INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE- CAMPUS ARAQUARI

CURSO MEDICINA VETERINRIA

Elizabeth Baggio Jean Carlo Scortegagna Vicari Larissa Caroline Danchura Taiany Krum de Freitas Vanssa Jung

PCR REAO POLIMERASE EM CADEIA

ARAQUARI 2011

Elizabeth Baggio Jean Carlo Scortegagna Vicari Larissa Caroline Danchura Taiany Krum de Freitas Vanssa Jung

PCR REAO POLIMERASE EM CADEIA

O Presente trabalho de Pesquisa apresentado s Professoras da disciplina Microbiologia Veterinria, do Curso de Medicina Veterinria, no Instituto Federal Catarinense Campus Araquari, como requisito de avaliao parcial do segundo semestre de 2011.

ARAQUARI 2011

SUMRIO

Introduo ................................................................................................................... 4 1. Histrico da PCR. .................................................................................................... 5 2. O que PCR? ........................................................................................................ 6 2.1 Componentes da PCR e suas funes na reao ............................................. 7 2.1.1 DNA molde: ................................................................................................. 7 2.1.2 DNA polimerase: .......................................................................................... 7 2.1.3 Tampo e sais: ............................................................................................ 8 2.1.4 Ction metal divalente: ................................................................................ 9 2.1.5 Desoxinucleotdeos:..................................................................................... 9 2.1.6 Primers sintticos:........................................................................................ 9 2.1.7 Gel de agarose/poliacrilamida: .................................................................. 10 2.1.8 Termociclador: ........................................................................................... 10 2.1.9 Reagentes de alta densidade e corantes:.................................................. 11 2.1.10 Marcador de massa molecular (ladder): .................................................. 11 2.2 Como se faz? ................................................................................................... 11 2.3 Tipos de PCR ................................................................................................... 14 2.3.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):.................................... 14 2.3.2 Multiplex PCR: ........................................................................................... 14 2.3.3 Nested PCR: .............................................................................................. 15 2.3.4 PCR Competitiva: ...................................................................................... 15 2.3.5 AFLP: ......................................................................................................... 15 2.3.6 Hot Start:.................................................................................................... 16 2.3.7 PCRcolony: .............................................................................................. 16 2.3.8 Real-Time PCR: ......................................................................................... 16 2.3.9 Long: .......................................................................................................... 17 2.3.10 Inverse: .................................................................................................... 17 2.3.11 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorfism).................................... 17 2.4 Anlise do produto da PCR.............................................................................. 18 Concluso ................................................................................................................. 20 Referencias: .............................................................................................................. 21

Introduo Reao em cadeia da polimerase (PCR) um mtodo in vitro rpido, sensvel e verstil para amplificao seletiva de seqencias definidas de DNA (ou RNA) a partir de amostras complexas de cidos nuclicos. O desenvolvimento da PCR no meio cientfico tem sido comparado frequentemente com o desenvolvimento da internet. Ambas as invenes surgiram nos ltimos 20 anos, sendo difcil imaginar a vida sem eles. Ambos tm crescido muito alm dos limites do seu design original simples e criaram oportunidades inimaginveis antes de sua inveno. difcil acreditar que a tcnica que se formou com o projeto genoma humano fundamental para os laboratrios de biologia molecular. A tcnica do PCR valiosa para os cientistas, auxiliando o mapeamento gentico, deteco de doenas, estudo das funes dos genes, a identificao de clulas, e analises de identificao forense. Pode ser usada para estudos de diversidade gentica em qualquer grupo de animal ou vegetal . A PCR tambm revolucionou a biologia evolutiva, tornando possvel analisar o DNA dos mamutes e restos mortais de antigos humanos encontrados em pntanos.

1. Histrico da PCR. Na dcada de 60 vrios pesquisadores procuraram obter a sntese de DNA in vitro. A obteno do DNA em tubo de ensaio foi o primeiro passo para um universo de experimentos em gentica molecular. O primeiro a conseguir Arthur Kornberg, que identifica a polimerase, uma enzima que catalisa a sntese de DNA. Em 1983, Kary Banks Mullis, pesquisador da Cetus Corporation, em Emervylle, Califrnia, imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase iniciasse e terminasse seu trabalho em trechos pr-determinados do DNA. Atravs deste sistema seria possvel amplificar milhes de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de DNA. Mullis percebeu que possua uma importante ferramenta em mos, tentou publicar seus experimentos nas duas revistas cientficas mais importantes do mundo, a Science e a Nature, ambas negaram a publicao, resignado, conseguiu publicar ento seu artigo sobre amplificao do gene da betaglobina humana na Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor. A idia da PCR foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985. A Cetus Corporation pagou a Mullis para desenvolver a patente PCR 10.000 dlares, que a corporao venderia mais tarde por 300.000.000 de dlares. Frustrado tanto pelo tamanho do prmio e como as restries a sua pesquisa , Mullis deixou a Cetus em 1986, tornando se um consultor de pesquisa privado. Em 1989, a revista Science escolheu a molcula usada na PCR, a Taq polimerase, como a primeira molcula do ano. Em 1991 a PCR se tornou comum em laboratrios do mundo todo e referncias ao uso da tcnica j somavam milhares nas revistas cientificas. Na dcada de 90 foi referenciada em pelos menos 10.000 publicaes cientificas por ano.
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Em 1993 , Mullis ganhou o Prmio Nobel em Qumica. Cientistas da Cetus desenvolveram uma verso comercial do PCR e uma mquina chamada do termociclador, com a adio de elementos qumicos do DNA, chamados nucleotdeos, e um catalisador bioqumico chamado polimerase, a mquina realizaria o processo automaticamente em um pedao alvo de DNA.

2. O que PCR? PCR ou Reao de Cadeia Polimerase uma tcnica de Biologia Molecular que tem como funo amplificar uma poro especfica do material gentico por meio de uma enzima termosttil in vitro. Ela faz uma amplificao exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de material gentico de uma nica clula, que pode variar de poucos pares de bases a muitos pares de bases. Atravs desse processo o DNA molde sofre uma amplificao controlada por enzimas obtendo-se milhes de cpias do fragmento de DNA de interesse. Essa tcnica explora a funo natural da enzima chamada de taq- polimerase extrada da bactria Thermus aquaticus que capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5 3. Essa Bactria alm de ser capaz de sintetizar o DNA teve grande importncia neste processo, pois antes da sua utilizao o grande problema para a execuo da tcnica era o aumento da temperatura, o que foi controlado por esta. O molde utilizado pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla como o DNA genmico, podendo se utilizar uma gota de sangue, um fio de cabelo, fragmentos de pele e rgos ou at uma clula do epitlio bucal. Esse mtodo tem como princpios bsicos a utilizao de oligonucleotdeos (primers) e regies especficas da molcula de DNA e a ao da DNA polimerase. Esses primers so
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utilizados para direcionar a sntese do DNA em ciclos repetidos. A cada ciclo as fitas servem de molde para a gerao de novas fitas e o numero de ciclos determinado pelos objetivos e condies utilizadas. 2.1 Componentes da PCR e suas funes na reao: 2.1.1 DNA molde: a informao que se deseja amplificar. Tora reao de PCR parte de um DNA molde, extrado da amostra que est sendo utilizada. Pode ser utilizada uma amostra de DNA ou de RNA. No caso de uma amostra de RNA esta dever primeiramente ser convertida em uma fita de cDNA (DNA complementar). O ideal que o cido nuclico esteja livre de impurezas como protenas, lipdios, outros cidos nuclicos ou reagentes de extrao, e em uma concentrao mnima de 5g/mL, porm quantidades menores tambm podem ser utilizadas (VIEIRA). 2.1.2 DNA polimerase: a enzima responsvel pelo processo de amplificao do DNA alvo. A DNA polimerase a adio dos desoxinucleotdeos em sequencias complementares ao DNA molde, gerando assim novas cadeias de DNA iguais ao DNA molde. Para esta tarefa ela utiliza tambm os primers sintticos, que acoplam-se ao DNA molde e marcam os pontos de inicio da adio de nucleotdeos (VIEIRA, Aula 1). A DNA polimerase mais utilizada a Taq polimerase, uma polimerase isolada da bactria Thermus aquaticus, que habita fontes termais. Existe tambm a Tth polimerase, isolada em Thermus thermophilus.

A taq uma enzima chamada non-proofreading, o que quer dizer que podem haver alguns erros na sequncia do fragmento final. Enzimas desta classe percorrem a fita de DNA apenas uma vez, dando a chance de que algum erro durante a duplicao no seja reparado. Alm disso ela tambm adiciona uma adenina as extremidades 3 do DNA, o que pode dificultar o uso posterior do amplificado(VIEIRA, Aula 2). Para estes casos existem as enzimas da classe proofreading, que alm de percorrerem a fita me pelo menos duas vezes, em geral no adicionam nucleotdeos extras nas bordas das cadeias-filhas. Deste grupo pode-se destacar a Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis) (VIERIA, Aula 2). 2.1.3 Tampo e sais: Os tampes tm por funo manter o pH da soluo ideal para a atividade da enzima e para a conservao do DNA molde. Os sais proporcionam fora inica para a atividade enzimtica e influenciam a cintica de hibridizao do DNA (RABELO). As solues-tampo so geralmente fornecidas juntamente com a DNA polimerase, e possuem composies especficas de acordo com cada fabricante, por questes de maior especificidade. Basicamente estas solues contm ons diversos, Na+, Cl-, K+ entre outros. Alguns tampes contm ainda detergentes, inibindo a formao de dmeros das cadeias enzimticas, protenas estabilizantes (BSA albumina srica bovina) e algumas substncias que agem na desnaturao da cadeia molde, quebrando as pontes de hidrognio entre as bases (VIEIRA, Aula 1. RABELO).

2.1.4 Ction metal divalente: Reagente de grande importncia na reao. Um dos mais utilizados o MgCl2, um doador muito estvel de ons Mg+2, que so co-fatores indispensveis para a atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam tambm outros ons metlicos como cofatores. Um exemplo a Tth polimerase. Na presena de Mg2= ela possui atividade DNA polimersica. Porm na presena de Mn2+ ela apresenta atividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir de uma cadeia de RNA (VIEIRA Aula 1). 2.1.5 Desoxinucleotdeos: Os desoxinucleotdeos so a matria prima da reao de PCR. So compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5 da desoxirribose. So adicionados pela DNA polimerase complementarmente a fita molde, para compor as cpias do DNA. Adiciona-se na reao uma mistura de todos os nucleotdeos em concentraes iguais (VIEIRA Aula 1. RABELO) 2.1.6 Primers sintticos: So oligonicleotdeos curtos e de fita simples. Possuem sequncia linear e complementar ao DNA alvo (sequncia de DNA que se procura e deseja amplificar). Os primers acoplam-se ao DNA molde nos pontos onde o DNA complementar sua sequncia de bases, e a partir da servem como ponto de inicio (stios de iniciao) para a DNA polimerase realizar a adio de nucleotdeos, no processo de amplificao do DNA ((CORRA & POSSIK. RABELO).

2.1.7 Gel de agarose/poliacrilamida: Utilizados como matriz de separao dos fragmentos de DNA durante a corrida eletrofortica. A utilizao de uma matriz ou outra depende do tamanho dos fragmentos que se procura, devido diferena no tamanho dos poros de cada gel. O gel de agarose pode ser utilizado para separar fragmentos de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases), e a poliacrilamida para fragmentos menores, de at 1 kb (CORRA & POSSIK. SILVA, 2001). Apesar de ser mais efetiva na separao de fragmentos menores, ela apresenta alguns problemas, como o fato de, em soluo, ser neurotxica (CORRA & POSSIK). A agarose um polissacardeo extrado de uma alga marinha vermelha e formado por resduos de D e L galactose unidos por ligaes glicosdicas (1 (1 3) e

4), um material gelatinoso e semelhante gelatina incolor. O gel de

agarose pode ser reciclado aps o uso e utilizado na preparao de outros gis (CORRA & POSSIK). 2.1.8 Termociclador: Este equipamento comanda os ciclos de temperatura necessrios para o processo de amplificao do DNA. Ele responsvel por controlar as elevaes e redues de temperatura e controlar o tempo de durao de cada ciclo. Cada etapa do processo demanda uma temperatura e um tempo especfico (SILVA, 2001). A maioria dos termocicladores segue o padro: aquecimento por resistncia eltrica e refrigerao por ventoinhas e serpentina preenchida por etileno glicol. Os termicicladores mais sofisticados possuem um bloco de aquecimento composto por
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uma liga metlica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada (VIEIRA, Aula 1. SILVA, 2001). 2.1.9 Reagentes de alta densidade e corantes: Estas substncias geralmente esto presentes no tampo. Os reagentes de alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol). Sua funo garantir que a amostra de DNA entre nos poos pela fora da gravidade. J os corantes facilitam a aplicao da amostra no gel e auxiliam no monitoramento da corrida (CORRA & POSSIK). 2.1.10 Marcador de massa molecular (ladder): O ladder uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e concentraes conhecidos, gerados a partir da digesto de plasmideos com enzimas de restrio. Ele permite inferir, por comparao, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada (CORRA & POSSIK). 2.2 Como se faz? Para a execuo da tcnica da PCR preciso que se tenha conhecimento prvio da sequncia do cido nuclico que se deseja amplificar, dita sequncia alvo. A partir disto, desenham-se dois iniciadores (primers) para dar partida ao processo de sntese em um local especfico. Um primer serve para sintetizar a sequncia alvo no sentido 3- 5e outro para o sentido inverso isto , 5-3. O primer uma pequena sequncia de nucleotdeos que hibridiza no incio da sequncia alvo que se quer amplificar e da qual ele complementar. Ao reconhecer o primer, a polimerase sintetiza uma cpia complementar, obedecendo informao contida na sequncia de DNA que ser replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de deoxinucleosdeos trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que so quatro
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componente qumicos diferentes que atuam como se fossem tijolos na construo da molcula de DNA. O primeiro passo para a realizao de um PCR a coleta da amostra biolgica. Para tanto, importante levar em considerao o que se deseja pesquisar. Por exemplo: se um paciente apresenta uma leso na pele, deve ser recolhida uma amostra da mesma e no do sangue do paciente. O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado. Esta extrao segue um critrio de metodologia bsico, que varia dependendo da amostra utilizada. Basicamente utilizam-se substncias desproteinizantes como o fenol-clorofrmio, capazes de desnaturar e retirar as protenas que esto acopladas ao DNA. A adio posterior de etanol, ento, far com que o material gentico precipite no tubo que posteriormente ser solubilizado em tampo apropriado para o uso na reao. O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reao. A mistura de reao contm as substncias necessrias para fazer novas cpias de DNA no processo da PCR. Ento, dentro de um tubo so colocados: 1) soluo tampo para manter a mistura de reao no pH e condies inicas ideais para a reao. 2) os deoxinucleotdeos j mencionados; 3) os primers. 4) a Taq Polimerase 5) o DNA extrado da amostra. O quarto passo consiste na reao em si que feita em uma mquina especial, chamada de termociclador, que aquece e resfria o tubo em vrios ciclos consecutivos para amplificar o DNA.
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Primeiramente, o tubo aquecido a 90-96 graus para que o DNA seja desnaturado (separao das fitas). Em seguida, a temperatura do termociclador diminui para permitir a hibridizao ou anelamento; nesta fase, os primers se ligam, especificamente, s suas sequncias complementares no DNA. A prxima etapa a sntese pela polimerase. Aps diversos ciclos (geralmente em torno de 30 ciclos) o DNA estar amplificado em milhes de cpias. Os problemas tcnicos podem surgir. O mais importante a contaminao da amostra com material gentico estranho que pode gerar cpias de DNA no relacionadas ao DNA que est sendo investigado e o resultado pode levar a concluses erradas. Para diminuir os riscos deste tipo de contaminao ao mnimo possvel, os laboratrios devem ter cuidado no manuseio da amostra, utilizando luvas, tubos descartveis etc...O laboratrio deve ter reas separadas para cada etapa do processo: para o preparo da amostra, da mistura de reao, realizao do processo da reao e anlise. Outro problema pode ser a presena, na amostra, de substncias que, conhecidamente, inibem a reao (como exemplo a hemoglobina). Para isso a amostra deve ser devidamente tratada para limp-las destas substncias. O passo final a anlise do produto de reao. Esta pode ser feita atravs de gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por brometo de etdio. Em qualquer uma delas, o material amplificado visualizado como uma banda, a ser analizada de acordo com o seu peso molecular.

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2.3 Tipos de PCR Existem vrios tipos de reaes de PCR que possuem processos e finalidades singulares. A descrio dos principais processos de reao em cadeia da polimerase est descritos a seguir:

2.3.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): um processo constitudo de duas etapas: uma transcrio reversa e a amplificao propriamente dita. O diferencial deste procedimento que a amostra fornece apenas um molde de RNA, sendo necessrio converter esse RNA em cDNA (DNA complementar) antes de realizar a amplificao. A reao em cadeia da transcriptase reversa muito til, pois avaliando o mRNA podemos detectar quais protenas esto sendo efetivamente expressas. O primeiro passo da reao consiste na sntese de uma fita de DNA utilizando como template uma fita de RNA numa reao catalisada por uma transcriptase reversa. Geralmente esta enzima pode ser extrada de dois vrus: AMV (Avian Mieloblastosis Vrus) ou M-MuLV (Moloney Murine Laeukemia Vrus). Tambm so utilizados primers, inespecficos e que se nunca apresentam aos pares, compostos de varias timinas consecutivos (6 a 35), que so aneladas s regies Poly-A do RNA, ricas em adeninas. Aps este ciclo tem-se o cDNA necessrio para a realizao da PCR. 2.3.2 Multiplex PCR: Nesta reao mais de um segmento genmico amplificado, cada um com seu par de primers especficos. Este processo til para a introduo de um
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controle de reao e para simplificar alguns experimentos, como a investigao de paternidade, onde vrios marcadores genmicos devem ser analisados. 2.3.3 Nested PCR: a variao de PCR na qual so utilizados dois pares de primers para amplificar um mesmo fragmento. Para melhorar a especificidade e a eficincia da reao, o segmento genmico amplificado primeiro de forma abrangente, copiando at mesmo sequencias localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificao da real sequencia-alvo. Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente ou em duas reaes separadamente (Semi-Nested PCR). 2.3.4 PCR Competitiva: Nesta reao alm do DNA molde, adicionado reao outro trecho de DNA, que possui seqncia, tamanho e concentrao conhecidos (controle). As extremidades deste pedao de DNA so complementares tambm aos primers que iro amplificar a sequncia-alvo. O resultado a amplificao de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. A amplificao de controle serve de padro para a quantificao do DNA-alvo. Desta forma, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as condies da reao, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. 2.3.5 AFLP: Anlise do polimorfismo dos fragmentos amplificados ou AFLP PCR foi originalmente descrita em 1993. AFLP um mtodo muito sensvel baseado na reao de PCR para deteco de polimorfismos no DNA. Tambm usado para
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genotipagem individual de um grande nmero de loci usando um nmero mnimo de reaes de PCR. 2.3.6 Hot Start: PCR Hot Start o processo que permite a inibio da atividade da polimerase durante a preparao para a reao de PCR. Atravs da limitao da atividade da polimerase antes da ciclagem do PCR, a Hot Start PCR reduz amplificaes no especificas e aumenta o rendimento-alvo do produto da PCR. Este tipo de PCR realizado pelo uso de modificaes qumicas includas, mtodos de barramento com ceras e inibio por anticorpos direcionados enzima Taq. 2.3.7 PCRcolony: O PCR-colony baseia-se na seleo de clones de bactrias (E. Coli), leveduras ou produtos de plasmdeos. As colnias selecionadas de bactrias ou leveduras so colhidas com um palito estril ou pipeta de uma placa de crescimento (agarose). Este ento inserido no mster mix PCR ou pr-introduzido na gua autoclavada. A PCR ento conduzida para determinar se a colnia contm o fragmento de DNA ou plasmdeo de interesse. 2.3.8 Real-Time PCR: O PCR em tempo real caracterizado pelo perodo de tempo, quando a amplificao do produto da PCR de interesse detectada antes mesmo da verificao da quantidade final do produto da PCR acumulada depois da reao, que continha um grande nmero de ciclos. Este tipo de PCR, atravs do monitoramento da quantidade de fluorescncia emitida durante a reao de PCR, funciona como um
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indicador de quantidade de amplificao de PCR que ocorre durante cada ciclo de PCR. Portanto, em novas maquinas de PCR possvel acompanhar a reao em tempo real. A PCR em tempo real ainda contm uma gama dinmica muito maior de at 107 vezes, em comparao a 1000 vezes na RT-PCR convencional, resultando em uma quantificao mais precisa. A faixa dinmica de um ensaio determina o quanto a concentrao-alvo pode variar e ainda assim ser codificado. 2.3.9 Long: Long PCR a reao que mais extensa ou mais longa que o padro da PCR, ou seja, mais de 5 kilobases. geralmente til somente se for de alta preciso, assim, misturas especiais de polimerases proficiente juntamente com polimerases precisas so muitas vezes misturadas. Este processo PE frequentemente usado para clonar genes maiores ou grandes segmentos de DNA que a PCR convencional no consegue realizar. 2.3.10 Inverse: PCR inversa ou tambm chamada IPCR, foi descrito pela primeira vez em 1988. A PCR padro possui a limitao de que necessrio conhecer as regies laterais de sentido 5 e 3 do fragmento de DNA de interesse. A PCR inversa permite a conduo da reao de PCR com a informao apenas de uma sequencia interna. 2.3.11 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorfism): uma reao em que os organismos podem ser diferenciados pela anlise de padres derivados da clivagem do seu DNA, ou seja, os comprimentos dos fragmentos produzidos pela clivagem de uma endonuclease de restrio de dois
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organismo diferentes vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrio. Para esta tcnica utilizada a metodologia de Shouthern Blotting, descrita e 1975, onde aps a restrio enzimtica os fragmentos de DNA genmico so sujeitos a eletroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte solido de nitrocelulose atravs do arrastamento por capilaridade. Aps hibridizao com sondas radioativas este processo possibilita a identificao, entre milhares de fragmentos de restrio obtidos, de sequncias bem determinadas. 2.4 Anlise do produto da PCR : O produto da reao em cadeia da polimerase analisado atravs da tcnica de eletroforese em gel. Esta se vale do principio de que a carga global de uma fita de DNA negativa, desta forma, uma soluo que possua ons livres e que tenha molculas de DNA em suspenso pode ser purificada ao se aplicar uma dada voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estaro prximas ao catodo(positivo), atraente de molculas de carga negativa. O objetivo desta tcnica separar os fragmentos por tamanho, j que a reao gera fragmentos de mesma extenso. A soluo peneirar o resultado da PCR por peneiras moleculares. As cadeias so empurradas atravs da peneira pela corrente eltrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas sero retidas ou liberadas. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. So os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que so misturas de trechos de DNA com tamanhos variveis, normalmente equidistante entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na
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prtica que ele mostrar vrias bandas, cada uma maior 50 pares de base do que a anterior (50bp, 100bp,150bp, 200bp, 250bp...). Existem dois tipos de eletroforese: Baseada em gis de agarose ou em gis de poliacrilamida. As duas formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, sendo que estas substncias so dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica. Para impedir que a amostra comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema, esta sofre uma mistura com outra substancia tampo, com o objetivo de aumentar sua viscosidade. Para a visualizao do andamento da corrida utiliza-se um corante no tampo da amostra. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampo de corrida apropriado para cada reao. Na cuba de eletroforese aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel (entre 10 e 200V) e corrente de 50 a 3000mA. Quanto maior a concentrao de gel maior a capacidade de distinguir tamanhos prximos (definio), normalmente usase 0,5 a 3% de agarose. A visualizao dos produtos no gel aps a corrida se d pela reao de ligao do DNA com brometo de Etdio que possui a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescncia quando excitado com radiao ultravioleta. Utiliza-se 10g/mL de EtBr no gel liquefeito antes da corrida. Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nvel de dificuldade de realizao, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho, e no quanto sequncia.
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Concluso

Tcnicas precisas de diagnstico so de suma importncia para a prtica clnica e pesquisas na rea da sade, pois se bem desenvolvidas fornecem informaes precisas. Com o advento do teste PCR pode-se estudar o padro de expresso gnica, fazer seqenciamento direto de produtos amplificados, deteco de mutaes em genes, diagnstico de doenas infecciosas, deteco de bactrias, vrus, protozorios e parasitos, elucidar relaes evolutivas entre espcies e auxiliar na Medicina Forense. A PCR pode amplificar qualquer sequncia especfica de DNA, a partir de amostras de diferentes materiais biolgicos como sangue, urina e outros fluidos corporais, cabelo e cortes de tecidos (bipsias frescas ou em blocos de parafina). Amostras de microorganismos, clulas animais ou vegetais, alguns deles com milhares, possivelmente at milhes, de anos de idade podem, tambm, ser detectadas.

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Referencias: BARTLETT, John M. S e STIRLING, David. PCR Protocols. 2 edition. Humana Press.

CORRA, Elisete Marcia. POSSIK, Patrcia Abrao. A anlise de DNA por eletroforese.

GENESIS.

Reao

em

cadeia

da

polimerase.

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Tipos de PCR. Disponvel em:< http://www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/ material_didatico_2009/6_Tipos_de_PCR.pdf>. Acesso em:21/09/2011.

VIEIRA, Daniel Perez. Tcnicas de PCR: Aplicao e padronizao de reaes aula 1: princpios e tipos de PCR. Protozoologia IMTSP/Laboratrio de Biologia Molecular - IPEN .

VIEIRA, Daniel Perez. Tcnicas de PCR: Aplicao e padronizao de reaes aula 2: Caractersticas das reaes e padronizao. Protozoologia

IMTSP/Laboratrio de Biologia Molecular - IPEN .

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