ISSN 1679-2254

Produção de Mudas Micropropagadas de

Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel
por Embriogênese Somática

41 Introdução
Circular
Técnica

A floricultura empresarial brasileira tem adquirido notável desenvolvimento e, nos

últimos anos, vem se caracterizando como um dos mais promissores segmentos
da horticultura intensiva no agronegócio nacional (JUNQUEIRA; PEETZ, 2008).
Levando-se em conta a elevada mão de obra por área, quando comparada à
agricultura extensiva, a floricultura contribui para a fixação da força de trabalho no
campo, além de ser importante alternativa para pequenos produtores (ANEFALOS
et al., 2010).

Em 2010, as exportações brasileiras de flores e plantas ornamentais somaram

US$ 28,7 milhões, com uma redução de 7,9% sobre os valores negociados no
mercado internacional no ano anterior (US$ 31,1 milhões). Esse foi o segundo ano
consecutivo de queda comercial, depois de o Brasil ter experimentado 9 anos de
recordes sucessivos nos embarques dos produtos da floricultura (JUNQUEIRA;
Fortaleza, CE PEETZ, 2011a). O desempenho decrescente do comércio externo da floricultura
Outubro, 2012
brasileira reflete os efeitos da crise econômica e financeira internacional nos
principais mercados importadores mundiais (zona do Euro, Estados Unidos da
Autores América e Japão), além da sustentada valorização da política cambial do real, que
Ana Cristina Portugal Pinto de
induz à perda de competitividade das flores e plantas ornamentais brasileiras no
Carvalho mercado mundial (JUNQUEIRA; PEETZ, 2011a).
Bióloga, D.Sc. em Genética,
pesquisadora da Embrapa
Agroindústria Tropical,
Fortaleza, CE,
O Brasil apresenta potencial para tornar-se grande produtor de flores e plantas
cristina.carvalho@embrapa.br ornamentais, destacando-se as espécies tropicais, devido à grande diversidade
Marcos Vinícius Marques Pinheiro genética e ao clima propício para a sua produção. A floricultura tropical, classificada
Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em
Fisiologia Vegetal, doutorando em
como um negócio lucrativo, vem se expandindo e sendo considerada uma
Botânica pela Universidade Federal alternativa viável para pequenas áreas rurais (JUNQUEIRA; PEETZ, 2011b).
de Viçosa, Viçosa, MG,
macvini@gmail.com

Fabrina Bolzan Martins Dentre as espécies tropicais, destaca-se o antúrio, que tem apresentado boa
Engenheira Florestal, D.Sc. em
Ciência Florestal, professora do
aceitação nos mercados interno e externo. Dessa forma, existem perspectivas
Instituto de Recursos Naturais da favoráveis para elevar a sua produção, comercialização e consumo, em ambos os
Universidade Federal de Itajubá,
Itajubá, MG, fabrinabm@gmail.com mercados (ANEFALOS et al., 2010).
Ana Claudia Ferreira da Cruz
Engenheira-agrônoma, D.Sc. em O antúrio (Anthurium sp.) é uma importante flor tropical, pertencente à família
Botânica, bolsista da Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Araceae, sendo originário das Américas do Sul e Central (COELHO; CATHARINO,
aclaudia5@hotmail.com
2005). A principal espécie desse gênero, Anthurium andraeanum Linden, tem
Wagner Campos Otoni como centro de origem a Venezuela e a Colômbia, sendo preferida sobre as outras
Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em
Genética e Melhoramento, professor flores tropicais, devido ao tamanho, cor e durabilidade pós-colheita das suas
do Departamento de Biologia Vegetal,
Universidade Federal de Viçosa, inflorescências (TOMBOLATO et al., 2004b; TOMBOLATO; CASTRO, 2005).
Viçosa, MG, wotoni@ufv.br

No mercado mundial, os antúrios têm grande importância econômica e, entre as

flores tropicais, atingem o segundo maior valor comercial, perdendo apenas para
as orquídeas (DUFOUR; GUÉRIN, 2003; CHEN et al., 2003). No Brasil, os antúrios
vêm sendo largamente utilizados na floricultura e no paisagismo, e, atualmente,
2 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

é a principal espécie de flor tropical de interesse

Fotos: David dos Santos Júnior

econômico (ANEFALOS et al., 2010), destacando-
-se tanto no mercado interno quanto no externo.
Suas inflorescências atingem o maior preço unitário,
quando comparado ao de outras flores tropicais,
além de possuírem longa durabilidade e resistência,
em média de 25 a 30 dias, podendo chegar a 40
dias (JUNQUEIRA; PEETZ, 2008). O Estado de São
Paulo é considerado o maior centro de produção
e comercialização, concentradas nas regiões de
Holambra, Atibaia e Vale do Ribeira (Figura 1-A).
Entretanto, outros estados, como Bahia, Ceará e
Pernambuco, são potenciais regiões de produção
(LEME; HONÓRIO, 2004; CALDARI JÚNIOR, 2004).

O programa de melhoramento genético de antúrios,

conduzido pelo Instituto Agronômico (IAC), em
Campinas, SP, desde 1980, foi responsável
pelo desenvolvimento das primeiras variedades
brasileiras, para cultivo e plantio comercial tanto
para flor de corte quanto para planta de vaso.
Esse programa tem como objetivo a produção
de plantas de menor custo e bem adaptadas às
condições climáticas do País, visando competir
com as cultivares importadas (TOMBOLATO et
al., 2004a). Dentre as principais variedades de
antúrio lançadas pelo IAC, destaca-se a ‘Eidibel’ (IAC
0-11), altamente produtiva, de crescimento rápido,
vigorosa, de porte médio, com espata de formato
cordiforme de tamanho médio, com textura grossa
e de boa enervação, de coloração vermelha forte e
espádice branca suavemente perfumada e de longa
durabilidade pós-colheita (Figura 1-B). Devido à
coloração de sua inflorescência, vermelha forte, cor
de maior demanda no mercado de flores de corte,
e à boa produtividade alcançada em diferentes
condições ambientais, representa de 50% a 60% de
Figura 1. (A) Plantio comercial de antúrio (Anthurium
todo o mercado brasileiro de antúrio. Esses fatores
andraeanum) cv. Eidibel, sob cultivo protegido, na região
possibilitaram que essa variedade se tornasse a mais
do Vale do Ribeira, em São Paulo. (B) Inflorescência
cultivada (LEME; HONÓRIO, 2004) e comercializada de antúrio cv. Eidibel, tipo espiga (espádice) e bráctea
para flor de corte no País (TOMBOLATO et al., 2004a). (espata); o conjunto normalmente é conhecido como flor.

Propagação
enquanto as estruturas masculinas ainda se
A propagação do antúrio ocorre por via sexuada e encontram imaturas, dificultando a autofecundação
assexuada. A produção de mudas por sementes é e favorecendo o cruzamento natural entre plantas
um processo lento, gerando progênies heterogêneas (TOMBOLATO; CASTRO, 2005). Consequentemente,
devido à polinização cruzada (BEJOY et al., 2008), as plantas resultantes podem variar em vigor,
em função do fenômeno da protoginia. Nesse tamanho e produtividade, e as inflorescências,
processo, os órgãos sexuais femininos atingem apresentar diferenças em relação à cor, forma
primeiramente a maturidade e tornam-se receptivos, e tamanho. Tem sido observado também que
3 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

as plantas derivadas de sementes apresentam calos e posterior formação de gemas adventícias.

diversidade quanto à época para o início da floração Entretanto, esse método proporciona taxas de
(JAHAN et al., 2009). Além disso, as sementes não multiplicação relativamente baixas e inconsistentes,
podem ser conservadas, devendo ser coletadas logo com a provável ocorrência de variação somaclonal
após a maturação do fruto, permanecendo viáveis nas mudas obtidas (TE-CHATO et al., 2006;
por apenas 2 a 3 dias, após a coleta (VIÉGAS et al., BAUTISTA et al., 2008).
2007). Ademais, as sementes apresentam baixa taxa
de germinação, em torno de 20% a 30% (JAHAN et Em relação aos métodos organogênicos, Gantait
al., 2009). et al. (2012) mencionam que a melhor resposta
foi a registrada por Gantait et al. (2008), com,
Por outro lado, a propagação vegetativa, obtida aproximadamente, 60 mudas obtidas a partir de
por meio da divisão de touceiras ou por estaquia, uma única gema apical, num período de 103 dias.
possibilita a disseminação de pragas e doenças, Entretanto, os autores ressaltam que outros métodos
além de limitar a quantidade de mudas disponíveis de micropropagação necessitam ser estudados
(TOMBOLATO et al., 2004a). Dessa forma, a visando à obtenção de maior número de mudas por
propagação in vitro tem sido bastante utilizada como explante. É o caso da utilização da embriogênese
importante método para a produção massiva de somática, uma das principais técnicas da propagação
mudas dessa espécie, permitindo a uniformização in vitro, que permite a produção massiva de plantas
das características (FUZITANI; NOMURA, 2004; e a redução de mão de obra, possibilitando diminuir
MAIRA et al., 2009). significativamente o custo por unidade produzida,
além dos embriões somáticos poderem ser produzidos
Atualmente, a maioria das variedades de antúrio
de forma sincronizada, com alto grau de uniformização
disponíveis para comercialização como plantas de
e conformidade clonal (YEUNG, 1995).
vaso, no mercado internacional, é produzida por
cultura de tecidos (MAIRA et al., 2010). O uso dessa
técnica tem sido sugerido como alternativa para o
Embriogênese somática
aumento da produção de antúrio (JAHAN et al., 2009). Entre os métodos de propagação in vitro, a
embriogênese somática é considerada a mais
Em pesquisa desenvolvida visando ampliar o adequada para a produção de mudas em larga
conhecimento sobre flores tropicais, com ênfase escala, para várias espécies vegetais (MATSUMOTO
na cultura do antúrio e na adoção de novas et al., 1996). Essa técnica também apresenta grande
tecnologias, constatou-se que 97% dos entrevistados aplicabilidade para estudos relacionados com a
consideraram que o uso de mudas micropropagadas fisiologia, genética e bioquímica do desenvolvimento
representa um bom investimento, desde que haja embrionário (YEUNG, 1995; FEHÉR et al., 2003;
garantia de qualidade do produto, com produção de FEHÉR, 2005), além de constituir uma ferramenta para
clones melhorados, mais homogêneos e resistentes a obtenção de plantas transgênicas, a preservação
a pragas e doenças (ANEFALOS et al., 2010). de germoplasma por criopreservação, a hibridação
somática, entre outros (SANTOS-SEREJO et al., 2006).
Micropropagação (Propagação in vitro)
Vários trabalhos têm sido conduzidos com a cultura A princípio, a formação de embriões a partir
de tecidos de antúrio, visando à avaliação do seu de tecidos somáticos in vitro é semelhante à
potencial morfogenético na obtenção de mudas. De embriogênese zigótica que ocorre nos órgãos
uma forma geral, o fator mais importante tem sido a reprodutivos das plantas (DODEMAN et al., 2007).
especificidade da cultivar, resultando na necessidade As células somáticas são capazes de recapitular o
do desenvolvimento de protocolos exclusivos para desenvolvimento embriogênico sem que ocorra a
cada genótipo. Devem ser levados em conta o tipo fusão de gametas (COSTA et al., 2006), culminando
e a idade do explante a ser utilizado (GANTAIT; na formação de uma planta completa a partir de
MANDAL, 2010). uma única célula. Anatomicamente, são formadas
estruturas bipolares, constituídas de ápices caulinar
O antúrio tem sido propagado in vitro e radicular. Além disso, o ápice radicular é fechado,
tradicionalmente mediante a organogênese indireta, ou seja, não tem conexão com os tecidos do explante
por meio do cultivo de explantes foliares, indução de inicial materno (ROCHA et al., 2012).
4 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Existem dois padrões básicos de expressão da dependente. Esses autores utilizaram explantes
embriogênese somática: o modelo direto, no foliares, com a adição de 2,4-D no meio de cultura,
qual os embriões somáticos originam-se dos que resultaram na formação de embriões somáticos.
tecidos matrizes sem a formação de estágios Bautista et al. (2008) também obtiveram sucesso na
intermediários, e o modelo indireto, no qual os obtenção de embriões somáticos, a partir a cultura
embriões somáticos se formam a partir de um tecido in vitro de explantes foliares, cultivados em meio de
intermediário denominado calo, que apresenta cultura adicionado dessa mesma auxina. Já Pinheiro
células em diferentes estádios de diferenciação (2010) empregou explantes de segmentos nodais,
e, consequentemente, com distintos graus de constatando que a formação dos embriões somáticos
determinação (GUERRA et al., 1998; FEHÉR et al., foi dependente do tipo e da concentração de auxinas.
2003; ROCHA et al., 2012). O modelo de embriogênese somática empregado
nesses três trabalhos foi via indireta, isto é, por meio
Segundo George et al. (2008), a regeneração de da formação intermediária de calos.
plantas via embriogênese somática ocorre em cinco
etapas: As metodologias utilizadas para a indução de
embriogênese somática, em antúrio, envolvem
1. Indução de culturas embriogênicas a partir do diferentes cultivares (KUEHNLE et al., 1992;
cultivo inicial dos explantes em meio de cultura MATSUMOTO et al., 1996; TE-CHATO et al., 2006;
suplementado com reguladores de crescimento. RAAD et al., 2012), diversas fontes de explantes
Nesta fase, geralmente são utilizadas auxinas (KUEHNLE et al., 1992; TE-CHATO et al., 2006;
sintéticas em elevadas concentrações, como o XIN et al., 2006; RAAD et al., 2012), mudanças na
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). composição do meio de cultura (KUEHNLE et al.,
1992; MATSUMOTO et al., 1996; TE-CHATO et al.,
2. Proliferação das culturas embriogênicas em 2006; BEYRAMIZADE et al., 2008; BAUTISTA et
meio líquido ou semissólido, suplementado com al., 2008; RAAD et al., 2012), suplementação com
as mesmas concentrações dos reguladores de diferentes tipos e concentrações de reguladores de
crescimento usados no estabelecimento das crescimento (KUEHNLE et al., 1992; MATSUMOTO
culturas embriogênicas. et al., 1996; BAUTISTA et al., 2007; BEYRAMIZADE
et al., 2008; BAUTISTA et al., 2008; RAAD et al.,
3. Maturação dos embriões somáticos em meio 2012), de açúcares e agentes gelificantes (KUEHNLE
de cultura sem a adição de reguladores de et al., 1992) e alterações nas condições de cultivo,
crescimento. Com isso, ocorre a inibição da como fotoperíodo e irradiância (RAAD et al., 2012).
proliferação das culturas embriogênicas e o
estímulo à formação e ao desenvolvimento dos Dessa forma, este estudo fornece informações
embriões somáticos. sobre a metodologia de obtenção de embriões
somáticos, via embriogênese somática indireta, como
4. Germinação dos embriões somáticos em meio de uma técnica alternativa para a produção de mudas
cultura suplementado com ácido abscísico e/ou micropropagadas de antúrio cv. Eidibel.
com redução no potencial osmótico.

5. Regeneração de plantas em meio de cultura Metodologia

desprovido de reguladores de crescimento. Nesta
fase, para algumas espécies, o acréscimo de Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de
alguns componentes suplementares ao meio de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal, da Embrapa
cultura, como glutamina e caseína hidrolisada, Agroindústria Tropical, em Fortaleza, Ceará, e no
pode ser necessário para a melhor aclimatização Laboratório de Cultura de Tecidos II do Instituto de
das plantas obtidas. Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (Bioagro),
da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em
Na espécie A. andraeanum, os primeiros trabalhos Viçosa, Minas Gerais. As análises histoquímicas
com embriogênese somática foram conduzidos por e anatômicas foram realizadas no Laboratório de
Kuehnle et al. (1992), constatando que a resposta Anatomia Vegetal, do Centro de Ciências Biológicas
morfogenética, nesse sistema, também é genótipo e da Saúde, da UFV.
5 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Etapa 1: Indução de calos embriogênicos 25 mL de meio de cultura ESA (PIERIK, 1976)

Os materiais vegetais utilizados para a indução de (Tabela 1), adicionado de 10,0 µM (que corresponde
calos embriogênicos são explantes oriundos do a 1,86 mg L-1) de ácido α-naftalenoacético (ANA) e
seccionamento de mudas de A. andraeanum cv. suplementado com 20 g L-1 de sacarose; solidificado
Eidibel estabelecidas in vitro (Figura 2-A e 2-B), com 6,5 g L-1 de ágar (Merck®) e o pH ajustado
cedidas pelo IAC, obtidas a partir da organogênese para 5,8; e autoclavado a 121 ºC, por 15 minutos.
indireta de folhas jovens (TOMBOLATO et al., 1998). Em cada placa de Petri, devem ser inoculados,
horizontalmente, nove segmentos nodais (Figura 2-C).
Os explantes, segmentos nodais com As culturas devem ser mantidas no escuro em sala
aproximadamente 1,0 cm de comprimento contendo de crescimento, com temperatura de 25±2 ºC, por
uma gema (Figura 2-B), devem ser inoculados, sob 60 dias. Após esse período, cerca de 50% dos
condições assépticas, em câmara de fluxo laminar, explantes devem apresentar a formação de calos
em placas de Petri de 90 mm x 15 mm, contendo embriogênicos (Figura 2-D).
Foto A: Ana Cristina P. P. de Carvalho

Fotos B-D: Marcos Vinícius Marques Pinheiro

Figura 2. Indução de calos embriogênicos, a partir do cultivo in vitro de explantes de segmento nodal em antúrio (Anthurium
andraeanum) cv. Eidibel. (A) Mudas de antúrio cv. Eidibel, previamente estabelecidas in vitro, em desenvolvimento adequado
para a excisão dos explantes para indução de calos embriogênicos. (B) Planta estabelecida in vitro, a partir da qual os
explantes foram excisados. (C) Segmentos nodais inoculados horizontalmente em placa de Petri. (D) Segmento nodal com
formação de calos embriogênicos, aos 60 dias após a inoculação, em meio Pierik suplementado com 10,0 µM de ANA.
6 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Embora vários trabalhos de pesquisa tratem da de calos é um processo de difícil obtenção e que
produção de mudas micropropagadas de antúrio, demanda muito tempo, cerca de 2 meses (RAAD et
via embriogênese somática, dados relativos à al., 2012), a recomendação de um protocolo com a
porcentagem de obtenção de calos embriogênicos, utilização de outra fonte de auxina, como o ANA, é
a partir dos explantes utilizados, são escassos. uma alternativa viável para obtenção de embriões
Te-Chato et al. (2006) verificaram que 60% e somáticos nessa espécie, visando evitar os efeitos
70% dos explantes de segmento nodal formaram negativos causados pelo 2,4-D. Além disso, não
calos embriogênicos nos meios de cultura MS há registro na literatura sobre os efeitos de ANA
(MURASHIGE; SKOOG, 1962) e WPM (LLOYD; em cultivos prolongados, na indução de variações
McCOWN, 1980), respectivamente. A partir de genéticas e epigenéticas afetando o potencial
explantes foliares, foram registradas taxas de embriogênico das culturas.
formação de calos embriogênicos que variaram
de 0,0% a 38,8% (KUEHNLE et al., 1992), de Aos 60 dias, a natureza dos calos embriogênicos
29,3% a 48,7% (BAUTISTA et al., 2008) e 61,1% (Figura 3-A) pode ser diagnosticada por aspectos
(MATSUMOTO et al., 1996). Na metodologia histoquímicos, por meio da dupla coloração com
proposta, metade dos explantes de segmento nodal carmim acético (2%) e azul de Evans (0,1%),
é responsiva na formação de calos embriogênicos,
seguindo-se o proposto por Durzan (1988). As
(PINHEIRO et al., no prelo. a), indicando que esse
estruturas que reagiram ao carmim acético são
valor é semelhante aos citados na literatura, e que
coradas de vermelho e revelam setores com
as variações registradas devem ser atribuídas aos
características embriogênicas (Figura 3-B); aquelas
protocolos utilizados, bem como às cultivares de
que reagirem ao azul de Evans são coradas de azul,
antúrio estudadas.
revelando estruturas não embriogênicas. Assim,
confirma-se a presença de calos embriogênicos,
Vários estudos têm destacado o papel fundamental
da aplicação de auxinas como indutores da e não de massas parenquimáticas calosas. Além
embriogênese somática, em especial o 2,4-D. Essa disso, pode-se realizar o teste de lugol (0,1%) em
auxina tem sido considerada a mais indicada para calos macerados para detectar a presença de amido
a indução de maiores taxas de embriões somáticos (JENSEN, 1962), já que os calos embriogênicos
na espécie A. andraeanum (KUEHNLE et al., 1992; possuem elevada quantidade de amido em
BAUTISTA et al., 2008). Entretanto, Guerra et al. suas células que reagem ao lugol, corando de
(1998) ressaltam que a manutenção prolongada dos amarelo-escuro a preto-azulado (Figura 3-C). Isso
calos embriogênicos em meio contendo 2,4-D pode confirma que os calos produzidos possuem células
induzir variações genéticas e epigenéticas, afetando embriogênicas. Os calos embriogênicos formados
o potencial embriogênico das culturas. Além disso, devem apresentar coloração amarelo-clara, e os
os mesmos autores observaram que os embriões embriões somáticos, tanto a presença de grãos
somáticos tornam-se habituados quando cultivados de amido em suas células, quanto de procâmbio e
por longos períodos na presença dessa auxina, delimitações da protoderme bem definidas, além de
resultando na perda do potencial de maturação e, sinais de polarização (Figura 3-D; 3-E), confirmados
consequentemente, da capacidade de conversão dos a partir do uso de técnicas da Anatomia Vegetal
embriões em plantas. Como, em antúrio, a indução (KARNOVSKY, 1965; O´BRIEN; MACCULLY, 1981).
7 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Fotos A-C: Marcos Vinícius Marques Pinheiro

Fotos D-E: Marcos Vinícius Marques Pinheiro; Ana Claudia Ferreira da Cruz
Figura 3. Indução de calos embriogênicos em explantes de segmento nodal de antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel,
em meio Pierik suplementado com 10,0 µM de ANA. (A) Calos embriogênicos induzidos aos 60 dias de cultivo in vitro.
(B) Culturas embriogênicas, em que as células de coloração vermelha revelam características embriogênicas. (C) Culturas
embriogênicas coradas com lugol para detecção de amido (reação positiva: coloração marrom). (D-E) Seções transversais
de embriões somáticos desenvolvidos aos 60 dias de cultivo in vitro. (D) Embrião somático com início de formação de
protoderme. (E) Embriões somáticos com formação de protoderme e procâmbio, além da presença de grãos de amido
em suas células, quando corados com lugol. Eb: embrião; Pt: protoderme; Pc: procâmbio; Ga: grãos de amido; círculo:
evidencia a presença de grãos de amido nas células embriogênicas. Barras: A: 500 µm; B: 300 µm; C: 200 µm;
D: 150 µm; E: 100 µm.

Etapa 2: Proliferação das culturas A Etapa 2 tem como objetivo a estabilização da

embriogênicas capacidade embriogênica e da proliferação das
linhagens celulares, por meio de quatro subcultivos, a
Para a proliferação das culturas embriogênicas,
cada 60 dias. Guerra et al. (1998) enfatizam que são
recomenda-se que os calos embriogênicos, obtidos
necessários 4 ou 5 subcultivos sucessivos para que
na Etapa 1, sejam subdivididos, isto é, seccionados
ocorram a purificação e a estabilização das culturas
em partes menores (Figura 4-A). Cada calo pode
embriogênicas, de tal maneira que elas possam ser
ser dividido, em média, em duas partes, sendo,
consideradas linhagens celulares embriogenéticas.
posteriormente, transferidas, sob condições
Sendo assim, com esse procedimento de subcultivos,
assépticas, em câmara de fluxo laminar, para
serão produzidos embriões somáticos secundários
placas de Petri contendo meio de cultura na mesma
(Figura 4-B), e a partir daí poderão ser efetuados
composição e quantidade citadas para a Etapa 1.
subcultivos sucessivos até que se obtenha
Sugere-se a inoculação de nove calos por placa de
quantidade desejada de calos embriogênicos para a
Petri. As culturas devem ser mantidas nas mesmas
introdução da Etapa 3.
condições estabelecidas para a Etapa 1.
8
Fotos: Marcos Vinícius Marques Pinheiro. Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Figura 4. Proliferação de calos embriogênicos de antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel. (A) Calo embriogênico, aos
60 dias, induzido em meio Pierik suplementado com 10,0 µM de ANA. (B) Calo embriogênico subcultivado a cada 60 dias,
no mesmo meio indutor, evidenciando embriogênese somática secundária. Barras: A: 500 µm; B: 1.000 µm.

Etapa 3: Maturação dos embriões Ao final desse período, são produzidos cerca de
somáticos 5,2 embriões somáticos por calo embriogênico.
Embora apresentem desenvolvimento normal, não
Para a maturação dos embriões somáticos, calos ocorre o desprendimento dos embriões dos calos
embriogênicos obtidos na Etapa 2 devem ser embriogênicos (Figura 5-D). É possível observar
selecionados em função da presença de setores com ainda que os calos apresentam textura friável, alguns
grande capacidade de proliferação (Figura 4-B) e com desenvolvimento embrionário avançado, ou seja,
crescimento embrionário com sinais de polarização embriões nos estádios de globular ao estádio juvenil
(Figura 3-D e 3-E) (PINHEIRO et al., no prelo. b). (germinado), como mostrado na Figura 5-E.

Nessa fase, os calos embriogênicos selecionados, Por meio da análise histológica das culturas
com cerca de 90 mg de massa fresca (Figura 5-B), embriogênicas, é possível observar embriões em
devem ser inoculados, sob condições assépticas, em diferentes estádios de maturação (Figura 5-F e 5-G);
Erlenmeyers de 125 mL, contendo 25 mL de meio de embriões somáticos em início de formação (Figura
cultura ESB líquido suplementado com 0,47 µM (que 5-F); embriões somáticos com protoderme bem
corresponde a 0,10 mg L-1) de 6-furfurilaminopurina definida e presença de procâmbio, evidenciando
(cinetina) (Tabela 1), como mostrado na Figura 5-A. a presença de um sistema vascular fechado,
Os calos embriogênicos devem ser mantidos em o que demonstra sinais de polarização (Figura
sala de crescimento a 25±2 oC, no escuro (cobertos 5-G); embrião somático em estádio avançado de
por papel alumínio), sob agitação orbital a 100 rpm, desenvolvimento (Figura 5-H).
durante 45 dias (Figura 5-C).
9 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

F-H: Marcos Vinícius Marques Pinheiro; Ana Claudia Ferreira da Cruz

Fotos A-E: Marcos Vinícius Marques Pinheiro

Figura 5. Maturação de calos embriogênicos de antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel. (A) Erlenmeyer, contendo 25 mL de
meio de cultura Pierik líquido suplementado com 0,47 µM de cinetina, para a inoculação dos calos embriogênicos. (B) Explante
inicial: calos embriogênicos inoculados em Erlenmeyer contendo o referido meio. (C) Manutenção dos calos embriogênicos
em mesa agitadora, no escuro, sob agitação orbital a 100 rpm, durante 45 dias. (D) Explante final: calos embriogênicos com
embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento, aos 45 dias de cultivo. (E) Explante final: calos embriogênicos
com embriões de maturação completa e germinados, aos 45 dias de cultivo. (F) Calos embriogênicos com início de formação
de embrião somático. (G) Embrião somático em estádio intermediário de desenvolvimento, com protoderme e procâmbio bem
definidos. (H) Maturação completa do embrião em planta, demonstrando zonas meristemáticas apical e radicular evidentes, Cl: calo;
Eb: embrião; Pc: procâmbio; Pt: protoderme. Barras: A: 5 mm; B: 10 mm; C: 30 mm; D: 1 mm; E: 100 µm; F; G; H: 300 µM.
10 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Etapa 4: Germinação dos embriões Aos 45 dias de cultivo in vitro, observa-se o

somáticos desenvolvimento normal dos embriões somáticos
em brotos com posterior regeneração de plantas
Nessa fase, cerca de quatro calos embriogênicos
(41,2%), com a presença da parte aérea e da
com embriões maduros devem ser inoculados, sob
radicular (Figura 6-A; 6-B).
condições assépticas em Erlenmeyers de 125 mL,
contendo 25 mL de meio de cultura ESC, Pierik Em antúrio, a porcentagem de conversão de
semissólido suplementado com 2,32 μM (que embriões somáticos em plantas é muito inconstante,
corresponde a 0,5 mg L-1) de cinetina (Tabela 1). As principalmente em função do genótipo e da
culturas são mantidas em sala de crescimento a composição do meio de cultura, usado na etapa
25±2 oC, sob fotoperíodo de 16 horas e irradiância de inicial de indução dos calos embriogênicos.
36 μmol m-2s-1, por 45 dias.

Tabela 1. Meios de cultura ESA (etapas 1: indução de calos embriogênicos e 2: proliferação das culturas
embriogênicas), ESB (etapa 3: maturação dos embriões somáticos) e ESC (etapa 4: germinação dos
embriões somáticos) utilizados na produção de mudas micropropagadas de antúrio, (Anthurium
andraeanum) via embriogênese somática (PIERIK, 1976 modificado).
Meio de cultura ESA ESB ESC
componente (1) mg L-1
Nitrato de amônio (NH4NO3) 825 825 825
Nitrato de potássio (KNO3) 950 950 950
Sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O) 185 185 185
Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) 85 85 85
Cloreto de cálcio tetra-hidratado (CaCl2.4H2O) 220 220 220
Sacarose 20.000 20.000 20.000
ANA 1,86 - -
Cinetina - 0,10 0,50
Ágar (Merck ) ®
6.500 - 6.500
(1)
Este meio deve ser adicionado de microelementos, FeEDTA, mio-inositol e vitaminas do meio MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962).

Kuehnle et al. (1992) constataram porcentagens de Após esse processo, as mudas enraizadas, com
formação de plantas que variaram de 14% a 85%, cerca de duas folhas e 1,5 cm de altura, devem ser
70% e 100% para os híbridos UH780, UH965 e separadas (Figura 6-B) e transplantadas, em número
UH1060, respectivamente. Na cultivar Lambada, em de cinco mudas por frasco do tipo Agripot® (Figura
função da concentração da citocinina adicionada 6-C), contendo substrato comercial Plantmax®, e
ao meio de cultura, a porcentagem de embriões fechados com tampas plásticas transparentes de
somáticos que formaram plantas variou de 29,8% polipropileno com 6,0 cm de diâmetro e área de
a 64,5% (BAUTISTA et al., 2008). Na metodologia 90 cm3, objetivando-se manter o ambiente interno do
proposta, 41,2% dos embriões somáticos resultaram recipiente bem úmido. As plantas devem permanecer
na obtenção de plantas completas, indicando que nessas condições por 2 meses, sob condições
esse valor deve ser atribuído à cultivar estudada, de temperatura ambiente (cerca de 28±2 °C),
bem como ao protocolo empregado. luminosidade artificial de 50 μmol m-2s-1 e luz natural
indireta. Após esse período, as mudas devem ser
transplantadas individualmente para copos plásticos,
Etapa 5: Aclimatização das plantas
com capacidade de 300 cm3, totalmente preenchido
As plantas regeneradas, provenientes dos embriões com o substrato Plantmax® e mantidas em casa de
somáticos formados na Etapa 4, devem ser retiradas vegetação, com temperatura e umidade controladas
dos Erlenmeyers e lavadas com água corrente (Figura 6-D). A porcentagem de sobrevivência das
para a remoção do meio de cultura nelas aderido. plantas durante a aclimatização foi de 65%.
11 Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Fotos: Marcos Vinícius Marques Pinheiro

Figura 6. Germinação dos embriões somáticos e aclimatização de mudas de antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel a
partir da embriogênese somática. (A) Embriões formados em meio semissólido Pierik, acrescido de 2,32 µM de cinetina.
(B) Planta completa obtida a partir da conversão dos embriões somáticos. (C) Detalhe do tipo de frasco (Agripot®) utilizado
para a aclimatização das mudas. (D) Planta com 5 meses de idade em casa de vegetação.

Todos os meios de cultura são acrescidos dos 15 minutos. Em relação aos meios ESA e ESC, que
microelementos, FeEDTA, mio-inositol e vitaminas do possuem a consistência semissólida, a quantidade
meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), tendo o pH do agente gelificante a ser adicionada ao meio de
corrigido para 5,8 e autoclavados a 121 oC, durante cultura vai depender da marca do produto.
12
Fotos: Marcos Vinícius Marques Pinheiro Produção de Mudas Micropropagadas de Antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel por Embriogênese Somática

Figura 7. Esquema ilustrativo resumido das fases da embriogênese somática em antúrio (Anthurium andraeanum) cv. Eidibel.

Considerações Agradecimentos
O protocolo em questão (Figura 7) abre novas Os autores agradecem ao Instituto Agronômico (IAC)
possibilidades para a transformação genética por cederem as mudas in vitro para a realização
de plantas, preservação de germoplasma por deste trabalho; à Embrapa e à Fundação de Amparo
criopreservação e integração de técnicas associadas à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig),
à tecnologia de sementes sintéticas, além da rápida pelo auxílio à pesquisa; e à Capes, pela concessão
propagação de mudas de antúrio cv. Eidibel. Esse de bolsa ao segundo autor.
protocolo de embriogênese somática foi desenvolvido
pela Embrapa Agroindústria Tropical, em parceria
com a Universidade Federal de Viçosa, para essa
Referências
cultivar. Além disso, este estudo fornece valiosas ANEFALOS, L. C.; TOMBOLATO, A. F. C.; RICORDI, A. Panorama
informações que podem ser utilizadas no futuro para atual e perspectivas futuras da cadeia produtiva de flores
aprimorar a técnica de propagação in vitro dessa tropicais: o caso do antúrio. Revista Brasileira de Horticultura
espécie cultivada no Brasil, favorecendo a produção Ornamental, Campinas, v. 16, n. 1, p. 107-111, 2010.

de mudas para produtores de antúrio em todas as BAUTISTA, N. R. del; PEÑALVER, D. A.; RODRÍGUEZ, R.
regiões do País. B.; CHIU, W. C.; LÓPEZ, R. C.; TERRY, F. J.; PERALTA, M.
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Circular Exemplares desta edição podem ser adquiridos na: Comitê de Presidente: Marlon Vagner Valentim Martins
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Rodrigues de Miranda.
1a edição (2012): on-line
Expediente Revisão de texto: Marcos Antonio Nakayama
Editoração eletrônica: Arilo Nobre de Oliveira
Normalização bibliográfica: Edineide Maria M. Maia.