Metodologia Pesq 2013

SETOR DE CIEÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
MB045 – FITOQUIMICA III
Profª. Drª. Tomoe NAKASHIMA
FITOQUÍMICA
METODOLOGIA DE PESQUISA
OBJETIVO: pesquisa dos constituintes químicos em espécies vegetais
1. Sem dados químicos bibliográficos
Análise fitoquímica preliminar – Screening ou Marcha Fitoquímica

Presença de metabólitos secundários
2. Dados químicos presentes na bibliografia
Pesquisa com foco em compostos de interesse - relacionados com certa atividade

biológica
Isolamento
Identificação química
ETAPAS ENVOLVIDAS NA PESQUISA FITOQUIMICA:
• Coleta
• Preparação do material vegetal

Estabilização e secagem;
Moagem
• Extração
Polaridade dos solventes
Extrações à quente e à frio –
Sistemas abertos e fechados
ANÁLISE FITOQUÍMICA PRELIMINAR
Reações de caracterização de metabólitos secundários, tais como: cumarinas,

polifenóis (flavonóides, taninos, antraquinonas), alcalóides, triterpenos e esteróides
(saponinas, glicosídeos cardiotônicos), entre outros
FRACIONAMENTO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS
Partição de solventes;
Métodos cromatográficos;
Métodos espectrométricos
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de próton e carbono
EXTRAÇÃO: retirada, da forma mais seletiva e completa possível, das substâncias ou fração
ativa contida na droga vegetal , por meio de um líquido ou misturas de líquidos adequados
PONTOS RELEVANTES:
características do material vegetal;

grau de divisão;
meio extrator (solvente);
LÍQUIDOS EXTRATORES
Seletividade X Polaridade Otimização da extração
Propriedades extrativas Parâmetros de solubilidade
A ESCOLHA DO SOLVENTE ESTÁ RELACIONADA DIRETAMENTE COM SUAS

PROPRIEDADES EXTRATIVAS, ADEQUAÇÃO TECNOLÓGICA, TOXICIDADE,
CUSTO E DISPONIBILIDADE
ÁGUA – um dos líquidos extratores mais importantes, sendo utilizada na extração de

substâncias hidrofílicas, como aminoácidos, açúcares, alcalóides na forma de sal, saponinas,
flavonóides e mucilagens
MAIORIA DOS CONSTITUINTES APRESENTAM ALGUMA SOLUBILIDADE EM

MISTURAS HIDROALCOÓLICAS, SENDO O USO FREQUENTE
EXTRAÇÃO FRACIONADA
SOLVENTES SUSTÂNCIAS EXTRAÍDAS
Éter de petróleo, Hexano Lipídeos, ceras, pigmentos, furanocumarinas
Tolueno, Diclorometano, Bases livres de alcalóides, antraquinonas livres,
Clorofórmio glicosídeos cardiotônicos
Acetato de etila, N-butanol Flavonóides, cumarinas simples
Misturas hidroalcoólicas Saponinas, taninos
OUTROS FATORES INTERFERENTES:
• pH do líquido extrator
• Agitação,
• Temperatura
• Tempo de extração
MÉTODOS EXTRATIVOS
Segundo a eficiência os métodos extrativos são classificados como operação

extrativa parcial e operação de extração exaustiva
1) MACERAÇÃO
Extração do material, em temperatura ambiente, durante um período prolongado
(horas ou dias), sem renovação do líquido extrator
Variações:
• Digestão – sistema aquecido de 40 – 60ºC;
• Maceração dinâmica – sob agitação mecânica constante;
• Remaceração – repetição do processo com o mesmo material
vegetal, renovando-se o líquido extrator
2) INFUSÃO
Permanência do material vegetal em contato com água fervente, num recipiente
tampado, durante determinado tempo.
Indicado para partes vegetais de estrutura mole, que devem ser rasuradas, cortadas ou
diminuídas de maneira grosseira.
3) DECOCÇÃO
Consiste em manter o material vegetal em contato com um solvente,
geralmente a água, durante certo, tempo sob ebulição.
Uso restrito – alteração das substâncias
Materiais vegetais duros e lenhosos
4) PERCOLAÇÃO
• Extração exaustiva das substâncias ativas, sendo a droga moída colocada em um

percolador, por meio do qual é passado o líquido extrator
• Indicada para extração de substâncias farmacologicamente muito ativas, presentes em

pequenas quantidades
5) EXTRAÇÃO CONTÍNUA EM APARELHO DE SOXHLET

Utilizada, principalmente, para sólidos com solventes voláteis, sendo que em cada
ciclo da operação o material vegetal entra em contato com o solvente renovado.
VANTAGENS:
• Extração eficaz;
• Quantidade reduzida de solvente;
• Sistema fechado
DESVANTAGENs:
• Solvente deve ser volátil;
• Substância alvo não deve ser volátil ou termolábil
6) TURBOLIZAÇÃO
Nesse processo a extração simultânea à redução do tamanho da partícula.
A redução do tamanho do material com o seguinte rompimento das células favorece o
processo de dissolução dos componentes no líquido extrator.
VANTAGENS:
• Reduzido tempo de extração (min);
• Quase esgotamento da droga;
DESVANTAGENS:
• Difícil separação da solução extrativa por filtração;
• Geração de calor = controle de temperatura
• Restrição de líquidos voláteis
7) EXTRAÇÃO SOB REFLUXO

Extração do material vegetal com o líquido extrator em ebulição, acoplado a um
condensador, de maneira que o solvente evaporado volte ao sistema.
Cuidados com temperatura e substâncias termolábeis.
8) EXTRAÇÃO COM ARRASTE DE VAPOR DE ÁGUA - HIDRODESTILAÇÃO

Aparelho de Clevenger
9) EXTRAÇÃO CONTRA-CORRENTE
10) EXTRAÇÃO COM FLUÍDO SUPER CRÍTICO
Acima de certa pressão e temperatura, as substâncias não condensam, existindo como fluido
=> estado crítico
Nestas condições fase líquida e gasosa possuem mesma densidade, não existindo
divisão entre as duas fases
Alguns gases utilizados: Nitrogênio, Propano, Etano, Etileno, entre outros
Ex: CO2
TC =31ºC PC = 74atm
• CO2 não deixa resíduos de solvente;

• Baixa temperatura ;
• Solubilidade adequada = modificando pressão e temperatura;
• Baixo custo do solvente
ANÁLISE FITOQUÍMICA PRELIMINAR
Primeiros roteiros de análise sistemática.

Dois princípios:
• Partição de substâncias entre fases orgânica e aquosa

Realizado em funil de separação – coeficiente de partição
• Formação de sais com diferenças de solubilidade em relação às bases ou ácidos que

lhes deram origem
• Caracterização dos principais metabólitos secundários por reações de precipitação e
/ou coloração
Uso do extrato direto ou com o solvente eliminado
Extrato bruto = mascarar o resultado

MATERIAL VEGETAL SECO, ESTABILIZADO E RASURADO
PESAR
EXTRAÇÃO POR MACERAÇÃO DINÂMICA (BM)
EXTRATOS
CONCENTRAÇÃO EM ROTAEVAPORADOR (1/3 VOL)
EXTRAÇÃO: PARTIÇÃO/LIQUIDO/LÍQUIDO
SOLVENTES DE POLARIDADE CRESCENTE: hexano; diclorometano; acetato de etila e

butanol
BM – EVAPORAÇÃO DO LÍQUIDO EXTRATOR
RESÍDUO ressuspender em EtOH 70 %
• Partição por solventes

Solventes orgânicos, ácido-base
Coeficiente de partição
• Métodos cromatográficos
Cromatografia de partição – dois solventes
Cromatografia de adsorção - CG, HPLC, CCD
Troca iônica
Cromatografia por exclusão ou filtração molecular
• Espectroscopia no UV
Posição dos substituintes no esqueleto da molécula
Ex: UV de flavonóides permitem verificação da presença e substituição dos
grupamentos OH nos anéis – diferenciação entre os vários tipos de flavonóides
• Espectroscopia no IV
Verificação de grupos funcionais e insaturações
Prova de identidade – identificação de fármacos
• Espectro de massas (EM)

MM e padrões de fragmentação da molécula
Presença e posição de grupos funcionais
Fracionamento, isolamento e purificação de substâncias
• RMN de próton e carbono

Caracterização do número e tipos de átomos de H e C, em função da localização e
desdobramentos referentes à absorção eletromagnética
• Atividade óptica e Cristalografia por raios X

Estabelecimento da estereoquímica, centros de assimetria
DADOS DE DIFERENTES TÉCNICAS PERMITEM , EM CONJUNTO, A

ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE UMA SUBSTÂNCIA DESCONHECIDA.
EXEMPLO: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE FITOTERÁPICOS
BIBLIOGRAFIA:
COSTA, A. F. Farmacognosia. 4ª Ed. Vol. I. Lisboa:Fundação Calouste Gulbenkian, 1986.
CUNHA, A. P. Farmacognosia e fitoquimica..Fundação Calouste Gulbenkian, 2005.
DEY, P. M.; HARBORNE, J. B. Plant biochemistry. Academic Press, 1997.
NAKASHIMA, T. Fitoquimica experimental. Apostila prática. Departamento de Farmácia,

UFPR, 1993, 25p.
SIMÕES,C. M. O. et al. Farmacognosia : da planta ao medicamento. 2º Ed. Ed. UFSC,

Porto Alegre, 2000.
YUNES, R. A.; CECHINEL Fº, V. Quimica de produtos naturais, novos fármacos e a

moderna farmacognosia. 2ª Ed.; Ed. UNIVALI, 2009.

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OBJETIVO: pesquisa dos constituintes químicos em espécies vegetais

1. Sem dados químicos bibliográficos

Análise fitoquímica preliminar – Screening ou Marcha Fitoquímica

2. Dados químicos presentes na bibliografia

Pesquisa com foco em compostos de interesse - relacionados com certa atividade

ETAPAS ENVOLVIDAS NA PESQUISA FITOQUIMICA:

• Preparação do material vegetal

ANÁLISE FITOQUÍMICA PRELIMINAR

Reações de caracterização de metabólitos secundários, tais como: cumarinas,

FRACIONAMENTO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de próton e carbono

características do material vegetal;

Seletividade X Polaridade Otimização da extração

Propriedades extrativas Parâmetros de solubilidade

A ESCOLHA DO SOLVENTE ESTÁ RELACIONADA DIRETAMENTE COM SUAS

ÁGUA – um dos líquidos extratores mais importantes, sendo utilizada na extração de

MAIORIA DOS CONSTITUINTES APRESENTAM ALGUMA SOLUBILIDADE EM

Segundo a eficiência os métodos extrativos são classificados como operação

• Extração exaustiva das substâncias ativas, sendo a droga moída colocada em um

• Indicada para extração de substâncias farmacologicamente muito ativas, presentes em

5) EXTRAÇÃO CONTÍNUA EM APARELHO DE SOXHLET

7) EXTRAÇÃO SOB REFLUXO

8) EXTRAÇÃO COM ARRASTE DE VAPOR DE ÁGUA - HIDRODESTILAÇÃO

10) EXTRAÇÃO COM FLUÍDO SUPER CRÍTICO

• CO2 não deixa resíduos de solvente;

ANÁLISE FITOQUÍMICA PRELIMINAR

Primeiros roteiros de análise sistemática.

• Partição de substâncias entre fases orgânica e aquosa

• Formação de sais com diferenças de solubilidade em relação às bases ou ácidos que

Uso do extrato direto ou com o solvente eliminado

Extrato bruto = mascarar o resultado

MATERIAL VEGETAL SECO, ESTABILIZADO E RASURADO

EXTRAÇÃO POR MACERAÇÃO DINÂMICA (BM)

CONCENTRAÇÃO EM ROTAEVAPORADOR (1/3 VOL)

SOLVENTES DE POLARIDADE CRESCENTE: hexano; diclorometano; acetato de etila e

BM – EVAPORAÇÃO DO LÍQUIDO EXTRATOR

RESÍDUO ressuspender em EtOH 70 %

FRACIONAMENTO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

• Partição por solventes

FRACIONAMENTO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

Prova de identidade – identificação de fármacos

• Espectro de massas (EM)

Fracionamento, isolamento e purificação de substâncias

• RMN de próton e carbono

• Atividade óptica e Cristalografia por raios X

DADOS DE DIFERENTES TÉCNICAS PERMITEM , EM CONJUNTO, A

EXEMPLO: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE FITOTERÁPICOS

COSTA, A. F. Farmacognosia. 4ª Ed. Vol. I. Lisboa:Fundação Calouste Gulbenkian, 1986.

CUNHA, A. P. Farmacognosia e fitoquimica..Fundação Calouste Gulbenkian, 2005.

DEY, P. M.; HARBORNE, J. B. Plant biochemistry. Academic Press, 1997.

NAKASHIMA, T. Fitoquimica experimental. Apostila prática. Departamento de Farmácia,

SIMÕES,C. M. O. et al. Farmacognosia : da planta ao medicamento. 2º Ed. Ed. UFSC,

YUNES, R. A.; CECHINEL Fº, V. Quimica de produtos naturais, novos fármacos e a

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