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EFEITO DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE A ENZIMA UREASE:

UM ESTUDO IN VITRO E IN SILICO

EFFECT OF ESSENTIAL OILS ON UREASE ENZYME: IN VITRO AND IN

SILICO STUDY

Deisiane Aparecida da Silva1, Flavianny Brencis da Silva Mikalouski2,

Rubia Michele Suzuki2, Rafaelle Bonzanini Romero1, Adriano Lopes
Romero1
1
Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Departamento Acadêmico de Química,
2
Campo Mourão, Paraná. Universidade Tecnológica Federal do Paraná,
Departamento Acadêmico de Química, Apucarana, Paraná. Agência de fomento:
Fundação Araucária
e-mail: adrianoromero@utfpr.edu.br

RESUMO - O objetivo deste estudo foi realizar estudos in vitro e in

silico com óleos essenciais visando à busca de substâncias bioativas
inibidoras de urease com potencial atividade anti-H. pylori. A
metodologia para os estudos in vitro baseou-se na utilização da urease
de soja, escolhida como um sistema modelo para estudar o efeito de
potenciais inibidores de urease. Os constituintes majoritários dos óleos
essenciais avaliados foram submetidos a estudos de ancoragem
molecular frente a enzima urease (PDB 1E9Z). Os resultados obtidos
sugerem que os compostos eucaliptol, geranial e D-limomeno podem
atuar como inibidores de urease por interagir no sítio ativo da enzima.
Conclui-se que os óleos essenciais podem ser considerados fontes
promissoras de substâncias bioativas com efeito inibitório sobre a
enzima urease de H. pylori.
Palavras-chave: Óleos Essenciais; Urease; Inibição Enzimática; Estudo
In Silico; Helicobacter Pylori.

ABSTRACT - The objective of this study was to perform in vitro and in

silico studies with essential oils in order to search bioactive substances
with potential anti-H. pylori activity. The methodology for in vitro
studies was based on the use of soy urease, chosen as a model system
to study the effect of potential inhibitors of urease. The major
constituents of the evaluated essential oils were subjected to studies
of molecular docking with the urease enzyme (PDB 1E9Z). The results
suggest that eucalyptol, geranial and D-limomene can act as urease
inhibitors to interact in the active site of the enzyme. This study
Recebido em: 19/08/2015 concludes that essential oils can be considered promising sources of
Revisado em: 31/08/2015 bioactive substances with inhibitory effect on H. pylori urease activity.
Aprovado em: 08/09/2015 Keywords: Essential Oils; Urease; Enzymatic Inhibition; In Silico Study;
Helicobacter Pylori.

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1. INTRODUÇÃO mucosa gástrica (LADEIRA, 2003). Este

Desde sua identificação por Marshall mecanismo de sobrevivência é atribuído a
e Warren (1982), o Helicobacter pylori potente atividade da enzima urease
rapidamente se tornou alvo de incontáveis (SIQUEIRA, 2007). Esta enzima, que é uma
estudos microbiológicos, histológicos, proteína de alto peso molecular (500 a 600
epidemiológicos, imunológicos, ecológicos e kDa), atua promovendo a hidrólise da uréia,
clínicos. Consequentemente, em curto presente em condições fisiológicas no suco
período de tempo, os avanços do gástrico, levando à produção de amônia e
conhecimento na área puderam ser dióxido de carbono. A amônia produzida atua
utilizados, de forma revolucionária, na como receptor de íons H+, tornando o pH
prática médica diária de clínicos e neutro no interior da bactéria, o que confere
gastroenterologistas (COELHO; ZATERKA, ao H. pylori resistência à acidez gástrica.
2005). A descoberta do H. pylori Desta maneira, a bactéria fica protegida dos
revolucionou os conceitos fisiopatológicos efeitos deletérios do pH ácido do estômago.
das patologias gastroduodenais, como a Perante tal problemática, muitas
gastrite, a doença ulcerosa péptica, a razões movem os prescritores a recomendar
neoplasia gástrica e o linfoma MALT (PINTO, abusivamente o uso de antibióticos. A grande
2007). Segundo Souza (2013) esta bactéria é disponibilidade desses medicamentos,
capaz de facilitar a fixação no estômago, acompanhada de publicidade pouco
induzir uma lesão mucosa e evitar a defesa judiciosa, finda por acentuar o seu uso
do hospedeiro, sendo assim, considerada abusivo. Com isso se mantêm ou agravam as
uma das bactérias mais prejudiciais ao doenças infecciosas, aparecem mais reações
organismo. adversas, usam-se alternativas
Com a evolução do gênero o H. pylori antimicrobianas mais onerosas e se
desenvolveu estratégias que lhe permitem produzem mais hospitalizações. Portanto,
sobreviver e persistir na mucosa gástrica, torna-se imprescindível a necessidade de
regulando negativamente a resposta imune encontrar, desenvolver, e introduzir no
do hospedeiro através dos seus fatores de arsenal médico, modalidades terapêuticas
virulência (COELHO, 2013). A resistência ao mais eficientes que possam oferecer aos
ácido clorídrico presente no estômago é de pacientes com doenças distintas, novas
vital importância na patogênese do H. pylori, oportunidades de tratamento que visem
visto que, sem este atributo biológico, a melhorias na erradicação de bactérias. Nesta
bactéria não teria condições de colonizar a modalidade, os produtos naturais surgem

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como fortes contribuintes no tratamento de fator de 200. O filtrado obtido foi utilizado,
enfermidades. sem purificações adicionais, como fonte de
Harvey (2008) reporta os produtos urease nos testes de inibição enzimática.
naturais como a fonte da maioria dos Para utilização dos óleos essenciais,
ingredientes ativos de medicamentos, sendo foram preparadas soluções acetônicas em
amplamente aceitos desde a descoberta de sete concentrações distintas 6,25; 12,5; 25;
drogas, onde mais de 80% dos fármacos 50; 100; 150 e 250 ppm. Como controle
eram produtos naturais ou inspirados por um optou-se pelo uso de solução acetônica de
composto natural. Ao estabelecer tiouréia, considerada um inibidor de urease,
comparações das informações apresentadas nas mesmas concentrações.
sobre as fontes de novos medicamentos O procedimento experimental para
entre 1981-2007, os autores observaram que determinação da atividade inibidora de
aproximadamente metade dos urease seguiu o procedimento proposto por
medicamentos aprovados desde 1994 eram Weatherburn (1967). Em cada tubo de ensaio
baseadas em produtos naturais. foram colocados 100 L de solução urease,
Diante deste cenário, torna-se 100 L da solução do óleo essencial a ser
fundamental o conhecimento sobre a eficácia testado e 100 L de solução de uréia 6 g/L. O
das diferentes terapêuticas para a tubo foi mantido em banho-maria na
erradicação da H. pylori. Neste contexto, este temperatura de 37 ºC por trinta minutos. Em
trabalho teve como finalidade realizar seguida acrescentou-se 500 L dos reagentes
estudos in vitro e in silico com óleos A e B. O tubo foi novamente mantido na
essenciais visando à busca de substâncias mesma temperatura por mais trinta minutos.
bioativas inibidoras de urease com potencial Após o tempo indicado realizou-se leituras
atividade anti-H. pylori, apresentando-se em um espectrofotômetro UV-VIS (PG
como uma alternativa ao uso de antibióticos Instruments, modelo T80+) no comprimento
convencionais. de onda de 630 nm. Todas as determinações
foram realizadas em triplicata. Os valores de
2. METODOLOGIA absorbância foram convertidos em
Para a obtenção da urease, triturou-se porcentagem de inibição de urease utilizando
em um liquidificador, 10 g de soja em 100 mL a equação 1:
de água destilada. Em seguida, utilizando o
método tradicional de filtração o extrato foi
filtrado e a solução obtida foi diluída em um

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I(%) = 100 – [(Ainibidor/Apadrão) × 100], onde: (1) "NIST Mass Spectrometry Data Center" e
Ainibidor: Valor da absorção "Spectral Database for Organic Compounds".
apresentado no teste com óleo O estudo de ancoragem molecular foi
essencial; realizado no software iGEMDOCK 2.1 (HSU et
Apadrão: Valor da absorção al., 2011), utilizando na seção "Prepare
apresentado no teste com o padrão Binding Site" a opção "by current file". Os
(tiouréia). arquivos dos produtos naturais (ligantes)
foram carregados em formato ".mol", as
Os valores de concentração inibitória estruturas dos ligantes foram previamente
média (IC50) foram calculados utilizando o otimizadas utilizando o software ACD
programa Microsoft Excel. ChemSketch. Os parâmetros foram ajustados
A composição química dos óleos para "Standard Docking", em que a
essenciais foi estudada utilizando população foi definida como 200, as gerações
cromatografia gasosa acoplada à como 70 e o número de soluções como 2. As
espectrometria de massas (CG-EM). As configurações padrão foram mantidas na
análises de CG-EM foram realizadas seção "Scoring function". Para visualização e
empregando-se um cromatógrafo Hewlett tratamento dos docking utilizou-se o
Packard 6890, acoplado a um detector programa UCSF Chimera 1.10.1.
seletivo de massas, operando com uma fonte
de elétrons com energia de ionização de 70 3. RESULTADOS
eV. O cromatógrafo operava com coluna O perfil da relação concentração e
capilar de sílica fundida do tipo HP-5 (30 m x inibição enzimática dos quatro óleos
0,25 mm x 0,25 μm). Empregou-se hélio de essenciais avaliados mostrou-se semelhante
alta pureza como gás de arraste, com fluxo ao perfil encontrado para o inibidor padrão
de 1 mL/min. As análises foram realizadas (tiouréia). Utilizando a equação da linha de
com injetor operando a 250 ºC e interface a tendência obtida em cada um dos estudos
280 ºC. Os volumes injetados foram de 1 μL calculou-se a concentração inibitória média
de solução, sem divisão de fluxo. A (IC50) para os óleos essenciais avaliados, cujos
identificação dos constituintes químicos dos valores são apresentados na tabela 1. A
óleos essenciais estudados foi realizada composição química, em percentual, dos
comparando-se o espectro de massas de óleos essenciais avaliados é apresentada na
cada componente com espectros de massas tabela 2.
armazenados nos bancos de dados digitais

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Tabela 1. Valores de IC50 para os óleos essenciais de R. officinalis, C. citratus,

C. winterianius e C. sinensis.
Óleo essencial/padrão IC50 (ppm)
Rosmarinus officinalis 789,7
Cymbopogon citratus 167,5
Cymbopogon winterianius 67,6
Citrus sinensis 60,7
Tiouréia 7,85

Tabela 2. Composição química, em percentual, dos óleos essenciais de Rosmarinus officinalis,

Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianus e Citrus sinensis.
Composto Tempo de retenção R. officinalis C. citratus C. C. sinensis
(min.) winterianus
6-metil-5-Hepten-2- 8,217 - 1,34 - -
ona
Sabineno 6,408 8,52 - - -
Canfeno 6,896 5,86 - - -
-Pineno 7,841 3,22 - - -
β-Pineno 8,327 1,10 - - -
p-Cimeno 9,654 1,80 - - -
D-limoneno 9,789 3,58 - 4,11 75,68
Eucaliptol 9,985 32,23 - - -
4-Nonanona 11,591 - 0,29 - -
cis-Verbenol 11,935 - 1,94 - -
Linalool 12,848 1,52 1,35 1,12 0,73
cis-Óxido de 14,293 - - - 2,74
limoneno
trans-Óxido de 14,504 - - - 3,05
limoneno
Isopulegol 14,871 - - 1,97 -
Cânfora 14,971 26,26 - - -
Isoborneol 15,436 2,11 - - -
Citronelal 15,558 - - 21,10 -
Borneol 15,855 3,04 - - -
-Terpineol 16,962 1,83 - - -
Decanal 17,592 - - 0,16 -
Citronelol 18,926 - - 12,84 -
trans-Carveol 18,276 3,85
Carvona 19,403 3,82
Neral 19,728 - 21,51 0,42 -
Geraniol 20,451 - 8,05 20,94 -
Geranial 21,253 - 27,93 - -
Acetato de bornila 21,373 3,00 - - -
Nerol 25,808 - 4,71 5,58 -
β-Cariofileno 27,280 2,89 2,54 - -
m-Eugenol 28,569 - 0,37 1,33 -
Humuleno 28,729 0,42 0,29 - -
Metil m-Eugenol 30,606 - - 0,48 -
δ-Cadineno 31,328 - 1,64 - -
-Muruleno 31,676 - 0,55 2,50 -
-Elemol 32,809 - - 4,06 -
Nerolidol 33,106 - - 0,37 -
Óxido de cariofileno 34,133 - 0,46 - -

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t-Cadinol 36,436 - - 1,01 -

Eudesmol 36,767 - - 0,31 -
-Cadinol 36,935 - - 1,18 -
Miristato de 43,025 - 1,00 - -
isopropila
Nonadecanol 44,927 - 0,91 - -
Esqualeno 68,752 - 2,90 - -
Total 97,38 77,78 79,48 89,87

Os resultados de ancoragem limoneno estão ancorados no sítio ativo da

molecular dos constituintes majoritários dos urease, apresentando energia de interação
óleos essenciais estudados na enzima urease ligante-enzima de -73,78, -71,79 e -57,39
(PDB 1E9Z) são apresentadas nas figuras 1 - kcal/mol, respectivamente.
4. Os compostos eucaliptol, geranial e D-

Figura 1. (a) Estrutura da enzima urease; (b) localização dos compostos majoritários do óleo
essencial de R. officinalis após o estudo de ancoragem molecular; (c) Eucaliptol e D-limoneno
interagindo no sítio ativo da enzima urease.

Figura 2. (a) Estrutura da enzima urease; (b) localização dos compostos majoritários do óleo
essencial de C. citratus após o estudo de docagem molecular; (c) geranial interagindo no sítio ativo
da enzima urease.

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Figura 3. (a) Estrutura da enzima urease; (b) localização dos compostos majoritários do óleo
essencial de C. winterianius após o estudo de docagem molecular; (c) D-limoneno interagindo no
sítio ativo da enzima urease.

Figura 4. (a) Estrutura da enzima urease; (b) localização dos compostos majoritários do óleo
essencial de C. sinensis após o estudo de docagem molecular; (c) D-limoneno interagindo no sítio
ativo da enzima urease.

4. DISCUSSÃO fenilpropanóides. Várias atividades

Pode-se observar que os óleos biológicas/farmacológicas foram
essenciais de Rosmarinus officinalis, comprovadas para diferentes óleos
Cymbopogon citratus, Cymbopogon essenciais, tais como anti-inflamatória,
winterianius e Citrus sinensis foram capazes inseticida, antimicrobiana, antitumoral,
de inibir a atividade da enzima urease, antiviral, imunomoduladora,
embora tenham apresentado grande anticonvulvante, antiespamódica e
variação de IC50 (60,7 - 789,7 ppm). O estudo ansiolítica. A maioria dessas atividades
da relação concentração de tiouréia e biológicas/farmacológicas são atribuídas aos
porcentagem de inibição revela um terpenóides constituintes dos óleos
comportamento logarítmico para a linha de essenciais (ROMERO; ROMERO, 2014). O D-
tendência, tal como relatado na literatura limoneno, por exemplo, monoterpeno
(BIGLAR et al., 2012). encontrado em vários óleos essenciais,
O estudo por CG-EM revelou que os apresentou, em testes in vitro, atividade
óleos essenciais estudados são constituídos inibidora de H. pylori (ROZZA et al., 2011).
principalmente por terpenos e

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Os resultados obtidos nos estudos de para verificar se in vivo estes óleos

ancoragem molecular sugerem que os apresentarão efeito sobre a bactéria H.
compostos eucaliptol, geranial e D-limomeno pylori.
podem atuar como inibidores da enzima
urease por interagir no sítio ativo, tal como REFERÊNCIAS
relatado para a tiouréia e outros inibidores BIGLAR, M. et al. A preliminary investigation
of the jack-bean urease inhibition by
reconhecidos para esta enzima. Observa-se
randomly selected traditionally used herbal
que os três monoterpenos mencionados medicine. Iranian Journal of Pharmaceutical
Research, Tehran, v.11, n.3, p.831-837, 2012.
interagem, através de interações de van der
Waals, com o resíduo His221, apontado na COELHO, L. G. V.; ZATERKA, S. (Org.). II
Consenso Brasileiro sobre Helicobacter pylori.
literatura como importante para a ancoração
Arq. Gastroenterol., São Paulo, v.42, n.2,
da uréia no sítio ativo da urease (DIXON et p.128-132, abr./jun. 2005.
al., 1980). Estes resultados sugerem que a
COELHO, F. M. M. C. Helicobacter pylori
atividade inibidora de urease apresentada Eficácia da terapêutica. 2013. 60f.
Dissertação (Mestrado) - Ciências da Saúde,
pelos óleos essenciais estudados pode
Universidade da Beira Interior, Covilhã.
ocorrer por um mecanismo de inibição
DIXON, N. E. et al. Jack bean urease (EC
reversível competitivo. Além da inibição
3.5.1.5). V. On the mechanism of action of
enzimática através da interação de ligantes urease on urea, formamide, acetamide, N-
methylurea, and related compounds. Can. J.
no sítio ativo é possível que os constituintes
Biochem. Cell Biol., Ottawa, v.58, n.12,
dos óleos essenciais realizem a inibição da p.1335-1344, dez. 1980.
urease por outros mecanismos.
HARVEY, A. L. Natural products in drug
discovery. Drug Discovery Today, Glasgow,
v.13, n.19, p.894-897, out. 2008.
5. CONCLUSÃO
http://dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2008.07.0
Os resultados apresentados neste 04
trabalho indicam que óleos essenciais podem
HSU, K.-C. et al. iGEMDOCK: a graphical
ser considerados fontes promissoras de environment of enhancing GEMDOCK using
pharmacological interactions and post-
substâncias bioativas inibidoras de urease.
screening analysis. BMC Bioinformatics,
Dentre as nove amostras avaliadas Londres, v.12, (Suppl 1), p.S33, fev. 2011.
http://dx.doi.org/10.1186/1471-2105-12-S1-
determinou-se que os óleos essenciais de
S33
Rosmarinus officinalis, Cymbopogon citratus,
LADEIRA, M. S. P. et al. Biopatologia do
Cymbopogon winterianius e Citrus sinensis
Helicobacter pylori. Jornal Brasileiro de
são promissores inibidores de urease. Sendo Patologia e Medicina Laboratorial, Rio de
Janeiro, v.39, n.4, p.335-342, mar. 2003.
assim, estudos posteriores são necessários

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