25º Curso de Pós Graduação em Hematologia

Prof Fábio de Moura Camara

Diagnóstico Laboratorial das

Diáteses Hemorrágicas
CONTROLE DE QUALIDADE
EM HEMOSTASIA
 CONTROLE DE QUALIDADE

• Coleta
• Processamento
• Estoque
• Controle dos reagentes e equipamentos
• Implantação dos valores normais
 CQ - COLETA

• Jejum de 4 horas
• Medicamentos
• Coleta sem intercorrência
• Garrote
• Agulhas
• Tubos
• Anticoagulante - Citrato de sódio 3.8%
- EDTA
CQ - COLETA

• Anticoagulante - Citrato de sódio 3.8%/3.2%

Proporção 1V : 9V sangue
Hematocritos <20% e >55% reajuste Anticoag

C = 1.85 x 10-3 (100-Hto) x V

C = volume do anticoagulante
V = volume de sangue
 CQ - COLETA

Cateter de longa permanência

Contaminação com heparina - TT e TTPA

Retirada da heparina - heparinase ou coluna de ecteola celulose

CQ - PROCESSAMENTO

• Centrifugação
- Plasma Rico em Plaquetas (200g - 6 min)
- Plasma Pobre em Plaquetas (1800 g - 15 min)
• Tempo entre a coleta e o teste 4 horas - Coag/Fibr
2 horas - Plaq
• Aspecto da amostra
*Lipemia, hemólise, ictérico
CQ - ESTOQUE

• Congelamento rápido
- Nitrogênio líquido
- Gelo seco + alcool
- -200C ou -800C
• Descongelamento rápido
- 370C
CQ - REAGENTES E EQUIPAMENTOS

• Coagulômetros
• Agregometros
• Microscópios
• Banho-maria
• Pipetas
• Reagentes
• Vidraria
CQ - CONTROLES E NORMAIS

• Controles comerciais
• Controles internos (Pool de plasmas normais)
Pool de plasmas normais = 20 doadores N

• Valor Normal = 30 doadores N sem drogas

(15 homens e 15 mulheres)

Média  2 SD
TESTES DE HEMOSTASIA
 MÉTODOS EM COAGULAÇÃO

A maioria dos testes são comparativos

• Funcionais - Coagulação
- Cromogênicos
• Quantitativos - Imunológicos
- Imunodifusão radial
- Eletroimunodifusão
- ELISA
MÉTODO FUNCIONAL

• Coagulômetros automatizados
- Aumentam a precisão
- Reduzem a influência do operador
Métodos
- Turbidimétrico
Lipemia, icterícia
- Nefelométrico (luz emitida)
- Mecânico (barras magnéticas)
HEMOSTASIA PRIMÁRIA

• Contagem de plaquetas (manual/equipamento)

• Tempo de sangramento (TS)

- Duke (lóbulo da orelha)
- Ivy (3 incisões)
- Ivy modificado (1 incisão)

• Agregação plaquetária
 COAGULOGRAMA
Tempo de Sangramento
Contagem de Plaquetas
Tempo de Protrombina
Tempo Parcial de Tromboplastina ativado
Dosagem de Fibrinogênio
Duke
 Ivy (Simplate)

Local da incisão 40 mmHg Incisão

1ª bolha Cronometrar Fim do teste

Ivy (Lanceta)
 Desvantagem

Invasivo
Pouco reprodutivo
Dependente de operador
Baixa sensibilidade à disfunção leve
Pouca correlação com tendência ao sangramento
TEMPO DE SANGRAMENTO

Método de Duke
(1 - 3 min)

Método de Ivy
(Lanceta: até 5 min;
Simplate: até 9 min)
 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Encurtado: Não há significado clínico

Prolongado: Def. quantitativa ou qualitativa de plaquetas

Def. congênita dos Fatores I e V
Estados Fibrinolíticos
Estados urêmicos
Uso excessivo de certos medicamentos como AAS
Tempo de Protrombina
Tromboplastina

X VIIa VII

Xa V

II IIa

Fibrinogênio Fibrina
RESULTADOS

Tempo em segundos

Razão (<1,20)

INR
INR = ( Relação P/C) ISI
 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Encurtado: Barbitúricos
Digitálicos
Vitamina K
Anticoncepcionais orais
Prolongado: Def. congênita dos Fatores da via extrínseca e
comum (II, V, VII, X)
Fibrinogênio <100mg/dL
Afecções hepáticas
Heparina e anticoagulantes orais
Deficiência de vitamina K
 Tempo Parcial de Tromboplastina ativado
XII
Ativador
XI
XIIa IX
XIa
IXa X
VIII
Xa
Tromboplastina
V parcial

II IIa

Fibrinogênio Fibrina
RESULTADOS

Tempo em segundos

Razão (<1,30)
 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Encurtado: Não há significado clínico

Prolongado: Def. congênita dos Fatores da via intrínseca e

comum (II, V, VIII , IX, X, XI e XII)
Fibrinogênio <100mg/dL
Heparina e anticoagulantes orais
Deficiência de vitamina K
 FIBRINOGÊNIO
Método de Claus
ALGORÍTMOS
DIAGNÓSTICOS
 Tempo de Sangramento
Prolongado

Contagem de
Plaquetas

Anormal Normal

Trombocitopenia
FvW
Trombocitose
Normal Anormal

Agregação Plaquetária Doença de von

Willebrand
ADP, EPI, COL, Risto, AA
 PT Prolongado

PTTa

Anormal Normal

Dosar Dosar
F II, F V, F X F VII
Normal Anormal

TT Def. Fator Def. F VII

Anormal
Normal
Heparina
Disfibrinogenemia Inibidor Lúpico
Hipofibrinogenemia
 PTTa Prolongado

PT TT
Anormal Normal Normal Anormal

Dosar Pesquisa de Heparina

FII, FV, FX Anticoagulante Disfibrinog.
Circulante Hipofibrinog.
Negativo Positivo

Dosar História de
Sangramento
FVIII, FIX, FXI, FXII
Anormal Positivo Negativo
Dosar Fatores Inibidor Lúpico
Deficiência do Fator
 TT Prolongado

Tempo de Reptilase

Anormal Normal
Heparina
Dosar
Fibrinogênio

Normal Anormal
Disfibrinogenemia Hipofibrinogenemia
Inibidor da formação
da Fibrina
TROMBOELESTOGRAFIA

Tromboelastometria rotativa (ROTEM-

Tromboelastometria rotativa) é um teste de
coagulação usado para avaliar as
propriedades viscoelásticas de coágulos
formados em todos os estágios da
coagulação, como iniciação, amplificação,
propagação e estabilidade do coágulo.
Representado pela fibrinólise.
 TROMBOELESTOGRAFIA
Início da formação
60 do coágulo em
função da Trombina Amplitude
40 Máxima
20
Dinâmica
20 da
Máxima
formação Lise Máxima do
40 interação entre
Cascata da do coágulo Coágulo
o Fibrinogênio e
coagulação a Plaqueta
60
 DETERMINAÇÃO DE FATORES
Reagentes
• Plasma deficiente do fator
• Plasma do paciente em duas ou mais diluições
• Reagente de TP/TTPA/TT
Curva referência
Pool de plasma N/Padrão comercial
Diluições: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80......
(100%) ( 50% ) ( 25% ) (12.5%)
 DETERMINAÇÃO DOS FATORES

CURVA REFERÊNCIA
TEMPO DE
COAGULAÇÃO
EM SEG

6.25 12.5 25 50 100 %

 DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL DE
DOENÇAS HEMORRÁGICAS
 DOENÇAS HEMORRÁGICAS

• Anammese - história familiar

- exame clínico

• Exames laboratoriais
 DOENÇAS HEMORRÁGICAS
• Localização

- Sangramentos multifocais - investigação

- Sangramentos localizados

- locais não sujeitos a traumas

- intensidade ou duração desproporcionais ao trauma
- recidivantes e diferentes episódios em diferentes locais
• Sangramentos - geralmente de causas adquiridas
 DOENÇAS HEMORRÁGICAS

Sangramento imediato (mucoso cutâneo)

• Púrpuras vasculares (Schonlein)
plaquetárias -Trombocitopenica imunológica
- S. Bernard Soulier
-T de Glanzmann
-Doença de Grânulos/outras
Sangramento tardio (articulações, musculares, etc)
• Deficiências plasmáticas - VIII:C; IX; XI
PLAQUETOPATIAS
 TESTE DE FUNÇÃO PLAQUETÁRIA
Testes globais: Tempo de Sangramento
FPA®100
Testes de Agregação Plaquetária : Transmissão de luz
Impedância
Lumigregometria
Citometria de Fluxo: Glicoproteínas plaquetárias (IIb-IIIa, Ib)
Atividade Pró-coagulante
VASP (fosfoproteína estimulada por vasodilatador)
Marcadores de ativação plaquetária no plasma: 2TG
PF4
PLAQUETOPATIAS

• NÚMERO DE PLAQUETAS (N/D)

• TEMPO DE SANGRAMENTO ( A /N )

• AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA (Ausente/hipoagregante)

TS - PROLONGADO

• Plaquetas abaixo de 100.000/mm3

• Trombastenia de Glanzmann
• Síndrome de Bernard Soulier
• Doença de estoque
• Doença de von Willebrand
• Uremias
• Ingestão de drogas(AAS)
 PFA100

Boa Sensibilidade para DvW e baixa sensibilidade plaquetopatias

AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA

Avalia a função plaquetária na presença de diferentes agonistas

• Métodos
Óptico (PRP)
Impedância (PRP e Sangue total)
 AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Agentes agonistas utilizados

ADP (3.75 uM e 0.75 uM)

ADRENALINA (50 uM e 5 uM)
ÁCIDO ARAQUIDÔNICO (15 mM e 0.25 mM)
COLÁGENO (1.5 ; 0.9; 0.6; 0.3 ug/ml)
RISTOCETINA
PLASMA BOVINO (15 ul)
 AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA/SISTEMA
ÓPTICO
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

FONTE LUZ
FOTOCÉLULA
 AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Defeito de primeira onda de agregação
(ADP, ADRENALINA, AA, COLÁGENO)
Fibrinogênio (afibrinogenemia, disfibrinogenemia,
hipofibrinogenemia)
Receptores específicos
Receptores IIb-IIIa (trombastenia de glanzmann)
Hipergamaglobulinemia
Drogas (Ticlopidina; Penicilina e derivados)
 INTERFERENTES
ANTIMICROBIANOS;
• Penicilinas
• Cefalosporinas
• Nitrofurantoína
• Anfotericina
• Hidrocloroquina

AGENTES CARDIOVASCULARES
•  Bloqueadores
• Vasodilatadores
• Diuréticos
• Bloqueadores de canal de Cálcio

ALIMENTOS E TEMPEROS
• Café
• Gengibre
• Alho
• Álcool
• Vitaminas C e E
• Pó de guaraná
• Cravo-da-índia
Repouso

Pseudopodes
1ª Onda:
Receptor específico
GP IIb-IIIa 2ª Onda:
Transdução do sinal Metabolismo AA
Liberação do conteúdo do
grânulos
Agregação Normal
DvW ou Bernard Soulier ?
Trombastenia de Glanzmann
Aspirina Like
 AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Defeito na segunda onda de agregação
Reação de Liberação
-Hereditárias (cicloxigenase; tromboxano
sintetase)
- Adquiridas (AAS, antinflamatórios não esteroidais,
uremia, mieloproliferação)

Doenças de estoque
- Grânulos alfa, denso, lisossomal
 PLAQUETOPATIAS
DOENÇA ADP ADR AA COL RISTO PB

T. de Glanzmann A A A A N N

S. Bernard Soulier N N N D D/A D/A

D.von Willebrand N N N N D N
Doença de Estoque H H N H N N
Drogas (AAS) H H A H N N

Def. Ciclox./Tromb. H H H H N N
DEFICIÊNCIAS PLASMÁTICAS
HEMOFILIAS
A B
 HEMOFILIAS

• Hemofilia A relacionada com FVIII:C( 1/5000 masc )

• Hemofilia B relacionada com FIX (1/3 a 1/5 Hemof A)

• Classificação
- Severa (<1%)
- Moderada (1-5%)
- Leve (> 5%)
 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS HEMOFILIAS

• Coagulograma
• Determinação do Fator VIII:C/IX
• Atividade do cofator de ristocetina
• Pesquisa de inibidor
• Quantificação de inibidor
DETERMINAÇÃO DOS FATORES VIII:C e
IX

Métodos

Um estágio(plasma deficiente em FVIII:C/IX)

Colorimétrico (Substrato cromogênico)

 FATOR VIII:C / IX MÉTODO DE UM ESTÁGIO

• TTPA + Plasma deficiente em fator VIII:C/IX

• Tempo de coagulação inversamente proporcional à
atividade coagulante do fator
PROCEDIMENTO
Curva referência com pool de plasmas normais
1/5 ; 1/10 ; 1/20 ; 1/40 ; até 1/640
100%; 50% ; 25% ; 12.5% até 0.78%

Plasma teste diluído 1/5 e 1/10

 FATOR VIII:C / IX
MÉTODO DE UM ESTÁGIO

SEG

0.78 1 2 3 25 50 100

VN : 50 - 150% ATIVIDADE (%)

Interferentes : Coleta; Estoque; Anticoagulante Lúpico

 PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS

Pesquisa Qualitativa
TTPA Prolongado
TTPA (paciente e pool normal) após 2 horas a 370C

Resultado:
Corrigiu Falta de fator

Não corrigiu Presença de inibidor

 PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS

Quantificação de inibidor em Unidades Bethesda

Princípio
Uma unidade Bethesda inibe 50% da atividade de uma unidade de fator
VIII:C ou IX

Quantificação : Mistura do plasma do paciente e pool N por 2 horas e

posteriormente é realizada a determinação da atividade residual do fator
VIII:C ou IX
 PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
Procedimento (UB)

Diluição do plasma do paciente 1:2; 1:4; 1:8.....em tampão

Pool N diluído = 1V + 1V tampão

Plasma do paciente 1V + 1V Pool N
Plasma do paciente 1:2 (1V) + 1V Pool N 2 horas 370C
Plasma do paciente 1:4 (1V) + 1V Pool N
Plasma do paciente 1:8 (1V) + 1V Pool N
 PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
Procedimento (UB)

Após a incubação, diluir todas as misturas 1/5

para determinação do fator VIII:C/IX

Cálculo da atividade do fator residual:

Atividade do fator (paciente) x 100

Atividade do fator do Pool N diluído
 PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
CÁLCULOS UB

A atividade residual do fator é convertida em UB

utilizando-se a tabela de conversão

Considera-se a diluição do plasma do paciente que

apresenta valor residual igual ou acima de 25%

A UB é calculada multiplicando-se a diluição do plasma do

paciente utilizada para a determinação do fator residual
INIBIDOR VIII:C/IX

Misturas VIII:C/IX residual

1/2 Pac + Pool N 12%
1/4 Pac + Pool N 20%
1/8 Pac + Pool N 25%

Na tabela 25% de VIII:C/IX res = 2 UB

1/8 foi a diluição 8 x 2UB = 16 UB

Um Hemofílico apresentou sua dosagem inicial de Fator VIII de 2,3%. Ao realizar a Pesquisa de Inibidor o
resultado foi POSITIVO. A dosagem encontra-se abaixo:
Pool + Tampão: 45 %de FVIII
Paciente+Pool: 10%
Paciente/2 + Pool: 10%
Paciente/4 + Pool: 15%
Paciente/8 + Pool: 35%

Tabela:
UBe FVIIIr%
1. 50
2 25
4 12,5
DOENÇA DE VON
WILLEBRAND
 Doença de von Willebrand

•Doença hemorrágica hereditária mais comum

(0,8 – 2%)

•Padrão de transmissão autossômico

•Redução ou alteração funcional do FVW

 Funções do fator von Willebrand

•Adesão plaquetária

•Ligação ao FVIII:C
DOENÇA DE VON WILLEBRAND/CLASSIFICAÇÃO

• Deficiência quantitativa
• Deficiência qualitativa

• Deficiência quantitativa
- Tipo I: def. parcial do fator vW
- Tipo III ; def. completa do fator vW
 DOENÇA DE VON
WILLEBRAND/CLASSIFICAÇÃO

• Deficiência qualitativa
- 2A: redução da função dependente de plaquetas, associada à
ausência dos multímeros de alto peso molecular
- 2B: maior afinidade pela GPIb
- 2M: redução da função dependente de plaquetas não devido a
ausência de APM
- 2N: menor afinidade pelo fVIII:C
 DOENÇA DE VON WILLEBRAND
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
DIAGNÓSTICO
SUBTIPO
TS
padrão multimérico
TTPA
FVW:VIIIB
FVIII:C FVW intra-plaquetário
FVW:Ag RIPA
FVW:RCo
 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA DE
VON WILLEBRAND
Determinação de fator von Willebrand:Ag

Métodos Imunológicos
- Imunoeletrodifusão (número de moléculas)

- ELISA (número de sítios antigênicos)

 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA
DE VON WILLEBRAND

Determinação de fator von Willebrand:Ag (+)

IMUNOELETRODIFUSÃO (agarose 1%)

100 50 25 12.5 1 2 3 4 5 6 7 8 (-)

 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA DE
VON WILLEBRAND

DETERMINAÇÃO DO FVW:Ag POR (ELISA)

Anticorpo capturante anti-von Willebrand

Anticorpo anti-von Willebrand ligado à Peroxidase
Substrato específico (OPD)
A intensidade da cor é diretamente proporcional à
concentração do antígeno
 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA DE
VON WILLEBRAND
Padrão Multimérico do Fator von Willebrand

Eletroforese em gel de agarose

Transferência em papel de nitrocelulose
Reação com Ac anti-von Willebrand
Reação com Ac secundário - Peroxidase
Revelação com Luminol
 DEFICIÊNCIA DO FATOR XIII

Prova de solubilidade da uréia 5M

Princípio
Polímero de fibrina é estabilizado por ação do XIIIa formando
ligações covalentes. Na ausência de XIIIa formam-se ligações fracas
que na presença de uréia , as ligações de desfazem
Sensibilidade: 2 - 3%
Manifestação hemorrágica : < 3%
Não detecta deficiências moderadas
 Paciente de 7 anos, apresentou equimoses, hematomas de psoas que não
permitia mais deambular, após uma partida de futebol, de acordo com
relatos da mãe. Preocupada, a mãe procurou um clínico que solicitou um
estudo da coagulação. A mãe do paciente nega história prévia
sangramento ou uso de medicamentos. Os resultados encontrados no
screening foram:

Tempo de Sangramento Ivy: 4 min (até 5 min)

Tempo de Protrombina: Cont 12s Pac 12s (R P/C <1,20)
Tempo parcial de Tromboplastina ativada: Cont: 21s Pac 75s (R P/C
<1,30)
Fibrinogênio: 320 mg/dl ( 200 – 400 mg/dl)

De acordo com os resultados, estabeleça um algoritmo de diagnóstico

COAGULAÇÃO
INTRAVASCULAR
DISSEMINADA:
DIAGNÓSTICO CLÍNICO E
LABORATORIAL
 COAGULAÇÃO INTRAVASCULAR DISSEMINADA
(CIVD)

• Resposta inflamatória generalizada ou localizada

maciça, com liberação de proteases, citoquinas e
hormônios, causando lesão extensa do endotélio
microvascular.
• Vasodilatação, perda da união entre as células
endoteliais, com extravasamento capilar e choque
• Perda do controle regulatório, ativação da coagulação
e geração excessiva de trombina, com formação de
microtrombos, isquemia e disfunção de múltiplos
órgãos.
• Consumo e exaustão de plaquetas e fatores da
coagulação levando a manifestações hemorrágicas.
 Sepsis e CIVD

• causa mais freqüente de CIVD

• bactérias, vírus, parasitas, fungo

• incidência: 30-50%

• mecanismo:
endotoxinas ou exotoxinas  citocinas  ativação da coagulação
 CIVD / Clínica

• CIVD crônica:
. estímulo fraco ou intermitente
. equimose de extremidade
. epistaxe ou sangramento mucoso recurrente
. tromboflebite / evidência de vaso-oclusão
. manifestações hemorrágicas após procedimento invasivo ou progressão
da doença de base
. ocorre geralmente em associação com feto morto retido, hemangioma
gigante, neoplasia, aneurisma,
entre outros
 CIVD / Clínica

• CIVD aguda:
. principal manifestação: sangramento
. hemorragia grave, de instalação abrupta, sinais de
hipoperfusão
. evidência de disfunção orgânica
. equimose generalizada, petéquias, sangramento dos locais de
punção venosa e catéter
. gengivorragia, sangramento TGI, TGU e pulmonar
. hemorragia por drenos e traqueostomia
 CIVD / Diagnóstico

• detecção de fibrina solúvel

• medida dos monômeros de fibrina

• marcadores de geração de trombina

• limitações:
- sensibilidade / especificidade limitadas
- não disponíveis na rotina
 CIVD / Diagnóstico

• contagem plaquetária
• prolongamento dos testes de coagulação

•  de fatores da coagulação

•  ATIII

•  PDF, D-dímero