktivitas Penangkapan Radikal bebas dengan menggunakan
DPPH
Larutan seri pembanding dan larutan seri sampel masing-masing dipipet
sebanyak 1 mL lalu ditambahkan 3 mL metanol p.a dan 1 mL DPPH 0,4 mM.
Kemudian larutan dikocok sampai homogen. Selanjutnya larutan diinkubasi selama
waktu operating time pada suhu ruangan. Absorbansi larutan masing-masing diukur
pada panjang gelombang maksimum DPPH 0,4 mM yang telah diperoleh (Sami dan
Siti, 2015).

31
7) Persentase tingkat Inhibisi (IC50)
Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan absorbansi
radikal bebas DPPH melalui perhitungan tingkat inhibisi serapan DPPH dengan
menggunakan rumus tingkat inhibisi dan Nilai IC 50 dihitung dengan menggunakan
rumus persamaan regresi linier (perhitungan tingkat inhibisi dan IC50 (Andayani dkk.,
2008).

Tingkat inhibisi % = x 100%

b. Metode ABTS
1) Pembuatan larutan stok ABTS
a) Larutan ABTS : Ditimbang 18 mg ABTS (7 mM) dilarutkan kedalam aqua
deionisasi dalam labu ukur 5 mL
b) Larutan K2S2O8 : Ditimbang 14 mg kalium persulfat (2,45 mM) dilarutkan ke
dalam aqua deionisasi dalam botol sampai 20 mL.
c) Larutan stok ABTS : 5 mL larutan ABTS ditambahkan 5 mL larutan kalium
persulfat, diinkubasi dalam ruang gelap suhu 22-240C selama 12-16 jam sebelum
digunakan, dihasilkan ABTS dengan warna biru gelap (Misriyani dkk., 2017).
2) Pengukuran Serapan Larutan stok ABTS
Larutan ABTS dipipet sebanyak 1 ml dan dicukupkan volumenya sampai 5 ml
dengan etanol absolut dalam labu terukur. Larutan ini kemudian diukur dengan
spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 450 - 600 nm (Sami dan Siti,
2015).

3) Penentuan Operating time

Penentuan operating time dilakukan dengan cara 1 mL larutan stok ABTS
ditambahkan 3 mL metanol p.a, dan 1 mL Vitamin C. larutan tersebut diukur pada
menit 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 pada panjang gelombang maksimum yang telah
diperoleh (Rastuti dan Purwanti, 2012).

32
4) Pembuatan larutan pembanding
Dibuat larutan Vitamin C 1000 ppm sebagai pembanding dengan cara
menimbang 0,01 g dan dilarutkan dalam metanol 100 ml. Larutan induk diencerkan
sehingga diperoleh konsentrasi 1; 2; 3; 4 dan 5 ppm (Sami dan Siti, 2015).

5) Pengukuran Aktivitas Pengikatan Radikal bebas dengan menggunakan

larutan ABTS
Larutan seri pembanding dan larutan seri sampel masing-masing dipipet
sebanyak 1 mL lalu ditambahkan 3 mL metanol p.a dan 1 mL larutan stok ABTS
Kemudian larutan dikocok sampai homogen. Selanjutnya larutan diinkubasi selama
waktu operating time pada suhu ruangan. Absorbansi larutan masing-masing diukur
pada panjang gelombang maksimum larutan stok ABTS yang telah diperoleh (Sami
dan Siti, 2015).

a. Persentase tingkat Inhibisi (IC50)

Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan absorbansi
radikal ABTS melalui perhitungan tingkat inhibisi serapan ABTS dengan
menggunakan rumus tingkat inhibisi dan Nilai IC 50 dihitung dengan menggunakan
rumus persamaan regresi linier (perhitungan tingkat inhibisi dan IC 50 (Andayani dkk.,
2008).

Tingkat inhibisi % = x 100%

3.9 Penetapan Kadar flavonoid

a. Penentuan Kurva Baku Quarsetin
Pembuatan larutan standar baku kuersetin, Ditimbang 10 mg kuersetin dan
dilarutkan dalam 10 ml metanol p.a untuk 1000 ppm. Kemudian dibuat beberapa
konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, dan 50 ppm. Dari masing-masing
konsentrasi larutan standar kuersetin diambil 1 mL ditambahkan 3 mL methanol, 0,2
mL AlCl3 10%, 0,2 mL kalium asetat 1 M, dan dicukupkan dengan aquadestilata

33
sampai 10 mL. Setelah itu dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum dan
operating time salah satu larutan baku. Seluruh seri konsentrasi larutan baku
dilakukan pengukuran pada panjang gelomang maksimum yang diperoleh dan di
ikubasi selama operating time. Dibuat kurva kalibrasi hubungan anatara quarsetin
dengan absorbansi. (Ahmad dkk., 2015; Wardaningsih dkk., 2017).

b. Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak Dan Fraksi Daun Libo

Ditimbang 10 mg ekstrak dan fraksi dilarutkan dalam 10 mL metanol. Diambil
1 mL l tambahan 3 mL metanol, ditambahkan 0,2 mL AlCl3 10%, tambahkan 0,2 mL
kalium asetat, dan dicukupkan dengan aquadestilata sampai 10 mL. Setelah itu
diinkubasi selama waktu operating time pada suhu ruangan dan diukur absorbansinya
dengan panjang gelombang maksimum. Larutan sampel dibuat dalam tiga kali
replikasi sehingga kadar flavonoid yang diperoleh sebagai ekuivalen kuersetin (EQ)
(Ahmad dkk., 2015; Wahdaningsih dkk., 2017).
Kadar flavonoid total diperoleh dari nilai absorbansi masing-masing sampel
kemudian diplotkan kedalam persamaan kurva baku kuarsetin. Nilai yang didapat
dikalikan volume total sampel dan dibandingkan dengan bobot penimbangan dengan
rumus:
Kadar total flavonoid per berat sampel = (Wardhani, dkk., 2018).

Keterangan :
fp = Faktor pengenceran
c = kadar total flavonoid
v = Volume sampel (L)
m = Berat sampel (g)

34
3.10. Penetapan Kandungan Fenolik Total
a. Penentuan Kurva Baku Asam Galat
Larutan standar asam galat 1000 ppm dibuat dengan menimbang 10 mg asam
gallat dilarutkan dengan metanol p.a hingga volume 10 mL. Kemudian dibuat
beberapa konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm dan 25 ppm. Dari masing-
masing konsentrasi tersebut diambil 1 mL, ditambahkan 0,4 mL reagen Folin-
Ciocalteau dikocok dan dibiarkan 8 menit, ditambahkan 4 mL larutan Na 2CO3 7%
kocok hingga homogen dan ditambahkan aquades hingga 10 mL. Dilakukan
pengukuran panjang gelombang maksimum dan operating time salah satu larutan
baku. Seluruh seri konsentrasi larutan baku dilakukan pengukuran pada panjang
gelombang maksimum dilakukan tiga kali pengulangan. Dibuat kurva kalibrasi
hubungan antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi (Ahmad ddk., 2015).
b. Penetapan fenol total ekstrak metanol dan fraksi daun libo
Masing-masing larutan ekstrak metanol dan fraksi dibuat dengan cara
menimbang 10 mg kemudian dilarutkan dengan 10 mL metanol p.a Masing-masing
dipipet sebanyak 1 mL larutan ekstrak metanol dan fraksi, kemudian sampel
ditambahkan dengan 0,4 mL reagen Folin Ciocalteau dikocok dan dibiarkan 4-8
menit, tambahkan 4,0 mL larutan Na2 CO3 7% kocok hingga homogen. Tambahkan
aquabi destillata hingga 10 mL dan diamkan selama operating time pada suhu
ruangan. Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan dalam 3
kali pengukurandan kadar fenolik yang diperoleh dinyatakan sebagai ekuivalen asam
galat (EAG) (Ahmad dkk., 2015).
Kadar fenolik total diperoleh dari nilai absorbansi masing-masing sampel
kemudian diplotkankedalam persamaan kurva baku asam galat. Nilai yang didapat
dikalikan volume total sampel dan dibandingkan dengan bobot penimbangan dengan
rumus:
Kadar total flavonoid per berat sampel = (Wardhani, dkk., 2018).

35
 Keterangan :
fp = Faktor pengenceran
c = kadar total flavonoid
v = Volume sampel (L)
m = Berat sampel (g)

Korelasi antara kadar fenolik total dan aktivitas antioksidan diperoleh dari
persamaan regresi antara fenolik total dengan IC50 masing-masing ekstrak dan fraksi
(Lukmanto, 2015).

36
 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Determinasi Tanaman libo

Determinasi tanaman dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan kebenaran
bahan yang digunakan pada penelitian. Determinasi tanaman libo dilakukan di
Laboratorium Pengembangan Unit Biologi FKIP Universitas Halu Oleo Kendari.
Determinasi dari tanaman libo dilakukan dengan cara mencocokkan morfologi kulit
batang dengan menggunakan buku acuan Flora Untuk Sekolah di Indonesia (Van
Steenis dkk., 2008).
Hasil determinasi tanaman libo menunjukkan kunci determinasi sesuai pada
Lampiran 1, sebagai beriku:
1a-2b-3a-4b-5b-6b-7a-8b-9a-10b-11a
Hasil determinasi yang telah dilakukan menunjukkan bahwa tanaman yang
digunakan adalah tanaman libo (Ficus Septica Burm.F).
4.2. Penyiapan Sampel
Sampel daun libo diperoleh di Kelurahan kambu, Kecamatan kambu, Kota
kendari , Sulawesi Tenggara. Kulit batang dilakukan sortasi basah untuk memisahkan
pengotor atau bagian tanaman yang tidak diperlukan dalam penelitian dan terbawa
pada saat proses pengumpulan daun. Setelah itu dilakukan proses pencucian di bawah
air yang mengalir agar kotoran yang ada pada sampel dapat ikut hilang bersama aliran
air. Daun libo yang telah dicuci kemudian dirajang untuk mempermudah dalam
proses pengeringan. Pengeringan dilakukan di bawah sinar matahari. Sampel kulit
daun libo yang telah kering kemudian dilakukan sortasi kering untuk membersihkan
pengotor yang melekat pada saat pengeringan. Kemudian dilakukan penghalusan.
Penghalusan dilakukan untuk mengubah ukuran sampel menjadi lebih kecil dengan
luas permukaan yang lebih besar sehingga dapat memaksimalkan proses maserasi
untuk menarik dan melarutkan senyawa metabolit sekunder (Harbone, 1987).

37
4.3. Ekstraksi Daun Libo
Serbuk kering daun libo 789,1 gram dimaserasi dengan metanol sebanyak 5 L.
Metode maserasi dipilih sebagai metode dalam mengekstrasi karena mekanisme
pengerjaannya yang lebih praktis dan sederhana. Pemilihan metanol sebagai pelarut
dikarenakan metanol dapat menarik senyawa-senyawa organik baik yang bersifat
polar dan non polar serta pelarut metanol mempunyai titik didih yang relatif rendah
sehingga mudah dipisahkan dengan cara penguapan (Suryanto dkk., 2009).
Prinsip ekstraksi dengan metode maserasi adalah pelarut akan masuk ke dalam
sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi
antara larutan di dalam sel dan diluar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan
terdesak keluar dan diganti oleh pelarut. Peristiwa tersebut akan terus berulang
sampai terjadi kesetimbangan antara konsentrasi di dalam sel dan diluar sel. Hasil
ekstraksi 789,1 g simplisia kulit batang libo dengan cara maserasi menggunakan
pelarut methanol sebanyak 9 L, diperoleh ekstrak sebanyak 195 g dengan nilai
rendamen ekstrak sebesar 24,71 %.
4.4. Fraksinasi Ekstrak Daun Libo
Fraksinasi adalah suatu metode pemisahan senyawa organik berdasarkan
kelarutan senyawa-senyawa tersebut dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur,
biasanya antara pelarut air dan pelarut organik. Metode fraksinasi yang biasa
digunakan adalah ekstraksi cair-cair. Pada ekstraksi cair-cair digunakan dua jenis
pelarut yang berbeda sifat kepolarannya, dengan prinsip like disolved like yang
menyatakan bahwa suatu senyawa akan larut pada pelarut yang memiliki tingkat
kepolaran yang sama (Pratiwi dkk., 2016).
Teknik pemisahan dilakukan dengan menggunakan corong pisah. Kedua pelarut
yang tidak saling bercampur tersebut dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian
digojok dan didiamkan. Senyawa metabolit sekunder akanterdistribusi ke dalam
fasenya masing-masing tergantung pada kelarutannya terhadap fase tersebut dan

38
kemudian akan terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan atasdan lapisan bawah (Dey,
2012).
Tahap fraksinasi penelitian ini, digunakan empat jenis pelarut yaitu n heksan,
korofom, etil asetat dan air. Ekstrak kental metanol yang akan difraksinasi terlebih
dahulu dilarutkan didalam air dan diekstraksi cair-cair menggunakan pelarut n-heksan
sehigga fase air berada dilapisan bawah sedangkan fase n-heksan berada dilapisan
atas, sesuai dengan masa jenis air yang lebih besar yaitu 1g/mL dibandingkan n-
heksan 0,6548 g/mL. Selanjutnya sisa air di fraksi nasi kembali dengan pelarut
lainnya. Perbedaan jenis pelarut akan mempengaruhi jumlah fraksi yang dihasilkan.
Hasil fraksinasi yang diperoleh disajikan dalam tabel 4.1

Tabel 4.1 Hasil fraksi daun libo

No. Fraksi Berat Fraksi Rendamen (%)
1. N-heksan 14 gram 14 %
2. Klorofom 3,8 gram 3,8 %
3. Etil Asetat 2,8 gram 2,8 %
4 Air 12,53 gram 12,5 %

Berdasarkan tabel 4.1. dapat dilihat bahwa hasil fraksinasi yang paling banyak
adalah fraksi n heksan sebanyak 14 gram diikuti fraksi air sebanyak 12, 5 gram
selanjutnya klorofom sebanyak 3,8 gram dan terahir etil asetat 2,8 gram. Dengan
demikian dapat disimpulkan bahwa sampel Daun Libo lebih banyak mengandung
senyawa polar karena berat rendamen yang diperoleh lebih banyak terdapat pada
fraksi n heksan dan air di bandingkan pelarut nonpolar seperti klorofom dan etil
asetat.

4.5. Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia dilakukan untuk mengidentifikasi kandungan metabolit
sekunder yang tersari di dalam ekstrak metanol dan fraksi daun libo sehingga dapat
diketahui metabolit sekunder yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan.

39
Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi klorofom, fraksi
etil asetat dan fraksi air daun libo

Golongan Pereaksi Sampel Hasil Keterangan

Senyawa
Ekstrak + Endapan Coklat
Fraksi N + Endapan Coklat
Heksan
Alkaloid Pereaksi Fraksi + Endapan Coklat
dragendrof Klorofom
Fraksi Etil + Endapan Coklat
Asetat
Fraksi Air + Endapan Coklat
- Tidak terdapat endapan
Ekstrak
putih
Fraksi N - Tidak terdapat endapan
Heksan putih
Alkaloid Pereaksi Fraksi - Tidak terdapat endapan
meyer Klorofom putih
Fraksi Etil - Tidak terdapat endapan
Asetat putih
- Tidak terdapat endapan
Fraksi Air
putih
- Tidak terdapat endapan
Ekstrak
coklat
Fraksi N - Tidak terdapat endapan
Heksan coklat
Alkaloid Pereaksi Fraksi - Tidak terdapat endapan
wagner Klorofom coklat
Fraksi Etil - Tidak terdapat endapan
Asetat coklat
- Tidak terdapat endapan
Fraksi Air
coklat
Ekstrak + Larutan Berwarna Merah
Fraksi N + Larutan Berwarna Merah
Heksan
Fraksi + Larutan Berwarna Merah
Flavonoid Mg+ HCl 2N
Klorofom
Fraksi Etil + Larutan Berwarna Merah
Asetat
Fraksi Air + Larutan Berwarna Merah

40
 Ekstrak + Hijau kehitaman

Fraksi N + Hijau kehitaman

Heksan
((CH3CO)2O)
Fraksi + Hijau kehitaman
Terpenoid + H2SO4
Klorofom
pekat
Fraksi Etil + Hijau kehitaman
Asetat
+ Hijau kehitaman
Fraksi Air
Ekstrak + Biru Kehitaman
Fraksi N + Biru Kehitaman
Heksan
Fraksi + Biru Kehitaman
Tanin FeCl3 1%
Klorofom
Fraksi Etil + Biru Kehitaman
Asetat
Fraksi Air + Biru Kehitaman
Ekstrak + Terbentuk Busa
Fraksi N + Terbentuk Busa
Heksan
Fraksi + Terbentuk Busa
Saponin Aquades Klorofom
Fraksi Etil + Terbentuk Busa
Asetat
+ Terbentuk Busa
Fraksi Air

Ekstrak + Hitam Pekat

Fraksi N + Hitam Pekat

Heksan
FeCl31% Fraksi + Hitam Pekat
Fenolik
Klorofom
Fraksi Etil + Hitam Pekat
Asetat
+ Hitam Pekat
Fraksi Air

Berdasarkan Tabel 4.2 menunjukkan bahwa hasil uji senyawa alkaloid pada
ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi klorofom, fraksi etil asetat dan fraksi air
mengandung senyawa alkaloid. Identifikasi alkaloid terbentuk endapan berwarna

41
coklat pada eksrak metanol. Hasil ini sesuai dengan teori Harbone yang mengatakan
bahwa hasil positif alkaloid pada uji dragendrof ditandai dengan terbentuknya
endapan coklat. Pada uji alkaloid terjadi reaksi pengendapan karena adanya
penggantian logam. Atom nitrogen yang memiliki pasangan elektron bebas sehingga
dapat membentuk ikatan kovalen koordinasi dengan ion logam (Harbone, 1987).
Hasil uji senyawa flavonoid dilihat dengan perubahan larutan uji menjadi warna
merah, warna jingga dan warna hijau dengan penambahan serbuk magnesium dan
HCL pekat. Penambahan serbuk magnesium dan asam klorida pada pengujian
flavonoid akan menyebabkan tereduksinya senyawa flavonoid (Harbone, 1987). Hasil
yang didapat pada ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi klorofom, fraksi etil asetat
dan fraksi air daun libo berwarna merah. Hal ini menunjukkan bahwa sampel positif
mengandung flavonoid.
Hasil uji senyawa terpenoid pada ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi
klorofom, dan fraksi etil asetat memberikan hasil positif yang ditujukan oleh
perubahan warna menjadi warna kuning keemasan atau coklat, ketika sampel
direaksikan dengan asam sulfat. Sedangkan pada fraksi air tidak menunjukkan adanya
perubahan warna kuning ke emasan atau coklat. Hasil ini sesuai dengan teori bahwa
hasil positif terpenoid ditandai dengan terbentuknya warna coklat. Perubahan warna
terjadi karena oksidasi pada golongan senyawa terpenoid melalui pembentukan ikatan
rangkap terkonjugasi (Harbone, 1987).
Hasil uji senyawa tanin pada daun libo bahwa ekstrak metanol, fraksi n heksan,
fraksi klorofom, fraksi etil asetat dan fraksi air memberikan hasil positif dengan
terbentuknya warna hitam. Hasil tersebut sesuai dengan teori bahwa hasil positif uji
tanin apabila timbul warna hitam. Terbentuknya warna hitam setelah ditambahkan
FeCl3 disebabkan karena tanin akan membentuk senyawa kompleks dengan ion Fe 3+
(Harbone, 1987).
Hasil uji senyawa saponin menunjukkan bahwa ekstrak metanol, fraksi etil
asetat dan fraksi air negatif karena tidak ada busa stabil yang terbentuk. Menurut
Robinson (1995) senyawa yang memiliki gugus polar dan nonpolar bersifat aktif

42
permukaan sehingga saat saponin dikocok dengan air dapat membentuk misel. Pada
struktur misel, gugus polar menghadap ke luar sedangkan gugus nonpolarnya
menghadap ke dalam, keadaan inilah yang tampak seperti busa.
Hasil uji senyawa fenolik pada ekstrak metanol, fraksi klorofom, fraksi etil
asetat dan fraksi air pada daun libo menunjukan hasil positif dengan terbentuknya
warna biru ke hitaman sedangkang pada fraksi n heksan tidak berwarna biru
kehitaman sehingga katakan bahwa pada fraksi n heksan pada daunlibo tidak
memiliki senyawa fenolik. Hasil tersebut sesuai dengan teori
4.6 Uji Aktivitas Antioksidan
a. Metode DPPH
Prinsip kerja metode DPPH adalah adanya atom hidrogen dari senyawa
antioksidan yang berikatan dengan elektron bebas pada senyawa radikal sehingga
menyebabkan perubahan dari radikal bebas menjadi senyawa non-radikal (Setiawan
dkk., 2018).
Pemilihan penggunaan metode ini karena merupakan metode yang sederhana,
mudah dan cepat. DPPH merupakan radikal bebas yang berwarna ungu. Ketika
senyawa radikal bebas direaksikan dengan suatu antioksidan maka intensitas warna
ungu akan berkurang dan bila senyawa antioksidan yang bereaksi jumlahnya besar
maka DPPH akan berubah warna menjadi kuning. Antioksidan yang bereaksi dengan
DPPH menyebabkan elektron DPPH menjadi berpasangan, kemudian menyebabkan
penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil (Hanani,
2005).
Pengujian antioksidan secara kuantitatif untuk sampel ekstrak methanol, fraksi
n heksan, fraksi klorofom, fraksi etil asetat dan fraksi air. Pengujian antioksidan
secara kuantitati dinyatakan dengan Persentase penghambatan didapatkan dari
perbedaan serapan antara absorban DPPH dalam metanol dengan absorban sampel.
Persamaan regresi yang diperoleh dari grafik hubungan antara konsentrasi sampel
dengan persen penghambatan DPPH digunakan untuk memperoleh nilai IC50
(inhibition concentration). Besarnya aktivitas antioksidan ditandai dengan nilai IC50

43
yaitu konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal
bebas DPPH. Semakin kecil nilai IC50 senyawa maka makin besar kemampuan
senyawa tersebut untuk menangkal radikal bebas (Prakash dkk., 2001).
Pengukuran absorban ekstrak dan fraksi daun libo dengan metode DPPH
menggunakan spektrofotometer UV-Vis dilakukan penentuan panjang gelombang
maksimum DPPH dan operating time. Penentuan panjang gelombang maksimum
bertujuan mengetahui besarnya panjang gelombang yang dibutuhkan larutan DPPH.
Hasil penetapan panjang gelombang maksimum larutan DPPH adalah 528,6 nm
(Lampiran7). Penentuan operating time bertujuan menentukan waktu optimum
inkubasi sampel dengan larutan DPPH untuk bereaksi. Hasil penentuan dari
operating time didapatkan serapan yang stabil mulai menit ke-30, dapat dilihat pada
lampiran 8. Selanjutnya, besarnya aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol, fraksi
etil asetat, fraksi air dan pembanding vitamin C diinkubasi selama 30 menit dan
dikukur pada panjang gelombang maksimum 528,6 nm. Hasil uji aktivitas
antioksidan dapat dilihat pada Tabel 4.3

Tabel 4.3 Hasil uji aktivitas antioksidan metode DPPH daun libo

IC50 (ppm)
Sampel I II III X IC50 ±SD
(ppm)
Vitamin c 4,151 4,113 4,163 4,1±0,026
Ekstrak metanol 6,671 6,687 6,675 6,7±0,008
Fraksi n heksan 7,203 7,346 7,296 7,3±0,072
Fraksi etil asetat 6,011 5,997 6,023 6,0±0,012
Fraksi klorofom 8,497 8,630 8,416 8,5±0,108
Fraksi air 10,365 10,464 10,426 10,4±0,050

Berdasarkan Tabel 4.3 Dapat dilihat bahwa kenaikan konsentrasi berbanding

lurus dengan peningkatan persen penghambatan. Peningkatan persen penghambatan
DPPH menunjukkan adanya aktivitas antioksidan terhadap ekstrak metanol, fraksi etil
asetat dan fraksi air. Interaksi antioksidan dengan DPPH melalui mekanisme transfer

44
elektron terhadap DPPH, akan menetralkan radikal bebas DPPH. Jika semua elektron
pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari
ungu tua menjadi kuning (Hanani, 2005).
Berdasarkan persamaan regresi antara konsentrasi sampel (x) dan persen
penghambatan (y) dapat dihitung nilai IC50 untuk menyatakan aktivitas antioksidan.
Hasil akivitas antioksidan vitamin C, ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi
klorofom, fraksi etil asetat dan fraksi air dapat dilihat pada gambar 4.1

Gambar 4.1 Aktivitas antioksidan daun libo dengan metode DPPH

Berdasarkan Gambar 4.6. hasil pengukuran aktivitas antioksidan menunjukkan

bahwa pembanding Vitamin C, ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi klorofom,
fraksi etil asetat, dan fraksi air daun libo memiliki aktivitas antioksidan yang berbeda-
beda. Hasil penelitian diperoleh nilai IC50 ekstrak metanol sebesar 6,70 ppm, fraksi n
heksan sebesar 7.30 ppm , fraksi klorofom sebesar 8,50 ppm fraksi etil asetat sebasar
6,0 ppm, fraksi air 10.40 ppm dan vitamin C sebesar 4,10 ppm. Menurut Molyneux
(2004) suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika memiliki nilai
IC50 kurang dari 50 ppm, kuat untuk IC50 bernilai 50-100 ppm, sedang jika bernilai
100-150 ppm, dan lemah jika nilai IC50 bernilai 151-200 ppm. Berdasarkan hasil
tersebut, nilai IC50 fraksi methanol,fraksin heksan,fraksi klorofom, fraksi etil asetat
serta fraksi air dan pembanding vitamin C memiliki nilai IC50 kurang dari 50 ppm.
Dengan demikian tanaman libo merupakan jenis tanaman yang memiliki kemampuan

45
antioksidan yang sangat kuat baik ekstrak maupun fraksi. Adapun nilai IC 50 yang
tertinggi adalah terdapat pada sampel fraksi etil asetat.
Menutut (Imrawati dkk., 2017) berdasarkan beberapa peneitian sebelumnya yang
menunjukkan bahwa fraksi etil asetat memiliki aktivitas anti oksidan paling tinggi
untuk menghambat radikal bebas DPPH, di bandingkan dengan fraksi-fraksi yang
lain. Didukung juga oleh (Huang dkk., 2011) bahwa senyawa antioksidan semi polar
mempunyai aktivitas menangkap radikal DPPH lebih tinggi dibandingkan senyawa
antioksidan polar dan sangat polar. Hal ini sesuai hasil yang diperoleh dimana
aktivitas antioksidan yang tertinggi terdapat pada fraksi etil asetat pada daun libo.

b. Pengujan ABTS
ABTS adalah suatu radikal dengan pusat nitrogen yang mempunyai
karakteristik warna biru-hijau, yang bila tereduksi oleh antioksidan akan berubah
menjadi bentuk non radikal dari berwarna menjadi tidak berwarna. Metode ABTS
sangat sensitif terhadap cahaya, bahkan pembentukan ABTS memerlukan waktu
inkubasi selama 12-16 jam dalam kondisi gelap (Setiawan dkk. 2018). Prinsip
pengujian ABTS adalah penyetabilan radikal bebas melalui donor proton.
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan penghilangan warna ABTS
yang semula berwarna biru hijau akan berubah menjadi tidak berwarna apabila
tereduksi oleh radikal bebas. Metode ABTS sangat sensitif terhadap cahaya, bahkan
pembentukan ABTS memerlukan waktu inkubasi selama 12-16 jam dalam kondisi
gelap Kelebihan dari metode ABTS ini yaitu memberikan absorbansi spesifik pada
panjang gelombang visible dan waktu reaksi yang lebih cepat. Selain itu, ABTS dapat
dilarutkan dalam pelarut organik maupun air sehingga bisa medeteksi senyawa yang
bersifat lipofilik maupun hidrofilik (Karadag dkk., 2009).
Metode DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan suatu senyawa untuk
mendonorkan ion hidrogen (H3O+), sedangkan pada metode ABTS dilihat
berdasarkan kemampuan senyawa tersebut untuk menstabilkan senyawa radikal bebas
dengan mendonorkan radikal proton (Imrawati dkk., 2017)

46
 Pengukuran absorban ekstrak dan fraksi daun libo dengan metode ABTS
menggunakan spektrofotometer UV-Vis dilakukan penentuan panjang gelombang
maksimum ABTS dan operating time. Penentuan panjang gelombang maksimum
bertujuan mengetahui besarnya panjang gelombang yang dibutuhkan larutan ABTS.
Hasil penetapan panjang gelombang maksimum larutan ABTS adalah 745,5 nm
(Lampiran 12). Penentuan operating time bertujuan menentukan waktu optimum
inkubasi sampel dengan larutan ABTS untuk bereaksi. Hasil penentuan dari
operating time didapatkan serapan yang stabil mulai menit ke-30. Hasil uji aktivitas
antioksidan dapat dilihat pada Tabel 4.4

Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antioksidan metode ABTS daun libo

IC50 (ppm)
Sampel I II III X IC 50 ±SD
(ppm)
Vtamin c 4,673 4,635 4,610 4.6±0,022
Ekstrak metanol 7,230 7,246 6,973 7,1±0,153
Fraksi n heksan 7,542 7,449 7,495 7,5±0,046
Fraksi etil asetat 5,928 5,933 5,964 5,9±0,019
Fraksi klorofom 8,968 8,844 8,930 8,9±0,0,61
Fraksi air 10,699 10,559 10,575 10,6±0,076

Berdasarkan Tabel 4.4 Dapat dilihat bahwa kenaikan konsentrasi berbanding

lurus dengan peningkatan persen penghambatan. Peningkatan persen penghambatan
ABTS menunjukkan adanya aktivitas antioksidan terhadap ekstrak metanol, fraksi n
heksan, fraksi klorofom, fraksi etil asetat dan fraksi air.
Berdasarkan persamaan regresi antara konsentrasi sampel (x) dan persen
penghambatan (y) dapat dihitung nilai IC50 untuk menyatakan aktivitas antioksidan.
Hasil akivitas antioksidan vitamin C, ekstrak metanol, fraksi n heksan, fraksi
klorofom, fraksi etil asetat dan fraksi air dapat dilihat pada gambar 4.2

47
 Gambar 4.2 Aktivitas antioksidan daun libo dengan metode ABTS

Berdasarkan Gambar 4.2 hasil pengukuran aktivitas antioksidan

menunjukkan bahwa pembanding Vitamin C, ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi
kloroform, fraksi etil asetat, fraksi air daun libo memiliki aktivitas antioksidan yang
berbeda-beda. Hasil penelitian diperoleh nilai IC50 ekstrak metanol sebesar 7,1ppm,
fraksi n-heksan sebasar 7,5 ppm, fraksi kloroform sebesar 8,9 ppm fraksi etil asetat
sebasar 5,9 ppm, fraksi air 10,6 ppm dan vitamin C sebesar 4,6 ppm. Menurut
(Molyneux, 2004) suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika
memiliki nilai IC50 kurang dari 50 ppm, kuat untuk IC50 bernilai 50-100 ppm, sedang
jika bernilai 100-150 ppm, dan lemah jika nilai IC50 bernilai 151-200 ppm.
Berdasarkan hasil tersebut, nilai IC50 fraksi etil asetat, ekstrak metanol, fraksi
kloroform, fraksi n-heksan, fraksi air dan pembanding vitamin C memiliki nilai IC50
kurang dari 50 ppm. Dengan demikian tanaman libo merupakan jenis tanaman yang
memiliki kemampuan antioksidan yang sangat kuat baik ekstrak maupun fraksi.
Adapun aktivitas antioksidan yang paling tertinggi adalah terdapat pada sampel fraksi
etil asetat.
Menurut (Fitriana dkk., 2015) fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan
paling tinggi dibandingkan fraksi lainnya. Aktivitas antioksidan dipengaruhi oleh
senyawa senyawa fenolat yang berada dalam fasa yang diukur. Senyawa fenolat

48
memiliki kemampuan sebagai antioksidan yang tinggi. Hal ini sesuai hasil yang
diperoleh dimana aktivitas antioksidan yang tertinggi terdapat pada fraksi etil asetat
pada daun libo.
4.7 Penetapan Kadar Flavonoid Total
Analisis kuantitatif senyawa flavonoid total pada ekstrak dan fraksi daun libo
dilakukan dengan metode aluminium klorida. Prinsip penetapan kadar flavonoid
metode aluminium klorida adalah terjadinya pembentukan kompleks antara
aluminium klorida dengan gugus ketodan gugus hidroksi pada senyawa flavonoid.
Pengukuran serapan panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang sekitar
400-600 nm. Panjang gelombang maksimum yang dihasilkan adalah 409 nm, panjang
gelombang maksimum tersebut digunakan untuk mengukur serapan kurva kalibrasi
dan sampel ekstrak dan fraksi daun libo. Setelah didapatkan panjang gelombang
maksimum selanjutnya dilakukan penentuan operating time untuk menentukan waktu
optimum inkubasi sampel dengan aluminium klorida dan aluminium asetat. Hasil
penentuan dari operating time didapatkan serapan yang stabil mulai menit ke-30,
dapat dilihat pada lampiran 14.
Larutan standar kuarsetin dibuat dalam beberapa variasi konsentrasi yang
diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis double beam pada
panjang gelombang 409 nm. Kemudian dibuat kurva kalibrasi hubungan antara
konsentrasi kuarsetin dan absorbansinya (Lampiran 17). Hasil kadar flavonoid total
dapat dilihat pada Tabel 4.5
Tabel 4.5. Hasil Kadar flavonoid total pada ekstrak dan fraksi daun libo

Kadar flavanoid
(ppm) X±SD (mg/g sampel)
Sampel
(ppm) X±SD
I II III

Ekstrak metanol 53,83 54,67 55,83 54,78 547,77

Fraksi n heksan 65,00 64,83 66,00 65,28 652,78
Fraksi klorofom 65,33 65,50 66,50 65,78 657,77
Fraksi etil asetat 73,83 76,67 75,3 74,28 742,78
Fraksi air 49,00 49,83 49,67 49,50 495,00

49
 Berdasarkan Tabel 4.5. diketahui bahwa kadar total flavonoid pada fraksi etil
asetat mengandung senyawa flavonoid yang paling tinggi yaitu 74,28 ppm dengan
kadar total flavonoid sebesar 724,77 mg/g sampel , kemudian fraksi klorofom
mengandung senyawa flavonoid sebesar 65,78 ppm dengan kadar total flavonoid
sebesar 657,77 mg/g sampel, selanjutnya fraksi n heksan mengandung senyawa
flavanoid sebesar 65,28 ppm dengan kadar total flavanoid 652,78 mg/g sampel,
selanjutnya fraksi methanol mengandung senyawa flavanoid sebesar 54,78 ppm
dengan kadar total flavanoid 547,77 mg/g sampel dan terakhir fraksi air mengandung
senyawa flavonoid terendah yaitu 49,50 ppm dengan kadar total flavonoid sebesar
495,00 mg/g sampel.
Hal ini menunjukkan bahwa jumlah flavonoid terbanyak terdapat pada fraksi
etil asetat maka senyawa flavonoid yang terdapat pada daun libo merupakan senyawa
flavonoid yang bersifat semi polar.
Nilai kadar flavonoid total masing-masing sampel yang telah ditentukkan,
dikorelasikan dengan nilai IC50 masing-masing sampel dengan menggunakan
persamaan regresi linear dapat dilihat pada gambar 4.3

Gambar 4.3 Hubungan antara kandungan flavonoid total ekstrak dan fraksi daun libo
dengan nilai IC50 aktivitas antioksidan dari metode DPPH

50
 Berdasarkan Gambar 4.3. hasil dari regresi linear antara IC50(x) dan kadar
flavonoid total (y) ekstrak dan fraksi daun libo mempunyai koefisien korelasi r20,933
(y = -5,479x + 104,5). Hal tersebut menunjukkan bahwa 93,3 % aktivitas antioksidan
dari ekstrak dan fraksi daun libo karena konstribusi senyawa flavonoid dan 6,7 %
dipengaruhi oleh senyawa lain selain flavonoid seperti senyawa fenolik sederhana
atau senyawa karoten. Dengan demikian aktivitas antioksidan tidak hanya berasal dari
senyawa flavonoid, tetapi dapat berasal dari metabolit sekunder yang bersifat
antikosidan.

Gambar 4.4. Hubungan antara kandungan flavonoid total ekstrak dan fraksi daun
Libo dengan nilai IC50 aktivitas antioksidan dari metode ABTS.

Berdasarkan Gambar 4.4. hasil dari regresi linear antara IC50(x) dan kadar
flavonoid total (y) ekstrak dan fraksi daun libo mempunyai korelasi r2 0,973 (y = -
5,354x + 104,7). Hal tersebut menunjukkan bahwa 97,3 % aktivitas antioksidan dari
ekstrak dan fraksi daun libo karena konstribusi senyawa flavonoid dan 2,7 %
dipengaruhi oleh senyawa lain selain flavonoid seperti senyawa fenolik sederhana
atau senyawa karoten. Dengan demikian aktivitas antioksidan tidak hanya berasal dari
senyawa flavonoid, tetapi dapat berasal dari metabolit sekunder yang bersifat
antikosidan.

51
4.8 Penetapan Kadar Fenolik Total
Analisis kuantitatif senyawa fenolik total pada ekstrak dan fraksi daun libo
dilakukan dengan metode Follin-Ciocalteu. Follin-Ciocalteu adalah pereaksi
anorganik yang dapat membentuk larutan kompleks dengan senyawa fenol yaitu
molybdenum tungstant yang berwarna biru. Semakin pekat intensitas warna akan
menunjukan kadar fenolik dalam fraksi semakin besar (Wungkana dkk., 2013).
Pengukuran serapan panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang
sekitar 400-800 nm. Panjang gelombang maksimum yang dihasilkan adalah 750 nm,
panjang gelombang maksimum tersebut digunakan untuk mengukur serapan kurva
kalibrasi dan sampel ekstrak dan fraksi daun libo. Setelah didapatkan panjang
gelombang maksimum selanjutnya dilakukan penentuan operating timeuntuk
menentukan waktu optimum inkubasisampel dengan reagen follin-Ciocalteu dan
Na2Co3. Hasil penentuan dari operating time didapatkan serapan yang stabil mulai
menit ke-30, dapat dilihat pada lampiran 22.
Larutan standar asam galat dibuat dalam beberapa variasi konsentrasi yang
diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis doeble beam pada
panjang gelombang 742,75 nm. Kemudian dibuat kurva kalibrasi hubungan antara
konsentrasi kuarsetin dan absorbansinya (Lampiran 21). Hasil kadar fenolik total
dapat dilihat pada tabel 4.6.

Tabel 4.6 Hasil Kadar fenolik total pada ekstrak dan fraksi daun libo

Kadar fenolik
(ppm) X±SD (mg/g sampel)
Sampel
(ppm) X±SD
I II III

Ekstrak metanol 25,11 25,16 25,16 25,14 251,40

Fraksi n heksan 26,16 26,21 26,21 26,19 261,93
Fraksi klorofom 23,21 23,11 23,26 23,19 231,93
Fraksi etil asetat 28,00 28,05 28,05 28,03 280,35
Fraksi air 7,47 7,58 7,53 7,52 75,2

52
 Berasarkan Tabel 4.6. hasil kadar total fenolik dapat dilihat bahwa kadar total
fenolik pada fraksi etil asetat mengandung senyawa fenolik yang paling tinggi yaitu
28,03 ppm dengan kadar total fenolik sebesar 280,35 mg/g sampel fraksi etil asetat,
kemudian fraksi nheksan mengandung senyawa fenolik sebesar 26,19 ppm dengan
kadar total fenolik sebesar 216,93 mg/g sampel fraksi, ketiga ekstrak metanol
mengandung senyawa fenolik sebesar 25,14 ppm dengan kadar total fenolik sebesar
251,40 mg/g sampel fraksi, ke empat fraksi klorofom mengandung senyawa fenolik
sebesar 23,19 ppm dengan kadar total fenolik sebesar 231,93 mg/g sampel fraksi dan
fraksi air mengandung senyawa fenolik terendah yaitu 7,52 ppm dengan kadar total
flavonoid sebesar 75,2 mg/g sampel fraksi. Dari tabel 4.6 menunjukkan bahwa fraksi
etil asetat memiliki kemampuan yang baik dalam mereduksi reagen Folin-Ciocalteu
dari pada fraksi-fraksi lainnya. Larutan asam galat yang digunakan untuk menentukan
kandungan total fenol karena asam galat mempunyai gugus hidroksi dan ikatan
rangkap yang terkonjugasi pada cincin aromatis. Asam galat sangat efektif dalam
membentuk senyawa kompleks dengan reagen Folin-Ciocalteu sehingga reaksi yang
terjadi lebih sensitif dan intensif. Dari hasil pengujian, asam galat menghasilkan
warna biru yang pekat pada saat bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu (Shahidi dan
Naczk, 1995). Ini berarti bahwa kandungan total fenolik yang diperoleh sebagian
besar adalah senyawa sangat semi polar yang dapat larut dalam pelarut semi polar
seperti etil asetat.
Hal ini menunjukkan bahwa jumlah fenolik terbanyak terdapat pada fraksi etil
asetat maka senyawa fenolik yang terdapat pada daun libo merupakan senyawa
fenolik yang bersifat semi polar.
Nilai kadar fenolik total masing-masing sampel yang telah ditentukkan,
dikorelasikan dengan nilai IC50 DPPH dan ABTS masing-masing sampel dengan
menggunakan persamaan regresi linear dapat dilihat pada gambar 4.5

53
Gambar 4.5. Hubungan antara kandungan fenolik total ekstrak dan fraksi daun

libo dengan nilai IC50 aktivitas antioksidan dari metode DPPH.

Berdasarkan Gambar 4.5. hubungan antara IC50 (x) dengan kandungan fenolik
total (y) ekstrak dan fraksi memiliki nilai koefisien korelasi r2= 0,889 (y = - 4,571x +
57,39). Hasil ini menunjukkan bahwa 88,9 % aktivitas antioksidan daun libo
merupakan bagian dari senyawa-senyawa fenolik, sehingga 11,1 % aktivitas
antioksidan yang dihasilkan ekstrak dan fraksi daun libo dipengaruhi senyawa selain
fenolik.

Gambar 4.6. Hubungan antara kandungan fenolik total ekstrak dan fraksi daun

Libo dengan nilai IC50 aktivitas antioksidan dari metode ABTS.

54
 Berdasarkan Gambar 4.6. hubungan antara IC50 (x) dengan kandungan
fenolik total (y) ekstrak dan fraksi memiliki nilai koefisien korelasi = 0,818 (y = -
4,153x +55,24). Hasil ini menunjukkan bahwa 81,8 % aktivitas antioksidan daun libo
merupakan bagian dari senyawa fenolik, sehingga 18,2 % aktivitas antioksidan yang
dihasilkan ekstrak dan fraksi daun libo dipengaruhi senyawa selain fenolik. Senyawa
senyawa fenolik telah dilaporkan mempunyai aktivitas antioksidan karena sifat-sifat
redoksnya. Senyawa fenolik bereaksi sebagai agen pereduksi, pemberi hidrogen,
peredam oksigen singlet, dan juga sebagai pengleat logam yang potensial (Kahkonen
dkk.,1999).

55
 BAB V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdsarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan sebagai berikut:
a. Ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi klorofrom, fraksi etil asetat dan fraksi air
mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, tanin, fenolik dan
mengandung senyawa saponin.
b. Ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air
daun libo memiliki aktivitas antioksidan pada metode DPPH dan ABTS dengan
nilai IC50 berturut-turut pada DPPH 6,70 ppm, 7,30 ppm, 8,50 ppm, 6,00 ppm, dan
10,4 ppm. Untuk ABTS 7,1 ppm, 7,5 ppm, 8,9 ppm, 5,9 ppm, dan 10,6 ppm.
c. Kadar total flavonoid ekstrak dan fraksi daun libo yaitu ekstrak methanol sebesar
547,77 mg/g sampel, fraksi n-heksan 652,78 mg/g sampel, fraksi kloroform
sebesar 657,77 mg/g sampel, fraksi etil asetat sebesar 742,78 mg/g sampel dan
fraksi air sebesar 495,00 mg/g sampel.
d. Kadar total fenolik ekstrak dan fraksi daun libo yaitu ekstrak methanol sebesar
251,40 mg/g sampel, fraksi n-heksan 261,93 mg/g sampel, fraksi kloroform
sebesar 231,93 mg/g , fraksi etil asetat sebesar 280,35 mg/g sampel dan fraksi air
sebesar 75,0 mg/g sampel.
e. Korelasi aktivitas antioksidan metode DPPH dan metode ABTS dengan kadar total
flavonoid ekstrak dan fraksi daun libo masing-masing diperoleh 93,3% dan 97,9
%. Korelasi aktivitas antioksidan metode DPPH dan ABTS dengan kadar total
fenolik ekstrak dan fraksi daun libo masing-masing diperoleh 88,9 % dan 81,8% .

5.2 Saran
Perlu dilakukan pemurnian fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi air, fraksi
etil asetat, ekstrak metanol daun libo dengan metode pemisahan yang sesuai untuk
mengetahui senyawa murni yang berperan sebagai antioksidan.

56
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, A. R., Juwita, J., Ratulangi, S. A. D., dan Malik, A. 2017, Penetapan kadar
fenolik dan flavonoid total ekstrak metanol buah dan daun patikala (Etlingera
elatior (Jack) RM SM). Pharmaceutical Sciences And Research (Psr), 2(1), 1–
10.
Anggraito, Y. U., Susanti, R., Iswari, R., Yuniastuti, A., Lisdiana., Nugrahaningsih,
W., Habibah, N. A., Bintari, S. H., 2018, Metabolit Sekunder dari Tanaman:
Aplikasi dan Produksi, Fakultas Ilmu Matematka dan Pengetahua Alam:
Semarang.

Apak, R., Guclu, K., Demirata, B., Ozyurek, M., Celik, S. E., Bektasoglu, B., 2007,
Comparative Evaluation of Various Total Antioxidant Capacity Assays Applied
to Phenolic Compounds With The CUPRAC Assay, Molecules, 12:1496

Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., Esin, C. S., 2008, Mechanism of Antioxidant
Capacity Assays and the CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant
Capacity) Assay, Springer-Verlag., 160 (413–419).

Ardie, A. M., 2011, Radikal Bebas dan Peran Antioksidan dalam Mencegah Penuaan.
Medicinus, 24 (1).

Arifin, A. S., Yuliana, N. D., Rafi, M., 2019, Aktivitas Antioksidan pada Beras
Berpigmen dan Dampaknya terhadap Kesehatan Antioxidant Activity of
Pigmented Rice and Impact on Health, Jurnal Ilmiah MIPA, 8(2).

Arifin, B., Ibrahim, S., 2018, Struktur Bioaktivitas dan Antioksidan Flavonoid, Jurnal
Zarah, Vol 6 (1).

Azizah, D. N., Endang, K., Fahrauk, F., 2014, Penetapan Kadar Flavonoid Metode
AlCl3 pada Ekstrak Metanol Kulit Buah Kakao (Theobroma Cacao L.), Kartika
Jurnal Ilmiah Farmasi.,Vol 2 (2).

57
Departemen Kesehatan RI, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Direktorat Jendral
Pengawasan Obat dan Makanan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,
Jakarta.

Departemen Kesehatan RI, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV Depertemen

Kesehatan RI, Jakarta

Departemen Kesehatan RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Dey, P. M., 2012, Methods in Plant Biochemistry, Academic Press, 1(1).

Erawati., 2012, Skripsi “Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun (Garcinia dae
dalanthera Pierre) dengan Metode DPPH (1,1-Difenil Pikrilhidrazil) dan
Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Paling Aktif”, Universitas
Indonesia, Depok.

Ergina, Nuryanti. S., Pursitasar, I. D., 2014, Uji Kualitatif Senyawa Metabolit
Sekunder pada Daun Palado (Agave Angustifolia) yang Diekstraksi dengan
Pelarut Air dan Etanol, Jurnal Akademika Kimia. Vol 3(3).

Fitriana, W. D., Fatmawati, S,. dan Ersam. T., 2015., Uji Aktivitas Antioksidan
Terhadap DPPH dan ABTS dari Fraksi-Fraksi Daun Kelor (Moringa Oleifera).,
Prosiding Simposium Nasional Inovasi Dan Pembelajaran Sains., ISBN: 978-
602-19655-8-0.
Haeria., Nurshalati, T., Munadiah., 2018, Penentuan Kadar Flavonoid dan Kapasitas
Antioksidan Ekstrak Etanol Kulit Batang Kelor (Moringa Oleifera L) dengan
Metode DPPH, CUPRAC Dan FRAP, Jf Fik Uinam, 6 (2).

Halvorsen, B.L., Holte, Kari, M., Mari, C. W., Barikmo, I., Hvattum, E., Remberg, S.
F., Wold, A., Haffner, K, Baugerød, H., Andersen, L. F., Moskaug, J., Jacobs,

58
 D. R., Blomhoff, R., 2002., A Systematic Screening of Total Antioxidant in
Dietary Plants, Journal of Nutritio,Vol 3(3).

Hanin, N. N.. F, Pratiwi, R., 2017, Kandungan Fenolik, Flavonoid dan Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Daun Paku Laut (Acrostichum Aureum L.) Fertil dan
Steril, Journal Of Tropical Biodiversity And Biotechnology,Vol (2).

Harbone, J. B., 1987, Metode Fitokimia, edisi I. Bandung: ITB.

Harbone, J. B., 1987, Metode Fitokimia, edisi II, Diterjemahkan oleh kosasih
padmawinata dan iwan soediro, Bandung: ITB press.

Huang, D., Ou, B., Prior, R. L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant Capacity
Assays, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54:1841-1856.

Hutapea, dan Syamsuhidayat, J. R., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia,

Departemen kesehatan republik indonesia, badan penelitian dan pengembangan,
Jakarta.

Imrawati, Mus, S., Gani, S. A., Bubua, K. I., 2017, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi
Etil Asetat Daun Kersen (Muntingia Calabura L.) Menggunakan Metode
ABTS. Journal Of Pharmaceutical And Medicinal Sciences:2(2).
Junaidi, L., 2007, Antioksidan Alami: Sumber, Kimi, dan Teknologi Ekstrak, J.Of
Agro-Based Industry, 24 (2).

Kahkonen, M. P., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J. P., Pihlaja, K., Kujala, T. S.,
dan Heinonen, M., (1999), Antioxidant activity of plant extracts containing
phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(10),
3954–3962.
Karadag, A. B., Ozcelik, S. S., 2009, Review of Methods to Determine Antioxidant
Capacities, Food Analytical Methods, (1) 41-60.

59
Kasmawati, S., Ihsan, S., Suprianti, R., 2019, Kajian Etnomedisin Tumbuhan Obat
Tradisional Suku Muna Desa Oe Nsuli Kecamatan Kabangka Kabupaten Muna
Sulawesi Tenggar, Pharmauho, Vol 5 (1).

Khaira, K., 2010, Menangkal Radikal Bebas dengan Anti-oksidan, Jurnal Saintek, 11
(2).

Lukmanto., 2015, Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Flavonoid Total
Ekstrak dan Fraksi Daun Kenari (Canarium Indicium L), Skripsi, Universitas
Jember.

Maesaroh, K., Dikdik, K., Jamaludin, A. A., 2018, Perbandingan Metode Uji
Aktivitas Antioksidan DPPH, FRAP dan FIC Terhadap Asam Askorbat, Asam
Galat dan Kuersetin, Chimica Et Natura Acta, 6 (2).

Minarno, E. B., 2015, Skrining Fitokimia dan Kandungan Total Flavanoid pada Buah
Carica Pubescens Lenne & K. Koch, El-Hayah, 5 (2)

Mirwan, A., 2013, Keberlakuan Model Hb-Gft Sistem N-Heksana – Mek – Air pada
Ekstraksi Cair-Cair Kolom Isian, Konversi, 2 (1).

Mistriyani, M., Riyanto, S., dan Rohman, A., 2018, Antioxidant activities of
rambutan (Nephelium lappaceum L) peel in vitro. Food Res, 2(1), 119–123.
Molyneux, P., 2004, The Use Of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl
(DPPH) Form Estimating Antioxidant Activity, Journal of Science Technology,
26 (2), 211-219.
Mukhrian., 2014, Ekstraksi Pemisahan Senyawa dan Identifikasi Senyawa Aktif.
Jurnal Kesehatan,Vol 7(2).

Noer, S., Pratiwi, R. D., Gresint, E., 2018, Penetapan Kadar Senyawa Fitokimia
(Tanin, Saponin dan Flavonoid Sebagai Kuersetin) pada Ekstrak Daun Inggu
(Ruta angustifolia L.), Jurnal Ilmu-ilmu MIPA.

60
Nurhasnawati, H. N., Sukmarni., Handayani., 2017, Perbandingan Metode Ekstraksi
Maserasi dan Sokletasi terhadap Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun
Jambu Bol (Syzygium Malaccense L.), Jurnal Ilmiah Manuntung, 3 (1), 9195.

Ozgen, M., Reese, R. N., Tulio, A. Z., Scheerens, J. C., Miller, A. R., 2006,
Modified 2,2-azinobis-3ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) Method
To Measure Antioxidant Capacity of Selected Small Fruits and Comparison To
Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) and 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH) methods, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (4), 1151–
1157.

Pourmorad, F., Hossenimehr, S. J., Shahabimajd, N., 2006, Antioxidant Activity,

Phenol and Flavonoid Contents of Some Selected Iranian Medicial Plants.
African, Journal of Biotechnology, (11) :1142-1145.

Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Journal Of Analytical Chemistry, 10 (2)

Pratiwi, L., Achmad, F., Ronny, M., dan Suwidjiyo, P., 2016, Ekstrak etanol, Ekstrak
etil asetat, Fraksi etil asetat, dan Fraksi n-heksan Kulit Manggis (Garcinia
mangostana L.) Sebagai Sumber Zat Bioaktif Penangkal Radikal Bebas,
Journal of Pharmaceutical Science and Clinical Research.2(3)

Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K., 2005, Standardized Methods For The
Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics In Foods And Dietary
Supplements. J Agric Food Chem, 53 (8) : 3101–3113.

Rahmawati, A., Muflihunna, La. Ode. M. S., 2015, Analisis Aktivitas Antioksidan
Produk Sirup Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dengan Metode DPPH,
Jurnal Fitofarmaka Indonesia, 2 (2).

61
Rastuti, U., dan Purwanti., 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Kalba
(Albazia falcataria) dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil) dan
Indentifikasi Senyawa Metabolik Sekundernya. Molekul, 7 (1), 33–42.

Robinson, T., 1995, Kandungan organik tumbuhan tinggi. In Bandung: ITB (Vol.14).
Rohman A, 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta.

Rohman, A., Sugeng, R., Nurul, K. H., Aktivitas Antioksidan, Kandungan Fenolik
Total, dan Flavonoid Total Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L) Agritech,
27, (4).

Rosahdi, T. D., Mimin, K., Fitri, R. W., 2013, Uji Aktivitas Daya Antioksidan Buah
Rambutan Rapiah dengan Metode Dpph, Jurnal ISTEK, 7(1)

Sami, F. J., Sitti, R., 2015, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Bunga Brokoli
(Brassica Oleracea L. Var. Italica) dengan Metode Dpph (2,2 Diphenyl-
1Picrylhydrazyl) dan Metode Abts (2,2 Azinobis (3-Etilbenzotiazolin)-6-Asam
Sulfonat), Jurnal Fitofarmaka Indonesia, 2 (2).

Sari, A. K., Noverda, A., 2017, Penetapan Kadar Fenolik Total Flavonoid Total
Ekstrak Beras Hitam (Oryza sativa L) dari Kalimantan Selatan, Jurnal Ilmiah
Ibnu Sina, 2 (2).

Sayuti, K., Yenrina, R., 2015, Antioksidan Alami dan Sintetik, Andalas University
Press: Padang, 10-14.

Setiawan, F., Oeke, Y., Ade K, 2018, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Kayu
Secang (Caesalpinia sappan) Menggunakan Metode DPPH, ABTS, dan FRAP,
Media Pharmaceutica Indonesiana, 2 (2).

Shahidi, F., dan Naczk, M., 1995, Food phenolics. Technomic Pub.Co.

62
Silvia, D., Kezia, K., Stefanny, A. H, Vanessa, A., Yunita, S., 2016, Pengumpulan
Data Base Sumber Antioksidan Alami Alternatif Berbasis Pangan Lokal di
Indonesia, Surya Octagon Interdisciplinary Journal of Technology, 1 (2).

Steenis, Van., 2008, Flora, Cetakan Ke-12. Jakarta, PT.Pradnya Paramita.

Steenis,Van., 2005, Flora untuk Sekolah di Indonesia, Jakarta: PT. Pradnya Paramita.

Sudarsono, D. G., Wahyuono, S., Donatus, I., Purnomo., 2002, Tumbuhan Obat II
(Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan), 69-71, Pusat Penelitian Obat.

Suharmiati., Herti, M., 2003, Khasiat dan Manfaat Daun Dewa dan Sambung Nyawa,
Penerbit PT Agromedia Pustaka.

Sunarni, T. S., Pramono, R. Asma., 2007. Flavonoid Antioksidan Penangkap Radikal

dari Daun Kepel (Stelechocarpus burahol), Majalah Farmasi Indonesia, 18 (3).
111- 116

Suryanto, D., Nofri, Y., dan Erman, M., 2016, Antifungal Activity of Endophyte
Bacterial Isolates from Torch ginger (Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith) Root
to Some Pathogenic Fungal Isolates, International Journal of PhramTech
Research, 9(8).

Susanty, Fairus, B., 2016, Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Refluks
Terhadap Kadar Fenolik dari Ekstrak Tongkol Jagung (Zea Mays L.), Konvers,
5 (2).

Syamsul, E. K., Yana, Y. H., Henny, N., 2019, Penetapan Kadar Flavonoid Ekstrak
Daun Kelakai (Stenochlaena Palustris (Burm.F) dengan Metode
Spektrofotometri UV-Vis, Jurnal Riset Kefarmasian Indonesia, 1 (1).

63
Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical Screening
and Extraction: A Review, International Pharmaceutica Sciencia, (1):98-106.
Tradisional, UGM: Jakarta.

Wahdaningsih, S., Subagus, W., Sugeng, R., Retno, M., 2017, Penetapan Kadar
Fenolik Total dan Flavonoid Total Ekstrak Metanol dan Fraksi Etil Asetat Kulit
Buah Naga Merah (Hylocereus Polyrhizus (F.A.C.Weber) Britton, Pharmacon,
6 (3), ISSN 2302–2493.

Wahyuni, R., Guswandi, Riva. H., 2014., Pengaruh Cara Pengeringan dengan Oven,
Kering Angin dan Cahaya Matahari Langsung Terhadap Mutu Simplisia Herba
Sambiloto. Jurnal Farmasi Higea. Vol 6 (2).

Wardhani, R. A., Okviyoandra, A., Emilda, P., 2018, Analisis Skrining Fitokimia,
Kadar Total Fenol-Flavonoid dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Kulit
Tanamn Galam Rawa Gambut (Melaleuca cajuputi roxb), Al Ulum Sains dan
Teknologi, Vol 4 (1).

Werdhasari, A., 2014., Peran Antioksidan Bagi Kesehatan, Jurnal Biotek Medisiana
Indonesia,Vol.3 (2)

Windono, T., Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita., Erowati, T. I.,
2001, Uji Perendam Radikal Bebas terhadap 1,1- Diphenyl-2 Picrylhydrazil
(DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinitera L.)
Probolinggo Biru dan Bali, Artocarpus, 1(1), 34-43.

Wulansari, A. N,, 2018, Alternatif Cantigi Ungu (Vaccinium Varingiae folium)

Sebagai Antioksidan Alami : Review Farmaka,Vol 16 (2).

Wungkana, I., 2013, Aktivitas antioksidan dan tabir surya fraksi fenolik dari limbah
tongkol jagung (Zea mays L.), Pharmacon, 2(4).

64
Yanlinastuti, Syamsul, F., 2016, Pengaruh Konsentrasi Pelarut Untuk Menentukan
Kadar Zirkonium dalam Paduan U-Zr dengan Menggunakan Metode
Spektrofotometri Uv-Vis, Artocarpus. ISSN 1979-2

Zuhra, C. F., Tarigan, J. B., dan Sihotang, H., 2008, Aktivitas antioksidan senyawa
flavonoid dari daun katuk (Sauropus androgunus (L) Merr.). Jurnal Biologi
Sumatera, 3(1).

65
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman

66
67
68
Lampiran 2. Skema Alur Kerja Penelitian
Daun libo

- Diambil bagian batang dan disortasi

basah
- Dicuci bersih dengan air
- Diangin-anginkan dan dirajang
- Dikeringkan dibawah sinar matahari
- Disortasi kering
Simplisia 789 gram
- Diblender hingga diperoleh serbuk
kering
Serbuk Simplisia
- Dimaserasi dengan metanol
sebanyak 9 L
- Diuapkan dengan rotary
evaporator
Ekstrak metanol
195gram
- Ditambahkan aquades 1 L
- Difraksinasi dengan pelarut n-heksan

Sisa air Fraksi n heksan

- Difraksinasi dengan pelarut korofom

Fraksi air Fraksi klorofom

- Difraksinasi dengan pelarut etil asetat

Fraksi air Fraksi etil asetat

Skrining Uji aktivitas Penetapan Kadar Penetapan

Fitokimia antioksidan Flavonoid Kadar Fenolik

Metabolit Aktivitas Kadar Kadar

Sekunder antioksidan Flavonoid Fenolik
nnnnnnnn

69
Lampiran 3. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi

1. Rendamen ekstrak metanol daun libo

Berat simplisia kering = 789,1 g
Berat wadah kosong = 207,4 g
Berat wadah + ekstrak = 402 g
Berak ekstrak = 402 g – 207,4 g = 195 g
% Rendamen = x 100%

= 24,7 %
2. Rendemen fraksi daun libo
a. Berat fraksi n-heksan
Berat ekstrak kental = 100 g
Berat wadah kosong = 20,7 g
Berat wadah + fraksi = 34,7 g
Berak fraksi = 34,7 g – 20,7 g = 14 g
% Rendamen = x 100%

= 14 %
b. Berat fraksi klorofom
Berat ekstrak kental = 100 g
Berat wadah kosong = 20,7 g
Berat wadah + fraksi = 24,5 g
Berak fraksi = 24,5 g – 20,7 g = 3,8 g
% Rendamen = x 100%

= 3,8 %
c. Berat fraksi etil asetat
Berat ekstrak kental = 100 g
Berat wadah kosong = 20,7g
Berat wadah + fraksi = 23,5 g
Berak fraksi = 23,5 g – 20,7 g = 2,8 g
% Rendamen = x 100%

70
 =

= 2,8 %

d. Berat fraksi air

Berat ekstrak kental = 100 g
Berat wadah kosong = 20,7 g
Berat wadah + fraksi = 33,2 g
Berak fraksi = 33,2 g – 20,7 g = 12,5 g
% Rendamen = x 100%

= 12,5 %

71
Lampiran 4.Skrining Fitokimia

1. Pembuatan Pereaksi

a. Pereaksi Dragendrof

Bismuth nitrat Kalium iodida

-Ditimbang 8 g - Ditimbang 27,2 g

-Dilarutkan dalam asam - Dilarutkan dalam
nitrat 20 mL 50 mL aquades

Larutan A Larutan B

Larutan A + B

-Campuran didiamkan sampai memisah

sempurna
-Larutan jernih diambil
-Diencerkan dengan aquadest
secukupnya hingga 100 mL

Pereaksi
Dragendrof

b. Pereaksi Besi (III) klorida 1 %

Besi (III) klorida

-Ditimbang 1g
-Dilarutkan dalam aquades hingga 100
mL
-Disaring
Besi (III)
klorida 1 %

72
2. Uji skrining Fitokimia

a. Alkaloid
Ekstrak dan fraksi daun
libo

- Dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL

- Ditambahkan 2-3 tetes pereaksi dragendrof
- Diamati

(+) atau (-)

Coklat muda atau
kuning

b. Flavonoid
Ekstrak dan fraksi daun
libo

-Dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak

1 mL
-Ditambahkan 0,2 gram serbuk magnesium
-Ditambahakan 2 ml HCL pekat.

(+) atau (-)

berwarna merah

73
c. Terpenoid
Ekstrak dan fraksi daun
libo

- Dimasukkan dalam tabung reaksi

sebanyak 1 mL
- ditambahkan 0,5 mL asam asetat
anhidrat
- ditambahkan 2 mL asam sulfat
pekat

(+) atau (-)

Hijau/hijau
kebiruan

d. Tanin
Ekstrak dan fraksi daun
libo

-Dimasukkan dalam tabung reaksi

sebanyak 1 mL
-Ditambahkan dengan 1 mL
-larutan Fe (III) klorida 1%.

(+) atau (-)

Biru tua, biru
kehitaman, hitam
kehijauan

74
e. Saponin
Ekstrak dan fraksi daun
libo

-Dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 1 ml

-Ditambahkan 2 mlair panas kemudian didinginkan
-Dikocok kuat selama 10 detik.

(+) atau (-)

Terbentuk Busa

e. Fenolik
Ekstrak dan fraksi daun
libo

-Dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL

-Ditambahkan dengan 1 mL larutan Fe (III) klorida 1%.

(+) atau (-)

hitam kehijauan

75
Lampiran 5. Hasil Skrining Fitokimia

a. Ekstrak metanol
1. Alkaloid pereaksi dragendrof Alkaloid pereaksi meyer

B
A A B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak metanol A. Blanko larutan ekstrak metanol
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan pereaksi
dragendrof hasil positif alkaloid dragendrof hasil positif alkaloid
(terbentuk endapan coklat) (terbentuk endapan putih)
Alkaloid pereaksi wagner 2. Flavanoid

B B
A A

76
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak metanol A. Blanko larutan ekstrak metanol
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan
dragendrof hasil positif alkaloid magnesium dan HCL pekat hasil
(terbentuk endapan coklat) positif flavonoid (terbentuk warna
merah)

2. Tanin 3. Saponin

B
A
A
B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak metanol A. Blanko larutan ekstrak metanol
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 1% B. Ekstrak metanol dengan air hangat
positif tanin (terbentuk warna hijau (tidak terbentuk busa)
kehitamam)
5. Terpenoid 6. Fenolik

B B
A
A

77
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak metanol A. Blanko larutan ekstrak metanol
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan H2SO4 B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 1%
pekat dan asam asetat anhidrat positif tanin (terbentuk kehitamam)
hasil positif terpenoid (hijau ke
hitaman)

b. Fraksi n heksan
1. Alkaloid pereaksi dragendrof Alkaloid pereaksi meyer

B A
A B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak n heksan A. Blanko larutan ekstrak n heksan
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan pereaksi
dragendrof hasil positif alkaloid dragendrof hasil positif alkaloid
(terbentuk endapan coklat) (terbentuk endapan putih)

Alkaloid pereaksi wagner 2. Flavanoid

B
A B

78
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak n heksan A. Blanko larutan ekstrak n heksan
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan
dragendrof hasil positif alkaloid magnesium dan HCL pekat hasil
(terbentuk endapan coklat) positif flavonoid (terbentuk warna
merah)

3. Tanin 4. Saponin

A A
B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak n heksan A. Blanko larutan ekstrak n heksan
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 B. Ekstrak metanol dengan air hangat
positif tanin (terbentuk warna hijau (tidak terbentuk busa)
kehitamam)
5. Terpenoid 6. Fenolik

A
B
A

79
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak n heksan A. Blanko larutan ekstrak n heksan
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan H2SO4 B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 1%
pekat dan asam asetat anhidrat positif tanin (terbentuk kehitamam)
hasil positif terpenoid (hijau ke
hitaman)

c. Fraksi klorofom
1. Alkaloid pereaksi dragendrof Alkaloid pereaksi meyer

B A
A B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak klorofom A. Blanko larutan ekstrak klorofom
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan pereaksi
dragendrof hasil positif alkaloid dragendrof hasil positif alkaloid
(terbentuk endapan coklat) (terbentuk endapan putih)
Alkaloid pereaksi wagner 2. Flavanoid

B
A B
A

80
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak klorofom A. Blanko larutan ekstrak klorofom
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan
dragendrof hasil positif alkaloid magnesium dan HCL pekat hasil
(terbentuk endapan coklat) positif flavonoid (terbentuk warna
merah)

3. Tanin 4. Saponin

A
B A

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak klorofom A. Blanko larutan ekstrak klorofom
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 B. Ekstrak metanol dengan air hangat
positif tanin (terbentuk warna hijau (tidak terbentuk busa)
kehitamam)
5. Terpenoid 6. Fenolik

B B

A
A

81
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak klorofom A. Blanko larutan ekstrak klorofom
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan H2SO4 B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 1%
pekat dan asam asetat anhidrat positif tanin (terbentuk kehitamam)
hasil positif terpenoid (hijau ke
hitaman)

d. Fraksi etil asetat

1. Alkaloid pereaksi dragendrof Alkaloid pereaksi meyer

B A
A B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak etil asetat A. Blanko larutan ekstrak etil asetat
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan pereaksi
dragendrof hasil positif alkaloid dragendrof hasil positif alkaloid
(terbentuk endapan coklat) (terbentuk endapan putih)
Alkaloid pereaksi wagner 2. Flavanoid

B
A
B
A

82
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak etil asetat A. Blanko larutan ekstrak etil asetat
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan
dragendrof hasil positif alkaloid magnesium dan HCL pekat hasil
(terbentuk endapan coklat) positif flavonoid (terbentuk warna
merah)

3. Tanin 4. Saponin

B B
A
A

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak etil asetat A. Blanko larutan ekstrak etil asetat
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 B. Ekstrak metanol dengan air hangat
positif tanin (terbentuk warna hijau (tidak terbentuk busa)
kehitamam)
5. Terpenoid 6. Fenolik

B
A B A

83
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak etil asetat A. Blanko larutan ekstrak etil asetat
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan H2SO4 B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 1%
pekat dan asam asetat anhidrat hasil positif tanin (terbentuk kehitamam)
positif terpenoid (hijau ke hitaman)

e. Fraksi air
1. Alkaloid pereaksi dragendrof Alkaloid pereaksi meyer

B
A
A B

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak air A. Blanko larutan ekstrak air
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan pereaksi
dragendrof hasil positif alkaloid dragendrof hasil positif alkaloid
(terbentuk endapan coklat) (terbentuk endapan putih)
Alkaloid pereaksi wagner 2. Flavanoid

B B
A

84
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak air A. Blanko larutan ekstrak air
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan pereaksi B. Ekstrak metanol dengan
dragendrof hasil positif alkaloid magnesium dan HCL pekat hasil
(terbentuk endapan coklat) positif flavonoid (terbentuk warna
merah)

3. Tanin 4. Saponin

B
B
A
A

Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak air A. Blanko larutan ekstrak air
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 B. Ekstrak metanol dengan air hangat
positif tanin (terbentuk warna hijau (tidak terbentuk busa)
kehitamam)
7. Terpenoid 8. Fenolik

B
B
A
A

85
Keterangan: Keterangan:
A. Blanko larutan ekstrak air A. Blanko larutan ekstrak air
tanpa pereaksi tanpa pereaksi
B. Ekstrak metanol dengan H2SO4 B. Ekstrak metanol dengan FeCL3 1%
pekat dan asam asetat anhidrat positif tanin (terbentuk kehitamam)
hasil positif terpenoid (terbentuk
warna hijau ke hitaman)

86
Lampiran 6. Pengujian Antioksidan Ekstrak

1. Skema Kerja Uji Antioksidan

a. Pembuatan larutan DPPH

DPPH

- Di timbang 16 mg DPPH
- Dilarutkan dalam matanol p.a
- Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL
- Diencerkan hingga tanda tera
- dikocok sampai homogen

Larutan DPPH 0,4 mM

b. Pembuatan larutan pembanding

Vitamin C

- Ditimbang 10 mg asam vitamin C

- Dilarutkan menggunakan metanol p.a
sambil diaduk dan dihomogenkan
- Dicukupkan volumenya 100 mL
- Dibuatvariasikonsentrasi

1ppm 2 ppm 3 ppm 4 ppm 5 ppm

- Dimasukkan masing-masing larutan ke dalam tabung

reaksi sebanyak 1 ml
- Ditambahkan 1mL DPPH dan metanol p.a 5,3 mL
- Dikocok hingga homogen
- Diinkubasi pada ruang selama 30 menit
- Diuji serapan pada panjang gelombang 528,6 nm
- Dihitung nilai IC50

Hasil

87
c. Pembuatan larutan sampel dan pengujian

Ekstrak dan fraksi

daun libo

- Ditimbang 10 mg ekstrak
- Dilarutkan menggunakan metanol p.a
sambildiaduk dan dihomogenkan
- Dicukupkan volumenya 100 mL
- Dibuatvariasikonsentrasi

1 ppm 2 ppm 3ppm 4ppm 5 ppm

- Dimasukkan masing-masing larutan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 1 ml
- Ditambahkan 1mL DPPH dan metanol p.a 5,3 mL
- Dikocok hingga homogen
- Diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit
- Diuji serapan pada panjang gelombang 528,6 nm
- Dihitung nilai IC50

Hasil

88
2. Perhitungan Konsentrasi Untuk Uji Antioksidan
a. pembuatan larutan DPPH
Molaritas (M) =

Mol =

Mol = = = 4,057 10-5 mol

Molaritas (M) =

0.004 M = 0,4 mM

b. Perhitungan Seri konsentrasi pembanding Vitamin C dan sampel daun libo

a. Konsentrasi 1ppm b. Konsentrasi 1ppm

M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
100 ppm.V1 =1ppm. 10 mL 100 ppm.V1 =2 ppm. 10 mL
100 ppm.V1 = 100 ppm.V1 =

V1 = V1 =

V1 = 0,1 mL V1 = 0,2 mL

c. Konsentrasi 1ppm d. Konsentrasi 1ppm

M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
100 ppm.V1 =1ppm. 10 mL 100 ppm.V1 =1ppm. 10 mL
100 ppm.V1 = 100 ppm.V1 =

V1 = V1 =

V1 = 0,3 mL V1 = 0,4 mL

e. Konsentrasi 1ppm
M1.V1 = M2.V2
100 ppm.V1 =1ppm. 10 mL
100 ppm.V1 =

V1 =

V1 = 0,5 mL

89
Lampiran 7. Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas antioksidan

Data
ABS
WL awal 600
WL akhir 400
Panjang gelombang maksimum 528,6 nm
Lampiran 8. Penentuan Operating Time Untuk Uji Aktivitas Antioksidan pada panjang gelombang
528,6 nm

Waktu Absorbansi (Å)

Inkubasi Rata-Rata
I II III
(Menit)
10 0.639 0.64 0.639 0.639
20 0.633 0.632 0.632 0.633
30 0.617 0.613 0.611 0.614
40 0.613 0.614 0.613 0.613
50 0.611 0.613 0.614 0.613
60 0.617 0.614 0.611 0.614

90
Operating time yang diperoleh 30 menit

Lampiran 9. Hasil pengukuran Uji aktivitas antioksidan daun libo pada panjang gelombang
528,6 nm

Sampel Konsentrasi Absorbansi (Å) Rata-rata

(ppm) I II III
DPPH 0,4 mM 0.741 0.743 0.742 0.742
1 0.610 0.611 0.611 0.611
2 0.543 0.542 0.543 0.543
Vitamin C 3 0.433 0.431 0.434 0.433
4 0.385 0.386 0.387 0.386
5 0.313 0.309 0.315 0.312
1 0.704 0.704 0.703 0.704
2 0.675 0.673 0.675 0.674
Ekstrak
3 0.576 0.575 0.576 0.576
Metanol
4 0.500 0.500 0.502 0.501
5 0.493 0.495 0.492 0.493
1 0.710 0.709 0.709 0.709
2 0.689 0.686 0.688 0.688
Fraksi n
3 0.646 0.647 0.646 0.646
heksan
4 0.560 0.569 0.563 0.564
5 0.481 0.483 0.484 0.483
1 0.719 0.714 0.726 0.720
2 0.695 0.692 0.696 0.694
Fraksi
3 0.642 0.641 0.642 0.642
kloroform
4 0.591 0.590 0.590 0.590
5 0.530 0.532 0.533 0.532
Fraksi etil 1 0.681 0.682 0.681 0.681

91
 asetat 2 0.635 0.632 0.634 0.634
3 0.592 0.591 0.594 0.592
4 0.547 0.543 0.547 0.546
5 0.394 0.397 0.395 0.395
1 0.721 0.722 0.724 0.722
2 0.686 0.685 0.685 0.685
Fraksi air 3 0.653 0.654 0.656 0.654
4 0.602 0.604 0.606 0.604
5 0.575 0.577 0.576 0.576

Lampiran 10. Kurva Aktivitas Antioksidan terhadap terhadap DPPH

Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas

antioksidan vitamin c antioksidan vitamin c

Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas

antioksidan vitamin c antioksidan ekstrak metanol

92
Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas
antioksidan ekstrak metanol antioksidan ekstrak metanol

Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas

antioksidan fraksi h heksan antioksidan fraksi n heksan

93
Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas
antioksidan fraksi n heksan antioksidan fraksi klorofom

Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas

antioksidan fraksi klorofom antioksidan fraksi klorofom

Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas

antioksidan fraksi etil asetat antioksidan fraksi etil asetat

94
 Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas
antioksidan fraksi etil asetat antioksidan fraksi air

Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas

antioksidan fraksi air antioksidan fraksi air

Lampiran 11. Pengujian Antioksidan Ekstrak

a. Pembuatan larutan ABTS

ABTS
- Di timbang 0,0900 g ABTS
- Dilarutkan 5 ml aquades
- Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL
- Diencerkan hingga tanda tera menggunakan metanol p.a
- dikocok sampai homogeny

Larutan ABTS 7 Mm

95
b. Pembuatan larutan kalium persulfat

K2S2O8

- Di timbang 0,1655 g K2S2O8

- Dilarutkan 5 ml aquades yang sudah dipanaskan
- Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL
- Diencerkan hingga tanda tera menggunakan metanol p.a
- dikocok sampai homogeny

Larutan K2S2O8 24,5 mM

c. Pembuatan larutan stok ABTS

ABTS 7 mM dan
K2S2O8 24,5 mM
- Di masukan larutan ABTS 7 mM dalam labu ukur 50 ml
- Ditambahkan larutan K2S2O8 24,5 mM dalam labu ukur yang sama
- Diencerkan hingga tanda tera
- dikocok sampai homogeny
- Diinkubasi selama 16 jam pada suhu ruangan

Larutan K2S2O8 24,5 mM

96
e. Pembuatan larutan sampel dan pengujian

Ekstrak dan fraksi

daun libo

- Ditimbang 10 mg asam vitamin C

- Dilarutkan menggunakan metanol p.a
sambil diaduk dan dihomogenkan
- Dicukupkan volumenya 100 mL
- Dibuatvariasikonsentrasi

1ppm 2 ppm 3 ppm 4 ppm 5 ppm

- dimasukkan masing-masing larutan ke dalam tabung

reaksi sebanyak 1 mL
- Ditambahkan 1mL DPPH dan metanol p.a 5,3 mL
- Dikocok hingga homogen
- Diinkubasi pada ruang selama 30 menit
- Diuji serapan pada panjang gelombang 745,5 nm
- Dihitung nilai IC50

Hasil

97
d. Perhitungan Konsentrasi Untuk Uji Antioksidan
a. pembuatan larutan ABTS
Molaritas (M) =

Mol =

Mol = = = 1,75.10-4 mol

Molaritas (M) =

0.007 M = 0,7 Mm

b. pembuatan larutan kalium persulfat

Molaritas (M) =

Mol =

Mol = = = 6,125 10-4mol

Molaritas (M) =

0.0245 M = 24,5 Mm

c. Perhitungan Seri konsentrasi pembanding Vitamin C dan sampel daun libo

a. Konsentrasi 1ppm b. Konsentrasi 1ppm
M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
.V
100 ppm 1 =1ppm. 10 mL .V
100 ppm 1 =2 ppm. 10 mL
V
100 ppm. 1 = 100 ppm.V1 =

V1 = V1 =

V1 = 0,1 mL V1 = 0,2 mL

98
 c. Konsentrasi 1ppm d. Konsentrasi 1ppm
M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
100 ppm.V1 =1ppm. 10 mL 100 ppm.V1 =1ppm. 10 mL
100 ppm.V1 = 100 ppm.V1 =

V1 = V1 =

V1 = 0,3 mL V1 = 0,4 mL
e. Konsentrasi 1ppm
M1.V1 = M2.V2
.V
100 ppm 1 =1ppm. 10 mL
100 ppm.V1 =

V1 =

V1 = 0,5 mL

Lampiran 12. Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas antioksidan

Data
ABS
WL awal 800
WL akhir 400
Panjang gelombang maksimum 745,5 nm

Lampiran 13. Penentuan Operating Time Untuk Uji Aktivitas Antioksidan pada
panjang gelombang 745,5 nm

99
 Waktu Absorbansi (Å)
Inkubasi Rata-Rata
(Menit) I II III

10 0.628 0.626 0.625 0.627

20 0.622 0.622 0.622 0.622
30 0.618 0.619 0.62 0.619
40 0.619 0.62 0.618 0.619
50 0.620 0.619 0.618 0.619
60 0.619 0.62 0.618 0.619
Operating time yang diperoleh 30 menit

Gambar. Operating time ABTS

100
Lampiran 14. Hasil pengukuran Uji aktivitas antioksidan daun libo pada
panjang gelombang 745,5 nm

Sampel Konsentrasi Absorbansi (Å) Rata-rata

(ppm) I II III
ABTS dan
7 mM dan
Kalium 0,786 0,784 0,785 -
24,5 mM
persulfat
1 0.625 0.629 0.630 0.628
2 0.592 0.591 0.592 0.592
Vitamin C 3 0.534 0.534 0.534 0.534
4 0.414 0.413 0.414 0.414
5 0.372 0.367 0.364 0.368
1 0.721 0.720 0.721 0.721
2 0.654 0.655 0.675 0.661
Ekstrak
3 0.600 0.600 0.593 0.598
Metanol
4 0.556 0.555 0.544 0.552
5 0.493 0.495 0.492 0.493
1 0.710 0.711 0.710 0.710
2 0.674 0.676 0.676 0.675
Fraksi n
3 0.626 0.626 0.625 0.626
heksan
4 0.567 0.566 0.565 0.566
5 0.495 0.493 0.495 0.494
1 0.715 0.717 0.716 0.716
2 0.694 0.692 0.695 0.694
Fraksi
3 0.64 0.641 0.642 0.641
kloroform
4 0.590 0.589 0.590 0.590
5 0.544 0.542 0.543 0.543
1 0.691 0.692 0.692 0.692
2 0.645 0.646 0.647 0.646
Fraksi etil
3 0.582 0.585 0.587 0.585
asetat
4 0.556 0.557 0.558 0.557
5 0.390 0.391 0.392 0.391
1 0.722 0.724 0.726 0.724
2 0.691 0.692 0.693 0.692
Fraksi air 3 0.666 0.667 0.668 0.667
4 0.604 0.605 0.606 0.605
5 0.582 0.581 0.582 0.582

101
Lampiran 15. Kurva Aktivitas Antioksidan terhadap terhadap DPPH

Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas

antioksidan vitamin c antioksidan vitamin c

Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas

antioksidan vitamin c Ektrak metanol

102
Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas
Ekstrak metanol Ektrak metanol

Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas

Fraksi n heksan Fraksi n heksan

Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas

Fraksi n heksan Fraksi klorofom

Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas

Fraksi klorofom Fraksi klorofom

103
Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas
Fraksi etil asetat Fraksi etil asetat

Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas Gambar. Kurva ABS 1 aktivitas

Fraksi etil asetat Fraksi air

Gambar. Kurva ABS 2 aktivitas Gambar. Kurva ABS 3 aktivitas

Fraksi air Fraksi air

104
Lampiran 16. Penentuan kadar Flavonoid

1. Skema Kerja

a. Pembuatan dan Pengukuran Larutan Quarsetin

Kuarsetin

- Di timbang 10 mg quarsetin
- Dilarutkan dalam matanol pa sebanyak
- Dimasukkan ke dalam labu ukur10 mL
- Diencerkan hingga tanda tera
- dikocok sampai homogen

20 ppm 40 ppm 60 ppm 80 ppm 100 ppm

- Diambil 1 mL
- Ditambahkan 3 mL metanol p.a
- Ditambahkan 0,2 mL AlCl3 10 %,
- Ditambahkan 0,2 mL kalium asetat 1 M
- dicukupkan dengan aqudes sampai 10 mL
- Dilakukan pengukuran panjang gelombang
maksimal dan operating time sala satu
larutan baku

Hasil

105
a. Pembuatan dan pengukuran Larutan Sampel

Ekstrak dan fraksi daun libo

( Ficus septica burm. F)

- Di timbang 10 mg
- Dilarutkan dalam matanol pa sebanyak
- Dimasukkan ke dalam labu ukur10 mL
- Diencerkan hingga tanda tera
- dikocok sampai homogen

Larutan sampel 1000 ppm

- diambil 1 mL ditambahkan 3 mL metanol

p.a
- ditambahkan 0,2 mL AlCl3 10%
- ditambahkan 0,2 mL kalium asetat 1M dan
- dicukupkan dengan aquades sampai 10 mL
- diinkubasi selama operating time pada suhu
ruang
- diukur absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum 430,6 nm

Hasil

106
1. Perhitungan Konsentrasi penetapan kadar Flavonoid

a. Pembuatan larutan ALCL3 10%

% berat = %

%=

Jadi pembuatan larutan ALCL3 10% dalam 100 mL, ditimbang 10 gram dilarutkan sebanyak

100 mL aquades.

b. Pembuatan Larutan Kalium Asetat 1 Molaritas

M=

1=

Massa= 9,8 gram

c. Perhitungan konsentrasi untuk larutan pembanding kuarsetin

1. Konsentrasi 20 ppm 2. Konsentrasi 40 ppm

M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
1000 ppm. V1 = 20 ppm. 10 mL 1000 ppm. V1 = 40 ppm. 10 mL
1000 ppm. V1 = 1000ppm. V1 =

V1 = = 0,2 mL V1 = = 0,4 mL

107
3. Konsentrasi 60 ppm 4. Konsentrasi 80 ppm

M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2

1000 ppm. V1 = 60 ppm. 10 mL 1000 ppm. V1 = 80 ppm. 10 mL

1000 ppm. V1 = 1000 ppm. V1 =

V1 = = 0,8 mL
V1 = = 0,6 mL

5. Konsentrasi 100 ppm

M1.V1 = M2.V2
1000 ppm. V1 = 100 ppm. 10 mL
1000ppm. V1 =

V1 = = 1 mL

108
Lampiran 17. Penentuan panjang gelombang maksimum penetapan kadar flavonoid
Total

Data
ABS
WL awal 600
WL akhir 400
Panjang gelombang maksimum 409 nm

Lampiran 18. Penentuan Operating Time Untuk penetapan kadar flavonoid pada
panjang gelombang 409 nm

Waktu Absorbansi (Å)

Inkubasi Rata-Rata
(Menit) I II III

10 0.425 0.426 0.424 0.425

20 0.469 0.467 0.468 0.468

30 0.375 0.376 0.377 0.376

40 0.377 0.376 0.378 0.377

50 0.377 0.376 0.377 0.377

60 0.378 0.378 0.376 0.377

Operating time yang diperoleh 30 menit

109
 Gambar. Operating time kuarsetin

Lampiran 19. Perhitungan Kadar Flavonoid Total

Tabel 7. Hasil Pengukuran Abosrbansi Standar Quersetin

Konsentrasi Absorbansi (Å)

kuarsetin Rata-rata
(ppm) I II III
20 0.311 0.31 0.3 0.307
40 0.452 0.453 0.453 0.453
60 0.596 0.598 0.598 0.597
80 0.688 0.687 0.687 0.687
100 0.789 0.788 0.788 0.788

Kurva baku kuarsetin abs 1

Gambar. Hubungan antara Absorbansi dengan Konsentrasi kuarsetin yang dinyatakan

dalam mg/L (ppm)

110
 Persamaan regreasi linier y = 0,006x + 0,209, dengan persamaan regresi linier dapat
diketahui nilai x menyatakan konsentrasi dalam mg/L (ppm) dan y menyatakan absorbansi.
Perhitungan kadar total flavonoid pada eksrak dan fraksi daun libo.

a. Ekstrak metanol b. Fraksi n heksan

y = 0,006x + 0,209 y = 0,006x + 0,209

0,532= 0,006x + 0,209 0,599= 0,006x + 0,209

0,006x = 0.532 - 0,209 0,006x = 0.599 - 0,209

0,006x = 0,323x = = 53,83ppm 0,006x = 0,390x = = 65,00 ppm

c. Fraksi klorofom d. Fraksi etil asetat

y = 0,006x + 0,209 y = 0,006x + 0,209

0,601= 0,006x + 0,209 0,652= 0,006x + 0,209

0,006x = 0.601 - 0,209 0,006x = 0.652 - 0,209

0,006x = 0,392x = = 65,33 ppm 0,006x = 0,443x = = 73,83 ppm

a. Fraksi air
y = 0,006x + 0,209

0,503= 0,006x + 0,209

0,006x = 0.503 - 0,209

0,006x = 0,294x = = 49,00 ppm

2. Perhitungan Kadar Total Flavonoid per berat sampel

a. ekstrak metanol
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g

111
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 53,83 ppm = 53,83 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran

Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 538,3 mgEK/g ekstrak

b. fraksi n heksan
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 65,00 ppm = 65,00 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran

Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 650 mgEK/g ekstrak

c. fraksi klorofom
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 65,33 ppm = 65,33 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran

Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 653,3 mgEK/g ekstrak

d. fraksi etil asetat
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 73,83ppm = 73,83 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran

112
 Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 738,3 mgEK/g ekstrak

e. fraksi air
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 49,00 ppm = 49,00 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran

Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 490 mgEK/g ekstrak

Kurva baku kuarsetin abs 2

Gambar. Hubungan antara Absorbansi dengan Konsentrasi kuarsetin yang dinyatakan dalam mg/L
(ppm)
Persamaan regreasi linier y =0,006x + 0,210, dengan persamaan regresi linier dapat diketahui
nilai x menyatakan konsentrasi dalam mg/L (ppm) dan y menyatakan absorbansi.
h. Perhitungan kadar total flavonoid pada eksrak dan fraksi daun libo.
a. Ekstrak metanol b. Fraksi n heksan
y = 0,006x + 0,210 y = 0,006x + 0,210

0,538= 0,006x + 0,210 0,599= 0,006x + 0,210

113
 0,006x = 0.538- 0,210 0,006x = 0.599 - 0,210

0,006x = 0,328x = = 5,46 ppm 0,006x = 0,389x = = 6,48 ppm

c. Fraksi klorofom d. Fraksi etil asetat

y = 0,006x + 0,210 y = 0,006x + 0,210

0,603= 0,006x + 0,210 0,652= 0,006x + 0,210

0,006x = 0.603 - 0,210 0,006x = 0.652 - 0,210

0,006x = 0,393x = = 6,55 ppm 0,006x = 0,442x = = 7,36 ppm

e. Fraksi air
y = 0,006x + 0,210

0,509= 0,006x + 0,210

0,006x = 0.509 - 0,210

0,006x = 0,299x = = 4,98 ppm

3. Perhitungan Kadar Total Flavonoid per berat sampel

a. ekstrak metanol
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 5, 46 ppm = 5,46 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 54,6 mgEK/g ekstrak

b. fraksi n heksan
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
114
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 6,48 ppm = 6,48mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 64,8 mgEK/g ekstrak

c. fraksi klorofom
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 6,55ppm = 6,55mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 65, 5 mgEK/g ekstrak

d. fraksi etil asetat

Berat Ekstrak(m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 7,36 ppm = 7,36 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 73,6 mgEK/g ekstrak

e. fraksi air
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 4,98 ppm = 4,98 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 49,8 mgEK/g ekstrak

115
Kurva baku kuarsetin abs 3

Gambar. Hubungan antara Absorbansi dengan Konsentrasi kuarsetin yang dinyatakan dalam mg/L
(ppm)
Persamaan regreasi linier y =0,006x + 0,202, dengan persamaan regresi linier dapat diketahui
nilai x menyatakan konsentrasi dalam mg/L (ppm) dan y menyatakan absorbansi.
h. Perhitungan kadar total flavonoid pada eksrak dan fraksi daun libo.
a. Ekstrak metanol b. Fraksi n heksan
y = 0,006x + 0,202 y = 0,006x + 0,202

0,537= 0,006x + 0,202 0,598= 0,006x + 0,202

0,006x = 0.537- 0,202 0,006x = 0.598 - 0,202

0,006x = 0,335x = = 55,83 ppm 0,006x = 0,396x = = 66,00 ppm

c. Fraksi klorofom d. Fraksi etil asetat

y = 0,006x + 0,202 y = 0,006x + 0,202

0,601= 0,006x + 0,202 0,654= 0,006x + 0,202

0,006x = 0.601 - 0,202 0,006x = 0.654 - 0,202

0,006x = 0,399x = = 66,5 ppm 0,006x = 0,452x = = 75,3 ppm

116
 e. Fraksi air
y = 0,006x + 0,202

0,500= 0,006x + 0,202

0,006x = 0.500 - 0,202

0,006x = 0,298x = = 49,66 ppm

4. Perhitungan Kadar Total Flavonoid per berat sampel

a. ekstrak metanol
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 55,83 ppm = 55,83mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 558,3 mgEK/g ekstrak

b. fraksi n heksan
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 66,00 ppm = 66,00 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 660 mgEK/g ekstrak

c. fraksi klorofom
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 66,5 ppm = 66,5 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

117
 = 665 mgEK/g ekstrak

d. fraksi etil asetat

Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 75,3 ppm = 75,3 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 753 mgEK/g ekstrak

e. fraksi air
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total flavonoid (C) = nilai x = 49,66 ppm = 49,66 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total flavonoid per berat sampel = =

= 496,6 mgEK/g ekstrak

118
Lampiran 20. Penentuan kadar Fenolik
1. Skema Kerja

a. Pembuatan dan Pengukuran Larutan asam galat

Asam Galat

- Di timbang 10 mg asam galat

- Dilarutkan dalam matanol p.a
- Dimasukkan ke dalam labu ukur
10 mL
- Diencerkan hingga tanda tera,
dikocok sampai homogen

5 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm 25 ppm

- Diambil 1 mL dimasukkan masing-masing larutan ke

dalam lab ukur
- Ditambahkan 0,4 mL reagen Folin-cioalteu
- Dibiarkan selama 5-8 menit
- Ditambahkan NaCO3 7 % sebanyak 4 ml dan
aquabidestilata sampai tanda tera.
- Dilakukan pengukuran panjang gelombang
maksimum dan operating time sala satu larutan baku
-

Hasil

119
b. Pembuatan dan Pengukuran Larutan Sampel

Ekstrak dan fraksi daun libo

( Ficus septica Burm)

- Di timbang 10 mg
- Dilarutkan dalam matanol p.a
- Dimasukkan ke dalam labu ukur10
mL
- Diencerkan hingga tanda tera
- dikocok sampai homogen
Larutan sampel 1000
ppm

- Masing-masing diambil sebanyak 1 mL

setiap larutan
- Ditambahkan dengan 0,4 mL reagen Folin
Ciocalteau
- Dikocok dan dibiarkan 4-8 menit,
- Ditambahkan 4 mL larutan Na2CO3 7%,
dikocok hingga homogen
- Ditambahkan aquades hingga 10 mL.
- Didiamkan selama operating time
- Diukur absorbansinya pada panjang
maksimum 745,7 nm
-

Hasil

120
1. Perhitungan Konsentrasi Untuk penetapan Kandungan Fenol Total
a. Pembuatan larutan Na2CO3 7%
% berat = %

%=

b. larutan pembanding asam galat

1. Konsentrasi 5 ppm 2. Konsentrasi 10 ppm
M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
1000 ppm. V1 = 5 ppm. 10 mL 1000 ppm. V1 = 10 ppm. 10 mL
1000 ppm. V1 = 1000ppm. V1 =

V1 = = 0,05 mL V1 = = 0,1 mL

3. Konsentrasi 15 ppm 4. Konsentrasi 20 ppm

M1.V1 = M2.V2 M1.V1 = M2.V2
1000 ppm. V1 = 15 ppm. 10 mL 1000 ppm. V1 = 20 ppm. 10 mL
1000 ppm. V1 = 1000 ppm. V1 =

V1 = = 0,15 mL V1 = = 0,2 mL

5. Konsentrasi 25 ppm
M1.V1 = M2.V2
1000 ppm. V1 = 25 ppm. 10 mL
1000ppm. V1 =

V1 = = 0,25mL

121
 Lampiran 21. Penentuan panjang gelombang maksimum penetapan kadar fenolik total

Data
ABS
WL awal 800
WL akhir 600
Panjang gelombang maksimum 742,5 nm

Lampiran 22. Penentuan Operating Time Untuk penetapan kadar fenolik pada panjang
gelombang 742,75 nm
Waktu Absorbans (Å)
Rata-
Inkubasi
I II III Rata
(Menit)

10 0.267 0.266 0.268 0.267

20 0.298 0.299 0.299 0.299

30 0.336 0.337 0.336 0.336

40 0.336 0.337 0.335 0.336

Gambar. Operating time fenolik
50 0.336 0.335 0.336 0.336
Operating time yang diperoleh 30 menit
60 0.337 0.336 0.336 0.336

122
Lampiran 18. Perhitungan kadar fenolik Total

Konsentrasi Absorbansi (Å)

kuarsetin Rata-rata
(ppm) I II III
5 0.348 0.347 0.347 0.347
10 0.456 0.457 0.454 0.456
15 0.571 0.572 0.572 0.572
20 0.636 0.637 0.636 0.637
25 0.747 0.745 0.746 0.746

Kurva baku kuarsetin abs 1

Gambar .Hubungan Absorbansi dengan Konsentrasi asam galat yang dinyatakan dalam mg/L
(ppm)
Persamaan regreasi linier y =0,019x + 0,258, dengan persamaan regresi linier dapat
diketahui nilai x menyatakan konsentrasi dalam mg/L (ppm) dan y menyatakan absorbansi.
a. Ekstrak metanol b. Fraksi n heksan
y = 0,019x + 0,258 y = 0,019x + 0,258

0,735= 0,019 + 0,258 0,755,= 0,019 + 0,258

0,019x = 0,735- 0,258 0,019x = 0,755- 0,258

0,019x = 0,477x = = 25,10 ppm 0,019x = 0,497x = = 26,15 ppm

123
 c. Fraksi klorofom d. Fraksi etil asetat
y = 0,019x + 0,258 y = 0,019x + 0,258

0,699= 0,019 + 0,258 0,790= 0,019 + 0,258

0,019x = 0,699- 0,258 0,019x = 0,790- 0,258

0,019x = 0,441x = = 23,21 ppm 0,019x = 0,532x = = 28 ppm

e. Fraksi air
y = 0,019x + 0,258

0,400= 0,019 + 0,258

0,019x = 0,400- 0,258

0,019x = 0,142x = = 7,47 ppm

2. Perhitungan Kadar Total Fenolik per berat sampel

a. ekstrak metanol
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 25,10 ppm = 25,10 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 251 mgEK/g ekstrak

b. fraksi n heksan

Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g

Kadar total fenolik (C) = nilai x = 26, 15 ppm = 26,15 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
124
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 261,5 mgEK/g ekstrak

c. fraksi klorofom
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 23,21 ppm = 23,21mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L= 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 232,1 mgEK/g ekstrak

d. fraksi etil asetat

Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 28 ppm = 28 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 280 mgEK/g ekstrak

e. fraksi air
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 7,47 ppm = 7,47 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 74,7 mgEK/g ekstrak

125
Kurva baku asam galat abs 2

Gambar .Hubungan Absorbansi dengan Konsentrasi asam galat yang dinyatakan dalam mg/L
(ppm)
Persamaan regreasi linier y =0,019x + 0,258, dengan persamaan regresi linier dapat
diketahui nilai x menyatakan konsentrasi dalam mg/L (ppm) dan y menyatakan absorbansi
.
a. Ekstrak metanol b. Fraksi n heksan
y = 0,019x + 0,258 y = 0,019x + 0,258

0,736= 0,019 + 0,258 0,756,= 0,019 + 0,258

0,019x = 0,736- 0,258 0,019x = 0,756- 0,258

0,019x = 0,478x = = 25,15 ppm 0,019x = 0,498x = = 26,21 ppm

c. Fraksi klorofom d. Fraksi etil asetat

y = 0,019x + 0,258 y = 0,019x + 0,258

0,697= 0,019 + 0,258 0,791= 0,019 + 0,258

0,019x = 0,697- 0,258 0,019x = 0,791- 0,258

0,019x = 0,439x = = 23,10 ppm 0,019x = 0,533x = = 28,05 ppm

126
 e. Fraksi air
y = 0,019x + 0,258

0,402= 0,019 + 0,258

0,019x = 0,402- 0,258

0,019x = 0,144x = = 7,57 ppm

3. Perhitungan Kadar Total Fenolik per berat sampel

a. ekstrak metanol
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 25,15 ppm = 25,15 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 251,5 mgEK/g ekstrak

b. fraksi n heksan
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 26, 21ppm = 26,21 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 262,1mgEK/g ekstrak

c. fraksi klorofom
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 23,10 ppm = 23,10 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L= 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

127
 = 231 mgEK/g ekstrak

d. fraksi etil asetat

Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 28,05 ppm = 28,05 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 280,5 mgEK/g ekstrak

e. fraksi air
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 7,57 ppm = 7,57 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 75,7 mgEK/g ekstrak

Kurva baku asam galat abs 3

Gambar .Hubungan Absorbansi dengan Konsentrasi asam galat yang dinyatakan dalam mg/L
(ppm)
Persamaan regreasi linier y =0,019x + 0,257, dengan persamaan regresi linier dapat
diketahui nilai x menyatakan konsentrasi dalam mg/L (ppm) dan y menyatakan absorbansi.

128
 a. Ekstrak metanol b. Fraksi n heksan
y = 0,019x + 0,257 y = 0,019x + 0,257

0735, =0,019x + 0,257 0,755 =0,019x + 0,257

0,019x = 0,735 - 0,257 0,019x = 0,755 - 0,257

0,019x = 0,478 x = = 25,15 ppm 0,019x = 0,498 x = = 26,21 ppm

c. Fraksi klorofom d. Fraksi etil asetat

y = 0,019x + 0,257 y = 0,019x + 0,257

0,699=0,019x + 0,257 0,791=0,019x + 0,257

0,019x = 0,699 - 0,257 0,019x = 0,791 - 0,257

0,019x = 0,442x = = 23,26 ppm 0,019x = 0,534x = = 28,10 ppm

e. Fraksi air
y = 0,019x + 0,257

0,400 =0,019x + 0,257

0,019x = 0,400 - 0,257

0,019x = 0,143 x = = 7,52 ppm

4. Perhitungan Kadar Total Fenolik per berat sampel

a. ekstrak metanol
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 25,15 ppm = 25,15 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran

129
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 251,5 mgEK/g ekstrak

b. fraksi n heksan
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 26, 21ppm = 26,21 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 262,1mgEK/g ekstrak
c. fraksi klorofom
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 23,26 ppm = 23,26 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L= 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 231 mgEK/g ekstrak

d. fraksi etil asetat

Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 28,10 ppm = 28,10 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 280,5 mgEK/g ekstrak

e. fraksi air
Berat Ekstrak (m) = 10 mg = 0,01 g
Kadar total fenolik (C) = nilai x = 7,52 ppm = 7,52 mg/L
Volume ekstrak (v) = 0,01 L = 0,01 kg
Fp = 10 kali pengenceran
Kadar total fenolik per berat sampel = =

= 75,7 mgEK/g ekstrak

130
Lampiran 23. Dokumentasi Penelitian
a. Preparasi Sampel

Pengambilan Sampel Pengeringan Simplisia

b. Preparasi Sampel

Proses Maserasi Penyaringan Evaporasi

Hasil ekstrak

131
c. Fraksinasi

Proses fraksinasi Evaporasi hasil fraksi Fraksi kental n-heksan

Fraksi kental etil asetat Fraksi kloroform Fraksi kental Air

d. Uji Aktivitas Antioksidan

Larutan Kontrol DPPH 0,6 Larutan DPPH sebelum Larutan DPPH setelah

132
 Mm ditambahkan sampel ditambahkan vitamin C

Larutan DPPH setelah Pengukuran Absorbansi

ditambahkan sampel

Larutan Kontrol ABTS Larutan ABST sebelum Larutan ABTS setelah

ditambahkan sampel ditambahkan vitamin C

133
 Larutan ABTS setelah Pengukuran Absorbansi
ditambahkan sampel
e. Penetapan Kadar Flavonoid

Larutan Satandar Larutan sampel Pengukuran Absorbansi

Quarsetin

f. Penetapan Kadar Fenolik

Larutan Satandar Larutan sampel Pengukuran Absorbansi

Quarsetin

134