BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan dari bulan Maret sampai Mei di Laboraturium

Bioteknologi Bahan Alam Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Jl. Raya Bogor Km
46, Cibinong 1699, Bogor, Jawa Barat, Indonesia.

3.2 Bahan

Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun keji beling,
daun bakau merah dan batang katuk yang diperoleh dari Laboraturium Bioteknologi
Bahan Alam Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong, etanol 96%, akuades,
kertas saring, HCL pekat, pereaksi Wagner, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorff,
metanol pro analisis, magnesium, FeCl3, kloroform, asam asetat anhidrat, asam
sulfat pekat, aluminium foil, telur larva udang (Artemia salina L.) dan air laut
buatan.

3.3 Alat

Timbangan, blender, ayakan 40 mesh, toples kaca besar, alat gelas, panci
infusa, rotary vacuum evaporator, penangas air, termometer, ultrasonic cleaner,
spektrofotometer UV, mikro pipet, botol vial, labu takar, oven, desikator, cawan
porselin, Bejana penetasan larva Lampu

3.4 Metode dan Cara Kerja

3.4.1 Determinasi sampel

Daun keji beling, daun bakau merah dan batang katuk yang akan diteliti
terlebih dahulu dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi-
LIPI Jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong 1699 untuk memastikan kebenaran dan
keaslian dari tanaman yang digunakan.

20
 21

3.4.2 Pembuatan Simplisia

Sebanyak ± 4 kg sampel disortasi basah setelah itu dicuci dengan air

mengalir, ditiriskan. Kemudian sampel dirajang tipis - tipis dengan ketebalan ± 1
cm. setelah melalui proses perajangan sampel dikeringkan dengan cara diangin -
anginkan tidak di bawah sinar matahari langsung. Setelah kering sampel dihaluskan
menggunakan blender dan diayak menggunakan saringan mesh berukuran 40.

3.4.3 Penentuan Kadar Air (AOAC, 2006)

Penentuan kadar air dilakukan menurut metode Association of Official

Analytical Chemist (2006). Cawan porselin yang akan digunakan dioven pada suhu
105o C terlebih dahulu selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam desikator
untuk menghilangkan uap air dan ditimbang bobotnya (A). sampel berupa simplisia
ditimbang sebanyak 1-2 gram dalam cawan yang sudah dikeringkan (B). kemudian
dioven pada suhu 105o C selama 2 jam, lalu didinginkan dalam desikator selama
15 menit dan ditimbang bobot akhirnya (C). tahap ini diulang hingga dicapai bobot
konstan. Penentuan kadar air dilakukan triplo atau 3 kali replikasi dan dihitung
dengan menggunakan persamaan:

𝐵−𝐶
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 = 𝑥 100%
𝐵−𝐴

Keterangan:
A = Berat cawan kosong
B = Berat cawan + sampel sebelum dikeringkan
C = Berat cawan + sampel sesudah dikeringkan

3.4.4 Ekstraksi

a. Ekstraksi metode maserasi

Masing - masing simplisia daun keji beling, daun bakau merah dan batang
katuk ditimbang sebanyak 600 gram berat kering, kemudian dimasukan
kedalam toples kaca besar yang berbeda, dimaserasi menggunakan pelarut
 22

etanol 96% sampai terendam seluruhnya, ditutup dan dibiarkan selama 24

jam, terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk. Setelah 24 jam, dikocok
dan disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh filtrat (maserat) I. Hal
yang sama dilakukan sampai dengan 3x pengulangan hingga diperoleh
filtrat II dan III. Filtrat I, II, dan III kemudian dicampur dan dipekatkan
menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50oC sampai diperoleh
ekstrak kental etanol dan dihitung % rendemennya. Perhitungan rendemen
ekstrak dihitung dengan rumus sebagai berikut:

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ

% 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 𝑥 100%
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑠𝑒𝑟𝑏𝑢𝑘

Untuk pembuatan kombinasi multi ekstrak dibuat dengan cara

mencampurkan ekstrak daun keji beling, daun bakau merah dan batang
katuk dengan berbagai perbandingan, dapat dilihat pada Tabel 5.

Table 5. Kombinasi Multi Ekstrak

No Perbandingan Keji Beling Bakau Merah Katuk
1 1:1:1 1g 1g 1g
2 1:1:2 1g 1g 2g
3 1:2:1 1g 2g 1g
4 2:1:1 2g 1g 1g
Keterangan:
Kombinasi daun keji beling : daun bakau merah : batang katuk

b. Ekstraksi metode infusa

Simplisia daun keji beling, daun bakau merah, dan batang katuk masing -
masing sebanyak 150 g berat kering, diinfudasi selama 15 menit dihitung
mulai suhu 90oC menggunakan akuades sebanyak 1,5 L disaring dan
dilakukan 3 kali pengulangan, filtrat yang diperoleh diuapkan diatas
penangas air / water bath dengan suhu 60o sampai diperoleh ekstrak kental
dan dihitung % rendemennya, dengan rumus:
 23

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ

% 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 𝑥 100%
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑠𝑒𝑟𝑏𝑢𝑘

Untuk pembuatan kombinasi multi herbal dibuat dengan cara

mencampurkan simplisia daun keji beling, daun bakau merah dan batang
katuk dengan berbagai perbandingan, kombinasi multi herbal dapat dilihat
pada Tabel 6.

Table 6. Kombinasi Multi Herbal

No Perbandingan Keji Beling Bakau Merah Katuk
1 1:1:1 30 g 30 g 30 g
2 1:1:2 30 g 30 g 60 g
3 1:2:1 30 g 60 g 30 g
4 2:1:1 60 g 30 g 30 g
Keterangan:
Kombinasi daun keji beling : daun bakau merah : batang katuk

3.4.5 Skrining Fitokimia

Menurut Harborne (1987) skrining fitokimia dilakukan pada infusa dan

ekstrak etanol daun keji beling, daun bakau merah serta batang katuk :

a. Uji Alkaloid

Sebanyak ± 20 mg ekstrak ditambahkan 1 ml HCL 2N dan 9 ml akuades

kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan pada
temperatur ruang. Kemudian disaring hasil filtrat tersebut dibagi kedalam 3
tabung reaksi yaitu :
i. Sejumlah 1 ml filtrat pada tabung reaksi, ditambahkan 2 tetes pereaksi
Wagner. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan coklat
kemerahan.
ii. Sejumlah 1 ml filtrat pada tabung reaksi, ditambahkan 2 tetes pereaksi
Mayer. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan putih atau
kuning yang larut dalam metanol.
 24

iii. Sejumlah 1 ml filtrat pada tabung reaksi, ditambahkan 2 tetes pereaksi

Dragendorff. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan jingga
coklat.
b. Uji Flavonoid

Sejumlah ekstrak diambil dan dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian

dilarutkan dengan penambahan 4 ml metanol kemudian ditambahkan 0,1
gram serbuk magnesium kemudian ditambahkan 10 tetes HCL pekat jika
mengalami perubahan warna menjadi merah kuning atau jingga maka
ekstrak tersebut positif mengandung flavonoid.
c. Uji Tanin dan Fenolik

50 mg ekstrak dilarutkan dengan 10 ml metanol ditambahkan pereaksi FeCl3

10% sebanyak 2 ml. apabila menghasilkan warna hijau, merah ungu, ungu
atau hitam menunjukkan adanya senyawa polifenol.
d. Uji Saponin

20 mg ekstrak ditambahkan akuades sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi

setelah itu larutan dipanaskan lalu dinginkan kemudian dikocok kuat secara
vertikal selama 10 detik. Jika terdapat saponin akan terbentuk busa setinggi
1-10 cm yang stabil selama lebih dari 10 menit dan jika ditambahkan 1 tetes
HCL 2N busa tidak hilang.
e. Uji Terpenoid dan Steroid

Ekstrak pekat sebanyak 20 mg ditambahkan 0,5 ml kloroform, selanjutnya

ditambahkan 0,5 ml asam asetat anhidrat. Setelah itu ditambahkan 2 ml
asam sulfat pekat dan menetesi kedalam campuran tersebut melalui dinding
tabung. Hasil reaksi ini positif bila terbentuk cincin kecoklatan atau violet
pada perbatasan larutan, jika terdapat cincin biru kehijauan menunjukan
adanya senyawa sterol.

3.4.6 Pengujian Sitotoksik Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

Metode Meyer et al. (1982) digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel

secara umum dengan menggunakan larva udang (arthemia Salina L).
Tahapan pengujian toksisitas daun keji beling, daun bakau merah, dan
 25

batang katuk terdiri dari persiapan larva udang, persiapan sampel,

pembuatan kelompok uji, dan uji BSLT.
a. Penetasan telur Artemia salina Leach

Sejumlah kurang lebih 20 mg Artemia salina Leach dimasukkan ke dalam

wadah penetas yang telah berisi air laut sintetik yang dibuat dengan cara
menimbang kurang lebih 38 gram tanpa yodium dan dilarutkan dalam air 1
L air, kemudian disaring dengan kertas saring dan didiberi penyinaran
dengan lampu TL 18 Watt. Setelah 48 jam, telur yang sudah menetas
menjadi nauplii dipindahkan ketempat lain, setelah itu nauplii tersebut
sudah dapat digunakan sebagai hewan uji.
b. Persiapan larutan uji

Pembuatan larutan ekstrak 2000 ppm,di timbang sebanyak 40 mg ekstrak

dengan teliti. Lalu dilarutkan dalam 20 ml air laut. Konsentrasi 200 ppm
dibuat dengan memipet 2 ml larutan ekstrak 2000 ppm dan ditambahkan air
laut sampai 20 ml. konsentrasi 20 ppm dibuat dengan memipet 2 ml larutan
konsentrasi 200 ppm dan ditambahkan air laut sampai 20 ml.
Larutan sampel 1000 ppm dibuat dengan cara memipet 5 ml larutan ekstrak
2000 ppm dan ditambahkan air laut 5 ml. Konsentrasi larutan 100 ppm
dibuat dengan cara memipet larutan ekstrak 200 ppm sebanyak 5 ml dan
ditambahkan air laut 5 ml. Kosentrasi 10 ppm dibuat dengan cara memipet
larutan ekstrak 20 ppm sebanyak 5 ml dan ditambahkan 5 ml air laut.
c. Pembuatan Kelompok Uji

Sebelum dilakukan pengujian dengan metode BSLT terlebih dahulu dibuat

kelompok dari ketiga ekstrak. Tujuannya adalah untuk memudahkan
pengambilan data dari masing-masing sampel karena sampel yang di
gunakan lebih dari satu sampel yaitu ektrak daun keji beling, daun bakau
merah dan batang katuk. Dari ketiga sampel ekstak daun keji beling, ekstrak
daun bakau merah dan ekstrak batang katuk di buat kombinasi dengan
perbandingan 1:1:1, 1:1:2, 1:2:1, dan 2:1:1.
 26

d. Uji toksisitas

Uji toksisitas dilakukan dengan memasukan 15 ekor larva udang yang

berumur 48 jam kedalam vial yang berisi larutan ekstrak dan air laut.Untuk
setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan (Triplo). Sebagai control
adalah airlaut yang tidak diberi ekstrak sampel. Vial percobaan disimpan
dibawah pencahayaan lampu. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam.
Dihitung tingkat kematian atau mortalitas dengan membandingkan antara
jumlah larva yang mati dibagi dengan jumlah total larva.
e. Perhitngan nilai LC50

Nilai nilai LC50 (Lethality Concentration) yaitu konsentrasi zat uji yang
menyebabkan kematian sebanyak 50% dari total populasi larva udang.
Suatu sampel dikatakan sangat toksik terhadap larva udang Artemia Salina
Leach apabila LC50 < 30 µg/mL, toksik apabila mempunyai LC50 30-1000
µg/mL, dan tidak toksik apabila mempunyai LC50 > 1000 µg/mL. Suatu zat
dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 µg/mL.

3.4.7 Uji Profil Senyawa Kimia Pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Uji dilakukan dengan menggunakan lempeng silika gel GF254 dan

menggunakan beberapa fase gerak. Fase gerak yang digunakan terdiri dari
campuran dua atau lebih pelarut dengan perbandingan tertentu. Campuran
pelarut yang digunakan sebagai fase gerak adalah heksana : etil asetat (1:1),
kloroform : metanol (5:1), kloroform : metanol (1:1), kloroform : metanol :
air (5:5:1). Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak yang memiliki nilai LC50
kemudian ekstrak tersebut ditotolkan pada lempeng silika gel GF254
menggunakan pipa kapiler, kemudian lempeng dimasukkan ke dalam
bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak
yang telah ditentukan, biar fase gerak merambat naik pada lempeng KLT
hingga batas jarak rambat, lalu diangkat, dibiarkan hingga kering, dan lihat
dibawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 dan 366 nm.
 27

3.5 Analisis Data

Pengolahan data hasil pengamatan dengan menggunakan regresi linear dari
persen kematian kumulatif untuk mendapatkan nilai Lethal concentration (LC50)
pada 50% hewan uji, dengan cara :
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑣𝑎 𝑚𝑎𝑡𝑖−𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑒𝑚𝑎𝑡𝑖𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
% 𝐾𝑒𝑚𝑎𝑡𝑖𝑎𝑛 = 𝑥 100%
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑣𝑎 𝑢𝑗𝑖 (10 𝑒𝑘𝑜𝑟)

LC50 dihitung menggunakan regresi linear dengan menggunakan

persamaan garis: y = bx + a
Keterangan : x = Log konsentrasi
y = % Kematian hewan
 28

Skema Alur Penelitian

Daun Keji Beling Daun Bakau Batang Katuk

Merah

Simplisia Daun Keji Beling,

Daun Bakau Merah, Batang
Katuk
Infudasi dengan air Maserasi dengan
etanol 96%

1. Ekstrak etanol daun keji beling

1. Ekstrak air daun keji beling
2. Ekstrak etanol daun bakau
2. Ekstrak air daun bakau merah
merah
3. Ekstrak air batang katuk
3. Ekstrak etanol batang katuk

Dibuat kombinasi Dibuat kombinasi

dengan perbandingan dengan perbandingan

1:1:1 1:1:2 1:2:1 2:1:1

Uji Sitotoksik

Nilai LC50
 29

Skema Kerja Uji Toksisitas

(Larutan induk 2000bpj)

40 mg ekstrak + air laut sintetik
ad 20 mL

Dipipet Dipipet Dipipet

2000 µL 200 µL 20 µL
+ air laut sintetik + air laut sintetik + air laut sintetik + air laut sintetik
± 5 mL ± 5 mL ± 5 mL ± 5 mL

Masukkan 15 Masukkan 15 Masukkan 15 Masukkan 15

ekor larva udang ekor larva udang ekor larva udang ekor larva udang

+ air laut sintetik + air laut sintetik + air laut sintetik + air laut sintetik
ad 10 mL ad 10 mL ad 10 mL ad 10 mL

1000 bpj 100 bpj 10 bpj Larutan

(triplo) (triplo) (triplo) Kontrol

Di diamkan selama 24 jam

Hitung jumlah larva udang yang mati

Hitung nilai LC50