Teste de Biologia do RNA

Ano Lectivo 2015-2016

Nov 2015
Duração 2h

Nome: ...................................................................................................................

Número mecanográfico : ............................. Mestrado:...................................

Parte A. Responda a todas as alíneas de cada pergunta assinalando as respostas

verdadeiras com V e as falsas com F (10 valores).

1. Em Eucariotas a RNA polimerase II:

__F___É uma enzima responsável pela tradução
__V___É inibida por baixas concentrações de alfa-amanitina
__V___Está localizada no nucleo
__F___Está localizada no nucléolo
__V___Transcreve os mRNAs e snRNAs

2. A transcrição pela RNA polimerase II:

__V___Requer que o complexo de iniciação se forme no promotor
__V___É inbida pela compactação da cromatina
__F___Precisa de snRNAs
__F___Não depende do padrão de fosforilação da CTD
__V__Ocorre ao mesmo tempo que o pre-mRNA é processado
3. O domínio carboxi-terminal (CTD) da RNA polimerase II
__F___Contém modificações no C e N terminal das hitonas
__V___Participa na formação do terminal 3’ de snRNAs
__V___Consiste em 52 repetições de sete aminoácidos em mamíferos
__V___Liga proteínas envolvidas na formação do terminal 3’ de mRNAs
__V___Liga proteínas envolvidas no 5’ capping de mRNAs

4. A fosforilação da CTD:
__V___Pode ocorrer nos resíduos Ser, Thr e Tyr do heptapéptido
__V___É elevada no resíduo de aminoácido Ser5 no inicio da transcrição
__F___É baixa no resíduo de aminoácido Ser5 no inicio da transcrição
__V___É elevada no resíduo de aminoácido Ser2 no final da transcrição
__V___É necessária para o recrutamento de factores de poliadenilação

5. Em Eucariotas, a RNA polimerase II termina a transcrição:

__V___Quando a enzima se liberta do DNA molde
__F___Quando a maquinaria transcricional encontra uma estrutura em forma de
“gancho de cabelo”
__V___Quando existe de um sinal poli(A)
__V___Dependendo da existência da exonuclease Xrn2
__F___Depende do CstF

6. Um mRNA Eucariota caracteriza-se por:

__V___Ter uma estrutura cap no terminal 5’
__V___Ter uma cauda poli(A) no terminal 3’
__F___Conter intrões
__V___Não conter intrões
__V___Ter “RNA binding proteins” ligadas a si

7. O 3’UTR do mRNA:
__F___É uma sequência curta de RNA que apenas separa o codão stop da cadeia
poli(A)
__V___Pode regular a expressão genética
__F___Serve apenas para destabilizar o mRNA
__V___Regula a tradução
__F___Liga-se a factores de elongação da transcrição
8. A modificação 5’ CAP do mRNA é formada:
__F___Durante a montagem do complexo de pré-iniciação da transcrição.
__V___Pelo dinucleótideo 5´-Gppp-5´X
__F___Pelo dinucleótideo 5´-Gpp-3´G
__F___Pelo trinucleótideo 5´-GpppGppX-3´.
__V___Pela metilação da guanosina do dinucleótideo 5´-Gppp-5´-X

9. A 5’ CAP do mRNA tem as seguintes funções:

___V__Protecção do mRNA de degradação.
___V__Aumento da eficiência de tradução do mRNA.
___V__Aumento da eficiência de transporte do mRNA para o citoplasma
___V__Aumento da eficiência de splicing
___F__Diminuição da eficiência do splicing

10. O spliceossoma:
__V___É formado por RNAs e proteínas
__F___É formado por RNAs apenas
__F___É formado por proteínas apenas
__F___Não cliva todos os intrões nos pre-mRNAs que codificam proteínas
__V___Participa no splicing alternativo

11. No mecanismo de splicing:

__V___Os elementos conservados GU..A..AG estão num contexto conservado
__F___Os elementos conservados são reconhecidos pelo spliceosoma pré-
montado.
__V___Os vários componentes do spliceosoma são montados sequencialmente
nos intrões.
___V__A snRNP U1 reconhece o sinal GU.
__V___A snRNP U2 reconhece a A do ponto de ramificação (branch point)

12. O splicing alternativo:

__F___Não requer o spliceosoma.
__V___É co-transcricional.
__V___Utiliza proteínas SR.
__V___Utiliza proteínas do tipo hnRNP
__V___Utiliza proteínas suja expressão é específica de determinados tecidos.
13. O 3’ dos mRNAs das histonas é processado:
__V___Por clivagem do pré-mRNA pela CPSF73
__F___Não existe clivagem do pré-mRNA
__F___Por adição de uma cauda poli(A)
__V___Por emparelhamento da U7 snRNP a uma sequência no pré-mRNA
__V___Pela SLBP que se liga a uma estrutura em forma de gancho de cabelo

14. A poliadenilação dos mRNAs:

__V___É dependente de um sinal de poliadenilação
__V___Faz-se após a clivagem do pré-mRNA
__V___Precisa do complexo proteico CPSF
__F___Necessita da polimerização da enzima CFI/CFII
__F___Requer a clivagem do pré-mRNA pela enzima CstF

15. A cadeia poli(A) dos mRNAs:

__V___Existe em todos os mRNAs
__V___Pode ser longa (>50 nucleótideos)
__V___É adicionada pela RNA polimerase
__V___Protege o mRNA de degradação
__V___Aumenta a eficiência da tradução

16. O CPSF:
__V___Reconhece o hexamero do sinal poli(A) no pré-mRNA
__V___Não reconhece o DSE (GU/U)
__V___É recrutado pela CTD para o promotor
__V___É recrutado pela CTD para o sinal poli(A)
__V___Participa na clivagem do pré-mRNA

17. A poliadenilação alternativa:

__F___Permite fazer combinações alternativas de intrões.
__V___Ocorre no nucleo
__V___Permite incluir 3’UTRs de diferentes tamanhos no mRNA
__V___É regulada por RNA binding proteins
__F___Não é regulada pela velocidade da transcrição
18. Os níveis de mRNA (steady-state levels) podem ser determinados por metódos
de:
__V___Northern blotting
__V___PCR em tempo real ou quantitativo (RT-qPCR)
__F___PCR convencional
__V___RT-PCR
__V___Sequenciação de RNA (RNA-Seq)

19. A técnica de ChIp (chromatin immunoprecipiation) é usada para:

__V___Localizar uma proteína específica em locais específicos do DNA
__F___Localizar uma proteína específica em locais específicos do RNA
__F___Medir niveis de mRNA
__F___Medir níveis de snRNPs
__V___Verificar se uma proteína específica se liga a cromatina

20. A técnica de RIP (RNA immunoprecipitation):

__V___Permite identificar RNAs que se ligam a uma proteína específica
__F___Permite identificar proteínas que se ligam a um RNA específico
__F___Permite identificar a sequência no RNA a que uma determinada proteína
se liga
__F___Consiste na immunoprecipitação de uma proteína que se liga ao DNA
__F___Consiste na immunoprecipitação de RNA

Parte B (10 valores)

1. Descreva como é que a transcrição pela RNA polimerase II se integra com o

capping (2 valores).
O 5’ capping ocorre co-transcricionalmente, e consiste no processamento do
terminal 5’ de pre-mRNAs por factores proteicos (o cap binding complex). Estes
são recrutados para o pré-mRNA pela CTD da RNAPII durante a transcrição. A
fosforilação do residuo Ser5 da CTD facilita esse recrutamento, integrando o
capping com a transcrição.

2. Comente a frase, enunciando exemplos se for necessário:”O splicing

alternativo é co-transcricional e por vezes depende da velocidade de
transcrição” (2 valores)
O splicing, assim como o splicing alternativo, ocorre na maior parte dos casos co-
transcricionalmente, sendo afectado pela iniciação da transcrição e elongação.
Por exemplo, a taxa da elongação da transcrição pode affectar alguns tipos de
splicing alternativo (kinetic coupling model). Em particular for demonstrado que
uma mutação pontual na subunidade maior da RNAPII que confere uma
 diminuição de cerca de 50% na sua taxa de elongação causa maior inclusão de
exões fracos, que normalmente seriam excisados.

3. Como é que um splicing incorrecto pode dar origem a doenças e dê um

exemplo (2 valores)
Ao haver splicing incorrecto, os intrões podem não ser correctamente excisados
e/ou os exões incluídos no pré-mRNA, produzindo um mRNA que não é funcional
e/ou que não é traduzido em proteina funcional, ou em quantidades de proteína
suficientes.
Ex Atrofia muscular espinal (SMA) – A SMN é codificada por 2 genes: SMN1 e
SMN2. Pacientes com SMA têm mutações/delecções no SMN1, e os níveis de
proteína dados por SMN2 não são suficientes, porque há uma substituição de C
para T no ESE do exão 7, levando à sua excisão/skipping.
Outros exs que podem ser descritos: DMD, fibrose quística, demência
frontotemporal

4. Dê um exemplo de como a poliadenilação alternativa pode afectar a expressão

génica (2 valores)
Poliadenilação alternativa consiste no uso diferencial ou alternativo de
diferentes sinais pA.
Os sinais pA podem estar localizados no 3’UTR e neste caso a poliadenilação
alternativa dá origem a mRNAs com 3’UTR com comprimentos diferentes. Como
no 3’UTR existem regiões reguladores da estabilidade e tradução do mRNA, a
poliadenilação alternativa nesta região pode afectar a expressão génica.
No caso do uso de sinais pA localizados em intrões ou exões, formam-se mRNAs
diferentes, dando oriegm a proteínas diferentes com funções diferentes, logo
afecta a expressão génica.
Um destes exemplos:
APA específica de tecido: A calcitonina e o péptido relacionado com o gene da
calcitonina (CGRP). O transcrito primário codifica para duas proteínas com
funções diferentes: Calcitonina – hormona porduzida na tiróide – e o CGRP –
vasodilatador produzido em neurónios. Na tiroide a PTB liga-se a uma região
reguladora no intrão 4 activando o sinal poliA a montante, localizado no exão 4 e
formando um mRNA que codifica a calcitonina. No neurónio o exão 4 é ecisado
por splicing alternativo e é usado o sinal poliA no final da unidade transcricional,
originando o CGRP.
APA específica de tipo celular (desenvolvimento celular). Em células B e pré-B o
CstF encontra-se em concentrações limitantes e o sinal poliA mais forte
localizado no fim da unidade transcricional da IgM é reconhecido, formando um
mRNA que contem os exões que codificam para os domínios da proteína
responsáveis pela ligação à membrana. Em células plasmáticas, o CstF não é
 limitante e o primeiro sinal poliA a ser transcrito é reconhecido (“first come, first
served model”). O sinal poliA fraco localizado no exão S é reconhecido e forma-
se o mRNA que produz a forma secretada da proteína.
APA no 3’UTR: Drosophila polo. O polo sofre APA na 3’UTR pela utilização de 2
sinais poliA, formando 2 mRNAs que só diferem no comprimentos da 3’UTR. A
delecção do segundo sinal é letal, porque este mRNA é mais traduzido em
proteína que o mais curto. Ao não ser usado o segundo sinal poliA, não é
produzido o mRNA mais longo e não há proteína Polo suficiente para que as
células dos histoblastos proliferem durante a metamorfose, estadio do
desenvolvimento da mosca em que ocorrem multiplas divisões celulares muito
rápidas, que requerem muita proteína Polo.

5. A formação do terminal 3’ de mRNA pode servir como um mecanismo de

auto-regulação dos níveis de mRNA. Descreva um exemplo. (2 valores)
A formação do terminal 3’ de mRNAs que codificam para proteínas (à excepção
das histonas) consite na clivagem do transcrito primário (pré-mRNA) e
polimerização de uma cauda poliA.
Exemplo de mecanismo de auto-regulação dos níveis de mRNA:
O pré-mRNA da U1A contem uma estrutura em forma de gancho de cabelo
(stem-loop) a montante do sinal poliA denominada PIE - polyadenylation
inhibition element.
Quando há um excesso de proteína U1A, duas moléculas da proteína U1A ligam-
se a esta estrutura, recrutando a poliA polimerase (PAP) e inibindo a
polimerização da cauda poliA, inbindo assim a formação do mRNA da U1A.
Quando não há excesso de proteína U1A, ela não se liga ao PIE e há produção de
mRNA da U1A.
Outro exemplo:
Quando há sobreexpressão da proteína Polo, há activação do sinal pA mais
proximal (pA1) dando origem a um mRNA que é pouco traduzido.