As Ciencias Biologicas e Da Saude Na Contemporaneidade 2

Nayara Araújo Cardoso CAPÍTULO
Renan Rhonalty Rocha

Maria Vitória Laurindo
RESERVADO PARA TITULO
(Organizadores)
As Ciências Biológicas e da Saúde na

Contemporaneidade 2
Atena Editora
2019
As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade 2 Capítulo 2

2019 by Atena Editora
Copyright da Atena Editora
Editora Chefe: Profª Drª Antonella Carvalho de Oliveira
Diagramação e Edição de Arte: Natália Sandrini e Lorena Prestes
Revisão: Os autores
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
(eDOC BRASIL, Belo Horizonte/MG)
C569 As ciências biológicas e da saúde na contemporaneidade 2 [recurso
eletrônico] / Organizadores Nayara Araújo Cardoso, Renan
Rhonalty Rocha, Maria Vitória Laurindo. – Ponta Grossa (PR):
Atena Editora, 2019. – (As Ciências Biológicas e da Saúde na
Contemporaneidade; v. 2)
Formato: PDF
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Modo de acesso: World Wide Web.
Inclui bibliografia
ISBN 978-85-7247-216-6
DOI 10.22533/at.ed.166192803
1. Ciências biológicas. 2. Biologia – Pesquisa – Brasil. 3. Saúde

– Brasil. I. Cardoso, Nayara Araújo. II. Rocha, Renan Rhonalty.
III.Laurindo, Maria Vitória. IV. Série.
CDD 574
Elaborado por Maurício Amormino Júnior – CRB6/2422
O conteúdo dos artigos e seus dados em sua forma, correção e confiabilidade são de
responsabilidade exclusiva dos autores.
2019
Permitido o download da obra e o compartilhamento desde que sejam atribuídos créditos aos
autores, mas sem a possibilidade de alterá-la de nenhuma forma ou utilizá-la para fins comerciais.
APRESENTAÇÃO
A obra “As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade” consiste de

uma série de livros de publicação da Atena Editora, em seus 22 capítulos do volume
II, apresenta a importância do desenvolvimento de novas pesquisas nos âmbitos da
saúde e da natureza e ainda a relevância da busca de novas terapias para o tratamento
de variadas patologias.
O desenvolvimento de pesquisas no campo da saúde representa uma ferramenta
importante para a busca de novas estratégias para o diagnóstico, acompanhamento
do curso e tratamento de doenças. É na área da saúde que a biotecnologia encontra
algumas de suas aplicações mais benéficas e abrangentes. Por meio de diferentes
vertentes biotecnológicas, como a produção e atuação de organismos geneticamente
modificados; a engenharia genética, que permite qualquer tipo de alteração em nível de
DNA e experimentos empregando espécies vegetais e/ou compostos isolados para o
desenvolvimento de terapias alternativas e aprimoramento das terapias convencionais.
Atualmente a busca por novos compostos com atividade terapêutica é feita
majoritariamente através da experimentação de produtos naturais, uma vez que
muitos destes têm comprovadas cientificamente suas propriedades antimicrobianas,
antioxidantes, anti-inflamatórias, antineoplásicas, analgésicas, entre outras.
Desse modo, este volume II apresenta artigos que tratam: das propriedades
antioxidantes de espécies vegetais como o alecrim e o chá verde; estudos
microbiológicos e de toxicidade de espécies vegetais e animais; caracterização de
ácidos nucleicos e proteínas; emprego da engenharia genética para elucidação de
mecanismos de ação e desenvolvimento e experimentação de alimentos funcionais.
Assim, esta obra é dedicada aos pesquisadores da área de saúde, que buscam reciclar
seus conhecimentos por meio de pesquisas relevantes e se atualizar perante às novas
tecnologias e descobertas científicas e biotecnológicas aplicadas às áreas da saúde.
Portanto, esperamos que este livro possa estimular outros estudantes e
profissionais de saúde ao desenvolvimento de pesquisas e estudos a fim de incorporar
à literatura referências atualizadas e possibilitar a aplicabilidade dos resultados dessas
pesquisas às práticas profissionais diárias.
Nayara Araújo Cardoso

Renan Rhonalty Rocha
Maria Vitória Laurindo
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1................................................................................................................. 1
A BIOLOGIA SINTÉTICA E ENGENHARIA METABÓLICA PARA DESENVOLVIMENTO DE SOLUÇÕES
EM BIOTECNOLOGIA
Mauricio Schiavo
Gabriel Dall’Alba
Mauricio Moura da Silveira
Sergio Echeverrigaray
DOI 10.22533/at.ed.1661928031
CAPÍTULO 2............................................................................................................... 18
A CONSTRUÇÃO DE MODELOS DIDÁTICOS DA ESTRUTURA DO DNA COM MATERIAIS
ALTERNATIVOS: CRIANDO E APRENDENDO
Maria da Conceição dos Reis Leal
João Gabriel Rangel Gonçalves
DOI 10.22533/at.ed.1661928032
CAPÍTULO 3............................................................................................................... 28
ALECRIM (Rosmarinus officinalis L.): EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES E SUA
IMPORTÂNCIA NO CONTROLE DA DOENÇA MANCHA FOLIAR EM PLANTAS DE CEVADA
Fernando Luquis
Brenda Mery Santos de Godoy
Cristiane Santana Garcia
Victor Alves Franklin
Luciana Leite Oliveira
Nilsa Sumie Yamashita Wadt
Vinicius de Oliveira Cardoso
Erna Elisabeth Bach
DOI 10.22533/at.ed.1661928033
CAPÍTULO 4............................................................................................................... 37
ALELOPATIA DE EXTRATOS AQUOSOS DE Eragrostis lugens Nees. NA GERMINAÇÃO E
CRESCIMENTO INICIAL DE Oryza sativa L
Daniela Sponchiado
Jéssica Cezar Cassol
Douglas de Lima Righi
Lucas Menezes Jorge
Eduarda Mena Barreto
Juçara Terezinha Paranhos
DOI 10.22533/at.ed.1661928034
SUMÁRIO
CAPÍTULO 5............................................................................................................... 45
AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE DE COMBRETUM LEPROSUM MART.: TESTE ALLIUM CEPA
Raidan Costa Rodrigues
Valéria Moura de Carvalho
Jadielson da Silva Santos
Brenda Lois Barros dos Santos
Andressa Jordanne Pereira Ramos
Cairo Hilbert Santos de Melo
Juliane Moreira Ramos
Elizângela de Carvalho Nunes
Sâmya Katya Barros Guimarães
Wanderson Ferreira Martins
Adão Correia Maia
Kelly Maria Rêgo da Silva
Mateus Sávio Amorim
Antonio Lima Braga
DOI 10.22533/at.ed.1661928035
CAPÍTULO 6............................................................................................................... 50
AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS DE ALECRIM (ROSMARINUS
OFFICINALIS) E CHÁ VERDE (CARMELLIA SINENSIS) EM LINGUIÇAS FRESCAL BOVINA
Thaisa Cidarta Melo Barbosa
Juliana Nobrega Clemente
Karina da Silva Chaves
Sthelio Braga da Fonseca
Bruno Raniere Lins de Albuquerque Meireles
DOI 10.22533/at.ed.1661928036
CAPÍTULO 7............................................................................................................... 61
AVALIAÇÃO DO USO DE AÇÚCAR NA TERAPIA TÓPICA DE FERIDAS
Ingrid dos Santos Farias
Emanuelle Karine Frota Batista
Hebelys Ibiapina da Trindade
Janayna Batista Barbosa de Sousa Muller
Maria José Lima Nascimento
Evanita da Rocha Luz
Maria do Carmo de Souza Batista
DOI 10.22533/at.ed.1661928037
CAPÍTULO 8............................................................................................................... 71
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA VITAMINA C SOBRE A DEFESA ANTIOXIDANTE ENZIMÁTICA
NA FASE AGUDA DA DOENÇA DE CHAGAS EM CAMUNDONGOS EXPERIMENTALMENTE
INFECTADOS COM A CEPA QM2 DE Trypanosoma cruzi
Patrícia Milani de Moraes
Bruna de Lima Pereira
Ludmyla Toller Cocco
Luciamare Perinetti Alves Martins
DOI 10.22533/at.ed.1661928038
SUMÁRIO
CAPÍTULO 9............................................................................................................... 84
AVALIAÇÃO DOS ÍNDICES DE REGENERAÇÃO HEPÁTICA NO MODELO EXPERIMENTAL DE
HEPATECTOMIA A 70%
Luz Marina Gonçalves de Araujo Oliveira
Pedro Luiz Squilacci Leme
Maria Cristina Chavantes
DOI 10.22533/at.ed.1661928039
CAPÍTULO 10............................................................................................................. 94
BIOTECNOLOGIA NO CONTROLE DE MOSQUITOS TRANSMISSORES DE ARBOVIROSES:
BIOENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INSETICIDA EM MOSQUITOS ADULTOS
Fabíola da Cruz Nunes
Louise Helena Guimarães de Oliveira
Patrícia Alexandria Paiva Silva de Sousa
Hyago Luiz Rique
DOI 10.22533/at.ed.16619280310
CAPÍTULO 11........................................................................................................... 103

COMPOSTOS BIOATIVOS E POTENCIAL NUTRACÊUTICO DO FRUTO DE BURITI (Mauritia flexuosa
L) NA TERAPIA COADJUVANTE EM PORTADORES DE DISLIPIDEMIA
Joilane Alves Pereira-Freire
Vivianne Rodrigues Amorim
Fernanda Maria de Carvalho Ribeiro
Stella Regina Arcanjo Medeiros
Jurandy do Nascimento Silva
Paulo Michel Pinheiro Ferreira
DOI 10.22533/at.ed.16619280311
CAPÍTULO 12........................................................................................................... 116

DESENVOLVIMENTO DE MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO DE CÁLCIO PARA IMOBILIZAÇÃO
DE Chlorella vulgaris
Felipe de Albuquerque Santos
Eduardo Bittencourt Sydney
Alessandra Cristine Novak Sydney
DOI 10.22533/at.ed.16619280312
CAPÍTULO 13........................................................................................................... 127

DESENVOLVIMENTO DE PÃO DE FORMA CONTENDO FARINHA MISTA DE MARACUJÁ E
JABUTICABA
Jamilly Salustiano Ferreira Constantino
Julice Dutra Lopes
DOI 10.22533/at.ed.16619280313
CAPÍTULO 14........................................................................................................... 143

DETERMINAÇÃO DO EHL (EQUILÍBRIO-HIDROFÍLICO LIPOFÍLICO) DO ÓLEO DE ABACATE
Laíssa Aparecida Praxedes dos Reis
Alessandra Cristine Novak Sydney
DOI 10.22533/at.ed.16619280314
SUMÁRIO
CAPÍTULO 15........................................................................................................... 150
ESTUDO DA TOXICIDADE DE Combretum leprosum Mart.: TESTE ALLIUM CEPA
Valéria Moura de Carvalho
Raidan Costa Rodrigues
Kelly Maria Rêgo da Silva
Sâmya Katya Barros Guimarães
Brenda Lois Barros dos Santos
Cairo Hilbert Santos de Melo
Juliane Moreira Ramos
Wanderson Ferreira Martins
Gabrielle Costa Bento Campos
Adão Correia Maia
Antonio Lima Braga
Jadielson dos Santos
DOI 10.22533/at.ed.16619280315
CAPÍTULO 16........................................................................................................... 155

ESTUDO E MODELAGEM CINÉTICA HETEROGÊNEA DA REAÇÃO DE CETALIZAÇÃO DO GLICEROL
COM ACETONA UTILIZANDO ZEÓLITAS DO TIPO H-BEA E H-FER COMO CATALISADORES
Vinicius Rossa
Gisel Chenard Díaz
Yordanka Reyes Cruz
Sibele Berenice Castellã Pergher
Donato Alexandre Gomes Aranda
DOI 10.22533/at.ed.16619280316
CAPÍTULO 17........................................................................................................... 171

ESTUDOS MICROBIOLÓGICOS DAS FOLHAS DA Eugenia uniflora Linn. (PITANGA)
Giovanna Gabrielly Alves da Silva Fraga
Maria Gabrielle de Oliveira Tabosa
Emilay Lira de Freitas
Leticia Vieira dos Santos Beserra
Arquimedes Fernandes Monteiro de Melo
Risonildo Pereira Cordeiro
DOI 10.22533/at.ed.16619280317
CAPÍTULO 18........................................................................................................... 177

NEW PROCESS FOR OBTAINING NANOCHITOSAN / BURITI OIL (Mauritia flexuosa) BIOCOMPOSITE:
A BIOMATERIAL FOR REGENERATIVE MEDICINE AND TISSUE ENGINEERING
Júlia Silveira Broquá
Luciano Pighinelli
Magda Comoretto Gall
Jader Figueiredo
Giovani André Piva
Lucas Eduardo Lopes
Machado, Pamela Persson
Anderson Rockenbach
Renata Pospichil
Luan Rios Paz
Fernando Guimarães
Gabrielle Zanin
Marzena Kmiec Pighinelli
DOI 10.22533/at.ed.16619280318
SUMÁRIO
CAPÍTULO 19........................................................................................................... 192
PORPHYROMONAS GINGIVALIS NA PERIODONTITE: POR QUE ESTUDAR SEUS FATORES DE
VIRULÊNCIA COM FERRAMENTAS IN SILICO?
Ellen Karla Nobre dos Santos-Lima
Larissa de Mattos Oliveira
Michelle Miranda Lopes Falcão
Manoelito Coelho dos Santos Junior
Márcia Tosta Xavier
Soraya Castro Trindade
DOI 10.22533/at.ed.16619280319
CAPÍTULO 20........................................................................................................... 211

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIOSSURFACTANTES PRODUZIDOS POR Bacillus subtilis
A PARTIR DO EXTRATO AQUOSO DA ALGAROBA [Prosopis juliflora (SW) DC] COMO SUBSTRATO
NÃO CONVENCIONAL
Adrielly Silva Albuquerque de Andrade
Emanuele Cardoso Dias
Napoleão José de Oliveira Neto
Graciana Clécia Dantas
Adna Cristina Barbosa de Sousa
Andréa Farias de Almeida
DOI 10.22533/at.ed.16619280320
CAPÍTULO 21........................................................................................................... 224

SUPLEMENTAÇÃO COM DIFERENTES NUTRACÊUTICOS ATENUA PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS CARACTERÍSTICOS DO TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
Ana Olívia Martins Laurentino
Naiana da Rosa
Tamires Mateus Gomes
Eduardo de Medeiros Peretti
Fabiana Durante de Medeiros
Jucélia Jeremias Fortunato
DOI 10.22533/at.ed.16619280321
CAPÍTULO 22 .......................................................................................................... 231

USO DO EXTRATO DE Ganoderma lucidum NO CONTROLE DA MANCHA FOLIAR EM PLANTAS DE
CEVADA PROTEGENDO O MEIO AMBIENTE
Ricardo Zanirato da Costa Fernandes
Lorena de Cássia Barboza Pires
Jessica Pojato da Silva
Joseanne Meira Cambuí
Edgar Matias Bach Hi
Erna Elisabeth Bach
DOI 10.22533/at.ed.16619280322
SOBRE OS ORGANIZADORES.............................................................................. 239
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
A BIOLOGIA SINTÉTICA E ENGENHARIA

METABÓLICA PARA DESENVOLVIMENTO DE
SOLUÇÕES EM BIOTECNOLOGIA
Mauricio Schiavo indústria farmacêutica, com a possibilidade de

Fundação Universidade de Caxias do Sul, modificar vias metabólicas pouco produtivas de
Laboratório de biotecnologia e microbiologia compostos de interesse no desenvolvimento de
aplicada, Caxias do Sul - Rio Grande do Sul
farmacos e a utilização de diferentes organismos
Gabriel Dall’Alba para expressão de novas vias metabólicas; na
Fundação Universidade de Caxias do Sul, Núcleo
medicina, sendo a biologia sintética aplicada
de Pesquisa em Bioinformática, Caxias do Sul -
no desenvolvimento de terapias gênicas e no
Rio Grande do Sul
combate de agentes etiológicos biológicos
Mauricio Moura da Silveira
como vírus e microrganismos patológicos; na
Fundação Universidade de Caxias do Sul,
Laboratório de bioprocessos, Caxias do Sul - Rio indústria de alimentos, sendo que a biologia
Grande do Sul sintética e a engenharia metabólica são
aplicados em microrganismos para obtenção de
Sergio Echeverrigaray
Fundação Universidade de Caxias do Sul, flavorizantes, aromatizantes e diferentes micro e
Laboratório de biotecnologia e microbiologia macro nutrientes; no desenvolvimento de novas
aplicada, Caxias do Sul - Rio Grande do Sul soluções industriais e outras aplicações de
organismos chassis que envolvam detecção e
sinalização, purificação e extração e modificação
enzimática de diferentes compostos químicos.
RESUMO: Os avanços na biologia molecular,
Outras aplicações destas tecnologias poderão
bioinformática, biologia de sistemas e no estudo
influenciar em várias questões diárias e trazer
de genômica, proteômica e metabolômica
soluções em campos ainda não explorados.
levaram ao desenvolvimento de duas areas
Neste trabalho visamos organizar os pontos
tecnológicas com potencial para revolucionar a
relevantes recentes na biologia sintética e
biotecnologia como um todo. Ambas as areas, a
engenharia metabólica, com exemplos de
biologia sintética e a engenharia metabólica vem
aplicações destas tecnologias no mundo
sendo desenvolvidas e aplicadas para solução
acadêmico e no setor produtivo, discutindo
de diversos problemas, alguns exemplos
o presente, e a prospecção futura de estado
sendo: na redução dos custos de produção de
da arte destas tecnologias e as mudanças de
compostos químicos de maior valor agregado em
paradigma que podem trazer para a sociedade.
biorrefinarias, reduzindo o impacto ambiental e
Este trabalho também pode servir de inspiração
possibilitando a criação de sistemas renováveis
no desenvolvimento de novas combinações de
para obtenção destes variados compostos; na
As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade 2 Capítulo 1 1
biobricks e de novos sistemas baseados em engenharia metabólica e biologia sintética.
PALAVRAS-CHAVE: Biologia sintética, Engenharia metabólica, biobricks
ABSTRACT: Advances in molecular biology, bioinformatics, systems biology and the

study of genomics, proteomics, and metabolomics have led to the development of two
technological areas with the potential to revolutionize biotechnology as a whole. Both
areas, synthetic biology, and metabolic engineering have been developed and applied to
solve several problems, some examples being: reducing the production costs of higher
value-added chemical compounds in biorefineries, diminishing environmental impact
and enabling the creation of renewable systems to obtain these various compounds; in
the pharmaceutical industry, with the possibility of modifying poorly productive metabolic
pathways of compounds of interest in the development of drugs and the use of different
organisms to express new metabolic pathways; in medicine, in the development of
gene therapies and in the efforts to uphold against biological etiological agents such as
viruses and microorganisms; in the food industry to modify microorganisms to obtain
additives, flavorings and different micro and macronutrients; in the development of new
industrial solutions and other applications of chassis organisms involving detection
and signaling, purification and extraction and enzymatic modification of chemicals
and peptides of interest. Other applications of these technologies may influence
many daily issues and bring solutions in fields not yet explored. In this work we aim
to organize the relevant aspects of synthetic biology and metabolic engineering, with
examples of applications of these technologies by the academic community and the
productive sector, discussing the present, and future state-of-the-art exploration of
these technologies and paradigm shifts that they may bring to society. This work can
also be an inspiration for the development of new combinations of biobricks and new
systems based on metabolic engineering and synthetic biology.
KEYWORDS: Synthetic biology, metabolic engineering, biobricks
BIOLOGIA SINTÉTICA
A biologia sintética é um novo termo para uma ideia antiga. Em seu livro de
1912, The Mechanistic Conception of Life, o biólogo alemão-americano Jacques Loeb
propôs que os organismos vivos fossem considerados a partir de uma perspectiva
de engenharia - não apenas como entidades “projetadas” pela evolução, mas como
dispositivos passíveis de intervenção humana, manipulação e alteração (BALL, 2018).
Essa foi uma visão nascida em parte por pura ingenuidade. De onde vinha a
vitalidade da vida havia sido um profundo mistério para os cientistas, mas apenas
nas décadas seguintes à proposta de Loeb é que os biólogos começaram a perceber
que as origens surgiam da capacidade da matéria viva de se organizar em escalas
microscópicas. E essa organização se mostrou incrivelmente complicada (BALL,
2018).
As esperanças de total compreensão dos mecanismos de herança e controle

genéticos, para levar a compreensão das células e os organismos em termos de sua
maquinaria molecular, deram lugar a uma apreciação da complexidade desconcertante
dos sistemas vivos (BALL, 2018).
Entretanto, mesmo com os desafios ainda existentes, é possível intervir na
genética de maneiras que às vezes são previsíveis. Entende-se muito sobre como
os genes tendem a funcionar em redes, regulando a atividade uns dos outros para
direcionar o destino da célula. Essa análise dos genomas em termos de redes
funcionais envolvendo feedback, switching e amplificação é aquela que soa familiar
aos engenheiros. (BALL, 2018).
Dessa forma, a biologia sintética se caracteriza como um campo tecnológico
emergente que envolve a construção orientada por engenharia de entidades biológicas
cada vez mais complexas para novas aplicações. Os principais aspectos de uma
abordagem de engenharia são a orientação para propósitos específicos, a percepção
profunda dos princípios científicos subjacentes, uma hierarquia de abstração incluindo
interfaces adequadas entre e dentro dos níveis da hierarquia, padronização e
separação entre projeto e fabricação. A biologia sintética investiga as possibilidades
de implementar esses requisitos no processo de engenharia de sistemas biológicos
(HEINEMANN; PANKE, 2006).
O advento da biologia de sistemas, o constante desenvolvimento de tecnologias
fundamentais, como a síntese de novo de DNA (TIAN et al., 2004; HEINEMANN;
PANKE, 2006), experimentos importantes, como o redesenho computacional de
enzimas (DWYER, 2004; HEINEMANN; PANKE, 2006), a oportunidade de recombinar
amplamente sistemas utilizando tecnologias como CRISPR-Cas9 (MAO, 2018),
proteínas zinc-finger (DREIER et al., 2001; HEINEMANN; PANKE, 2006) e proteínas
TALENs (WOOD et al., 2011) para reprogramar a especificidade do local de ligação ao
DNA, e ainda a disponibilidade de sistemas regulatórios modelo bem definidos para
o design de dispositivos moleculares inspirados em engenharia, fornecem uma base
de conhecimento e tecnologia muito poderosa para a construção de novas entidades
biológicas.
Aplicações encorajadoras vêm de áreas tão diversas quanto o desenho de redes
de genes artificiais (SPRINZAK; ELOWITZ, 2005; HEINEMANN; PANKE, 2006), a
refatoração de pequenos genomas (CHAN; KOSURI; ENDY, 2005; HEINEMANN;
PANKE, 2006), a reprogramação de vias de sinalização (DUEBER, 2003; HEINEMANN;
PANKE, 2006) ou engenharia metabólica (MARTIN et al., 2003; HEINEMANN; PANKE,
2006). Em conjunto, estas abordagens têm sido referidas como “biologia sintética”.
ENGENHARIA METABÓLICA
A engenharia metabólica é um campo tecnológico em expansão que visa

modificar o sistema metabólico endógeno de um organismo para aproveitá-lo em uma

tarefa biotecnologicamente útil como, por exemplo, a produção de um composto de
interesse (ERB; JONES; BAR-EVEN, 2017).
Tem sido um dos objetivos finais da biologia chegar ao mesmo nível conceitual
e sintético alcançado na química, desde o princípio das pesquisas em “engenharia
metabólica” desenvolvidas no início dos anos 90. No entanto, as células ainda estão
longe de serem pequenas fábricas para obtenção de produtos químicos (WOOLSTON;
EDGAR; STEPHANOPOULOS, 2013), sendo que a engenharia metabólica continua
sendo limitada na sua capacidade sintética, dependendo primariamente da transposição
de vias metabólicas de um organismo para outro seguido por otimização desta via
(ERB; JONES; BAR-EVEN, 2017).
Nestes esforços, diferentes enzimas existentes, de diferentes organismos ou de
diferentes vias metabólicas conhecidas e que podem ser responsáveis por um passo
específico de uma nova via metabólica sintética são integradas para realizar uma
determinada tarefa metabólica com maior eficiência ou nova funcionalidade (ERB;
JONES; BAR-EVEN, 2017).
Considerando as modificações genéticas baseadas em biologia sintética e
engenharia metabólica, o aprofundamento do uso de técnicas e ferramentas de biologia
molecular é necessário, tanto para modificação no genoma de um microorganismo ou
alterações baseadas no uso de plasmídeos de expressão.
Ferramentas para biologia sintética e engenharia metabólica:
Alterações no genoma
A biologia molecular investiga técnicas de edição genética há décadas. Goldstein

(2017) traz as primeiras definições de “engenharia genética” como o conjunto de
técnicas de manipulação do DNA que surgem através da clonagem de um gene,
colocando-o em um outro contexto a fim de ser propagado. Contudo, hoje o termo
ganha novos horizontes, sendo utilizado para descrever toda e qualquer atividade que
envolva a manipulação de DNA, introdução de alterações em células somáticas de
animais e/ou plantas e alterações em células germinativas.
A engenharia genética ganhou volume no início da década de noventa. Foi
quando, através da recombinação homóloga, células tronco embrionárias de ratos
foram intencionalmente modificadas, sendo a primeira vez em que cientistas puderam
selecionar e silenciar genes de interesse (THOMAS e CAPECCHI, 1987) (CAPECCHI,
1989). A partir disso, foi possível expandir o uso do ratos para gerar modelos de estudo
de doenças humanas (expressando proteínas associadas à doenças através da
substituição de genes normais por genes mutados). Embora o sucesso da metodologia,
o desenvolvimento de abordagens alternativas, mais baratas e práticas, tornou-se
necessário para seguir promovendo avanços nesse campo de pesquisa.
Cronologicamente, o primeiro mecanismo a surgir em seguida e ser amplamente
utilizado foram as nucleases Zinc-Finger (Zinc Finger Proteins), seguido pelas
nucleases TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease) e, mais recentemente,
o complexo enzimático CRISPR-Cas9 e suas variantes (dCas9, Cas13 e Cas12a) vem
atraindo os olhares de pesquisadores mundo à fora (BATISTA e PACHECO, 2018).
As nucleases Zinc-Finger são abundantes domínios de ligação ao DNA em
eucariotos e consistem de aproximadamente 30 aminoácidos, estabilizada por íons
Zn2+. Estas nucleases são capazes de reconhecer trípletos de DNA (trechos de no
máximo três pares de base) e seu funcionamento depende da presença de um par
de nucleases, um para a região upstream e um para a região downstream do sítio de
clivagem, e de uma associação dos domínios à enzima de restrição FokI, que realiza
a clivagem de fato (BATISTA e PACHECO, 2018) (LISTIK e CARMO, 2016).
A técnica tornou possível a edição gênica em mamíferos que não eram
contemplados pelas técnicas previamente utilizadas. Como contrapontos da técnica
estão descritos: (i) o alto custo; (ii) a complexidade da técnica e (iii) os altos índices de
clivagem em regiões similares ao alvo (denominadas de off-targets) (FERNÁNDEZ et
al., 2017).
Mesmo assim, ainda se há um espaço considerável para as Zinc-Finger até
os dias de hoje, sendo muito utilizada para a detecção de DNA, conforme Batista e
Pacheco (2018) discutem. Jen e Wang (2016) mencionam o uso das proteínas Zinc-
Finger como potenciais marcadores de progressão de diferentes tipos de câncer em
humanos.
Em 2011, pesquisadores identificaram em Xanthomonas um interessante
mecanismo envolvendo domínios de ligação ao DNA (nesse caso, efetores pseudo-
ativador de transcrição (transcription activator-like effectors)) associadas a uma FokI
(CERMAK et al., 2011). Foi descoberto que as TALENs reconhecem sequências de
DNA através de um mecanismo de pareamento de bases envolvendo resíduos de
aminoácidos e pares de base específicos (e.g. asparagina-isoleucina reconhece
Adenina) (LISTIK e CARMO, 2016).
As TALENs demonstraram-se vantajosas em relação às Zinc-Finger devido ao
baixo índice de off-targets, característica dada pelas especificidades das cadeias de
aminoácidos das TALENs, que conseguem se ligar a até 20 bases nitrogenadas. Além
disso, enquanto as Zinc-Fingers possuem diversas restrições de montagem (JOUNG
e SANDER, 2013), não se conhece complicações na capacidade de interação com
sequências-alvo das TALENs nem com sua especificidade.
WareJoncas et al. (2018) afirmam que, até os dias atuais, as TALENs mantém-se
no topo das plataformas de DNA mais programáveis e com menos restrições ao seu
funcionamento. Segundo os autores, o número de publicações que utilizam TALENs
em suas metodologias ultrapassou substancialmente as publicações que utilizam Zinc-
Fingers após a descoberta e aplicação dessa técnica, embora o alto custo monetário
das TALENs impeça seu amplo uso em laboratórios de biologia molecular.
A descoberta de um complexo ribonucleoproteico – CRISPR-Cas9 – tornou a
edição gênica em uma tendência de pesquisa. CRISPR é a abreviação de Repetições
Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um sistema natural encontrado
nos mecanismos de imunidade em bactérias. As primeiras evidências do mecanismo
vieram através do trabalho de Ishino et al. (1987), observando regiões espaçadoras
e regiões de repetição no gene Iap de Escherichia coli. Não muito tempo depois, a
atividade da proteína Cas9 (integrada no complexo CRISPR) foi observada envolvendo
a degradação de plasmídios ou de fagos invasivos, identificando que as regiões
espaçadoras são, na verdade, cópias de DNA viral.
A formação do complexo CRISPR começa com a transcrição de DNA viral
(espaçadores) e com a transcrição das repetições que agem como domínios de
regulação gênica. Em seguida, o RNA resultante (crRNA), juntamente com um RNA
transativador (tracrRNA), liga-se à uma endonuclease Cas9, agindo como guia da
enzima até a sequência alvo. Após o pareamento, a endonuclease induz uma quebra
da dupla-fita de DNA para a clivagem da sequência alvo.
Os sistemas CRISPR-Cas9 podem ser classificados em duas classes principais,
de acordo com a performance das suas subunidades enzimáticas. A primeira classe
consiste de complexos de múltiplas subunidades efetoras de RNA (tipos I, III e
V), enquanto que a segunda classe consiste em efetores de RNA com uma única
subunidade (tipos II e V) (KHADEMPAR et al., 2018; BARRANGOU et al., 2007).
A compreensão desse mecanismo trouxe vantagens na dinâmica da edição gênica
por apresentar-se mais específica e dinâmica do que outros mecanismos prévios. A
capacidade de realizar a fusão do crRNA e do tracrRNA em um único RNA guia (gRNA)
simplificou o uso deste mecanismo, uma vez que, assim, a única necessidade para
criar um complexo de interação com o DNA é criar um gRNA de interesse que seja
capaz de atrelar-se à Cas9.
Com isso, o baixo custo da técnica aumentou a acessibilidade à tecnologia
pelos laboratórios de biologia molecular ao redor do mundo. WareJoncas et al. (2018)
evidencia que o CRISPR-Cas9 possui limitações evidentes, como ainda apresentar
clivagens em regiões off-target (similarmente às outras técnicas) e uma alta tolerância a
interações não totalmente pareadas. Com isso, surgem tentativas de unificar diferentes
técnicas, como CRISPR-Cas9 + Sistemas Zinc Finger, juntando os monômeros FokI
à proteínas Cas9 inativadas, tornando o complexo mais específico e, assim, evitando
off-targets.
Mais recentemente, variações da CRISPR, como a CRISPR-Cas12a (ou Cpf1) e
CRISPR-Cas13a (gerado com gRNAs), oferecem alernativas às limitações do sistema
dependente de Cas9 através das particularidades exclusivas de cada variante. Por
exemplo, o sistema Cas12a aparenta ser mais naturalmente específico do que o Cas9
(KIM et al., 2016), enquanto que a Cas13a apresenta motivos proteicos similares às
TALE, ligando-se cada uma a uma única base nitrogenada de RNA específica (dando
ainda mais especificidade ao complexo).
Com a eficácia e barateamento das técnicas de edição gênica, principalmente
com o uso dos complexos CRISPR, crescem as pesquisas buscando mecanismos
cada vez mais específicos de identificação e interação com uma sequência alvo.
As aplicações de diferentes técnicas de edição gênica (figura 1) podem ser
vistas ao longo das décadas de seus usos, como: descobertas de mecanismos de
desenvolvimento e funcionamento da vesícula biliar feitas com o uso de técnicas de
entrega de genes aleatórios (nontargeted gene delivery) (Warejoncas et al., 2018);
geração de modelos animais (como de camundongos (Marusugi et al., 2016), ratos
(CHEN et al., 2013) e porcos (He et al., 2015) utilizando zinc-finger, TALEN, CRISPR-
Cas9 e inativação de genes/edição de genes-alvo (e.g. a recriação da mutação W no
gene p.C147, associada a doença renal em ratos (JOHNSON et al., 2017).
Mais recentemente, um polêmico caso de pesquisa com embriões humanos virou
o centro das atenções. He Jiankui, da Universidade do Sul de Ciência e Tecnologia da
China, foi capaz de silenciar um gene envolvido na capacidade do vírus HIV (Vírus da
Imunodeficiência Humana) de infectar células utilizando CRISPR-Cas9. O controverso
trabalho levantou uma série de questões éticas, uma vez que há, ainda, a necessidade
de aprimorar as técnicas de edição gênica, a fim de evitar efeitos indesejados de
alterações no genoma que envolvem a clivagem parcial de sítios alvo, a clivagem
off-target e os efeitos das deleções e modificações genéticas a nível transcricional,
traducional, fisiológico e imunológico e a possibilidade da herdabilidade das alterações
genéticas realizadas - algo que ainda é um desafio evidente para pesquisadores
(REGALADO, 2018).
Os constantes avanços da pesquisa em edição gênica parecem, eventualmente,
levar à edição de genes em humanos (com o objetivo de resolver problemas ligados
à doenças atualmente sem cura ou tratamento), tornando evidente não apenas a
necessidade de aprimorar as técnicas utilizadas, mas de discutir as questões éticas
por trás dessa aplicação.

Figura 1: sistemas de modificação gênica utilizados para alterações a nível cromossomal ou
outras aplicações de edição gênica in vivo. Adaptado de Warejoncas et al. (2018). Sistemas
representados: (a) Zinc Finger; (b) TALENs e © CRISPR-Cas9.
Alterações no nível de expressão de genes
O silenciamento gênico, fenômeno em que ocorre o bloqueio do processo de

transcrição, ou degradação de RNA transcrito, também conhecido como RNA de
interferência (RNAi), é um mecanismo celular que pode ocorrer durante a transcrição
do RNAm (RNA mensageiro). As funções vitais de qualquer organismo dependem da
expressão de seus genes, isto é, a partir do DNA os genes são primeiro transcritos
para o RNA, e depois traduzidos em proteínas (LIPPMAN; MARTIENSSEN, 2004).
Quando ocorre o silenciamento gênico, o RNAi (fragmento de aproximadamente
vinte e um nucleotídeos complementares a sequência do RNA mensageiro) atua
em conjunto com complexos enzimáticos e leva a degradação do RNA alvo ou o

impedimento físico do processo de tradução. Desse modo considera-se que o gene
para dado transcrito foi “desligado” (LIPPMAN; MARTIENSSEN, 2004).
A ocorrência desse mecanismo foi identificada nos mais diversos organismos
eucarióticos, como insetos, fungos, nematóides e plantas. A interferência por RNA
ocorre naturalmente nesses organismos, funcionando como uma forma de regulação
da produção de proteínas e como mecanismo de defesa contra vírus entre outras
funções regulatórias (BRANTL, 2002).
Além da utilização de RNAi, outra alternativa que vem sendo estudada é o bloqueio
físico de regiões promotoras utilizando CRISPR-dCAS (a enzima CAS possuindo uma
mutação que inibe a sua atividade endonucleásica). Dessa forma, o processo de
transcrição é interrompido antes da elongação e formação do RNAm. CRISPR-dCAS
aparenta ser uma ferramenta mais versátil por poder ser aplicada tanto em eucariotos
quanto em procariotos (XU; QI, 2019).
Sistemas de silenciamento gênico podem ser aplicados na terapia gênica,
quando se busca evitar uma deleção completa de um gene específico ou apenas uma
modulação na sua expressão. RNAi também pode ser utilizado no desenvolvimento de
sistemas moleculares de combate a vírus de RNA e DNA em seres humanos, animais
e plantas. A modulação específica na expressão de alguns genes também pode ser de
interesse para preparar plantas de cultivo para situações de estresse biótico e abiótico
(BRANTL, 2002; LIPPMAN; MARTIENSSEN, 2004; CULLEN, 2005; XU; QI, 2019).
Plasmídeos e sistemas para expressão extracromossomal
Além dos métodos desenvolvidos para alteração genômica de eucariotos e

procariotos, sistemas de superexpressão e sistemas de switch genéticos (que envolvem
sistemas de sinalização e regulação de expressão de genes repórter ou ativação
de vias metabólicas) e outros sistemas de deleção de genes foram desenvolvidos
utilizando fragmentos circulares de DNA, conhecidos como plasmídeos ou vetores
(PURNICK; WEISS, 2009).
A utilização de plasmídeos e vetores de expressão gênica foram as primeiras
estratégias exploradas no desenvolvimento de organismos geneticamente modificados
e no desenvolvimento de engenharia metabólica visando a superexpressão de
proteínas de interesse (BERG; MERTZ, 2010).
Estes plasmídeos podem ser encontrados em bancos de dados como Adgene,
Snapgene, iGEM repository, e adquiridos em diferentes empresas, sendo que
no Brasil, pode-se adquirir sequências sintéticas inteiras clonadas em diferentes
vetores de escolha pelo valor de R$ 3,00 a R$ 2,00 por par de base dependendo das
especificações e do fornecedor.
Geralmente vetores e plasmídeos possuem três regiões distintas, essenciais para
seu funcionamento, sendo elas: um sítio de replicação, para promover a multiplicação
do plasmídeo no interior da célula chassis; um marcador expresso que atribui uma

característica específica a célula do organismo chassis, para posterior seleção de
transformantes; e um sítio de múltipla clonagem (MCS) que permite a inserção de um
fragmento de DNA específico. Como exemplo tem-se plasmídeos para clonagem e
expressão de genes em procariotos que contém uma região ori de replicação de DNA
plasmidial obtida de pBR322, uma região para expressão do gene para β-lactamase
ampR que atribui resistência a antibióticos como ampicilina e penicilina para seleção de
transformantes e um sítio de clonagem múltipla no interior de uma região codificadora,
expressa sobre um promotor e operador lac Figura 2 (NOVAGEN, 2018).
Figura 2: Exemplo de plasmídeo ou vetor para clonagem de sequências de DNA específico.

Imagem adaptada de vetor plasmidial pET-11a e desenvolvida utilizando software Snapgene
(GSL Biotech LLC. 2017).
No sítio de clonagem múltipla (MCS) pode-se inserir diferentes combinações

de partes e biobricks para desenvolvimento de novas funções metabólicas ou novos
peptídeos e moléculas de DNA e RNA com funções específicas (NOVAGEN, 2018).
Biobricks, são partes partes, como promotores, reguladores, sequências de
codificação entre outras que são descritas e utilizadas conforme o sistema de linguagem
aberta em biologia sintética (SBOL) para design de novas combinações e sistemas de
expressão. Biobricks funcionam como um repositório de partes de sequências de DNA
que podem ser utilizadas em diferentes combinações para novas funções (Turing ATE
my hamster LTD. 2018).
Peptídeos e suas aplicações
Plasmídeos e construções de biobricks são aplicados no design de novas

proteínas e enzimas que vão atribuir uma nova função ou alteração para obtenção
do próprio peptídeo purificado ou compostos gerados a partir de vias metabólicas
obtidas por engenharia metabólica, ou sistemas de sinalização para interpretação de
substâncias e proteínas em um meio específico (PURNICK; WEISS, 2009).

Considerando a expressão heteróloga de proteínas e sua reformulação,
diferentes domínios de enzimas e peptídeos inteiros podem ser ligados para formação
de proteínas de fusão. Aplicações de uma enzima de fusão em diferentes conceitos é
explorada na figura 3 (ELLEUCHE, 2014).
Figura. 3 Cascatas de reações acopladas em sistemas vivos como paradigmas para modelos
artificiais. A) Ação combinada de três diferentes enzimas em um compartimento específico,
como uma célula (natureza) ou em um reator de um único recipiente (sistema artificial)
catalisa a conversão de um substrato para formação de um dado produto. B) As enzimas
estão representadas na superfície celular, cell-surface display, (natureza) ou imobilizadas em
partículas (sistema artificial). C) Enzimas são orientadas por uma proteína de suporte scaffold,
como por exemplo em celulossomas (natureza) ou imobilizadas em uma superfície (sistema
artificial). D) Uma enzima modular composta por três regiões ou domínios catalíticos (natureza)
ou enzimas artificialmente fundidas (sistema artificial) catalisam três etapas de reação. Setas
ilustram uma reação hipotética catalisada por três enzimas para converter um substrato em um
produto. Adaptado de Elleuche (2014).
Além da fusão de enzimas e proteínas um processo de evolução e mutação

direcionada de genes para proteínas já conhecidas pode levar a formação de vias
metabólicas sintéticas mais rápidas e eficientes na utilização de substratos específicos,
no desenvolvimento de novas proteínas repórter e cromoproteínas e aprimoramento
de especificidade e capacidade de ligação de peptídeos, aptâmeros e fragmentos de

anticorpo voltados a identificação de epítopos específicos (ARNOLD, 2017).
Um exemplo complexo para aplicações destas técnicas são o desenvolvimento de
novas vias metabólicas para obtenção do composto 2,3-butanodiol a partir do substrato
glicerol em células chassis de Klebsiella aerogenes e Escherichia coli. Dentre as
modificações aplicadas estão a superexpressão de enzimas para acelerar o consumo
de glicerol e sua conversão em dihidroxiacetona para metabolismo em via metabólica
de formação de piruvato, a superexpressão de genes para enzimas envolvidas na
conversão de piruvato em 2,3-butanodiol, a deleção de genes para enzimas que levam
ao desvio do piruvato para formação de outros subprodutos como acetato, etanol
e lactato e a superexpressão de genes para auxiliar no reciclo de cofatores NAD e
NADH envolvidos nos passos metabólicos de conversão de glicerol em 2,3-butanodiol
e para manter o balanço redox interno das células chassis em homeostase. Também
é explorado o uso de proteínas de fusão para realizar as funções descritas acima, um
destes exemplos foi explorado pelo grupo de pesquisa do laboratório de biotecnologia
e microbiologia aplicada da Universidade de Caxias do Sul, em que foi realizada
a fusão das enzimas glicerol desidrogenase (para formação de dihidroxiacetona e
NADH) e acetoína redutase (responsável pela formação de 2,3-butanodiol e NAD),
esta estratégia visa trazer soluções para aumento no consumo de glicerol como
substrato, aumento da produção de 2,3-butanodiol e um mutuo reciclo e reutilização
de cofatores NAD e NADH, levando em consideração a aproximação física de ambas
as enzimas (YANG; ZHANG, 2018).
Exemplos de aplicações recentes de engenharia metabólica e biologia
sintética:
Nos Estados Unidos, uma iniciativa chamada iGEM (genetically engineered

machine) do MIT (Massachusetts Institute of Technology), realiza uma competição
anual entre acadêmicos de nível de graduação para fomentar o desenvolvimento
de novos designs e aplicações baseados em biologia sintética e a formação de
empreendedores em biotecnologia (PURNICK; WEISS, 2009).
Entretanto, o uso de técnicas e aplicações em biologia sintética e engenharia
metabólica não se restringem apenas a academia. Empresas e startups já vem
desenvolvendo soluções e produtos baseados nestas técnicas, exemplos de empresas
e startups que alcançaram investimento de 25 a 150 milhões de dólares em 2018
estão representadas na tabela 1 (SYNBIOBETA, 2018).

Ramo de atuação ou País de
Startup/Empresa O que faz
Indústria fundação
Desenvolvimento de terapias com
Indústria farmacêutica/
Autolus células T altamente direcionadas,
terapias para Reino Unido
Therapeutics controladas e altamente ativas.
tratamento do câncer
Engenharia de células T.
Desenvolve um hamburguer de proteína
vegetal contendo em seu ingrediente
Estados
Impossible foods Indústria alimentícia a levedura Pichia pastoris modificada
Unidos
expresando hemoglobina vegetal de
raízes de plantas de soja.
Método próprio e sistemas de
Indústria farmacêutica/ modificação genética invivo. Terapia
Precision Estados
AgroIndústria/ gênica e alteração de genes envolvidos
Biosciences Unidos
Biotecnologia com patologias e características
específicas em plantas e animais.
Utiliza a tecnologia CRISPR para
editar genes e alterar uma única base
Beam Estados
Indústria farmacêutica nitrogenada. Modificação de SNP’s
Therapeutics Unidos
(single nucleotide polymorphisms)
utilizando CRISPR.
DNA sintético para tradução invitro
Estados
Synthorxs Indústria farmacêutica de peptídeos para uso como
Unidos
medicamentos e tratamentos.
Edição genética utilizando TALEN
para produção de plantas com traços
que aumentem seu valor nutricional
AgroIndústria/ Indústria Estados
Calyxt e quantidade de nutrientes. Foco
alimentícia Unidos
na produção de alimentos para o
consumidor final e não somente na
produtividade.
Edição genética de células do
sistema imune para combater células
Inovio Estados
Indústria farmacêutica cancerosas e células infectadas com
Pharmaceutical Unidos
vírus. Produção de antígenos. in vivo
Antigen-targeted immunotherapies.
Síntese de DNA. Produção de genes Estados
Twist biosciences Biotecnologia
sintéticos. Unidos
Evolução direcionada de proteínas
e enzimas para aumento de
Estados
Codexis Biotecnologia especificidade e atividade catalítica
Unidos
entre outras atribuições. Protein
engineering
Poseida Modificações genéticas em células Estados
Indústria farmacêutica
Therapeutics CAR-T. Targeted immunotherapies. Unidos
Desenvolvimento de microorganismos
de microbioma, geneticamente
modificados, utilizando engenharia
metabólica para produção de
Biotecnologia/Indústria compostos para tratamentos específicos Estados
Synlogics
farmacêutica a partir de um sistema gênico de Unidos
circuitos para sinalizar ativação ou
inativação destas vias metabólicas
dependendo de sinais moleculares
presentes no intestino.
Tabela 1: Empresas e startups que utilizam o conceito de biologia sintética e que alcançaram
investimento de 25.000.000,00 US$ a 150.000.000,00 US$ em 2018 (SYNBIOBETA, 2018).

Os Estados Unidos lideram a inovação e formação de empresas em biologia
sintética, sendo que se destacam sua aplicação na indústria alimentícia, na agroindústria
e na medicina e indústria farmacêutica (SYNBIOBETA, 2018).
Outras aplicações que também vem sendo exploradas são o desenvolvimento de
microrganismos para produção de combustíveis e outros compostos com aplicação na
indústria química e de polímeros (SYNBIOBETA, 2018).
Acesso a capital para empreendedorismo em biologia sintética e biotecnologia
No Brasil, a iniciativa privada também tem voltado sua atenção para o

desenvolvimento de startups no setor de biotecnologia, sendo que aplicações
em biologia sintética são de áreas de interesse de agências financiadoras como
FINEP (Agência financiadora de inovação e pesquisa) e StartupBrasil do CNPq
(Conselho nacional de desenvolvimento cientifico e tecnologico). Outros incentivos
ao empreendedorismo em ciências da vida vêm de programas como BioStartupLab,
que busca auxiliar pesquisadores e cientistas empreendedores ou levar soluções
desenvolvidas na academia para o mercado. Outro espaço em expansão no incentivo a
stratups e empresas de biotecnologia são os pólos, parques e incubadoras tecnológicas
nas universidades e instituições de pesquisa brasileiras.
Além dos incentivos nacionais, outros programas internacionais buscam startups
de biologia sintética e biotecnologia para investimento em seed capital como os
programas Rebelbio do Reino Unido e Indiebio dos Estados Unidos, ambos oferecem
investimento inicial de 200.000,00 £ a 250.000,00 US$ mais experiência, mentoria e
aceleração de negócios em biotecnologia.
CONCLUSÕES
O desenvolvimento da biologia sintética e suas aplicações vem crescendo tanto

no âmbito acadêmico quanto no setor produtivo trazendo soluções para diversos
problemas. A aplicação dos conceitos de engenharia na biotecnologia e a construção
de sistemas baseados em switch gênicos podem simplificar e padronizar a construção
destes sistemas complexos, tornando sua aplicação e entendimento mais acessível
para acadêmicos, engenheiros e empreendedores em biotecnologia. Considerando
os exemplos abordados neste trabalho, fica claro a liderança dos Estados Unidos no
fomento a biologia sintética e a sua liderança em captação de capital para empresas
deste ramo. No Brasil, apesar dos esforços recentes, o ecossistema de desenvolvimento
em biologia sintética e engenharia metabólica permanece embrionário, apesar das
possibilidades e vantagens nacionais envolvendo a bioprospecção de organismos de
interesse, sendo o Brasil o país mais biodiverso do mundo. Os exemplos apresentados
neste trabalho também podem servir de inspiração para acadêmicos e pesquisadores
para o desenvolvimento de startups para atender o mercado nacional de biotecnologia.

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CAPÍTULO 2
A CONSTRUÇÃO DE MODELOS DIDÁTICOS

DA ESTRUTURA DO DNA COM MATERIAIS
ALTERNATIVOS: CRIANDO E APRENDENDO
Maria da Conceição dos Reis Leal motivação, autonomia e a criatividade, como

Colégio Cruzeiro - Unidade Centro também para o reconhecimento do potencial
Rio de Janeiro – Rido de Janeiro dos materiais alternativos, que antes seriam
João Gabriel Rangel Gonçalves descartados como lixo, na confecção de
Colégio Cruzeiro - Unidade Centro modelos pedagógicos.
Rio de Janeiro – Rido de Janeiro PALAVRAS-CHAVE: Ensino Médio; Motivação;
Criatividade; DNA; Modelo.
ABSTRACT: In recent decades, the teaching

RESUMO: O ensino de Biologia tem sido nas
of biology has been the object of study and
últimas décadas, objeto de estudo e preocupação
concern for researchers in education, due
para os pesquisadores em Educação, em
not only to the vast programmatic content but
função não só do vasto conteúdo programático,
also to the use of many technical and abstract
mas também da utilização de muitos termos
terms that discourage students. Studies
técnicos e abstratos, que desmotivam os
prove the construction of didactic models are
alunos. Estudos comprovam a construção de
important tools capable of promoting learning
modelos didáticos são importantes ferramentas
in a playful way, promoting socialization and
capazes de promover o aprendizado de forma
motivation through the act of learning. Thus,
lúdica, promovendo socialização e motivação
the objective of this work was to stimulate the
pelo ato de aprender. Assim, o objetivo deste
students of the Secondary School of Cruzeiro
trabalho foi estimular os alunos da 2ª série do
College - Unit Center, of the private education
Ensino Médio do Colégio Cruzeiro – Unidade
network of the city of Rio de Janeiro, to make
Centro, da rede privada de ensino do município
models of the molecule of the double helix of
do Rio de Janeiro, a confeccionarem modelos
the DNA, using alternative materials, in order
da molécula da dupla hélice do DNA, utilizando
to make them active subjects of the learning
materiais alternativos, de modo a torná-los
process. The results showed that the activity
sujeitos ativos do processo de aprendizagem.
contributed not only to the assimilation of
Os resultados demostraram que a atividade
content and to the development of important
contribuiu não só para a assimilação do
skills for the construction of knowledge, such
conteúdo e para o desenvolvimento de
as socialization, motivation, autonomy and
importantes habilidades para a construção
creativity, but also for the recognition of the
do conhecimento, como a socialização, a
potential of alternative materials, which would previously be discarded as garbage, in
the making of pedagogical models.
KEYWORDS: High School; Motivation; Criativity; DNA; Model.
1 | INTRODUÇÃO
É difícil conceber um ensino de Biologia meramente teórico, assim como a visão

tradicional do ensino, que coloca o aluno como agente passivo do processo ensino-
aprendizagem (expectador) e pauta no professor o papel de detentor do conhecimento
(transmissor). Esse modelo, que desconsidera o aluno como sujeito ativo, contribui
para desestimular a curiosidade e o interesse pela compreensão de conceitos e/ou
atividades que poderiam contribuir para o processo de construção de conhecimento
no espaço escolar.
O ensino tradicional, centralizado na memorização e desvinculado da realidade

do aluno, torna-se monótono e ineficiente necessitando ser superado por práticas
pedagógicas inovadoras. Assim, diante de uma série de estratégias didáticas,
amplamente divulgadas no âmbito escolar, os docentes devem se encorajar a
experimentá-las a fim de encontrar aquelas que proporcionem uma aprendizagem
mais atrativa, eficiente e significativa aos seus alunos. (Souto et al, 2016, p.1482)
Mas, apesar de sofrer constantes críticas, o modelo tradicional de ensino ainda

faz parte do cotidiano escolar (RIBEIRO & SANTOS, 2001). Além disso, a linguagem
presente nos livros didáticos é acadêmica, muitas vezes difícil e sem relação com a
realidade dos jovens.
Diante deste quadro, o professor, comprometido com a sua prática pedagógica,
procura criar um clima de expectativa e interesse nos alunos. Mas, apesar da
disponibilidade de tantas ferramentas inovadoras no campo da educação, como
por exemplo, os recursos da informática, o uso de multimídia, a interação com a
internet, etc., o professor ainda se depara com muitas dificuldades em sala de aula,
principalmente em relação à motivação dos alunos para a aprendizagem (FIALHO,
2008).
Neste contexto, a utilização de diferentes recursos didáticos corresponde a um
importante fator dentre as diversas estratégias metodológicas desenvolvidas para
facilitar e promover o processo da aprendizagem, atraindo o interesse dos alunos e
possibilitando atender às diferenças individuais (KRASILCHICK, 2004).
O presente trabalho relata uma experiência com alunos da 2ª série do Ensino
Médio, do Colégio Cruzeiro – Unidade Centro, na cidade do Rio de Janeiro, realizada
no primeiro trimestre de 2017, que procurou facilitar o ensino da estrutura da dupla
hélice da molécula do DNA, revisando os conteúdos que foram estudados ao longo
desse período e integrando a informação à dimensão temporal, na busca da atenção
dos alunos de forma espontânea, estabelecendo uma relação de relevância entre o
tema estudado e o indivíduo. É constatada aqui a importância da confecção do modelo
em foco no processo de ensino-aprendizagem, a partir de materiais alternativos
escolhidos pelos próprios alunos, constituindo um importante recurso didático motivador
que auxilie o aluno, enquanto sujeito ativo desse processo, a pensar, possibilitando o
desenvolvimento de sua imaginação e de sua capacidade de estabelecer analogias,
contribuindo para a sua aprendizagem.
A proposta educacional utilizada procurou estimular os alunos, além de trabalhar
com habilidades, geralmente não valorizadas nas aulas teóricas, como aquelas
propostas por Gardner (1983)1. O autor introduziu uma “teoria de inteligências
múltiplas”, em oposição aos testes de QI2, redimensionando a inteligência à luz das
origens biológicas da habilidade para resolver problemas, na medida em que pontua
que o cérebro é “o órgão do aprendizado”, com alta plasticidade e que sofre mudanças
constantemente. Desta forma, o indivíduo está sempre predisposto a aprender.
Para a Educação, a teoria proposta por Gardner implica na criação de um ambiente
educacional mais amplo, que não esteja limitado unicamente aos sistemas simbólicos
da lógica e da linguística, proporcionado aos indivíduos diferentes oportunidades de
desenvolvimento em todas as áreas do conhecimento.
2 | O USO DE MODELOS DIDÁTICOS – A MOLÉCULA DO DNA
O conhecimento científico é amplamente divulgado atualmente através da mídia.

Grande parte desse conhecimento permite que o ser humano seja capaz de alterar
o patrimônio genético de todos os seres vivos, incluindo o seu. Esse fato provoca na
sociedade tanto os sentimentos de euforia quanto de medo, visto que o ser humano
tem agora não só a possibilidade de produzir seres perfeitos, possibilitar uma maior
expectativa e qualidade de vida, como também de praticar uma seleção eugênica,
com as implicações éticas decorrentes (SCHEID et al, 2003). É evidente que essas
questões chegam ao espaço escolar, cabendo principalmente aos professores de
Biologia, a tarefa de promover as reflexões e discussões acerca das mesmas. Ao
mesmo tempo, os autores alertam que pesquisas demonstram que os alunos do
ensino médio apresentam muitas dificuldades na compreensão dos conceitos básicos
da Genética, como a relação gene/cromossomo e DNA/cromatina/cromossomo, por
exemplo.
Diante desta realidade, a utilização de recursos didáticos diferenciados são
instrumentos importantes, que podem auxiliar tanto na superação do paradigma
tradicional do ensino, proporcionando a participação ativa dos alunos no processo
de construção do conhecimento, quanto na compreensão dos conceitos trabalhados
em sala de aula. O modelo didático em particular, simula, segundo Justina e Ferla
1. Em sua teoria, Gardner propõe sete potencialidades ou inteligências, afirmando que por razões genéticas e am-
bientais, os indivíduos são muito diferentes entre si quanto aos seus perfis intelectuais. As inteligências propostas
pelo autor, que se somam às habilidades tradicionais são: corporo/sinestésica, visual/espacial, musical/rítmica,
interpessoal e intrapessoal.
2. O teste de QI valoriza habilidades tradicionais escolares, como as habilidades lógico/matemática e a linguística/
verbal.

(2005), uma estrutura/imagem de referência que possibilita a materialização de
uma ideia ou um conceito, que colocado frente à realidade, possibilita a assimilação
desses. Contribuindo para esta discussão, Krasilchik (2004), aponta que os modelos
demonstrativos auxiliam o aluno a refletir e assimilar o conteúdo com mais facilidade,
além de despertar um maior interesse do aluno para o processo ensino-aprendizagem.
Assim como a utilização de modelos tridimensionais foi de extrema importância
para a o processo de descoberta da estrutura do DNA, a apresentação da estrutura
sob a forma de modelo nos diferentes níveis de ensino é um recurso que facilita a
compreensão de vários fenômenos relacionados ao funcionamento dessa molécula.
Algumas características da molécula de DNA são facilmente representadas em

figuras e outras exigem esquemas mais elaborados e maior esforço de abstração.
Espera-se que a apresentação de modelos tridimensionais facilite não só a
compreensão da estrutura como também a posterior interpretação de figuras,
permitindo que o aluno reconheça com maior facilidade as situações relacionadas
ao funcionamento celular que envolvem complementariedade e antiparalelismo
da fitas do DNA, a existência dos sulcos e as possibilidades de mudanças nos
parâmetros relacionados com a torção da molécula. (Sepel e Loreto, 2007, p.3)
O modelo da dupla hélice da molécula do DNA proposto em 1953 por James

Watson e Francis Crick, contou com a contribuição de vários pesquisadores (WATSON
& BERRY, 2005; FERREIRA & ANDRADE, 2015). O modelo em questão representa a
molécula do DNA com conformação helicoidal, apresentando duas fitas de nucleotídeos
antiparalelas e complementares a partir de ligações de hidrogênio entre as bases
nitrogenadas (GRIFFITITHS et al., 2008).
Reconhecendo os benefícios didáticos da utilização de modelos da molécula do
DNA, Sepel e Loreto (2007, p.3) destacam que há no mercado excelentes materiais,
mas que geralmente são muito caros. Apesar de existirem propostas alternativas,
empregando materiais acessíveis para a construção da molécula de DNA, “esses
modelos envolvem tempo para a preparação e exigem do executor habilidades
especiais, o que também limita a aplicação”.
Neste contexto, para Souto et al (2016, p.1483), “a confecção de modelos a
partir de materiais mais simples, manipulados pelos próprios alunos, estimula o
desenvolvimento de importantes habilidades para a construção do conhecimento”.
Sendo uma atividade lúdica, o ato da construção dos modelos didáticos pelos alunos
apresenta duas faces que contribuem para o sucesso da atividade educativa – o
prazer e o esforço espontâneo. Tais características envolvem emocionalmente o
indivíduo de forma intensa, tornando a atividade motivadora e criativa, proporcionando
o fortalecimento das relações sociais, o desenvolvimento da capacidade de encontrar
soluções para os problemas e a autonomia dos alunos.

3 | OBJETIVOS
Objetivo geral
Revisar os conteúdos sobre Ácidos Nucleicos – a molécula de DNA, trabalhados no

primeiro trimestre, com o auxílio de modelos didáticos, estimulando o desenvolvimento
de importantes habilidades para a construção do conhecimento como a socialização,
motivação e a criatividade.
Objetivos específicos
Confeccionar modelos didáticos do modelo da dupla hélice da molécula de DNA,

adaptados como instrumento de apoio, constituindo elementos úteis no reforço de
conteúdos já estudados.
Incentivar a imaginação, a motivação, a criatividade, a construção de uma
conscientização ecológica, além de promover a integração social entre os alunos.
4 | METODOLOGIA
Como prática facilitadora do aprendizado, ao final do primeiro trimestre do ano

letivo de 2017, os alunos da 2ª série do Ensino Médio do Colégio Cruzeiro – Unidade
Centro, da rede privada de ensino do município do Rio de Janeiro, foram incentivados a
construir modelos didáticos da molécula do DNA a partir de uma determinada sequência
de RNA mensageiro (transcrito) utilizando, na medida do possível, materiais reciclados
e reutilizados. Esta atividade fez parte do quadro de avaliações do trimestre em foco.
No primeiro momento, as turmas foram divididas em grupos de 4 a 6 alunos, que
receberam como suporte para a atividade, uma sequência de RNA mensageiro e um
roteiro com as principais informações que deveriam ser abordadas junto ao modelo,
que serviram de referenciais para a avaliação da atividade, tais como:
Sequenciamento dos nucleotídeos de ambas as fitas do DNA;
Identificação das bases nitrogenadas;
Pareamento das bases nitrogenadas com indicação do número de ligações de
hidrogênio entre elas;
Identificação da fita ativa que originou a molécula de RNA mensageiro recebida;
Sequenciamento dos aminoácidos de um oligopeptídeo a partir da leitura dos
códons da molécula de RNA mensageiro recebido;
Identificação e relação de todos os materiais utilizados com os componentes da
molécula de DNA.
Foi solicitado também que os grupos procurassem utilizar materiais alternativos,
como embalagens vazias, pedaços de garrafa pet, tampas de garrafas, barbantes,
pedaços de fios, etc, com o intuito de estimular a criatividade e a construção de uma
conscientização ecológica. A bibliografia sugerida foi o próprio livro didático adotado. O
prazo estipulado para a confecção e a entrega do modelo foi de aproximadamente um
mês e a atividade foi desenvolvida de forma extraclasse, em períodos determinados
pelos próprios grupos.
As etapas do trabalho foram acompanhadas pelos professores regentes, que
promoveram a orientação das mesmas, sem tirar a autonomia dos alunos.
5 | ANÁLISE DOS RESULTADOS
Nas datas agendadas para a entrega dos modelos, os alunos apresentaram os

mesmos, o que proporcionou, além da discussão sobre as principais características da
molécula do DNA, a reflexão sobre alguns aspectos do seu funcionamento.
Os modelos confeccionados pelos alunos se mostraram extremamente didáticos,
criativos, utilizando materiais diversificados (Figs.1, 2, 3 e 4), sendo a atividade ainda
muito elogiada pelas turmas, que registraram ter assimilado melhor o conteúdo
e de forma divertida e até mesmo, compreendido melhor os processos de fluxo da
informação genética.
Figura 1: Modelo da molécula do DNA com legendas indicando os materiais utilizados e a

sequência dos aminoácidos a partir da leitura da sequência de nucleotídeos de um RNA
mensageiro.

Figura 2: Modelo da molécula do DNA
Figura 3: Legendas do modelo da molécula do DNA, indicando os materiais utilizados e a

mensageiro.

Figura 4: Modelo da molécula do DNA com legendas indicando os materiais utilizados e a
mensageiro.
Assim como relatado por Almeida (2003), também foi constatado que o rendimento
dos alunos superou as expectativas quando os mesmos trabalham de forma interativa,
participativa e contextualizada. Também Rotbain et al (2006) pontuaram que, as
atividades didáticas que utilizam modelos tridimensionais, na medida em que propiciam
um grande envolvimento dos alunos, contribuem de forma mais efetiva na melhora da
capacidade de adquirir e fixar informações, se comparado com os métodos tradicionais
de ensino.
Nesse contexto, a realização da dinâmica constituiu um recurso didático
extremamente útil ao processo da aprendizagem, servindo como um apoio para os
professores e como instrumento motivador para os alunos, uma vez que proporcionou
a fixação e revisão dos conteúdos e tornou o aluno um sujeito ativo do processo de
aprendizagem. Ressalta-se também a extrema preocupação dos grupos em utilizar
materiais reciclados e reutilizados, como por exemplo, a confecção de nucleotídeos
com massa de amido de milho e tintas extraídas de vegetais, visando o mínimo
consumo e produção de lixo.
Os alunos também reconheceram as limitações dos modelos construídos e se
demonstraram surpreendidos com o potencial na utilização de materiais alternativos.
Para Moreira (1999), a aprendizagem significativa é atingida quando se pode
inserir o conteúdo que foi estudado, de forma ativa, na realidade e isso, com certeza,
dependem da atitude do professor ao utilizar materiais que auxiliem nesse processo.
6 | CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na medida em que os alunos não são sujeitos passivos que apenas recebem
informações e sim indivíduos pensantes que necessitam de estímulos para construir
conhecimentos, há a necessidade dos professores buscarem, constantemente, novas
propostas pedagógicas e metodológicas que atuem nos componentes internos da
aprendizagem para auxiliar os alunos a se apropriarem dos conhecimentos.
Nesse sentido, a utilização de modelos didáticos, que trabalhem a visão
tridimensional é relevante, constituindo ferramentas instrucionais eficientes, auxiliando
os alunos no entendimento dos fenômenos que ocorrem a nível microscópico,
promovendo uma visão mais dinâmica desses fenômenos, facilitando o aprendizado
e aumentando a capacidade de retenção do que foi ensinado, o que nem sempre é
possível apenas com a utilização das ilustrações contidas nos livros didáticos.
Por meio da construção dos modelos didáticos, ainda são reveladas a autonomia,
a criatividade e a originalidade. Além da questão visual, os modelos didáticos, segundo
Aguiar (2003), permitem que os alunos manipulem os materiais, visualizando-os de
vários ângulos, aprimorando dessa forma, a compreensão dos conteúdos trabalhados.
Além disso, durante a construção dos modelos, os alunos ficam atentos com os
detalhes intrínsecos desses e procuram a melhor forma de representá-los, o que
contribui tanto para a revisão dos conteúdos, como também para o desenvolvimento
das suas habilidades artísticas.
A experiência relatada neste artigo reflete a importância dos professores estarem
num constante processo de repensar a elaboração de materiais didáticos utilizados
na sua prática pedagógica, no sentido de promover a aprendizagem construtivista e
significativa. Desta forma, estaremos contribuindo para a o sucesso da aprendizagem,
favorecendo a construção do conhecimento, permitindo o processo de socialização,
despertando um maior interesse nos alunos, além do desenvolvimento da criatividade,
ao mesmo tempo em que os conteúdos previstos para a série são trabalhados.
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CAPÍTULO 3
ALECRIM (ROSMARINUS OFFICINALIS L.):

EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES E
SUA IMPORTÂNCIA NO CONTROLE DA DOENÇA
MANCHA FOLIAR EM PLANTAS DE CEVADA
Fernando Luquis do sistema digestório, diuréticas, entre outras. O

Curso Farmácia, Diretoria da Saúde, UNINOVE, extrato foi avaliado frente a um modelo de planta
São Paulo de cevada por esta possuir uma fina camada de
Brenda Mery Santos de Godoy celulose que é sensível a compostos tóxicos.
Curso Biomedicina; Diretoria da Saúde, O objetivo do presente trabalho foi avaliar o
UNINOVE, São Paulo
efeito dos compostos extraídos do alecrim, em
Cristiane Santana Garcia plantas de cevada inoculadas com o patógeno
Curso Biomedicina; Diretoria da Saúde,
Bipolaris sorokiniana verificando se o extrato
UNINOVE, São Paulo
possui a capacidade de dar resistência à planta.
Victor Alves Franklin Foram avaliadas 3 concentrações do extrato
sendo 0,606; 0,303 e 0,202mg de proteína
UNINOVE, São Paulo
em plantas de cevada Elis. Os resultados
Luciana Leite Oliveira
indicaram que plantas de cevada apresentaram
UNINOVE, São Paulo de 65 a 80% de proteção contra a penetração
do fungo. Em relação às análises bioquímicas
Nilsa Sumie Yamashita Wadt
UNIP, Saúde, São Paulo foi possível observar que plantas submetidas a
tratamento e depois ao patógeno, apresentaram
Prof.UNINOVE, Depto. Saúde, São Paulo maior concentração de proteínas e menor
concentração de fenóis quando comparadas
Erna Elisabeth Bach
Prof.UNINOVE, Depto. Saúde, São Paulo com plantas infectadas. O extrato de alecrim foi
separado por cromatografia em gel e avaliado
email:ernabach@gmail.com
perante a folha de cevada destacada indicando
que a fração 2 foi a melhor, contendo polifenóis
sendo que o ácido clorogênico estava em
RESUMO: Vários fitocompostos têm sido maior concentração. Por conclusão, o extrato
extraídos de plantas, podendo ser utilizados de alecrim pode ser usado como indutor de
para vários fins, como, por exemplo, em resistência em plantas de cevada contra
medicamentos ou alimentos. O alecrim foi mancha foliar.
escolhido, pois possui várias utilidades como PALAVRAS-CHAVE: Alecrim, antimicrobiano,
condimento, além de possuir propriedades cevada, resistência.
cicatrizantes, antiespasmódicas, estimulantes

ABSTRACT: Many phytochemicals have been extracted from plants, being used for
a variety of ends, such as, for example, in medicines or feed. The rosemary plant was
chosen, due to its many uses as a condiment, besides possessing other described
properties, being: wound healing, antispasmodic, gastrointestinal tract stimulant,
diuretic, and others. The extract was evaluated against a barley plant model, due
to this possessing a thin cellulose layer that is sensible to toxic compounds. The
objective of the present work was to evaluate the effect of the compounds extracted
from rosemary, in barley plants inoculated with the pathogen Bipolaris sorokiniana,
evaluating whether the extract can lead to resistance against the pathogen or not.
Three different concentrations of the extract were evaluated, those being: 0,606;
0,303; 0,202mg of protein in Elis barley plants. The results indicated that the barley
plants presented fungus penetration protection ranging from 65 to 80%. Regarding
the biochemical analysis, it was possible to observe that plants submitted to treatment
and after inoculated by the pathogen presented an increased concentration of proteins
and lower phenol concentration when compared with infected plants. The rosemary
extract was separated by gel chromatography, and evaluated toward the barley leaf
highlighted, indicating that fraction 2 presented the best results, containing poliphenols,
with chlorogenic acid being in higher concentration. In conclusion, rosemary extract
can be used as a resistance inductor in barley plants against leaf spot disease.
KEYWORDS: Rosemary; antimicrobial; barley; resistance
1 | INTRODUÇÃO
Rosmarinus officinalis L. da família LAMIACEAE (Labiatae) conhecida

popularmente como alecrim, é uma espécie com interesse agronômico, alimentício
e fitoterápico. Existem outros nomes vulgares como alecrim-do-reino, alecrim-do-
sul ou alecrim-verdadeiro (BEGUM et al., 2013; RAJA, 2012). O alecrim é rico em
fitocompostos, além de ser utilizado em temperos na alimentação, pois ressalta o
sabor de alguns pratos.
Além das suas propriedades nutricionais, aromatizantes e protetoras contra a
degradação microbiana e oxidativa dos alimentos, possui efeitos benéficos para a
saúde como: antidismenorreico, antiespasmódico, antinociceptivo, antiulcerogênico,
diurético, devido aos seus diversos compostos fitoquímicos. (SASAKI et. al., 2013).
A atividade antioxidante de alecrim está relacionada a componentes como
diterpenos fenólicos, carnosol e a sua capacidade antioxidante é devido principalmente
aos compostos fenólicos que ocorre devido à capacidade de eliminar os radicais livres,
doar hidrogênio, átomos e cátions de metal quelato (TERUEL et. al., 2015).
Seus principais compostos, os diterpenos - ácido carnósico (CA) e carnosol
(CAR) e o ácido rosmarínico derivado do cafeoil, exerce vários efeitos benéficos na
saúde, incluindo a capacidade antioxidante potente, hepaprotetor, antimicrobiano,
anti-inflamatório, efeitos anticancerígenos e antidiabéticos (PÉREZ-SÁNCHEZ et. al.,
2017).

Existem várias maneiras de proceder à extração dos metabólitos secundários com
óleo, água ou álcool. O conhecimento das estruturas químicas dos produtos naturais,
bem como de suas funções nas interações das plantas com os organismos vizinhos,
possibilita uma melhor compreensão dos mecanismos bioquímicos dessas interações,
tornando possível o desenvolvimento de novos agentes bioativos (BARNES et al.,
2007).
No caso da mancha foliar causada pelo fungo Bipolaris sorokiniana, o controle é,
normalmente, realizado por uso de fungicidas sendo que esta doença causa prejuízos
aos produtores. Outro problema é o risco para o meio ambiente e para a saúde do
homem. Visando eliminar estes inconvenientes, um dos métodos preconizados tem
sido a utilização de indutores de resistência oriundos de produtos naturais.
A indução de resistência tem sido observada em várias plantas em resposta ao
tratamento prévio do hospedeiro com agentes bióticos ou abióticos, denominados
elicitores ou indutores de resistência (KUC, 1987; 2000; 2001; MANANDHAR et al.,
1999). As plantas ativam um conjunto de respostas após o reconhecimento de um
patógeno ou da aplicação exógena de indutor, assim, capacitando-as a responderem
mais rapidamente à infecção promovendo uma resposta de resistência. A indução de
resistência tem sido observada e sugerida como controle alternativo para diferentes
doenças e interações como: trigo - Bipolaris sorokiniana e Drechslera teres (BACH,
1997; BACH et al, 2003); cevada - Bipolaris sorokiniana (CASTRO e BACH, 2004);
café - Hemileia vastatrix (GUZZO et. al., 1993) e arroz - Pyricularia oryzae e Bipolaris
sorokiniana (MANANDHAR et al, 1999).
Assim, o objetivo do presente trabalho foi preparar o extrato do alecrim, avaliar os
compostos fitoquímicos, verificar a presença de antioxidantes e o efeito como indutor
de resistência em plantas de cevada inoculadas com o patógeno Bipolaris sorokiniana
(mancha foliar).
2 | MATERIAL E MÉTODOS
As partes aéreas do Alecrim foram colhidas em Ibiúna, sendo transportadas

para o laboratório da UNINOVE em geladeira de isopor. Para a obtenção do extrato
de folhas de Alecrim, a fresco, 20g de folhas foram trituradas em 100mL de água
destilada gelada. O extrato foi mantido em geladeira por uma hora e filtrado em gaze
sendo armazenado em frasco de vidro e mantido a -4ºC até a utilização (SILVA &
BACH, 2005).
O extrato foi submetido à quantificação de proteínas através do método de Lowry,
em equivalentes de SAB (Soro Albumina Bovina) (LOWRY, 1951) e, quantificação de
fenóis baseado no método de SWAIN & HILLIS (1959), em equivalentes de ácido
clorogênico.
Como antioxidante foi usado o método de ABTS (RUFINO et al, 2007) com a

reação envolvendo 7mM ABTS (5mL e 2,45mM (88mL) de persulfato de potássio,
após incubação à temperatura ambiente e escuro por 16h. Após o período, foi diluído
em 80% de etanol até dar uma absorbância de 0,700 ± 0.005 a 734 nm. A medida de
2,7mL da solução de ABTS foi misturada devagar com 0,3mL das amostras. Após
30min a 30ºC, foi realizada a leitura no espectrofotômetro na absorbância de 734nm.
O padrão foi Trolox.
2.1 Preparação de plantas de cevada e tratamentos
As sementes de cevada de cultivo Elis foram fornecidas pela Fundação Agrária

de Guarapuava, Paraná, sendo semeadas em vasos, mantidas em casa-de-vegetação
à temperatura ambiente, até o estágio 5 da escala de Feekes-Large (LARGE, 1954).
Na composição do substrato foi utilizada uma parte de solo vermelho, oriundo do
Paraná e uma parte de terra vegetal adubada com NPK (na formulação Nitrogênio10,
Fósforo-10, Potássio-10) e micronutrientes da marca Ouro Verde (de acordo com a
especificação do produtor).
Grupos de dez plantas de cevada foram usados nos testes biológicos para cada
tratamento, em 3 repetições. Em todos os tratamentos foram aspergidos cerca de
10 mL da suspensão de conídios ou, solução do extrato (indutor) ou ainda, água. O
extrato aquoso de folhas de alecrim foi avaliado como indutor em 3 concentrações de
proteína sendo 0,606; 0,303 e 0,202mg de proteína.
Os tratamentos foram: a) sadia (plantas aspergidas com água); b) tratadas
com indutor (plantas aspergidas com extrato aquoso); c) inoculadas com o patógeno
(plantas aspergidas com suspensão de conídios); d) tratadas com indutor e após 24
horas, inoculadas com suspensão de conídios; e) idem ao grupo d, inoculadas após
48 h; f) idem ao grupo d, inoculadas após 72 horas. As plantas dos grupos d, e, f,
foram inicialmente aspergidas com indutor, após 24, 48 e, 72 h, sob condições de
temperatura ambiente e fotoperíodo de 12 horas (luz fluorescente 7,35 W m-2). As
folhas foram inoculadas, por aspersão, com as suspensões de conídios do isolado.
Durante as primeiras 24h após a inoculação do patógeno, as plantas foram mantidas
em câmara úmida (100% UR), temperatura ambiente e escuro. Em seguida, o material
foi transferido para casa-de-vegetação e mantido sob condições de temperatura e
luminosidade ambiente. A proteção das plantas foi avaliada 4 dias após a inoculação
do patógeno de acordo com BACH (1997).
Das plantas induzidas à proteção, foi realizado um extrato envolvendo 5g de
folha em 10mL de tampão fosfato de sódio pH=7 0,05mol/L. Os extratos foram também
submetidos a testes de quantificação de proteínas e fenóis.
2.2 Purificação do extrato de alecrim e avaliação em folhas de cevada destacadas.
O extrato de alecrim foi submetido a cromatografia em gel filtração (Sephadex

G-50), com tampão fosfato pH=7 0,05mol/L, coletando 2mL por tubo e preparando

pool de 4 frações. Todas as frações foram passadas no HPLC.
Folhas de cevada foram colocadas em 6 placas de Petri, com umidade mantida
por algodão, e pinceladas as referidas frações sendo 1) fração 0: volume externo
da coluna; 2) fração 1: volume interno da coluna correspondente a 6mL; 3) fração
2: volume interno da coluna correspondente a 10mL; 4) fração 3: volume interno da
coluna correspondente a 14mL; 5) tampão fosfato como controle; 6) tampão fosfato
para controle-fungo. Após 72h foi pincelado o conídio do fungo em todas as placas
com exceção da placa 5, correspondente à planta sadia. Após 5 dias foram observadas
o aparecimento de lesões e observada a proteção. A fração que indicou proteção foi
avaliada por HPLC.
Compostos fenólicos foram separados no equipamento HPLC (Young Lin YL
9300) equipado com bomba quaternária, detector UV-vis e forno de coluna (YL9330).
A coluna usada foi a Kinetex C18 (4.6mm×250mm i.d., 5um) e o comprimento de onda
foi 254nm. Eluição foi realizada a 1,0mL/min a 35ºC. A fase A consiste em metanol e
fase B foi 0,1% de ácido acético em água. O volume injetado foi de 20uL. Os compostos
usados como padrão foram adquiridos da Sigma (ácidos cumárico, ferúlico, cafeico,
rutina, quercetina, canferol) e dissolvidos em solvente grau HPLC (metanol). Para
identificação foi usado o tempo de retenção e áreas dos picos correlacionados com
concentração pelo software Clarity.
2.3 Estatística
Todos os experimentos foram realizados em duplicatas e a média analisada pelo

método de Student`s ou Origin (Anova).
3 | RESULTADOS
O extrato aquoso de folhas de alecrim apresentou 6,07mg de proteína e 2,52mg

de fenol com atividade antioxidante de 950μmol TEAC*/g. A partir do extrato bruto
foram feitas as diluições.
Os resultados da indução de proteção podem ser observados na Tabela 1. O
extrato na concentração de 0,202mg apresentou variação de 55 até 70% nos intervalos
de tempo variando de 24 até 72h, mas, quando o extrato apresentou 0,606mg e 0,303mg
a proteção foi semelhante, variando de 65 ou 68% até 80%, nos mesmos intervalos de
tempo entre indutor e patógeno. Como as proteções foram semelhantes, as plantas
oriundas do tratamento de 0,303mg de proteína foram submetidas à quantificação
de proteína, fenol e análise por cromatografia de camada delgada. Estes resultados
vieram ao encontro com os encontrados por GUZZO et al. (1993); BACH et al. (2003;
2012; 2014; 2015); CASTRO e BACH (2004).

Tratamentos Extrato mg proteína
0,607 0,303 0,202
Alecrim água c x X x
Alecrim água 24h 68* a,c 65 a,d 55 a,e
Alecrim água 48h 78 a,f 78 a,g 60 a,h
Alecrim água 72h 80 a,i 80 a,i 70 a,j
Infectada 0b 0b 0b
Tabela 1: Porcentagem de proteção em folhas de cevada submetidas ao tratamento com indutor

(extrato de alecrim em diferentes concentrações) nos diferentes intervalos de tempo entre
indutor e patógeno.
*Porcentagem de proteção. Primeira letra seguida por a, são significativamente diferentes do controle (plantas
infectadas letra b) pelo teste T (P<0,05). Segunda letra diferente, indica diferença significativa nas linhas no
mesmo tratamento. Os números representam média de um total de 50 folhas/tratamento.
**Quantidade de proteínas e fenóis seguidas por letra b, são significativamente diferentes do controle (plantas
infectadas) pelo teste T (P<0,05).
Quando folhas de cevada, oriundas do tratamento com extrato de alecrim na

concentração de 0,303mg de proteína, foi submetida a extração, foi possível determinar
a concentração de proteína e fenol (Tabela 2). Observando primeiramente plantas
sadias e infectadas, tem-se que plantas sadias apresentaram maior quantidade de
proteína e, menor de fenol, sendo ao contrário em plantas infectadas quando estas
apresentam baixa quantidade de proteína e maior quantidade de fenol, podendo ser
devido pelo ataque do patógeno na planta com reação necrotrófica (Tabela 2). Já nas
plantas tratadas, observou-se aumento de proteína conforme o aumento no intervalo
de tempo. Os resultados estão de acordo com BACH et al. (2003, 2014, 2015) e
CASTRO & BACH (2004).
Tratamentos mg proteína mg fenol

Alecrim água c 0,505 0,421
Alecrim água 24h 0,403 0,567
Sadia 0,773 0,490

Infectada 0,255 0,811
Tabela 2: Concentração de proteínas e fenóis presentes nos extratos de folhas de cevada

submetidas ao tratamento com extrato de alecrim na concentração de 0.302mg de proteína.
As folhas de cevada destacadas e pré-tratadas com as frações coletadas da

coluna de Sephadex G-50, e depois pinceladas com o fungo, apresentaram lesões
nas placas 1,2,4, quando comparadas com sadia e folha infectada-controle. Assim, a
única fração da placa 3, foi a que apresentou proteção. Esta fração foi avaliada no
HPLC apresentando os seguintes compostos fenólicos: ácido clorogênico, ferúlico,
quercetina e canferol (Tabela3).

Rt Concentração Composto
2,260 1,500 ug ác. Clorogênico
2,650 0,570 ug ác. Ferúlico
3,280 0,570 ug Quercetina
3,760 8,00mV Composto não identificado
4,710 0,310 ug Canferol
Tabela 3: Resultado obtido no HPLC comparado com padrões fenólicos com respectivo tempo
de retenção (Rt) e concentração.
Os resultados obtidos no trabalho apresentam concordância com ANDRADE et

al (2018) e AL-SEREITI et al (1999) mostrando que polifenóis são compostos químicos
antioxidantes e classificados como ácidos fenólicos, flavonóides e não flavonóides.
As propriedades antioxidantes podem ser responsáveis pela defesa de plantas contra
patógenos e predadores, podendo controlar, também, infeções em humanos. Existem
vários polifenóis no alecrim, sendo o ácido clorogênico o mais abundante, e um dos
responsáveis pela indução de resistência na folha de cevada.
4 | CONCLUSÃO
Concluiu-se que o extrato de alecrim promoveu a indução de resistência em

plantas de cevada no controle do fungo causador da mancha foliar, tendo o ácido
clorogênico como um dos compostos responsáveis pela indução de resistência em
plantas.
AGRADECIMENTO
Ao CNPq pelo auxilio na aquisição do HPLC e reagentes (Processo número:

474681/2013).

REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 4
ALELOPATIA DE EXTRATOS AQUOSOS DE Eragrostis

lugens Nees. NA GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO
INICIAL DE Oryza sativa L
Daniela Sponchiado RESUMO: Uma das estratégias utilizadas

Universidade Federal de Santa Maria – UFSM pelas plantas invasoras para competir e
- Mestranda no Curso de Pós-Graduação em dominar comunidades vegetais é a liberação
Agrobiologia
de aleloquímicos - fenômeno este chamado
Santa Maria/ RS.
de alelopatia. A cultura do arroz (Oryza sativa)
Jéssica Cezar Cassol no Rio Grande do Sul sofre a interferência
Universidade Federal de Santa Maria – UFSM
de diversos fatores durante o ciclo biológico,
- Mestranda no Curso de Pós-Graduação em
com impacto na produtividade. Um desses
Agrobiologia
fatores é a competição com plantas invasoras
Santa Maria/ RS.
ou daninhas, entre elas a espécie Eragrostis
Douglas de Lima Righi
lugens (eragrostis, pasto-ilusão ou pasto-
Universidade Federal de Santa Maria – UFSM –
mosquito). Extratos aquosos de folhas desta
Aluno do Curso de Graduação em Agronomia/
Bolsista de Iniciação Científica. espécie foram preparados nas concentrações
Santa Maria/ RS 4,0, 8,0 e 16,0 % (p/v) com o objetivo de avaliar
o potencial alelopático na germinação das
Lucas Menezes Jorge
Universidade Federal de Santa Maria – UFSM –
sementes e crescimento inicial das plântulas de
Aluno do Curso de Graduação em Agronomia/ arroz. Os bioensaios foram montados em placas
Bolsista de Iniciação Científica. de petri e mantidos em câmara de crescimento.
Santa Maria/ RS O número de sementes germinadas foi aferido
Eduarda Mena Barreto a cada 24 h por sete dias, sendo então obtidas
Universidade Federal de Santa Maria – UFSM – a percentagem de germinação (%G) e o
Aluna do Curso de Graduação em Agronomia/ índice de velocidade de germinação (IVG). O
Bolsista de Iniciação Científica. comprimento da radícula e da parte aérea foram
Santa Maria/ RS mensurados aos sete dias de experimento.
Juçara Terezinha Paranhos Os extratos de folhas de Eragrostis lugens
Universidade Federal de Santa Maria – UFSM apresentam efeito alelopático reduzindo e/ou
– Professora Doutora do Centro de Ciências inibindo a percentagem e o índice de velocidade
Naturais e Exatas/ Orientadora no Programa de de germinação das sementes de arroz, bem
Pós-Graduação em Agrobiologia.
como o desenvolvimento inicial das plântulas,
Santa Maria/ RS
em uma relação concentração dependente,
sendo a radícula mais sensível à ação dos

aleloquímicos quando comparada à parte aérea.
PALAVRAS-CHAVE: alelopatia; arroz; pasto mosquito; planta daninha; germinação;
crescimento inicial.
ABSTRACT: One of the strategies used by invasive plants to compete and dominate
plant communities is the release of allelochemicals - a phenomenon called allelopathy.
The rice crop (Oryza sativa) in Rio Grande do Sul suffers the interference of several
factors during the biological cycle, with an impact on productivity. One of these factors
is competition with invasive or weedy plants, among them the species Eragrostis
lugens (eragrostis, pasto-delusion or grass-mosquito). Aqueous extracts of leaves of
this species were prepared at concentrations of 4.0, 8.0 and 16.0% (w / v) with the
objective of evaluating the allelopathic potential in seed germination and initial growth
of rice seedlings. The bioassays were mounted on petri dishes and kept in a growth
chamber. The number of germinated seeds was measured every 24 hours for seven
days, and the germination percentage (% G) and the germination rate index (IVG) were
obtained. The radicle and shoot length were measured at seven days of experiment.
Leaf extracts of Eragrostis lugens present an allelopathic effect reducing and / or
inhibiting the percentage and rate of germination speed of rice seeds, as well as the
initial development of the seedlings, in a concentration-dependent ratio, the radicle
being more sensitive to the action of allelochemicals when compared to aerial part.
KEYWORDS: allelopathy; rice; mosquito grass; weed; germination; growth.
1 | INTRODUÇÃO
Uma das estratégias utilizadas pelas plantas invasoras para competir e dominar
comunidades vegetais é a liberação de aleloquímicos - fenômeno este chamado de
alelopatia (LARCHER, 2000). A alelopatia pode ser definida como um processo através
do qual, produtos provenientes do metabolismo secundário vegetal são liberados no
ambiente, podendo impedir ou promover a germinação e/ou o crescimento de plantas
que se encontrem relativamente próximas a elas (SOARES, 2000; FERNANDEZ et
al., 2006).
A cultura do arroz, assim como outras culturas comerciais, sofre a interferência
de diversos fatores durante o ciclo biológico, com impacto na produtividade (FLECK,
2000). Um desses fatores é a competição com plantas daninhas poáceas (gramíneas),
principalmente por luz e nutrientes (DORNELLES, 2009).
Nos últimos anos, espécies gramíneas (Família Poaceae) perenes e anuais,
que ocorrem comumente em áreas no entorno das lavouras, têm sido encontradas
nos quadros onde se cultiva o arroz no Rio Grande do Sul. Entre elas, destacam-se
Panicum dichotomiflorum, e espécies do gênero Eragrostis (CANTO-DOROW, 2011).
Uma das espécies, dentro deste gênero, que é invasiva das lavouras arrozeiras é
Eragrostis lugens, conhecida popularmente como eragrostis, pasto-ilusão ou pasto-

mosquito.
E. lugens é uma planta perene que se desenvolve tanto em áreas de coxilha,
quanto em áreas de várzea, e reproduz-se por sementes. Pertence à família Poaceae,
sendo muito próxima morfologicamente do capim-annoni (E. plana), que desde a
década de 90 é considerada como a invasora mais agressiva e de mais difícil controle
na cultura do arroz no Rio Grande do Sul (COSTA et al., 2013).
Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo realizar a avaliação da
alelopatia de extratos aquosos de Eragrostis lugens na germinação e crescimento
inicial de Oryza sativa, visando entender os mecanismos e as mudanças fisiológicas
causadas pelos mesmos nas plantas afetadas.
2 | METODOLOGIA
2.1 Material vegetal
Foram utilizadas folhas de Eragrostis lugens, coletadas em lavouras de arroz

irrigado na região de Santa Maria -RS, lavadas e secas em estufa a 40 ºC por sete
dias e posteriormente trituradas em moinho para a preparação dos extratos vegetais.
Os diásporos (fruto cariopse concrescido com a semente e protegido pelas brácteas
lemas) foram usados para os testes de germinação das sementes e crescimento inicial
das plântulas de arroz (Oryza sativa).
2.2 Obtenção dos extratos
Os extratos aquosos (água destilada) foram preparados nas concentrações

4,0, 8,0 e 16,0 % (p/v) de folhas de E. lugens (secas e previamente trituradas).
Posteriormente foram deixados por 24 h no escuro e em temperatura controlada (25
º C). Após, foram filtrados em algodão, sendo o pH ajustado para ±5,8 e o potencial
osmótico mensurado através do método de Chardakov (1953). O tratamento controle
constou de água destilada, com pH ajustado para mesmo valor.
2.3 Germinação das sementes e crescimento inicial
Em câmara de fluxo laminar, os diásporos de arroz foram desinfestados em etanol

70% por um minuto, seguido de solução de hipoclorito de sódio 0,2% por 15 minutos
e três lavagens em água destilada. Após, foram inoculados em placas de petri (150
mm de diâmetro), contendo duas camadas de papel germitest e pré-embebidas com
20 mL das diferentes concentrações dos extratos e vedadas com plástico parafilm. As
culturas foram mantidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16 horas e
temperatura de 25ºC.
As três concentrações de extrato de E. lugens mais o controle constituíram os
tratamentos, com cinco repetições, e cada repetição constou de duas placas contendo

20 diásporos cada.
O número de sementes germinadas foi aferido a cada 24 h durante o período de
sete dias. Foram considerados germinados os inóculos que apresentaram no mínimo
1,0 mm de radícula, sendo então obtida a percentagem de germinação (%G), conforme
Labouriau & Valadares (1976) e o índice de velocidade de germinação (IVG), conforme
Maguire (1962).
Os dados do crescimento inicial das plântulas foram coletados ao final dos sete
dias de experimento, sendo que o comprimento, em centímetros da radícula e da parte
aérea foi mensurado com o auxílio de uma régua.
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado. Os dados obtidos
foram submetidos à análise de variância e a comparação entre as médias foi efetuada
através do teste de Tukey (p£0,05), utilizando-se o programa estatístico SISVAR.
3 | RESULTADOS E DISCUSSÃO
A caracterização físico-química dos extratos aquosos revelou variação de

potencial osmótico na faixa entre 0.03 e 0.01 MPa. De acordo com Ferreira e Aquila
(2000), nos estudos de alelopatia, o potencial osmótico é um aspecto pouco considerado
e que pode mascarar o fenômeno alelopático. Os efeitos do potencial osmótico podem
ser notados no comportamento germinativo pelo atraso na velocidade de germinação,
mas os efeitos osmóticos também são observados sobre o crescimento da planta.
Os valores de potencial osmótico encontrados nos extratos utilizados no
presente trabalho consideram-se adequados para a germinação e crescimento
inicial das plântulas. Assim, discrimina-se a influência do pH (ajustado a ±5,8) e do
potencial osmótico nos resultados alcançados. A concentração osmótica dos extratos
é fundamental, pois pode haver neles substâncias como açúcares, aminoácidos
e ácidos orgânicos que influem no pH e são osmoticamente ativos (FERREIRA &
AQUILA, 2000).
Comparando as diferentes concentrações dos extratos, registrou-se interferência
na germinação de sementes para os parâmetros porcentagem de germinação e
índice de velocidade de germinação. O processo germinativo das sementes de arroz
foi influenciado negativamente pelos extratos de E. lugens quando comparados ao
tratamento controle.
O percentual de germinação das sementes de arroz foi afetado em uma relação
concentração dependente, ou seja, quanto maior a concentração do extrato, maior o
efeito observado. Este fato é bem evidente na concentração mais elevada (16,0 %),
em que foram registrados os menores valores de germinação (FIGURA 1). Fiorenza
et al. (2016), testando o potencial alelopático de uma espécie do mesmo gênero,
Eragrostis plana observaram que os extratos aquosos desta planta apresentaram
efeito alelopático sobre a germinação de espécies forrageiras, sendo este efeito maior
evidenciado nas concentrações mais elevadas.

FIGURA 1- Percentagem de germinação de sementes de arroz sob efeito de extratos aquosos
de Eragrostis lugens. Letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05).
Os valores do IVG apresentaram uma relação de proporcionalidade com os

da porcentagem de germinação, havendo alteração nos mesmos sob o efeito dos
extratos aquosos de E. lugens. Observam-se diferenças significativas entre todos os
tratamentos, tanto quando comparados ao controle, quanto entre si. A redução do
Índice de velocidade da germinação é proporcional ao aumento da concentração do
extrato (FIGURA 2). Tais resultados corroboram com os observados por Ferreira, et
al. (2008), nos quais o índice de velocidade de germinação de gramíneas tropicais e
alface foi alterado pelas diferentes concentrações de extratos aquosos de E. plana.
De acordo com Ferreira & Borghetti (2004), quanto maior o IVG, maior é o vigor das
sementes. No presente trabalho, os extratos atuaram diminuindo o vigor das sementes,
evidenciando o efeito alelopático de folhas de E. lugens sobre a germinação do arroz
em todas as concentrações testadas.
FIGURA 2 – Índice de velocidade de germinação de sementes de arroz sob efeito de extratos

aquosos de Eragrostis lugens. Letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p£0,05).
Nos estudos alelopáticos, a germinabilidade (índice final de sementes germinadas

ou percentagem de germinação) é um índice muito usado, embora não demonstre
outros aspectos do processo de germinação, como atrasos, já que envolve apenas
resultados finais, ignorando períodos de germinação inativa no decorrer do bioensaio.
Em decorrência disso, muitas vezes o efeito alelopático não é observado sobre a
germinabilidade, mas sim, sobre a velocidade de germinação (CHIAPUSIO et al. 1997,
MAULI et al. 2009; FERREIRA E AQUILA, 2000). Tais efeitos podem ser observados no
presente trabalho onde o índice de velocidade de germinação apresentou resultados
mais significativos quando comparado à percentagem de germinação.
Os extratos aquosos de E. lugens também interferiram no crescimento inicial
do arroz, com redução e/ou inibição no comprimento da parte aérea e do sistema
radicular, sendo que com o aumento da concentração do extrato, a redução no
crescimento mostrou-se mais expressiva (FIGURA 3). O comprimento da parte aérea
reduziu significativamente em todos os tratamentos (Figura 3-A). Para o comprimento
radicular não houve diferença significativa entre os tratamentos controle e 4,0 %, porém,
ocorreu uma diminuição drástica no comprimento das radículas nos tratamentos 8,0
% e 16,0 %, em comparação com os demais, com diferença estatística (Figura 3-B).
Tais resultados corroboram com os observados por Borges et al. (2016), nos quais
extratos aquosos de Eragrostis plana interferiram negativamente no crescimento
inicial de feijão-miúdo e cornichão, com redução e/ou inibição no comprimento da
parte aérea e do sistema radicular, sendo o segundo mais sensível aos aleloquímicos.
Em concordância, Ghebrehiwot et al. (2013), testando o efeito alelopático de extratos
aquosos de Eragrostis curvula, observaram efeitos negativos dos mesmos sobre o
crescimento inicial de alface em todas as concentrações testadas (2,0, 10,0, 25,0 e
40,0 %), sendo que, nas concentrações mais altas (25,0 e 40,0 %), ocorreu a completa
inibição do crescimento radicular.
Essa resposta diferente da parte aérea em relação à radicular submetidas
aos extratos pode ser ocasionada pelas estruturas próprias de cada órgão (DE
CONTI & FRANCO, 2011). Dentre os sistemas das plantas o radicular é o mais
sensível à ação de aleloquímicos, porque o seu alongamento depende das
divisões celulares que, se inibidas, comprometem o seu desenvolvimento normal
(HOFFMANN et al. 2007).

FIGURA 3- Crescimento inicial de plântulas de arroz sob efeito de extratos aquosos de
Eragrostis lugens. A – Parte aérea (cm); B- Radícula (cm). Letras iguais não diferem entre si
pelo teste de Tukey (p£0,05).
O retardamento do crescimento ou da germinação pode ser descrito como

mecanismo de seleção. Se o desenvolvimento das outras espécies é prejudicado, a
espécie favorecida pode estabelecer sua prole, evitando a pressão de competição.
Assim, os mecanismos a que são submetidos os cultivos, podem não ser somente de
competição, mas causados por outras plantas cultivadas ou silvestres anteriormente
presentes (GOETZE, 2004).
O presente estudo demonstra que o extrato de folhas de Eragrostis lugens

apresenta efeito alelopático reduzindo e/ou inibindo a germinação de sementes, o
índice de velocidade de germinação e o desenvolvimento inicial das plântulas de
arroz, em uma relação concentração dependente. No que se refere ao crescimento,
a parte radicular mostrou-se mais sensível aos aleloquímicos quando comparada à
parte aérea.
REFERÊNCIAS
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crescimento de duas forageiras. Anais do VII Salão Internacional de Ensino, Pesquisa e Extensão –
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CAPÍTULO 5
AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE DE COMBRETUM

LEPROSUM MART.: TESTE ALLIUM CEPA
Raidan Costa Rodrigues Adão Correia Maia

Centro Universitário UNINOVAFAPI Centro Universitário UNINOVAFAPI
Teresina – Piauí Teresina – Piauí
Valéria Moura de Carvalho Kelly Maria Rêgo da Silva
Centro Universitário UNINOVAFAPI Faculdade Mauricio de Nassau
Jadielson da Silva Santos Mateus Sávio Amorim
Universidade Federal do Piauí (UFPI) Faculdade Mauricio de Nassau
Brenda Lois Barros dos Santos Antonio Lima Braga
Centro Universitário UNINOVAFAPI Faculdade Mauricio de Nassau
Andressa Jordanne Pereira Ramos
Centro Universitário UNINOVAFAPI
Teresina – Piauí
RESUMO: O Combretum leprosum Mart.
Cairo Hilbert Santos de Melo também vulgarmente vem sendo utilizada
Universidade Federal do Piauí (UFPI)
como planta medicinal por sua capacidade
Teresina – Piauí
cicatrizante, por prevenir irritações cutâneas
Juliane Moreira Ramos sem limpeza de feridas, ajudar na contenção
de hemorragias, útil como sedativo, antitússico,
Teresina – Piauí
expectorante e antiparasitária. O Allium cepa é
Elizângela de Carvalho Nunes um teste utilizado frementemente, sensível para
identificar a existência de diversas substâncias
Teresina – Piauí que possam causar alterações cromossômicas
Sâmya Katya Barros Guimarães e de baixo custo. Os bioensaios vegetais
Centro Universitário UNINOVAFAPI são sistemas bem definidos e utilizados para
Teresina – Piauí monitoramento e análise da genotoxicidade
Wanderson Ferreira Martins de substâncias. O presente estudo tem como
Centro Universitário UNINOVAFAPI objetivo verificar a genotoxidade de extrato
Teresina – Piauí aquoso das raízes de Combretum leprosum

Mart. através de teste de Allium cepa. O experimento foi realizado com extratos das
raízes de C. leprosum Mart., tendo como controle água destilada. Seguindo o protocolo,
realizaram-se os esfregaços em lâminas aguardando a secagem em temperatura
ambiente, e logo após a coração e nova secagem, observou-se na objetiva de 40X
a contagem de 5000 células. A exposição dos extratos das raízes de Combretum
leprosum Mart. demonstraram um número significativo de anormalidades nucleares
nas células, influenciando diretamente na frequência de aberrações cromossômicas,
em relação ao número de atrasos, pontes e fragmentos e micronúcleos. Os resultados
obtidos demonstraram que o extrato das raízes de Combretum leprosum Mart.
possui atividade genotóxica no de teste Allium cepa. No entanto, mais estudos são
necessários para verificar o processo de interação bioquímica e possíveis efeitos da
substância estudada.
PALAVRAS-CHAVE: Combretum leprosum Mart., Planta medicinal, Genotoxicidade,
Allium cepa.
ABSTRACT: The Combretum leprosum Mart. also commonly used as a medicinal

plant because of its healing capacity, to prevent skin irritations without cleaning
wounds, to help contain hemorrhages, useful as sedative, antitussive, expectorant and
antiparasitic. Allium cepa is a test used frequently, sensitive to identify the existence
of several substances that can cause chromosomal changes and of low cost. Plant
bioassays are well defined systems used for monitoring and analyzing the genotoxicity
of substances. The present study aims to verify the genotoxicity of aqueous extract of
the roots of Combretum leprosum Mart. through the Allium cepa test. The experiment
was carried out with extracts of the roots of Combretum leprosum Mart., With control
as distilled water. Following the protocol, smears were performed on slides waiting for
drying at room temperature, and shortly after the heart and redrying, a count of 5000
cells was observed on the 40X objective. The exposition of extracts of the roots of
Combretum leprosum Mart. demonstrated a significant number of nuclear abnormalities
in the cells, directly influencing the frequency of chromosomal aberrations, in relation
to the number of delays, bridges and fragments and micronuclei. The results obtained
showed that the extract of the roots of Combretum leprosum Mart. has genotoxic
activity in the Allium cepa test. However, more studies are needed to verify the process
of biochemical interaction and possible effects of the substance under study.
KEYWORDS: Combretum leprosum Mart., Medicinal plant, Genotoxicity, Allium cepa.
INTRODUÇÃO
O Combretum leprosum Mart. também vulgarmente conhecida como mofumbo,

carne-de-vaca e cipoaba, vem sendo utilizada como planta medicinal por sua
capacidade cicatrizante, por prevenir irritações cutâneas sem limpeza de feridas,
ajudar na contenção de hemorragias, útil como sedativo (PIETROVSKI et al., 2006),
antitússico, expectorante (AGRA et al., 2007), atividade antiparasitária em cepas de

promastigotas de Leishmania amazonenses (TELES et al. 2011).
O Allium cepa é um dos testes que vem sendo utilizado frementemente por vários
pesquisadores, por ser um ensaio bastante sensível para identificar a existência de
diversas substâncias que possam causar alterações cromossômicas, em soma, possui
um baixo custo para execução. É um modelo in vivo pertinente e efetivo, no qual as
raízes crescem em contato direto com o analito de interesse, permitindo que os possíveis
danos ao DNA das células possam observados (TEDESCO; LAUGHINGHOUSE,
2012).
A genética toxicológica visa identificar e analisar as interações de substâncias
químicas sobre o material genético dos organismos, que promovem alterações
significativas nos sistemas biológicos, para tanto podem ser utilizados várias análises
genéticas. Bioensaios de mutagenicidade em plantas vem sendo realizados há
muitos anos. Os bioensaios vegetais são sistemas bem definidos e utilizados para
monitoramento e análise da genotoxicidade de substâncias (LIMA et al., 2011; MATOS,
2009).
De acordo com Mattos e colaboradores (2016) o uso de bioindicadores como
organismos testes através de bioensaios para detectar tanto a genotoxicidade quanto
mutagenicidade de extratos que se ligam quimicamente com o material genético está
cada vez mais presente em pesquisas.
Segundo Luz e colaboradores (2012), aberrações cromossômicas (AC) são
qualificadas por mudanças em qualquer estrutura cromossômica ou no número total
de cromossomos, sendo causados por agentes clastogênicos e aneuploidogênicos.
AC estruturais podem ser provocadas por várias condições, como rupturas ou trocas
de material cromossômico, inibição da síntese de DNA e danos na replicação do DNA.
As anormalidades nucleares (AN) são caracterizadas por alterações morfológicas
nos núcleos interfásicos, muitas vezes, na forma de núcleos lobulados, brotos
nucleares, células polinucleares e minicélulas (CARITÁ; MARIN-MORALES, 2008;
LEME; ANGELIS; MARIN-MORALES, 2008; FERNANDES; MAZZEO; MARIN-
MORALES, 2009).
Os micronúcleos (MN) vêm sendo considerados por vários autores como o
mais efetivo e simples fator para analisar efeitos mutagênicos, devido ao fato dos MN
culminarem a danos nas células parentais, sendo facilmente observados em células
(LEME; MARIN-MORALES, 2009).
Diante das informações expostas acima, o presente estudo tem como objetivo
verificar a genotoxidade de extrato aquoso das raízes de Combretum leprosum Mart.
através de teste de Allium cepa.
METODOLOGIA
Para realização do estudo os bulbos foram colocados em água destilada para

crescimento das raízes até elas atingirem um tamanho de aproximadamente 1cm.
Após aparecimento de raízes os bulbos foram expostos em contato com os extratos
das raízes de Combretum leprosum Mart. durante um período de 48 horas. Ao término
desse período, foi retirado as raízes com a coifa, com um tamanho por volta de 2cm.
Aproximadamente seis raízes foram mantidas nos bulbos para realização do processo
de controle, onde os mesmos retornavam para água destilada durante um período de
24 horas, para avaliarmos a capacidade da célula executar o processo de reparo após
injuria.
Os meristemas radiculares, foram armazenados em microtubos contendo fixador
Carnoy por 24 horas e logo após, as raízes foram lavadas em água destilada por três
vezes e armazenadas em álcool 70% sob refrigeração até a confecção das lâminas.
Foram feitos esfregaços em laminas aguardando a secagem em temperatura ambiente,
e logo após a coração e nova secagem, observou-se em microscopia óptica na objetiva
de 40X a contagem de 5000 células, para registro de células com anomalias no ciclo
mitótico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O resultado contendo as aberrações cromossômicas observadas foram dispostas

na tabela abaixo:
Aberrações Cromossômicas (AC)

Cromossomos Micronúcleos
Atrasos Pontes Fragmentos
Soltos (MN)
6% 3% 3% 0 2%
Tabela 1. Aberrações cromossômicas observadas nas amostras dos meristemas expostos aos
extratos das raízes de Combretum leprosum Mart. após 48 h.
Fonte: Autoria própria (2017)
A exposição dos extratos das raízes de Combretum leprosum Mart. demonstraram

uma significativa AN nas células, influenciando diretamente na AC descritas na tabela 1,
em relação ao número de atrasos, pontes e fragmentos e MN nas amostras realizadas.
O aumento na ocorrência de MN também permite identificar uma eventual
mutação nas células que são expostas a uma variada gama de agentes genotóxicos,
expressando-se através dos danos no cromossomo como MNs (FLORES; YAMAGUCHI,
2008).
Segundo Combes (1992) a genotoxicidade dar-se no momento em que a
capacidade de replicação e de levar informação do DNA é alterada, consequentemente
levando a danos no DNA, que podem resultar em efeitos mutagênicos e carcinogênicos.
Nas amostras observaram-se alterações nas divisões celulares, com a presença
de AC, podendo classificar o extrato de Combretum leprosum Mart. neste ensaio uma
substância genotóxica.

CONCLUSÃO
Os resultados obtidos demonstraram que o extrato das raízes de Combretum

leprosum Mart. possui atividade genotóxica no de teste Allium cepa. No entanto, mais
estudos são necessários para verificar o processo de interação bioquímica e possíveis
efeitos da substância estudada.
REFERENCIAS
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CAPÍTULO 6
AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE DOS

EXTRATOS DE ALECRIM (ROSMARINUS
OFFICINALIS) E CHÁ VERDE (CARMELLIA SINENSIS)
EM LINGUIÇAS FRESCAL BOVINA
Thaisa Cidarta Melo Barbosa totais dos extratos vegetais foi avaliado por
Universidade Federal da Paraíba Folin-Ciocalteu e cromatografia líquida de
João Pessoa- Paraíba alta eficiência (CLAE). As linguiças foram
Juliana Nobrega Clemente preparadas utilizando as formulações: (F1):
Universidade Federal de Campina Grande sem antioxidante; (F2): antioxidante BHT; (F3):
Pombal -Paraíba extrato de alecrim e (F4): extrato de chá verde,
Karina da Silva Chaves nas quais foram realizadas análises físico-
Universidade Federal do Mato Grosso químicas e de oxidação lipídica no período de 30
Barra do Garças - Mato Grosso dias de armazenamento. Com relação ao teor de
Sthelio Braga da Fonseca fenólicos totais, os extratos revelaram resultados
Universidade Federal de Campina Grande de 464,52 mg EAG/g para o alecrim e 266,47 mg
Pombal -Paraíba EAG/g para o chá verde. Todas as formulações
Bruno Raniere Lins de Albuquerque das linguiças apresentaram resultados dentro
Meireles dos parâmetros físico-químicos preconizados
Universidade Federal de Campina Grande em legislação vigente, com valores médios de
Pombal -Paraíba 69,20; 18,10 e 5,25% para umidade, proteína,
lipídios, respectivamente. A avaliação da
oxidação lipídica indicou que o antioxidante
BHT inibiu 99% dos efeitos indesejáveis da
RESUMO: A composição química dos
oxidação, enquanto os antioxidantes naturais
embutidos cárneos torna-os susceptíveis
apresentaram inibições para alecrim de 43,2%
às alterações sensoriais e nutricionais pelo
e chá verde de 63,9%. Dessa forma, os extratos
processo de oxidação lipídica. Uma alternativa
vegetais mostraram-se eficientes no controle
para estender a vida de prateleira é a adição de
da oxidação em linguiça frescal bovina.
antioxidantes naturais, uma vez que a utilização
PALAVRAS-CHAVE: compostos bioativos,
está associada aos benefícios proporcionados
oxidação lipídica, produtos cárneos.
a saúde e a preservação das características
dos alimentos. Neste contexto, objetivou-se
ABSTRACT: The chemical composition of meat
avaliar o potencial antioxidante dos extratos
sausages making them susceptible to sensorial
de alecrim (Rosmarinus officinalis) e chá verde
and nutritional changes by the lipid oxidation
(Carmellia sinensis) na estabilidade oxidativa
process. An alternative to extending shelf life is
de linguiça frescal bovina. O teor de fenólicos
the addition of natural antioxidants, since use is associated with the health benefits
and preservation of food characteristics. In this context, the objective was to evaluate
the antioxidant potential of rosemary extracts (Rosmarinus officinalis) and green tea
(Carmellia sinensis) on the oxidative stability of fresh bovine sausage. The total phenolic
content of the plant extracts was evaluated by Folin-Ciocalteu and high performance
liquid chromatography (HPLC). The sausages were prepared using the formulations:
(F1): without antioxidant; (F2): antioxidant BHT; (F3): rosemary extract and (F4): green
tea extract, in which physicochemical and lipid oxidation analyzes were carried out
within 30 days of storage. With respect to the total phenolics content of the extracts
showed results of 464.52 mg EAG / g for rosemary and 266.47 mg EAG / g for green
tea. All the formulations of the sausages presented results within the physico-chemical
parameters recommended in current legislation, with average values of 69.20; 18.10
and 5.25% for moisture, protein, lipids, respectively. The evaluation of the lipid oxidative
indicated that the antioxidant BHT inhibited 99% of the undesirable effects of the
oxidation, whereas the natural antioxidants showed inhibitions for rosemary of 43.2%
and green tea of 63.9%. Thus, the extracts were efficient in the control of oxidation in
fresh bovine sausage.
KEYWORDS: bioactive compounds, lipid oxidation, meat products.
1 | INTRODUÇÃO
A carne bovina é um alimento extremamente nutritivo, rico em proteínas,

aminoácidos essenciais, vitaminas do complexo B e minerais como ferro e zinco
(MEDEIROS et al., 2015). Uma estratégia viável para prolongar a vida útil, produzir
alimentos proteicos com alta qualidade e agregar valor a matéria-prima é a elaboração
de produtos cárneos (SILVA et al., 2017).
Em decorrência do fácil preparo, aceitabilidade e por possuir nutrientes que saciam
a fome rapidamente, a linguiça frescal tornou-se um produto potencial no mercado
para comercialização e consumo. De acordo com a legislação brasileira, entende-se
por linguiça o produto cárneo industrializado, obtido de carnes de animais de açougue,
adicionados ou não de tecido adiposo, ingredientes, embutidos em envoltório natural
ou artificial, e submetido ao processo tecnológico adequado (BRASIL, 2000).
Os embutidos cárneos possuem uma composição rica em lipídios que confere
características desejáveis, como suculência, sabor e maciez às carnes. No entanto,
este constituinte químico torna os produtos cárneos susceptíveis à oxidação lipídica,
responsável pela degradação de ácidos graxos essenciais e do surgimento de odores
e de sabores desagradáveis (ranço), além da formação de compostos potencialmente
tóxicos ao organismo humano (LIMA, 2016). Em contraponto, a indústria de alimentos
tem buscado diversos métodos para estender ao máximo a vida de prateleira dos
produtos. Uma das substâncias utilizadas para este fim são os antioxidantes, cuja
finalidade consiste em inibir ou retardar a oxidação dos componentes lipídicos.
Vários tipos de antioxidantes sintéticos, como hidroxitolueno butilado (BHT),
hidroxianisol butilado (BHA), propil galato (PG) e terc butil hidroquinona (TBHQ) há
muito tempo são utilizados na indústria de carnes para retardar a oxidação (MARIUTTI
et al., 2011). Nos últimos anos pesquisas se intensificaram, comprovando que estes
compostos apresentaram efeitos tóxicos e carcinogênico (OLIVEIRA, 2012). Assim,
o interesse na utilização de antioxidantes naturais, proveniente de extratos vegetais,
surge como alternativa viável, visto que possuem propriedades antimicrobianas,
antioxidantes e estabilizantes para os alimentos, além da redução dos riscos de várias
doenças para os consumidores (SIGER et al., 2012).
As ervas alecrim (Rosmarinus officinalis) e chá verde (Carmellia sinensis) são
conhecidas por possuírem características antioxidantes efetivas nos alimentos,
uma vez que são fontes de compostos fenólicos, substâncias naturais extraídas
de material vegetal, cuja aplicação na indústria de alimentos deve-se às suas
propriedades antimicrobianas e antioxidantes (HONORATO et al., 2013). Além disso,
atuam na proteção do corpo humano contra os radicais livres, inibindo doenças
crônicas (SERAFINI, 2013). Deste modo, as pesquisas por antioxidantes naturais
têm aumentado, tornando-se uma ferramenta no controle de processos oxidativos em
alimentos.
Dessa forma, objetivou-se avaliar a estabilidade oxidativa de linguiça frescal
bovina adicionada de extratos de alecrim (Rosmarinus officinalis) e chá verde (Carmellia
sinensis) durante 30 dias de armazenamento.
2 | MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Tecnologia de Carne, Ovos e

Pescado da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG/UATA), utilizando a
etapas descritas nesta metodologia.
2.1 Obtenção e avaliação dos extratos vegetais
Os extratos vegetais foram obtidos utilizando amostras de chá verde (Carmellia

sinensis) e alecrim (Rosmarinus officinalis), com auxilio dos solventes de extração
aquoso (100% água), alcoólico (100% etanol) e o hidroalcóolico (70% etanol e 30%
água). Os extratos foram preparados seguindo a metodologia descrita por Cordeiro
et al. (2012), a partir de 10 g de erva para 100 ml de solvente, onde passou por um
processo de agitação mecânica por quatro horas. Em seguida, houve a filtração em
papel filtro e secagem em estufa de circulação a 40ºC até estarem completamente
secos. Após a secagem, foram armazenados sob refrigeração e ao abrigo da luz.
O teor de fenólicos totais presentes nos extratos de chá verde e alecrim foram
verificados por meio do método de Folin-Ciocalteu segundo Rossi e Singleton (1965),
com modificações de Silva et al. (2006). O ácido gálico foi usado na curva padrão e
os resultados foram expressos em termos de ácido gálico equivalente (mg GAE/g

extrato).
As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo líquido de alto
desempenho (HPLC) Shimadzu (Kyoto, Japão), equipado com um injetor automático
Rheodyne 7125i e um detector UV/VIS. As colunas utilizadas foram uma coluna
Shimadzu LC-18 (25 cm x 4,6 mm, 5µm particle size, da Supelco, Bellefonte, PA) e
uma pré-coluna C-18 ODS Shimadzu. Para a identificação dos compostos fenólicos,
as amostras foram eluídas com um sistema gradiente que consiste em solvente A (2%
ácido acético, v/v) e solvente B (acetonitrila:metanol, 2:1, v/v), utilizados como fases
móveis, com um fluxo de 1 mL/min. A temperatura da coluna foi mantida a 25 °C e o
volume de injeção foi de 20 µL. O sistema de gradiente iniciou-se a partir de 90% A a
0 min, 88% A em 3 min, 85% A em 6 min, 82% A em 10 min, 80% A em 12 min, 70%
A em 15 min, 65% A em 20 min, 60% A em 25 min, 50% A em 30-40 min, 75% A em
42 min e 90% A em 44 min, segundo Meireles (2017). A corrida cromatográfica total
foi de 50 minutos. Os picos dos compostos fenólicos foram monitorizados a 280 nm.
Os compostos fenólicos foram identificados por meio da comparação dos tempos de
retenção com os padrões de ácidos fenólicos e flavonoides, sendo quantificados em
concentrações de mg/mL a partir de curvas de calibração e os cromatogramas foram
registrados no software LabSolutions Data System.
2.2 Elaboração e caracterização da linguiça frescal bovina
Foram elaboradas quatro formulações de linguiça frescal bovina com duas

repetições de cada tratamento, com as formulações: F1- sem adição de antioxidante,
F2 - adição do antioxidante BHT (0,003%), F3 - adição do extrato de alecrim (0,006%)
e F4 - adição do extrato de chá verde (0,021%). As dosagens dos antioxidantes
adicionados nas linguiças foram determinadas conforme resultados verificados em
análise do teor de fenólicos totais e segundo estudos consoantes de Pereira (2009),
Cordeiro et al. (2012) e a legislação brasileira para antioxidantes sintéticos (BRASIL,
2006).
Para obtenção das linguiças frescais a carne (corte coxão mole) e o toucinho
foram submetidos à moagem, seguido da adição dos ingredientes descritos na Tabela
1 e de homogeneização manual. Posteriormente a emulsão cárnea foi embutida em
tripa natural suína, sendo todos os tratamentos armazenados sob refrigeração de 0 a
+ 4 ºC e submetidos ao estudo de vida de prateleira (DALMÁS, 2013).
F4
Ingredientes F1 F2 F3
(Chá
(%) (Controle) (BHT) (Alecrim)
verde)
Carne bovina 82,5 82,5 82,5 82,5
Toucinho 10 10 10 10
Sal refinado 1,5 1,5 1,5 1,5
Antioxidante - - - -
BHT - 0,003 - -

Alecrim - - 0,006 -
Chá verde - - - 0,021
Pimenta 0,1 0,1 0,1 0,1
Alho 0,1 0,1 0,1 0,1
Realçador de
0,1 0,1 0,1 0,1
sabor
Estabilizante 0,2 0,2 0,2 0,2
Sal de cura 0,2 0,2 0,2 0,2
Água gelada 5 5 5 5
Tabela 1. Formulações da linguiça frescal bovina
As linguiças frescais bovina foram caracterizadas obedecendo às metodologias

descritas abaixo, com a realização das análises em triplicatas:
Composição Centesimal: os teores de umidade, cinzas e proteínas realizadas de
acordo com a metodologia da AOAC (2012). O teor lipídico foi verificado seguindo os
procedimentos de Folch et al. (1957). Os carboidratos foram estimados por diferença
seguindo a metodologia do Instituto Adolpho Lutz (2008).
Oxidação lipídica: a oxidação lipídica dos produtos foi determinada durante 30
dias pelo método do ácido tiobarbitúrico (TBARS), de acordo com a metodologia
descrita por Rosmini et al. (1996).
Análise estatística: os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância
(ANOVA), utilizando um delineamento inteiramente casualizado (DIC) e teste de média
Tukey ao nível de 5% de significância, com auxílio do software estatístico ASSISTAT
7.7.
3 | RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os resultados verificados na análise de compostos fenólicos totais para o

antioxidante sintético e os extratos naturais utilizando diferentes solventes de extração
estão apresentados na Tabela 2.
Teor de fenólicos totais*

Solventes de Extrato de
Extrato de chá verde BHT
extração (%) alecrim
Água 464,52a 178,77b
Etanol 44,17c 32,22c 1332,34
Etanol/Água 145,30 b
266,47 a
Tabela 2- Teor de fenólicos totais do antioxidante sintético e dos extratos vegetais

* Os resultados estão expressos em mg EAG/g extrato para teor de fenólicos totais.
O extrato de alecrim utilizando solvente aquoso apresentou maior conteúdo de

compostos fenólicos totais dentre os extratos vegetais analisados, já o extrato de chá

verde obtido com solvente hidroalcoólico conteve maior teor de compostos fenólicos,
demonstrando assim que esses solventes foram mais eficientes na extração dessa
classe de substâncias químicas. Para o antioxidante sintético BHT foi verificado o
resultado de 1332,34 EAG/g de compostos fenólicos totais, apresentando conteúdo
superior de compostos quando comparado com os demais tratamentos. A elevada
quantidade de substâncias bioativas está relacionada à capacidade de retardar a
deterioração, rancidez ou descoloração causada pela oxidação (HONORATO et al.,
2013).
Na Tabela 3 e na Figura 1 estão apresentados os resultados verificados na
identificação e a concentração dos compostos fenólicos encontrados nos extratos
vegetais.
Extrato Aquoso de Extrato hidroalcoólico de

Compostos fenólicos (mg/100g)
Alecrim Chá verde
Ácidos fenólicos
Ácido 3,4 dihiroxibenzoico 0,22 2,43
Ácido 4 Hidroxibenzoico 0,09 0,23
Ácido p-Cumárico 0,03 0,01
Ácido Siríngico 0,03 -
Ácido 2,5 dihidroxibenzoico 0,95 3,51
Ácido Vanílico 0,14 0,93
Ácido Felúrico 0,20 0,02
Ácido Elágico 0,07 -
Ácido Cafeico 0,23 2,43
Ácido transcinâmico - 0,05
Flavonoides
Rutina 0,23 0,21
Miricetina 0,29 0,74
Quercetina 0,04 0,02
Kampferol 0,02 -
Catequina 0,03 0,05
Crisina 0,05 0,21
Vanilina - 0,14
TOTAL 2,62 10,98
Tabela 3- Identificação e quantificação dos compostos fenólicos por CLAE presentes nos
extratos vegetais

Figura 1 - Cromatograma do perfil dos compostos fenólicos
Os ácidos fenólicos identificados em maiores quantidades nos extratos de alecrim

e chá verde foram o ácido 2,5 dihidroxibenzoico, o ácido 3,4 dihroxibenzoico e o ácido
Cafeico (Tabela 3, Figura 1).
O ácido 2,5-dihidroxibenzóico foi verificado em concentrações de 0,95 mg/g no
extrato de alecrim e 3,51 mg/g no extrato de chá verde. O ácido está vinculado à
atividade neuroprotetora, inibição da oxidação do LDL e na prevenção de doenças
cardiovasculares (KABRA et al., 2014).
Os flavonoides são importantes compostos que possuem capacidade antioxidante
atuando na proteção dos tecidos contra aos danos oxidativos, devido ao elevado
potencial de oxidação e redução (COIMBRA, JORGE, 2012). Dentre os flavonoides
identificados nos extratos vegetais, observou-se quantidades majoritárias de rutina e
miricetina (Tabela 3, Figura 1).
A rutina é amplamente encontrada em alimentos de fontes vegetais. Nos extratos
de alecrim e chá verde foram obtidos valores de 0,23 mg/g e 0,21mg/g, respectivamente.
Esse composto é considerado o mais importante da classe dos flavonoides, tendo
em vista que apresenta propriedades de inibir o processo de formação de radicais
livres em vários estágios e outras atividades biológicas como prevenção de doenças
cardiovasculares e anticarcinogênica (LEE et al., 2011).
Os resultados obtidos para a caracterização físico-química da linguiça frescal
bovina estão descritos na Tabela 4.
F1 F2 F3 F4
Parâmetros
(Controle) (BHT) (Alecrim) (Chá verde)
Umidade (g/100 g) 69,46a±0,53 69,10a±0,53 68,87a±0,53 69,36a±0,53
Proteína (g/100 g) 17,37b±2,65 18,15ab±2,65 18,45a±2,65 18,44ab±2,65
Lipídios (g/100 g) 5,18a±0,25 5,33a±0,25 5,03a±0,25 5,44a±0,25
Carboidrato (g/100 g) 5,40a±0,80 4,91a±0,80 4,99a±0,80 4,01a±0,80
Cinzas (g/100 g) 2,57a±0,10 2,51a±0,10 2,65a±0,10 2,73a±0,10
Tabela 4- Parâmetros físico-químicos da linguiça frescal bovina
A umidade influencia nas características sensoriais, físico-químicas e

microbiológicas dos produtos cárneos (SANTOS, 2016). O teor de umidade verificado
no estudo para as diferentes formulações encontram-se de acordo com a legislação
brasileira, que permite a quantidade máxima de umidade de 70 % em linguiça
frescal. Já as proteínas presentes nos produtos cárneos desempenham importantes
propriedades funcionais, sensoriais e nutricionais (UTRERA; ESTÉVEZ, 2012). Nos
resultados verificados no estudo observa-se que todas as formulações permaneceram
dentro dos limites estabelecidos pela legislação que admite para linguiça frescal no
mínimo 12% de proteína no produto final (BRASIL, 2000).
As linguiças frescais apresentaram resultados semelhantes para o teor lipídico,
identificando valores que variaram de 5,03 a 5,44%, não sendo verificada diferença
significativa em relação às formulações analisadas. Como também os resultados
permaneceram dentro dos limites estabelecidos pela Instrução Normativa Nº 4 do
MAPA (BRASIL, 2000). Os lipídios presentes nos produtos cárneos atribuem aos
alimentos sabor e aroma agradável, melhora a textura e palatabilidade. Todavia, este
constituinte químico tornam os produtos susceptíveis à oxidação lipídica, diminuindo o
tempo de vida útil do alimento (LIMA, 2016).
Em relação ao conteúdo de resíduo mineral fixo os resultados obtidos nesta
pesquisa variaram de 2,51 a 2,73%, não apresentando diferença estatística significativa
(p>0,05) entre as formulações avaliadas. Para o constituinte carboidrato verificou-se
que as formulações de linguiças também não apresentaram diferença significativa.
Na Tabela 5 estão apresentados os resultados da oxidação lipídica na linguiça
frescal, observados pela formação do malonaldeído durante o armazenamento 30
dias.

Estudo da vida de prateleira
Formulações 0 (dias) 30 (dias)
F1 (Controle) 0,3418 ± 0,24
bB
0,6441bA ± 1,22
F2 (BHT) 0,4099aA ± 0,18 0,4064bA ± 0,39
F3 (Alecrim) 0,4216aB ± 0,28 1,0733aA ± 1,11
F4 (Chá verde) 0,4114aB ± 0,18 0,5893bA ± 0,51
Tabela 5. Estudo da vida de prateleira de linguiça frescal bovina adicionada de diferentes

antioxidantes
* Letras maiúsculas diferentes nas linhas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (P<0,05); Letras
minúsculas diferentes nas colunas indicam diferença estatística pelo teste Tukey (P<0,05)
A oxidação lipídica é uma reação em cadeia complexa ocasionada por radical

livre que envolve o consumo de oxigênio molecular e afeta principalmente os
ácidos graxos insaturados dos lipídios presentes nos produtos cárneos, levando ao
desenvolvimento de rancidez e alterações nas caracteristicas sensoriais e nutricionais.
A extensão da oxidação é afetado por vários fatores, como catalisadores de metais,
mioglobina, enzimas, atividade de água, composição de gordura, enzimas oxidativas,
processamento e armazenamento (VIEIRA et al., 2017).
Os resultados obtidos demonstram que ao final do estudo de vida de prateleira
com 30 dias, as formulações F1, F3 e F4 diferiram estatisticamente, apresentando um
aumento na oxidação lipídica em relação ao tempo inicial. Bem como, observou-se
que as linguiças adicionadas de extrato de alecrim obtiveram maiores resultados de
TBARS, indicando uma maior oxidação para a formulação, podendo está relacionado
à menor quantidade de compostos fenólicos presentes no extrato de alecrim verificado
nos resultados descritos na Tabela 3 deste estudo.
4 | CONCLUSÃO
Os extratos vegetais revelaram maior conteúdo de compostos fenólicos totais na

extração aquosa para o alecrim e hidroalcólico para o chá verde, demonstrando serem
importantes fontes de compostos bioativos, através da identificação e quantificação
de composto fenólicos e flavonoides (ácido 2,5 dihidroxibenzoico, o ácido 3,4
dihroxibenzoico,ácido, rutina e a mericetina).
Os resultados da caracterização físico-química das linguiças frescais adicionadas
de diferentes antioxidantes atenderam as normas estabelecidas pela legislação para
linguiça frescal.
Durante o estudo de vida de prateleira a oxidação lipídica foi inibida com maior
eficácia pela adição do antioxidante BHT. Porém, o extrato vegetal de chá verde
evidenciou a capacidade de inibir a oxidação lipídica, favorecendo a substituição de
substâncias artificiais por naturais na indústria de alimentos.

REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 7
AVALIAÇÃO DO USO DE AÇÚCAR NA TERAPIA

TÓPICA DE FERIDAS
Ingrid dos Santos Farias por Pseudomonas sp e Staphylococcus

Bacharel em Medicina Veterinária, UFPI aureus. Os experimentos foram divididos em
Teresina- Piauí duas fases, ambas utilizando camundongos.
Emanuelle Karine Frota Batista Nestes foram produzido feridas na região dorso-
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, lateral, após anestesia dissociativa. Na primeira
UFPI fase, avaliou-se a macroscopia das feridas
Teresina- Piauí limpas e infectadas por Pseudomonas sp,
Hebelys Ibiapina da Trindade tratadas com açúcar granulado, refinado e
Instituto Federal do Maranhão xarope de açúcar. Na fase dois, avaliou-se
São Raimundo das Mangabeiras- Maranhão a macro e microscopia de feridas limpas e
Janayna Batista Barbosa de Sousa Muller infectadas por S. aureus, tratadas com açúcar
Secretaria Estadual da Saúde do Piauí, granulado. Realizou-se observação clínica
Teresina- Piauí diária e avaliação histopatológica do tecido
Maria José Lima Nascimento cicatricial. Na primeira fase não houve diferença
Clínica Veterinária Animal’s significativa (P>0,05) entre o açúcar granulado
Teresina- Piauí e xarope, mas o açúcar reduziu o tempo de
Evanita da Rocha Luz cicatrização de feridas infectadas (11,87±1,55
Médica Veterinária autônoma, e 12,87±1,64 dias, respectivamente) em
Teresina- Piauí comparação com as feridas infectadas não
Maria do Carmo de Souza Batista tratadas (15,25±1,75 dias). Na fase dois, apenas
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, o grupo infectado e não tratado apresentou
UFPI diferença estatística. Concluiu-se que o açúcar
Teresina- Piauí reduz significativamente o tempo de cicatrização
de feridas infectadas promovendo a formação
de um tecido de granulação mais organizado.
PALAVRAS-CHAVE: cicatrização, ferimentos,
RESUMO: O açúcar é eficaz no tratamento
Pseudomonas sp, Staphylococcus aureus
de feridas e atua como antibiótico, interferindo
com o equilíbrio osmótico da célula bacteriana.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito
do açúcar granulado, refinado e xarope na
terapia tópica de feridas limpas e infectadas
EVALUATION OF SUGAR USE IN TOPICAL WOUND THERAPY
ABSTRACT: Sugar is effective in treating wounds and acts as an antibiotic, interfering

with the osmotic balance of the bacterial cell. The objective of this work was to evaluate
the effect of granulated, refined and syrup sugar on topical treatment of clean and
infected wounds by Pseudomonas sp and Staphylococcus aureus. The experiments
were divided into two phases, both using mice. In these cases wounds were produced in
the dorsolateral region, after dissociative anesthesia. In the first phase, the macroscopy
of the clean and infected wounds of Pseudomonas sp treated with granulated sugar,
refined and sugar syrup was evaluated. In phase two, the macro and microscopy of clean
and S. aureus-infected wounds treated with granulated sugar were evaluated. Daily
clinical observation and histopathological assessment of scar tissue were performed.
In the first phase there was no significant difference (P> 0.05) between granulated
sugar and syrup, but sugar reduced the healing time of infected wounds (11,87 ± 1,55
and 12,87 ± 1,64 days, respectively) compared to untreated infected wounds (15,25 ±
1,75 days). In phase two, only the infected and untreated group presented statistical
difference. It was concluded that sugar significantly reduces the healing time of infected
wounds by promoting the formation of a more organized granulation tissue.
KEYWORDS: healing, wounds, Pseudomonas sp, Staphylococcus aureus
INTRODUÇÃO
Ferida é toda e qualquer ruptura da continuidade normal da pele, geralmente

produzida por ação traumática externa a partir de dano físico, químico, térmico (MELO
et al., 2009; THAKUR et al., 2011). A cicatrização é o processo pelo qual um tecido
lesado é substituído por tecido conjuntivo vascularizado, quer a lesão tenha sido
traumática ou necrótica (PANOBIANCO et al., 2012). Assim, o processo de cicatrização
tem como finalidade restabelecer a homeostasia tecidual (CAVALCANTE et al., 2012).
A cicatrização pode ocorrer por primeira, segunda ou terceira intenção. Na
cicatrização por primeira intenção, a ferida é considerada limpa, com perda mínima de
tecido e possibilidade de aproximação das bordas da lesão por suturas. O fechamento
por segunda intenção está relacionado a ferimentos potencialmente infectados e/ou
com significativa perda tecidual, inviabilizando a aproximação das bordas via sutura.
Esse processo requer maior produção de tecido de granulação e tempo mais prolongado
para a contração e epitelização da ferida (BLANCK, 2008). Na cicatrização por terceira
intenção a ferida é deixada aberta por um período, funcionando como cicatrização
por segunda intenção, sendo suturada posteriormente, como cicatrização por primeira
intenção. Este procedimento é empregado geralmente nas feridas cirúrgicas com
infecção (BLANES, 2004).
Se as feridas não forem tratadas corretamente, a infecção pode ocorrer
e o processo de cicatrização e a reepitelização ocorre de forma mais lenta

(INNGJERDINGER et al., 2004). O tratamento de feridas infectadas é importante na
prática clínico-cirúrgica, especialmente no momento atual de aparecimento crescente
de microrganismos resistentes, decorrente do uso indiscriminado de antimicrobianos
(ALVES et al., 2008). Alguns medicamentos com efeito cicatrizante podem ser
utilizados para favorecer e acelerar a reparação tecidual. Atualmente, há uma grande
tendência para o aproveitamento de produtos naturais a base de extratos de plantas,
(fitoterápicos), o mel e o açúcar como opções eficientes para o tratamento de todos
os tipos de feridas, por apresentarem vantagens econômicas, serem eficientes e
apresentarem poucos efeitos colaterais. Esta categoria de medicamentos promove
a cicatrização por diversos mecanismos, além da ação anti-inflamatória e antibiótica
(THAKUR et al., 2011; SANTOS et al., 2012).
O açúcar é indicado para a fase inflamatória da cicatrização até início da
fase proliferativa. Sua ação na terapêutica de feridas inclui: redução do edema
local, pois é capaz de atrair fluidos e linfa para a ferida; taxia de macrófagos que
aceleram a descamação do tecido necrótico, permitindo um debridamento superficial;
fornecimento de energia para as células e formação de camada protetora de proteína
sobre a lesão; redução na congestão vascular dos tecidos perilesionais, melhorando
sua oxigenação e irrigação; maturação do tecido de granulação (KRAHWINKEL;
BOOTHE, 2006; O’CONNELL; WARDLAW, 2011). A alta osmolaridade também
promove ação antibacteriana, principalmente contra E. coli, Pseudomonas aeruginosa
e Streptococcus canis (O’CONNELL; WARDLAW, 2011).
Embora existam vários estudos que mostram a eficácia do uso do açúcar em
feridas, ainda não se sabe se o açúcar possui atividade cicatrizante, ou se a cicatrização
se deve à sua atividade antimicrobiana. Estudos sobre a investigação histológica das
feridas tratadas com açúcar são raros. Portanto, este estudo foi realizado objetivando
avaliar o efeito do açúcar nas formulações de granulado, refinado e xarope na terapia
tópica de feridas limpas e infectadas por Pseudomonas sp, e avaliar o processo
de cicatrização macroscópica e microscópica de feridas limpas e infectadas com
Staphylococcus aureus, tratados com a formulação de açúcar granulado.
MATERIAL E MÉTODOS
O projeto foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação

com Animais da Universidade Federal do Piauí (UFPI), protocolo n º 002/12. Esse
experimento foi realizado em duas etapas no Laboratório de Ciências Fisiológicas, do
Departamento de Morfofisiologia Veterinária do Centro de Ciências Agrárias – UFPI.
Primeira etapa
Animais
Nesta etapa foram utilizados 64 camundongos (Mus musculus) de ambos os sexos,

fornecidos pelo Biotério de Manutenção de Animais Destinados à Experimentação
(BIOMADEX) do Centro de Ciências Agrárias – UFPI. Estes animais foram divididos
em oito grupos, com oito animais cada. Todos os camundongos foram mantidos em
condições uniformes de manejo, recebendo ração balanceada e água ad libitum.
Estirpes bacterianas
As estirpes bacterianas foram obtidas de culturas de Pseudomonas

aeruginosa, cultivadas em caldo de lactose e mantidas no Laboratório Microbiologia da
Universidade Federal do Piauí.
Confecção cirúrgica das feridas
As feridas foram confeccionadas pelo método cirúrgico, mediante prévia anestesia

dissociativa (associação de xilazina 8,0 mg/kg e cloridrato de cetamina 140 mg/kg, via
intraperitoneal). Após a anestesia dos animais, selecionou-se a região lateral direita da
linha media dorsal realizando-se tricotomia e antissepsia (solução de álcool iodado a
2%). As feridas foram demarcadas usando-se um molde de esparadrapo com 1cm2 e
produzidas cirurgicamente, retirando-se a pele e tecido subcutâneo.
Nos grupos GII, GIV, GVI e GVIII, a infecção das feridas foi realizada imediatamente
após a cirurgia, realizando-se três aplicações subsequentes a cada seis horas, obtidas
da cultura de P. aeruginosa com o auxílio de zaragatoas esterilizadas. Quarenta e oito
horas após a confecção cirúrgica das feridas coletou-se material das mesmas, que foi
semeada em um tubo de ensaio contendo ágar-lactose e Gram (ALVES et al., 2008).
Tratamentos
Após 72 horas da confecção das feridas, confirmou-se a presença de

microrganismos em todas as lâminas provenientes dos grupos GII, GIV, GVI e GVIII, e
procedeu-se o tratamento tópico das feridas conforme tabela 1.
Grupos Tipos de feridas Tratamento Esquema de Administração

GI Limpa Controle Não tratada
GII Infectada Controle Não tratada
GIII Limpa Açúcar granulado 2 vezes por dia
GIV Infectada Açúcar granulado 2 vezes por dia
GV Limpa Açúcar refinado 2 vezes por dia
GVI Infectada Açúcar refinado 2 vezes por dia
GVII Limpa Xarope de açúcar 2 vezes por dia
GVIII Infectada Xarope de açúcar 2 vezes por dia
Tabela 1 - Delineamento experimental da primeira etapa do experimento

O xarope foi uma solução de água destilada com açúcar a 85%, fervida durante
três minutos e mantida à temperatura ambiente. Antes de cada aplicação tópica, as
feridas foram limpas com um cotonete levemente umedecido com água filtrada. Nos
grupos GVII e GVIII, swabs foram usadas para auxiliar as aplicações de xarope.
Avaliação macroscópica do processo de cicatrização
A avaliação macroscópica das feridas foi feita por observação diária de sua
aparência, verificando a ocorrência de hiperemia, exsudação e a presença da crosta.
No sétimo e décimo dia após a cirurgia, a área da lesão de cada ferida foi medida com
auxilio de um paquímetro.
Segunda etapa
Animais
Na segunda fase, 56 camundongos de ambos os sexos foram divididos em oito

grupos de sete animais, que foram mantidos em condições idênticas às da primeira
fase. Cada grupo consistiu em quatro machos e três fêmeas. As feridas foram
produzidas de maneira semelhante à primeira etapa.
A infecção das feridas
Nos grupos GIV, GVI e GVIII, a infecção das feridas foi feito por aplicação da cultura
de Staphylococcus aureus (estirpe MRPI98) com o auxílio de zaragatoas estéreis,
imediatamente depois da cirurgia. Para confirmar a infecção, o material colhido a partir
das feridas foi semeado em caldo de lactose e Gram, e foram preparadas lâminas, 48
horas após a infecção.
Tratamento
Nesta etapa apenas o açúcar granulado foi utilizado na terapêutica tópica das
feridas. A aplicação do tratamento começou 50 horas após a confecção das feridas,
conforme delineamento abaixo (Tab. 2).

Grupos Tipos de feridas Tratamento Esquema de Administração
GI Limpa Controle Não tratada
GII Infectada Controle Não tratada
GIII Limpa Açúcar granulado 1 vezes por dia
GIV Infectada Açúcar granulado 1 vezes por dia
GV Limpa Açúcar granulado 2 vezes por dia
GVI Infectada Açúcar granulado 2 vezes por dia
GVII Limpa Açúcar granulado 3 vezes por dia
GVIII Infectada Açúcar granulado 3 vezes por dia
Tabela 2 - Delineamento experimental da segunda etapa do experimento
Avaliações macroscópicas e microscópicas
A avaliação macroscópica das feridas foi feita de forma idêntica à da primeira

fase. Para a avaliação microscópica da morfologia do tecido, dois animais selecionados
aleatoriamente de cada grupo, sendo um macho e uma fêmea, foram eutanasiados por
sobredose anestésica e fragmentos das feridas foram coletados, nos dias sete e dez
após a cirurgia. Estes fragmentos foram fixados em formal a 10% durante 24 horas,
desidratados em álcool, diafanizados em xilol, embebidos em parafina, cortadas em
5μm e coradas pela técnica de hematoxilina e eosina (LUNA, 1968).
Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias

foram comparadas pelo teste de Tukey, ambos a 5% de probabilidade.
RESULTADOS
Na primeira fase do experimento, o estudo macroscópico revelou diferenças

significativas entre o GII (feridas não tratadas e não infectadas) e todos os outros
grupos, sendo que estes não diferirem entre si, em relação ao tempo de cicatrização,
como apresentado na Tabela 3.
Tipos de Esquema de Tempo de cicatrização Desvio

Grupos
feridas Administração (dias) padrão
GI Limpo Não tratada 12,63a 1,41
GII Infectado Não tratada 15,25b 1,75
GIII Limpos 2 vezes por dia 12,75a 1,83
GIV Infectada 2 vezes por dia 11,87a 1,55
GV Limpos 2 vezes por dia 12,25a 1,91
GVI Infectada 2 vezes por dia 12,87a 1,64
GVII Limpo 2 vezes por dia 11,25a 1,53
GVIII Infectada 2 vezes por dia 11,62a 1,92
Tabela 3 - Tempo de tratamento de feridas limpas e infectadas por Pseudomonas sp, tratadas
topicamente com açúcar em formulações diferentes, aplicado duas vezes por dia
Nota: diferentes letras na mesma coluna indicam diferença significativa (P <0,05).

Não houve diferença significativa entre as formulações analisadas, embora o
tempo médio de cicatrização nos grupos tratados com xarope de açúcar foi menor.
Provavelmente devido a este fornecer um maior contato do açúcar com o ferimento.
Verificou-se que o açúcar foi eficaz na redução do tempo de cicatrização de feridas
infectadas por Pseudomonas sp.
Não foi observada mortalidade dos animais durante o experimento, indicando
que o murino é muito resistente, pois a P. aeruginosa causa infecções graves com
alta letalidade (PELLEGRINO et al., 2012), sendo uma das principais bactérias
causadoras de infecção, superada apenas pelo Staphylococcus coagulase-
negativo e Staphylococcus aureus (SADER et al., 2001). Além disso, os animais
foram submetidos à tensão produzida por cirurgia, além de sofrer uma perda de pele
relativamente grande.
Na segunda fase do experimento, verificou-se que o açúcar granulado não
causa redução acentuada no tempo de cicatrização de feridas limpas, mas em feridas
infectadas com S. aureus e tratadas com açúcar granulado, o processo de cicatrização
foi rápido quando comparada com os ferimentos não tratados (Tabela 4). O esquema
de administração não apresentou diferença estatisticamente significativa sobre o
tempo de cicatrização.
Tipos de Esquema de Tempo de cicatrização Desvio

Grupos
feridas Administração (dias) padrão
GI Limpo Não tratada 10,29a 1,25
GII Infectado Não tratada 16,43b 2,37
GIII Limpos 2 vezes por dia 12,14a 1,06
GIV Infectada 2 vezes por dia 13,71a 3,19
GV Limpos 2 vezes por dia 11,14a 2,41
GVI Infectada 2 vezes por dia 13,43a 1,98
GVII Limpo 2 vezes por dia 11,86a 2,03
GVIII Infectada 2 vezes por dia 12,86a 2,54
Tabela 4 - Tempo médio de cicatrização de feridas limpas e infectadas pelo S. aureus, tratadas
topicamente com açúcar em diferentes esquemas de administração
Nota: diferentes letras na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
Avaliação histológica do processo cicatricial indica que os grupos tratados

apresentaram um tecido de granulação mais evidente que os grupos não tratados,
com vários fibroblastos e fibras de colágeno paralelas à superfície, cuja organização
foi mais evidente quando os tratamentos foram aplicados dois e três vezes por dia.
DISCUSSÃO
O açúcar tem um efeito bactericida in vitro contra Pseudomonas sp. (MARTINEZ;

SGARBI; SGARBI, 1986), bem como um efeito bactericida in vivo sobre a cicatrização
de úlceras de pressão infectadas por Pseudomonas sp. (ALVES; DEANA, 2009). O

açúcar também é eficaz no tratamento de infecções causadas por S. aureus (ADDISON;
WALTERSPIEL, 1985). Esta bactéria é frequentemente encontradas em feridas
cutâneas infectadas, sendo resistente à baixa atividade da água (MORRIS, 2008).
Por outro lado, a P. aeruginosa é um patógeno oportunista, ou seja, que raramente
causa doenças em um sistema imunológico saudável, mas explora eventuais
fraquezas do organismo para estabelecer um quadro de infecção. É a causa mais
comum de infecções no ouvido e por queimaduras, e é o mais frequente colonizador
de equipamentos médicos (HENRIQUES, 2004).
A atividade do açúcar contra a infecção por Pseudomonas sp. deve envolver
uma hiperosmolaridade inerente (BALL et al., 2010), com menor disponibilidade de
água na lesão, reduzindo-a para níveis que limitam o crescimento de microrganismos
(PELLEGRINO et al., 2002). O açúcar atrai macrófagos, que participam na “limpeza” da
ferida, aceleram o descolamento do tecido desvitalizado, necrótico e/ou gangrenoso,
proporciona uma fonte de energia local e forma uma camada protetora de proteína para
a ferida. Tem também propriedades desodorizantes, uma vez que as bactérias utilizam
a glicose em vez do metabolismo de aminoácidos, a produção de ácido láctico em vez
de substâncias maloliente (amoníaco, aminas e aminoácidos contendo enxofre). O
açúcar não só absorve o líquido a partir do citoplasma das bactérias, mas também
a partir das células da superfície do leito da ferida. Estas células, ao contrário das
bactérias, estão ligadas umas as outras, e o processo de hidratação não ocorre, mas
uma migração de fluidos e sangue a partir dos substratos de superfície da ferida, com
a formação de microcapilares, fazendo com que a ferida fique mais nutrida e úmida,
o que ajuda seu debridamento, evitar odores desagradáveis durante a eliminação de
detritos e substrato bacterianos, promovendo uma cicatrização mais fisiológica, rápida,
limpa e consolidada (MERCHAN-MAYADO; FERRY; MELERO-RUBIO, 2006).
As ações obtidas com o emprego do açúcar em feridas contaminadas ou infectadas
são: oferta de nutrição às células lesadas, diminuição do odor exalado pela inibição
do crescimento bacteriano, drenagem da exsudação pela ação osmótica, redução do
edema inflamatório devido ao seu efeito higroscópico, diminuição do pH, o que eleva
o efeito bacteriostático, dilatação dos pequenos vasos sanguíneos, aprimorando a
nutrição tecidual, formação de uma camada protetora de proteína, liberação de calor
ao dissolver-se, atração de macrófagos reduzindo a necessidade de debridamento
cirúrgico e estimulação do tecido de granulação, em parte pela ação mecânica local
de eliminação de tecido necrótico e estimulação do crescimento de tecido epitelial
(SERAFINI et al., 2012).
CONCLUSÃO
Devido às suas propriedades antimicrobianas, o açúcar reduz o tempo de

cicatrização de feridas infectadas, e nas feridas limpas seu poder de cicatrização não

é um resultado do processo de aceleração cicatricial, mas a partir da formação de uma
matriz extracelular mais organizada.
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CAPÍTULO 8
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA VITAMINA C

SOBRE A DEFESA ANTIOXIDANTE ENZIMÁTICA
NA FASE AGUDA DA DOENÇA DE CHAGAS
EM CAMUNDONGOS EXPERIMENTALMENTE
INFECTADOS COM A CEPA QM2 DE TRYPANOSOMA
CRUZI
Patrícia Milani de Moraes quando comparado aos demais tecidos no 30°

Faculdade de Medicina de Marília e 60° dias. No fígado, houve os maiores valores
Marília/SP de atividade enzimática durante o 30° e 60° dia.
Bruna de Lima Pereira Os três tecidos apresentaram p<0,05 entre os
Faculdade de Medicina de Marília animais do grupo A entre 15 e 60 dias e também
Marília/SP no grupo B entre 15 e 30 dias. b) FRAP: No
Ludmyla Toller Cocco 15° dia pós-infecção, a atividade antioxidante
Faculdade de Medicina de Marília foi maior nos animais infectados, o que também
Marília/SP ocorreu no 30° dia. Nos três tecidos do grupo
Luciamare Perinetti Alves Martins A houve aumento da capacidade antioxidante
Departamento de Parasitologia da Faculdade de ao longo dos 30 dias. No músculo do grupo D,
Medicina de Marília houve diminuição da capacidade antioxidante
Marília/SP nos 30 dias. No grupo B entre 15 e 60 dias
houve aumento da capacidade antioxidante
total do coração e fígado. Entretanto, no grupo
C, entre 15 e 30 dias, ocorreu uma diminuição
RESUMO: O presente estudo testou o papel
na capacidade antioxidante total do tecido
da vitamina C na doença de Chagas através de
hepático. Concluímos então: a) G6PD: Em
estudo bioquímico da G6PD e FRAP. Para tanto,
alguns momentos, a vitamina C atuou com
foram determinados os perfis antioxidantes
efeito pró-oxidativo, sendo, portanto, prejudicial
de animais infectados e não infectados e
ao tratamento da doença de Chagas, em
suplementados ou não com vitamina C, no
outra associação, não foi possível especificar
15°, 30° e 60° dia pós-infecção, separados
se foi a vitamina C ou a própria infecção que
aleatoriamente em quatro grupos (A, B, C e
aumentou o dano celular. Pode-se questionar
D) de 12 camundongos “Swiss”. Os resultados
a possibilidade de a vitamina C, nos três
obtidos indicaram: a) G6PD: No tecido muscular
tecidos, ter um efeito pró-oxidativo no início
esquelético e no fígado, separadamente, houve
da infecção/tratamento, já que com 30 dias há
p<0,05 entre grupo A e D durante os 30 dias
um aumento significativo do estresse oxidativo,
pós-infecção e entre os animais do grupo D
enquanto que com a infecção ocorreu com
entre 15 e 30 dias. No músculo houve p<0,05
aproximadamente 60 dias pós-infecção. b)
entre os grupos B e D no 30° dia, além de
FRAP: A suplementação com vitamina C pode
apresentar os menores valores enzimáticos
ter sido maléfico, considerando um efeito pró oxidante da substância.
PALAVRAS-CHAVE: Trypanosoma cruzi. defesas antioxidantes. glicose-6-fosfato
desidrogenase. FRAP. estresse oxidativo.
ABSTRACT: This study sought to clarify the true role of vitamin C in Chagas disease
through an enzymatic study of G6PD and FRAP. The antioxidant profiles of 12
infected and uninfected and vitamin C-supplemented animal and not supplemented
were randomly assigned to four groups (A, B, C and D) of 12 Swiss mice. The results
indicated: a) G6PD: In skeletal muscle tissue and liver, there were p <0.05 between
group A and D during the 30 days postinfection and between the animals of group D
between 15 and 30 days. In the muscle there were p <0.05 between groups B and D
on the 30th day, in addition to presenting the lowest enzymatic values when compared
to the other tissues in the 30th and 60th days. In the liver, there were the highest
values of enzymatic activity during the 30th and 60th day. The three tissues presented
p <0.05 between the animals of group A between 15 and 60 days and also in group
B between 15 and 30 days. b) FRAP: On the 15th day post-infection, the antioxidant
activity was higher in the infected animals, which also occurred on the 30th day. In the
three tissues of group A there was an increase in antioxidant capacity over the 30 days.
In the muscle of group D, there was a reduction of the antioxidant capacity in the 30
days. In group B between 15 and 60 days there was an increase in the total antioxidant
capacity of the heart and liver. However, in group C, between 15 and 30 days, there
was a decrease in the total antioxidant capacity of the hepatic tissue. We conclude a)
G6PD: At some moments, vitamin C acted with pro-oxidative effect, and, therefore,
harmful to the treatment of Chagas disease, in another association, it was not possible
to specify if it was the vitamin C or the infection itself that increased the damage cell.
One may question the possibility that vitamin C in the three tissues has a more recent
pro-oxidative effect, since at 30 days there is a significant increase of oxidative stress,
while the infection reaches it with approximately 60 days post infection. b) FRAP:
Vitamin C supplementation proved to be harmful to the treatment of Chagas due to the
increase in antioxidant activity.
KEYWORDS: Trypanosoma cruzi. antioxidant defenses. glucose-6-phosphate
dehydrogenase. FRAP. oxidative stress.
1 | INTRODUÇÃO
A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi, um protozoário parasita

transmitido por insetos hematófagos da família Triatominae, popularmente conhecidos
como “barbeiros”. Em humanos a infecção apresenta uma fase aguda com elevada
parasitemia e formação de ninhos amastigotas e a fase crônica com lesão dos plexos
nervosos cardíaco, mioentérico e esofágico através de ação imune e do protozoário,
levando às apresentações clínicas da doença.
Do ponto de vista imunológico, foi demonstrado que a ativação de macrófagos

pelo T. cruzi resulta na formação de espécies reativas do oxigênio (EROs) (GUPTA
et al., 2009), que podem causar danos em qualquer tecido, porém a membrana
celular é um dos mais lesados devido à peroxidação lipídica (MELLO FILHO, 1984) e,
para combater os radicais livres, os sistemas biológicos aeróbicos utilizam a defesa
antioxidante, pois possuem mecanismos de defesa enzimáticos e não enzimáticos
(VALAVANIDIS et al., 2006) que protegem os componentes celulares contra danos
causados por oxidação, inibindo ou diminuindo a oxidação resultante das espécies
reativas de oxigênio (MCCORD, 2000).
O uso da terapia antioxidante como um meio de aumentar a defesa antioxidante do
hospedeiro na doença de Chagas e minimizar os danos oriundos do estresse oxidativo,
tem sido estudado, por Maçao et al. (2007) que encontraram resultados favoráveis
ao hospedeiro com o uso da vitamina C em associação a vitamina E, contudo os
resultados obtidos por Marim et al. (2015) não deixam claro se o uso isolado de ácido
ascórbico agiu como anti ou pró-oxidante quando administrado por longo período na
infecção chagásica experimental. A vitamina C, um antioxidante não enzimático, atua
como agente redutor de diferentes reações, mas sua propriedade mais difundida é
a de ser um dos mais poderosos antioxidantes do plasma. Embora as propriedades
antioxidantes da vitamina C estejam bem estabelecidas (FREI, ENGLAND E AMES,
1989; BARREIROS et al, 2006), ainda é discutível o seu possível efeito pró oxidante (
DUARTE & LUNEC, 2005) e anti/pro-inflamatório (JIALAL & SINGH, 2006; MIKIROVA
et al., 2012).
Após a penetração das formas tripomastigotas e sua internalização nas células
de defesa do hospedeiro iniciam-se o desenvolvimento do estresse oxidativo causado
pelo burst respiratório. Assim, observa-se que a Glicose 6-Fosfato Desidrogenase
(G6PDH), que é a primeira e a enzima limitante do ramo oxidativo da via das pentoses
fosfato, é uma via alternativa e independente da glicólise, gerando NADPH e pentoses
(ribose-5-fosfato). Assim, a atividade da enzima G6PDH aumenta quanto maior a
necessidade de NADPH para manter a GSH, com o objetivo de proteger as células da
lesão oxidativa em condições normais.
Desta forma, o hospedeiro responde à fase aguda da infecção por mecanismos
de “up regulation” do sistema de defesa antioxidante envolvendo a Glutationa.(WEN
& GARG, 2004) e, sendo a coenzima Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
reduzida (NADPH) a principal fornecedora de elétrons redutores no citoplasma, seu
papel torna-se essencial para manter a Glutationa em seu estado reduzido (CHAN et.
al., 1999). A GSH exerce um papel central na manutenção do estado redox e suas
funções protegem as células contra danos oxidativos. Paralelamente, existe formação
de substâncias antioxidantes não enzimáticas como ácido úrico (SAMUDI et al., 2009).
Neste cenário, a avaliação da atividade destas enzimas, bem como os
antioxidantes não enzimáticos no modelo experimental de suplementação da vitamina
C na doença de Chagas poderá oferecer importantes indicações sobre os efeitos da
suplementação nestas defesas do sistema antioxidante.
Neste trabalho foram utilizados 32 camundongos “Swiss” machos de 20 dias

de idade, os quais foram infectados pela via intraperitoneal com 5,0 x 104 formas
tripomastigotas da cepa QM2 de T. cruzi (Martins et al., 2008), com sangue proveniente
de outro camundongo previamente infectado. Após a infecção, foram separados
aleatoriamente quatro grupos de 12 camundongos cada os quais foram denominados
grupos A, B, C e D.
Grupo A: animais não-infectados e alimentados com ração padrão e água sem
vitamina C.
Grupo B: animais não-infectados e alimentados com ração padrão e água
suplementada com o equivalente a 500 mg/dia de vitamina C.
Grupo C: animais infectados e alimentados com ração padrão e água sem
vitamina C.
Grupo D: animais infectados e alimentados com ração padrão e água suplementada
com o equivalente a 500 mg/dia de vitamina C.
Esses animais foram mantidos em gaiolas individuais no Biotério de Manutenção
do Laboratório de Parasitologia onde receberam água, ração padrão (Nuvilab®) e água
(suplementada ou não com vitamina C) ad libitum.
O tratamento iniciou no dia da infecção e os grupos receberam esse tratamento
por 60 dias.
A dosagem equivalente a 500 mg/dia de vitamina C para adultos humanos foi
determinada considerando pesquisas prévias realizadas (MARIN et al., 2015). Para a
suplementação da água que foi oferecida aos camundongos foi usado Cewin® gotas.
O bebedouro, que serviu de recipiente para a água suplementada, foi envolvido
em papel alumínio para evitar a oxidação da vitamina C pela luz e a água foi trocada
a cada 12 horas.
Para as análises bioquímicas, quatro animais de cada grupo foram eutanasiados
com CO2 no 30º e no 60º dia. Após a eutanásia dos animais, um fragmento do músculo
esquelético, cardíaco e o fígado foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido
e, posteriormente, armazenados à -80°C.
Para a determinação de proteínas os tecidos foram homogeneizados em
tampão de homogeneização (Tris 30 mM, EDTA 1 mM, MgSO4 5mM, pH 7,6) para
a determinação do G6PDH e em solução gelada de KCl 1,15% (10% peso / volume)
para a determinação do FRAP (LOWRY, 1951).
FRAP: A determinação da capacidade antioxidante total dos tecidos se baseou
na capacidade dos antioxidantes não enzimáticos presentes na amostra em reduzir os
íons Fe3+ em Fe2+ na presença de 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) com a formação do
complexo TPTZ-Fe2+, que possui intensa coloração azul medida em 593 nm (BENZIE
& STRAIN, 1996).
G6PDH: A atividade da G6PDH foi determinada através da redução do NADP+ por

meio de ensaio cinético em Tampão de ensaio (Tris 30 mM, EDTA 1 mM, MgSO4.7H2O
5 mM, pH 7,6), segundo o protocolo de KORNBERG & HORECKER, 1955; LÖHR &
WALLER, 1974.
Devido à natureza das variáveis em estudo, no resumo dos dados foram utilizadas
médias, desvio-padrões. Os resultados foram analisados pelo teste de normalidade
(Shapiro-Wilks) para verificar se os dados seguem uma distribuição normal e
homogeneidade de variâncias entre os grupos pelo teste de Levene. As comparações
entre os grupos foram realizadas por meio da análise de variância um fator. Quando o
resultado do teste de normalidade dos dados foi significante, por restrição teórica, foi
utilizado o teste de análise de variância não-paramétrica de Kruskal-Wallis (ARMITAGE
& BERRY, 1997). Foi adotado o nível de significância de 5% de probabilidade para a
rejeição da hipótese de nulidade em todos os testes.
A forma de tratamento, cuidados e eutanásia dos camundongos seguiram as
normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (CEUA). Este projeto foi
aprovado pelo CEUA-Famema sob nº 1253/13.
3 | RESULTADOS
As Tabelas 1 e 2 demonstram os resultados obtidos no ensaio G6PD e FRAP

respectivamente, assim como as Figuras de 1 a 6. Os valores estatisticamente
significativos (p<0,05) obtidos entre as associações de grupos foram identificados.
Os resultados mostraram que a atuação da enzima G6PD no tecido muscular
esquelético e no fígado, separadamente, apresentou diferença estatisticamente
significativa (p<0,05), entre o grupo A quando comparado ao grupo D durante os 30
dias pós-infecção e, no grupo D entre os 15° e 30° dias. Por outro lado, os três tecidos,
separadamente, apresentaram (p<0,05) nos animais do grupo A entre os 15° e 60°
dias e também no grupo B entre os 15° e 30° dias pós-infecção.
No músculo, houve (p<0,05) entre o grupo B com o grupo D no 30° dia pós-
infecção, além disso, neste tecido, foram encontrados os menores valores de atividade
enzimática quando comparado aos demais tecidos no 30° e 60° dias pós-infecção. Já
no fígado, foram encontrados os maiores valores de atividade enzimática durante o
30° e 60° dia pós-infecção.
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D

15 dias
0,172
0,131 0,055 0,173
Músculo (0,076)
(0,055) (0,004) (0,184)
0,138
0,241 0,195 0,223
Coração (0,052)
(0,097) (0,082) (0,029)
0,218
0,223 0,078 0,365
Fígado (0,083)
(0,054) (0,036) (0,041)

30 dias
11,558
9,756 21,959 104,141
Músculo (3,166)
(0,429) (12,868) (36,212)
35,003
23,476 35,88 31,075
Coração (6,992)
(4,221) (7,064) (4,826)
27,177 41,097 33,716 70,844
Fígado
(17,358) (8,162) (7,555) (23,935)
60 dias
30,519
20,693 21,646 36,842
Músculo (20,342)
(9,173) (32,167) (15,781)
41,122
25,967 24,165 34,555
Coração (16,652)
(7,176) (8,922) (12,443)
27,067 27,827 48,567 45,88
Fígado
(8,652) (14,536) (19,791) (10,415)
Tabela 1. Valores médios e desvio padrão para a atividade tecidual da enzima G6PD (μM/min/
mg proteína; 37°C, pH 7,6)
Figura 1. Valores médios e desvio padrão para atividade enzimática da G6PD no músculo
esquelético aos 15, 30 e 60º dia pós-infecção.
*,*,*, * Diferença significativa p<0,05

Figura 2. Valores médios e desvio padrão para atividade enzimática da G6PD em tecido de
coração aos 15,30 e 60º dia pós-infecção.
*,*,* Diferença significativa p<0,05
Figura 3. Valores médios e desvio padrão para atividade enzimática da G6PD em fígado aos
15,30 e 60º dia pós-infecção.
*,*,*, * Diferença significativa p<0,05
Em relação ao FRAP no 15º dia de infecção, o uso de vitamina C ou não

nos camundongos infectados ou não infectados não gerou dados estatisticamente
significativos nos tecidos muscular, cardíaco e hepático. A relevância das associações
obtidas nos mostrou que a atividade antioxidante foi maior nos animais infectados com
T. cruzi. Resultado este que também se repetiu no músculo ao 30° dia.
Houve um aumento da capacidade antioxidante no decorrer dos primeiros 30
dias nos animais do grupo A em todos os tecidos.
Em relação ao músculo do grupo D, nos últimos 30 dias de fase aguda, houve
diminuição da capacidade antioxidante.
O período de 45 dias de uso de vitamina C no grupo B aumentou a capacidade
antioxidante total do coração e fígado. Entretanto no intervalo que se estendeu de
15 para 30 dias, houve uma diminuição da capacidade antioxidante total no tecido
hepático dos animais do grupo C.
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D

15 dias
12,59 9,40 31,39 24,67
Músculo
(3,10) (2,38) (12,68) (7,59)
17,60 11,77 39,19 25,97
Coração
(5,78) (5,78) (11,01) (7,59)
15,66 14,04 54,49 33,37
Fígado
(1,97) (1,46) (11,55) (7,92)
30 dias

34,79
22,09 17,5 27,54
Músculo (7,61)
(2,4) (2,75) (7,92)
28,58
31,57 20,45 24,46
Coração (5,39)
(3,24) (2,91) (7,7)
26,09 21,53 29,22 34,46
Fígado
(2,8) (4,12) (3,84) (7,63)
60 dias
18,86
14,51 17,22 20,19
Músculo (6,02)
(2,07) (4,52) (8,32)
25,95
22,06 25,07 24,73
Coração (2,76)
(4,66) (2,98) (1,61)
25,8 25,1 29,74 31,96
Fígado
(4,93) (2,88) (4) (13,95)
Tabela 2. Valores médios e desvio padrão para a capacidade antioxidante tecidual determinada
pela concentração do FRAP (mM/ mg de proteína)
Figura 4. Valores médios da capacidade antioxidante total pelo método FRAP e desvio padrão
no músculo esquelético nos períodos de 15, 30 e 60 dias pós-infecção.
*,* Diferença significativa p<0,05

no coração nos períodos de 15, 30 e 60 dias pós-infecção.
no fígado nos períodos de 15, 30 e 60 dias pós-infecção.
*,*,* Diferença significativa p<0,05
4 | DISCUSSÃO
Na infecção aguda por T. cruzi, além do processo inflamatório vigente, macrófagos

e neutrófilos ativados promovem liberação de radicais livres de oxigênio e de nitrogênio,
que contribuem para o estresse oxidativo que pode ser agravado pela liberação de
toxinas do parasita (GUPTA; WEN; GARG, 2009).
O aumento do perfil antioxidante não enzimático determinado pelo FRAP na
vigência de infecção foi observado em todos os tecidos aos 15 dias e também no
músculo no 30° dia. Segundo SAMUDI et al. (2009), a presença de uma infecção

interfere na regulação da enzima xantina oxidase. Esta, em sua forma desidrogenase,
converte a xantina, que é um produto gerado na tentativa de erradicação do parasita
através da produção de radicais superóxidos, em ácido úrico. Esta substância é um
poderoso antioxidante que contribui em até 60% da atividade FRAP (BENZIE; STRAIN,
1996).
A suplementação de vitamina C nos animais do grupo D pode ter sido prejudicial,
pois a diminuição da capacidade antioxidante observada neste grupo pode ser
explicada por um efeito pró-oxidante da vitamina C, uma vez que o ácido ascórbico, na
presença de íons Fe2+, atua como pró-oxidante pela estimulação da reação de Fenton
(DUARTE; LUNEC, 2005), gerando Fe3+ e radicais hidroxila através da interação entre
peróxido de hidrogênio (H2O2) e Fe2+, sendo estas as substâncias mais deletérias
para o organismo devido sua meia vida curta e dificuldade de serem neutralizadas
(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Da mesma forma, a diminuição da atividade FRAP encontrada no fígado de
animais do grupo C na evolução de 15 para 30 dias denota uma diminuição dos níveis
de antioxidantes não enzimáticos possivelmente pelo consumo dos mesmos frente à
persistência da infecção com a geração de radicais livres e peroxidação lipídica. Frei,
England e Ames (1989) estabeleceram a ordem de consumo dos antioxidantes no
plasma na presença de peroxidação lipídica, sendo que a vitamina C e tióis foram os
primeiros a serem consumidos, seguidos por bilirrubina, urato e alfa tocoferol.
Entretanto na ausência de infecção, observou-se aumento na capacidade
antioxidante nos tecidos cardíaco e hepático no decorrer do 15° ao 60° dia nos animais
do grupo B, provavelmente pela administração exógena de vitamina C, a qual pode
contribuir em 15% na atividade do FRAP (BENZIE; STRAIN, 1996).
Os resultados obtidos no G6PD mostraram diferença estatisticamente significativa
(p<0,05) entre o grupo A quando comparado ao grupo D no músculo esquelético e
no fígado, separadamente, no 30° dia pós-inoculação, propiciando inferir que houve
o aumento do estresse oxidativo, uma vez que a G6PD atua indiretamente na
neutralização de espécies reativas de oxigênio, aumentando sua atividade enzimática
quando há processos de estresse oxidativo e que isto seja devido à infecção e/ou à
suplementação com vitamina C. Além disso, também quando a vitamina C esteve
associada à infecção, observou-se os maiores valores de estresse oxidativo, levando-
nos a questionar a hipótese de ambas adicionarem seus efeitos pró-oxidativos, como
pode ser observado no grupo D entre o 15° e 30° dia no músculo esquelético e no
fígado, separadamente, no qual nota-se um aumento enzimático no decorrer do tempo
e também no músculo no 30° dia, entre o grupo B com o grupo D.
Assim, há a possibilidade de a vitamina C não ter efeito contra a multiplicação
parasitária, como tem sido mostrado, em recentes estudos, em que alguns parasitas,
através do ácido ascórbico, podem diminuir enzimas antioxidantes dependentes de
ascorbato presente em tecidos infectados, podendo-se proteger da ação oxidante de
ROS e das espécies reativas do nitrogênio (RNS) produzido pelas células inflamatórias
hospedeiras (MONTEIRO G. et al., 2007; LOGAN et al., 2007). Sendo assim, apesar
da suplementação com vitamina C, os parasitas sobreviveriam e elevariam a atividade
oxidativa cansando dano ao hospedeiro.
Além disso, enquanto no músculo foram encontrados os menores valores de
atividade enzimática quando comparado aos demais tecidos no 30° e 60° dia pós-
infecção, o fígado apresentou os maiores valores nesses períodos, corroborando com
os resultados obtidos por DI MEO et al. (1996), onde mostrou que o fígado possui
maior capacidade antioxidante que o coração seguido do músculo esquelético.
Além disso, acreditamos que valores significativos (p<0,05) no grupo B entre os
15° e 30° dias no músculo, coração e fígado, sejam devidos possivelmente somente
à suplementação de vitamina C levando ao aumento da atividade oxidativa no
decorrer dos dias, de maneira que segundo alguns autores, dependendo da dose de
vitamina C, esta pode atuar como pró-oxidante (PADAYATTY et al., 2003; FERREIRA,
MATSUBARA, 1997).
Ainda, no músculo, coração e fígado, separadamente, no grupo C foi observado
p<0,05 entre o 15° e 60° dias, com aumento da atividade da G6PD possivelmente
devido somente à infecção, com o aumento do estresse oxidativo no decorrer dos dias.
Pode-se discutir as possíveis ações da vitamina C, nos três tecidos, ou seja, ter
um efeito pró-oxidativo no início da infecção/tratamento, já que com 30 dias há um
aumento significativo do estresse oxidativo, enquanto que com a infecção ocorreu com
aproximadamente 60 dias pós-infecção.
AGRADECIMENTOS
A Priscilla Oliveira pela colaboração nos treinamentos de execução dos ensaios

bioquímicos em laboratório.
Em memória à Elane de Fátima Taipeiro, nossa querida professora que nos
orientou durante todo o processo, com o máximo zelo e carinho.
CONFLITOS DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no

desenvolvimento do estudo.
SUPORTE FINANCEIRO
FAPESP 2015/09561-0.
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 9
AVALIAÇÃO DOS ÍNDICES DE REGENERAÇÃO

HEPÁTICA NO MODELO EXPERIMENTAL DE
HEPATECTOMIA A 70%
Luz Marina Gonçalves de Araujo Oliveira houve diferenças nos índices morfológicos
Universidade Nove de Julho, Programa de Pós- (peso, volume hepáticos e IHS) após o
Graduação em Medicina, São Paulo, SP período experimental entre os quatro grupos
Pedro Luiz Squilacci Leme de animais; houve diferenças entre o grupo
Universidade Nove de Julho, Programa de Pós- Controle e os três grupos de estudo do Índice
Graduação em Medicina, São Paulo, SP
Mitótico; houve diferenças entre os grupos
Maria Cristina Chavantes Controle, H3 e H7 comparando-se com o
Universidade Nove de Julho, Programa de Pós-
grupo H14 na porcentagem de área positiva
Graduação em Medicina, São Paulo, SP
para PAS. Houve diferenças entre o Índice
de Proliferação dos Hepatócitos aferido por
estudo imunohistoquímico por PCNA do grupo
RESUMO: Objetivos: este estudo procurou controle nos três grupos de estudo. Conclusão:
padronizar o modelo experimental para analisamos os índices morfológicos,
estudo da regeneração hepática pelos histomorfométricos e imunohistoquímicos para
índices morfológicos, histomorfométricos e avaliar o Índice de Proliferação dos Hepatócitos
imunohistoquímicos em ratos Wistar adultos, pelo PCNA. Estes índices avaliaram as principais
após hepatectomia parcial a 70%; o período características da regeneração hepática:
de análise de regeneração em 3, 7 ou 14 dias. hipertrofia (peso, volume e IHS) e hiperplasia
Métodos: Vinte e oito ratos machos adultos (estudo histomorfométrico e imunohistoquímico)
da raça Wistar foram distribuídos em quatro do segmento remanescente do fígado.
grupos, conforme tempo de observação após o PALAVRAS-CHAVE: Regeneração hepática.
procedimento cirúrgico: Controle (C), 3 (H.3), 7 Estudo Histomorfométrico. Imunohistoquímica.
(H.7) ou 14 (H.14) dias. O grupo Controle foi Hepatectomia. Ratos.
submetido a laparotomia; os grupos H3, H7 e
H14 foram submetidos à hepatectomia parcial
EVALUATION OF HEPATIC REGENERATION
e, posteriormente, após transcorrido o tempo de
cada grupo, foram eutanasiados, procedendo- INDICES IN THE EXPERIMENTAL MODEL OF
se a retirada do fígado regenerado. A peça da HEPATECTOMY 70%
hepatectomia e o fígado regenerado foram
pesados, submetidos aos cálculos de volume
ABSTRACT: The analysis of hepatic
e índices hepatossomáticos. Resultados: Não

regeneration after partial hepatectomy in rats can be performed through different
indices: morphological, histomorphometric and immunohistomochemical. Objectives:
The present study analyzed the characteristics of hepatic biometry as a parameter for
monitoring liver regeneration in adult Wistar rats after partial hepatectomy. Methods:
Twenty-eight male adult Wistar rats were divided into four groups, according to
observation time after the surgical procedure: Control (C), 3 (H.3), 7 (H.7) or 14 (H .14
days. The Control group underwent laparotomy; The H3, H7 and H14 groups underwent
partial hepatectomy and, after the time elapsed after each group, were euthanized, and
the regenerated liver was removed. The hepatectomy specimen and the regenerated
liver were weighed, submitted to calculations of volume and hepatosomatic index.
Results: There were no differences in the morphological indices (weight, hepatic volume
and IHS) after the experimental period among the four groups of animals; There was a
strong correlation between hepatic weight x volume in the Control, H3 and H7 groups;
IM x PCNA in group H3, volume x PCNA in group H14, positive correlation between
volume x IHS and negative correlation between IHS x IM in the H7 group. There
were differences between the Control group and the three study groups of the Mitotic
Index. There were differences between the Control, H3 and H7 groups, comparing
with the H14 group in the percentage of positive area for SBP. There were differences
between the Hepatocyte Proliferation Index verified by immunohistochemical study
by PCNA of the control group with the three study groups. Conclusion: we analyzed
the morphological, histomorphometric and immunohistochemical indices to evaluate
the Proliferation Index of Hepatocytes by PCNA. These indices evaluated the main
characteristics of hepatic regeneration: hypertrophy (weight, volume and IHS) and
hyperplasia (histomorphometric and immunohistochemical study) of the remaining
segment of the liver.
KEYWORDS: Liver regeneration. Morphology. Histomorphometric study.
Immunohistochemistry. Hepatectomy. Rats.
INTRODUÇÃO
A habilidade extraordinária do fígado em regenerar-se após ressecção ou lesão

tem fascinado médicos, cientistas e leigos ao longo da história da humanidade. A
mitologia grega, historicamente, foi a primeira a abordar o tema acerca da capacidade
de regeneração do fígado. A citação mais antiga acerca da capacidade regenerativa
hepática foi descrita por Hesíodo (750-700 A.C) em sua obra Theogony acerca do
mito de Prometeu9. Desde então, a regeneração hepática vem despertando grande
interesse ao longo da história, mas seus mecanismos permaneceram desconhecidos
por centenas de anos. As primeiras descrições científicas sobre o assunto remontam
ao século XVII; desde o início do século XX vem sendo estudada sistematicamente. A
mais antiga referência bibliográfica sobre regeneração hepática data de 1909. Milne,
neste ano, percebeu que qualquer alteração patológica ou experimental levando
à destruição de hepatócitos era capaz de desencadear o processo de proliferação

celular hepática2. Em 1920, Rous e Larimore reportaram o aumento do volume dos
lobos hepáticos não submetidos à ligadura, enquanto o restante do fígado era provido
de suprimento portal11. Em 1931, Higgins e Anderson publicaram seu trabalho onde
apresentaram a dinâmica da regeneração hepática após HP a 70 % em ratos, sendo
esta técnica empregada até hoje6.
A regeneração do fígado é o processo que envolve hiperplasia (aumento do número
de células) e hipertrofia (aumento do volume celular ou do conteúdo proteico na fase pré-
replicação). O conceito de regeneração é usado comumente na literatura; no entanto,
regeneração hepática é primariamente um processo de hiperplasia compensatória, a
qual é dirigida mais por necessidades funcionais do que anatômicas5. Logo, apesar
de ser amplamente empregado na literatura, o termo “regeneração” não é adequado
do ponto de vista biológico, uma vez que a resposta desencadeada pelo dano tecidual
hepático promove hiperplasia e hipertrofia compensatória do tecido remanescente,
até o restabelecimento da massa hepática primitiva. No entanto, os lobos hepáticos
ressecados cirurgicamente não são recuperados8 . Nos últimos anos, surgiram novos
conhecimentos sobre os fatores envolvidos no processo de regeneração hepática;
acrescentar um fator com efeito potencialmente negativo à regeneração após HP para
a restauração hepática desperta interesse para a investigação científica5.
Desta forma, o estudo da regeneração hepática avaliada por diversos índices
morfológicos, histomorfométricos e imunohistoquímicos pode fornecer informações
pertinentes no desenvolvimento do modelo experimental e passível de ser aplicado na
investigação científica4;7;12.
MÉTODOS
Este estudo foi realizado no Biotério Central do campus Vergueiro da Universidade

Nove de Julho, São Paulo, sendo conduzido de acordo com a lei federal 6.638 de maio
de 1979 e após ser autorizado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
UNINOVE (número de aprovação CEUA Na 0015/2014) e as demais normas aplicáveis
à utilização de animais para o ensino e pesquisa, especialmente as resoluções do
Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. Vinte e oito
ratos machos da raça Wistar, adultos jovens, de peso médio 533,03 ± 71,04 g, foram
distribuídos em quatro grupos, conforme tempo de observação após o procedimento
cirúrgico: Controle (laparotomia sem hepatectomia), 3 (H3), 7 (H7) e 14 (H14) dias.
Os grupos H3, H7 e H14 foram submetidos à HP a 70% com ressecção dos lobos
mediano e esquerdo conforme modelo de HIGGINS & ANDERSON e, posteriormente,
após o período de estudo, os animais foram eutanasiados e seus fígados removidos
(estes apresentavam o segmento em regeneração e o segmento hepático restante pós-
hepatectomia); as amostras foram submetidas às análises morfológicas (peso, volume
e IHS), histomorfométricas (hematoxilina-eosina para aferição do Índice Mitótico. PAS
para quantificação do glicogênio citoplasmático hepático) e imunohistoquímicas pelo
PCNA para aferição do Índice de Proliferação dos Hepatócitos). Para análise estatística,
foram utilizados os testes de Kolmogorov-Smirnov para avaliação da normalidade dos
dados, One-Way ANOVA, ANOVA de dois fatores (grupo X tempo) e Correlação de
Pearson. Os valores de p < 0,05 indicaram significância estatística.
Figura 10 – Fases da 1ª etapa cirúrgica (hepatectomia 70%). (A) Animal anestesiado em

posição para a cirurgia. (B) Laparotomia mediana. (C) Abordagem dos lobos esquerdo e
mediano. (D) Lobos esquerdo e mediano exteriorizados. (E) Ligadura do pedículo dos lobos.
(F) Ligadura do pedículo dos lobos. (G) Cavidade peritoneal após excisão dos lobos hepáticos
esquerdo e mediano. (H) Sutura do plano músculo-aponeurótico. (I) Sutura do plano cutâneo.
(J) Sutura finalizada. Aspecto final da cicatriz cirúrgica.
RESULTADOS
Não houve diferenças nos índices morfológicos (peso, volume hepáticos e IHS)
após o período experimental entre os quatro grupos de animais: grupo controle, grupo
de ratos hepatectomizados a 70 % e eutanasiados após 3 dias, 7 dias e 14 dias; houve
forte correlação entre peso X volume hepáticos nos grupos Controle, H3 e H7; IM X
PCNA no grupo H3, volume X PCNA no grupo H14, correlação positiva entre volume X
IHS e correlação negativa entre IHS X IM no grupo H7. Houve diferenças entre o grupo
Controle e os três grupos de estudo do Índice Mitótico. Houve diferenças entre os

grupos Controle, H3 e H7 comparando-se com o grupo H14 na porcentagem de área
positiva para PAS. Houve diferenças entre o Índice de Proliferação dos Hepatócitos
aferido por estudo imunohistoquímico por PCNA do grupo controle com os três grupos
de estudo.
Fígado de ratos do grupo H3 demonstrando aspecto macroscópico da área de segmento

hepático restante pós-hepatectomia (amarela) e área hiperplásica (setas). A ligadura do
pedículo realizada na HP está demonstrada na seta.
Fígado de ratos do grupo H7 demonstrando aspecto macroscópico da área hiperplásica

apontada pelas setas. A pinça aponta para a área de segmento hepático restante pós-
hepatectomia em amarelo. A ligadura do pedículo realizada na HP está demonstrada na seta.

Fígado de ratos do grupo H14 demonstrando aspecto macroscópico da área hiperplásica
apontada pelas setas. A ligadura do pedículo realizada na HP está demonstrada na seta.

Índices Histomorfométricos e Imunohistoquímicos

Fotomicrografias do fígado de rato macho Wistar, do grupo Controle, e do segmento
hiperplásico dos fígados dos grupos H3, H7 e H14, indicando: parênquima hepático com
formação sinusoidal típica (s) com hepatócitos de núcleo denso (h) e células epiteliais (ce). As
áreas demarcadas indicam figuras de mitose (m). Coloração HE; aumento de 400 X.
Fotomicrografias do fígado de rato macho Wistar, do grupo Controle, e do segmento

hiperplásico dos fígados dos grupos H3, H7 e H14, indicando: grânulos de glicogênio (g)
corados em magenta no citoplasma dos hepatócitos e núcleo (n) corado em azul. Coloração
PAS/Hematoxilina, 400 X.
Fotomicrografias do fígado de rato macho Wistar, do segmento hiperplásico dos fígados dos
animais dos grupos Controle, H3, H7 e H14, coradas pelo PCNA, demonstrando a presença de
núcleos positivos corados em castanho e núcleos negativos em azul. Aumento de 400 X.

DISCUSSÃO
Ao longo das últimas décadas, muitas pesquisas sobre os mecanismos da

regeneração hepática foram realizadas, objetivando-se analisar os efeitos positivos e
negativos de diversos fatores sobre este processo, como a ação de fármacos, nutrientes,
plantas, hormônios, doenças metabólicas como diabetes melitus e tireoidopatias, laser
de baixa potência, procedimentos cirúrgicos, tumores, dentre outros1. Diversos índices
podem ser utilizados para análise do processo de regeneração hepática; variáveis
moleculares, bioquímicas, morfológicas, histomorfométricas e imunohistoquímicas são
as mais empregadas, mas a literatura diverge consideravelmente sobre quais métodos
de avaliação são mais indicados em diferentes situações1;2;3;10;13. Em nosso estudo,
procuramos avaliar os índices que caracterizam os dois aspectos fundamentais da
regeneração hepática: índices morfológicos, histomorfométricos e imunohistoquímicos
que avaliam a hipertrofia e hiperplasia hepáticas8. Desta forma, pudemos avaliar os
índices mais indicados e o tempo em que o processo de regeneração se deu de modo
satisfatório14.
CONCLUSÕES
Esta pesquisa demonstrou que, pelas análises realizadas, recomendamos

a análise dos índices morfológicos, histomorfométricos e imunohistoquímicos
empregados neste estudo: dentre os índices morfológicos, peso, volume hepáticos e
IHS; dentre os índices histomorfométricos, a quantificação do glicogênio hepático pela
coloração PAS; e o estudo imunohistoquímico para avaliar o Índice de Proliferação
dos Hepatócitos pelo PCNA. Estes índices avaliaram as principais características
da regeneração hepática: hipertrofia (peso, volume e IHS) e hiperplasia (estudo
histomorfométrico e imunohistoquímico) do segmento remanescente do fígado. Em
relação ao tempo de estudo para regeneração hepática, recomendamos o período
de 7 dias, pois foi neste período que se deu a regeneração satisfatória. A partir deste
modelo, objetivamos impulsionar os pesquisadores a realizar diversos estudos, e desta
forma contribuir para novas descobertas no campo da regeneração hepática, tendo
em vista que fatores que aceleram ou inibem este processo são de grande relevância
no campo da cirurgia hepática, especialmente no que se refere à sobrevivência dos
pacientes submetidos a grandes ressecções hepáticas por tumores ou trauma e nos
transplantes hepáticos intervivos. Tendo em vista que o processo de regeneração
é fundamental tanto para o doador quanto para o receptor, este último aspecto se
constitui no grande desafio atual nas pesquisas sobre regeneração hepática.

REFERÊNCIAS
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imaging techniques to study liver regeneration. Eur Surg Res.2015; 54(3-4):97-113.

CAPÍTULO 10
BIOTECNOLOGIA NO CONTROLE DE MOSQUITOS

TRANSMISSORES DE ARBOVIROSES: BIOENSAIOS
PARA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INSETICIDA EM
MOSQUITOS ADULTOS
Fabíola da Cruz Nunes estudos de atividade inseticida em mosquitos

Universidade Federal da Paraíba, Departamento adultos. Como metodologia, foram propostos
de Biologia Celular e Molecular, João Pessoa-PB. três bioensaios utilizando Aedes aegypti: teste
Louise Helena Guimarães de Oliveira de contato tarsal, teste de contato corporal e
Universidade Federal da Paraíba, Curso de teste de ingestão. Como resultados, observou-
Graduação em Biotecnologia, João Pessoa-PB.
se que as três metodologias são adequadas para
Patrícia Alexandria Paiva Silva de Sousa estudo de atividade inseticida contra mosquitos
Universidade Federal da Paraíba, Curso de
adultos e fornecem informações sobre qual a
melhor via de utilização do inseticida estudado.
Hyago Luiz Rique O teste de contato tarsal simula a aplicação de
Universidade Federal da Paraíba, Curso de
inseticidas sobre superfícies e é adequado para
estudo sobre o efeito residual dos inseticidas
sobre os mosquitos. Já o teste de contato
corporal, simula a aplicação direta do inseticida
RESUMO: Atualmente, diversas arboviroses sobre o mosquito, enquanto o teste de ingestão
vem causando preocupação ao redor do é adequado para estudo em que se pretende
mundo. Dengue, febre amarela urbana, zika desenvolver iscas de alimentação. Conclui-se
e chikungunya afetam grande número de que as metodologias propostas são de simples
pessoas, sobretudo em países tropicais como execução, baixo custo e de grande utilidade para
o Brasil. Diversas estratégias de controle pesquisas de novas substâncias inseticidas
dessas doenças vem sendo estudadas, tais que possam ser utilizadas no combate aos
como vacinas e terapias antivirais. Apesar mosquitos vetores de arboviroses.
disso, a principal forma de combate consiste PALAVRAS-CHAVE: Arbovírus, Aedes aegypti,
no controle dos mosquitos vetores, sobretudo inseto.
através da eliminação mecânica dos criadouros
e da utilização de inseticidas. Infelizmente, tais ABSTRACT: Currently, many arboviruses is
esforços não tem sido suficientes para manter causing concern around the world. Dengue,
essas doenças controladas. Dessa forma, urban yellow fever, zika and chikungunya affect
pesquisas que enfoquem no controle dos large numbers of people, especially in tropical
mosquitos são de grande importância. O objetivo countries like Brazil. Several strategies to control
desse capítulo é descrever metodologias para these diseases have been studied, such as

vaccines and antiviral therapies. Nevertheless, the main way to combat those consists
in the control of mosquito vectors, particularly by mechanical removal of breeding and
use of insecticides. Unfortunately, such efforts have not been enough to keep these
diseases under control. Therefore, research that focuses on mosquito control are so
important. The aim of this chapter is to describe methodologies for insecticidal activity
studies in adult mosquitoes. As methods, three bioassays were proposed using Aedes
aegypti: tarsal contact test, body contact test and ingestion test. As results, the three
methodologies were adequate to study insecticidal activity against adult mosquitoes.
These methods provide information on the best way of using the insecticide studied.
The tarsal contact test simulates the application of insecticides on surfaces and is
suitable for study on the residual effect of insecticides on mosquitoes. On the other
hand, the body contact test simulates the direct application of the insecticide on the
mosquito, while the ingestion test is adequate to develop feeding baits. As conclusion
the results show that the proposed methodologies are simple, low cost and very useful
for research on new insecticides that can be used to combat mosquito vectors of
arboviruses.
KEYWORDS: arboviruses, Aedes aegypti, insect.
1 | INTRODUÇÃO
Nos últimos anos a saúde pública tem enfrentado um importante desafio

de conter o inseto Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762), uma vez que é
considerado o principal vetor dos vírus da dengue, chikungunya e zika (Terra et al,
2017). As evidências existentes apontam que o Ae. aegypti se originou na África
tropical, habitando ambientes silvestres, como escavações em rochas e troncos de
árvores. Com o passar do tempo essa espécie adaptou-se aos centros urbanos, onde
as alterações provocadas pelo homem propiciam sua proliferação. No continente
americano, acredita-se que tenha sido transportada em barris que vinham dos navios
de exploradores e colonizadores (Dive, 2007). Nas terras brasileiras, as primeiras
suspeitas ligadas ao mosquito apareceram em meados do século XVIII, época em
que havia o comércio de escravos negros vindos da África. Porém, somente no final
do século XIX que cientistas passaram a estudar detalhadamente o inseto, vindo
então a descobrir as doenças que estes eram capazes de provocar, além de descobrir
formas de combatê-los. O Ae. aegypti apresenta grande capacidade de adaptação a
criadouros artificiais, o que possibilita o aumento de sua população e, por conseguinte,
o aparecimento de epidemias devido ao seu hábito antropofílico (Consoli & Oliveira,
1994).
Controlar o Ae. aegypti tem sido um grande e importante desafio, principalmente
em países emergentes. Até em situações onde recursos são liberados especificamente
para a aplicação de programas de combate ao vetor, na maioria das vezes não se
tem alcançado sucesso. Os problemas de infraestrutura das cidades, como baixas

coberturas na coleta de lixo e intermitência no abastecimento de água, são fatores que
comprometem a efetividade dos métodos tradicionais de controle do Aedes sp. (Zara
et al., 2016; Coelho, 2008).
Atualmente o território brasileiro passa por um momento com alta incidência
de arboviroses (dengue, chikungunya e zika), mas além disto, alguns dados
epidemiológicos apontam números preocupantes de casos graves e muitos óbitos.
Outro problema atual é a associação do zika vírus com a síndrome de Guillain-Barré e,
principalmente, com a transmissão vertical, resultando em casos de microcefalia, que
têm sido motivo de alarme nacional e internacional (Terra et al, 2017).
Para a redução da densidade populacional do Ae. aegypti, recomenda-se
o controle integrado. O controle integrado é um conjunto de ações preventivas e
corretivas, para impedir a atração, abrigo, acesso ou proliferação de vetores e pragas
urbanas e, como parte deste controle, o uso de inseticidas e repelentes ambientais.
No entanto, tal prática tem levado à seleção de populações de insetos resistentes.
Dessa forma, faz-se necessário buscar métodos alternativos que sejam mais seguros,
eficazes, com preços acessíveis e biodegradáveis (Silva et al., 2014; Brasil, 2016b).
Além dos problemas relacionados à toxicidade, o surgimento da resistência por
parte do Aedes aegypti aos inseticidas químicos mais utilizados tem sido reportada
por diversos autores (Luna, 2004; Horta, 2011). O Brasil possui um alto potencial
de recursos naturais para o desenvolvimento de inseticidas a partir da flora nativa.
Neste contexto, pesquisadores vem utilizando a biotecnologia para explorar nossos
recursos naturais e desenvolver novos inseticidas (Nunes et al., 2014; Oliveira et al.,
2015; Fernandes et al.,2018). Dessa forma, este estudo tem como objetivo analisar 3
metodologias para avaliação da atividade inseticida em mosquitos adultos, simulando
diferentes formas de aplicação de inseticidas.
2 | METODOLOGIA
Bioensaios para avaliação da atividade adulticida
Insetos
Para esse estudo, foram utilizados mosquitos da espécie Aedes aegypti, da

linhagem Rockfeller João Pessoa, obtidos de uma colônia cíclica mantida a mais de
sete anos no Laboratório de Biotecnologia Aplicada a Parasitas e Vetores (LAPAVET),
do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba. As populações da
linhagem Rockfeller, são caracterizadas como uma linhagem padrão de mosquito,
susceptível a classe de inseticidas químicos derivados de produtos naturais. Estes são
utilizados como referência em estudos de monitoramento de resistência comparados
com os mosquitos existentes nas cidades brasileiras (FRANÇA, 2015).

O ciclo do Ae. aegypti é mantido dentro de uma câmara climatizada do tipo
Biological Oxygen Demand (BOD), sob condições de temperatura controlada de 27 ±
2°C, umidade relativa do ar 75 ± 5% e fotoperíodo de 12 horas de claro e escuro (WHO,
2013; IMAM et al. 2014; NUNES et al. 2015). A utilização de condições normalizadas
de manutenção do ciclo de vida do mosquito para ensaios laboratoriais é essencial
para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos dados (WHO, 2013). Foram
utilizados nos experimentos, ovos, larvas no quarto estágio de desenvolvimento (L4),
pupas e mosquitos adultos de Ae. aegypti.
Substâncias teste
Para os bioensaios utilizou-se o extrato liofilizado de Agave híbrida 11648 e

o extrato liofilizado de Agave sisalana, ambos fornecidos pela Embrapa Algodão –
Campina Grande. O cultivo foi feito na cidade de Monteiro, na Paraíba. O extrato foi
obtido a partir da moagem das folhas em moinho manual até a completa extração da
seiva clorofilada e posteriormente foi submetido a filtragem e ao processo de liofilização
até completa secagem da amostra. A amostra foi acondicionada em recipiente, ao
abrigo da luz e em temperatura ambiente até o momento da utilização. A concentração
testada foi a de 10 mg/mL.
Teste de contato tarsal
A metodologia proposta tem a intenção de simular a aplicação intradomiciliar de

inseticidas e seu poder residual nas paredes dos ambientes. Neste ensaio, utilizou-se
como substância teste, os extrato liofilizados de Agave sisalana e Agave híbrida 11648
diluídos em água na concentração de 10 mg/mL. A solução teste foi embebida em
algodão e passada por toda a parede de um recipiente de plástico de 250 mL, que é
deixado secar completamente, antes da transferência dos mosquitos para o mesmo.
Dez mosquitos adultos de Ae. aegypti com 5 dias de vida, foram transferidos para
esses recipientes previamente tratadas com as substâncias teste e observados por 24
e 48 horas. No grupo controle negativo, a superfície do copo foi tratada apenas com
água destilada, enquanto no controle positivo a superfície foi tratada com inseticida
comercial Baygon ® á base de Praletrina 0.03%, Cipermetrina 0.1% e Imiprotrina
0.03%. Os testes foram realizados em triplicata.
Teste de contato corporal
A metodologia proposta tem a intenção de simular a aplicação do inseticida

diretamente sobre o mosquito e foi adaptada da WHO (1981). Neste ensaio, vinte
mosquitos foram previamente anestesiados pelo frio, sendo mantido em congelador
durante 2 minutos. Posteriormente, com o auxílio de uma pipeta automática, receberam
10 μL das substâncias teste dissolvidas em água destilada. Após a aplicação, os
mosquitos foram mantidos em condições ideais de desenvolvimento em caixas

plásticas teladas e observados por 24 e 48 horas. Após esse período, os mosquitos
foram considerados mortos se não apresentassem nenhum sinal de movimento,
deitados no fundo do recipiente plástico e não respondendo à estimulação mecânica
(CHOOCHOTE et al. 2006). No grupo controle negativo, as paredes do copo foram
tratadas com água destilada. O controle positivo foi composto por 10 mosquitos
adultos expostos ao inseticida com composição Imiprotrina 0,02%, Permetrina 0,05%
e Esbiotrina 0,1% (NUNES et al. 2015). Para determinar as atividades tarsal e corporal
foi utilizada a seguinte fórmula:
Teste da ingestão
O teste de ingestão é indicado nos estudos onde se pretende desenvolver iscas

inseticidas. Neste ensaio utilizou-se uma caixa de polipropileno com tampa (insetário),
sendo a tampa perfurada para fixação do dispositivo de alimentação. Para confecção do
dispositivo de alimentação utilizou-se um absorvente interno feminino, o qual foi fixado
a tampa da caixa pelo próprio cordão de algodão (Figura 1). No grupo experimental
o dispositivo de alimentação foi embebido na solução da substância teste, enquanto
no grupo controle, o dispositivo foi embebido numa solução de mel e água a 10%.
Utilizou-se dez mosquitos por insetário, os quais tiveram acesso irrestrito apenas ao
dispositivo de alimentação. Os mosquitos foram observados durante 48h e os ensaios
foram realizados em triplicata.
Figura 1: dispositivo de alimentação utilizado nos testes de ingestão da substância teste.
3 | ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada usando o programa GraphPad Prism versão 5.0
para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Diferenças significativas entre os
grupos foram analisadas por ANOVA e pós-teste de Tukey (P < 0.05).

As metodologias propostas tem como objetivo avaliar a atividade inseticida de

substâncias sintéticas ou naturais. Os principais achados desse estudo foram: No
bioensaio de contato tarsal observou-se que o grupo exposto a A. sisalana teve 100 %
de mortalidade em 24 horas, enquanto o grupo exposto a Agave híbrida teve 63% de
mortalidade (Figura 2). Já no bioensaio de contato corporal, observou-se que o grupo
exposto a A. sisalana manteve 100 % de mortalidade em 24 horas, enquanto o grupo
exposto a Agave híbrida teve sua mortalidade aumentada para 70%, sete por cento,
portanto, que nos ensaios de contato tarsal (Figura 2).
Figura 2: Teste de avaliação da atividade inseticida pelo contato tarsal (A) e corporal (B).
Dessa forma, observou-se que tanto o extrato liofilizado da A. sisalana quanto o

da Agave híbrida 11648 possuem atividade inseticida seja pelo contato do mosquito
com superfícies tratadas, como no caso do contato tarsal, seja pela aplicação direta
sobre o corpo do mosquito (contato corporal). No caso da Agave híbrida, que não tinha
atingido 100 % de mortalidade no bioensaio de contato tarsal, observou-se que o efeito
foi potencializado quando adotou-se a metodologia do contato corporal, chegando a
100 % de mortalidade, sem aumentar a concentração da substância. Lucena et al.
(2011) realizou testes de avaliação da atividade inseticida da Rhinella marina, por
contato tarsal e corporal com mosquitos adultos. Em seu estudo, utilizando-se apenas
a concentração de 100 ppm, a mortalidade passou de 20 para 36%, corroborando os
nossos achados.
Um dos grandes achados desse estudo foi em relação ao efeito da ingestão
da Agave híbrida sobre os mosquito adultos. Os mosquitos não só se alimentaram
espontaneamente das soluções de Agave como o grupo alimentado com a Agave
híbrida, na concentração de 5,0 mg/mL, teve 53 % de mortalidade em 24 h (Figura 3).
Essa metodologia tem grande utilidade na biotecnologia, sobretudo na confecção de
iscas de inseticida, produto inexistente no mercado.

10
8
*
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6
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Figura 3: Teste de avaliação da atividade inseticida pelo teste de ingestão.
Em estudo de atividade inseticida realizados por Govindarajam & Sivakumar

(2014) e Salmeron (2002). O teste de contato corporal se mostrou mais efetivo,
matando os mosquitos num tempo menor se comparado ao teste de contato corporal
como podemos observar nos gráficos 5 e 6. Esse efeito já era esperado pois segundo
Salmeron (2012), o método é mais sensível, embora a técnica possa não refletir a
forma pela qual os insetos são expostos a campo.
O controle do Ae. aegypti tem sido dificultado devido ao surgimento de resistência
a inseticidas sintéticos. O piriproxyfen utilizado para o controle positivo é um eficaz
larvicida, sendo utilizado nas fórmulas de diversos produtos comerciais e com
diferentes apresentações (Spray, fumegantes e outros), porém Maoz et al. (2017) fez
uma compilação de estudos que relatam a resistência dos insetos a este inseticida.
O controle vetorial é o único método amplamente utilizado para prevenção e controle
primário das diversas doenças que o Ae. aegypti transmite.
Dessa forma, essas metodologias aqui expostas s constituem numa importante
ferramenta biotecnológica para o desenvolvimento de novos inseticidas que possam
ser utilizados no combate aos vetores das arboviroses.
5 | CONCLUSÕES
Diante dos resultados apresentados conclui-se que os bioensaios de contato

tarsal, corporal e de ingestão são metodologias de fácil execução, baixo custo e muito
eficientes no desenvolvimento de novos inseticidas. Essas metodologias, além de
determinarem a atividade inseticida de determinada substância, permitem estabelecer
qual é a melhor forma de sua utilização, seja por meio de aplicação em superfícies,
seja por aplicação direta na forma de spray, ou ainda na forma de iscas alimentares.

REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 11
COMPOSTOS BIOATIVOS E POTENCIAL

NUTRACÊUTICO DO FRUTO DE BURITI (Mauritia
flexuosa L) NA TERAPIA COADJUVANTE EM
PORTADORES DE DISLIPIDEMIA
Joilane Alves Pereira-Freire e caracterizadas por níveis elevados de

Departamento de Nutrição, Universidade Federal colesterol e triglicérides. O tratamento para
do Piauí, Picos - Piauí dislipidemias deve ser medicamentoso com
Vivianne Rodrigues Amorim associação de mudanças na dieta habitual e o
Departamento de Biofísica e Fisiologia, acréscimo de suplementação alimentar. Diante
Laboratório de Cancerologia Experimental,
disso, os compostos nutracêuticos, despontam
Universidade Federal do Piauí, Teresina - Piauí
como uma alternativa para o tratamento de
Fernanda Maria de Carvalho Ribeiro doenças crônicas. Dentre as plantas do bioma
Departamento de Nutrição, Universidade Federal
nordestino tem-se o buriti (M. flexuosa), rico
do Piauí, Picos – Piauí
em substâncias bioativas como compostos
Stella Regina Arcanjo Medeiros
fenólicos, flavonoides, ácido ascórbico e beta
Departamento de Nutrição, Universidade Federal
do Piauí, Picos - Piauí caroteno e com grande potencial nutracêutico
em terapia coadjuvante em portadores de
Jurandy do Nascimento Silva
, Laboratório de Cancerologia Experimental, dislipidemia. O presente trabalho analisa partes
Universidade Federal do Piauí, Teresina - Piauí de subprodutos do fruto de M. flexuosa que
conseguiram reduzir de maneira significativa os
Paulo Michel Pinheiro Ferreira
Departamento de Biofísica e Fisiologia, níveis de triglicerídeos e colesterol total quando
Laboratório de Cancerologia Experimental, avaliada em tratamento subagudo de 28 dias
Universidade Federal do Piauí, Teresina - Piauí consecutivos com administração oral de casca
(epicarpo), polpa (mesocarpo) e endocarpo do
buriti.
PALAVRAS-CHAVE: Compostos bioativos.
RESUMO: Em decorrência das mudanças
Bioma nordestino. Potencial nutracêutico.
no estilo de vida do brasileiro, com aumento
Dislipidemias
do sedentarismo e hábitos alimentares
inadequados, além de outros fatores genéticos
ABSTRACT: As a result of changes in the
e ambientais, é possível perceber um relevante
Brazilian lifestyle, with an increase in sedentary
crescimento de dislipidemias na população,
lifestyle and inadequate eating habits, in
desde idades cada vez mais precoces. As
addition to other genetic and environmental
dislipidemias são conhecidas como distúrbios
factors, it is possible to perceive a significant
nos níveis dos lipídeos e/ou lipoproteínas
growth of dyslipidemias in the population, from

earlier ages. Dyslipidemias are known as disorders of lipid and / or lipoprotein levels
and characterized by elevated levels of cholesterol and triglycerides. The treatment for
dyslipidemias should be medicated with an association of changes in the usual diet and
the addition of food supplementation. Therefore, nutraceutical compounds appear as
an alternative for the treatment of chronic diseases. Among the Brazilian native plants
are buriti (M. flexuosa), rich in bioactive substances such as phenolic compounds,
flavonoids, ascorbic acid and beta carotenes and with great nutraceutical potential
in adjuvant therapy in patients with dyslipidemia. The present study shows results in
which parts of M. flexuosa fruit by-products were able to significantly reduce triglyceride
and total cholesterol levels when evaluated in 28 consecutive days subacute treatment
with oral administration of peel (epicarp), pulp (mesocarp) and endocarp of the fruit of
M. flexuosa, buriti.
KEYWORDS: Bioactive compounds. Buriti palm. Nutraceutical Potential. Dyslipidemias
1 | INTRODUÇÃO
Em decorrência do estilo de vida atual, que inclui estresse, sedentarismo,

tabagismo, alcoolismo, uso de contraceptivos orais, bem como alterações no
comportamento alimentar, os quais são influenciados pela cultura, sazonalidade,
condições socioeconômicas, entre outros fatores, o homem fica exposto a uma gama
de riscos para doenças da modernidade que por sua vez são um grande desafio da
epidemiologia nutricional (VOLP et al, 2009).
Segundo a OMS (2013), mais de 20 milhões de pessoas morrerão por doenças
cardiovasculares em 2030. Dados descritos pelo Data SUS afirmavam que no Brasil,
as doenças do aparelho circulatório foram responsáveis pela segunda maior taxa de
mortalidade, a partir de internações pelo SUS, em 2012.
As dislipidemias são doenças crônicas que podem impactar o risco
cardiovascular e a sua associação com a doença aterosclerótica é amplamente aceita
pela comunidade científica (XAVIER et al, 2013).
As dislipidemias são conhecidas como distúrbios nos níveis dos lipídeos e/
ou lipoproteínas no sangue e, são caracterizadas por índices altos de colesterol e
triglicérides. Estes distúrbios são causados por alterações metabólicas resultados de
maus hábitos alimentares, associados com fatores genéticos e falta de atividade física
(SANTOS; CARDOSO; AMARAL, 2014).
Alterações no lipidograma podem sinalizar para ocorrência das dislipidemias,
que podem ser classificadas como hipercolesterolemia isolada (elevação de LDL);
hipertrigliceridemia isolada (elevação de TG); hiperlipidemia mista (elevação de
colesterol e TG) e diminuição isolada do HDL colesterol (XAVIER et al., 2013). O
tratamento para dislipidemias pode ser através de medicamentos em casos mais
graves e através de medidas não medicamentosas, principalmente com a mudança
na alimentação e se possível com suplementação alimentar (ABADI E BUDEL,

2014), com isso, há um importante aumento da produção de alimentos específicos,
visando a promoção, prevenção e manutenção da saúde. Baseados neste conceito
de alimentação saudável surgiram os compostos nutracêuticos (VANENZUELA et al.,
2014).
Diversas nomenclaturas e alegações têm confundido os consumidores sobre as
diferenças entre nutracêuticos e alimentos funcionais, no entanto é bom se esclarecer
que os nutracêuticos geralmente são apresentados em formulações farmacêuticas
(ex: cápsulas), enquanto alimentos funcionais são os alimentos in natura, ou seja, o
alimento em si, pronto para o consumo (ex: acerola rica em vitamina C) (GOMES et
al, 2017).
Estudos clínicos desenvolvidos pela European Association for Cardiovascular
Prevention & Rehabilitation em pacientes que apresentam hipercolesterolemia,
demonstraram que o uso de nutracêuticos foi eficaz na redução do perfil lipídico
plasmático (EUROPEAN, 2011); corroborando com esta afirmação CICERO (2016) e
KARL et al (2012) afirmam que uso dos nutracêuticos são ferramentas eficazes para
melhorar o perfil lipídico e contribuir com a prevenção de doenças cardiovasculares.
Dentre as plantas nativas de solo brasileiro tem-se a Mauritia flexuosa também
conhecida como buriti, coqueiro-buriti, miriti, muriti, muritim, palmeira-dos-brejos,
carandá-guaçu e carnadaí-guaçu, é uma palmeira da família Palmae, que vegeta as
regiões alagadas e úmidas do Centro-Oeste, Norte e Nordeste do Brasil (BATISTA et
al, 2011).
O buriti tem demonstrado elevado potencial nutricional e econômico com base
no desenvolvimento de biotecnologia sustentável e utilização de recursos naturais,
no entanto, na indústria alimentícia brasileira, a casca e o endocarpo são comumente
descartados ou subutilizados, em detrimento da utilização da polpa no preparo de
doces, sorvetes, sucos, compotas e mingaus, além da extração do óleo (CHAVES et
al., 2015). Além disso, alguns estudos enfatizam as potencialidades farmacológicas
de partes da M. flexuosa, como antimicrobianos (SIQUEIRA et al., 2014), antitumorais
(SIQUEIRA et al., 2014), hipolipemiantes (AQUINO et al., 2016), hipoglicemiantes
(BATAGLION et al., 2014) e com ação de cicatrização (BATISTA et al., 2012). Assim o
presente trabalho busca expor os compostos biologicamente ativos do buriti (Mauritia
flexuosa l) e com base nesses dados propor um fruto com potencial nutracêutico em
terapia coadjuvante em portadores de dislipidemia.
2.1 Produção das farinhas liofilizadas a partir dos subprodutos de buriti
Foram coletados 300 frutos de buriti (Mauritia flexuosa L.) na cidade de Água
Branca, município do estado do Piauí, esses frutos foram selecionados quanto à

sanidade e um mesmo estádio de maturação, em seguida, higienizados em água
corrente contendo 25 ppm de hipoclorito de sódio comercial. Posteriormente, a
polpa (PL), casca (CL) e o endocarpo (EL), foram liofilizados e analisados após esse
processo, conforme metodologia descrita em PEREIRA-FREIRE et al., 2018 (Figura
1).
FIGURA 1. Processamento das farinhas a partir dos frutos de M. flexuosa
As amostras liofilizadas foram acondicionadas em embalagens plásticas e sob

refrigeração, para em seguida serem processadas (pulverização) em moinho de rotor
tipo ciclone (TE-651/2-TECNAL) até a obtenção de um pó homogêneo (0,5 mesh) –
Figura 1.
2.2 Toxicidade subaguda com avaliação do perfil lipídico
2.2.1 Preparo do extrato aquoso e metanólico
As três amostras do fruto de buriti, após o processo de desidratação por liofilização

e processamento em moinho rotor até a obtenção de um pó homogêneo (0,5 mesh),
foram posteriormente submetidas à extração com solução aquosa e metanólica
por maceração em gral de pistilo durante 10 minutos (1/10, amostra/solvente) até
obter uma consistência uniforme. Em seguida, foi realizado o armazenamento dos
extratos metanólico e aquoso em 4 °C por até 2 dias para procedimento das análises
de quantificação dos compostos bioativos (fenóis, flavonoides, acido ascórbico,
carotenoides e taninos) e o estudo de toxicidade subagudo foi desenvolvido com o
extrato aquoso, preparado a cada 2 dias.

2.2.2 Compostos Bioativos
Realizou-se a determinação de fenóis, flavonoides, carotenoides e taninos

condensados e hidrolisáveis, bem como a caracterização fitoquímica por CLAE /
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para análise qualitativa, segundo
metodologia descrita em PEREIRA-FREIRE et al., 2018.
2.2.3 Toxicidade e análise bioquímica
Nesse protocolo foram utilizados 7 camundongos por grupo, sendo todos fêmeas
da linhagem Swiss, nulíparas, não grávidas, saudáveis, com 3 meses de idade e média
de 30,0 ± 0,10 g, todos provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do
Piauí. Foram administradas as doses de 300 e 600 mg/kg de cada amostra (polpa,
casca e endocarpo) além do grupo veículo (água, v.o. 1mL/100g). A administração
foi realizada por via oral durante 28 dias consecutivos, sempre no mesmo horário,
respeitando o ciclo claro/escuro. Após os 28 dias foram feitas as análises bioquímicas.
O protocolo completo e metodologias estão descritas no trabalho original de PEREIRA-
FREIRE et al., 2018.
3.1 Compostos bioativos
Os resultados da triagem dos compostos bioativos (CB) de partes do fruto de buriti

estão descritos na Tabela 1. A casca foi a amostra que apresentou maiores valores
para fenóis, flavonoides, carotenoides e taninos, quando comparado com a polpa e o
endocarpo (p<0,05). E na polpa, houve predominância de todos os CB avaliados em
relação ao EL (p<0,05).
Classe dos compostos * Polpa Casca Endocarpo

Fenois totais
553,5 ± 7,7 b 1288,0 ± 10,4 a,c 597,1 ± 6,5 b
(mg EAG/100 g AM)
Flavonoides totais
264,4 ± 2,1 b,c 339,4 ± 3,9 a,c 145,4 ± 10,2 a,b
(mg EQE/100 g AM)
Carotenoides totais
58,9 ± 0,1 b,c 88,3 ± 0,3 a,c 19,1 ± 0,2 a,b
(mg βCTE/100 g AM)
Taninos hidrolisáveis
47,4 ± 0,3 b,c 56,1 ± 0,4 a,c 0,1 ± 0,0 a,b
(mg ACT/100g AM)
Taninos condesados
69,6 ± 1,8 b,c 118,3 ± 2,1 a,c 36,5 ± 1,2 a,b
(mg CTQ/100g AM)
Tabela 1 - Quantificação (mg/100g amostra) de fenóis, flavonoides, carotenoides, taninos

condensados e hidrolisados em extratos metanólicos de polpa, casca e endocarpo liofilizados
de buriti.
Os valores representam a média ± E.P.M. ap < 0,05 em relação à polpa (0,5 mg/mL). bp < 0,05 em relação à
casca (0,5 mg/mL). cp < 0,05 em relação ao endocarpo (0,5 mg/mL) (ANOVA e Neuman-Keuls como post hoc
teste).

A casca liofilizada do fruto apresentou os maiores valores para todos os
compostos bioativos, quando comparada com as demais amostras (Tabela 1). Em
todas as partes da planta, existe a presença de compostos fenólicos totais, flavonoides
totais, ácido ascórbico e beta caroteno.
De fato, estudos anteriores demonstraram que extratos de polpa de Buriti da
região amazônica têm principalmente ácido quínico, ácido cafeico, ácido clorogênico,
ácido ferúlico, p-Cumárico, protocatecúico, catequina, epicatequina, luteolina,
apigenina, miricetina, canferol e quercetina, alguns deles são encontrados também
em concentrações mais baixas (BATAGLION et al., 2014). A análise por cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) também demonstra que o buriti é uma excelente
fonte de carotenóides (44600 μg / 100 g), especialmente α- e β-caroteno e cis- e
trans-ᵞ-caroteno, que normalmente são encontrados em cenouras, fonte de vitamina
A mais conhecida e aceita pelos consumidores, justificando seu uso no tratamento de
hipovitaminose A (LIMA et al., 2009; SANTOS et al., 2015, AQUINO et al. 2015).
Os resultados do screening fitoquímico apresentaram diferenças por 100g
de material seco, considerando que as amostras de buriti da atual pesquisa foram
coletadas em condições naturais do Cerrado brasileiro (um tipo de savana). Porém, a
maioria dos estudos revisados apresentou resultados com frutos da região amazônica.
Essas diferenças podem ser explicadas por variações nas condições do bioma, já que
a Amazônia é quente e úmida, enquanto o Cerrado apresenta um clima mais seco.
Além disso, o Cerrado é mais ácido e rico em sais de alumínio, o que provavelmente
irá gerar maior estresse oxidativo para as plantas que reagem produzindo agentes
antioxidantes (CÂNDIDO, SILVA, AGOSTINI-COSTA, 2015).
De um modo geral, os antioxidantes estão presentes em pequenas quantidades
nos alimentos e nas plantas. A busca por novos compostos antioxidantes é o foco
principal de muitas pesquisas devido à participação dos radicais livres no surgimento
e progresso de doenças crônicas e, sobretudo, ao aumento da expectativa de vida
populacional.
3.2 Caracterização fitoquímica por HPLC das amostras de buriti
Os resultados da caracterização fitoquímica de extratos metanólicos de polpa,

casca e endocarpo de buriti, identificados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,
descritos nos cromatogramas das Figuras 2 (A, B e C) e Tabela 2. Os cromatogramas
foram obtidos no comprimento de onda de detecção de 230 nm, visto que, nele os
compostos fenólicos apresentam os máximos de absorção, além da obtenção de
melhores perfis cromatográficos.
A correlação dos picos cromatográficos foi obtida pela comparação dos tempos
de retenção (tR) com padrões de referência. Todas as análises cromatográficas
foram realizadas em triplicata e revelaram compostos fenólicos (ácido protocatecuico,
quercetina, apigenina, catequina e epicatequina) com os seguintes tR: 16,3, 33,6,
41,7, 53,6 e 49,3 minutos, respectivamente (Tabela 2).
Figura 2 - Perfil cromatográfico obtido por CLAE-DAD para (A) extrato metanólico de polpa, (B)
casca e (C) endocarpo (230 nm).
Tempo de
Nome IUPAC Estrutura química Classe Retenção Amostra
(min)
Ácido 3,4-dihidroxibenzoico
(ácido protocatecúico) Fenol 16,3 Polpa
2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-
trihidroxichromen-4-ona Flavonoide 33,6 Polpa
(quercetina)

4′,5,7-trihidroxiflavona Polpa
Flavonoide 41,7
(apigenina) Endocarpo
(−)-trans-3,3′,4′,5,7-
pentahidroxiflavona, (2S,3R)-2- Endocarpo
Tanino
(3,4-dihidroxifenil)-3,4-dihidro- 53,6 Casca
Condensado
1(2H)-benzopiran-3,5,7-triol Polpa
(catequina)
(−)-cis-3,3′,4′,5,7-
pentahidroxiflavona, (2R,3R)-2-
Tanino
(3,4-dihidroxifenil)-3,4-dihidro- 48,3 Casca
condensado
1(2H)-benzopiran-3,5,7-triol
(epicatequina)
Tabela 2 – Identificação de compostos por HPLC em amostras de partes do fruto de buriti.
Pesquisas recentes afirmam que os compostos fenólicos tem a capacidade

antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória e cardioprotetora; seu estudo é
importante porque seus subprodutos são de interesse para as indústrias de alimentos,
nutracêutica, farmacêutica e química, principalmente devido à possibilidade de
aproveitar os resíduos, ricos em compostos fenólicos, para produção de extratos e
novos produtos de manutenção da saúde humana. A extração desses compostos
de materiais derivados das práticas industriais representa uma alternativa atrativa,
sustentável e de baixo custo para obter bioativos com alto valor biológico, os quais
podem ser incorporados em alimentos (JARA-PALACIOS et al., 2015).
Os flavonoides são substâncias importantes devido às suas diversas atividades
sobre os vários sistemas biológicos, em especial, sobre o sistema cardiovascular
(SILVA et al, 2015). Os flavonoides se apresentam como uma fonte promissora no
desenvolvimento de medicamentos para o tratamento da Doença de Alzheimer e outras
doenças crônico-degenerativas não transmissíveis como dislipidemia entre outras
doenças, devido ao seu largo espectro de atividades farmacológicas, principalmente
pela capacidade de se ligar aos polímeros biológicos (enzimas, hormônios e DNA),
bem como agir como quelantes de íons metálicos (Fe2+, Cu2+, Zn2+), catalisando
transporte eletrônico e impedindo a formação de radicais livres, além da baixa
toxicidade (NASCIMENTO et al, 2015).
Por fim os resultados demonstram por cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC) que o buriti é uma excelente fonte de beta caroteno (44600 μg/100g), destes
70% são de β-caroteno, 12% de α-caroteno e 1,6% de luteína, estando acima dos
teores normalmente encontrados em cenoura, uma fonte muito conhecida e aceita

pelos consumidores, tais dados justificam a utilização do fruto de buriti no combate à
hipovitaminose A (AQUINO et al., 2015).
Nos últimos anos, o mercado brasileiro de produtos naturais está em franca
expansão, acompanhando uma tendência mundial e isso se deve ao argumento de que
as plantas e compostos naturais são eficazes, seguros e isentos de efeitos adversos,
além de apresentarem atividade terapêutica específica (RECKZIEGEL et al., 2011).
Entretanto, em sua maioria, essas indicações terapêuticas possuem fundamentação
apenas em hábitos e costumes populares, sem comprovação farmacológica ou
mesmo estudos de toxicidade pré-clínicos. Tais produtos naturais possuem uma
ampla variabilidade de constituintes químicos e isso reflete em diferentes mecanismos
biológicos, farmacológicos e toxicológicos, assim como interfere também sobre sua
eficácia e segurança.
Perfil bioquímico
Polpa Casca Endocarpo
Controle
Parâmetros 300 mg/ 600 mg/ 300 mg/ 600 300 mg/ 600 mg/
negativo
kg kg kg mg/kg kg kg
Triglicerídeos 149,20 ± 128,50 ± 119,30 ± 102,20 ± 99,33 ± 111,80 ± 106,30 ±
(mg/dL) 2,72 0,43* 0,67* 2,87* 2,58* 1,30* 0,67*
Colesterol 104,90 ± 79,43 ± 82,14 ± 87,00 ± 87,14 ± 82,43 ± 90,86 ±
Total (mg/dL) 1,14 3,36* 4,58* 2,01* 1,62* 4,52* 1,97*
49,50 ± 56,43 ± 54,67 ± 52,83 ± 62,33 ± 52,83 ± 52,17 ±
HDL (mg/dL)
1,33 3,10 3,15 2,60 1,45* 2,96 1,70
TABELA 3. Perfil bioquímico de camundongos Swiss tratados via oral por gavagem com
extratos da polpa, casca e endocarpo de Mauritia flexuosa em doses repetidas por 28 dias.
Os dados apresentados na tabela 3 fazem parte de um estudo mais completo

de toxidade subaguda desses subprodutos em que foi avaliado diversos parâmetros
bioquímicos e hematológicos (PEREIRA-FREIE, 2017) e recorte desses dados estão
aqui apresentados e sugerem que o buriti reduziu de forma significativa os níveis
de triglicerídeos e colesterol total nas três partes da planta avaliadas e que também
conseguiu elevar o HDL na casca na dose de 600 mg/Kg. É importante destacar que o
protocolo desenvolvido nessa pesquisa, não foi específico para dislipidemias e sim um
estudo de toxicidade dos subprodutos do fruto de buriti, porém evidenciou-se dados
relevantes sobre o perfil lipídico desses animais durante o tratamento. Entretanto,
mais pesquisas devem ser desenvolvidas para a compreensão e elucidação desses
mecanismos de ação e propriedades farmacológicas do buriti.
Ainda assim, é necessário frisar que o consumo de alimentos ricos em fibras
solúveis pode auxiliar na redução da glicemia e do colesterol (MUDGIL; BARAK,
2013), e os bioprodutos de buriti, especialmente a polpa, apresentaram quantidade
relevante de fibras solúveis, o que proporciona viscosidade e capacidade para formar
géis e/ou atuam como emulsionantes, melhorando o perfil glicídico e lipídico. Outros
pontos importantes a ressaltar são:

a) Os ácidos graxos presentes no fruto que são tipicamente insaturados, os quais
podem atuar favoravelmente na redução dos lipídios séricos (DARNET et al., 2011;
AQUINO et al 2015, 2016);
b) Extratos de diferentes partes da Mauritia flexuosa (folha, caule e fruto) possuem
quantidades significantes de compostos fenólicos, principalmente ácido clorogênico e
o protocatecuico (KOOLEN et al., 2013). Ambos reduzem a síntese de ácidos graxos,
por inibir a atividade da HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
redutase), sugerindo que eles possuem efeitos biológicos sobre o peso corporal, o
metabolismo lipídico e níveis de hormônios relacionados à obesidade como leptina e
adiponectina (CHO et al., 2010);
c) O ácido protocatecuico possui atividade hipoglicemiante e efeitos benéficos
sobre o tecido adiposo, devido as suas propriedades anti-inflamatórias e sensibilidade
à insulina, de modo que ele se revelou como protetor contra a resistência à insulina
(BATAGLION et al., 2014, SCAZZOCCHIO et al., 2015). Este composto fenólico e
muitos outros foram identificados nas amostras de polpa, casca e endocarpo de buriti,
conforme resultados previamente descritos;
d) Ratos jovens alimentados de forma suplementar com óleo refinado de buriti
mostraram redução do colesterol total, da lipopreína de baixa densidade (LDL), de
triglicerídeos e da enzima aspartato transaminase em comparação àqueles alimentados
com dieta adicionada de óleo cru. Algumas análises fitoquímicas demonstraram que
em óleo cru extraído da M. flexuosa existe maiores concentrações de fitoesteróis,
vitaminas, antioxidantes e pigmentos (AQUINO et al., 2015; MILANEZ et al., 2016),
substâncias que estão frequentemente associadas à redução de colesterol sérico e do
estresse oxidativo.
4 | CONCLUSÃO
Com base nos dados expostos, as farinhas produzidas a partir de subprodutos do

fruto buriti demonstraram potencial terapêutico com possível ação hipocolesterolêmica,
abrindo possibilidades para estudos futuros que vislumbrem a elaboração de
nutracêuticos com características hipolipemiantes e desse modo ser útil em terapia
coadjuvante em portadores de dislipidemias, uma vez que os bioprodutos do buriti
utilizados nessa pesquisa são ricos em compostos bioativos, frequentemente
associados à redução de colesterol sérico e ao estresse oxidativo.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo público brasileiro agência

“Fundação do Amparo” a Pesquisa do Estado do Piauí [FAPEPI (concessão nº
004/2016)]. Os autores correspondentes são gratos a todos que contribuiram direta
ou indiretamente .O coautor Dr. Paulo Michel Pinheiro Ferreira também agradece
ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico [CNPq
(#305086/2016-2)] pelo reconhecimento científico na forma de bolsa de produtividade.
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CAPÍTULO 12
DESENVOLVIMENTO DE MICROPARTÍCULAS DE
ALGINATO DE CÁLCIO PARA IMOBILIZAÇÃO DE
Chlorella vulgaris
Felipe de Albuquerque Santos O procedimento foi realizado em fluxo laminar

Universidade Tecnológica Federal do Paraná, com uma bomba peristáltica a 31 rpm, com
Ponta Grossa – Paraná saída da solução para gotejamento por ponteira
Eduardo Bittencourt Sydney de micropipeta de 200µL, inclinada 45º sobre a
Universidade Tecnológica Federal do Paraná, solução de cloreto de cálcio 125mM, e fluxo de
Ponta Grossa – Paraná
ar proveniente do biorreator com vazão de 10L.
Alessandra Cristine Novak Sydney min-1. Depois de encapsuladas, as partículas
Universidade Tecnológica Federal do Paraná,
obtidas foram colocadas em frasco Erlemeyer
Ponta Grossa – Paraná
contendo meio de cultivo (MBM – Meio Bristol
modificado), e outro frasco, contendo apenas
células livres e meio de cultivo, foi utilizado
RESUMO: A microalga Chlorella vulgaris é como controle. Os cultivos foram mantidos a
amplamente estudada e comercializada. Os 25ºC, em fotoperíodo 12h:12h durante 7 dias.
custos de produção de microalgas devem ser O desenvolvimento de micropartículas para
continuamente reduzidos, visando aumentar imobilização de Chlorella vulgaris possibilita
a sua competitividade. O objetivo do presente estudos sobre a aplicação da mesma no
estudo foi analisar a viabilidade de crescimento da tratamento de resíduos, suplementação
microalga Chlorella vulgaris, aspirando diminuir alimentar e produção de energia.
os custos com a recuperação das suas células, PALAVRAS-CHAVE: Imobilização, Chlorella
que poderiam ser simplesmente filtradas ao vulgaris, Downstream.
invés de centrifugadas (método convencional).
Uma das alternativas para recuperação das ABSTRACT: The microalgae Chlorella vulgaris
células é o método de imobilização celular. is widely studied and commercialized. The
Dentre os métodos de imobilização, o método costs of producing microalgae should be
do gelificação iônica é baseado no gotejamento continuously reduced in order to increase their
de alginato de sódio sobre solução de cloreto competitiveness. The objective of the present
de cálcio, formando alginato de cálcio, que study was to analyse the viability of growth of
produz uma estrutura em rede tridimensional. A the microalga Chlorella vulgaris, in order to
estabilidade, rigidez e esfericidade adequadas reduce the costs of recovering its cells, which
das partículas são condições fundamentais para could be simply filtered instead of centrifuged
o fluxo de nutrientes entre o meio e as células. (conventional method). One of the alternatives

for cell recovery is the cell immobilization method. Among the immobilization methods,
the ionic gelling method is based on the drip of sodium alginate on calcium chloride
solution, forming calcium alginate, which produces a three-dimensional network
structure. Suitable stability, stiffness and sphericity of the particles are fundamental
conditions for the flow of nutrients between the medium and the cells. The procedure
was carried out in laminar flow with a peristaltic pump at 31 rpm, with solution outlet
for dripping by a micropipette tip of 200μL, inclined 45º on the solution of calcium
chloride 125mM, and air flow from the bioreactor at 10 L.min-¹. After encapsulation, the
obtained particles were placed in a flask containing culture medium (MBM), and another
flask, containing only free cells and culture medium, was used as a control. Cultures
were maintained at 25°C, in photoperiod 12h: 12h for 7 days. The development of
microparticles for immobilization of Chlorella vulgaris enables studies on its application
in waste treatment, food supplementation and energy production.
KEYWORDS: Immobilization, Chlorella vulgaris, Downstream.
1 | INTRODUÇÃO
A biotecnologia consiste em um vasto campo que estuda a utilização de sistemas

e constituintes celulares para serem aplicados na indústria e, posteriormente, em
produtos do cotidiano das pessoas. Dessa maneira, torna-se um ramo essencial no
desenvolvimento econômico1.
A cada dia que passa, aumenta-se a necessidade do uso de ativos biotecnológicos
para diversos fins, seja para tratamento de efluentes, fixação de CO2 proveniente de
termoelétricas, produção de biocombustíveis, suplementos nutritivos, utilização de
microrganismos geneticamente modificados, dentre outros. Porém, esses ativos são
muitas vezes perdidos durante os processos, ou então têm baixo reaproveitamento
devido às dificuldades de se trabalhar com os microrganismos livres. Devido a esse fato,
busca-se novos meios de reutilizar os ativos biotecnológicos e, por isso, é necessário
desenvolver e aplicar técnicas eficazes de reaproveitamento desses ativos, sem que
haja danos aos mesmos.
Dentre os ativos biotecnológicos em evidência atualmente, encontra-se a microalga
Chlorella vulgaris. Possui alto potencial econômico, pois é utilizada para produção de
suplementos alimentares ricos em ferro e no tratamento de resíduos abundantes em
nitrogênio e fósforo. Particularmente, a Chlorella vulgaris é uma espécie unicelular
de água doce pertencente à classe Chlorophyceae, ordem Chlorococcales e família
Oocystaceae. Pode acumular pigmentos como clorofila a e b, β-caroteno e xantofilas
2
. Visto que a microalga em estudo é amplamente comercializada, um dos grandes
desafios é reduzir os custos de sua obtenção para aumentar sua competitividade no
mercado.
O método tradicional de obtenção Chlorella vulgaris é por meio da centrifugação.
Entretanto, esse é um método relativamente dispendioso. Além disso, apresenta

reaproveitamento baixo, pois há perda de biomassa durante o processo.
Um dos meios alternativos de obtenção e reaproveitamento da Chlorella vulgaris
é através da imobilização celular. O processo de imobilização é caracterizado pela
restrição da mobilidade do ativo em um espaço confinado, suportando assim altas
concentrações celulares, implicando em maiores velocidades de processamento 3.
Algumas vantagens da imobilização celular são a eliminação do uso de métodos de
reciclos externos para obtenção do ativo, possibilitando, por exemplo, reciclos simples
como a filtração. Além disso, há maior proteção das células de estresse ambiental,
como altas concentrações de pH, substrato e cisalhamento 4. A imobilização de células
consiste no contato entre o material imobilizador e as células vivas, sob condições
controladas. Existem basicamente três métodos de imobilização celular: adsorção,
ligação covalente e envolvimento.
Devido ao baixo custo e menor complexidade, o método de imobilização mais
utilizado é por envolvimento. Este método fundamenta-se no princípio de gotejamento
de uma solução polimérica acrescida de células vivas sobre uma solução de CaCl2 4.
Dentre as soluções poliméricas, também chamadas de suporte, encontra-se o
alginato. O alginato é um polímero natural e, atualmente, um dos mais utilizados para
encapsulamento de células vivas. Não possui toxicidade, é biocompatível e apresenta
elevada resistência mecânica 5. O alginato comercial é extraído de algas marrons,
principalmente de diferentes espécies do gênero Laminaria (L. hyperborea, L. digitata,
L. japonica) e do gênero Sargassum (Macrocystis pyrifera, Ascophillum nodosum,
Lesonia negrescens). O alginato de sódio é um polímero linear composto por ácido
β-D-manurônico (M) e ácido α-L-gulorônico (G). M e G são as unidades monoméricas.
Os monômeros se agrupam em séries de MM, GG e MG 6.
Quando a solução de alginato contendo células de Chlorella vulgaris cai sobre a
solução de CaCl2, formam-se gotas insolúveis em água e de alta viscosidade. Apesar
disso, as condições de sobrevivência do ativo imobilizado são mantidas, visto que há
o fluxo de substâncias e a conservação metabólica 7.
Quando as estruturas gulorônicas reagem com íons Ca2+, forma-se uma espécie
de caixa de ovos. Essa espécie de “egg-box” foi assim denominada por Grant, seu
descobridor 8. O alginato modifica sua forma linear ao reagir com íons cálcio divalentes,
gerando uma rede tridimensional, ampliando a possibilidade de mais íons cálcio
reagirem com o alginato, formando estruturas cada vez mais complexas, assim como
representado na figura 1.

Figura 1. Modelo “egg-box” do alginato.
Fonte: Bressel, 2007.
Entretanto, sabe-se que quanto menor a partícula, mais organizada torna-se

essa estrutura tridimensional 9. Portanto, há melhor fluxo de nutrientes do meio de
cultura para as células e maior sobrevivência das mesmas. Daí decorre a importância
em desenvolver micropartículas capazes de assegurar o crescimento celular, uma vez
que a faixa de tamanhos de micropartículas oscila de 1µm a 999µm 10.
O desenvolvimento de micropartículas não é simples, visto que a solução de
alginato acrescida de células é altamente viscosa, além do que, requer materiais
sofisticados e caros. Portanto, adaptou-se um sistema gerador de micropartículas
utilizado em uma tese de doutorado da UFRGS 6, com algumas modificações a fim de
produzir micropartículas para imobilizar a microalga Chlorella vulgaris.
Com o intuito de desenvolver micropartículas estáveis e uniformes, vários fatores
precisam ser levados em consideração, como: concentração do alginato, altura de
gotejamento, diâmetro da ponteira, fluxo de gotejamento da bomba peristáltica 11. O
fluxo de ar constante é outro fator que influencia na formação de micropartículas 6.
O objetivo principal desse estudo é desenvolver partículas de alginato de cálcio
entre 1µm a 999µm capazes de permitirem o desenvolvimento celular da microalga
Chlorella vulgaris. Os objetivos particulares do estudo são: propor uma altura de
gotejamento adequada para formação de partículas esféricas; formular, baseado na
literatura, a concentração ideal da mistura alginato de sódio e cloreto de cálcio para
formar esferas rígidas; demonstrar o crescimento do cultivo do ativo imobilizado.
A pesquisa foi realizada no laboratório de Fermentações na Universidade

Tecnológica Federal do Paraná, câmpus Ponta Grossa.
Cultivo de cultura de células. As células da microalga Chlorella vulgaris foram
cultivadas em MBM (Meio Bristol Modificado) à temperatura de 25±1ºC, sob iluminação
de 2 lâmpadas fluorescentes de 15W, fluxo luminoso de 788,8 lux cada, em uma sala

do laboratório de Fermentações da UTFPR, câmpus Ponta Grossa em um erlenmeyer
de 6L.
Centrifugação das células de Chlorella vulgaris. No fluxo laminar, foi retirada
uma alíquota de 800mL de um Erlemeyer contendo 6L do cultivo de cultura inicial.
Essa alíquota foi distribuída em 16 tubos Falcon e centrifugada a 5000 rpm durante
30 minutos. Esse método foi baseado na literatura, com a diferença no tempo de
centrifugação12. Descartou-se o sobrenadante, deixando 12,5mL em cada tubo Falcon.
De cada tubo, retirou-se uma amostra de 6,25mL para adicionar na solução de 100mL
de alginato 3%, totalizando uma solução de alginato acrescida do ativo 1,5%. Ainda
foram misturados 6,25mL restantes do ativo de cada tubo Falcon a 100mL de água
destilada. Dessa maneira, preparou-se a solução para produzir micropartículas e a
solução de controle.
Preparação de micropartículas com Chlorella vulgaris imobilizada. No fluxo
laminar, foi montado um sistema contendo uma solução 1,5% de alginato acrescida
de células de Chlorella vulgaris à uma altura de 33cm que passava pela mangueira
da bomba peristáltica à 31rpm e caía sobre uma solução de CaCl2 125mM, através de
uma ponteira de micropipeta 200µL inclinada a 45º e inserida dentro do tubo de fluxo
de ar proveniente do biorreator. A distância da mangueira proveniente do biorreator até
o béquer contendo a solução de CaCl2 é de 1,5m. A altura da seringa até a superfície
da solução de CaCl2 foi de 3cm. O esquema do sistema foi baseado na literatura 6 e
está representado na figura 2. A montagem do sistema está apresentado na figura 3.
As microalgas encapsuladas foram deixadas em banho iônico (CaCl2) por 30
minutos para cura 13. Posteriormente, as micropartículas foram filtradas com peneira
metálica, lavadas com água destilada para remover CaCl2 não-ligado e colocadas em
750mL de MBM.
Figura. 2. Sistema gerador de micropartículas. a) Solução de alginato de sódio acrescida de

Chlorella vulgaris (1,5%). b) Mangueira da bomba peristáltica. c) Bomba peristáltica Watson-

Marlow modelo 120S. d) Ponteira de micropipeta 200µL. e) Solução de CaCl2 125mM. f)
Mangueira de 1,5m provinda do biorreator. g) Suportes auxiliadores. h) Câmara de fluxo
laminar. i) Rotâmetro. j) Biorreator.
Figura 3. Montagem do sistema gerador de micropartículas.
Cultivo das micropartículas imobilizadas e da solução de controle. As

micropartículas foram filtradas com auxílio de uma peneira metálica autoclavada e
colocadas em um Erlenmeyer contendo 750mL de MBM. A solução de controle (100mL
de células livres + 100mL de água destilada) foi adicionada em outro Erlenmeyer
contendo 750mL de MBM. Ambas as amostras foram expostas às mesmas condições:
temperatura de 25±1ºC, sob iluminação de 2 lâmpadas fluorescentes de 15W, fluxo
luminoso de 788,8 lux cada, em uma sala do laboratório de Fermentações da UTFPR,
câmpus Ponta Grossa.
Redissolução das micropartículas. As células de Chlorella vulgaris imobilizadas
foram redissolvidas com citrato de sódio 50mM 9 e centrifugadas durante 30 minutos à
5000rpm para posterior realização de contagem do número de células.
Contagem do número de células. A contagem de células foi realizada na Câmara
de Neubauer através do microscópio óptico com aumento final de 400x durante 7 dias.
Medição do tamanho das micropartículas. A medição do diâmetro médio das
partículas foi feita com o auxílio de um micrômetro digital Western MC-3.
Para realizar a imobilização da microalga, baseou-se no sistema gerador de

microcápsulas da fig. 2, porém com algumas mudanças.
O sistema montado na literatura 6
propõe a altura do suporte 50cm acima da
bomba peristáltica. No presente estudo, posicionou-se o copo de béquer contendo
alginato de sódio acrescido de Chlorella vulgaris à uma altura de 33cm acima da
bomba peristáltica, devido à limitações físicas da câmara de fluxo laminar. Entretanto,
verificou-se um fluxo constante da solução até a bomba peristáltica.
Outra mudança foi a ponteira de gotejamento. A literatura sugere a utilização de
agulhas de 22G (0,7mm) 14 à 25G (0,5mm) 6. No entanto, notou-se que a utilização de
uma ponteira autoclavada de micropipeta de 200µL deixaria o sistema mais rígido e
com a mesma eficiência do uso de uma agulha, pois o diâmetro da ponteira usada foi
de 0,65mm, estando dentro dos diâmetros sugeridos pela literatura.
No sistema proposto por 6, utilizou-se um cilindro de ar comprimido conectado
a uma agulha com distância de 80cm entre esses. Neste estudo, utilizou-se fluxo de
ar proveniente do biorreator disponível no laboratório de Fermentações da UTFPR -
câmpus Ponta Grossa, com uma distância de saída da mangueira do biorreator até o
local de gotejamento de 150cm.
Foram realizados alguns testes experimentais para analisar as melhores
condições de formação de micropartículas esféricas e estáveis. Para propósitos
práticos, considera-se que micropartículas rígidas são indicadas para imobilização de
células vivas 7. A necessidade de produzir micropartículas esféricas e estáveis reside
no fato de que há melhor distribuição de células e melhor difusão de oxigênio. Quando
não há distribuição uniforme de oxigênio, as células da superfície migram para o meio
externo, ocasionado o rompimento da matriz 15.
Sabe-se que a altura da ponteira até a superfície da solução de CaCl2 influencia
no formato da partícula 16. Foram realizadas três tentativas de alturas diferentes para
definir a micropartícula mais esférica.
A tabela 1 apresenta a esfericidade das partículas de acordo com a altura de
gotejamento (desde a extremidade da ponteira até a superfície da solução de CaCl2).
Altura de gotejamento (cm) Esfericidade

7 Partícula achatada
5 Partícula com cauda
3 Partícula esférica
Tabela 1. Esfericidade da micropartícula em função da altura do bico gotejador.
(a) (b) (c)

Figura. 4. Micropartículas com diferentes alturas de gotejamento: (a) com altura de 7cm; (b)
com altura de 5cm; (c) com altura de 3cm.
A micropartícula (b) da figura 4 foi produzida sem microalga imobilizada para

melhor representação da cauda produzida. Os resultados demonstram que quanto
maior a altura da ponteira, mais irregular o formato da micropartícula. Isso pode ser
explicado pelo fato de que quanto maior a altura, maior a velocidade de impacto da
gota com a superfície de CaCl2 16.
No presente estudo, a esfericidade ideal da micropartícula foi encontrada a uma
altura de 3cm desde a ponteira até a superfície da solução de CaCl2.
O fluxo da bomba peristáltica é outro fator influencia diretamente no formato
das micropartículas 16. Quanto maior o fluxo da bomba peristáltica, mais irregulares se
tornam as micropartículas 13. Foram realizados testes anteriores e decidiu-se utilizar
o fluxo constante de 140 mL.h-1 na bomba peristáltica como uma média dos fluxos
sugeridos por 13. Intercalou-se diferentes fluxos de ar provenientes do biorreator para
analisar a esfericidade das micropartículas.
A tabela 2 mostra as combinações testadas do fluxo de ar e fluxo da bomba
peristáltica.
Fluxo de ar (L.min-1) Fluxo da bomba peristáltica Esfericidade das

(mL.h-1) micropartículas
8,0 140 Micropartículas com cauda
8,5 140 Micropartículas com cauda
9,0 140 Micropartículas com leve
formato de gota
9,5 140 Micropartículas com leve
formato de gota
10,0 140 Micropartículas esféricas
Tabela 2. Relação do fluxo de ar e da bomba peristáltica com a esfericidade das

micropartículas.
A literatura sugere testar fluxos de ar de até 15 L.min-1 13

, porém o biorreator
utilizado neste estudo tem um fluxo de ar máximo de 10L.min . Portanto, não foram
-1
testadas vazões volumétricas acima desse valor.

O fluxo constante de 140 mL.h-1 foi utilizado porque notou-se que ao aumentar o
fluxo da bomba peristáltica acima de 140 mL.h-1, as partículas começaram a assumir
formato achatado e irregular. Além disso, pelo esquema proposto, ao ultrapassar a
vazão de 140 mL.h-1, começa-se respingar alginato no tubo de fluxo de ar. Isso pode
ocasionar a secagem e acúmulo do alginato na saída do tubo durante o tempo de
produção das micropartículas, ocasionando diferenças significativas no tamanho e na
forma das mesmas.
Outro ponto fundamental a ser analisado para obtenção de partículas esféricas
e rígidas foi a utilização de diferentes combinações de concentrações de alginato

de sódio e cloreto de cálcio 16
. Concentrações de alginato de 1% até 4% em água
são sugeridas e para CaCl2 concentrações de 0,05M a 0,5M 4. Decidiu-se fixar a
concentração de 125mM para o CaCl2 e testar diferentes concentrações de alginato
de sódio. A resistência das micropartículas consta na Tabela 3.
Concentração de Alg. De Concentração de Cloreto de Resistência

sódio (%) Cálcio (M)
1% 0,125 Micropartículas muito frágeis
2% 0,125 Micropartículas Estáveis
3% 0,125 Micropartículas resistentes
Tabela 3. Combinações de concentração de Alginato de sódio e Cloreto de Cálcio.
Três soluções distintas de alginato 1%, 2% e 3% foram preparadas e deixadas

em três Erlenmeyer distintos contendo NaCl 5% durante 10 dias. Notou-se que as
micropartículas contendo alginato 1% e 2% rompiam-se mais facilmente do que a
solução de alginato 3% ao aplicar pressão mecânica. Isso se deve ao fato de que
concentrações mais elevadas de alginato tornam a micropartícula mais rígida devido à
formação de redes tridimensionais mais complexas 17.
Retirou-se uma amostra com 100 micropartículas. Realizou-se uma média
aritmética, que resultou no diâmetro médio de 890µm.
Para comprovar a eficácia da técnica de imobilização, foram realizadas contagens
diárias de células durante 7 dias. Foram contadas células das micropartículas, células
da microalga livre e possíveis células do meio de cultivo ao qual estavam inseridas as
micropartículas.
O gráfico comparativo da concentração de células pelo tempo da microalga
imobilizada com a microalga livre está expresso logo abaixo na Figura 5.
Figura. 5. Gráfico comparativo da microalga imobilizada com a microalga livre.
Nota-se através da Figura 5 que a partir do mesmo inóculo, as microalgas

imobilizadas apresentaram maior crescimento celular em relação às microalgas livres.
No último dia de contagem, as microalgas imobilizadas apresentaram valor de 1,36 x
107 células.mL-1, enquanto que na contagem das microalgas livres foram contabilizadas
6,91 x 106 células.mL-1. Esse fato corrobora a transferência adequada de nutrientes e
de oxigênio do meio para as micropartículas.
Além disso, foi analisado macro e microscopicamente o meio de cultivo das
células imobilizadas, e não foi constatada nenhuma célula livre, o que evidencia que
as partículas de alginato aprisionaram corretamente as células, não permitindo o seu
escape pelos poros.
O pH ideal de crescimento da microalga Chorella vulgaris fica em torno de 5,5 a
8,0 e qualquer mudança afeta diretamente na sua curva de crescimento 2. O pH medido
do meio de cultivo foi 7,0. O resultado da curva seguiu a tendência de crescimento da
microalga Chlorella vulgaris inserida em um meio com esse pH.
4 | CONCLUSÕES
De maneira geral, as micropartículas produzidas obtiveram o tamanho de

diâmetro médio de 890µm, estando dentro da faixa de 1µm a 999µm. A busca de
uma concentração de alginato e cloreto de cálcio, além de uma altura de gotejamento
ideal, permitiram a formação de micropartículas esféricas e rígidas e proporcionaram
o correto crescimento da microalga. A comprovação desse fato está no crescimento
da microalga imobilizada.
O método de imobilização da microalga Chlorella vulgaris foi eficaz para sua
obtenção e reutilização, visto que as micropartículas puderam ser facilmente peneiradas
sem custos além dos materiais utilizados. Nessa perspectiva, o uso deste método
propicia a aplicação da microalga imobilizada para fins de tratamento de resíduos,
nutricionais, produção de energia, dentre outros, com custos mais baixos, pois o custo
de obtenção e reutilização do microrganismo é significativamente menor.
REFERÊNCIAS
1 BORZANI, W.; SCHMIDELL, W; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia Industrial:
Fundamentos. V.1. São Paulo: Edgard Blücher, 2001.
2 Avaliação do crescimento da Chlorella vulgaris em diferentes pH objetivando sua inserção

na matéria-prima do biodiesel. XVII Jornada de Ensino, Pesquisa e Extensão. Universidade Federal
Rural de Pernambuco. 2017.
3 GUISAN, J. M. Immobilization of Ezymes and Cells. Totowa: Humana Press: p.1-13. 2006.
4 BORZANI, W.; SCHMIDELL, W; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia Industrial:

Fundamentos. V.2. São Paulo: Edgard Blücher, 2001.
5 LIMA, A. M. F.; ANDREANI, L.; SOLDI, V. Influência da adição de plastificante e do processo de

reticulação na morfologia, absorção de água e propriedades mecânicas de filmes de alginato
de sódio. Química Nova, v. 30, No. 4, p. 832-837, 2007.

6 BRESSEL, T.A.B. Sistema gerador de microcápsulas de alginato. Tese de Doutorado em
Genética e Biologia Molecular – UFRGS. Porto Alegre, p. 56, 2007.
7 MARTINSEN, A.; SKJÄK-BRAEK, G.; SMIDSROD, O. Alginate as immobilization material: I.

Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads. Biotechnology and
Bioengeneering, v. 33, p. 79 – 89, 1989.
8 GRANT, G.T.; MORRIS, E.R.; REES, D.A.; SMITH, P.J.C.; THOM, D.. Biological interactions
between polysaccharides and divalent cations: The egg-box model. FEBS Letters, v. 32, p. 195-
198, 1973.
9 SIMPSON, N. E.; GRANT, S. C.; BLACKBAND, S. J.; CONSTANTINIDIS I. NMR properties of

alginate microbeads. Biomaterials, v. 24, p. 4941-4948, 2003.
10 DIAS, J. A. C. Nanopartículas poliméricas com aplicação na administração pulmonar de

proteínas. Dissertação em Ciências Farmacêuticas – Universidade do Algarve. Faro, p. 20, 2013.
11 FUNDUEANU, G., NASTRUZZI, C., CARPOV, A., DESBRIERES, J.,

RINAUTO, M.. Physico-chemical characterization of Ca-alginate microparticles produced with
different methods. Biomaterials, v. 20, p. 1427-1435, 1999.
12 MARCON, A. E. Remoção de coliformes fecais com microalgas (Chlorella) imobilizadas em

matriz de alginato de cálcio. Dissertação em Engenharia Sanitária – UFRN. Natal, p. 31, 2005.
13 COSTA, B. S. Micropartículas produzidas por gelificação iônica recobertas com gelatina de

peixe e isolado proteico de soja. Dissertação em Engenharia de Alimentos – UNICAMP. Campinas, p.
49, 2014.
14 Esferas (Beads) de Alginato como Agente Encapsulante de Óleo de Croton zehntneri Pax et
Hoffm. Polímeros, vol. 20, nº 2, p. 112-120, 2010.
15 GIESE, E. C. Potencial Biotecnológico do Uso de Micro-organismos Imobilizados em Gel de

Alginato de Cálcio. CETEM/MCTI : Rio de Janeiro, 2015.
16 TEIXEIRA, V. F. T. Estudo da obtenção de biocatalisadores com matrizes de alginato de

cálcio visando a produção de biodiesel. Dissertação em Ciências e Tecnologias Agropecuárias –
UENF. Campos dos Goytacazes, p.15, 2011.
17 ZIMMERMANN, A. L. S. Desenvolvimento e avaliação de micropartículas contendo

microrganismos viáveis utilizados como bioinseticida. Tese de doutorado em Produção e Controle
Farmacêuticos – USP. São Paulo, p.14, 2001.

CAPÍTULO 13
DESENVOLVIMENTO DE PÃO DE FORMA

CONTENDO FARINHA MISTA DE MARACUJÁ E
JABUTICABA
Jamilly Salustiano Ferreira Constantino funcional.

Mestranda em Engenharia Química, Universidade
Federal de Campina Grande, Campina Grande – ABSTRACT: The use of food in your entirety has
PB
been excelling in recent years as an alternative
Julice Dutra Lopes to the nutritional enrichment, as well as the
Profª Adjunta do Departamento de Engenharia
use of bark, stems and leaves. As a result, the
Química, Universidade Federal da Paraíba, João
objective of this study was to produce flour of
Pessoa – PB
yellow passion fruit’s albedo (FAM) and the bark
of jaboticaba (FJC), develop form type breads
enriched with these flours and characterize
RESUMO: O aproveitamento de alimentos them as their physical and chemical properties.
em sua forma integral vem se destacando Four formulations were made of bread, being a
nos últimos anos como uma alternativa para standard formulation, without adding the flour
o enriquecimento nutricional, bem como a (F1), and three partially substituting formulations
utilização de cascas, talos e folhas. Em virtude wheat flour for the FAM-5% percentage (F2),
disso, o objetivo do presente trabalho foi produzir 10% (F3) and 15% (F4) and all with addition of 2%
farinha do albedo do maracujá amarelo (FAM) e of FJC. Breads made with these flours showed
da casca da jabuticaba (FCJ), desenvolver pães high levels of crude fiber and concentrations of
tipo forma enriquecidos com essas farinhas e total anthocyanins.
caracterizá-los quanto as suas propriedades KEYWORDS: Paciflora edulis f. Flavicarpa.,
físicas e químicas. Foram elaboradas quatro Myrciaria cauliflora Berg., functional food.
formulações de pães, sendo uma formulação
padrão, sem adição das farinhas (F1), e três
formulações substituindo-se parcialmente a 1 | INTRODUÇÃO
farinha de trigo por percentuais da FAM - 5%
(F2), 10% (F3) e 15% (F4) e todas com adição O maracujá (Passiflora edulis f. Flavicarpa)
de 2% de FCJ. Os pães elaborados com essas é uma planta de clima tropical, sendo uma
farinhas apresentaram alto teor de fibra bruta e cultura em expansão tanto para o consumo
concentrações de antocianinas totais. in natura como para a produção de sucos,
PALAVRAS-CHAVE: Paciflora edulis f. destacando-se o Brasil como grande produtor
Flavicarpa., Myrciaria cauliflora Berg., alimento de maracujá. Já a jabuticabeira (Myrciaria

cauliflora Berg) pertence à família Myrtaceae, é de ocorrência espontânea em grande
parte do Brasil e nativa da Mata Atlântica, sendo cultivada em outras regiões e em
países sul-americanos (LIMA et al., 2008).
Segundo Gutkoski et al. (2007), a demanda por alimentos nutritivos está crescendo
mundialmente e a sua ingestão de forma balanceada é a maneira correta de evitar ou
mesmo corrigir problemas de saúde. Em virtude disso, o aproveitamento de alimentos
em sua forma integral vem se destacando nos últimos anos como uma alternativa para
o enriquecimento nutricional, como por exemplo, a utilização de talos, cascas e folhas.
Estas partes dos frutos e hortaliças são ricas em fibras (LUPATINI et al., 2011).
Uma fonte de fibra solúvel bastante conhecida é a casca do maracujá amarelo.
Esta casca é composta pelo flavedo (parte com coloração amarela) e albedo (parte
com coloração branca), sendo esta parte rica em pectina, espécie de fibra solúvel que
auxilia na redução das taxas de glicose no sangue, fonte de niacina (vitamina B3),
ferro, cálcio e fósforo (CAMARGO et al., 2008; CÓRDOVA et al., 2005).
Córdova et al. (2005) sugeriram a utilização da casca do maracujá como farinha,
na obtenção de produtos direcionados para pessoas que necessitam aumentar a
ingestão de fibras para prevenir doenças, principalmente, àquelas relacionadas ao
trato gastrointestinal e ao coração. Já a casca da jabuticaba possui propriedades
bioativas, como no caso da farinha da casca de jabuticaba, rica em compostos fenólicos
e antocianinas, sendo, portanto, uma alternativa para o uso em pães, bolos, sorvetes,
biscoitos, barras de cereais, entre outros produtos (MARQUETTI, 2014).
Existe uma grande quantidade de antocianinas na casca da jabuticaba,
dando coloração a fruta e funcionando como um corante natural. Estudos de vários
pesquisadores têm demonstrado as diversas propriedades farmacológicas de
flavonóides como a antocianina. Tem-se relatado que estas substâncias evitam a
agregação de plaquetas, reduzem os teores de colesterol e triacilgliceróis e atuam
como antioxidantes evitando doenças crônico-degenerativas. Também podem ser
usadas como anti-inflamatórios, além de evitar a ocorrência de cataratas em diabéticos
(HERTOG et al., 1993; PHILPOTT et al., 2004; TZENG et al., 1991).
Segundo o Regulamento Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade
do Pão (BRASIL, 2000), o pão é um produto obtido pela cocção, em condições
tecnologicamente adequadas, de uma massa fermentada, ou não, preparada com
farinha de trigo e/ou outras farinhas que contenham naturalmente proteínas formadoras
de glúten ou adicionadas das mesmas e água, podendo conter outros ingredientes.
A classificação “Pão de Forma” é dada ao produto obtido pela cocção da massa em
formas, apresentando miolo elástico e homogêneo, com poros finos e casca fina e
macia. A Associação Brasileira das Indústrias de Biscoitos, Massas Alimentícias e
Pães & Bolos Industrializados (Abimapi) afirma que a oferta de produtos integrais ou
enriquecidos cresceu muito, ganhando destaque nas prateleiras dos supermercados
(VIANA, 2015).
O uso de farinhas compostas em produtos de panificação tem finalidades
especificas, como por exemplo, melhorar as propriedades nutricionais do produto
pela adição de farinhas de origem oleaginosa, rica em fibras ou outros compostos
funcionais (SILVA, 1997).
Esta pesquisa teve como objetivo produzir e avaliar as características físicas e
físico-químicas de pão de forma elaborado com substituição parcial de farinha de trigo
por farinha do albedo do maracujá amarelo e farinha da casca de jabuticaba, visando
à obtenção de um produto com alto teor de fibras e antocianinas.
2.1 Obtenção das farinhas
Os frutos do maracujá e jabuticaba utilizados nos experimentos foram adquiridos

no mercado local da cidade de Campina Grande - PB, onde foram lavados e
sanitizados e, posteriormente, feita a separação da polpa e das cascas de forma
manual. A retirada do flavedo (parte amarela) da casca do maracujá foi realizada
após cozimento das cascas, e em seguida, submeteu-se uma parte das cascas a
um processo de maceração (imersão em água) durante 24 horas, para retirada do
amargor característico do produto pela presença de compostos flavonoides, com
posterior drenagem da água utilizando peneira plástica (SILVA et al., 2016). Outra
parte do albedo não foi submedida ao processo de maceração, para que houvesse
uma posterior comparação entre os dois processos.
O albedo do maracujá amarelo e a casca da jabuticaba foram dispostos em
cestas de alumínio, de peso conhecido, e submetidos à desidratação em estufa com
circulação de ar forçada com velocidade do ar a 2,0 m/s, nas temperaturas de 70 °C
para o albedo do maracujá e 60 °C para a casca da jabuticaba. Estas temperaturas
foram escolhidas após análise de estudos feitos por outros autores (FERREIRA et
al., 2012; SILVA et al., 2016; ZAGO, 2014), que verificaram a eficiência do processo
de secagem nestas temperaturas frente a conservação das características nutritivas
destas farinhas.
Após a desidratação, o albedo do maracujá e a casca da jabuticaba foram
triturados em liquidificador, obtendo-se farinhas de granulometria homogênea. As
farinhas foram armazenadas em recipientes de vidro escuro e mantidas em temperatura
de refrigeração (5 ± 1 °C) até o momento das análises.
2.2 Produção dos pães
Foram utilizados na formulação do pão de forma, a farinha do albedo do

maracujá macerado e a casca de jabuticaba, sendo utilizada uma mistura de farinha
de trigo, farinha do albedo do maracujá (FAM) e farinha da casca de jabuticaba (FCJ),
conforme apresentado na Tabela 1. A quantidade de FCJ foi fixada em 2% e uma
formulação apenas com farinha de trigo foi produzida e utilizada como formulação

controle. A quantidade de FCJ utilizada na formulação dos pães baseou-se em testes
preliminares, sendo o teor de 2% uma quantidade adequada para que não ocorresse
inibição da levedura durante a fermentação dos pães.
Proporção das farinhas (%)

Formulação Farinha de trigo FAM FCJ
F1 100 0 0
F2 93 5 2
F3 88 10 2
F4 83 15 2
Tabela 1 - Proporção de farinha de trigo, farinha do albedo de maracujá amarelo (FAM) e

farinha da casca de jabuticaba (FCJ) utilizada nas formulações dos pães tipo forma
Os pães tipo forma foram produzidos seguindo a formulação fornecida pelo

SENAI – PB, conforme apresentado na Tabela 2.
Ingredientes Quantidades (%)

Farinhas (trigo, maracujá, jabuticaba) * 100
Sal refinado** 2
Açúcar** 4
Margarina zero trans** 3
Fermento biológico seco** 3
Melhorador de massa** 1
Água** 52
Leite em pó integral** 2
Tabela 2 – Formulação do Pão tipo forma

*Com base nas quantidades definidas na Tabela 1
**Com base em 100 partes de farinha
Para o preparo dos pães, os ingredientes foram misturados na masseira até o

desenvolvimento do glúten. A massa foi modelada, colocada em forma de aço inoxidável
untada e levada para câmera de fermentação. Após o período de fermentação (60
minutos) os pães foram assados por 45 minutos aproximadamente e retirados das
formas após resfriamento completo. Posteriormente os pães foram fatiados, embalados
em sacos de polipropileno e mantidos em temperatura ambiente até o momento das
análises.
2.3 Análises físicas e físico-químicas das farinhas e dos pães de forma
Para caracterização físico-química das farinhas e dos pães foram realizadas, em

triplicata, as seguintes análises: teor de água; cinzas; fibra bruta; proteína por meio
da determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl (N x 6,25), conforme Normas

do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2008). O conteúdo de lipídios foi determinado pelo
método de Bligh e Dyer (1959). Estimou-se a fração de carboidratos não fibrosos por
diferença, subtraindo-se de 100 os valores obtidos para teor de água, proteína, lipídio,
fibra bruta e cinzas. Para análise de antocianinas na farinha da casca de jabuticaba
(FCJ) e nos pães enriquecidos utilizou-se o método de Lees e Francis (1972) e os
minerais da FCJ foram determinados através das cinzas por meio de Espectrômetro
de Fluorescência de Raio X por Energia Dispersiva, modelo EDX – 720 (Shimadzu,
Kyoto, Japão), com uso de nitrogênio líquido a -180° C. Os parâmetros de cor foram
determinados utilizando espectrofotômetro MiniScan HunterLab XE Plus (Reston, VA,
EUA), no sistema de cor Cielab e a atividade de água foram medidas de forma direta
em equipamento Aqualab, modelo 3TE (Decagon, Pulman - WA, EUA) na temperatura
de 25 °C.
Para avaliação de algumas características físicas dos pães ao longo de 7 dias
de armazenamento, foi realizada análise de atividade de água, na temperatura de 25
°C, nos dias 1, 4 e 7. A textura instrumental foi realizada nestes mesmos dias, e foi
expressa pela força máxima aplicada para pressionar uma fatia de pão de forma (com
espessura de 2,5 cm cada). Utilizou-se o texturômetro TA.XT Plus Texture Analyser
(Stable Micro Systems) e probe P 36/R. As condições dos testes empregadas foram:
força de compressão - 20 g; velocidade de teste - 1,7 mm/s; 40% de compressão da
amostra; velocidade de pré-teste - 2,0 mm/s e velocidade de pós-teste - 5,0 mm/s.
Com os dados de textura realizou-se um delineamento inteiramente casualizado, com
comparação entre médias pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, onde para
análise do mesmo utilizou-se o programa computacional Assistat versão 7.0 Beta
(SILVA; AZEVEDO, 2009).
Os parâmetros de cor das farinhas e dos pães foram determinados utilizando-se
o espectrofotômetro MiniScan HunterLab XE Plus (Reston, VA, EUA), no sistema de
cor Cielab.
3.1 Secagem
No presente trabalho verificou-se que para secagem do albedo (casca) do

maracujá amarelo, a 70 °C, foram necessários 13 horas, tanto para o albedo macerado
quanto para o não macerado. Já para secagem da casca da jabuticaba, a 60 °C, foram
necessárias 10 horas.
3.2 Análises Físico-químicas das farinhas e dos pães
O albedo do maracujá in natura submetido ao processo de maceração apresentou

teor de água de 96,11 g/100 g e o albedo não macerado teor de água de 93,41 g /100

g.
Os valores de teor de água obtidos foram semelhantes aos encontrados por Silva
(2016), que estudou a obtenção e caracterização da farinha do albedo do maracujá
para uso alimentício, encontrando o teor de água da casca (albedo) do maracujá de
96,64 ± 0,24 g/100g com maceração, e 94,03 ± 0,08 g/100g sem maceração, e superior
aos valores encontrados por Gondim et al. (2005), que estudaram a composição
centesimal e de minerais em cascas de frutas, encontrando o teor de água da casca
do maracujá em torno de 87,64 g/100g.
O teor de água da casca de jabuticaba foi de 84,16 g/100 g. Este valor foi superior
ao encontrado por Marquetti (2014), que ao estudar a obtenção e caracterização de
farinha de casca de jabuticaba para adição em biscoito tipo cooke, encontrou 78,69
g/100 g.
A composição centesimal da farinha da casca de jabuticaba (FCJ), da farinha do
albedo de maracujá (FAM), e dos pães elaborados, estão apresentados na Tabela 3.
Pode-se observar que o teor de água da FCJ encontrado foi quase o dobro do
valor encontrado na FAM, provavelmente devido a menor temperatura de secagem
utilizada. Resultados inferiores a estes foram obtidos por Ascheri et al. (2006), ao
avaliar a farinha do bagaço de jabuticaba, encontrando teor de água de 7,08 g/100
g. Já Ferreira et al. (2012), encontraram valores de 12,05 g / 100 g para a farinha de
jabuticaba. Com relação a FAM, o teor de água foi semelhante ao encontrado por
Ferreira e Pena (2010) ao estudarem a secagem da casca do maracujá amarelo na
temperatura de 70 °C, onde encontraram 6,0 g/100 g, e superior ao encontrado por
Silva (2016) ao obter a farinha do albedo do maracujá a 70 °C, encontrando teor de
água médio de 3,53 g/100 g. Pode-se observar também, que houve diferença no teor
de água entre a formulação 1 (F1) e a formulação 4 (F4) dos pães. Os teores de água
encontrados nas formulações dos pães variaram de 19,65% a 28,66%, com aumento
do teor de água proporcional à adição das farinhas, e todos os pães apresentaram teor
de água de acordo com a legislação brasileira, que permite um valor máximo de até
30% (BRASIL, 2000).
Parâmetros FAM F1 F2 F3 F4
FCJ
(g/100 g)
Teor de água 19,65 ±
10,80 ± 0,19 5,88 ± 0,37 21,26 ± 0,3bc 23,72 ± 0,36b 28,66 ± 0,90a
0,67c
Cinzas 1,98 ± 0,04 5,11 ± 0,23 1,20 ± 0,00b 1,23 ± 0,33b 1,57 ± 0,04ab 1,88 ± 0,16a
Lipídios 2,93 ±
0,71 ± 0,20 0,89 ± 0,20 2,26 ± 0,67b 3,45 ± 0,40ab 3,66 ± 0,07a
0,00ab
Proteínas 5,43 ± 0,15 5,47 ± 0,15 9,29 ± 1,76a 10,10 ± 0,56a 9,53 ± 0,01a 9,13 ± 0,06a
Fibra Bruta 20,40 ± 0,46 43,77 ± 0,68 1,63 ± 0,15d 5,40 ± 0,17c 6,50 ± 0,30b 8,8 ± 0,20a
Carboidratos 60,68 ± 0,21 38,88 ± 0,52 65,30 ± 0,5a 58,30 ± 2,03b 55,20 ± 0,97b 48,6 ± 1,70c
Antocianinas
67,66 ± 0,02 --- 0,00 ± 0,00c 2,00 ± 0,04b 2,22 ± 0,03a 2,02 ± 0,02b
(mg/100 g)

Tabela 3: Composição centesimal das farinhas da casca de jabuticaba, do albedo do maracujá
e dos pães enriquecidos
FCJ – Farinha da casca de jabuticaba; FAM – Farinha do albedo de maracujá; F1 (pão controle); F2 (5% FAM e
2% FCJ); F3 (10% FAM e 2%FCJ); F4 (15% FAM e 2% FCJ). Médias com as mesmas letras, em uma mesma
linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade.
Pode-se observar que o teor de água da FCJ encontrado foi quase o dobro do
valor encontrado na FAM, provavelmente devido a menor temperatura de secagem
utilizada. Resultados inferiores a estes foram obtidos por Ascheri et al. (2006), ao
avaliar a farinha do bagaço de jabuticaba, encontrando teor de água de 7,08 g/100
g. Já Ferreira et al. (2012), encontraram valores de 12,05 g / 100 g para a farinha de
jabuticaba. Com relação a FAM, o teor de água foi semelhante ao encontrado por
Ferreira e Pena (2010) ao estudarem a secagem da casca do maracujá amarelo na
temperatura de 70 °C, onde encontraram 6,0 g/100 g, e superior ao encontrado por
Silva (2016) ao obter a farinha do albedo do maracujá a 70 °C, encontrando teor de
água médio de 3,53 g/100 g. Pode-se observar também, que houve diferença no teor
de água entre a formulação 1 (F1) e a formulação 4 (F4) dos pães. Os teores de água
encontrados nas formulações dos pães variaram de 19,65% a 28,66%, com aumento
do teor de água proporcional à adição das farinhas, e todos os pães apresentaram teor
de água de acordo com a legislação brasileira, que permite um valor máximo de até
30% (BRASIL, 2000).
O teor de cinzas indica a quantidade de resíduo mineral presente em um material.
Foi encontrado conteúdo de cinzas para a FCJ em torno de 1,98 g/100 g. Teor inferior
a esse foi obtido por Marquetti (2014) (1,13 g/100 g). Entretanto, teores superiores
foram observados por Ascheri et al. (2006) (3,49 g/100g) e Ferreira et al. (2012)
(3,89 g/100g). Em relação a FAM, Freire et al. (2014) encontraram valores de cinzas
superiores (7,73 ± 0,18 g/100 g) aos encontrados neste estudo. Já com relação aos
pães enriquecidos, observou-se que a medida que foi adicionado FAM na formulação,
houve aumento do teor de cinzas, comparando com a formulação controle (F1). Essas
diferenças são atribuídas aos minerais presentes nas farinhas. Borges et al. (2012)
determinaram teor de cinzas em pães elaborados com farinha de quinoa e obtiveram
concentrações superiores aos encontrados no pão controle.
A Embrapa Floresta (2015) realizou pesquisa sobre o valor nutricional da
jabuticaba, encontrando cerca de 0,74 g/100g de lipídios na FCJ, sendo este resultado
semelhante ao obtido no presente trabalho (0,89 g/100 g). Valor inferior a este foi
encontrado por Silva (2016) (0,63 g / 100 g) em FAM obtida nas mesmas condições
de secagem utilizadas neste estudo, enquanto Souza et al. (2008) encontraram valor
superior (1,64 g/100 g). Observou-se ainda um aumento significativo na formulação F4
(15%FAM e 2% FCJ) com relação a formulação F2 (5% FAM e 2% FCJ).
Quanto ao teor de proteínas foram obtidos teores médios de 5,43 e 5,47 g/100 g,
para a FCJ e FAM, respectivamente. Appelt et al. (2015) descreveram valor semelhante
(6,4 g/100 g) de teor de proteína da FCJ obtida por secagem com circulação de ar

forçada a 55 °C. Ferreira et al. (2012) encontraram conteúdo semelhante (5,23 g/100 g)
para FCJ. Comparando os valores para FAM, Souza et al. (2008) encontraram valores
de proteínas superiores para a FAM em base úmida (11,76 g/ 100 g). A substituição
parcial de farinha de trigo por FAM e FCJ, não interferiu no teor de proteína total dos
pães, visto que não houve diferença significativa entre os resultados, o que pode ser
explicado pelo baixo teor de proteínas das farinhas. Borges et al. (2011) encontraram
ao trabalhar com substituição parcial da farinha de trigo pela farinha de linhaça,
valores superiores a esse, que foi aumentando a medida que se adicionou farinha da
formulação.
A determinação de fibra bruta mostrou que a FCJ e FAM são fontes de fibras,
apresentando valores médios de 20,4 e 43,77 g/100 g, respectivamente. De acordo
com a Portaria n° 27 do Ministério da Saúde (BRASIL, 1998), um produto alimentício é
considerado fonte de fibras se apresentar no mínimo 3 g/100 g de fibras para alimentos
sólidos. O conteúdo de fibras da FAM, se mostrou superior ao encontrado por Santos
(2013) com 34,57 g/100 g, Santana et al. (2011), com 36,05 g/100 g, enquanto o teor
de fibra da FCJ foi superior ao encontrado por Ferreira et al. (2012) (15,25 g/100 g).
O elevado teor de fibra bruta encontrado demonstra a possibilidade de incorporação
dessas farinhas no enriquecimento de diversos produtos alimentícios, como por
exemplo, produtos de panificação.
Com relação a quantidade de fibra bruta, observou-se que a medida que foi
acrescentado FAM, o teor de fibra bruta aumentou significativamente, quando
comparado a formulação controle (F1). Vale ressaltar que a FAM foi a responsável
por esse enriquecimento, por se tratar de um produto com alto teor de fibras,
aproximadamente (43,8 g/100 g). A quantidade de fibras nos pães enriquecidos permite
predizer que pode ser considerado fonte de fibras segundo a legislação brasileira que
preconiza no mínimo 3 g/100 g do alimento (BRASIL, 1998).
Os valores de antocianinas encontrados na FCJ, expõe elevadas concentrações
do composto bioativo, apresentando valores superiores ao encontrado por Silva et
al. (2010), que obtiveram 48,06 mg de antocianinas/100 g no extrato da casca de
jabuticaba. Vedana et al. (2008), quando trabalharam com extratos hidroalcoólicos de
uva, obtiveram 4,90 mg de antocianinas/100 g de uva, sendo esse valor bem inferior
ao encontrado no extrato da FCJ. Como observado nas formulações dos pães com 2%
da FCJ, houve um enriquecimento com antocianinas presentes na farinha, podendo
ser considerada uma boa fonte de pigmentos antociânicos por apresentar elevado teor
desse composto, podendo ser usado para o enriquecimento de produtos alimentícios,
como também uma alternativa viável para a obtenção de corantes naturais.
Os teores de minerais encontrados na farinha da casca de jabuticaba (FCJ) estão
apresentados na Tabela 4.

Minerais Teor (mg/100g)
Potássio (K) 1.650,00
Cálcio (Ca) 144,00
Fósforo (P) 93,00
Enxofre (S) 71,00
Ferro (Fe) 5,80
Zinco (Zn) 2,90
Manganês (Mn) 2,89
Cobre (Cu) 2,60
Rubídio (Rb) 2,26
Tabela 4 – Teor de minerais encontrados na farinha da casca de jabuticaba
Em relação ao conteúdo de minerais da FCJ, o mineral encontrado em maior

quantidade foi o K, seguido por Ca, P, S, Fe, Zn, Mn, Cu e Rb. Resultados semelhantes
foram obtidos por Ascheri et al. (2006), ao estudarem a caracterização do bagaço de
jabuticaba, encontrando quantidades de potássio equivalente (1273,12 mg/100 g) na
farinha elaborada, sendo este o mineral presente em maior quantidade.
3.3 Análises Físicas das Farinhas e dos Pães
3.3.1 Cor instrumental
Os resultados dos parâmetros L*, a* e b* da análise de cor das farinhas e

dos pães elaborados e a atividade de água das farinhas são mostrados na Tabela
5. Observando o valor de L*, pode-se perceber que a FCJ trata-se de uma farinha
escura, já que os valores de L* definem a claridade da cor, sendo que 0 (zero) indica
a cor totalmente preta e 100 (cem) cor totalmente branca. A coordenada de cor a*
varia do verde para o vermelho (-a* a +a*), com isso pode-se perceber a presença
de pigmentos avermelhados já que o valor médio correspondente do parâmetro a* foi
10,30. A coordenada b* refere-se a variação da tonalidade do azul ao amarelo (-b* a +b*)
e observou-se pequena presença de pigmentos amarelados. Resultados semelhantes
a estes foram encontrados por Alves (2014) quando trabalhou com FCJ, avaliando a
estabilidade de compostos nutricionais durante 12 meses de armazenamento.
A FAM apresentou luminosidade (L*) próxima a 100 (cem), sendo considerada
clara, e o parâmetro a* positivo mostra que FAM apresentou coloração ligeiramente
vermelha e fortemente amarela (b*). Silva (2014), quando produziu FAM em diferentes
temperaturas, encontrou valores de luminosidade superiores a este para luminosidade.

Parâmetros
Farinhas Cor
Aw
L* a* b*
FCJ 0,293 ± 0,002 22,58 ± 0,02 10,30 ± 0,03 10,28 ± 0,12
FAM 0,359 ± 0,004 66,50 ± 0,03 6,16 ± 0,04 25,17 ± 0,07
F1 - 75,24 ± 0,0088a 3,02 ± 0,02c 24,16 ± 0,09ª
F2 - 52,15 ± 0,13 b
4,82 ± 0,10ª 16,57 ± 0,3b
F3 - 52,04 ± 0,03b 4,26 ± 0,75b 16,49 ± 0,46b
F4 - 50,97 ± 0,076c 4,16 ± 0,008b 15,99 ± 0,26b
Tabela 5 – Análise de cor e atividade de água da farinhas da casca de jabuticaba (FCJ), da

farinha do albedo de maracujá (FAM) e das formulações dos pães enriquecidos
L* - luminosidade; a* - transição da cor verde (-a*) para o vermelho (+a*); e b* - transição da cor azul (-b*)
para a cor amarela (+b*); F1 (pão controle); F2 (pão com 5% de FAM e 2% FCJ); F3 (pão com 10% FAM e 2%
FCJ); F4 (pão com 15% FAM e 2% FCJ). Médias com as mesmas letras, em uma mesma coluna, não diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
A luminosidade das formulações dos pães tipo forma com propriedades funcionais,
variou entre 75,24 (F1 – formulação controle) e 50,97 (F4 – formulação com 15% de
FAM e 2% de FCJ). A luminosidade das formulações F1 e F2 foram semelhantes ao
obtido por Silva et al. (2009a), quando trabalhou com barras de cereais enriquecidos
com 30% do resíduo industrial de maracujá (49,0 ± 0,3). Os valores evidenciaram
que ocorreu um escurecimento progressivo (redução no valor dos parâmetros L e b)
e significativo (p<0,05), a medida que aumentou a quantidade de farinha mista na
formulação.
Através dos parâmetros a e b constatou-se que todas as formulações
apresentaram uma tendência por croma de menor intensidade para o amarelo e
aspecto levemente vermelho. A formulação F4, por apresentar um valor de L menor,
tendeu a uma coloração mais escura. Leoro (2007) observou que com o aumento da
quantidade de farelo do maracujá adicionado na formulação, o valor de L diminuiu,
produzindo extrusados mais escuros.
A atividade de água das farinhas foram menores que 0,60, o que segundo Chisté
et al. (2006), é considerada um limite máximo para não permitir o desenvolvimento de
microrganismos.
3.3.2 Textura Instrumental
A Tabela 6 apresenta os resultados das análises dos parâmetros de textura

(firmeza, coesividade, gomosidade e mastigabilidade), avaliados por um período de 7
dias de armazenamento dos pães tipo forma, especificamente no 1°, 4° e 7° dia após
produção.

1° dia após 4° dia após 7° dia após
Parâmetros Formulação
produção produção produção
F1 24,20867d 27.30600c 31.10233b
F2 53,35300c 78.91833b 91.90434a
Firmeza (N)
F3 83,00433b 82.76566b 131.75330a
F4 107,42530a 131.73870a 104.07970a
F1 0.56164a 0.46358a 0.58929a
F2 0.49340b 0.35336a 0.23524a
Coesividade
F3 0.50123ab 0.44828a 0.40578a
F4 0.40279c 0.31136a 0.36655a
F1 13.58629c 12.43268b 12.43268b
F2 26.24767b 27.88717a 27.88717a
Gomosidade (N)
F3 41.50120a 36.79583a 36.79583a
F4 43.15212a 40.88499a 40.88499a
F1 13.58496c 12.43087b 16.98546b
Mastigabilidade F2 26.24068b 27.88302a 22.21754b

(N) F3 41.50128a 36.79456a 53.11450a
F4 43.15475a 40.88377a 38.25254ab
Tabela 6 – Variação dos parâmetros de textura instrumental (firmeza, coesividade, gomosidade

e mastigabilidade) dos pães tipo forma, elaborados com diferentes concentrações de farinha
de trigo, farinha do albedo de maracujá (FAM) e farinha da casca de jabuticaba (FCJ) durante 7
dias de armazenamento
Médias com as mesmas letras, em uma mesma coluna e para o mesmo parâmetro, não diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. F1 (Controle); F2 (5% FAM e 2%
FCJ); F3 (10% FAM e 2% FCJ); F4 (15% FAM e 2% FCJ).
Observando os resultados da Tabela 6, verificou-se que houve diferença

significativa (p < 0,05) entre as formulações para todos os parâmetros analisados, no
primeiro dia após produção dos pães.
Observa-se que e a adição da FAM e da FCJ conferiu maior firmeza ao pão,
onde quanto maior foi o acréscimo de FAM na formulação, maior a firmeza do
pão, assim como também a medida que o tempo de armazenamento aumentou, a
firmeza e a mastigabilidade dos pães aumentaram gradativamente. O aumento da
dureza durante a estocagem normalmente ocorre em pães devido a retrogradação
do amido, desnaturação das proteínas e redução da água na massa após a cocção
(ESTELLER et al., 2004), assim, a formulação F4 com adição de 15% FAM e 2%
de FCJ apresentou maior maciez e diminuição da mastigabilidade no último dia de
análise. Essa diminuição da firmeza pode justificar-se pelo ganho de umidade durante
o tempo de armazenamento. Silva et al. (2009b) encontraram resultados semelhantes,
onde observaram um aumento na dureza devido aumento da percentagem de farinha
de “okara” na formulação de pão de fôrma.
Para a coesividade, que é a extensão ao qual um material pode ser deformado
antes da ruptura (SILVA et al., 2009b), as amostras apresentaram uma diminuição desse
parâmetro com a adição das farinhas na formulação e com o tempo de estocagem.
Gomosidade é a energia requerida para desintegrar um alimento até estar pronto
para deglutição (TUNCEL et al., 2014). A análise da gomosidade dos pães mostrou
que com o aumento da adição das farinhas nas formulações, houve um aumento da
mesma, e seus valores mantiveram-se constante a partir do 4° dia de armazenamento,
não apresentando diferença significativa (p>0,05) entras as amostras com adição de
10 e 15% de FAM (formulações F3 e F4).
O comportamento das formulações em relação ao parâmetro mastigabilidade,
que pode ser definida pela força necessária para desintegrar um alimento sólido até
ficar pronto para ser engolido (CARR et al., 2006), apresentaram resultados distintos,
onde para as formulações com adição de 0 e 10% de FAM houve um aumento dos
valores referentes a mastigabilidade, enquanto para as formulações com adição de
5 e 15% de FAM ocorreu uma diminuição do mesmo com o decorrer do período de
estocagem.
3.3.3 Atividade de água durante armazenamento dos pães
A Tabela 7 apresenta os resultados das análises de atividade de água dos pães

formulados com diferentes concentrações de FAM e FCJ, ao longo de 7 dias de
armazenamento, especificamente no 1°, 4° e 7º dia após produção.
Aw (Média ± Desvio Padrão)

Formulação
1º Dia 4º Dia 7º Dia
F1 0,955 ± 0,0006ª 0,939 ± 0,00057ª 0,951 ± 0,001ª
F2 0,958 ± 0,0006ª 0,950 ± 0,0006ª 0,955 ± 0,001ª
F3 0,959 ± 0,00057ª 0,953 ± 0,0010ª 0,956 ± 0,001ª
F4 0,966 ± 0,00057ª 0,949 ± 0,0010ª 0,961 ± 0,001a
Tabela 7 – Valores da média e desvio padrão da atividade de água das amostras de pão tipo
forma elaborados com farinhas mistas do albedo do maracujá (FAM) e da casca de jabuticaba
(FCJ)
Médias com as mesmas letras, em uma mesma linha, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey,
ao nível de 5% de probabilidade. F1 (Controle); F2 (5% FAM e 2% FCJ); F3 (10% FAM e 2% FCJ); F4 (15% FAM
e 2% FCJ).
A atividade de água Aw indica a quantidade de água disponível para realizar o

movimento molecular e suas transformações e promover o crescimento microbiano
(ZAMBRANO, 2005). Segundo Fennema (2000), produtos com atividade de água entre
0,80 e 0,88 favorecem o desenvolvimento de bolores e leveduras, respectivamente. O
pão de forma é um produto de alta atividade de água, por esse motivo, normalmente
os produtos disponíveis no mercado possuem baixa vida de prateleira. Os resultados
apresentados na Tabela 7 comprovam esse fato, onde todas as amostras apresentaram
valores de Aw superiores a 0,90, não havendo diferença significativa ao nível de 5% de
probabilidade entre os pães analisados. A grandeza dos valores apresentados coloca

todos os pães em uma faixa crítica de estabilidade. Estes valores foram semelhantes
aos encontrados por Montenegro (2011) e Gragnani (2010), que também encontraram
valores superiores a 0,90 para os pães de forma obtidos em seus estudos.
4 | CONCLUSÃO
Observou-se que a FCJ e FAM apresentaram elevados teores de fibra bruta,

podendo ser utilizadas como uma alternativa no enriquecimento de alimentos. A FCJ
apresentou elevadas concentrações de minerais, principalmente o potássio, e elevado
teor de antocianinas totais, indicando que a FCJ pode ser utilizada em formulações
alimentícias, com intuito de aumentar a disponibilidade de alimentos que sejam fontes
de substâncias antioxidantes como as antocianinas. A adição FAM nos pães elaborados
indicou que com o aumento da sua concentração, aumentou-se a quantidade de fibra
bruta e a adição de FCJ incluiu compostos bioativos, (antocianinas) nas formulações,
podendo ser considerado um produto alimentício enriquecido.
Os resultados permitem concluir ainda que FAM e FCJ apresentam potencial de
uso na elaboração de pães, sendo uma opção para aproveitamento de resíduos da
indústria de alimentos no enriquecimento de um produto de grande consumo como o
pão tipo forma. Os pães elaborados com farinha mista apresentaram elevada atividade
de água (acima de 0,95) e os parâmetros de firmeza, coesividade e mastigabilidade
aumentaram com o aumento da adição das farinhas e com o tempo de armazenamento
dos pães.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq) pela bolsa de

iniciação científica concedida para a realização desta pesquisa.
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CAPÍTULO 14
DETERMINAÇÃO DO EHL (EQUILÍBRIO-HIDROFÍLICO

LIPOFÍLICO) DO ÓLEO DE ABACATE
Laíssa Aparecida Praxedes dos Reis emulsão. A partir da análise turbidimétrica foi
Universidade Tecnológica Federal do Paraná determinado que o melhor método para preparar
Ponta Grossa – Paraná as emulsões é o inversão de fases. A partir disso
Alessandra Cristine Novak Sydney foram realizadas emulsões utilizando óleo de
Universidade Tecnológica Federal do Paraná abacate de três fabricantes (Mix das Essências,
Ponta Grossa – Paraná BioEssência e Duom). O EHL foi determinado
a partir das emulsões com maiores valores de
turbidez (723, 935 e 726, respectivamente), ou
seja, produziram emulsões mais estáveis. As
RESUMO: O óleo de abacate é um produto
emulsões que apresentaram esses valores de
amplamente utilizado na área cosmética
turbidez apresentaram EHL de 7,89, 7,82 e 7,97,
devido às suas propriedades de hidratação e
respectivamente. Com isso pode-se determinar
regeneração da pele. Para o uso de qualquer
que o EHL do óleo de abacate equivale a (7,89
óleo em emulsões cosméticas é preciso
± 0,06).
conhecer o seu Equilíbrio Hidrófilico-Lipofílico
PALAVRAS-CHAVE: Óleo de abacate, EHL,
(EHL), pois esse valor é determinante para
emulsão, turbidez
a escolha dos tensoativos do sistema. A
determinação do EHL do óleo foi realizado
ABSTRACT: Avocado oil is a product widely
pelo método de Griffin (1949), que consiste
used in the cosmetic area due to its properties
em multiplicar as massas de Span 80 e Tween
of hydration and skin regeneration. For the
80 utilizados no preparo da emulsão por seus
use of any oil in cosmetic emulsions it is
respectivos EHL e em seguida dividir este
necessary to know its hydrophilic-lipophilic
valor pela soma das massas dos tensoativos.
balance (HLB), because it is determinant for
As emulsões foram realizadas pelos métodos
the choice of the surfactants of the system. The
de inversão de fases e de preparação por
EHL determination of the oil was performed
simples mistura. Para analisar as emulsões
according to the Griffin (1949), which consists in
foi empregado o método turbidimétrico, que
multiplying the Span 80 and Tween 80 masses
permite estimar o tamanho das partículas da
used in the preparation of the emulsion by their
emulsão, sendo assim possível identificar
respective EHL and then dividing this value by
qual sistema possui maior estabilidade. De
the sum of the masses of the surfactants. The
acordo com esse método, os maiores valores
emulsions were performed by the methods of
de turbidez indicam menores partículas na
phase inversion and simple mixing. To analyze the emulsions, the turbidimetric method
was used, which allows to estimate the size of the particles of the emulsion, being
possible to identify which system has greater stability. According to this method, the
higher turbidity values indicate smaller particles in the emulsion. From the turbidimetric
analysis it was determined that the best method to prepare the emulsions is the phase
inversion. From this were made emulsions using avocado oil from three manufacturers
(Mix das Essências, BioEssência e Duom). The HLB was determined from the emulsions
with the highest turbidity values (723, 935 and 726, respectively), that is, they produced
more stable emulsions. Emulsions that showed these turbidity values showed HLB of
7,89, 7,82 and 7,97, respectively. Thus, it can be determined that the HLB of avocado
oil is equivalent to (7,89 ± 0,06).
KEYWORDS: Avocado oil, HLB, emulsion, turbidity
1 | INTRODUÇÃO
Produtos cosméticos são muitos comuns no dia-a-dia, sendo utilizados com o

intuito de embelezar, proteger e higienizar a pele, cabelos e unhas. A cosmetologia é
uma área que está em constante desenvolvimento, sendo recentemente incorporado à
esta ciência o termo nanocosméticos. Este termo é designado para descrever aqueles
cosméticos com a capacidade de transportar e liberar fármacos ou ativos na pele de
modo mais eficiente. (GOMES; GABRIEL, 2006; GALEMBECK; CSORDAS, 2009)
O pioneiro no estudo referente à aplicação transdérmica foi Rein, que em 1924
afirmou que a maior barreira para o transporte transdérmico é a epiderme mais externa
da pele, também conhecida como estrato córneo (REIN, 1924 apud PRAUSNITZ;
MITRAGOTRI; LANGER, 2004). A partir de então surgiram diversas propostas para
ultrapassar esta barreira e permitir que fármacos e vitaminas atinjam as camadas
externas da pele e até mesmo a corrente sanguínea (TORCHILIN, 2006). Segundo
Tadros e Kessell (2004) uma das alternativas para o transporte transdérmico é a
nanotecnologia, pois suas partículas possuem tamanhos menores que 5 nm facilitando
assim a absorção de substâncias ativas.
A microemulsão, apesar de conter na sua denominação o prefixo micro, que
indica uma dimensão de 10-6m, é um sistema termodinamicamente estável composto
por nanopartículas, que usualmente possuem dimensões da ordem de 10-9m. A sua
formação consiste em mistura de água, óleo, tensoativo e co-tensoativos (FORMARIZ
et al., 2005; DAMASCENO et al., 2010). Para que a microemulsão seja efetivamente
capaz de realizar o transporte de ativos é necessário que a mesma seja um sistema
estável, e para isso a escolha de seus componentes é de suma importância.
Os tensoativos e co-tensoativos exercem um papel importante na microemulsão,
pois estes são responsáveis por quebrar a tensão superficial da água fazendo com que
haja interação com o óleo originando assim uma emulsão. A escolha deste composto
deve ser feita com cautela, pois muitos destes podem causar irritação e queimação na

pele. (DALTIN, 2011; HEGDE; VERMA; GHOSH, 2013).
O óleo de abacate (Persea americana) é um composto que possui um alto teor
de hidratação, sendo rico em vitaminas, proteínas e potássio. Uma outra propriedade
deste óleo é que ele auxilia na cicatrização e na formação do colágeno. Devido às
suas propriedades, o óleo de abacate é amplamente utilizado na indústria cosmética e
farmacêutica (TANGO; TURATTI, 1992; SOARES; ITO, 2000). Por ser um composto
que possui muitas propriedades já apreciadas por diferentes indústrias, o óleo de
abacate se torna um composto promissor para a sua utilização em microemulsões.
Outro ponto de atenção na escolha dos componentes de uma microemulsão é
conhecer o equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) do óleo, para que a escolha do tensoativo
e co-tensoativo a ser utilizado seja feita adequadamente afim de formar uma emulsão
mais estável.
O equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) é definido como sendo o equilíbrio entre
o tamanho e a força de grupos hidrofílicos e lipofílicos que compõe a estrutura de
emulsificantes (tensoativos e co-tensoativos). Com o intuito de classificar estes
compostos, foi designado valores para o EHL que variam de 1 a 40. O valor de EHL
para tensoativos iônicos não ultrapassa o valor 20, já para tensoativos iônicos, que
possuem uma alta polaridade, o valor de EHL pode chegar a 40. É importante ressaltar
que o EHL e a solubilidade são características do emulsificante que diferem entre si,
porém, possuem uma certa relação, onde emulsificantes com baixos valores de EHL
tendem a se solubilizar em óleo formando emulsões do tipo A/O mais estáveis, já
por um outro lado, compostos com altos valores de EHL tendem a se solubilizar em
água formando emulsões O/A mais estáveis. Entretanto, essa relação não é tão exata,
pois podem existir diferentes emulsificantes com o mesmo valor de EHL, porém, com
solubilidades diferentes (GRIFFIN, 1949; HOLMBERG et al., 2002; DALTIN, 2011).
2 | MÉTODOS
Para a determinação do EHL do óleo foi utilizado o método descrito por Griffin
(1949), que consiste em relacionar as massas do co-tensotivo Span 80 (mS) e tensoativo
Tween 80 (mT) com seus respectivos valores de EHL 4,7 e 15, como mostrado abaixo
Foram realizados 4 experimentos, sendo cada um deles composto por 9

emulsões. Emulsões nas quais foram preparadas a partir de uma mistura de Span 80
e Tween 80, óleo de abacate (extraído por prensagem à frio) e água, nas proporções
1:2:7 respectivamente. A mistura de co-tensoativo e tensoativos foi realizada nas

proporções 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9.
O primeiro experimento (1A) foi realizado com o óleo de abacate do fabricante
Mix da Essências sendo o método utilizado o da preparação por simples mistura,
os compostos foram misturas e agitados durante 5 minutos no Vortex (Global Trade
Technology, XH-CU) à temperatura ambiente.
O segundo experimento (2A) foi realizado com o mesmo óleo, porém pelo
método da inversão de fases. Método este que consistiu na mistura e aquecimento
em banho maria (Novatecnica) a 80°C do óleo de abacate e o Tween 80, sendo em
um outro recipiente realizado o mesmo processo para a mistura Span 80 e água.
Após o aquecimento a mistura Span 80 e água foi vertida na mistura Tween 80 e
óleo e mantidos sob agitação no Vortex (Global Trade Technology, XH-CU) até que
a temperatura atingisse 25±5°C. Após o preparo das emulsões, as mesmas foram
mantidas em repouso por 24 horas e depois foram realizados análises turbidimétricas.
A análise da turbidez em emulsões permite identificar qual emulsão possui um
menor tamanho de partícula, atribuindo assim uma maior estabilidade ao sistema. Após
o repouso da amostra, a mesma foi agitada e um alíquota foi inserida no equipamento
(Policontrol – AP2000) através de uma cubeta, sendo este processo realizado para as
9 amostras. Ao inserir a amostra no equipamento, o mesmo emite uma luz que incide
na amostra atravessando-a e mostrando o valor da transmitância (NTU) no visor.
Valores altos de NTU significa que as partículas da solução são menores, pois
não absorvem tanta luz, por outro lado, valores de NTU baixos significa que mais
luz ficou retida entre as partículas da emulsão, sendo assim pode-se dizer que as
partículas neste caso são maiores .
O terceiro e quarto experimento (3A e 4A) foram realizados de acordo com o
método descrito no experimento 2, porém os óleos utilizados foram dos fabricantes
BioEssência e Duom respectivamente.
Para testar a influência do co-tensoativo na emulsão com óleo de abacate foram
realizados dois experimentos. No primeiro (1B) foram preparados 9 emulsões contendo
Tween 80, óleo de abacate (Mix das Essências) e água nas proporções 1:2:7. Para
o segundo (2B) experimento foram preparadas 9 emulsões contendo uma mistura
de Span 80 e Tween 80, óleo de abacate (Mix das Essências) e água nas mesmas
proporções do experimento anterior.
Após o preparo das emulsões as mesmas foram mantidas em repouso por 24
horas à temperatura ambiente e em seguida analisadas no microscópio.
3 | RESULTADOS
O preparo de emulsões é uma técnica puramente experimental quando se trata

em definir formulações, tamanho da partícula e estabilidade. Então com o intuito
de estudar a melhor técnica para o preparo de emulsões com o óleo de abacate
foram realizados os experimentos 1A e 2A, sendo os resultados de suas análises
turbidimétricas dispostos na Tabela 1.
Turbidez (NTU) Turbidez (NTU)

Emulsão
Simples Mistura Inversão de Fases
1 154 306
2 215 576
3 308 723
4 151 702
5 156 389
6 143 378
7 113 353
8 130 244
9 141 277
Tabela 1 – Análise turbidimétricas de dois diferentes métodos de preparação de emulsões

Analisando a Tabela 2 é possível verificar que o método de inversão de fases

possui valores de turbidez relativamente mais altos do que se comparado ao outro
método. A análise realizada se baseia na transmitância de um feixe de luz que incide
na amostra, sendo assim valores mais altos de turbidez implica que a luz passou
diretamente pela amostra não sendo absorvida pela partícula, ou seja, as gotículas
da amostra são menores daquelas que possuem um menor valor de turbidez. Dado
a isso, foi definido que o método de inversão de fases nos leva à um sistema que se
aproxima mais de uma microemulsão.
Com o preparo e análise dos experimentos 3A e 4A, a Tabela 2 foi construída,
sendo assim possível comparar a turbidez e o EHL dos três fabricantes de óleo de
abacate.
Mix das Essências BioEssência Duom

Turbidez Turbidez Turbidez
Emulsão EHL EHL EHL
(NTU) (NTU) (NTU)
1 306 5,75 413 5,71 473 5,73
2 576 6,98 553 6,72 638 6,75
3 723 7,89 935 7,82 726 7,97
4 702 8,75 731 8,81 559 9,02
5 389 9,74 496 9,87 239 9,86
6 378 10,99 644 10,87 278 10,99
7 353 11,90 395 11,83 383 11,90
8 244 12,91 434 12,82 281 12,97
9 277 13,86 460 13,94 248 13,94
Tabela 2 - Análise turbidimétricas e cálculo do EHL das emulsões


Mesmo possuindo valores de EHL próximos, foi verificado que os valores de
turbidez são consideravelmente. Esta diferença pode ser explicada pela quantidade
de ácidos graxos contidos no óleo, pois pode haver variações no tempo e temperatura
de extração do mesmo, alterando assim as quantidades de ácidos encontrados no
óleo.
Para os experimentos 1B e 2B não foi calculado o valor do EHL, pois o intuito foi
testar a influencia do tensoativo e co-tensotivo na emulsão. Temos então o resultados
dispostos a seguir.
a b
Figura 1 – Micrografia (40μm) da emulsão contendo Tween 80/ Span 80/óleo de abacate/água
(a) e Micrografia (40μm) da emulsão contendo Tween 80/óleo de abacate/água (b)
A Figura 1-b mostra um sistema com partículas de tamanhos variados e sem

uma forma definida, por outro lado a Figura 1-a mostra um sistema com partículas
esféricas bem definidas, porém com tamanhos diferenciados. Analisando as figuras,
pode-se observar que uma emulsão com co-tensoativo resulta em uma mistura mais
homogênea e definida.
4 | CONCLUSÃO
No preparo de emulsões contendo óleo de abacate, o método de inversão de

fases apresentou maiores valores de turbidez, ou seja, forma emulsões cujas partículas
são pequenas e por isso se torna um sistema mais estável.
Na análise da turbidez dos experimentos, pode-se concluir que a emulsão 3
apresentou um maior valor de transmitância para os diferentes fabricantes, sendo
possível concluir que o EHL do óleo de abacate é 7,89±0,06. Além disso, temos que
em emulsões com o óleo de abacate é necessário o uso de um co-tensoativo para que
o sistema forme partículas mais uniformes ajudando assim na estabilidade do sistema.
Com o estudo do EHL do óleo de abacate foi possível conhecer o comportamento

deste óleo em emulsão. Verificou-se a influência da metodologia e do uso de co-
tensoativos para o preparo das mesmas, e com isso foi possível obter um sistema
emulsionado composto por pequenas gotículas.
A partir do EHL encontrado para o óleo é possível fazer diferentes combinações
com diferentes tensoativos e co-tensoativos que possuem um EHL semelhante, sendo
possível encontrar componentes de baixo custo, que geram um produto de mesma
qualidade ou até mesmo superior.
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CAPÍTULO 15
ESTUDO DA TOXICIDADE DE Combretum leprosum

Mart.: TESTE ALLIUM CEPA
Valéria Moura de Carvalho Adão Correia Maia

Centro Universitário - UNINOVAFAPI Centro Universitário - UNINOVAFAPI
Raidan Costa Rodrigues Antonio Lima Braga
Centro Universitário - UNINOVAFAPI Faculdade Mauricio de Nassau Campus Aliança
Kelly Maria Rêgo da Silva Jadielson dos Santos
Faculdade Mauricio de Nassau Campus Aliança Universidade Federal do Piauí- UFPI
Centro Universitário - UNINOVAFAPI
Teresina – Piauí
RESUMO: O Combretum leprosum Mart.
Sâmya Katya Barros Guimarães é um tipo de arbusto de pequeno porte
também conhecido como mufumbo, mofumbo,
Teresina – Piauí
cipoaba e pente-de-macaco. É utilizado pelas
Brenda Lois Barros dos Santos suas propriedades afrodisíacas, sedativas,
expectorantes e hemostáticas, assim como
Teresina – Piauí
existe estudos farmacológicos do extrato desse
Cairo Hilbert Santos de Melo arbusto que sugerem atividades biológicas
Universidade Federal do Piauí- UFPI
com efeitos antiulcerogênico, antiinflamatório e
Teresina – Piauí antiproliferativo, e contra a forma promastigota
Juliane Moreira Ramos de Leishmania amazonenses. O presente
Centro Universitário - UNINOVAFAPI estudo teve como objetivo verificar a toxicidade
Teresina – Piauí de extrato aquoso de C. leprosum Mart. Para a
Wanderson Ferreira Martins avaliação a toxidade desse arbusto foi utilizada a
Centro Universitário - UNINOVAFAPI metodologia de Allium cepa devido ao seu baixo
Teresina – Piauí custo. Os resultados mostraram que o índice
Gabrielle Costa Bento Campos mitótico observado foi de interfase 48,94%;
Centro Universitário - UNINOVAFAPI prófase 49,64%; metáfase 4,54%; anáfase
Teresina – Piauí 3,84% e telófase 1,06 %. Com esses valores

é possível constatar que o extrato aquoso de C. leprosum Mart. nas concentrações
utilizadas nesse teste tem atividade tóxica. O estudo indica que precisa reforçar a
necessidade de estudos futuros para estabelecer um perfil químico desse extrato, pois
são utilizados popularmente para tratar várias patologias, sem um conhecimento certo
sobre as suas propriedades e efeitos.
PALAVRAS-CHAVE: Plantas medicinais, Toxicidade, Extrato.
ABSTRACT: The Combretum leprosum Mart. is a type of small shrub also known as
mufumbo, mofumbo, cipoaba and monkey comb. The aphrodisiac, sedative, expectorant
and hemostatic properties, as well as the pharmacological studies of the shrub extract
that are part of the biological functions of antiinflamatogenic, antiinflammatory and
antiproliferative, and against a promastigote form of Leishmania amazonenses. The
present study had as objective to verify the toxicity of the aqueous extract of C. leprosum
Mart. For a toxicity of this bush an Allium cepa methodology was used due to its low cost.
The results were that the mitectual index was 48.94%; prophase 49.64%; metaphase
4.54%; anaphase 3.84% and telophase 1.06%. With these values it is possible to verify
the aqueous extract of C. leprosum Mart. in which we may experience the test has
toxic activity. The evaluation of which extralised the exact evidence for development,
the profile of the multiple infrastructures, such as specific properties to their multiple
patology, without one unknown index in their properties and effects.
KEYWORDS: Medicinal plants, Toxicity, Extract.
1 | INTRODUÇÃO
Nos primórdios do século passado a humanidade sempre utilizou plantas para uso
medicinal, e quem faz uso popular delas sabe que possui atividade biológica a partir
da sua transformação química. A indústria farmacêutica até hoje utiliza substâncias
ativas das plantas na fabricação de medicamentos isso se deve pela diversificada flora
existente (FERREIRA et al., 2011).
Segundo Michelin et al. (2005), as doenças têm relação com a falta de saneamento
básico para a população, sendo comum nos países em desenvolvimento. A desnutrição
e a dificuldade de acesso aos medicamentos são outros fatores que leva a cronificação
dessas doenças.
Segundo Lima et al. (2011), os vegetais têm sido muito utilizados para fins láticos
e curativos no tratamento de infecções, entre a diversidade existente encontram-se
aqueles que são objetos para esse estudo. Atualmente existem muitos trabalhos
sendo desenvolvidos para a busca de novas espécies de plantas com atividade tóxica.
Combretum leprosum Mart. (Combretaceae) é um tipo de arbusto de pequeno
porte que cresce principalmente no nordeste do Brasil, onde é conhecido como
mufumbo, mofumbo, cipoaba e pente-de-macaco. No uso popular, os extratos são
feitos em diferentes partes da planta como a raiz, caule e folhas, e são conhecidos

pelas suas propriedades supostamente afrodisíacas, sedativas, expectorantes e
hemostáticas (ALVES FILHO et al., 2015).
De acordo com Teles et al. (2011), o estudo farmacológico com os extratos e
compostos isolados de diferentes partes da C. leprosum Mart, sugerem que as atividades
biológicas possuem efeitos antiulcerogênico, antiinflamatório e antiproliferativo, e
contra a forma promastigota de Leishmania amazonenses.
O conhecimento sobre as plantas tóxicas e os efeitos adversos que elas podem
causar é importante para a população, pois várias espécies podem ter uso medicinal
e espécies forrageiras tóxicas causam prejuízo à produção animal. Diante disso o
presente estudo teve como objetivo verificar a toxidade de extrato aquoso de C.
leprosum Mart.
2 | METODOLOGIA
Para a avaliação da toxicidade de C. leprosum Mart. foi utilizada a metodologia

de Allium cepa devido ao seu baixo custo. As análises tiveram início no dia 1° de
agosto de 2016 e término no dia 4 de setembro do mesmo ano. Os bulbos foram
postos para germinar com a parte inferior mergulhada em solução contendo 50 mL
de H2O destilada. Após aparecimento de raízes os bulbos foram expostos em contato
com o extrato vegetal em teste, durante um período de 48 horas.
Após esse período, as raízes com a coifa com um tamanho por volta de 2 cm foram
retiradas. Aproximadamente seis raízes foram mantidas nos bulbos para realização do
processo de controle, onde os mesmos retornavam para água destilada durante um
período de 24 horas. Logo após, foram feitas lâminas e analisadas em microscópio
para contagem de células.
Os meristemas radiculares foram armazenados em microtubos contendo fixador
Carnoy por 24 horas e posteriormente, as raízes foram lavadas em água destilada
por três vezes e armazenadas em álcool 70% sob refrigeração até a confecção
das lâminas. Foram realizados esfregaços em lâminas aguardando a secagem em
temperatura ambiente, e logo após a coração e nova secagem. Realizou-se a contagem
de 5000 células em microscopia óptica na objetiva de 40X para registro de células com
anomalias no ciclo mitótico.
O índice mitótico geral observado foi de interfase 48,94%; prófase 49,64%;

metáfase 4,54%; anáfase 3,84% e telófase 1,06 %. Com esses valores é possível
constatar que o extrato aquoso de C. leprosum Mart. nas concentrações utilizadas
nesse teste tem atividade tóxica.
De acordo com Pereira et al. (2017), os efeitos da toxicidade da C. leprosum

Mart. podem causar alterações nos índices mitóticos, que na verdade é o número total
de células que se dividem no ciclo celular, levando ao aumento do mesmo, com isso
leva à proliferação celular descontrolada e à formação de tecidos tumorais; também
pode fazer com que haja uma diminuição do índice mitótico, caracterizando a ação
química no crescimento e no desenvolvimento do organismo exposto.
Ainda de acordo com os autores, além da avaliação das preparações florestais
para efeitos citotóxicos, a casca de C. leprosum Mart. também foi utilizada para estimar
a toxicidade dos ratos. O extrato que foi tirado da casca, o hidroalcoólico mostrou uma
toxicidade aguda quando administrado por via oral e intraperitoneal em camundongos
machos, entretanto este mesmo extrato não mostrou toxicidade reprodutiva em
ratos fêmeas, ou seja, não promoveu atividade estrogênica ou antiestrogênica ou
toxicidade nos estágios embrionários (implantação, fertilização ou organogênese),
sem mortalidade fetal.
Segundo Lopes et al. (2012), o epicatequina é um composto isolado da fração
hidroalcoólica de Combreum leprosum Mart. e é conhecido principalmente pelas
suas propriedades antioxidantes. Existem vários estudos que avaliam o uso desta
substância para o tratamento de doenças cardiovasculares e para a prevenção de
câncer. Foi demonstrada a possível ação antinociceptiva do epicatequina, onde tem a
capacidade de bloquear os canais de sódio, estruturas que estão intimamente ligadas
à ativação de fibras sensoriais.
De acordo com os resultados do estudo de Silva et al. (2015), o composto
estudado, o lupane, que é isolado a partir de C. leprosum Mart. tem uma citotoxicidade
moderada, não induz a produção de TNF-α e IL-10 e não atua em topoisomerases
humanas.
4 | CONCLUSÃO
Este trabalho reforça a necessidade de se ter um conhecimento maior sobre

as propriedades químicas dos extratos que são utilizados popularmente para tratar
várias patologias, sem um conhecimento certo sobre as propriedades químicas e seus
efeitos.
REFERÊNCIAS
ALVES FILHO, F.C.; CAVALCANTI, P.M.S.; PASSAGLIA, R.C.A.T.; BALLEJO, G. Extrato das cascas
de Combretum leprosum causa relaxamento dependente de endotélio de longa duração em
artérias isoladas. Einstein, v. 13, n.3, p. 395-403, 2015.
FERREIRA, F.S.; SANTOS, S.C.; BARROS, T.F.; ROSSI-ALVA, J.C.; FERNANDEZ, LG. Atividade
antibacteriana in vitro de extratos de Rhizophora mangle L. Revista Brasileira de Plantas
Medicinais, v.13, n.3, 2011.
LACOUTH-SILVA, F.; XAVIER, C.V.; DA S SETÚBAL, S.; PONTES, A.S.; NERY, N.M,; DE CASTRO,
O.B.; FERNANDES, C.F.; HONDA, E.R.; ZANCHI, F.B.; CALDERON, L.A.; STÁBELI, R.G.; SOARES,

A.M.; SILVA-JARDIM, I.; FACUNDO, V.A.; ZULIANI, J.P. The effect of 3β, 6β, 16β-trihydroxylup-
20(29)-ene lupane compound isolated from Combretum leprosum Mart. on peripheral blood
mononuclear cells. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 15, 2015.
LIMA, E.R.; MOREIRA, L.S.; FACUNDO, V.A.; SILVA-JARDIM, I.; TELES, C.B.G. AVALIAÇÃO DA
BIOATIVIDADE DO EXTRATO ETANÓLICO E TRITERPENO LUPANO OBTIDOS DE COMBRETUM
LEPROSUM CONTRA MICROORGANISMOS. SABER CIENTÍFICO, v. 3, n. 1, p. 53-69, 2011.
LOPES L.S.; MARQUES R.B.; FERNANDES H.B.; PEREIRA S.S.; AYRES M.C.; CHAVES M.H.;
ALMEIDA F.R.. Mechanisms of antinociceptive action of (-)-epicatechin obtained from the
hydroalcoholic fraction of Combretum leprosum Mart. & Eic. in rodents. Journal of Biomedical
Science, v.19, n.1, p.68-73, 2012.
MICHELIN, D.C.; MORESCHI, P.E.; LIMA, A.C.; NASCIMENTO, G.G.F.; PAGANELLI, M.O.;
CHAUD, M.V. Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 15, n. 4, p.316-320, 2005.
PEREIRA, J. C. S.; CÂMARA, C. C.; BARROSO COELHO, L. C. B.; SILVA, M. D. Insights on

Pharmacological Properties of Combretum leprosum Mart. Biotechnology Journal International,
v.17, n.3, p.1-13, 2017.
TELES, C.B.G.; MOREIRA, L.S.; SILVA, A.A.E.; FACUNDO, V.A.; ZULIANI, J.P.; STÁBELI, R.G.;
SILVA-JARDIM, I. Activity of the Lupane isolated from Combretum leprosum against Leishmania
amazonenses promastigotes. Journal of the Brazilian Chemical Society, v.22, n.5, 2011.

CAPÍTULO 16
ESTUDO E MODELAGEM CINÉTICA HETEROGÊNEA

DA REAÇÃO DE CETALIZAÇÃO DO GLICEROL COM
ACETONA UTILIZANDO ZEÓLITAS DO TIPO H-BEA E
H-FER COMO CATALISADORES
Vinicius Rossa combustíveis. As zeólitas foram adquiridas no

UFU, Faculdade De Engenharia Química - PROCAT/UFRJ e possuem metodologias de
Laboratório GPCATT síntese e produção próprias. Um abrangente
Uberlândia – MG estudo cinético foi realizado para a reação de
Gisel Chenard Díaz cetalização do glicerol com acetona utilizando
UFRJ, Escola de Química - Laboratório GreenTec catalisadores heterogêneos H-BEA (XA=74%
Rio de Janeiro – RJ em 180min), e H-FER (XA=57 % em 180min),
Yordanka Reyes Cruz nos modelos de Langmuir-Hinshelwood-
UFRJ, Escola de Química - Departamento de Hougen-Watson (LHHW) e Eley-Rideal (ER).
Processos Orgânicos - Laboratório GreenTec. Foi verificado também que o catalisador mais
Rio de Janeiro – RJ ativo (H-BEA) pode ser utilizado por 4 vezes
Sibele Berenice Castellã Pergher sem necessitar de lavagens ou pré-tratametos
UFRN, Instituto de Química - Departamento de entre as reações em reator batelada. Pelo
Química do Petróleo - LABPMOL
cálculo de TOF para todos os catalisadores foi
Natal – RN
verificado que é possível substituir o catalisador
Donato Alexandre Gomes Aranda homogêneo (PTSA) pelos catalisadores
UFRJ, Escola de Química - Departamento de
heterogêneos (H-BEA e H-FER) no processo
Engenharia Química - Laboratório GreenTec.
industrial de cetalização do glicerol com
Rio de Janeiro – RJ
acetona.
PALAVRAS-CHAVE: Glicerol, Solketal,
Modelagem Cinética Heterogênea.
RESUMO: O Solketal comercial é conhecido
como Augeo™ SL 191 e é produzido pela ABSTRACT: Commercial Solketal is known as
Rhodia (membro da Solvey Group), destaca- Augeo ™ SL 191 and is produced by Rhodia
se por ser um solvente de evaporação lenta, (a member of the Solvey Group), which stands
derivado da glicerina que é considerada uma out as a slow evaporation solvent derived
fonte renovável. Apresenta baixa toxicidade from glycerin which is considered a renewable
para a saúde humana e para o meio ambiente. source. It has low toxicity to human health and
É um ótimo solvente para resinas e polímeros, the environment. It is a good solvent for resins
substituindo os solventes derivados do petróleo and polymers, replacing solvents derived from
e pode ser utilizado como aditivo de (bio) petroleum and can be used as an additive of (bio)

fuels. Zeolites were purchased from PROCAT/ UFRJ and have their own methodologies
synthesis and production. A comprehensive kinetic study was performed for the
ketalization reaction using homogeneous PTSA catalyst (XA=67% to 180min) for cases
where there was or was not inhibition by water; using heterogeneous H-BEA catalysts
(XA=74% to 180min), and H-FER (XA=57% to 180min) in the Langmuir-Hinshelwood-
Hougen-Watson (LHHW) and Eley-Rideal (ER) models It was also verified that the most
active catalyst (H-BEA) can be used 4 times without washing or pretreatment among
reactions in batch reactor. By the calculation of TOF for all the catalysts it was verified
that it is possible to replace the homogeneous catalyst (PTSA) by the heterogeneous
catalysts (H-BEA and H-FER) in the industrial process of ketalization of glycerol with
acetone.
KEYWORDS: Glycerol, Solketal, Heterogeneous Kinetic Modeling.
1 | INTRODUÇÃO
Para cada litro de biodiesel produzido por transesterificação de óleos e/

ou gorduras são obtidos 100 mL (10 %) de glicerina. Mesmo que vários produtos
contenham glicerina ou glicerol em sua formulação ainda não é o suficiente para
atender a demanda. Sendo necessário convertê-la em produtos de maior valor
agregado. Assim surgiu a gliceroquímica que abrange reações do tipo cetalização,
acetalização, carbonatação, desidratação, esterificação, eterificação, hidrogenólise,
oxidação, cloração entre outras. (SANCHEZ et al., 2010; MOTA et al., 2009; NANDA
et al., 2016; REDDY et al., 2011; ROYON et al., 2011; ROSSA et al., 2017) Neste
trabalho foi estudado a produção de Solketal pela reação de cetalização de glicerol
com acetona na presença de catalisadores ácidos (H-BEA e H-FER).
O Solketal é um excelente aditivo para a gasolina, pode ser usado na formulação
do óleo diesel e biodiesel. (MOTA et al., 2009) Também pode ser usado como “Solvente
Verde”.
A cetalização do glicerol gera compostos oxigenados ramificados, porém quando
a reação é realizada com acetona a seletividade é maior para a molécula do Solketal
(2,2-Dimetil-[1,3]dioxolan-4-il)metanol, que possui anel de cinco membros. E menor
para a molécula de 2,2-dimetil-[1,3]dioxan-5-ol, que possui anel de seis membros,
Figura 1 (ROYON et al., 2011).
OH
O O O
Catalisador ácido O
HO OH
+ + + H2 O
O OH
Solketal OH
Glicerol Acetona Dioxalanas Dioxanas
Figura 1 – Reação de cetalização do glicerol com acetona. (Adaptado de REDDY et al., 2011)

A reação química que representa a produção de Solketal foi dada por:
"H+"
A+B C + D (Eq. 1)
onde A, B, C e D correspondem respectivamente ao glicerol, à acetona, ao
Solketal e à água. O “H+” refere-se à catálise ácida. O estudo cinético em catálise
heterogênea é composto por sete etapas: (1) Difusão Externa (reagentes); (2) Difusão
Interna (reagentes); (3) Adsorção (reagentes); (4) Reação Química; (5) Dessorção
(produtos); (6) Difusão Interna (produtos); (7) Difusão Externa (produtos).
O estudo cinético, neste trabalho, considerou apenas as etapas químicas: (3), (4)
e (5). Sendo propostos dois mecanismos: Eley-Rideal (ER) e Langmuir-Hinshelwood-
Hougen-Watson (LHHW) para descreverem as transformações químicas e físicas
(HOUGEN et al., 1959; ELEY et al., 1940) que ocorrem na reação de cetalização do
glicerol com acetona ao utilizar as zeólitas H-BEA e H-FER como catalisadores.
Os catalisadores H-BEA (ZEOLYST S. A., SAR 19) e H-FER (PROCAT-UFRJ,

SAR 16) foram calcinados a 500°C/4 h, rampa de 10°C/min e armazenados a 100°C
até o momento das reações.
As cinéticas das reações foram realizadas em um reator batelada (300mL)
alimentado com 40g de glicerol (0,43mol), 100g de acetona (1,72 mols), ambos da
PROQUIMIOS (99.5 % P.A.), e 5% (em relação à massa de glicerol). As condições
reacionais foram 60°C, 700rpm, pressão autógena, razão molar de 1:4. Alíquotas
foram coletadas em diferentes tempos entre 5-180 minutos. Após, com os valores de
conversão (XA) para cada tempo (t) foi possível modelar as cinéticas com o auxílio do
Software STATISTICA 12.0. A metodologia aplicada para definir os modelos cinéticos
foi adaptada de HOUGEN (1959), ELEY (1940) e SHEKARA (2011).
REUSO DO CATALISADOR MAIS ATIVO: O teste de reuso consistiu em reutilizar
o mesmo catalisador por 5 vezes após a centrifugação da suspensão (catalisador/
solução), sem lavagens e/ou calcinação. Ao término das reações, a suspensão
reacional foi filtrada para a separação da suspensão reacional/catalisador. À mistura
obtida foi adicionado 2g de sulfato de sódio anidro para a remoção parcial de água e
novamente foi filtrada. Todas as amostras foram armazenadas a 15°C até o momento
da análise por CG-FID em coluna capilar Carbowax.
CARACTERÍSTICAS DOS CATALISADORES: A zeólita H-BEA tem um tamanho
bem uniforme e em torno de 10µm, já a zeólita H-FER possui uma distribuição de
tamanho de partículas menos uniforme, tendo partículas de tamanho entre 10µm,
70µm e 400µm. As Tabelas 1, 2 e 3 mostram as características de textura e acidez dos
catalisadores H-BEA e H-FER.

RESULTADOS H-BEA H-FER
Área BET [m²/g] 535 328
Área MICROPOROS [m²/g] 337 309
Área EXTERNA [m²/g] 198 19,0
Volume TOTAL [cm³/g] 0,56 0,18
Volume MICROPOROS [cm³/g] 0,15 0,15
Volume BJH/DES [cm³/g] 0,53 0,04
Tamanho médio de poros BET [nm]
4,20 2,20
Tamanho médio de poros BJH/DES [nm]
13,6 7,70
Tabela 1 - Características texturais dos catalisadores H-BEA e H-FER obtidos pela técnica de
Sorção de N2.
Acidez (mmolNH3/gCat)
Catalisador Sítios fracos Sítios Fortes Acidez Total F/f*
H-BEA 0,16 1,09 1,25 6,81
H-FER 0,25 0,73 0,98 2,92
Tabela 2 – Características da acidez dos catalisadores: quantidade de Sítios fracos, Fortes e

Acidez Total.
*Razão Sítios Fortes:Sítios fracos.
Concentração de sítios ácidos (µmolPy/gCat)

H-BEA H-FER
T (°C) Brönsted Lewis B/L* Brönsted Lewis B/L*
150 60,4 33,66 1,79 49,73 3,78 13,16
250 39,26 58,14 0,67 60,4 4,59 13,16
350 24,16 45,9 0,53 51,34 4,59 11,18
Tabela 3 – Tipo de sítios ácidos presentes nos catalisadores em μmol piridina/g de catalisador:
sítios ácidos de Brönsted (B) e sítios ácidos de Lewis (L), medidos a a 150 °C.
*B/L: Razão da concentração dos sítios ácidos de Brönsted/sítios ácidos de Lewis.
Ao fazer uma análise da Figura 2, percebe-se que o catalisador H-BEA foi o que
proporcionou melhores resultados de conversão de glicerol (XA) atingindo 74,17% aos
180min. Já o catalisador H-FER finaliza a reação com conversão (XA) 57,07% para o
glicerol.

Figura 2. Curva cinética (XA versus t) e seletividade à Solketal encontrada para os catalisadores
H-BEA e H-FER.
A Figura 2 mostra que o catalisador mais seletivo á Solketal (S5) foi a zeólita
H-BEA apresentando valores praticamente constante, em média 97,94%, durante todo
o processo. Já a seletividade da zeólita H-FER na produção de Solketal (S5) mostrou-
se bastante instável, variando entre 77,30 e 95,13% durante o processo.
Para a determinação das constantes cinéticas considerou-se os reagentes
glicerol e acetona e como produtos somente o Solketal e a água, o produto dioxana
(anel de 6 membros) foi considerado insignificante para esta etapa, em função do
baixo rendimento e seletividade.
• MODELAGEM CINÉTICA HETEROGÊNEA:
A reação química que representa a reação de cetalização do glicerol com acetona
foi dada por:
"H+"
A+B C + D (Eq. 1)
Onde A, B, C e D correspondem respectivamente ao glicerol, à acetona, ao
Solketal e à água. O “H+” refere-se aos sítios ácidos do catalisador heterogêneo.
O estudo cinético em catálise heterogênea é composto por sete etapas:
1. Difusão dos reagentes do seio do fluido até a superfície externa do catalisador;
2. Difusão dos reagentes da superfície externa do catalisador para o interior dos
poros;
3. Adsorção química ou física dos reagentes;
4. Reação Química;
5. Dessorção dos produtos;.
6. Difusão dos produtos do interior dos poros para a superfície externa do
catalisador;
7. Difusão dos produtos da superfície externa do catalisador para o seio do

fluído.
As etapas 3, 4 e 5 são de natureza química dependem fundamentalmente da
natureza do catalisador utilizado (H-BEA e H-FER). Enquanto que as etapas 1, 2, 6 e
7 que são totalmente de natureza física foram desprezadas.
Neste trabalho foram propostos dois mecanismos e estes mecanismos deram
origem a 11 modelos cinéticos, criados com o auxílio software Maple 18, que tentam
descrever o conjunto de transformações químicas e físicas que ocorrem na reação
de cetalização do glicerol com acetona usando os catalisadores heterogêneos do tipo
H-BEA e H-FER: A metodologia aplicada para definir os modelos cinéticos foi adaptada
de HOUGEN (1959), ELEY (1940) e SHEKARA (2011). Através dos mecanismos
de LHHW e ER é possível obter expressões que definem matematicamente o fator
cinético, a força motriz e o termo de adsorção (Tabela 4-8) e com a Equação 2 pode-se
construir os modelos que descrevem a taxa de reação, :
(Eq. 2)
Sendo n: expoente de adsorção.
Etapa Controladora fc
Adsorção de A kA
Adsorção de B kB
Dessorção de C KC.K
Adsorção de A com dissociação de A kA
Reação Homogênea K
Tabela 4 - Fator Cinético (fc)
Etapa Controladora A↔C A↔C+D A+B↔C A+B↔C+D

Adsorção de A PA-(PC/K) PA-(PC.PD/K) PA-(PC/K.PB) PA-(PC.PD/K.PB)
Adsorção de B 0 0 PB-(PC/K.PA) PB-(PC.PD/K.PA)
Dessorção de C PA-(PC/K) PA/PD-(PC/K) PA.PB-(PC/K) PA.PB/PD-(PC/K)
Reação Química PA-(PC/K) PA-(PC.PD/K) PA.PB-(PC/K) PA.PB-(PC.PD/K)
Reação Homogênea PA-(PC/K) PA-(PC.PD/K) PA.PB-(PC/K) PA.PB-(PC.PD/K)
Tabela 5 - Força Motriz.

Adsorção de A KA.PC/K KA.PC.PD/K KA.PC/K.PB KA.PC.PD/K.PB
KA.PA é substituido por
Adsorção de B 0 0 KB.PC/K.PA KB.PC.PD/K.PA
KB.PB é substituido por
Dessorção de C K.KC.PA K.KC.PA/PD K.KC.PA.PB K.KC.PA.PB/PD
KC.PC é substituído por
Adsorção de A com (KA.PC/K)1/2 (KA.PC.PD/K)1/2 (KA.PC/K.PB)1/2 (KA.PC.PD/K.PB)1/2
dissociação de A
KA.PA é substituído por
Quando A não é adsorvido 0 0 0 0
KA.PA é substituído por
(similar para B, C ou D)
Tabela 6 - Determinação do termo de adsorção geral: (1+KAPA+KBPB+KCPC+KDPD+KTPT)n.

T = Intermediário formado.

Sem dissociação k.KA k.KA k.KA.KB k.KA.KB
Com dissociação de A k.KA k.KA k.KA.KB k.KA.KB
Sem adsorção de B k.KA k.KA k.KA k.KA
Sem adsorção de B k.KA k.KA k.KA k.KA
e dissociação de A
Tabela 7 - Quando a etapa controladora é a reação química, fator cinético (fc)
Etapa Controladora A↔C A↔C+D A+B↔ C A+B↔C+D

Adsorção de A sem dissociação 1 1 1 1
Dessorção de C 1 1 1 1
Adsorção de A com dissociação 2 2 2 2
Reação Química sem dissociação de A 1 2 2 2
Reação Química com dissociação de A 2 2 3 3
Reação Química sem dissociação de A 0 - 1 2
(Sem adsorção de B)
Reação Química com dissociação de A - - 2 2
(Sem adsorção de B)
Tabela 8 - Expoente de adsorção (n)
Sendo:
• (-rA): Taxa de reação, [mol gcat-1 min-1];
• PA, PB, PC e PD: Pressão parcial de cada componente (A, B, C e D), [atm];
• k: Coeficiente cinético, [mol gcat-1 min-1];
• K: Constante de equilíbrio da reação, adimensional;
• KA, KB, KC e KD: Constante de reação de cada componente (A, B, C e D),
[atm-1];
• kA, kB, kC, kD: Coeficiente cinético de cada componente (A, B, C e D), [mol
gcat-1 min-1 atm-1].
(HOUGEN & WATSON, 1959)
A seguir será detalhado o procedimento utilizado para a substituição dos termos
cinéticos, potencial e de adsorção na Equação 3, obtidos das Tabelas 4-8, segundo
as condições assumidas para cada modelo. Para a criação dos modelos as pressões
(PA, PB, PC e PD) foram substituídas pelas concentrações molares (CA, CB, CC e CD),
seguindo este raciocínio:
Pi
Ci =
R.T (Eq. 3)
Onde Ci é a concentração molar (mol/L) da espécie i = A, B, C e D
. Pi é a pressão
parcial (atm) da espécie i = A, B, C e D
. R é a constante dos gases e igual a 0,082 atm L/
mol K e T é a temperatura em Kelvin (K).
Neste trabalho os dados foram obtidos em termos de conversão de glicerol (XA),
então como no início da reação não há produtos, considerou-se que:
CA = CA0 . (1 - XA) (Eq.4)

CB = CB0 – (CA0 . XA) (Eq. 5)
CC = CA0 . XA (Eq. 6)
CD = CA0 . XA (Eq. 7)
Considerando que não existem produtos no início da reação, ou seja, CC0 = CD0
= 0, e sabendo-se que se tratando de cinética heterogênea para um reator batelada
se cumpre que:
(Eq. 8)
Se obtém para cada modelo a equação da taxa de reação como função da

conversão do glicerol (XA), onde WCat (g) corresponde a massa de catalisador utilizada,
neste caso 2 g e t é o tempo (min).
1) Mecanismo de Eley-Rideal. Este mecanismo sugere que somente um dos
reagentes se adsorva na superfície do catalisador e reaja com o outro reagente que
não foi adsorvido, presente na fase líquida. Esse mecanismo consiste em 3 etapas:
na primeira ocorre a adsorção de um dos reagentes ou glicerol (A) ou acetona (B) nos
sítios ativos; na etapa 2 ocorre a reação química entre a acetona (B) ou glicerol (A)
adsorvido, sendo que somente um dos reagentes se adsorve (A) ou (B), enquanto o
outro (B) ou (A) está presente na fase líquida e por fim a dessorção do produto que
foi formado nos sítios catalíticos, Solketal (C) ou Água (D), sendo que somente um se
dessorve enquanto o outro está presente a fase líquida.
# Modelo 1: Reação reversível, sem dissociação dos reagentes (A e B), etapa
controladora: adsorção do glicerol (A);
(Eq. 9)
controladora: adsorção da acetona (B);
(Eq. 10)
controladora: reação química entre o glicerol (A) adsorvido na superfície do catalisador
com a acetona (B) presente na fase líquida;
(Eq. 11)

controladora: reação química entre a acetona (B) adsorvida na superfície do catalisador
com o o glicerol (A) presente na fase líquida;
(Eq. 12)
controladora: dessorção do Solketal (C);
Eq. 13)
controladora: dessorção da água (D);
(Eq. 14)
2) Mecanismo de Langmuir-Hinshelwood-Hougen-Watson (LHHW). Este
mecanismo propõe que a reação de cetalização do glicerol consiste em três etapas:
na primeira ocorre a adsorção do glicerol (A) e da acetona (B) nos sítios ativos; na
segunda etapa ocorre a reação química entre os reagentes, glicerol (A) e a acetona
(B), na superfície em que o Solketal (C) e água (D) são formados; na última etapa
ocorre a dessorção do Solketal (C) e da água (D).
controladora: adsorção do glicerol (A);
(Eq. 15)
controladora: adsorção da acetona (B);
(Eq.16)
controladora: reação química entre o glicerol (A) e a acetona (B), ambos adsorvidos
na superfície do catalisador;

(Eq. 17)
controladora: dessorção do Solketal (C);
(Eq. 18)
controladora: dessorção da água (D);
(Eq. 19)
Onde CA0 é a concentração molar da glicerina (mol/L), M (admensional) é o
quociente entre a concentração molar da acetona CB0 (10,91 mols/L) e a concentração
molar do glicerol CA0 (2,71 mols/L), M = CB0/CA0.
Os parâmetros KA, KB, KC e KD (L/mol) são as constantes de equilíbrio de adsorção
dos reagentes A (glicerol), B (acetona) e dos produtos C (Solketal) e D (água). K
(admensional) é a constante de equilíbrio da superfície. Já as representações kad, A;
kad, B; krs, A.X; krs, B.X; kdes, C; kdes, D; kAD, A; kAD, B; kRS; kDES, C; kDES, D são referentes à constante
cinética, k, (gCat L mol-1 min-1) referente a cada modelo criado. Enquanto rad, A; rad, B; rrs,
; rrs, B.X; rdes, C; rdes, D; rAD, A; rAD, B; rRS; rDES, C; rDES, D corresponde á taxa de reação (mol L-1
A.X
gCat-1 min-1) de cada modelo criado.

Os resultados dos parâmetros cinéticos para cada mecanismo e modelos criados
foram estimados através da regressão não-linear, utilizando o software STATISTICA
12.0 são apresentados nas Tabelas 9 (ER) e 10 (LHHW).
H-BEA Etapa Controladora

Parâmetros Cinéticos ad, A ad, B rs, A.X rs, B.X des, C des, D
Mecanismo: ER Modelo 1 Modelo 2 Modelo 3 Modelo 4 Modelo 5 Modelo 6
k (gCat L mol-1 min-1) 3,79E-02 9,42E-03 -1,47E-02 4,73E-01 nc nc
K 5,81E-01 5,81E-01 5,95E-01 5,95E-01 nc nc
KA (L/mol) -7,49E-01 ---- -1,13E-01 ---- nc nc
KB (L/mol) ---- 2,07E-01 ---- 8,82E-03 nc nc
KC (L/mol) 5,32E-01 ---- -3,10E-02 ---- nc nc
KD (L/mol) ---- 8,10E-01 ---- 1,39E-01 nc nc
R² 0,88759 0,8876 0,8872 0,8872 nc nc
Q 0,002416 0,002416 0,002424 0,002424 nc nc
H-FER Etapa Controladora
Parâmetros Cinéticos ad, A ad, B rs, A.X rs, B.X des, C des, D
Mecanismo: ER Modelo 1 Modelo 2 Modelo 3 Modelo 4 Modelo 5 Modelo 6

k (gCat L mol-1 min-1) 3,73E-03 9,27E-04 -4,57E-02 9,84E-02 nc nc
K 1,54E+04 4,91E+04 2,39E-01 2,39E-01 nc nc
KA (L/mol) 9,92E+05 ---- -1,13E-02 ---- nc nc
KB (L/mol) ---- 6,53E+05 ---- 1,31 nc nc
KC (L/mol) -4,04 ---- -1,68E-01 ---- nc nc
KD (L/mol) ---- -3,76 ---- -1,17 nc nc
R² 0,93457 0,9346 0,8224 0,8224 nc nc
Q 0,000062 0,000062 0,000159 0,000159 nc nc
Tabela 9 - Resultados dos Parâmetros de Ajuste estimados para a reação de cetalização do

glicerol com acetona pelo mecanismo ER, considerando os onze modelos propostos, com o
uso dos catalisadores H-BEA e H-FER. Condições: 700 rpm; razão molar 1:4 (G:A); 5 % de
catalisador em relação à massa de glicerol; 180 min.
nc: não convergiu.
H-BEA ETAPA CONTROLADORA

Parâmetros Cinéticos ADS, A ADS, B RS DES, C DES, D
Mecanismo: LHHW Modelo 7 Modelo 8 Modelo 9 Modelo 10 Modelo 11
k (gCat L mol-1 min-1) 7,98E-02 8,61E+02 4,04E+05 nc nc
K 5,81E-01 5,75E-01 5,78E-01 nc nc
KA (L/mol) -1,58 3,37E+04 3,08E-01 nc nc
KB (L/mol) 1,01E-01 1,19E+04 3,05E+05 nc nc
KC (L/mol) 6,11E-01 5,81E+04 2,97E+05 nc nc
KD (L/mol) 6,11E-01 5,81E+04 2,97E+05 nc nc
R² 0,88759 0,8875 0,8868 nc nc
Q 0,002416 0,002419 0,002433 nc nc
H-FER ETAPA CONTROLADORA
Parâmetros Cinéticos ADS, A ADS, B RS DES, C DES, D
Mecanismo: LHHW Modelo 7 Modelo 8 Modelo 9 Modelo 10 Modelo 11
k (gCat L mol-1 min-1) 1,86E-04 2,17E-05 1,46E-01 nc nc
K 3,38E-01 1,13 2,98E-01 nc nc
KA (L/mol) 1,09 -3,60E-01 1,91E-01 nc nc
KB (L/mol) -8,71E-02 3,45E-01 2,39E-01 nc nc
KC (L/mol) -1,45E-01 -2,24E-01 -7,05E-02 nc nc
KD (L/mol) -1,45E-01 -2,24E-01 -7,05E-02 nc nc
R² 0,92846 0,9328 0,8224 nc nc
Q 0,000068 0,000064 0,000159 nc nc
Tabela 10 - Resultados dos Parâmetros de Ajuste estimados para a reação de cetalização do

glicerol com acetona pelo mecanismo LHHW, considerando os onze modelos propostos, com
o uso dos catalisadores H-BEA e H-FER. Condições: 700 rpm; razão molar 1:4 (G:A); 5 % de
catalisador em relaç.ão à massa de glicerol; 180 min.
nc: não convergiu.
Para avaliar a adequabilidade dos modelos propostos considerou-se,

primeiramente, o realismo físico dos parâmetros estimados através da regressão não-
linear. Isto implica em dizer que os modelos nos quais foram obtidos valores negativos
para os parâmetros K; KA; KB; KC; KD; kad, A; kad, B; krs, A.X; krs, B.X; kdes, C; kdes, D; kAD, A; kAD, B; kRS;
kDES, C e kDES, D foram descartados. A partir desta designação, algoritmos de convergência
disponíveis no software STATISTICA 12.0 foram testados para um mesmo modelo,
dos quais o Quase-Newton foi o que melhor conseguiu minimizar o valor da soma dos

resíduos quadrados (Q), que é a diferença ao quadrado entre os valores das taxas de
reação experimental e das taxas de reação calculadas pelos modelos.
Ao observar as Tabelas 9 e 10 verificou-se que os modelos heterogêneos criados
somente podem descrever a cinética da reação heterogênea para o catalisador H-BEA,
pois para o catalisador H-FER todos os 11 modelos resultaram em um ou mais valores
negativos para seus parâmetros, sendo assim descartados.
Para estimar mecanismo e o modelo adequado para as reações empregando
H-BEA foi realizada uma análise com base na observação dos coeficientes de
variação, R², que mede a qualidade da confiança que pode ser depositada na equação
de regressão obtida como instrumento de precisão, gerando resultados confiáveis se
próximos ou iguais a 1.
Para o mecanismo de Eley-Rideal as etapas: ADSORÇÃO DE (B) ACETONA
(R²=0,8876) e REAÇÃO QUÍMICA COM SOMENTE (B) ACETONA SE ADSORVENDO
NA SUPERFÍCIE DO CATALISADOR (R² = 0,8872) podem explicar os fenômenos que
ocorrem quando usa-se H-BEA como catalisador na reação de cetalização do glicerol
com acetona e serem admitidas como as possíveis etapas controladoras.
Para o mecanismo de Langmuir-Hinshelwood-Hougen-Watson as etapas:
ADSORÇÃO DE (B) ACETONA (R² = 0,8875) e REAÇÃO QUÍMICA ENTRE OS
REAGENTES (A) GLICEROL e ACETONA (B) ADSORVIDOS NA SUPERFÍCIE
DO CATALISADOR (R² = 0,8868), podem ser admitidas como as possíveis etapas
controladoras.
Pode-se dizer que existem 4 modelos cinéticos que possuem bons ajustes para
o catalisador H-BEA:
• Modelos 2 e 4 do mecanismo de ER;
• Modelos 8 e 9 do mecanismo de LHHW.
Estudos sobre a cinética da reação de cetalização do glicerol com acetona
utilizando catalisadores heterogêneos foram realizados pelo grupo de Nanda (2014) e
pelo grupo de Esteban (2015).
Nanda (2014) utilizou a resina Amberlyst 35 como catalisador e utilizou o
modelo de LHHW para descrever a reação de cetalização do glicerol com acetona,
sendo a reação química a etapa limitante e representa, com a adequação dos dados
apresentados neste trabalho, um modelo plausível. Porém, o modelo de ER parece
ser o mais plausível. O grupo de Esteban (2015) chegou a essa mesma conclusão
e a possível explicação é de que o modelo de LHHW envolve a adsorção do glicerol
em direção a um sítio ativo que já contém uma molécula de acetona adsorvida. Isto
é muito menos provável de acontecer devido a estrutura da molécula de glicerol ter
menos afinidade, em comparação a molécula de acetona, com o sítio ativo das zeólitas.
Além disso, o excesso de acetona (4:1 molar) presente no meio reacional diminui a
possibilidade da adsorção do glicerol junto à acetona no sítio ativo ou catalítico da
zeólita H-BEA.

A aplicação de modelagem molecular computacional para o estudo do mecanismo
da reação de cetalização do glicerol com acetona, utilizando H-BEA e H-FER como
catalisadores, permitiria confirmar tanto os mecanismos, como as etapas controladoras,
para este caso.
• REUSO DO CATALISADOR H-BEA:
Foram realizados os experimentos de reuso para o catalisador H-BEA nas
condições ótimas, encontradas pelo planejamento experimental. Condições: 700 rpm;
razão molar 1:4 (G:A); 5 % de catalisador em relação à massa de glicerol; 60 °C;
60 min. Para a realização destes experimentos, no final da reação, o catalisador foi
apenas separado da solução reacional por filtração e logo em seguida foi reutilizado
por mais quatro vezes, da mesma maneira.
O motivo pelo qual optou-se em proceder os testes de reuso sem a necessidade
de pré-tratametos (lavagem e calcinação) para o catalisador entre uma reação e outra
foi para evitar o tempo morto entre uma reação e outra. Pois, industrialmente, não é
viável parar a produção para lavar e calcinar o catalisador a cada 60 min, visto que o
estudo se trata de um reator batelada.
O catalisador H-BEA em sua primeira utilização apresenta uma excelente
conversão de glicerol para a reação de cetalização do glicerol com acetona, atingindo
aproximadamente 70 % de conversão de glicerol. Da primeira reutilização até a terceira
a conversão de glicerol cai e atinge 50 %, em média. Se mantendo praticamente
constante, com conversão semelhante à conversão obtida pela indústria, 52,55 %, ao
utilizar o catalisador homogêneo (PTSA). Porém, a partir da quinta reação a conversão
de glicerol cai muito, convertendo somente 21,61 % do glicerol alimentado no reator. A
seletividade à Solketal, S5, se mantém constante em todo o processo ≈ 98 %.
Mesmo que os catalisadores ácidos possuam alta atividade podem ser
desativados pelo bloqueio dos sítios ativos por moléculas de água formadas durante
a reação, acrescentam os grupos de Silva (2011) e Sandesh (2015). Quanto maior for
à hidrofobicidade do catalisador menor será o número de sítios ácidos. No entanto, os
grupos hidrofóbicos atuam na interface glicerol-acetona, reduzindo a interferência de
moléculas de água na superfície do catalisador. (SILVA et al., 2011; SANDESH et al.,
2015)
De acordo com a literatura, tanto os sítios ácidos de Lewis como os de Brönsted
são ativos para a reação de cetalização do glicerol com acetona. (GADAMSETTI et
al., 2015 ; SANDESH et al., 2015; KOWALSKA-KUS et al., 2016; NANDA et al., 2016 ;
ROSSA et al., 2017 ; STAWICKA et al., 2016).
O grupo de Stawicka (2016) concluiu que os sítios ácidos de Brönsted foram
os mais eficientes, quando comparado aos sítios ácidos de Lewis ou uma mistura de
sítios ácidos Brönsted-Lewis. (STAWICKA et al., 2016)
Já se tratando de catálise homogênea de acordo com Li (2012) os ácidos de
Lewis foram muito mais eficientes do que os ácidos de Brönsted. (LI et al., 2012)

Neste trabalho, a concentração de sítios ácidos de Brönsted e de Lewis foram
muito maiores para o catalisador H-BEA do que para o catalisador H-FER. Ambas às
naturezas de sítios foram determinantes para a reação ocorrer. Portanto, as variáveis:
maior força ácida e natureza mista de sítios ácidos de Brönsted e Lewis também
contribuíram para que a zeólita H-BEA fosse o catalisador mais ativo.
Stawicka (2016) sugere que a seletividade á solketal se deve aos sítios ácidos
de Brönsted, sendo estes os mais eficientes para a seletividade.
A área específica, área externa, volume total (micro + meso) e a distribuíção de
tamanho de poros, também são muito superiores para a zeólita H-BEA se comparado
com a zeólita H-FER
O mesmo comportamento é observado em ROSSA (2017) na desativação ou
perda de atividade catalítica da zeólita H-BEA, ao fim dos experimentos de reuso, com
a perda das características texturais e de cristalinidade do catalisador se comparado
ao seu estado íntegro. (ROSSA et al., 2017)
Todas estas características corroboraram para que a zeólita H-BEA fosse o
catalisador mais ativo na reação de cetalização do glicerol com acetona.
Uma outra abordagem, em termos de Frequência de Turnover (TOF/Turnover
Frequency), foi realizada para estudar a atividade catalítica dos catalisadores utilizados
neste trabalho.
Em catálise ácida, mais especificamente na reação de cetalização de glicerol,
o TOF representa o número de mols de glicerol convertidos (ou mols de Solketal
formados) por mols de sítios ácidos no catalisador, por hora. Os valores de TOF para
os catalisadores H-BEA, H-FER e PTSA foram calculados a partir da Equação 20.
(Eq. 20)
Sendo:
• NC, a quantidade de matéria de Solketal produzido (mol);
• NCat, a quantidade de matéria de catalisador ou de sítios ácidos (mol);
• t, o tempo em horas (h);
• TOF, a Frequência de Turnover (h-1).
Os valores de TOF para cada catalisador e mais detalhes são apresentados
na Tabela 11, a quantidade de matéria referente aos sítios ácidos dos catalisadores
heterogêneos foram mensurados pela análise de TPD-NH3.
TOF
Catalisadores molCat 1h 2h 3h
H-BEA 0,0025 119,22 61,46 42,25
H-FER 0,0020 103,27 57,07 39,53
Tabela 11 – Mais detalhes para os cálculos de TOF.

O valor de TOF tende a diminuir com o passar do tempo, isso é explicado
pela perda de atividade do catalisador ou também pela reação ter chegado ao seu
equilíbrio, para o caso de reações reversíveis. O maior valor de TOF foi de 119,22 h-1,
obtido pelo catalisador H-BEA, após 1 hora de reação. Já o menor valor de TOF foi de
39,53 h-1, obtido pelo catalisador H-FER, após 3 hora de reação. O catalisador H-BEA
continua sendo o mais apropriado, por todas as suas características apresentadas
neste trabalho.
4 | CONCLUSÕES
O catalisador H-BEA exibiu melhores resultados, aos 180min, para a

conversão do glicerol (XA=74,17%), e maior seletividade a Solketal (S5≈98,00 %) e,
consequentemente, o maior rendimento de Solketal (R5 = 72,66 %).
Dos 11 modelos criados para tentar explicar a reação de cetalização do glicerol
com acetona só foram positivos para o catalisador H-BEA. Sendo que somente
os modelos 2, 4, 8 e 9 podem ser empregados com maior confiança para supor o
mecanismo e a etapa controladora da reação catalítica heterogênea.
O catalisador H-BEA pode ser reutilizado por 4 vezes consecutivas e não requer
lavagens e tratamentos ao término de cada reação. Uma quinta reação poderá ser
feita aumentando a temperatura de reação. É muito provável que de alguma forma a
água formada durante a reação e/ou as impurezas dos reagentes, como resíduos de
sódio no glicerol, tenham provocado a desestabilização da estrutura da zeólita H-BEA,
alterando a sua cristalinidade após a quarta reação consecutiva.
Concluiu-se que para o catalisador apresentar a melhor atividade para a reação
de cetalização do glicerol com acetona, em termos de conversão de glicerol o mesmo
deve apresentar alta área B.E.T., SAR elevado, maior contribuíção mesoporosa, menor
tamanho cristalito e de partículas, possuir sítios com maior força ácida e de natureza
tanto de Brönsted como de Lewis ou uma mistura Brönsted-Lewis de preferência com
baixa razão B/L e possuir alta hidrofobicidade e alta estabilidade hidrotérmica.
Os resultados de atividade catalítica avaliados pela Frequência de Turnover
(TOF) apontam que ambos os catalisadores heterogêneos apresentaram valores de
TOF muito próximos, porém o melhor foi o H-BEA.
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 17
ESTUDOS MICROBIOLÓGICOS DAS FOLHAS DA

Eugenia uniflora Linn. (PITANGA)
Giovanna Gabrielly Alves da Silva Fraga

INTRODUÇÃO
Discentes Do Centro Universitário Tabosa De
Almeida – ASCES/UNITA O uso de plantas medicinais é considerado
Maria Gabrielle de Oliveira Tabosa uma alternativa muito útil em programas de
Discentes Do Centro Universitário Tabosa De atenção primária de saúde, já que há justificação
Almeida – ASCES/UNITA
científica das propriedades terapêuticas,
Emilay Lira de Freitas sendo assim recomendável especialmente no
Discentes Do Centro Universitário Tabosa De
atendimento de comunidades carentes (MATOS,
1997). Nesse contexto, surge a Eugenia uniflora
Leticia Vieira dos Santos Beserra
Discentes Do Centro Universitário Tabosa De L. (pitanga), um vegetal originário do Brasil.
Almeida – ASCES/UNITA A Eugenia uniflora L. pertencente à família
Arquimedes Fernandes Monteiro de Melo Myrtaceae apresenta um grande número de
Doscentes Do Centro Universitário Tabosa De constituintes potencialmente terapêuticos,
Almeida – ASCES/UNITA além de ser uma planta de fruto comestível
Risonildo Pereira Cordeiro muito conceituada em todos os lugares do
Doscentes Do Centro Universitário Tabosa De
Brasil. Esta espécie demonstra distintos efeitos
terapêuticos sendo um deles, um alto potencial
antimicrobiano e alta atividade antifúngica por
meio de suas folhas.
RESUMO: O presente trabalho aplicou uma As informações sobre a atividade
metodologia para a análise microbiológica das antimicrobiana da E. uniflora variam de acordo
folhas da Eugenia uniflora (pitanga). A partir com a colheita, estação do ano e estágio de
dos resultados obtidos será possível analisar maturidade (AURICCHIO et al., 2003). Segundo
se a planta possui ação inibitória frente aos
uma pesquisa levantada por Auricchio (2007)
microrganismos testados.
a atividade antimicrobiana das folhas da E.
PALAVRAS-CHAVES: Eugenia uniflora,
uniflora sobre o extrato hidroalcoólico a 70%
microrganismos, atividade antimicrobiana
mostrou ter concentração inibitória mínima
(CIM) de 100 g/mL sobre Staphylococcus
aureus. O óleo essencial da pitanga apresenta
ação antibactericida sobre as bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas demonstrando uma reação variada com maior atividade
de inibição igual ou inferior a 10 mm de diâmetro.
Conforme a pesquisa de Ogunwande et al. (2005) a atividade antibacteriana
da folha e fruto da E. uniflora sobre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
apresentou grande ação contra Staphylococcus aureus com CIM de 39 μg/ml, na
mesma proporção houve resultados de inibição sobre Bacillus cereus, provocado
pelo óleo das folhas. A avaliação dos óleos essenciais das folhas frescas de algumas
espécies da família Myrtaceae, incluindo a E. uniflora demonstrou que os diferentes
óleos essenciais tinham diferentes ações antimicrobianas (LIMBERGER et al. 1998
apud AURICCHIO, 2003).
OBJETIVOS
Analisar o Potencial Inibitório (PI), Concentração Inibitória Mínima (CIM) e

Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) das folhas da Eugenia uniflora
(pitanga).
METODOLOGIA
Primordialmente foi realizado o extrato das folhas da pitanga onde as mesmas

foram colocadas por um período de 24h a sombra e em seguida depositadas na estufa
botânica à 40ºC para secagem. Posteriormente, as folhas secas foram reduzidas a pó
no moinho industrial e encaminhadas à maceração com solução hidroalcoólica a 95%
v/v durante 7 dias. As folhas foram filtradas e evaporadas, obtendo assim o extratos
brutos fluidos. Após a evaporação de 95% da solução, os extratos foram colocados em
uma estufa de ar circulante (B.O.D), até a secura total.
Para a realização da análise do potencial inibitório replicou-se a bactéria suspensas
em 5mL de soro fisiológico dentro de tubos de ensaio e em seguida embebedou o
swab com essa solução. A bactéria foi repicada para a placa de Petri que já estava
com o meio Agar Mueller-Hinton, previamente esterilizado e realizou-se o semeio em
forma de tapete. Dando seguimento ao teste, foram feitos os poços na placa, os quais
foram preenchidos com 50μL da diluição do extrato representando as concentrações
de 50%, 25%, 12,5% e 6,25% em relação à amostra inicial (1g de extrato bruto seco).
Para controle foi utilizado o antibiótico Amoxicilina. Posteriormente, foram colocados
na estufa a 37°C por no mínimo 18 horas. A avaliação foi feita verificando-se, com o
auxílio de uma régua, o diâmetro do halo formado ao redor do disco contendo o extrato.
Logo após foi realizado o teste da Concentração inibitória mínima, onde um
semeio de bactéria foi realizado, utilizando-se o swab, na placa de Petri contendo Ágar
Mueller-Hinton. As placas foram semeadas tipo tapete e feito nelas quatro poços de
6mm de diâmetro, pipetando 50μL de extrato bruto seco em diferentes concentrações,

a partir de diluições em 50%, 25%, 12,50% e 6,25% com relação à amostra inicial do
extrato bruto seco obtido (1g), realizou-se o procedimento em duplicata. As placas
foram incubadas a 37°C por no mínimo 18 horas para análise de resultados, que
constará da mínima concentração a formar halo.
Já na análise da Concentração inibitória mínima de aderência (CIMA) colocou-se
a bactéria em suspensão em soro fisiológico e em seguida transferiu 1 µL dessa solução
com bactéria para o tubo estéril com 4,5 mL de meio Mueller-Hinton em caldo e 0,5
mL da solução extrato em cada diluição identificando os tubos com seus respectivos
valores: 50%, 25%, 12,5% e 6,25%. Por fim os tubos foram colocados inclinados em
30º na estufa a 37°C por 18 a 24 horas para serem analisados os resultados com a
adição da fucsina ou azul metileno.
RESULTADOS
Potencial inibitório
O PI tem como função analisar se o extrato utilizado apresenta ou não ação

antibiótica frente às bactérias testadas.O extrato da Pitanga apresentou ação inibitória
nas concentrações testadas de 50%, 25% e 12,5% frente a cepas de S. aureus e C.
albicans, e nas concentrações de 50%, 25%, 12,5% e 6,25% na cepa de Klebsiella,
conforme tabela abaixo:
POTENCIAL INIBITÓRIO
Cepa 50% 25% 12,5% 6,25%
S. pyogenes -- -- --- ---
Klebsiella 25 mm 20 mm 19 mm 12 mm
S. aureus 24 mm 16 mm 13 mm ---
C. albicans 25 mm 20 mm 18 mm ---

As imagens representas os microrganismos Klebsiella e C. albicans
CONCETRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
O CIM possui um papel de determinar a menor concentração de extrato necessária

para inibir o crescimento do microrganismo inoculado. O resultado apontou que o
extrato utilizado apresentou formação de halo foi de 6,25%, na cepa de Klebsiella
como revela as imagens abaixo:

CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ADERERÊNCIA
Os resultados do CIMA avaliou a menor concentração necessária para inibir a

aderência dos micro-organismos, nos tubos de vidro, obtendo os seguintes resultados:
CIMA
Cepa 50% 25% 12,5% 6,25%
S. pyogenes - + + +
Klebsiella + + + +
S. aureus + + + +
C. albicans - - - -
+ formou biolfime
- não formou biofilme
Teste realizado com os seguintes microrganismos: S. pyogene, Klebsiella, S. aureus e C.

albicans demostrando a formação e não formação de biofilmes.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A amostra apresentou ação para a determinação da Concentração Inibitória

Mínima de Aderência nas concentrações e condições testadas porém não pode
apresentar formação de biofilme na parede do tubo. Além de apresentar formação
de halo que representa que o extrato analisado demonstra ação antibiótica nas
concentrações e condições testadas.

REFERÊNCIAS
AURICCHIO, M. T. Estudo Farmacognóstico de folhas de Eugenia uniflora L. São Paulo, 2001.
[Dissertação de Mestrado - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São
Paulo].
AURICCHIO, M. T., e Bacchi, E. M. Folhas de Eugenia uniflora L. (pitanga): propriedades

farmacobotânicas, químicas e farmacológicas. Rev.Inst. Adolfo Lutz, n. 62, p. 55 - 61. 2003.
AURICCHIO, M. T.; Bugno, A., Barros, C. B. M., Bacchi, E. M. Atividades Antimicrobiana e Antioxidante
e Toxicidade de Eugenia uniflora. Latin American Journal of Pharmacy. Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2007.
MATOS, F. J. A. Introdução à fitoquímica experimental, Fortaleza, UFC Edições, 1997, pp. 141.
OGUNWANDE, I. A. et al. Studies on the essential oils composition, antibacterial and cytotoxicity of
Eugenia uniflora L. The International Journal of Aromatherapy, n. 15, p. 147– 152, 2005.

CAPÍTULO 18
NEW PROCESS FOR OBTAINING NANOCHITOSAN

/ BURITI OIL (Mauritia flexuosa) BIOCOMPOSITE: A
BIOMATERIAL FOR REGENERATIVE MEDICINE AND
TISSUE ENGINEERING
Júlia Silveira Broquá biocomposite with nanochitosan and Buriti oil

Luciano Pighinelli through a new process, with great properties for
Magda Comoretto Gall the health area. The process is divided into two
Jader Figueiredo steps, starting with the dissolution of chitosan.
Giovani André Piva The second step comprises in the coagulation
Lucas Eduardo Lopes Machado of glucosamine molecules in a nanoparticulate
Pamela Persson matrix, performed in aqueous medium. In the
Anderson Rockenbach Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR-
Renata Pospichil
ATR) analysis, the characteristic groups of
Luan Rios Paz
nanochitosan and Buriti oil were identified. The
Fernando Guimarães
Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis
Gabrielle Zanin
showed nanopolymer agglomerates, suggesting
Marzena Kmiec Pighinelli
the encapsulation of the oil by nanochitosan.
Particle Size analysis showed a slight increase
in the biocomposite compared to nanochitosan,
ABSTRACT: For ages, wound healing is a corroborating with the encapsulation, also
big challenge for health area and scientific a decrease in polydispersity that promotes
community and the major goal is to develop a stable compound. Microbiological tests
the most effective wound dressing to cover and showed greater inhibition in the biocomposite
protect the injuries from external infections and compared to oil and polymer individually. The
to accelerate healing process. Chitosan is the final biomaterial did not show phase separation,
only biopolymer positively charged in nature, and intensified the expected characteristics,
with antioxidant, antimicrobial and antifungal confirming the potential of the biomaterial.
properties. In nanocrystalline chitosan, KEYWORDS: Regenerative Medicine,
the crystallinity is reduced resulting in a Chitosan, Essential Oil, Nanotechnology
nanomaterial with reactivity and adhesiveness.
The complexation of nanochitosan with
essential oils, such as Mauritia flexuosa 1 | INTRODUCTION
(Buriti), provides a unique biomaterial with
great potential for regenerative medicine. The skin is the largest and most exposed
The objective of this work was to obtain a organ in our bodies, thus it is the most susceptible

to injuries (MERCURIO, 2015). The term wound refers to the damage and/or rupture
(interruption of continuity) of the skin (FRANCO, 2014). The human body has the
capacity of healing some injuries, being the wound healing one of the most commons.
1.1 Skin Wound: Development and Mechanisms
This process consists of 3 overlapping phases: inflammatory, proliferation, and

remodeling (OLIVEIRA GONZALEZ, 2016).
• Inflammatory phase is described as the migration of leukocytes to the dama-
ged area, aiming the destruction of microorganisms and dead cells. This
phase is recognized by the erythema (redness of the surrounding tissue),
occurring in the first 24 hours and lasting up to two days.
• Proliferation phase is the phase responsible for the closing of the wound,
causing contraction, the formation of fibrous tissue, cell production for extra-
cellular matrix creation, followed by reepithelization of the skin. This process
begins in the first two days and can endure for about two weeks.
• Remodeling phase is the longest step in the whole process, taking from 2 or
3 weeks to over 1 year. Consists of the rearrangement of the extracellular
matrix, with the purpose of achieving the maximum tensile strength. The
rearrangement of the matrix is made by reorganization, degradation, and
resynthesizes of it. The failed subsequent attempts of reobtaining previous
tissue structure create the scar tissue.
Being a recurrent issue that all the world population is susceptible to has caused
the WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017) to recognize the skin wound as
a hidden epidemy. There is a huge concern about the efficiency and price of existing
treatments, causing the necessity of research on new materials and methods.
Figure 1: Stages of wound healing. Source: OLIVEIRA GONZALEZ, 2016.
1.2 Existing Treatments
The mainly employed treatment consists in the seaming (if needed) and appliance
of dressings such as cotton gauze, preferentially with a nonadherent and antimicrobial

material applied, to prevent the removal of newly formed epithelial tissue and infections
by external agents (ARAMWIT, 2016). It is common for it has low cost, although it’s not
the most efficient.
Another used method is the autografting, which consists of grafting skin tissue
removed from another area of the same individual. This method has high efficiency but
has a limit on how much skin can be grafted, plus the shortness on skin donations. This
issue contributes the research and development of artificial tissue for grafting, although
these researches face many obstacles, such as instability and risk of infection. The
focus on material development is now in the biomaterials since they possess many
properties that make them eligible in the health area. There are various biomaterials
already present in research and healthcare market, from both synthetical or natural
sources.
As representatives of the synthetical biopolymers in wound healing, we can find in
literature: Polyurethanes (and derivatives), polytetrafluoroethylene (Teflon®), silicone,
among others.
The natural biopolymers have furtherly more desirable properties, making them
suitable for potential substitution of ECM (extracellular matrix). The shared properties
they carry are: relieving effect, astringent, antimicrobial, anti-inflammatory, etc. These
polymers are used as a coating, serving as protection from external agents, as well as
stimulating the angiogenesis (cell proliferation). Another characteristic most biopolymers
share is that they are negatively charged ions, except for one: chitosan. Chitosan is the
deacetylated version of chitin, a biopolymer obtained throughout demineralization and
deproteination of fishing industries waste such as shrimp and crab shells.
1.3 Chitin and Chitosan
Chitin (N-Acetyl β-D-Glucosamine) is the second most abundant structural

biopolymer on Earth. In nature, it possesses two types of structural configuration: alpha
and beta, being the first the one with higher mechanical resistance and the second the
one with higher elasticity. A third allomorph can be created in a laboratory, mixing the
previous configurations: gamma.
The worldwide fishing industries can sum about 1011 tons of waste and from that
paradigm grew the interest of scientists to study and apply the biopolymer obtained
from it in other sectors of interest, such as healthcare and cosmetics. Chitin is obtained
from that waste, then suffers a process of deacetylation, which consists in a strong
attack on acetyl groups, giving way to the amino groups to remain on the molecule
surface, improving the biopolymer reactiveness. It is precisely that amino group the one
responsible for the positive ionic charge of chitosan. This trait brings us an enormous
amount of materials that can be complexed with chitosan, furtherly enhancing its
properties and even giving it new ones (BROQUÁ, 2018).

Figure 2: Representation of chitin and chitosan molecules. Source: KUMIRSKA et al, 2010.
As shown in this previous figure, chitosan is nothing more than the version
of chitin with less than 50% of Degree of Acetylation (DA). The reduction of acetyl
groups reduces the biopolymer’s strength, but on the other hand, provides some more
properties, which we can compare below.
Chitin
Properties
Chitosan
Properties
Figure 3: Board presenting chitin and chitosan properties. Source: FIGUEIREDO et al, 2018
These properties have been studied along many decades, yet the optimum chitosan
is still to be developed since there are various conditions of extraction and production
that affect the properties, thus being advised to assemble a process for each different
necessity, using a different production method. The industrial production employs
chemical agents in demineralization, deproteination, and deacetylation, which is a cheap
and practical method but results in the production of effluents that will require treatment.
There are studies regarding biotechnological means of production, that are not yet
usable in mass production for they require higher control and time. The optimum

response could be the combination of both methods, using practicality and less
aggressive materials to obtain the best both processes have to offer.
Figure 4: Board with a comparison between chitin production methods. Source: FIGUEIREDO et
al, 2018.
Another tendency in researches regards the use of nanoparticulated materials. In

the case of chitosan, there are some methods of nanoparticulated chitosan obtention.
These methods work by amplifying the biopolymer’s reactivity, enhancing previous
properties even further and allowing new possibilities such as encapsulating other
materials, which improves its capacity of complexation. Some of the methods found in
the literature (DIVYA, 2018) are:
Nanomaterials are usually hard to obtain, the methods above do not run from
that statement. One of the most accessible and operative methods in literature is the
coagulation method (PIGHINELLI, 2016), the one we chose to apply in our studies of
skin wound healing.
1.3.1 Chitosan Complexed Biomaterials
As a multi-property biopolymer that has the ability to link with other materials,
chitosan is widely studied around the world, hence being the protagonist of various

projects involving complexed materials.
From literature, we can resume some of its applications regarding biotechnology,
especially in the medical and pharmaceutical areas, in the following figure:
Biocatalysts Scaffolds as a support for metals in order to produce catalysts.

Enzyme immobilization and purification chelator; an emulsifier;
flocculent; blood cholesterol control; Lectin affinity chromatography;
Biomedical
biosensor; immobilization of antibody in the presence of alginate;
hemostatic agents.
Fibers; membranes; artificial organs and skin; surgical sutures; bone
and cartilage regeneration; wound healing and dressings; cancer
Medical
diagnosis; aid in cataract surgery; periodontal disease treatment;
collagen synthesis; contact lenses; tumor therapy; stem cell technology.
Pharmaceutical Manganese supplement complex; drug release; gene delivery.
Figure 6: a board with main chitosan applications in healthcare. Source: BROQUÁ et al, 2018.
According to Dhandayuthapani et al (2011), chitosan is mainly used as a scaffold,

a 3D structure that serves as support to the complexed materials. There are many
types of scaffold: Nano/microsphere encapsulation (bone and tissue regeneration),
injectable gel scaffolds (cartilage and bone regeneration, drug delivery), hydrogel
scaffolds (biosensors, matrix components and cell-cell interactions), fibrous scaffolds
(vascular grafts, tissue scaffolds, etc.) and a group named functional scaffolds (includes
membranes, foams, hydrogels, microspheres, and particles; used for angiogenesis
stimuli, bone regeneration and wound healing).
The applications, as seen before, are nearly unlimited. Having such biopolymer
with such vast applications, the next step in the development of a new biocomposite is
to choose another material with the properties that are desirable for the product to be
developed that is compatible with the positive electrochemical charge of the chitosan,
thus being required a negative charge from the added component.
The Brazilian biodiversity is an example of a natural biopolymer source, especially
in the Amazonian area (ROMERO, 2017). Among the supplies available due to the
climate conditions of that area, the ones with high applicability in the healthcare area
are the essential oils. These oils have been used by society for a long while, based on
some sort of popular belief of it’s healing properties.
The Buriti (Mauritia Flexuosa) essential oil has been used for wound healing in
Brazil by its Amazonian population, and those healing properties have been confirmed
in studies (SARAIVA, 2009). According to Freitas (2018), the Buriti essential oil can
be encapsulated by isolated soy protein positively charged, under the PH of 4.6,
corroborating the fact that the essential oil in question has a negative electrical charge
due to its fatty acids.

2 | EXPERIMENTAL METHOD
The research and method were developed in Biomatter P&D and Innovation on
Biomaterials Lab, Lutheran University of Brazil. The SENAI Institute of Innovation in
Polymer Engineering and Advanced Microscopy Multiuser Laboratory (LMMA) in Piauí
Federal University realized the analyses. The method of obtaining the Nanocrystalline
Chitosan / Buriti Oil biocomposite (NCCH/B) occurred according to the patents: INBI
BR 102017022292-6 and INBI BR 102017022720-0. The process can be divided into
two steps, starting with the dissolution into a chitosan salt and then coagulation with
Buriti oil.
2.1 Chitosan Dissolution
The commercial chitosan was purchased from Polymar (Fortaleza, CE) with
a 95% degree of deacetylation, 12,4% moisture content, 0,31 g/mL density with a
yellowish color. Firstly, 1% of the polymer powder was mixed with 500mL of deionized
water. Acetic acid solution 0,4% (w/v) was prepared in half of the quantity of water and
then added to the chitosan solution (2h, 600-800 RPM). The dissolution ends with 1L
of a transparent solution. Afterward, the chitosan acetate (CA) was filtered to removing
insoluble particles. The CA was stored at 5°C for 24h.
2.2 Nanocrystalline Chitosan / Buriti Oil Process of Obtaining
A new methodology was developed based on the agglutination method to

synthesize the nanoparticulate chitosan (INBI BR 102017022292-6). A solution of
NaOH was prepared according to to the same ratio of the acetic acid solution. Using the
CA solution obtained, as previously described, the NaOH solution was gradually added
with constant stirring (1000 RPM) and pH control. This is the crucial step of the process
because both complexation and the nanostructured chitosan are obtained; therefore,
all the parameters are extremally controlled for the correct formation of nanocrystals.
In the pH 5, started the slow addition of Buriti oil in the same ratio of polymer content.
This ratio was chosen to preserve the integrity of the oil, which has pH 4,5. After all
the oil was added, at the same polymer content, the acidic solution was neutralized
to pH 7,4 (3h, 700 RPM). The final solution (NCCH/B) was stored at 5°C for 24h. The
sodium hydroxide has the function of agglomerating the glucosamine monomers in the
chitosan acetate in a nanostructured matrix, neutralizing the solution at the same time.
The free oil in the solution is encapsulated while the coagulation occurs. The NCCH/B
solution was filtered and washed until the discarded water becomes neutral, in order to
eliminate the residual sodium acetate salt that was formed in the neutralization phase. It
was no observed residual oil in the washing process. Thereafter, 10 samples with 25mL
of NCCH/B biocomposite was added in Petri plates to dry for the posterior analyses
and a high concentration solution was stored at 5°C.

3 | RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Nanocrystalline Chitosan / Buriti Oil Biocomposite
This methodology was performed using three different concentrations of oil to

obtain the biocomposite: 0,5%, 1%, and 2%. The 1% solution was chosen to continue
the studies because it was homogeneous, with no phase segregation or migration of
the oil to the film surface and with the complete encapsulation of the oil by the nano-
chitosan. The NCCH/B films had a yellowish and orange color, according to the Buriti
oil ratio, and the solution with a gel texture (Figure 7).
Figure 7: NCCH/B films with 1:0,5, 1:1 and 1:2 of Buriti oil and polymer content, and NCCH/B
gel-like solution, respectively. Source: FIGUEIREDO et al, 2018.The synthesis of NCCH/B
biocomposite is not characterized as an ordinary mixture of biopolymer and oil, but a new
method of obtaining the material studied. Since this composite has been obtained in an aqueous
medium and the difference of polarity, composition of the substances, different densities
and structures support the idea of complexation. Buriti oil presents in its composition many
fatty acids containing ions compatible with the amine group from chitosan, which justifies the
complexation with one or more of these fatty acids, still not identified.
3.2 Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR-ATR)
Figure 9 represents the spectra of nanocrystalline chitosan (NCCH). The presence

of the functional groups NH2 (1590 cm-1), amide I (1746 cm-1), amide II (1419 cm-1) from
the NCCH is observed. The most intense energy peaks (1026 and 938 cm-1) identified
the COC (glucose-β-1-4) stretch, corresponding to the vibrations of the skeletal stretch
of the polysaccharide structure. N-H and O-H energy peaks are also observed at 3357
cm-1 and 3287 cm-1.

Figure 9: FTIR spectra of NCCH. Source: PIGHINELLI, 2016.
Figure 10 represents the spectra of Buriti oil, with a band formed in the region near
1750 cm-1, where the C=O bond is observed. This band is a hallmark of the oils spectra.
Figure 11 represents the spectra of NCCH/B biocomposite, where it is observed that
the band near 1750 cm-1, characteristic of the bond C=O of Buriti oil, remained with
some important peaks of nano-chitosan, as the functional group NH2 (near 1600 cm-
1
). Other important peaks of NCCH were observed with small displacements such as
(1100 cm-1 and 1050 cm-1) that identified COC (glucose-β-1-4) stretch corresponding to
the stretching vibrations of the polysaccharide backbone structure. N-H and O-H near
3500 cm-1 are also observed.
Figure 10: FTIR spectra of Buriti oil. Source: FIGUEIREDO et al, 2018.

Figure 11: FTIR spectra of NCCH/B biocomposite. Source: FIGUEIREDO et al, 2018.
3.3 Scanning Electron Spectroscopy (SEM) Analysis
The SEM analysis of nanoparticulate chitosan (Figure 12-a) are homogeneous,

with roughness and formation of agglomerates due to their amorphous nature, whereas
the SEM analysis of NCCH/B biocomposite shows a velvety area related to the oil
(Figure 12-b), with many agglomerates of NCCH due to high polydispersity (Figure
12-c).
Figure 12: (a) The SEM analysis of NCCH in x500 magnitude, while (b) and (c) are the SEM
analysis of NCCH / B biocomposite in x500 and x1000, respectively. Source: FIGUEIREDO et
al, 2018.
The nanostructured chitosan is more reactive, with high absorption potential up

to 600% (PIGHINELLI, 2017)proliferation (fibroblast phase. Due to the process, the
glucosamine macromolecule breakage occurs in dissolution, and then reconstructed in
the coagulation process, with a high reduction of the crystalline area and improvement
of the amorphous area. This crystalline modification allows the improvement of some
characteristics, such as reactivity and adhesion potential.
In NCCH/B biocomposite images, it can be noticed that the chitosan nanoparticles
remain intact, wrapped by Buriti oil outside the capsules. It is also observed a swelling
effect in the nanoparticles, suggesting the encapsulation of the oil by the polymer,

based on literature review.
3.4 Particle Size
Particle Size analyses were performed in NCCH 1% and NCCH/B 1:1 for
comparison. A Mesh 0,450 filter was used in order to reduce the high polydispersity
of the nanoparticles and standardize the particle size. Furthermore, were
performed six measures for each, and calculated the average value of the results.
The particle size of nanoparticulate chitosan originated from agglomeration process
ranges from 20 nm for 120 nm, with an average of 55,4 nm (PIGHINELLI, 2017)
proliferation (fibroblast phase. The results are illustrated in Table x. The NCCH has
an average of 85 nm, while the NCCH/B biocomposite has an average of 134 nm.
SAMPLES MEASURES PARTICLE SIZE (nm) POLYDISPERSITY

NCCH 1 80,93 0,370
NCCH 2 96,06 0,766
NCCH 3 57,91 0,923
NCCH 4 123,91 0,338
NCCH 5 65,63 0,353
NCCH 6 85,56 0,550
NCCH AVERAGE 85,00 0,550
NCCH/B 1 171,57 0,312
NCCH/B 2 197,56 0,278
NCCH/B 3 95,43 0,215
NCCH/B 4 112,65 0,271
NCCH/B 5 98,71 0,284
NCCH/B 6 126,51 0,248
NCCH/B AVERAGE 134,00 0,268
Table 1: Particle Size results of NCCH and NCCH/B biocomposite. Source: FIGUEIREDO et al,
2018.
It is noted an increase in particle sizes of NCCH/B biocomposite (134 nm) when

compared to NCCH (85 nm). This phenomenon suggests the encapsulation of the oil,
already studied and performed in literature, with Souza et al. (2014) and Hosseini et al.
(2013) works. Freitas (2016) had a similar average of particle size using Zein, chitosan,
and essential oils particles, with the same increase phenomenon, compared to the
single chitosan. It’s still possible to observe a reduction of polydispersity in NCCH/B,
from 0,550 to 0,268, suggesting more stability in NCCH/B biocomposite solution.
3.5 Microbiological Test
The microbiological tests were carried out in the ULBRA Canoas, Microbiology
Lab, using the macrodilution technique. Increasing amounts of each of the samples

analyzed were used to determine the Minimum Bactericidal Concentration (MBC). The
macrodilution method was applied by the Microbiology Laboratory in a way it could
be applied to the biopolymers potential properties appointed by the literature. The
selected bacteria were: Escherichia coli (as a Gram-negative) and Staphylococcus
aureus (as a Gram-positive). For this test, three different analyses were performed:
nanocrystalline chitosan and Buriti oil alone, and NCCH/B biocomposite. All these
samples for the assays were pre-sterilized in an autoclave at 121° C for 15 minutes, as
well as all materials used and culture media, to avoid interference of other bacteria from
the environment. The technical procedures were performed according to the Quality
Criteria for Microbiological Analysis (OPLUSTIL, 2010).
3.5.1 Inoculum preparation
The bacterial strains references used were Staphylococcus aureus (ATCC 25922)
and Escherichia coli (ATCC 25923). Lyophilized bacteria were prepared according to the
manufacturer’s recommendation. Afterward, they were sown in a petri dish containing
TSA Agar and incubated at 35ºC for 24h (OPLUSTIL, 2010).
3.5.2 Macrodilution method
The dilution method used two series of 10 Erlenmeyer flasks with BHI (Brain and
heart Infusion) culture medium for each of the 3 samples (Buriti, NCCH, and NCCH/B)
containing 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0 ... to 10 ml of samples in each of the bottles of the
respective sequence. In the first Erlenmeyer, 1 ml of sample and 18 ml of BHI broth
was pipetted. In the second Erlenmeyer, 2 ml of sample and 17 ml of BHI were pipetted,
successively, always increasing 1 ml of sample to each new flask and reducing 1 ml
in the broth. Afterward, 1ml of the bacterial suspension was added to the first flask.
The flask n°1 was thoroughly homogenized and 1 ml was collected to be transferred
to flask n°2. After homogenizing the flask n°2 as well, 1 ml was transferred to flask n°3
and so on until flask n°10. This procedure was carried out for each of the samples, in
two series, one of which was inoculated with 1 ml of reference Escherichia coli and the
other with Staphylococcus aureus.
All flasks were incubated at 35 °C for 24h. Visual observation of growth after
incubation was impaired by the turbidity of some samples, and all samples were seeded
on a PCA plate. The plates were incubated in a bacteriological oven at 35 °C for 24
hours and then, analysis occurred with the presence or absence of bacterial growth.
3.5.3 Microbiological Test Results
Following the described methodology, the results are presented in Figure 13

containing the NCCH/B biocomposite and both standards NCCH and Buriti oil. Reduction

of growth from n°7 vial plate onward was observed for all positive samples, regardless
of the bacterium tested. This decrease occurred around 20 to 30% of the growth for
all samples tested. In these plates, it was not possible to count because the number
of colonies was much more than 300 CFU (Colony Forming Unit)/ml. No growth was
observed from vial n°4 to S. aureus of NCCH/B, from vial n°5 of Buriti oil and vial n°6 of
NCCH samples. However, the absence of growth for E. coli occurred from n°9 for the
NCCH/B and Buriti oil samples. In this study, for the NCCH sample, it was not possible
to determine the MBC (Minimum Bactericidal Count) for Escherichia coli, probably due
to the distinct mechanism of action, since it’s a Gram-negative bacterium with a complex
cell wall structure different from Gram-positive. As approached in literature, chitosan
has a more antibacterial effect on Gram-negative bacteria, due to the positive surface
provided from free amino groups and nanoparticulate chitosan has more bacteriostatic
behavior (YOUNES et al, 2014). Due to the personalized microbiological test that
was required to attend the potential of the biocomposite, the bacteriostatic behavior
of nanochitosan couldn’t achieve. The best results were obtained from NCCH/B
biocomposite when compared to the standards NCCH and oil, as observed in Figure
13, with bacteriostatic effect identified in flasks with smaller amounts of the compound.
Figure 13: a graphical comparison of microbiological activity. Source: FIGUEIREDO et al, 2018.
4 | CONCLUSION
Nanoparticulate chitosan has high polydispersity, reactivity and absorption

potential due to its low crystallinity. This property allows the creation of new materials,
such as the Buriti oil complexed with the biopolymer. The main of this work was to
develop a new method of obtaining a biocomposite material through a new process, for
application in regenerative medicine as a wound healing.
In the FTIR analyses, it was noticed that the characteristic peaks of both chitosan
and Buriti oil are present in the NCCH/B, with preservation of the original structures,
without a new different formation.
The SEM analyses showed characteristic agglomerations of chitosan,
an expected phenomenon due to the amorphous structure of nanoparticulate
chitosan, and a velvety area related to the remaining oil was observed. The
“swelling” effect of nanocrystalline chitosan suggests the encapsulation of
the oil by the polymer, and the reduction of polydispersity is considerable.
in Particle Size analyses, nanocrystalline chitosan showed a lower ratio compared to
the biocomposite, still in nanoscale. This increase is interpreted as the encapsulation
again. The reduction of polydispersity in NCCH/B biocomposite indicates more stability
for the material.
It is still necessary to determine which specific group of the oil is bounding with the
free amino groups of chitosan to assert as a complex indeed.
The Microbiological Tests indicated more inhibition of bacterial growth in the
biocomposite than the standard chitosan and Buriti oil for Staphylococcus aureus.
The low effect in Escherichia coli, as mentioned before, is a behavior of chitosan. In
nanocrystalline chitosan, we have a bacteriostatic effect on Gram-negative bacteria.
This observation corroborates with the complexation that this research approaches.
More analyses are being provided to characterize the complexation. In vivo tests
are scheduled to confirm the healing potential and move a step forward as a new
product.
ACKNOWLEDGMENT
Our thanks to the Biomatter Lab and ULBRA University, that provided the research
space and all the work colleagues involved in this project. Our gratitude to the partners of
SENAI Technology Institute of Polymer Engineering for providing us with the analyses,
and to Quimicamar Chemical Industries for their support.
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CAPÍTULO 19
PORPHYROMONAS GINGIVALIS NA PERIODONTITE:

POR QUE ESTUDAR SEUS FATORES DE
VIRULÊNCIA COM FERRAMENTAS IN SILICO?
Ellen Karla Nobre dos Santos-Lima gingipaínas, HmuY e neuraminidase. Estudos

Universidade Federal da Bahia, Programa de Pós- sobre a imunogenicidade de seus fatores de
graduação em Imunologia virulência podem contribuir para o entendimento
Salvador – Bahia da resposta do hospedeiro à infecção. Dessa
Larissa de Mattos Oliveira forma, a presente revisão aborda tais proteínas
Universidade Estadual de Feira de Santana, e a relevância de se utilizar ferramentas in
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
silico em estudos dos fatores de virulência
Feira de Santana – Bahia de P. gingivalis, os quais podem esclarecer
Michelle Miranda Lopes Falcão a patogênese, a evolução e a influência em
Universidade Estadual de Feira de Santana, condições sistêmicas da periodontite, bem
Departamento de Saúde
como auxiliar a emissão do prognóstico da
Feira de Santana – Bahia
doença e o tratamento de casos refratários.
Manoelito Coelho dos Santos Junior PALAVRAS-CHAVE: doença periodontal,
Universidade Estadual de Feira de Santana,
resposta imune, imunoinformática.
Departamento de Saúde
Feira de Santana – Bahia
Márcia Tosta Xavier PORPHYROMONAS GINGIVALIS IN
Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública,
PERIODONTITIS: WHY STUDY ITS
Curso de Odontologia
Salvador – Bahia VIRULENCE FACTORS WITH IN SILICO
Soraya Castro Trindade TOOLS?

Universidade Estadual de Feira de Santana,
Departamento de Saúde ABSTRACT: Porphyromonas gingivalis is one
Feira de Santana – Bahia of the main microorganisms involved in the
etiology of periodontitis. It induces inflammation,
but it also evades the immune response, due
to its virulence factors, such as gingipains,
RESUMO: Porphyromonas gingivalis é um HmuY and neuraminidase. Studies on the
dos principais microrganismos envolvidos na immunogenicity of its virulence factors may
etiologia da periodontite. Induz a inflamação, contribute to the understanding of the host’s
mas também evade a resposta imune, response to infection. The present study aimed
devido aos seus fatores de virulência, como to conduct a literature review to comprehensively

investigate these proteins and the relevance of using in silico tools to investigations of P.
gingivalis virulence factors that can better clarify the pathogenesis and the progression
of periodontitis, as well as can help to determine the prognosis of the disease and the
more appropriate treatment in refractory cases.
KEYWORDS: periodontal disease, immune response, immunoinformatics.
1 | INTRODUÇÃO
A periodontite é uma doença multifatorial que acomete os tecidos de proteção e

suporte do dente. Pode ocasionar a perda das unidades dentárias acometidas devido
à destruição de fibras colágenas e à reabsorção do osso alveolar. Trata-se de uma
doença progressiva, caracterizada clinicamente por inflamação gengival, sangramento
à sondagem do sulco gengival, perda de inserção periodontal e do osso alveolar e por
bolsa periodontal (CATON et al., 2018).
Sua etiopatogenia está relacionada à resposta imune inata e adaptativa diante
da presença de um biofilme subgengival sinérgico e disbiótico (HAJISHENGALLIS
& LAMBRIS, 2012; HAJISHENGALLIS & LAMONT, 2012). A partir da interação do
biofilme disbiótico no ambiente subgengival, poderá ocorrer alteração no equilíbrio
da produção de mediadores inflamatórios e, assim, a progressão da doença (ZHOU
et al., 2017). Dentre os microrganismos patogênicos presentes no biofilme, destaca-
se Porphyromonas gingivalis, considerado um patógeno-chave na disbiose oral
(HAJISHENGALLIS, 2014).
O desenvolvimento de mecanismos específicos de interação do patógeno com
o seu hospedeiro (ABDI et al., 2017) fortalece a necessidade de compreender de que
forma as moléculas estruturais e metabólicas sintetizadas por P. gingivalis contribuem
para o desenvolvimento da doença periodontal (NAKAGAWA et al., 2006; GUO et al.,
2010; SMALLEY & OLCZAK, 2017). Do mesmo modo, justifica-se o estudo de moléculas
expressas pelo hospedeiro em resposta à infecção pelo periodontopatógeno, diante
da possibilidade da ocorrência de dano tecidual (MOUTSOPOULOS et al., 2012).
O estudo in silico é uma ferramenta capaz de auxiliar na compreensão das
interações moleculares. Assim, tal abordagem pode ser utilizada para os fatores de
virulência, buscando alvos terapêuticos (CUENO et al., 2014) e buscando compreender
sua interação com o sistema imune do hospedeiro. As gingipaínas, o sideróforo HmuY
e a neuraminidase são exemplos de proteínas sintetizadas por P. gingivalis, as quais
são consideradas fatores de virulência, contribuindo para sua capacidade de induzir
a periodontite (GUO et al., 2010; LI et al., 2012; CARVALHO-FILHO et al. 2016;
DASHPER et al., 2017).
Identificar peptídeos com atividade imunogênica em tais fatores utilizando
abordagens in silico pode contribuir para a compreensão da influência do microrganismo
na etiologia e patogênese da periodontite, bem como para o entendimento dos
mecanismos de resposta do hospedeiro à infecção. Dessa forma, a presente revisão
narrativa da literatura aborda tais proteínas e a relevância de se utilizar ferramentas in
silico para estudo dos fatores de virulência de P. gingivalis.
2 | REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Porphyromonas gingivalis, microbioma oral e modelo in silico
Porphyromonas gingivalis é uma bactéria pertencente ao filo Bacteroidetes

(SHAH & COLLINS, 1988). É um bacilo Gram-negativo, anaeróbio estrito, imóvel,
proteolítico e forma colônias marrons ou negras em ágar sangue (MAYER et al.,
2013). Linhagens de P. gingivalis tiveram seu genoma sequenciado para análises
comparativas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/714). A linhagem ATCC
33277 (isolada de gengiva humana) é considerada menos virulenta e é utilizada para
caracterização patofisiológica do microrganismo (NAITO et al., 2008). Seu genoma
foi publicado (NCBI Reference Sequence: NC_010729.1), bem como, as sequências
de suas proteínas e de seus epítopos candidatos têm sido depositadas em bancos
de dados públicos online, como o do National Center for Biotechnology Information
(NCBI) e o do Immune Epitope Database (IEDB) (NAITO et al., 2008; BITTNER-EDDY
et al., 2013; LI et al., 2016; LEONE et al., 2018). O NCBI apresentou 7.320 itens
referentes a proteínas dessa linhagem e o IEDB apresentou apenas 53 epítopos, em
22 de junho de 2018.
Em estudos clássicos, P. gingivalis foi agrupado no “complexo vermelho”,
junto a Tannerella forsythia e Treponema denticola. Esse grupo apresentou uma
forte relação positiva com os indicadores profundidade de bolsa periodontal e
sangramento à sondagem e teve sua colonização precedida pelos microrganismos
do “complexo laranja” (Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum,
Peptostreptococcus micros, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus
constellatus, Eubacterium nodatum, Campylobacter showae, Campylobacter
gracilis e Campylobacter rectus). O biofilme subgengival de indivíduos adultos com
periodontite exibiu uma proporção maior de espécies dos complexos vermelho e
laranja, as quais foram detectadas em maior número em bolsas ≥ 3mm. O biofilme
subgengival analisado apresentou contagem mais alta de P. nigrescens, P. intermedia,
T. forsythia e P. gingivalis. E os sítios que abrigavam P. gingivalis exibiram a maior
média de profundidade de bolsa periodontal. Além disso, P. intermedia e P. gingivalis
foram detectados em sítios supragengivais sem concomitante detecção subgengival
(SOCRANSKY et al., 1998; XIMÉNEZ-FYVIE, HAFFAJEE & SOCRANSKY, 2000).
Desde então, os conceitos de sucessão microbiana e de interação recíproca
desenvolvem-se e enfatizam a importância do relacionamento entre os microrganismos
(quorum sensing), entres esses e o ecossistema bucal e entre esses e a resposta imune
do hospedeiro na doença periodontal. Tal desenvolvimento ocorreu, principalmente, com

o auxílio dos métodos moleculares para acessar o microbioma oral e da bioinformática
para analisar e ajudar a compreender os dados gerados (SOCRANSKY & HAFFAJJE,
2005; PLANČAK, MUSIĆ & PUHAR, 2015; GUVEN-MAIOROV, TSAI & NUSSINOV,
2017). Diante da complexidade do microbioma oral (PROCTOR et al., 2018), entender
como os microrganismos atuam sinergicamente em um mecanismo de disbiose oral
amplia nosso conhecimento sobre a doença periodontal e suas implicações sistêmicas.
Nesse cenário, P. gingivalis é considerado um patógeno-chave por conseguir interferir
na simbiose oral (HAJISHENGALLIS, 2014; 2015; FLETCHER, 2018).
Sabe-se que modelos in silico são utilizados para a compreensão de sistemas
biológicos, bem como para selecionar, complementar e inspirar os experimentos
laboratoriais necessários (KOLLMANN & SOURJIK, 2007; SETTY, 2014; BRODLAND,
2015). Nesse contexto, a imunoinformática traz avanços na imunologia e pode
contribuir para a compreensão da resposta imune (LEFRANC, 2014; QIU et al., 2018).
A imunoinformática traz ferramentas que proporcionam uma análise ampla dos fatores
de virulência de P. gingivalis e de outros patógenos periodontais, além disso, contribui
para a compreensão da interação entre o microbioma oral e seu hospedeiro. A análise
in silico possibilita, por exemplo, a predição e a seleção de peptídeos imunogênicos
antes de serem sintetizados e testados quanto ao seu potencial biotecnológico, o que
diminui os custos na prospecção de moléculas promissoras.
2.2 Porphyromonas gingivalis e seus fatores de virulência
Apenas uma minoria de espécies bacterianas possui a capacidade de causar

doenças em humanos e um número relativamente pequeno de genes, os genes de
virulência, são responsáveis pela diferença entre um patógeno e outro microrganismo
não patogênico estreitamente relacionado. Os produtos desses genes são os fatores
de virulência (ALBERTS et al., 2010). Os fatores de virulência dos microrganismos
periodontais subdividem-se, basicamente, em fatores que promovem a colonização;
toxinas e enzimas que degradam os tecidos do hospedeiro; e mecanismos que
protegem as bactérias patogênicas do hospedeiro (TEUGHELS et al., 2011).
Em sua interação com o sistema imune do hospedeiro, P. gingivalis apresenta
fatores de virulência que se destacam, tais como capacidade de internalização
em células não fagocíticas, polissacarídeos de superfície resistentes ao sistema
complemento, fímbrias, lipopolissacarídeo (LPS), proteases (e.g. gingipaínas)
que degradam moléculas sinalizadoras e citocinas (PRESHAW & TAYLOR, 2011;
DASHPER et al., 2017), a lipoproteína HmuY (CARVALHO-FILHO et al., 2016) e a
neuraminidase (XU et al., 2017). A resposta inflamatória do hospedeiro decorrente da
infecção por P. gingivalis tem como consequência o dano tecidual. Portanto, o estudo
do comportamento da célula humana diante do fator de virulência e a mensuração
dos níveis, locais e sistêmicos, de moléculas pro e anti-inflamatórias são estratégias
empregadas na pesquisa em Periodontia (CARVALHO-FILHO et al., 2013; GÜMÜŞ et

al.; KATO et al., 2014).
As proteases são secretadas por P. gingivalis para prover nutrientes ao degradar
proteínas do hospedeiro, como proteínas estruturais (e.g. colágeno), proteínas do
sistema complemento e anticorpos. As cisteínoproteases, denominadas gingipaínas,
degradam componentes do sistema complemento, inclusive o fator B, contribuindo para
evasão da resposta imune (TEUGHELS et al., 2011; MAYER et al., 2013). Murakami
et al. (2004) observaram a diminuição da expressão de alguns fatores de virulência
de P. gingivalis ATCC 33277, incluindo gingipaínas, com o aumento da temperatura
de 37 a 40ºC em cultura. Essa característica pode contribuir para evasão da resposta
imune no sítio periodontal inflamado, visto que adotar um fenótipo menos inflamatório
favorece a sobrevivência de P. gingivalis.
Outro fator de virulência relevante, a neuraminidase (sialidase) é expressa por
patógenos, incluindo P. gingivalis, para a aquisição de ácidos siálicos a partir de
sialoglicoconjugados do microambiente (HONMA et al., 2011; GUALDI et al., 2012;
LI et al., 2012; KURNIYATI et al., 2013). Além de serem nutrientes, os ácidos siálicos
são incorporados à estrutura bacteriana, ajudando a mimetizar a célula hospedeira e
confundindo a resposta imune (LI et al., 2012; STAFFORD et al., 2012). Além disso,
assim como outros patógenos (SHTYRYA et al., 2009; BANERJEE et al., 2010; FREIRE-
DE-LIMA et al., 2015), P. gingivalis pode utilizar a sialidase para seu mecanismo de
invasão celular.
Componentes estruturais e metabólicos de P. gingivalis constituem fatores de
virulência que podem desencadear a resposta imune humoral em humanos. Indivíduos
com periodontite apresentaram níveis séricos mais elevados de IgG que reconhece
o extrato total sonicado de P. gingivalis e a proteína HmuY, enquanto indivíduos
sem periodontite exibiram baixa imunorreatividade para esses antígenos (FRANCA
et al., 2007; TRINDADE et al., 2008; 2012a). O extrato total P. gingivalis constitui-
se, basicamente, em proteínas somáticas e de membrana. Tal extrato sonicado de
P. gingivalis ATCC 33277 e frações proteicas obtidas após Fast Performance Liquid
Chromatography (FPLC) foram capazes de induzir resposta humoral em pacientes com
diferentes tipos de condição periodontal e as frações cromatográficas apresentaram
distintos perfis de resposta em Western Blotting. Diferentes níveis de imunoglobulinas
A e G e subclasses de IgG foram encontrados em soros de indivíduos com gengivite
e periodontite (TRINDADE et al., 2008). O sequenciamento e a identificação de
peptídeos antigênicos em fatores de virulência presentes nas frações cromatográficas
de P. gingivalis podem contribuir para a compreensão da influência deste patógeno na
etiologia da doença periodontal.
2.3 Fator de virulência gingipaína
As gingipaínas são as principais proteases de P. gingivalis (GUO et al., 2010)

e uma das suas principais funções é a aquisição de ferro, um nutriente essencial

para essa bactéria (SMALLEY & OLCZAK, 2017). Imamura (2003) revisou a função
das endopeptidases trypsin-like de P. gingivalis, as gingipaínas, na patogênese da
doença periodontal, observando que elas contribuem para a evasão dos mecanismos
de defesa do hospedeiro.
As gingipaínas pertencem à família das proteases de cisteína, que utilizam um
sítio ativo da cisteína residual para catálise (BARRETT & RAWLINGS, 2001). São
denominadas Arg-gingipaínas (RgpA e RgpB) ou Lys-gingipaína (Kgp) de acordo
com sua capacidade de clivar Arg-xaa ou Lys-xaa. Contudo, as gingipaínas são
multifuncionais, apresentando funções de adesão, degradação tecidual e evasão
das respostas do hospedeiro, além de contribuírem para a colonização de outros
patógenos (TEUGHELS et al., 2011; MAISETTA et al., 2011; BAO et al., 2014;
BENGTSSON, KHALAF & KHALAF, 2015; CHAIYARIT et al., 2018).
Gingipaínas promovem permeabilidade vascular através da liberação de
bradicinina, o que contribui para a produção de fluido gengival e formação de edema
nos sítios periodontais infectados, suprindo a nutrição bacteriana. Kgp é a principal
gingipaína envolvida na degradação de fibrinogênio, contribuindo para a tendência ao
sangramento da gengiva doente (IMAMURA, 2003). As gingipaínas, especialmente
Kgp, atuam na degradação de junções de adesão das células epiteliais, o que pode
contribuir para a invasão do tecido conjuntivo periodontal por P. gingivalis (KATZ et
al., 2002). Por essas e outras funções, Kgp é considerada um dos principais fatores
de virulência de P. gingivalis (de DIEGO et al., 2014). O gene kgp da linhagem ATCC
33277 codifica uma endopeptidase composta por 1723 aa, que pode ser clivada em
quatro cadeias - a subunidade catalítica e três adesinas (39kDa, 15kDa e 44kDa) - e é
secretada no meio extracelular (http://www.uniprot.org/uniprot/B2RLK2).
2.4 A lipoproteína HmuY
A lipoproteína HmuY é específica de P. gingivalis e anticorpos anti-HmuY não

reconhecem proteínas homólogas em outros periodontopatógenos (OLCZAK et al.,
2010; ŚMIGA et al., 2015). HmuY apresenta-se associada à membrana externa de P.
gingivalis e é também excretada; sendo, promissoramente, estudada em sua atividade
imunogênica (OLCZAK et al., 2008; WÓJTOWICZ et al., 2009; TRINDADE et al.,
2012a; TRINDADE et al.; CARVALHO-FILHO et al., 2013).
HmuY foi previamente revisada por Carvalho-Filho et al. (2016) e Smalley &
Olczak (2017). Assim como as gingipaínas, é uma proteína diretamente envolvida na
aquisição de ferro pelo patógeno, porém é produzida quando o nutriente se apresenta
em baixa concentração no microambiente (SMALLEY & OLCZAK, 2017). Em células
mononucleadas do sangue periférico humanas, HmuY é capaz de induzir morte celular
por apoptose tardia e necrose, induzir a produção das citocinas IL-1β e IL-10 e inibir a
produção de IL-8 (TRINDADE et al., 2012a; b).
Embora P. gingivalis seja tipicamente um patógeno extracelular que induz níveis

mais altos de citocinas IL-1β, IL-6, IL-22 e IL-23 no hospedeiro (MOUTSOPOULOS et
al., 2012), tem a capacidade de invadir células não-fagocíticas do hospedeiro como
um de seus fatores de virulência (OLSEN & PROGULSKE-FOX, 2015) e de sobreviver
em células fagocíticas, utilizando a proteína HmuY no mecanismo de sobrevivência
em macrófagos (GMITEREK et al., 2016). Portanto, esse mecanismo de evasão da
resposta imune merece ser mais investigado do ponto de vista da resposta imune
intracelular.
2.5 A neuraminidase de Porphyromonas gingivalis
A neuraminidase é uma sialidase, enzima que reconhece resíduos de ácido

siálico presentes nas glicoproteínas e nos glicolipídeos das células do hospedeiro e do
microambiente. O ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), o ácido siálico mais estudado
como nutriente, possui atividade antioxidante pela reação de redução do peróxido de
hidrogênio (H2O2), atuando como limpador do H2O2 em condições fisiológicas, podendo
neutralizar sua citotoxidade. Tal reação pode envolver o resíduo presente na cadeia
glicídica e ocorrer em variação de pH (IIJIMA et al., 2004; 2007).
A adição de ácido siálico, a sialilação, é uma das etapas da glicosilação, um dos
mecanismos de modificação de proteínas para regulação de sua atividade (NELSON
& COX, 2004a; b). Periodontopatógenos como T. forsythia e P. gingivalis utilizam a
glicosilação de suas proteínas para evadir a resposta imune e, assim, persistir no
hospedeiro causando destruição periodontal (SETTEM et al., 2013).
Moncla et al. (1990) identificaram a atividade de sialidase em P. gingivalis
(ATCC 33277) ao estudarem anaeróbios Gram-negativos. No entanto, atualmente,
estudos da sialidase de P. gingivalis ainda são escassos (XU et al., 2017; YANG et
al., 2018), comparados a estudos da gingipaína. Aruni et al. (2011) observaram três
genes relacionados à atividade de sialidase no genoma de P. gingivalis W83; destes
PG0352 tinha sido anotado como gene hipotético para sialidase e foi confirmado após
suas análises in silico e in vitro. Aruni et al. (2011) e Li et al. (2012) alinharam as
sequências de aminoácidos codificadas pelo gene NanH presente em outras espécies
bacterianas, inclusive em T. forsythia, em busca de correspondência em P. gingivalis. O
alinhamento das sequências mostrou que a porção C-terminal da proteína codificada
por PG0352 possui um domínio catalítico conservado de neuraminidase, que consiste
em um motivo RIP e três motivos Asp-box (LI et al., 2012).
No estudo realizado por Aruni et al. (2011), observou-se que a atividade
dessa sialidase e das duas sialoglicoproteases relacionadas pode estar envolvida na
regulação da atividade de gingipaína e de outros fatores de virulência. Com a alteração
da expressão dos três genes (incluindo PG0352), houve a diminuição da atividade
de gingipaína, provavelmente por deficiência na sialilação. O mutante para PG0352
utilizado por estes autores apresentou redução de 5% da atividade de sialidase. Li et al.
(2012) demonstraram que a inativação de PG0352 aboliu completamente a atividade

de neuraminidase, o que sugere que a enzima codificada seja a única neuraminidase
de P. gingivalis.
O gene PG0352 (P. gingivalis W83) codifica uma exo-α-neuraminidase que
contribui para formação do biofilme, para a biossíntese da cápsula bacteriana e para a
patogenicidade. A mutação deste gene implicou na formação de uma cápsula deficiente,
tornando o patógeno mutante menos resistente à ação do complemento. Além disso, os
patógenos mutantes apresentaram reduzida virulência em camundongos, após injeção
subcutânea (Li et al., 2012). Mutantes isogênicos apresentaram mais sensibilidade
ao H2O2 que o tipo selvagem e foi observada uma alteração na parede celular em
tais mutantes, enquanto que o tipo selvagem apresentou uma parede celular intacta
(ARUNI et al. 2011).
A neuraminidase codificada por PG0352 possui 526 aminoácidos, com
uma massa molecular predita de 58,5 kDa, além disso, apresenta um peptídeo de
sinalização em sua porção N-terminal, sugerindo ser secretada (LI et al., 2012). Sua
modelagem in silico permitiu classificá-la estruturalmente em BNR-neuraminidase
(ARUNI et al., 2011). O gene PG0352 corresponde a PGN_1608 em P. gingivalis
ATCC 33277 (Acesso GenBank: 6330303) (NAITO et al., 2008), cuja neuraminidase
também possui 526 aa (Acesso GenBank: BAG34127.1).
2.6 Peptídeos antigênicos de Porphyromonas gingivalis
Antígeno é qualquer molécula ou patógeno capaz de promover uma resposta

imune, podendo ser um vírus, um fragmento de parede celular bacteriana, uma
proteína ou outra macromolécula. Um antígeno complexo pode se ligar a diferentes
anticorpos e cada anticorpo ou receptor de célula T liga-se a uma estrutura molecular
particular no antígeno, chamada de determinante antigênico ou epítopo (NELSON &
COX, 2004c).
As células apresentadoras de antígeno (APC) expressam em sua superfície as
moléculas do MHC que se ligam a peptídeos. A maioria dos linfócitos T reconhece
apenas peptídeos lineares curtos, pois os receptores de antígenos das células T
CD4+ e T CD8+ são específicos para antígenos apresentados por moléculas do MHC.
Além disso, as células T reconhecem peptídeos lineares e não determinantes de
conformação de antígenos proteicos. As CD4+ reconhecem peptídeos provenientes
de proteínas extracelulares, apresentados pelas moléculas MHC de classe II (ROCHA
& NEEFJES, 2008; VYAS et al., 2008).
Epítopos imunodominantes candidatos de gingipaínas foram testados em
camundongos sob a hipótese que tais peptídeos, que se ligam ao MHC II I-Ab, seriam
apresentados às células T CD4+ durante a colonização oral por P. gingivalis. As
sequências das proteínas Kgp e RgpA de ATCC 33277 foram analisadas para a triagem
desses peptídeos com atividade imunogênica, os quais foram depositados no banco
de dados público online IEDB (http://www.iedb.org/sourceOrgId/431947). O peptídeo
na posição 467-477 de Kgp (ID 190728), por exemplo, obteve resultado positivo para
produção de IL-17A e IFN-γ quando injetado em Mus musculus (http://www.iedb.org/
epId/190728) (BITTNER-EDDY et al., 2013). Outros peptídeos de Kgp de P. gingivalis
W50 (ID 170347 / 173279) foram testados em M. musculus BALB/c, seguindo-se por
reestimularão in vitro, com resultado positivo na proliferação de células T (3H-timidina).
O peptídeo (ID 170347) também apresentou resultado positivo na produção de IFN-γ
e de IL-4 (TAM et al., 2008).
Epítopos de Kgp e da neuraminidase de P. gingivalis ATCC 33277 foram
recentemente obtidos por análise in silico das sequências proteicas, testados e
depositados no IEDB (Kgp: reference ID 1032999 / neuraminidase: reference ID
1033135). Nesse estudo, todos os peptídeos de Kgp testados foram reconhecidos por
IgG presente no soro e o peptídeo Kgp12 fez melhor distinção entre os grupos com
periodontite crônica e sem periodontite. Os peptídeos da neuraminidase apresentaram
baixo reconhecimento por IgG, o que pode ser favorável para a permanência do
patógeno no hospedeiro (SANTOS-LIMA et al., dados não publicados). No IEDB, não
foram identificados epítopos referentes à sialidase / neuraminidase de P. gingivalis até
a publicação decorrente deste trabalho e HmuY ainda não possui epítopos depositados
até 07 de novembro de 2018.
O peptídeo sintético Kgp12 conseguiu diferenciar indivíduos com gengivite
de indivíduos com periodontite quanto aos níveis de IgG. Em cultura de células
mononucleares do sangue periférico (CMSP) humano, os peptídeos Kgp12, 17 e 18
induziram baixas concentrações de IFN-γ e Kgp12 foi capaz de diferenciar a resposta
entre indivíduos com e sem periodontite quanto a produção desta citocina pois as CMSP
de indivíduos sem periodontite foram capazes de produzir maiores concentrações da
citocina em presença deste peptídeo. Kgp12 também induziu a produção de IL-6 e IL-
1β em CMSP dos mesmos indivíduos (SANTOS-LIMA et al., dados não publicados).
Embora se saiba que a ligação ao MHC seja necessária, mas não suficiente
para o reconhecimento do epítopo pelas células T, o uso das análises in silico para
predizer peptídeos imunogênicos mostra-se uma ferramenta útil para estudos de
imunogenicidade de patógenos. A análise permite selecionar peptídeos para a síntese
química e teste de imunogenicidade, reduzindo o tempo e o custo na busca por
resultados promissores. Identificar peptídeos antigênicos em fatores de virulência de
P. gingivalis pode contribuir para a compreensão da influência do microrganismo na
etiologia da doença periodontal, bem como para o entendimento dos mecanismos de
resposta do hospedeiro à infecção, visto que tais peptídeos podem ser sintetizados,
utilizados em experimentos que avaliem a imunogenicidade do patógeno e podem
ser ferramentas úteis em aplicações biotecnológicas para emissão assertiva do
prognóstico da doença.
2.7 Triagem virtual
As técnicas de triagem virtual, através da utilização de métodos computacionais,

também conhecidos pelo termo in silico, auxiliam na seleção de compostos orgânicos

promissores do ponto de vista biotecnológico (e.g. novos fármacos) (RODRIGUES
et al., 2012; CUENO et al., 2014). Tais métodos podem ser amplamente aplicados à
imunologia das doenças periodontais na prospecção de marcadores moleculares para
diagnóstico / prognóstico e de peptídeos quimeras para candidatos vacinais; e para
compreender a resposta frente aos diversos antígenos.
O conhecimento das estruturas de alvos macromoleculares ou de complexos do
tipo ligante-receptor permite a aplicação de estratégias de planejamento de fármacos
baseadas na estrutura do receptor (do inglês, Structure-Based Drug Design - SBDD).
Em contrapartida, quando a estrutura do alvo estudado não é conhecida, métodos de
planejamento de fármacos baseados na estrutura de ligantes (do inglês, Ligand-Based
Drug Design - LBDD) podem ser utilizados, explorando propriedades e características
de um conjunto de ligantes bioativos. O uso integrado dessas estratégias pode gerar
informações úteis no planejamento de novos fármacos uma vez que os conhecimentos
das estratégias se complementam (GUIDO, ANDRICOPULO & OLIVA, 2010).
Tendo em vista a priorização de moléculas com afinidade frente a um
alvo molecular em estudo, é possível utilizar as estratégias de aplicação de filtros
moleculares, triagens biológicas automatizadas em alta escala (do inglês, High-
Throughput Screening – HTS) e a triagem virtual (do inglês, Virtual Screening – VS)
em bancos de dados de estruturas (e.g. ZINC) que agregam compostos, os quais
podem ser avaliados posteriormente através de ensaios biológicos (STERLING &
IRWIN, 2015). Entre as abordagens baseadas na estrutura de ligantes, os modelos
farmacofóricos têm sido empregados em estudos de triagem virtual (LIU, SUN & HU,
2012).
O farmacóforo inclui todas as principais características envolvidas na interação do
ligante com o sítio receptor (RODRIGUES et al., 2012). De acordo com a definição da
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), um modelo farmacofórico
consiste em um conjunto de características estéricas e eletrônicas necessárias para
garantir as interações intermoleculares ideais com um alvo biológico específico e
modular uma resposta biológica (WERMUTH et al., 1998). Os modelos farmacofóricos
podem ser derivados de abordagens baseadas na estrutura do alvo ou em ligantes,
dependendo da disponibilidade da estrutura tridimensional do sítio ativo do alvo. A
elucidação de um modelo farmacofórico envolve três estágios principais: geração de
possíveis modelos usando métodos baseados em estrutura ou ligantes; preparação
da base de dados para a avaliação e avaliação dos modelos farmacofóricos (BRAGA
& ANDRADE, 2013). Alguns programas como Catalyst, GALAHAD™, GASP e
LigandScout são utilizados para a geração de modelos farmacofóricos.
Na construção do modelo farmacofórico baseado em ligantes, são utilizadas
moléculas com atividade biológica conhecida, que funcionam como moldes para
a triagem em bases de dados de novas entidades químicas com algum nível de
similaridade físico-química e mecanismo de ação com estes moldes (RODRIGUES et
al., 2012). O modelo farmacofórico é construído através da sobreposição de uma série
de compostos ativos que reúnem características essenciais para a atividade (YANG,
2010).
Os cálculos de acoplamento molecular, por sua vez, consistem em estratégias
baseadas na estrutura do receptor que permitem avaliar e diferenciar as diversas
conformações e orientações que um mesmo ligante pode adotar no sítio do alvo, assim
como estimar a afinidade de ligação dos complexos ligante-receptor (RODRIGUES
et al., 2012). Essa estratégia pode ser dividida em duas etapas principais: busca
conformacional e pontuação das conformações geradas (DIAS & AZEVEDO, 2008;
HUANG & ZOU, 2010). Os métodos de busca podem ser divididos em métodos
sistemáticos (e.g. construção incremental); métodos estocásticos (e.g. algoritmo
genético, Monte Carlo) e métodos de simulação (e.g. dinâmica molecular) (KITCHEN
et al., 2004).
Os métodos sistemáticos utilizam algoritmos que exploram os graus de
liberdade das moléculas, normalmente, através de sua construção incremental
através da fragmentação inicial da molécula no sítio receptor. A simulação se inicia
com o posicionamento de um fragmento do ligante, denominado âncora, no sítio
ativo do alvo molecular (RODRIGUES et al., 2012). O programa DOCK utiliza um
método sistemático de construção incremental, no qual as orientações dos ligantes
são exploradas através da imagem negativa na superfície do receptor. A imagem é
gerada na superfície de acesso ao solvente com a sobreposição de esferas, das quais
são selecionadas aquelas que representam o sítio ativo da proteína (BROZELL et al.,
2012). O programa Surflex-Dock (JAIN, 2003) também é um exemplo desse método.
Os métodos estocásticos de busca permitem mudanças aleatórias, geralmente
alterando um grau de liberdade da estrutura por vez. Exemplos de métodos estocásticos
são o método Monte Carlo (MC) e os algoritmos genéticos ou evolutivos (BROOIJMANS
& KUNTZ, 2003), os quais permitem simular operações genéticas, como mutações
e recombinações. A conformação de uma molécula deve ser representada de modo
a permitir que um processo evolucionário de mutação e seleção ocorra. Ou seja,
todas as informações de ângulos de torção de ligações de uma molécula (“gene”) são
armazenadas como uma sequência numérica (“cromossomo”) (RODRIGUES et al.,
2012). Os programas Autodock Vina e GOLD são exemplos da utilização do algoritmo
genético como estratégia.
As funções de pontuação podem ser classificadas em três tipos: (1) funções
baseadas em campos de força, (2) funções empíricas e (3) funções baseadas no
conhecimento (CHENG et al., 2012). (1) As funções baseadas em campos de força
utilizam os potenciais de campos de força clássicos para calcular as interações
intermoleculares não covalentes, de acordo com os potenciais de Lennard-Jones
(interações estéreas) e de Coulomb (interações eletrostáticas) (SCHULZ-GASCH &
STAHL, 2003). A função Grid Score é um exemplo da aplicação dessa abordagem. (2) As
funções empíricas calculam a energia livre global através da introdução de parâmetros
de ajuste que multiplicam termos que descrevem a energia de interação, ligações
de hidrogênio, contribuições entrópicas... (ELDRIDGE et al., 1997; HUANG & ZOU,
2010; CHENG et al., 2012). Programas como o AutoDock4, EADock e GOLD utilizam
essas funções. (3) As funções com base no conhecimento calculam as interações do
ligante com a macromolécula como a soma de dados estatísticos dos potenciais de
pares atômicos de ligação entre o alvo e o ligante. Esses dados são obtidos a partir
de complexos cristalográficos proteína-ligante ou ligante-ligante (CAPRA et al., 2009).
Uma vez que as interações com alvos moleculares são de natureza dinâmica e,
portanto, a flexibilidade é uma característica crucial para a identificação do modo de
ligação, as simulações de Dinâmica Molecular (DM) são capazes de descrever uma
variação do comportamento molecular (conteúdo da estrutura secundária, orientação
de cadeias laterais, conformação de alças e energia de interação entre diferentes
moléculas) em função do tempo. Segundo a IUPAC, a DM é um procedimento de
simulação que consiste na computação do movimento dos átomos em uma molécula
ou de átomos individuais ou moléculas em sólidos, líquidos e gases, de acordo com as
leis de movimento de Newton (VERLI, 2014). Um dos pacotes de programas gratuitos
de alto desempenho para realização das simulações de DM é o GROningen MAchine
for Chemical Simulation (GROMACS) (ABRAHAM et al., 2015). O campo de força
GROMOS53A6, presente no GROMACS, é adequado para ser aplicado quando se
deseja analisar um sistema solvatado, como o das proteínas globulares, pois seus
parâmetros foram especialmente otimizados considerando o cálculo da energia livre
da solvatação das cadeias laterais dos aminoácidos (OOSTENBRINK et al., 2004).
A avaliação de uma simulação de dinâmica molecular pode ser realizada através de
módulos disponíveis no pacote GROMACS 5.1.2, como rms, rmsf, gyrate e Hbond.
Em outra abordagem de triagem in silico, pode-se predizer peptídeos
imunogênicos ao longo de uma sequência proteica, os quais podem ser sintetizados
e testados in vitro e in vivo, reduzindo o tempo e o custo na busca por peptídeos
promissores. O IEDB (VITA et al., 2015) possui ferramentas gratuitas como a MHC-II
Binding Predictions (http://tools.immuneepitope.org/mhcii/), a qual emprega diferentes
métodos para predizer epítopos que se liguem ao receptor MHC de classe II (WANG
et al., 2008; 2010).
Os métodos aqui descritos representam abordagens para compor estudos dos
fatores de virulência dos patógenos associados à periodontite, buscando compreender
a interação entre os patógenos e o sistema imune do hospedeiro (patogênese, evolução
da doença), gerando potenciais marcadores para o prognóstico (e. g. o peptídeo
sintético Kgp12, o qual conseguiu diferenciar indivíduos com gengivite de indivíduos
com periodontite quanto aos níveis de IgG) e triando alvos terapêuticos específicos
para serem usados em casos refratários, como em Cueno et al. (2014). Após a análise
in silico de um fator de virulência, os peptídeos promissores sintéticos (MACHADO et
al., 2004), capazes de ser reconhecidos por anticorpos humanos e de induzir resposta
imune em cultura de células humanas, podem auxiliar no estudo do fator de virulência
e na busca pelo entendimento da patogenicidade de P. gingivalis.
Os fatores de virulência abordados apresentam influência na resposta imune

do hospedeiro diante de P. gingivalis. Abordagens in silico para explorar a relação
antígeno / hospedeiro com menor custo e com maior eficácia podem contribuir
para a compreensão da influência do microrganismo na patogênese e na evolução
da periodontite, bem como para o entendimento dos mecanismos de resposta do
hospedeiro à infecção.
4 | AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia da UFBA, ao Programa de

Pós-graduação em Biotecnologia da UEFS, ao Laboratório de Imunologia e Biologia
Molecular (ICS, UFBA) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia.
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CAPÍTULO 20
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
BIOSSURFACTANTES PRODUZIDOS POR Bacillus
subtilis A PARTIR DO EXTRATO AQUOSO DA
ALGAROBA [Prosopis juliflora (SW) DC] COMO
SUBSTRATO NÃO CONVENCIONAL
Adrielly Silva Albuquerque de Andrade utilizados no processo industrial. A estratégia

Universidade Federal da Paraíba, Programa de de substituição de substratos convencionais
Pós-Graduação em Biotecnologia – Mestrado, para sua produção (como glicose e sacarose)
João Pessoa – PB.
por substratos oriundos de fontes renováveis,
Emanuele Cardoso Dias mais baratos e ricos em nutrientes para o
Universidade Federal da Paraíba, Programa de
cultivo de microrganismos produtores de
Pós-Graduação em Biotecnologia – Mestrado,
biossurfactantes é essencial para viabilizar sua
João Pessoa – PB.
produção em escala industrial. Dessa forma,
Napoleão José de Oliveira Neto
foram realizados dois processos para produção
Universidade Federal da Paraíba, Graduando em
Biotecnologia, João Pessoa – PB. de biossurfactantes: meio contendo sacarose
(convencional), e o outro, o extrato aquoso
Graciana Clécia Dantas
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, obtido das vagens da algaroba [Prosopis
Programa de Pós-Graduação em Engenharia juliflora (SW) DC.] como substrato para o
Química, Natal – RN. desenvolvimento do Bacillus subtilis. Os cultivos
Adna Cristina Barbosa de Sousa foram acompanhados durante 96 horas e a
Universidade Federal da Paraíba, Departamento produção do biossurfactante foi caracterizada
de Biologia Celular e Molecular, João Pessoa – pelos testes de emulsificação, purificação
PB. (centrifugação, precipitação ácida e extração
Andréa Farias de Almeida líquido-líquido) e determinação da sua atividade
Universidade Federal da Paraíba, Departamento antimicrobiana. Os métodos de precipitação
de Biotecnologia, João Pessoa – PB. ácida e extração líquido-líquido recuperaram
uma produção de biossurfactantes de 0,064g/L
e 1,208g/L, respectivamente, sacarose e
RESUMO: Biossurfactantes são moléculas extrato aquoso da algaroba. Além disso, os
anfipáticas sintetizadas por microrganismos biossurfactantes produzidos demonstraram boa
que agem em interfaces água/óleo ou óleo/água capacidade emulsificante quando colocados
reduzindo as tensões superficiais e interfaciais em contato com três compostos hidrofóbicos
entre as fases fluidas e assim tornando alguns diferentes (óleo vegetal, óleo de motor e
compostos mais miscíveis. Apresentam alto querosene) e atividade antimicrobiana com
custo de produção, consequência do valor relação aos microrganismos Bacillus subtilis,
do substrato e dos métodos de purificação Bacillus pumilus e Pseudomonas sp.

PALAVRAS-CHAVE: Emulsificantes, surfactina, atividade antimicrobiana e biorreatores
ABSTRACT: Biosurfactants are amphipathic molecules synthesized by microorganisms

that act at water/oil or oil/water interfaces, reducing surface and interfacial tensions
between the fluid phases and thus making some compounds more miscible. They
present high cost of production, consequence of the value of the substrate and the
purification methods used in the industrial process. The strategy of replacing conventional
substrates for their production (such as glucose and sucrose) by substrates from
renewable sources, cheaper and rich in nutrients for the culture of microorganisms
producing biosurfactants is essential to enable their production on an industrial scale.
Thus, two processes were carried out to produce biosurfactants: medium containing
sucrose (conventional), and the other the aqueous extract obtained from the algaroba
pods [Prosopis juliflora (SW) DC] as a substrate for the development of Bacillus
subtilis. The cultures were monitored for 96 hours and the biosurfactant production
was characterized by emulsification, purification (centrifugation, acid precipitation and
liquid-liquid extraction) tests and determination of their antimicrobial activity. The acid
precipitation and liquid-liquid extraction methods recovered a biosurfactant production
of 0.064g/L and 1.208g/L, respectively, sucrose and aqueous extract of the algaroba.
In addition, the biosurfactants produced showed good emulsifying capacity when
placed in contact with three different hydrophobic compounds (vegetable oil, motor oil
and kerosene) and antimicrobial activity with respect to the microorganisms Bacillus
subtilis, Bacillus pumilus and Pseudomonas sp.
KEYWORDS: Emulsifiers, surfactin, antimicrobial activity and bioreactors.
1 | INTRODUÇÃO
Biossurfactantes são moléculas anfipáticas, constituídas de uma porção hidrofílica

e uma porção hidrofóbica, sintetizadas por microrganismos que agem nas interfaces
água/óleo ou óleo/água reduzindo as tensões superficiais e interfaciais entre elas
e assim tornando alguns compostos mais miscíveis (BANAT et al., 2010). A porção
apolar é frequentemente uma cadeia hidrocarbonada enquanto a polar pode ser iônica
(aniônica ou catiônica), não-iônica ou anfotérica. Essa constituição molecular confere
a capacidade de diminuir a tensão superficial entre fases fluidas, como água e óleo ou
ar e água (DESAI e BANAT, 1997).
A formação de um filme molecular, ordenado nas interfaces, reduz a tensão
interfacial e superficial, sendo responsável pelas propriedades únicas dos
surfactantes, como a capacidade de adsorção, formação de micelas, formação de
macro e microemulsões, lubrificação, ação espumante, solubilização e detergência.
Devido essa propriedade, várias são as aplicações industriais que envolvem o uso de
biossurfactantes, como indústria de petróleo no processo de recuperação melhorada
de petróleo (MEOR) (BANAT et al., 2000; SEN, 2008); farmacêutica e de cosméticos
como a capacidade de formar emulsões estáveis associada à boa compatibilidade com
pele e cabelos; na agricultura para a formulação de herbicidas e pesticidas (COSTA,
2005); na produção de produtos de higiene pessoal, detergentes, processamento
de alimentos como agentes emulsionantes conferindo a consistência e textura dos
alimentos (BANAT et al., 2000); tratamento e processamento de metais, vestuário,
processamento de polpas de papel (NITSCHKE e PASTORE, 2002).
A maioria dos surfactantes convencionais produzidos atualmente é derivada do
petróleo e constituem compostos tóxicos e não biodegradáveis, fatores que justificam
a busca por alternativas menos nocivas ao ambiente e ao homem, uma vez que existe
a preocupação com os efeitos alérgicos dos produtos artificiais. Os biossurfactantes
apresentam maior eficiência quando comparados aos surfactantes convencionais:
menor concentração micelar crítica (CMC), biodegradabilidade, maior taxa de redução
da tensão superficial, solubilidade em água alcalina, estabilidade térmica, estabilidade
em valores extremos de pH, a baixa toxicidade dos biossurfactantes permite então
seu uso em alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos (VIJAYAKUMAR e
SARAVANAN, 2015).
Os biossurfactantes podem ser sintetizados a partir de substratos que contenham
altos níveis de carboidratos ou de lipídeos, suprindo a necessidade de fonte de
carbono para sua produção (NITSCHKE; FERRAZ; PASTORE, 2004). Embora essas
biomoléculas apresentem inúmeras vantagens sobre os surfactantes sintéticos os custos
para sua produção ainda constituem um entrave para sua utilização em ampla escala.
O desenvolvimento de processos que reduzam custos de matérias primas permitiria
o sucesso da produção de biossurfactantes uma vez que estes são responsáveis por
cerca de 30% de todo custo de produção (MAKKAR e CAMEOTRA, 2002). A fim de
baratear sua produção, estratégias de utilizar substratos não convencionais, obtidos
de fontes renováveis, são desejáveis.
A algaroba [Prosopis juliflora (SW) D.C.] é uma leguminosa arbórea, não
oleaginosa, da família Fabaceae, originária das Américas, mais especificamente em
Piúra no Peru, (encontrada desde a América do Norte a Central e Sul) e também na
África Tropical. Chegou no Brasil há mais de 50 anos, estando difundida na região
Nordeste, em populações cultivadas e subespontâneas (SILVA et al., 2002). De
acordo com Lima (1988), o interesse e a grande difusão desse gênero no semiárido
nordestino pode ser atribuída as suas diversas características como: adaptar-se a
solos e climas severos; rápida taxa de crescimento; alta palatabilidade como forragem;
produtividade; capacidade de rebrotar e resistir a podas e ao pastejo; e resistência a
pragas e doenças. Além de sua rusticidade e por frutificar na época mais seca do ano,
sendo a única fonte alimentar economicamente viável que permite a sobrevivência
da criação de bovinos e caprinos (SILVA et al., 2003). Seu fruto é uma vagem rica
em proteína, gordura, vitaminas, sais minerais e, principalmente, açúcar (BORGES,
2004), que normalmente no período de seca é utilizada como ração animal.
As vagens de algaroba, quando maduras, possuem elevado teor de sacarose
e matéria seca de aproximadamente 84,0%. Silva et al. (2002) relataram que essa
produção comprova o potencial dessas vagens como aditivos em silagens de capim.
Os mesmos autores, reportaram ainda grande aceitabilidade da algaroba, por possuir
teores de 25 a 28% de glicose, 11 a 17% de proteínas e 14 a 20% de ácidos orgânicos,
pectinas entre outras substâncias. O resíduo da algaroba é classificado com concentrado
energético, pois possui alto teor de sacarose, e é bastante aceito na suplementação
alimentar dos animais pelo seu aroma agradável (MAGALHÃES, 2007). Carvalho et al.
(2006) estudaram as opções de alimentos alternativos de maior valor nutritivo e que
possam vir futuramente como alternativa na substituição de alimentos de alto custo
financeiro, como o milho e a soja. Portanto, mostrando-se ter um potencial alimentício
de mais baixo custo.
Neste contexto, para o processo de produção de biossurfactantes foi utilizado
o extrato aquoso obtido das vagens da algaroba, como fonte de carbono não
convencional, para o desenvolvimento Bacillus subtilis UFPEDA 16, linhagem produtora
de biossurfactantes como subtilisina e surfactina.
2.1 Microrganismo
O microrganismo utilizado no processo de produção de biossurfactantes foi a

linhagem Bacillus subtilis (UFPEDA 16) cedido da Coleção de Microrganismos do
Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco.
2.2 Manutenção das linhagens
As culturas foram mantidas em meio Ágar Nutriente. A renovação das células foi
realizada mensalmente por repiques e incubação a 30°C durante 24 horas e depois
armazenadas a 4°C.
2.3 Substrato
No processo de produção de biossurfactantes foi utilizado o extrato aquoso obtido

da prensagem das vagens da algaroba. As vagens da algaroba foram coletadas da
região semiárida do Rio Grande do Norte, especificamente na zona rural do município
de Japi – RN.
O extrato aquoso da algaroba foi obtido com base na metodologia descrita
por Silva et al. (2009), as vagens foram devidamente selecionadas, descartando as
atacadas por fungos e insetos. Pesadas e sanitizadas por meio da imersão em uma
solução de hipoclorito de sódio a 3%(v/v) durante 5 minutos. A remoção dos resíduos
sanitizantes foi realizada por lavagens sucessivas em água corrente. Em seguida,
foram hidratadas em água destilada aquecida a 65 ± 2°C, na proporção de 1:1 (m/v)
(1kg de vagem para 1L de água) durante 3 horas para melhor extração dos açúcares

disponíveis.
Para prensagem foi utilizada uma prensa hidráulica manual, em que a matéria-
prima foi inserida em um cilindro de aço inoxidável perfurado e submetidas a uma
pressão de 50Kgf/cm2.
2.4 Processo de produção de biossurfactantes
Foram realizados dois processos em cultivo submerso. O primeiro processo

foi utilizado como fonte de carbono a sacarose (padrão), e o segundo foi utilizado o
extrato aquoso da algaroba como fonte de carbono, ambos sendo desenvolvidos em
biorreator de bancada de 4,5L (Tecnal).
1° Processo 2° Processo
20g/L de sacarose 1% (v/v) de extrato de algaroba
3,0g/L KH2PO4 3,0g/L KH2PO4

7,0g/L K2HPO4 7,0g/L K2HPO4
0,2g/L MgSO4.7H2O 0,2g/L MgSO4.7H2O
1,0g/L (NH4)2SO4 1,0g/L (NH4)2SO4
1,0g/L de extrato de levedura
Tabela 1 – Composição dos meios utilizados no processo de produção de biossurfactantes em

biorreator de bancada
*Em ambos, o pH foi ajustado para 6,8.
Os inóculos foram preparados por meio da transferência, com alça de platina,

de colônias isoladas crescidas em tubos inclinados com meio de manutenção Ágar
Nutriente para frascos erlenmeyers de 250mL contendo 100mL de meio de cultura
para o processo, obedecendo uma razão de aeração de 40%, e incubados a 37°C sob
agitação de 200rpm em incubadora rotativa orbital (SL 422 - Solab). O crescimento
microbiano foi acompanhado pela determinação da absorbância dos meios de cultivos
a 600nm (D.O.600nm). Os inóculos foram adicionados ao cultivo, na proporção de
10% (v/v), quando a absorbância se encontrava entre 0,6 e 0,8 (HISS, 2001).
O cultivo com sacarose (substrato padrão) foi realizado em biorreator de bancada
com as seguintes condições de processo: volume útil de 4,5L contendo 2L de meio
de cultura, sob agitação de 150rpm, com uma vazão de 1L/min de ar esterilizado, a
37°C e pH controlado a 6,8. A espuma (alta concentração de biossurfactante) gerada
durante o cultivo foi coletada por meio de um dispositivo acoplado no biorreator (Figura
1), a fim de ser utilizada nos testes de emulsificação e na determinação da atividade
antimicrobiana.

Figura 1 – Biorreator durante o processo de produção de biossurfactantes com sacarose como
substrato, como é demonstrado em A. Em B, o frasco acoplado ao sistema para a coleta das
espumas.
Fonte: autores, 2018
O cultivo com extrato aquoso da algaroba (substrato não convencional) foi

realizado em biorreator nas mesmas condições citadas no processo com a sacarose
(substrato padrão).
2.5 Análises dos processos fermentativos
Em tempos regulares, os cultivos foram analisados quanto à concentração

de microrganismos, concentração de substrato e produção do biossurfactante por
determinação do índice de emulsificação.
2.5.1 Concentração de microrganismo (biomassa)
O crescimento microbiano foi acompanhado pelo método gravimétrico. A

determinação do peso seco consistia em adicionar 2mL de caldo fermentado ao
microtubo de massa conhecida, centrifugar (10000 rpm por 10 minutos, MiniSpin Plus)
e, após centrifugação, o sobrenadante era descartado.
A fração sólida sedimentada foi pesada e colocada em estufa a 80 °C por 24h.
Em seguida, a fração sólida livre de umidade foi pesada. O procedimento foi realizado
em triplicata. O peso seco foi determinado de acordo com a Equação 1.
(1)
2.5.2 Quantificação do substrato
A quantificação de substrato foi realizada pela análise do sobrenadante (caldo

fermentado isento de células). Para determinação dos açúcares redutores totais utilizou-
se o método DNS (ácido 3,5-dinitro salicílico) descrito por Miller (1959) e adaptada

por Santos (2007). A concentração dos açúcares redutores totais foi determinada
após hidrólise da amostra, uma vez que o extrato de algaroba é rico em sacarose. A
curva padrão de glicose (1g/L) foi utilizada para quantificação dos açúcares redutores
presentes na amostra. Cada amostra foi analisada em triplicata.
2.5.3 Quantificação do biossurfactante
A produção de biossurfactante foi determinada pelo índice de emulsificação (IE24)

com base na metodologia descrita por Cooper e Goldenberg (1987). Em três colunas
graduadas, adicionou-se três tipos de compostos hidrofóbicos (óleo de motor, óleo
vegetal e querosene) e o sobrenadante do cultivo na proporção (3:2). Todos os tubos
foram agitados em vórtex durante 2 minutos e deixados em repouso durante 24 horas.
A porcentagem de emulsificação foi determinada pela Equação 2:
(2)
2.6 Processo de purificação de biossurfactantes
2.6.1 Acidificação do sobrenadante
Os sobrenadantes de ambos os processos foram acidificados com ácido clorídrico

a 3,0 M até atingir o pH 2,0. Após, foram mantidos a 4°C por 24 horas para precipitação
do biossurfactante produzido. Os precipitados foram separados por centrifugação a
15000rpm por 10 min (MiniSpin plus, Eppendorf). Todo precipitado foi dissolvido em
10mL de água deionizada (pH 8,0).
2.6.2 Processo de extração líquido-líquido
Extração do biossurfactante obtido no processo com sacarose: a solução

resultante da acidificação foi transferida para um funil de separação e submetida à
extração com diclorometano (1:1). Agitou-se, vigorosamente, por 5 minutos. Seguido
por 1 hora de repouso para atingir a completa separação de fases. A fase mais densa
foi retirada do funil. Adicionou-se 2mL de metanol, a fim de transferir o produto para
o microtubo. O metanol foi evaporado. E o produto foi ressuspenso em 1mL de água
deionizada.
Extração do biossurfactante obtido no processo com extrato aquoso da algaroba:
a solução resultante foi transferida para um funil de separação e submetida à extração
com diclorometano (1:1). Agitou-se, vigorosamente, por 5 minutos. Seguido por 1 hora
de repouso para que a completa separação de fase. A fase mais densa foi retirada do
funil. Em seguida, foi realizada uma nova extração com diclorometano, clorofórmio e

metanol (1:1:1:1). Agitou-se por 5 minutos. Repouso por 1 hora. Novamente, a fase
mais densa foi retirada e submetida a uma nova extração com clorofórmio e metanol
(1:1:1). Agitou-se por 5 minutos e repouso por 1 hora. A fase resultante foi transferida
para um microtubo e centrifugada a 14.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi
descartado. Após evaporação dos solventes, o produto foi ressuspenso em 1,0mL de
água deionizada.
2.7 Determinação da atividade antimicrobiana
Para avaliação da atividade antimicrobiana foi utilizado os seguintes

microrganismos: Bacillus pumilus, isolado do solo cultivado da cana-de-açúcar da
região de Santa Rita/PB, Pseudomonas sp. cedido pelo Laboratório de Microbiologia
Ambiental do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba e Bacillus
sp. cedido pelo Laboratório de Biotecnologia Celular e Molecular do Centro de
Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba.
As linhagens foram repicadas em placas de Petri com 10mL de meio de
manutenção e incubadas por 24 horas a 37°C. Em seguida, foi adicionado 100µL do
biossurfactante em discos de papel de filtro com diâmetro de 2,7cm e, após as placas
foram deixadas em repouso por mais 24 horas.
3.1 Produção de biossurfactantes
As curvas mostradas na Figura 2A e 2B descrevem o crescimento celular, o

consumo de substrato durante o processo de produção de biossurfactantes utilizando
os substratos sacarose e extrato aquoso de algaroba, respectivamente.
(A)

(B)
Figura 2 – Curvas de crescimento celular e consumo de substrato durante o processo de

produção de biossurfactantes
Pela análise das curvas de crescimento microbiano, verifica-se que a linhagem

Bacillus subtilis UFPEDA 16 adaptou-se ao sistema de cultivo proporcionado para
ambos os substratos. A fase exponencial de crescimento foi observada de 0 a 52
horas de processo para o substrato sacarose e de 2 a 21 horas para o extrato aquoso
da algaroba, e a fase de estacionária foi estabelecida após esses períodos. Embora
normalmente cultivado em meio contendo sacarose como principal fonte de carbono,
a análise demonstra que a linhagem microbiana tem habilidade para se desenvolver
em outro substrato mais complexo.
No meio com sacarose, observa-se um rápido crescimento e maior duração da
fase exponencial durante o cultivo. A concentração celular máxima obtida foi de 4,75
g.L-1 e um consumo de sacarose de 6,78 g.L-1 em 52 horas.
Segundo Desai e Banat (1997), o estudo cinético relata muitas variações na
produção de biossurfactantes. Em casos específicos, a maior produção é observada
nas condições limitantes do crescimento, pela limitação do nitrogênio entre outros
fatores. Alguns autores defendem a teoria de que os biossurfactantes apresentam
maiores concentrações no final da fase estacionária e início da estacionária. Besson e
Michel (1992) afirmaram que em B. subtilis, o biossurfactante surfactina, já é produzida
na fase exponencial de crescimento, ainda que em pequenas concentrações. O produto
formado pode estar ou não associado ao crescimento celular, pois dependerá de
diversos fatores inclusos, como: o microrganismo proposto como agente transformador
ou até mesmo, o meio de cultivo a ser utilizado no processo (DEBON, 2015).
Como forma de identificar a presença de biossurfactante no processo, foi
determinado o índice de emulsificação dos sobrenadantes obtidos em cada um dos
cultivos analisados. As análises de índice de emulsificação estão ilustradas na Figura
3.
Ao observar a Figura 3, constata-se que os índices de emulsificação foram

similares, apresentando um índice médio de 54% de emulsão.
As análises realizadas com o querosene apresentaram emulsificação apenas
com a espuma e com o sobrenadante do cultivo com sacarose, provavelmente pela
característica do processo ter um meio de cultura apenas com reagentes sintéticos,
uma vez que o biossurfactante produzido presente na espuma não possui alta
concentração de metabólitos oriundos do cultivo.
Os melhores resultados foram obtidos quando os sobrenadantes dos cultivos
com sacarose e extrato aquoso da algaroba foram analisados com o óleo de motor.
Nestes, a emulsão apresentou maior índice de emulsificação e demonstrou-se
bastante estável durante a análise. Porém, a emulsificação com a espuma apresentou
um índice menor, mas mantendo-se estável durante o processo.
Figura 3 – Testes de emulsificação realizados com os sobrenadantes: (A) emulsificação

com o biossurfactante produzido a partir da sacarose (convencional) e (B) emulsificação
com o biossurfactante produzido a partir do extrato aquoso da algaroba (não convencional).
*compostos hidrofóbicos da esquerda para direita: querosene, óleo vegetal e óleo de motor
Os índices de emulsificação determinados podem ser acompanhados na Tabela

2:
Teste de 1° cultivo 2°cultivo

emulsificação
Espuma Sobrenadante Sobrenadante
Óleo vegetal 60% 48% 53%
Querosene 40% 45% 0,1%
Óleo de motor 20% 98% 62%
Tabela 2 – Índices de emulsificação representados em porcentagem. No primeiro cultivo foram

realizados dois testes, um com a espuma que foi coletada durante o processo fermentativo
e outro com o sobrenadante do cultivo de 90 horas. No segundo cultivo o teste foi realizado
apenas com o sobrenadante do processo fermentativo de 160 horas.
De acordo com alguns pesquisadores, para que a emulsão seja considerada

eficaz, o índice de emulsificação deve ser superior a 40% (YOUSSEF et al., 2004).
Logo, desta forma o presente estudo apresentou resultados satisfatórios, quando
considerado o composto com características lipofílicas.

3.2 Processo de purificação do biossurfactante
A característica do biossurfactante no ponto de vista estrutural permite a

sua solubilização em meio alcalino e precipitação em meio ácido. Baseado nessa
característica molecular, o sobrenadante do cultivo, em ambos substratos utilizados,
foi submetido à precipitação ácida como uma das etapas de recuperação e purificação
do biossurfactante produzido.
O processo de purificação do biossurfactante para o cultivo com sacarose
apresentou um rendimento da extração igual a 0,064g/L de surfactina. Já a análise da
extração do biossurfactante produzido em meio contendo o extrato aquoso da algaroba
apresentou um rendimento de 1,208g/L.
Os biossurfactantes produzidos a partir do extrato aquoso de algaroba e sacarose
obtiveram comportamentos distintos com relação às análises de caracterização.
Para recuperação do biossurfactante produzido a partir da sacarose foi utilizado
um processo de extração líquido-líquido somente com o diclorometano, uma vez
que a surfactina (biossurfactante produzido por Bacillus subtilis) tem maior caráter
lipossolúvel devido a sua estrutura molecular. Essa recuperação foi bastante eficiente
permitindo a separação do biossurfactante do sistema aquoso do caldo obtido do
processo fermentativo.
O processo de extração do biossurfactante produzido a partir do extrato aquoso de
algaroba utilizando somente o diclorometano não se apresentou tão eficiente quanto à
extração do cultivo com sacarose. Embora tenha observado uma concentração maior
no final dessa extração, não se pode afirmar que a extração foi mais eficiente, pois
mesmo após o processo de extração, o líquido resultante ainda apresentava alguns
resíduos do substrato utilizado, o que pode ter interferido no peso da amostra final. A
partir dessa observação, o precipitado formado além de conter a surfactina produzida
pelo Bacillus subtilis, pode conter ainda outros componentes do próprio extrato aquoso
da algaroba, como o polímero galactomana inerente a composição da algaroba,
tornando-se a separação mais difícil de ocorrer.
3.3 Determinação da atividade antimicrobiana
Os biossurfactantes purificados e a espuma demonstraram ter atividade

antimicrobiana frente aos microrganismos B. subtilis, B. pumilus e Pseudomonas sp.
Na Tabela 3, pode-se analisar os diâmetros dos halos formados pela atividade
antimicrobiana proporcionada pelos sobrenadantes e a espuma gerados nos processos
de produção de biossurfactantes.

Microrganismo alvo e
Amostra tamanho do halo formado (mm)
Bacillus sp. Bacillus pumillus Pseudomonas sp.
Controle 0,00 0,00 0,00
Biossurfactante (meio
0,00 90,0 0,00
sacarose)
Biossurfactante
70,0 90,0 10,0
(meio algaroba)
Espuma 125,0 130,0 150,0
Tabela 3 – Resultados da atividade antimicrobiana frente aos microrganismos analisados.
Os biossurfactantes do tipo surfactina têm características terapêuticas,

principalmente atividades antimicrobianas, tais análises demonstraram, por meio da
formação de halo na placa de cultivo, bastante eficiência com relação à atividade
antibiótica frente aos microrganismos analisados. A atividade antimicrobiana foi
quantificada, o biossurfactante presente na espuma apresentou a maior atividade
microbiana tendo como resultado um halo de 125, 130 e 150mm, respectivamente, no
Bacillus sp, no Bacillus pumillus e Pseudomonas sp.
4 | CONCLUSÃO
A utilização do extrato aquoso da algaroba pode ser considerada uma ótima

fonte renovável de substrato no cultivo de B. subtilis (UFPEDA 16) para produção de
biossurfactantes. A atividade emulsificante apresentada (62%) e o poder antimicrobiano
são considerados bons resultados para produção da surfactina a partir de um substrato
em abundância no nordeste brasileiro. Os métodos de extração do biossurfactante
foram eficientes, pois sua recuperação foi obtida com menos etapas possíveis de
purificação e atingindo boa reprodutibilidade nas análises de emulsificação e atividade
antimicrobiana.
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 21
SUPLEMENTAÇÃO COM DIFERENTES

NUTRACÊUTICOS ATENUA PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS CARACTERÍSTICOS DO
TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
Ana Olívia Martins Laurentino ou solução salina. A prole permaneceu com as

Universidade Federal do Rio Grande do Sul – mães até o desmame e no dia pós-natal (PND)
UFRGS 22 receberam por via oral ω-3, ácido fólico,
Porto alegre – RS risperidona ou salina em doses específicas.
Naiana da Rosa No PND 30 e 60 realizaram-se os testes de
Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL estereotipia e interação social e no PND 45
Tubarão – SC o teste de memória social. Os resultados
Tamires Mateus Gomes demonstraram que a suplementação com
Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL os nutracêuticos mostrou-se positivamente
Tubarão – SC efetiva sobre parâmetros comportamentais,
Eduardo de Medeiros Peretti especialmente a suplementação de ácido fólico,
Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL sugerindo que estes nutracêuticos podem servir
Tubarão – SC futuramente como uma alternativa terapêutica
Fabiana Durante de Medeiros não convencional para o tratamento do TEA.
Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL PALAVRAS-CHAVE: Transtorno do Espectro
Tubarão – SC Autista, Nutracêuticos, Ácido fólico.
Jucélia Jeremias Fortunato
Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL ABSTRACT: It is interesting to evaluate
Tubarão – SC the effects of omega-3 (ω-3) and folic acid
supplementation in an animal model of autism
due to the complexity of its symptoms and the
range of side effects caused by the drugs used
RESUMO: Torna-se interessante avaliar os
in its treatment. For this study Twenty pregnant
efeitos da suplementação de ômega-3 (ω-3) e
females Wistar rats were used. On gestational
ácido fólico em um modelo animal de autismo
day (DG) 9.5 the animals received 100 μg/
devido à complexidade dos seus sintomas e
kg of LPS or saline solution. The offspring
da gama de efeitos colaterais causados pelos
remained with the mothers until weaning and
fármacos utilizados no seu tratamento. Para
on the postnatal day (PND) 22 received orally
este estudo foram utilizadas 20 fêmeas de
ω-3, folic acid, risperidone or saline in specific
ratos Wistar prenhes. No dia gestacional (DG)
doses. In PND 30 and 60 was performed the
9.5 os animais receberam 100 µg/Kg de LPS
stereotypy and social interaction tests and in

the PND 45 the social memory test. The results showed that supplementation with
nutraceuticals was positivelly effective on behavioral parameters, especially folic acid
supplementation, suggesting that these nutraceuticals may serve in the future as a
non-conventional therapeutic alternative for the treatment of ASD.
KEYWORDS: Autism spectrum disorder, Nutraceuticals, Folic acid.
1 | INTRODUÇÃO
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é caracterizado como um transtorno

multifatorial que causa prejuízos nas áreas pertinentes ao comportamento e
interesses, interação social e comunicação. Acredita-se que infecções bacterianas ou
virais durante o período gestacional podem causar alterações nas respostas imunes
maternas e desencadear o desenvolvimento do TEA, porém, sua etiologia ainda não
foi bem elucidada (FORTUNATO et al., 2017).
Devido à complexidade patológica do TEA, os tratamentos indicados para o
autismo, como o uso de Risperidona, costumam causar diversos efeitos colaterais e
prejudicar a qualidade de vida dos indivíduos autistas (LAI et al., 2014). Desta forma, a
utilização de nutracêuticos, termo que refere-se um alimento ou parte de um alimento
que fornece benefícios à saúde, vem surgindo como uma alternativa terapêutica não
tradicional objetivando atenuar os sintomas característicos de transtornos complexos
como o TEA (REHMAN et al., 2018; SARRIS et al., 2016).
Considerando os estudos recentes sobre a relação entre alterações nos
mecanismos pró-inflamatórios juntamente com o estresse oxidativo e o desenvolvimento
do TEA, propomos investigar os efeitos da intervenção nutricional com ômega-3 e
ácido fólico sobre parâmetros comportamentais através de um modelo pré-clínico da
doença, pois, sugerimos que esta intervenção possa criar um modelo de integração
bem sucedida, melhorando a capacidade antioxidante e atenuando o estimulo pró-
inflamatório, com diminuição tanto do processo inflamatório quanto do dano decorrente
deste.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade
do Sul de Santa Catarina sob o protocolo 16.015.4.01.IV. Para tal, foram utilizadas
20 ratas fêmeas Wistar prenhes, pesando entre 250 e 300g, que foram acasaladas
com 10 machos da mesma linhagem e peso. Durante todo o experimento, os animais
permaneceram em padrão sanitário e em temperatura controlados (22ºC+1ºC),
com períodos de luz artificial (12 horas claro/escuro) e receberam ração comercial
padronizada e água ad libitum.
Para a caracterização do modelo animal de autismo a partir da ativação imune
materna descrita por Kirsten et al. (2010), as matrizes foram divididas aleatoriamente
em dois grupos. Um dos grupos recebeu a administração intraperitoneal (ip) de uma
única injeção de lipopolissacarídeo (LPS) extraído da bactéria E. coli (Sigma-Aldrich
Co.®), na dose de 100 µg/Kg no 9.5º dia gestacional (DG), caracterizando o grupo
experimental (LPS-tratados) (KIRSTEN et al., 2010). O segundo grupo recebeu
apenas solução NaCl 0,9% estéril via ip no volume equivalente ao grupo experimental,
caracterizando o grupo controle (Salina-tratados). A prole de cada um dos grupos
experimentais foi subdivida em outros 4 grupos no dia pós natal (DPN) 21, período em
que é feito o desmame, de acordo com o tratamento recebido:
Grupo Salina + Salina (n=10) Grupo LPS + Salina (n=10)

Grupo Salina + Risperidona (n=10) Grupo LPS + Risperidona (n=10)
Grupo Salina + AGP ω-3 (n=10) Grupo LPS + AGP ω-3 (n=10)
Grupo Salina + Ác. fólico (n=10) Grupo LPS + Ác. fólico (n=10)
O AGP ω-3 foi administrado na dose de 0,8 g/kg, via oral, durante 21 dias
consecutivos e a solução salina foi administrada no mesmo volume, na mesma via e
durante o mesmo período de tempo conforme descrito por FORTUNATO et al. (2017).
A risperidona (grupo controle-positivo) foi diluída em solução salina e administrada
na dose de 1,0 mg/kg, via oral por 21 dias consecutivos, configurando o grupo
controle positivo. O ácido fólico foi administrado na dose de 50mg/kg durante 7 dias
consecutivos por via oral. Todas as administrações iniciaram no DPN 22. No DPN 30
e DPN 60 foram realizados os testes de interação social e estereotipia de acordo com
o proposto por Schneider e Prezewlocki (2005) e no DPN 45 foi realizado o teste de
memória social conforme a metodologia de Barichello et al. (2007).
Figura 1 – Delineamento experimental dos períodos de tratamento e dos testes

comportamentais.
Fonte: Elaboração dos autores, 2018.
As análises estatísticas foram realizadas pelo programa GraphPad Prism v. 5 e

os dados paramétricos foram avaliados por análise de variância de uma via (ANOVA)
e os grupos foram comparados entre si através do post-hoc de Tukey. A significância
estatística foi considerada para valores de p<0,05 e todos os dados foram expressos
como média + desvio padrão.

O uso dos nutracêuticos na prevenção de doenças ou promoção da saúde é

uma tendência emergente e bastante promissora, pois, eles possuem a capacidade
de alterar funções metabólicas e fisiológicas. Do mesmo modo, autores afirmam que
suplementações com nutracêuticos têm sido utilizadas no tratamento de doenças
neurológicas e neuroinflamatórias, como: doença de Alzheimer (AD), doença de
Parkinson (DP) e autismo (PANDAREESH et al., 2018; MOORE et al., 2010; JAEGER
et al., 2017).
Dentre os nutracêuticos mais utilizados destacam-se o ácido fólico e o ômega-3.
O ácido fólico é comumente utilizado por gestantes para prevenir alterações na
formação do tubo neural. Contudo, muito tem se discutido se estes efeitos também
podem ser estendidos para as alterações neurocomportamentais como as encontradas
no TEA. Uma revisão realizada por Gao et al. (2016), mostrou que existem fortes
evidências de que a suplementação com ácido fólico possa causar efeitos benéficos
no neurodesenvolvimento e diminuir as características comportamentais típicas do
TEA.
Da mesma forma, um estudo experimental realizado por Fortunato et al. (2017)
mostrou que a suplementação com o ácido graxo poli-insaturado ômega-3 foi capaz
de reverter parâmetros comportamentais e bioquímicos associados a um modelo de
TEA induzido pela ativação imune materna.
Os nutracêuticos, de maneira geral, exercem um papel fundamental na
regulação do metabolismo energético e das vias de sinalização que agem modulando
a neurotransmissão e a neuroinflamação, além de estimular a atividade de fatores
neurotróficos envolvidos na neuroplasticidade e na prevenção de doenças
neurodegenerativas (PANDAREESH et al., 2018; MAZZIO et al., 2011).
Segundo Fortunato et al. (2017), apesar de a etiologia do TEA ainda ser
desconhecida, suspeita-se que a neuroinflamação possa estar envolvida na sua
fisiopatologia. Kirsten et al., (2010) postularam que a administração de LPS no 9,5º
DG de ratas é capaz de causar alterações comportamentais compatíveis com o TEA
na prole e que isto seja decorrente da ativação imune materna.
Os resultados dos testes de estereotipia (PND 30 e PND 60) mostraram que o
grupo LPS + Salina apresentou um aumento significativo na frequência de movimentos
estereotipados quando comparado com o grupo Salina + Salina, corroborando com o
modelo da doença proposto por Kirsten et al. (2010).
Quanto aos tratamentos, pode-se verificar que os animais tratados com
Risperidona e Ácido Fólico de ambos os grupos apresentaram frequência de grooming
significativamente menor quando comparados com os grupos Salina + Salina e LPS
+ Salina, sugerindo uma melhora do comportamento estereotipado. Ainda foi possível
verificar que os tratamentos com Risperidona e Ácido Fólico foram significativamente
mais efetivos no grupo LPS quando comparados com o tratamento Ômega-3 (Gráfico

1A e 1B).
Gráfico 1 – Frequência de grooming no PND 30 (Figura 1A) e no PND 60 (Figura 1B) dos
grupos: Sal + Sal, Sal + Risperidona, Sal + Ômega-3, Sal + Ácido fólico, LPS + Sal, LPS +
Risperidona, LPS + Ômega-3, LPS + Ácido fólico. *dados significativos quando comparados
com o grupo Sal + Sal; **dados significativos quando comparados com o grupo LPS + Sal; #
dados significativos quando comparados com o grupo LPS + Ácido fólico.
Os resultados dos testes de interação social não mostraram diferenças

significativas. Já os resultados do teste de memória social apresentaram significância
em dois parâmetros: seguir e passar por cima. No parâmetro de seguir houve uma
diminuição significativa entre os grupos Salina + Risperidona e LPS + Ácido Fólico
quando comparados com o grupo LPS + Salina (Gráfico 2A).
O grupo LPS suplementado com Ácido Fólico apresentou diminuição significativa
no parâmetro de passar por cima quando comparado com o grupo LPS + Salina e
em ambos os parâmetros o grupo LPS + Ômega-3 apresentou uma tendência à
diminuição, porém não significativa (Gráfico 2B). Estes dados permitem sugerir que a
suplementação foi capaz de reverter os danos na memória de reconhecimento social
causados pela exposição pré-natal ao LPS.
Gráfico 2 – Frequência de seguir (Figura 1A) e de passar por cima (Figura 1B) do teste de
memória social dos grupos: Sal + Sal, Sal + Risperidona, Sal + Ômega-3, Sal + Ácido fólico,
LPS + Sal, LPS + Risperidona, LPS + Ômega-3, LPS + Ácido fólico. * dados significativos
quando comparados com o grupo LPS + Sal.

A suplementação tem se mostrado eficaz para a prevenção ou melhora dos
sintomas de doenças neurodegenerativas que estão associadas ao estresse oxidativo
e à neuroinflamação por desempenharem um papel importante no desenvolvimento
cognitivo normal (PANDAREESH et al., 2018).
Segundo os resultados dos testes, a suplementação com ácido fólico foi mais
expressiva e, de acordo com a literatura, está intimamente relacionada com a diminuição
de defeitos congênitos relacionados ao tubo neural e pode auxiliar na diminuição do
surgimento de desordens neurobiológicas do desenvolvimento (GAO et al., 2016).
Além disso, Santos & Pereira (2007) sugerem que a suplementação pós-natal deste
nutracêutico pode reduzir as manifestações clínicas de indivíduos já afetados por
doenças neurológicas, corroborando, assim, com os dados deste trabalho.
Considerando os dados encontrados neste estudo, sugerimos que uma
intervenção nutricional com diferentes nutracêuticos, como o ômega-3 e ácido fólico,
pode vir a ser uma alternativa terapêutica eficaz na diminuição das manifestações
clínicas encontradas no TEA, sendo capaz de melhorar a capacidade antioxidante
e atenuar o estimulo pró-inflamatório com diminuição tanto do processo inflamatório
quanto do dano decorrente deste. O reconhecimento dos benefícios dos nutracêuticos
no TEA pode mudar a forma como a doença é conceituada e as futuras decisões
acerca do arsenal terapêutico, impactando positivamente na qualidade de vida dos
pacientes autistas, familiares e cuidadores.
4 | CONCLUSÕES
A suplementação com nutracêuticos, em especial a com ácido fólico, foi capaz

de atenuar os parâmetros comportamentais característicos do TEA. Acredita-se que
tais fatos tenham sido decorrentes das ações neuroprotetoras destas substâncias
e que estes nutracêuticos possam vir a ser utilizados como possíveis alternativas à
utilização dos fármacos convencionais. Contudo, é necessário que sejam realizados
mais estudos para verificar a efetividade destas substâncias em estudos clínicos.
O conhecimento dos efeitos positivos destes nutracêuticos para pacientes autistas
traz benefícios não só para os sujeitos afetados, como também para a família e os
profissionais envolvidos com o tratamento destes.
5 | FOMENTO
O trabalho teve a concessão de Bolsa pelo Programa Institucional de Bolsas de

Iniciação Científica (PIBIC) do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).

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CAPÍTULO 22
USO DO EXTRATO DE Ganoderma lucidum NO

CONTROLE DA MANCHA FOLIAR EM PLANTAS DE
CEVADA PROTEGENDO O MEIO AMBIENTE
Ricardo Zanirato da Costa Fernandes foi realizar extração de Gan., quantificar e,

Graduado em Biomedicina, Diretoria da Saúde, verificar a ação na planta de cevada no controle
UNINOVE, São Paulo. da mancha foliar causada pelo fungo Bipolaris
Lorena de Cássia Barboza Pires sorokiniana. O extrato foi obtido por extração
C, Curso Biomedicina; Diretoria da Saúde, aquosa e alcoólica sendo usada a mistura
UNINOVE, São Paulo.
do extrato aquoso e 20% de extrato alcoólico
Jessica Pojato da Silva perfazendo a solução hidroalcoólica. Este extrato
C, Curso Biomedicina; Diretoria da Saúde,
foi avaliado quanto a concentração presente de
proteínas, fenóis e beta-glucana. Para indução
Joseanne Meira Cambuí de resistência foram utilizadas plantas de cevada
C, Curso Biomedicina; Diretoria da Saúde,
variedade Elis e aspergidas ou com água,
extrato e suspensão de conídios de Bipolaris
Edgar Matias Bach Hi
sorokiniana (Bs). Os resultados demonstraram
UNILUS (Universidade Lusiadas), Núcleo
Acadêmico de Bioquímica Experimental (NABEX), que extrato de cogumelo apresentou proteína,
Santos, São Paulo fenol e beta glucana. As plantas submetidas
ao tratamento com extrato e inoculação com
Prof. Depto. Saúde, UNINOVE, São Paulo. fungo apresentou 65, 68 e 70% de proteção
email:ernabach@gmail.com respectivamente para o intervalo de tempo de
Erna Elisabeth Bach 24, 48 e 72h. As plantas de cevada com maior
Prof. Depto. Saúde, UNINOVE, São Paulo. proteção apresentaram maior quantidade de
email:ernabach@gmail.com proteínas e menor de fenóis quando comparado
com plantas infectadas, demonstrando efeito
indutor na planta de cevada. O metabolismo na
planta pode ter a beta glucana e fenóis como
RESUMO: Ganoderma lucidum é cogumelo
importantes na defesa. Assim, o extrato de Gan
conhecido popularmente como Reishi pelos
pode ser usado como indutor de resistência na
japoneses e tem sido empregado principalmente
planta de cevada controlando a doença causada
como agente antitumoral, imuno-restaurador,
por Bs além de proteger o meio ambiente não
hipotensivo e hipoglicêmico. No Brasil alguns
usando fungicida.
produtores de cogumelo estão iniciando o
PALAVRAS-CHAVES: Ganoderma, indução de
desenvolvimento de isolados de Ganoderma
resistência, cevada.
lucidum (Gan). O objetivo do presente trabalho
ABSTRACT: Ganoderma lucidum is a mushroom popularly known as Reishi by the
Japanese and has been used mainly as an antitumor, immuno-restorative., hypotensive
and hypoglycemic agent. In Brazil, some mushroom producers are beginning to develop
Ganoderma lucidum (Gan) isolates. The objective of the present work was to extract
Gan, quantify and verify the action in the barley plant in the control of the leaf spot caused
by the fungus Bipolaris sorokiniana. The extract was obtained by aqueous and alcoholic
extraction and the mixture of the aqueous extract and 20% of the alcoholic extract was
used, making up the hydroalcoholic solution. This extract was evaluated for the present
concentration of proteins, phenols and beta-glucan. To induce resistance were used
Elis barley plants and sprinkled with water, extract or suspension of conidia of Bipolaris
sorokiniana (Bs).The results showed that mushroom extract presented protein, phenol
and beta glucan. The plants submitted to the treatment with extract and inoculation with
fungus showed 65, 68 and 70% protection respectively for the time interval of 24, 48
and 72h. Barley plants with higher protection presented higher amounts of proteins and
lower phenols when compared to infected plants, demonstrating an inductive effect
on the barley plant. The metabolism in the plant may have beta glucan and phenols
as important agents in defense. Thus, the Gan extract can be used as a resistance
inducer in the barley plant by controlling the disease caused by Bs besides protecting
the environment by not using fungicide.
KEYWORDS: Ganoderma, resistance induction, barley.
1 | INTRODUÇÃO
A cevada é um cereal de inverno, utilizado na industrialização de bebidas,

farinhas, medicamentos, produtos dietéticos e sucedâneos de café. Ainda, é
empregada na alimentação animal como forragem e na fabricação de rações. No Brasil,
a malteação tem sido a principal aplicação econômica da cevada, com o consumo
anual pela indústria cervejeira estimada em um milhão de toneladas. A produção está
concentrada na Região Sul, com registros de cultivo também nos estados de GO e
MG (EMBRAPA, 2018). Aproximadamente, 75% da cevada produzida é utilizada em
processamento industrial (na fabricação de malte), 7% é reservada para semente e os
18% restantes na elaboração de rações, por não atingir padrão de qualidade cervejeira.
Aproximadamente 95% do malte é destinado para fins cervejeiros (EMBRAPA on line,
2012).
As sementes de cevada, frequentemente, encontram-se infectadas por fungos
patogênicos, entre eles Drechslera teres e Bipolaris sorokiniana. Para evitar a
introdução de organismos patogênicos, principalmente em áreas onde se pratica a
rotação de culturas, indica-se o tratamento de sementes com fungicidas. A eficácia
dos fungicidas indicados para o tratamento de sementes depende, fundamentalmente,
da uniformidade de distribuição dos produtos sobre elas (EMBRAPA, 2018).
Em decorrência de condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento de
fungos e à suscetibilidade do material em cultivo, a lavoura de cevada pode ter seu

rendimento severamente prejudicado pelo ataque de doenças fúngicas da parte aérea
(EMBRAPA, 2018). Para impedir que estas perdas ocorram, utilizam-se fungicidas no
controle dos fitopatógenos, podendo afetar o meio ambiente e a saúde do homem,
surgindo assim, a necessidade da utilização de substâncias naturais que possam
controlar os fitopatógenos impedindo o desenvolvimento das doenças na cevada sem
oferecer riscos ao meio ambiente e ao homem. A mancha foliar causada pelo fungo
Bipolaris sorokiniana é considerada a principal doença da cevada.
Assim, uma forma alternativa de controle de doenças em plantas é pelo uso de
indutores de resistência. A indução da resistência consiste no aumento da capacidade
de defesa da planta contra amplo espectro de organismos fitopatogênicos, incluindo
fungos, bactérias e vírus. A atuação dos indutores de resistência não se dá pela
eliminação do patógeno, e sim pela ativação da resistência latente da planta, fazendo
com que a entrada ou posterior atividade do patógeno em seus tecidos seja evitada
ou atrasada. Existem vários mecanismos de defesa relacionados com a indução de
resistência, sendo um deles o pós-formado após tratamento com algum produto natural
e formando na planta uma barreira bioquímica, que são substâncias que podem ser
tóxicas ao patógeno ou que criam condições que desfavorecem seu desenvolvimento
no interior da planta.
A exploração da atividade biológica de compostos secundários presentes em
extratos obtidos de cogumelos naturais, pode constituir, uma forma efetiva de controle
de doenças em plantas cultivadas. Baseando-se neste princípio, este trabalho teve
como objetivo avaliar o efeito curativo e preventivo do extrato de Ganoderma lucidum
no controle da mancha foliar em plantas de cevada
Ganoderma lucidum é conhecido popularmente como Reishi pelos japoneses
e, LINGZHI (planta do espírito) pelos chineses. Na China chegou a ser usado como
um remédio milagroso para diversas doenças, mesmo que em alguns casos a
reivindicação terapêutica fosse exagerada, no entanto atualmente estudos científicos
têm comprovado as suas propriedades terapêuticas eficazes (JIN et al, 2012;
WACHTEL-GALORET al, 2011). Este cogumelo tem sido empregado principalmente
como agente antitumoral, imunorestaurador, hipotensivo e hipoglicemiante (LI et al,
2012; MIZUNO et al., 1995). É utilizado também no tratamento de várias doenças
como hepatite, bronquite, hipercolesterolemia e câncer (LIN et al, 2003).
No Brasil alguns produtores de cogumelo estão iniciando o desenvolvimento
de isolados de Ganoderma lucidum (BACH, 2010) e, segundo WADT et al. (2015),
estes isolados desenvolvidos aqui no Brasil possuem proteína, fenol, peroxidase e
polifenoloxidase, acoplado de taninos, flavonoides, terpenos, anel lactona e açúcares
(beta glucanas).
Segundo CASTRO e BACH (2004) e BACH (2003), é possível usar o polissacarídeo
de goma xantana, o qual apresenta beta-glucanas, na indução de resistência em
plantas de trigo e cevada, para controlar a doença de mancha foliar.
O objetivo do presente trabalho foi realizar extração de compostos de Ganoderma
lucidum, quantificar e, verificar a ação na planta de cevada no controle da mancha
foliar causada pelo fungo Bipolaris sorokiniana.
2.1 Extração e análises do cogumelo
Corpos de frutificação seco do cogumelo foi oriundo da Firma Vitalli sendo triturado
em moinho de bola equipado com filtro de inox de 1mm mesh. O pó foi estocado em
ambiente seco até o uso. O pó foi submetido a dois métodos de extração sendo: 1)
Extrato aquoso: 30 gramas de pó foram homogeneizados em 100mL de água à 70°C
por uma hora e então a mistura foi filtrada em papel Whatmann n°1 e armazenada
até o uso. 2) Extrato alcoólico: 30 gramas de pó foram submetidos a um processo de
percolação com 50mL de etanol em concentração 70% por uma semana e a solução
foi armazenada até o uso. A solução para uso foi preparada pela mistura do extrato 1
com 20% do extrato 2, formando um extrato hidroalcoólico.
Foi realizada a quantificação de proteínas (LOWRY et al., 1951), fenóis (SWAIN
& HILLIS, 1959) e beta glucana Lever method (LEVER, 1972).
Compostos fenólicos foram separados no equipamento HPLC (Young Lin YL
9300) equipado com bomba quaternária, detector UV-vis e forno de coluna (YL9330).
A coluna usada foi a Kinetex C18 (4.6mm×250mm i.d., 5um). O comprimento de
onda usado foi 254nm. Eluição foi realizada a 1,0mL/min a 35C. A fase A consiste em
metanol e fase B foi 0,1% de ácido acético em água. O volume injetado foi de 20uL. Os
compostos usados como padrão foram adquiridos da Sigma (ácidos cumárico, ferúlico,
cafeico, rutina,quercetina, kaempferol) e dissolvidos em solvente grau HPLC (metanol).
Para identificação foi usado o tempo de retenção e áreas dos picos correlacionados
com concentração pelo software Clarity.
2.2 Plantas
Para a preparação das plantas foram semeadas dez sementes da cultivar

(Embrapa 195) em vasos contendo terra vegetal adubada e, mantidas em casa-de-
vegetação à temperatura ambiente até o estágio 5 da escala de Feekes-large (LARGE,
1954).
Grupos de dez plantas foram usadas nos testes biológicos para cada tratamento,
em 3 repetições. Em todos os tratamentos foram aspergidos cerca de 10mL da
suspensão de conídios ou, solução do extrato ganoderma ou ainda, água. Os
tratamentos foram: Grupo a)sadia (plantas aspergidas com água); Grupo b) tratadas
com indutor (plantas aspergidas com extrato); Grupo c) inoculadas com os patógenos
(plantas aspergidas com suspensões dos isolados); Grupo d) tratadas com indutor
e após 24 h inoculadas com suspensão de conídios; Grupo e) idem ao grupo d,

entretanto, após 48 horas; Grupo f) idem ao grupo d, entretanto, após 72 horas.
As plantas dos grupos d, e, f, foram inicialmente aspergidas com indutor sendo
que após 24, 48 e, 72 horas, sob condições de temperatura ambiente e fotoperíodo
de 12 horas (luz fluorescente 7,35 W m-2), as folhas foram inoculadas, por aspersão,
com as suspensões de conídios dos isolados.
Durante as primeiras 24 horas após a inoculação do patógeno, as plantas
foram mantidas em câmara úmida (100% UR), temperatura ambiente e, escuro. Em
seguida, o material foi transferido para casa-de-vegetação e mantido sob condições
de temperatura e luminosidade ambiente.
A proteção das plantas foi avaliada 4 dias após a inoculação do patógeno de
acordo com BACH et al. (2003) e CASTRO & BACH (2004). As folhas de cevada
foram coletadas para a contagem do número de folhas com lesões e calculada a
porcentagem de proteção.
Para as análises bioquímicas, 1g das folhas de cada tratamento foi triturada em
5mL de tampão fosfato 0,05mol/L pH=7,0 sendo depois filtrado e armazenado em
freezer até realização dos experimentos. Os extratos foram submetidos à quantificação
de proteínas através do método de Lowry, em equivalentes de SAB (Soro Albumina
Bovina) (LOWRY, 1951) e, quantificação de fenóis baseado no método de SWAIN &
HILLIS (1959), em equivalentes de ácido clorogênico.
2.3 Análise Estatística
Os dados foram avaliados pela média ± desvio padrão e avaliado por análise
de variância One-Way ANOVA sendo considerado significante *P <0,05 através do
software Assistat.
O extrato de Ganoderma hidroalcoólico apresentou 0,62mg de proteína, 1,12mg

de fenol, 98,7mg de beta glucana (Tabela 1) resultados estes de acordo com o descrito
por WADT et al (2015).
mg Beta- mg Açúcar Fenóis

Proteínas
Amostra glucana livre alfa/beta (mg ácido
(mg SBA)
(1,3; 1-6) glucan clorogênico)
Ganoderma
98,7a* 38,15a* 0,62a* 1,12a*
Tabela 1: Concentração de beta glucana, açúcar livre, proteínas e fenóis (mg/por 1g do pó)
presente no Ganoderma lucidum
*Média de 5 amostras de fungo. Letra a na colunas indicam que os valores das 5 amostras foram semelhantes.
Test Tukey (ANOVA).
SBA=soro albumina bovina

Compostos fenólicos possuem ação antioxidante e dentro do extrato de cogumelo
foram encontrados fenóis como ácido cumárico, caféico, ferúlico, rutina e quercetina,
podendo ser importantes no mecanismo de defesa da planta de cevada (Tabela 2).
Ácido Ácido Ácido

Extrato rutina quercetina
cumárico caféico ferúlico
Ganoderma 1.46 0.20 18.19 12.21 2.68
Tabela 2: Quantidade de ácido cumárico, caféico, ferúlico, rutina e quercetina em ug/mL

presente no extrato de Ganoderma pela análise no HPLC.
Na Tabela 3, pode-se observar que plantas de cevada tratadas com extrato de

Ganoderma apresentaram indução de resistência em até 70% quando comparado
com plantas infectadas isto porque as plantas infectadas apresentaram todas as
folhas com 100% de lesão. Nas plantas sadias e infectadas, tem-se que plantas sadias
apresentam maior quantidade de proteína e menor de fenol sendo ao contrário em
plantas infectadas quando estas apresentam baixa quantidade de proteína e maior
quantidade de fenol podendo ser pelo ataque do patógeno na planta que apresenta a
reação necrotrófica. Por este motivo, as plantas de cevada da cultivar Elis, quando
inoculadas com o patógeno e denominadas de infectadas, apresentaram a maior
concentração de fenol.
Já nas plantas de cevada, em relação ao tratamento, com o aumento no intervalo
de tempo, apresentou aumento na quantidade de proteínas e diminuição de fenol
como, por exemplo, a planta no intervalo de 72h está com 0,97mg de proteína e a
planta sadia com 0,773 mg de proteína, traduzindo em 70% de proteção em relação
a planta infectada. O mesmo ocorreu com o fenol sendo diminuído com o intervalo de
tempo. Isto vem de acordo com CASTRO & BACH (2004), onde em plantas de cevada
tratadas com elicitor goma xantana observaram que a concentração de proteínas
sempre foi maior. Entretanto, em relação a concentração de fenóis, o valor sempre
diminuiu.
Compostos como beta-glucana e fenóis pode estar envolvido no mecanismo de
proteção das plantas de cevada agindo como antioxidantes e fazendo com que a planta
de cevada reaja com seu mecanismo de defesa impedindo a entrada do patógeno.
Tratamentos % de proteção* proteina mg1 fenol mg1

Sadia (controle água) x 0,773a 0,590a
Controle (extrato) x 0.565a 0.192a
Gan 24h 65,0 b** 0.970a 0.210a

Gan 48h 68,0 b 0.971a 0.186a
Gan 72h 70,0 b 0.976a 0.149a
Infectada O,0 a 0,255b 0,811b

Tabela 3: Porcentagem de proteção em folhas de plantas de cevada variedade Elis, utilizando
extrato hidroalcoólico de ganoderma como indutor, nos diferentes intervalos de tempo.
*Porcentagem de proteção seguidas por letra b, são significativamente diferentes das plantas infectadas, pelo
teste T (P<0,05). Números representam média de um total de 30 folhas/tratamento.
4 | CONCLUSÃO
O extrato hidroalcoólico de Ganoderma, provou ser potente indutor de resistência

não necessitando de uso de fungicida auxiliando assim a não poluição do meio
ambiente e na manutenção da qualidade de vida e alimento para o ser humano.
AGRADECIMENTO
Ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo 474681/2013).
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MIZUNO, T.; WANG, G.; ZHANG, J.; KAWAGISHI, H.; NISHITOBA, T.; LI, J. Reishi, Ganoderma
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(Lingzhi or Reishi). A Medicinal Mushroom. In: Herbal Medicine, 2nd edition, Biomolecular and Clinical
Aspects. Editors: Iris F. F. Benzie and Sissi Wachtel-Galor. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor &
Francis; 2011.

SOBRE OS ORGANIZADORES
NAYARA ARAÚJO CARDOSO Graduada com titulação de Bacharel em Farmácia com

formação generalista pelo Instituto Superior de Teologia Aplicada – INTA. Especialista em
Farmácia Clínica e Cuidados Farmacêuticos pela Escola Superior da Amazônia – ESAMAZ.
Mestre em Biotecnologia pela Universidade Federal do Ceará – Campus Sobral. Membro
do Laboratório de Fisiologia e Neurociência, da Universidade Federal do Ceará – Campus
Sobral, no qual desenvolve pesquisas na área de neurofarmacologia, com ênfase em modelos
animais de depressão, ansiedade e convulsão. Atualmente é Farmacêutica Assistente Técnica
na empresa Farmácia São João, Sobral – Ceará e Farmacêutica Supervisora no Hospital
Regional Norte, Sobral – Ceará.
RENAN RHONALTY ROCHA Graduado com titulação de Bacharel em Farmácia com

formação generalista pelo Instituto Superior de Teologia Aplicada - INTA. Especialista em
Gestão da Assistência Farmacêutica e Gestão de Farmácia Hospitalar pela Universidade
Cândido Mendes. Especialista em Análises Clínicas e Toxicológicas pela Faculdade Farias
Brito. Especialista em Farmácia Clínica e Cuidados Farmacêuticos pela Escola Superior da
Amazônia - ESAMAZ. Especialista em Micropolítica da Gestão e Trabalho em Saúde do Sistema
Único de Saúde pela Universidade Federal Fluminense. Farmacêutico da Farmácia Satélite da
Emergência da Santa Casa de Sobral, possuindo experiência também em Farmácia Satélite
do Centro Cirúrgico. Membro integrante da Comissão de Farmacovigilância da Santa Casa
de Misericórdia de Sobral. Farmacêutico proprietário da Farmácia Unifarma em Morrinhos.
Foi coordenador da assistência farmacêutica de Morrinhos por dois anos. Mestrando em
Biotecnologia pela Universidade Federal do Ceará.
MARIA VITÓRIA LAURINDO Graduada com titulação de Bacharel em Enfermagem pelo

Centro Universitário INTA – UNINTA. Foi bolsista no hospital da Santa Casa de Misericórdia
de Sobral (SCMS) no setor de Quimioterapia, participei do programa de monitoria na disciplina
de Patologia Humana e fui integrante do Projeto de Extensão Humanização Hospitalar. Assim
como, desenvolvi ações em educação e saúde como extensionista para pacientes parturientes
no hospital Santa Casa de Sobral (SCMS).
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Nayara Araújo Cardoso CAPÍTULO

Renan Rhonalty Rocha

As Ciências Biológicas e da Saúde na

As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade 2 Capítulo 2

1. Ciências biológicas. 2. Biologia – Pesquisa – Brasil. 3. Saúde

A obra “As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade” consiste de

Nayara Araújo Cardoso

CAPÍTULO 11........................................................................................................... 103

CAPÍTULO 12........................................................................................................... 116

CAPÍTULO 13........................................................................................................... 127

CAPÍTULO 14........................................................................................................... 143

CAPÍTULO 16........................................................................................................... 155

CAPÍTULO 17........................................................................................................... 171

CAPÍTULO 18........................................................................................................... 177

CAPÍTULO 20........................................................................................................... 211

CAPÍTULO 21........................................................................................................... 224

CAPÍTULO 22 .......................................................................................................... 231

SOBRE OS ORGANIZADORES.............................................................................. 239

A BIOLOGIA SINTÉTICA E ENGENHARIA

Mauricio Schiavo indústria farmacêutica, com a possibilidade de

ABSTRACT: Advances in molecular biology, bioinformatics, systems biology and the

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Nos Estados Unidos, uma iniciativa chamada iGEM (genetically engineered

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Acesso a capital para empreendedorismo em biologia sintética e biotecnologia

No Brasil, a iniciativa privada também tem voltado sua atenção para o

O desenvolvimento da biologia sintética e suas aplicações vem crescendo tanto

As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade 2 Capítulo 1 14

BARRANGOU, R. et al. CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes.

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REGALADO, A. EXCLUSIVE: CHINESE SCIENTISTS ARE CREATING CRISPR BABIES.

As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade 2 Capítulo 1 15

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As Ciências Biológicas e da Saúde na Contemporaneidade 2 Capítulo 1 16

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